イディオタイプ抗原用担体およびそれを用いたイディオタイプワクチン
【課題】がん特異的免疫療法において、効率よくがん特異的抗原を細胞傷害性リンパ球に認識させるための方法および試薬（担体）、ワクチン等を提供する。特に、体内に大量に存在している免疫グロブリンをがん特異的抗原として用いた場合であっても抗原が特異的に効率よく抗原提示細胞へ取り込まれ、かつ同時に抗原提示細胞を活性化することを可能にする方法および試薬（担体）、ワクチン等を提供する。
【解決手段】イディオタイプ抗原と尿酸塩結晶からなる担体とからなる複合体を含むことを特徴とするイディオタイプワクチン。
【解決手段】イディオタイプ抗原と尿酸塩結晶からなる担体とからなる複合体を含むことを特徴とするイディオタイプワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫刺激のための特異的抗原の担体、さらに具体的にはがん細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞（以下、ＣＴＬということがある）を効率的に誘導するための、特異的抗原の担体に関する。本発明はまた、これらの担体を用いた抗原複合体およびそれを含む免疫刺激用組成物（ワクチン）、ならびにワクチンの製造方法等にも関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、腫瘍特異抗原の発見や樹状細胞の利用により腫瘍免疫療法が開発されている。がん抗原タンパク（がんワクチン）を用いた腫瘍特異的細胞免疫は、がんの治療や再発予防に応用することが可能である。腫瘍特異的細胞免疫は、（１）特異的抗原（がん抗原タンパク）の作製、（２）抗原提示細胞への抗原感作、（３）抗原提示細胞によるＣＴＬの教育・増殖の、３段階を経て惹起される。
【０００３】
がん細胞が特有な抗原を持っている場合、その抗原タンパクは腫瘍細胞内でペプチドに分解され、一部がＭＨＣクラスＩと複合体を形成し、がん細胞表面に提示される。末梢血中に存在するＣＴＬは、同細胞表面上のＴ細胞抗原レセプターを介してがん細胞のＭＨＣクラスＩ複合体と結合し、がん細胞を非自己と認識した場合には積極的に攻撃する。したがって、クラスＩ分子上に提示されるようながん特異的抗原をがんワクチンとして使用することによりＣＴＬを効率的に誘導することができる。
【０００４】
がん特異抗原が作製できたら、がん特異的免疫療法の成功のためには、がん特異的抗原をいかに効率的に細胞傷害性リンパ球に認識させるかが課題となる。樹状細胞（以下、ＤＣということがある）は、生体内で最も強力な抗原提示機能を有する細胞であり、自分が取り込んだ抗原をナイーブＴ細胞に提示し、抗原特異的なＣＴＬの増殖活性を誘導し、特異的免疫を機能させる能力を有する。樹状細胞は、抗原を感作させた後にリンパ球と混合培養すると、腫瘍に特異的なＣＴＬを最も効率的に誘導し感作効率を高めることが知られている。したがって、樹状細胞は、がんワクチンを用いた腫瘍特異的細胞免疫療法の司令塔として働く細胞として利用されている。
【０００５】
多発性骨髄腫は、白血病や悪性リンパ腫とならぶ造血器悪性腫瘍のひとつで、白血球の一種であるリンパ球から分化・成熟した形質細胞が、がん化して発症する疾患である。形質細胞は、身体に侵入したウイルスや細菌などの異物を排除する作用をもつタンパク質（抗体＝免疫グロブリン）を産生する。免疫グロブリンは、可変領域を含むＦａｂ領域（ab fraction； Ｆａｂ）部分と定常領域（constant fraction； Ｆｃ）部分とに分かれ、Ｆａｂの可変領域は対象抗原に特異的なイディオタイプ抗原である。形質細胞では１種類の免疫グロブリンしか産生されないため、がん化した形質細胞（骨髄腫細胞）の可変領域部分は腫瘍特異抗原として用いることができる。
【０００６】
既に、本発明者らは、多発性骨髄腫細胞株ＩＭ−９の培養上清よりＩｇＧ可変領域を切り出してイディオタイプ抗原とし、ＩＭ−９細胞とＨＬＡ−Ａが合致したボランティアの単球より誘導した樹状細胞を感作した後、同じボランティアから得たリンパ球と共培養した実験系において、増殖したリンパ球が骨髄腫細胞株ＩＭ−９に対する細胞傷害性を有することを証明した（非特許文献１および２）。すなわち、多発性骨髄腫において、比較的簡単に精製できる免疫グロブリンＦａｂ領域を抗原として樹状細胞を感作することにより、腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を効率的に誘導できる可能性があることが証明されている。
【０００７】
しかし、免疫グロブリンは患者体内に大量に存在しているため、がん抗原として感作されにくいことが予想される。そのため、免疫グロブリンを抗原として用いた場合であっても、抗原が特異的に抗原提示細胞へ取り込まれ、かつ同時に抗原提示細胞を活性化できるような方法を開発することにより、より効率的に腫瘍特異的細胞免疫が惹起されるようにすることが望まれている。
【０００８】
尿酸ナトリウム（ＭＳＵ）結晶は、ヒト体内においては体液中に過剰に存在する尿酸が体内で析出することにより形成され、痛風発作と呼ばれる特異的な関節炎症状を引き起こす物質である。ＭＳＵ結晶は２〜２０μmの長針状または桿状の形状を示し、結晶表面は不規則であり、空間の充填が乏しく催炎性が強いとされる表面構造を示す。結晶表面は陰性荷電を持ち、ＩｇＧを中心とした免疫グロブリンやリポタンパクの付着が認められ、ＩｇＧは陽性に荷電しているＦａｂ部分でＭＳＵ結晶と結合しているとされている（非特許文献３）。
【０００９】
近年、ＭＳＵ結晶が局所における免疫反応の重要物質として働いていると考えられるようになってきた。例えば、Shiらは、局所で傷害された細胞から放出された尿酸が内因性の危険信号（danger signal）として樹状細胞に働くこと、および予め形成させたＭＳＵ結晶をインビボ注射するとアジュバント活性が見られることを報告した(非特許文献４)。また、Huらは、尿酸濃度に依存して免疫拒絶反応が高まることやＭＳＵ結晶の皮下投与により異種移植片の拒絶反応が促進されることを報告した(非特許文献５)。
【００１０】
しかし、ＭＳＵ結晶を特定の抗原と予め結合させることは記載されていない。
【非特許文献１】酒巻一平、上田孝典、高澤ゆみえ、岩崎博道、稲井邦博、津谷 寛：「Ｆａｂを抗原としたmyeloma cell lineに対するallogenic ＣＴＬの誘導」。第６５回日本血液学会総会・第４５回日本臨床血液学会総会、2003.8. 臨床血液 44(8)，874，2003,8。
【非特許文献２】Sakamaki, I., Inai, K., Takazawa, Y., Tsutani, H., ＊Ueda, T.：Clonal expansion of TCR V beta repertoires in CD8 and CD4 T cells in response to idiotype protein. American Association for Cancer Research 95th Annual Meeting,Abstract. 45, 294-295, 2004,3.
【非特許文献３】Kozin F. et al., J Lab Clin Med. 1980
【非特許文献４】Shi et al., Nature 425:516-521 (2003)
【非特許文献５】Hu et al., Cancer Res. 64:5059-5062 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、がん特異的免疫療法において、効率よくがん特異的抗原を細胞傷害性リンパ球に認識させるための方法および試薬（担体）、ワクチン等を提供することを目的とする。特に、体内に大量に存在している免疫グロブリンをがん特異的抗原として用いた場合であっても抗原が特異的に効率よく抗原提示細胞へ取り込まれ、かつ同時に抗原提示細胞を活性化することを可能にする方法および試薬（担体）、ワクチン等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ＭＳＵ結晶を抗原担体として用いることにより上記目的が達成されることを見い出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明により、
〔１〕 イディオタイプ抗原と尿酸塩結晶からなる担体とからなる複合体を含むことを特徴とするイディオタイプワクチン；
〔２〕 イディオタイプ抗原が、多発性骨髄腫細胞によって産生される免疫グロブリンまたは可変領域を含むその一部である、前記〔１〕記載のイディオタイプワクチン；
〔３〕 尿酸塩結晶が、針状結晶を超音波処理したものである、前記〔１〕または〔２〕記載のイディオタイプワクチン；
〔４〕 前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載のイディオタイプワクチンを製造する方法であって、イディオタイプ抗原と尿酸塩結晶とを一緒にして静置することによりイディオタイプ抗原と尿酸塩結晶との複合体を形成させる工程を含む方法；
〔５〕 前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載のイディオタイプワクチンを用いて樹状細胞を刺激し、この樹状細胞を用いて細胞傷害性Ｔ細胞を刺激することを特徴とする、特異的細胞傷害性Ｔ細胞の免疫応答を促進する方法；
〔６〕 前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載のイディオタイプワクチンを製造するための担体であって、尿酸ナトリウム結晶からなる担体、が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のイディオタイプ抗原用担体は、樹状細胞にイディオタイプ抗原を効率的に取り込ませることができる。さらに、本発明のイディオタイプ抗原用担体を使用することにより、抗原の取り込み促進と同時に樹状細胞を活性化することができる。すなわち本発明の担体は、抗原取り込み能の優れた未熟樹状細胞に抗原を取り込ませると同時に、従来使用されてきた各種の成熟化物質を使用することなしに抗原提示能の優れた成熟樹状細胞への成熟化を行なうことができるので、非常に有利である。その結果、本発明のイディオタイプ抗原用担体を用いたイディオタイプワクチンは非常に有効性が高く、腫瘍特異的免疫療法が成功する可能性が高くなると期待される。また、本発明のイディオタイプ抗原用担体は生体内に存在しうる物質に基づいているため、予測できない副作用を引き起こす危険がなく、安全性が高い。したがって、本発明の担体に腫瘍由来のイディオタイプ抗原を結合させた複合体は、がんワクチン（抗がん剤）として使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の担体は、尿酸塩結晶からなる。尿酸塩結晶としては各種の形状のものが知られているが、どのような形状のものであってもよく、また、結晶は、公知のいずれの方法で作製してもよい。一般的には、水に難溶性の尿酸をアルカリや加熱により溶解して尿酸を含む溶液を用意し、静置して冷却することにより結晶を析出させる。
【００１６】
結晶のサイズは小さい方が細胞による取り込みのために有利である。例えば、結晶は、貪食されやすいように樹状細胞より小さいサイズ、例えば直径１０μm以下のサイズであることが好ましい。細かい結晶を得るためには、いったん製造した結晶を超音波処理等によって破砕してもよい。この場合、破砕のしやすさの点からは、針状結晶のみまたは針状結晶を主に含む結晶を使用することが好ましい。
【００１７】
尿酸塩として特に好ましいのは尿酸ナトリウム（ＭＳＵ）および尿酸水素ナトリウムであり、最も好ましいのは尿酸一ナトリウム一水和物である。痛風結節内など生体内の尿酸塩結晶は尿酸水素ナトリウムであり、さらに結晶水１分子を含み、尿酸一ナトリウム一水和物が形成される(非特許文献３)。ＭＳＵ結晶は、ピロリン酸カルシウム結晶やヒドロキシアパタイトとともに結晶誘発性関節炎の原因物質であり、催炎性が最も強い結晶である。また、生体への安全性、作製の容易性等の点からも、担体として最も好ましい。
【００１８】
また、本発明の担体は、タンパクとの結合能および樹状細胞の感作能等の機能を保持する範囲内で、適宜修飾または改変されていてもよい。
【００１９】
尿酸塩結晶は、陰性に荷電していることが知られている。したがって、本発明の担体は、陽性に荷電している免疫グロブリンＦａｂ部分と電気的に結合するという物理的特性を有する。本発明のイディオタイプワクチンは、このようにして結合した本発明の尿酸塩結晶からなる担体とイディオタイプ抗原とからなる複合体を含む。本発明のイディオタイプワクチンに含まれるイディオタイプ抗原としては、少なくとも可変領域を含むタンパクまたはポリペプチドであればよく、例えば免疫グロブリン全体、または可変領域を含む部分、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、軽鎖、重鎖、および重鎖のＦａｂ部分が挙げられる。ワクチン用として、免疫グロブリンは、ＩｇＧが好ましいが、場合によってはそれ以外の免疫グロブリン等またはそれらに由来する部分であってもよい。このような抗体の調製および抗体フラグメントの調製は当業者には充分公知である。
【００２０】
本発明のイディオタイプワクチンは、多発性骨髄腫を代表とするモノクローナルタンパクを産生する腫瘍などに対して治療目的で適用しうる。したがって、イディオタイプ抗原は、多発性骨髄腫等の患者の血液等から得ることができる。
【００２１】
本発明の担体と、イディオタイプ抗原とを結合させることによりそれらの複合体が得られる。担体と抗原との結合は、適当量の両者を混合して静置するだけで容易に起こすことができる。例えば、尿酸塩結晶：Ｆａｂを重量比０．１：１〜４：１程度でリン酸緩衝生理食塩水中で混合し、４℃〜室温程度で１〜４８時間静置することにより複合体が形成される。特定の条件下での最適な複合体形成条件は後述する方法などによって適宜決定することができる。
【００２２】
本発明のイディオタイプワクチンは、患者に直接投与することができる。投与経路としては、特に制限はないが、非経口経路が好ましく、一般的には皮内投与であり、リンパ節近傍の皮内に投与することが好ましい。したがって、本発明のイディオタイプワクチンは、イディオタイプ抗原と本発明の担体との複合体を含むほか、製造過程で使用されるリン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、塩酸などの緩衝剤とpH調整用試薬が添加されていてもよく、さらに投与経路や剤型等によって必要に応じてベンジルアルコールなどの無痛化剤、乳糖水和物、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−グルタミン、ゼラチンなどの安定剤、フェノール、ホルマリンなどの不活化剤など製剤分野で公知の成分を含んでいてもよい。また、他の抗がん剤等と組み合わせてもよい。
【００２３】
投与量は、患者の状態、投与経路、投薬スケジュール等によって変動するが、一般的には、抗原量として１．０〜２０．０μg/kg体重程度、担体量として２．０〜４０．０μg/kg体重程度（抗原と担体との複合体の量として３．０〜６０．０μg/kg体重）である。このような尿酸塩結晶の投与量は、ごく少量のため痛風患者の皮膚局所でみられる痛風結節のＭＳＵ結晶量の２万分の１〜１０００分の１程度に相当し、肉眼的に認識できる痛風結節を作ることもなく、そもそも皮膚ではみることはない痛風発作も当然惹起されることはないと考えられる。また例えすべて溶解し血液中内に移行したとしても血清尿酸値を０．００２５〜０．０５mg/dl上昇させる程度であり、担体の投与が尿酸塩結晶の組織への沈着を促進するとは考えられない。したがって、尿酸塩結晶による副作用の可能性はほとんどないと考えられる。
【００２４】
また、本発明のイディオタイプワクチンは、直接投与せずに、体外で本発明のイディオタイプワクチンで樹状細胞を感作することにより、がん細胞を標的とする樹状細胞を産生したり、さらにはこの樹状細胞を用いて特異的ＣＴＬを誘導したりするために使用することができる。このような樹状細胞またはＣＴＬを患者に与えることによっても腫瘍の治療を行なうことができる。
【実施例】
【００２５】
１．尿酸ナトリウム（ＭＳＵ）結晶担体の作製（１）
尿酸ナトリウム結晶を、MaCartyらの方法（Lancet 2:682, 1962）に基づいて以下のようにして作製した。
【００２６】
尿酸（ナカライテスク（株）、京都）３３６mgに蒸留水４０mLおよび水酸化ナトリウムを０．０８０mg加えて攪拌した。さらに蒸留水を加えて８０mLとし、加熱沸騰させて尿酸を完全に溶解させた。加熱を終了し、再び溶液量を８０mLに調整し（尿酸濃度４２０mg/dL）、自然冷却下で４５℃となったところでろ過滅菌した（商品名「ステリカップ‐ＧＰフィルターユニット」、日本ミリポア（株）、東京)。ろ過液を速やかに１．５mL容の滅菌済みマイクロチューブに分注し、４℃で５日間以上保存して、針状結晶の生成を最大限に促した。この間、ウリカーゼ・ペルオキシダーゼ法を用いて溶液中の尿酸濃度の減少を経時的にモニタリングした。その結果を図１に示す。
【００２７】
生成した尿酸ナトリウム（ＭＳＵ）結晶を、樹状細胞による貪食を容易にするために、イディオタイプ抗原と結合させる直前に１０μm以下になるように破砕した。閉式超音波細胞破砕装置（バイオラプターＵＣＷ２００ＴＭ、東湘電気（株）、横浜）を用い、２００Wにて３０秒間処理を１回とし、計４回断続して無菌的に上記低温保存しＭＳＵ結晶が析出したマイクロチューブを処理し、マイクロチューブ内のＭＳＵ結晶を細かくした。
【００２８】
この操作における破砕の進行状況を顕微鏡観察した（倍率１００倍）。結果を図２に示す。３０秒間の破砕（パネルＤ）で、きれいな断片化が行なわれたが、６０秒間（パネルＥ）では断片サイズが３０秒間より大きそうなものも含まれていたため、安定的に破砕が完了する１２０秒間（３０秒オン、３０秒オフのサイクルを４回；パネルＦ）を標準的に使用する破砕条件とした。
【００２９】
破砕後の溶液を７，０００×gでフラッシングした後、沈降させた結晶を０．１Mリン酸緩衝食塩水(pH７．０)で洗浄して、最終的に同液に沈降させて、イディオタイプ抗原用担体とした。
【００３０】
２．ＭＳＵ結晶担体の作製（２）
０．１Mリン酸緩衝食塩水（pH７．４）８０mLに尿酸１００mgを加えて加熱沸騰させて尿酸を完全に溶解させた。加熱を終了し、再び溶液量を８０mLに調整し、自然冷却下で４５℃となったところでろ過滅菌した（ステリカップ-ＧＰ フィルターユニット、日本ミリポア（株）、東京)。ろ過液を速やかに１．５mLの滅菌済みエッペンチューブに分注し、４℃で５日間以上保存して、針状結晶の生成を最大限に促した。
【００３１】
その後は上記と同様にしてイディオタイプ抗原用担体を調製した。
【００３２】
３．イディオタイプ抗原の作製
ＩｇＧ型多発性骨髄腫の患者血清０．５〜１．０mL（ＩｇＧ ４０mg相当）を採取し、０．１Mリン酸緩衝食塩水(pH７．４)で希釈して、同液にて予め充足させてあるＰｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（商品名「Hitrap protein G 1mL」、アマシャム ファルマシア バイオテク（株）、東京）に注入し、吸着させた。さらに０．１Mリン酸緩衝食塩水(pH７．０)を注入して非吸着成分をカラムより洗い出した。１M グリシン−塩酸緩衝液(pH２．７)３mLを注入して、吸着していたＩｇＧを溶出させ、溶出液に１Mトリス−塩酸緩衝液(pH９．０)を加えてpHを７．４程度に調整した。
【００３３】
溶出させたＩｇＧを、０．１２mg/mLシステインおよび２mM ＥＤＴＡナトリウム(pH７．４)混合液中で０．２５mg/mLパパイン（MERCK社、Darmstadt, Germany）を用いて、３７℃にて１２時間孵置することにより、ＩｇＧをＦａｂ部分とＦｃ部とに切断した。その後、１０．８mMヨードアセタミドで反応を停止した。
【００３４】
プロテインＡカラム（商品名「Hitrap protein A 5mL」、アマシャム ファルマシア バイオテク（株）、東京）に注入してＦｃ部分および消化されていないＩｇＧを吸着し、さらに０．１Mリン酸緩衝食塩水(pH７．４)を注入して非吸着成分であるＦａｂ部分を採取した。次に、遠心濃縮（商品名「アミコンウルトラ‐４ 遠心式フィルターユニット」、日本ミリポア（株）、東京）した後、０．１Mリン酸緩衝食塩水(pH７．４)を透析液として透析膜(ミリポア０．０２５μM ＶＳＷＰ ２５mm、日本ミリポア（株）、東京)を用いたDrop Dialysis法にて９０分間透析し、さらに滅菌済シリンジ加圧式フィルターユニット（商品名「マイレクス−ＧＶ」、０．２２μm、ＰＶＤＦ、日本ミリポア（株）、東京)を通してろ過滅菌し、イディオタイプ抗原液とした。
【００３５】
４．複合体の形成（１）
一定量のイディオタイプ抗原（Ｆａｂ）を含む溶液を用いて、ＭＳＵ結晶担体量と吸着したＦａｂタンパク量との関係を調べた。
【００３６】
上記１で作製したＭＳＵ結晶担体０〜３６０μgが入ったマイクロチューブに、上記３で作製したイディオタイプ抗原（Ｆａｂ）１００μgを含有する０．１Mリン酸緩衝生理食塩水１００μLを加え、４℃にて２４時間静置した。この溶液を７，０００×ｇでフラッシングした後に、上清のタンパク濃度をピロガロールレッド法（商品名「マイクロＴＰ−テスト」、和光純薬（株）、東京）で測定した。
【００３７】
結果を図３に示す。添加ＭＳＵ結晶担体量が多いほど緩衝液中のタンパク量は少なくなり、ＭＳＵ結晶担体がＦａｂタンパクを吸着していることが推測された。また、ＭＳＵ結晶担体１００μgではおよそ５０μgのＦａｂタンパクが吸着していることが計算より推定されるため、０．１Mリン酸緩衝生理食塩水１００μL中では、１００μgのＭＳＵ結晶担体に対して倍量のＦａｂタンパクを加えることにより、ＭＳＵ結晶担体が５０μg以上のＦａｂタンパクの吸着を確保できると考えられた。
【００３８】
５．複合体の形成（２）
結合の様子を確認するために、上記１と同様に作製したイディオタイプ抗原用担体混濁液４００μ1（ＭＳＵ結晶１．４mg相当；但し、３０秒間の超音波処理を行ったもの）を、マウスＦＩＴＣ標識ＩｇＧ・Ｆ（ａｂ’）２（ダコ・ジャパン、京都）１００μLと、あるいは等量の上記３の方法でマウスＦＩＴＣ標識ＩｇＧ・Ｆ（ａｂ’）２より作製したマウスＦＩＴＣ標識ＩｇＧ・Ｆａｂと混合し、４℃で１時間静置した。希塩酸液（pH６．５〜７．０）で３回洗浄し、光学顕微鏡下でＭＳＵ結晶の透過像を得た後で、励起波長４８８nmによる蛍光顕微鏡像を観察した。
【００３９】
無添加のＭＳＵ結晶は輪郭のみが識別できるのみで蛍光顕微鏡下で無色透明であった（結果は示さず）。一方、マウスＦＩＴＣ標識ＩｇＧ・ＦａｂまたはマウスＦＩＴＣ標識ＩｇＧ・Ｆ（ａｂ’）２を混合したＭＳＵ結晶は、蛍光検鏡下で緑色に輝いて見えた。図４、パネルＡ、ＢにＭＳＵ結晶担体とマウスＦＩＴＣ標識ＩｇＧ・Ｆａｂとの結合を、またパネルＥ、ＦにマウスＦＩＴＣ標識ＩｇＧ・Ｆ（ａｂ’）２との結合の結果を示す。パネルＡ、Ｅは光学顕微鏡像、パネルＢ、Ｆは蛍光顕微鏡像と光学顕微鏡像との結合像である。さらに、あらかじめＭＳＵ結晶を牛胎児血清と混合した後にＭＳＵ結晶担体とマウスＦＩＴＣ標識ＩｇＧ・Ｆａｂと混合すると、蛍光顕微鏡下での緑色の輝きは減弱した。
【００４０】
６．単球よりの未熟樹状細胞の作製
健常人ドナーよりヘパリン採血し、「RosetteSep Human Monocyte Enrichment Cocktail」（商品名；StemCell Technologies Inc, Vancouver, Canada)を用いて単球を取り出した。この単球（末梢血単球）を、ＧＭ−ＣＳＦ(PEPRO TECH INC, Rocky Hill, NJ)（１００ng/mL）、ＩＬ−４(PEPRO TECH EC, London, UK)（１００ng/mL）を加えた１０％ＡＢ血清含有ＲＰＭＩ１６４０培養液にて３７℃、５％ＣＯ２で６日間培養し、未熟樹状細胞を作製した。
【００４１】
７．尿酸塩結晶による樹状細胞の成熟化
２０μgの上記３で作製したイディオタイプ抗原（Ｆａｂ）と２０μgの上記１で作製したＭＳＵ結晶担体とを４℃、３時間静置して複合体を形成させた後、未熟樹状細胞（１×１０５個/ウェル）と１００μLの１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培養液中で４８時間培養した。同様に、未熟樹状細胞のみを４８時間培養した。これらの樹状細胞について、成熟化の指標であるＣＤ８３の発現強度を、ＰＥ標識した抗ＣＤ８３抗体（PE COULTER；Coulter-Immunotec, Krefeld, Germany）を用いてフローサイトメトリー（ＥＰＩＣＳ）(Coulter-Immunotec, Krefeld, Germany)にてsingle color条件にて測定した。
【００４２】
結果を図５に示す。あらかじめ尿酸塩結晶担体と抗原との複合体と共培養した樹状細胞のＣＤ８３発現強度（パネルＢ）は、樹状細胞のみで培養したもののＣＤ８３発現強度（パネルＡ）よりも明らかに高かった。したがって、尿酸塩結晶担体と抗原との複合体は未熟樹状細胞の成熟を促進することが確認された。
【００４３】
樹状細胞は、未熟な状態では抗原の取り込みには優れているが、抗原提示能、Ｔ細胞への刺激能については成熟樹状細胞の方が優れていると考えられている。樹状細胞の成熟化を促すために、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６といったサイトカインやプロスタグランディンＥ２、またピシバニール等の使用が報告されているが、尿酸塩結晶担体と抗原との複合体を用いることで、抗原タンパクの取り込みと同時に樹状細胞を成熟化させることができ、また上記のような成熟化物質を使用することなしに抗原提示能を上昇させることができることがわかった。
【００４４】
８．自己Ｔ細胞増殖試験
上記６におけるのと同様に、２０μgの上記３で作製した患者由来ＩｇＧのＦａｂと２０μgのＭＳＵ結晶担体とを４℃、３時間静置後、１×１０５個の未熟樹状細胞と４８時間共培養した。また、Ｆａｂタンパクのみ、尿酸塩結晶のみ、のいずれかを添加し、または刺激なしで、未熟樹状細胞と４８時間培養した。このうちのそれぞれ１×１０４個の樹状細胞に対して１×１０５個のＴ細胞を混合し、１００μL/ウェルで５日間培養した。
【００４５】
これら樹状細胞を冷ＰＢＳにて２回洗浄後、同じ健常人ドナーより「RosetteSep Human T cell Enrichment Cocktail」（商品名；StemCell Technologies Inc, Vancouver, Canada）を用いて採取したＴ細胞（１×１０６/mL ＣＤ３陽性細胞＞９５％）とともに、Ｔ細胞：樹状細胞の細胞数の比が１０：１となるようにして（すなわち１×１０４個の樹状細胞に対して１×１０５個のＴ細胞）、最終的に１００μLとなるように９６ウェル平底プレートにて１０％ＡＢ血清含有ＡＩＭ−Ｖ培養液（SIGMA）で５日間培養した。Ｔ細胞の増殖は、「CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay」（商品名；Promega, WI, USA）を用いて測定した。増殖比率（Stimulation Index；ＳＩ）を、樹状細胞と共培養したＴ細胞の各ウェルの測定値／樹状細胞で刺激しないＴ細胞の測定値として計算した。各データは３人の健常人の結果の平均±標準偏差で示した。
【００４６】
結果を、図６に示す。尿酸塩結晶担体とＦａｂタンパクとの複合体と共培養した樹状細胞で刺激したＴ細胞の増殖（カラムＡ；ＳＩ＝２．４４±０．１５）は、Ｆａｂのみと共培養した樹状細胞で刺激したＴ細胞の増殖（カラムＣ；ＳＩ＝１．７３±０．２４）に比して優位に高かった。尿酸塩結晶のみと共培養した樹状細胞で刺激したＴ細胞の増殖（カラムＢ；ＳＩ＝２．２７±０．２３）は、樹状細胞のみで刺激したＴ細胞の増殖（カラムＤ；ＳＩ＝１．２９±０．１３）に比して優位に高かった。
【００４７】
９．細胞傷害性試験
ＨＬＡ−Ａ２陽性の健常人ドナーより「RosetteSep Human Monocyte Enrichment Cocktail」（StemCell Technologies Inc）を用いて単球を取り出し、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ng/mL）、ＩＬ−４（１００ng/mL）を加えた１０％ＡＢ血清含有ＲＰＭＩ１６４０培養液にて３７℃、５％ＣＯ２で６日間培養し、未熟樹状細胞を作製した。
【００４８】
ＨＬＡ−Ａ２陽性のＩｇＧ産生骨髄腫細胞株ＩＭ−９の培養上清より上記３と同様にして同株細胞が分泌した単クローン性ＩｇＧを精製した後、Ｆａｂ領域を切り出してイディオタイプ抗原（Ｆａｂタンパク）を作製した。このＦａｂタンパクと上記１または２で作製した尿酸塩結晶担体とを結合させてから４８時間共培養した樹状細胞（Ａ）、共培養の際に用いるＦＢＳ(ウシ血清)と尿酸結晶担体とを結合させてからＦａｂと共に共培養した樹状細胞(Ｆａｂと尿酸結晶担体とを結合させずにＤＣと共培養するモデル)（Ｂ）、Ｆａｂのみと４８時間共培養した樹状細胞（Ｃ）、樹状細胞のみ（Ｄ）を用いて、同じドナーより採取したＴ細胞を上記７と同様にして刺激した。７日間培養後、再度同様に樹状細胞にて刺激し、さらに７日間培養後、「ＭＡＣＳ」（商品名；Miltenyi Biotec, Bergisch Glanbach, Germany）を使用してＣＤ８陽性細胞を取り出した。ＣＤ８陽性細胞：腫瘍細胞を５：１として（すなわち１×１０４個の腫瘍細胞に対してＣＤ８陽性細胞を１×１０５個）混合して１００μL中で４時間培養後、「CytoTox 96」（登録商標）Non-Radioactive Cytotoxicity Assay（Promega, WI, USA）にてＩＭ−９細胞に対するＴ細胞の細胞傷害性を測定した。
【００４９】
結果を図７に示す。尿酸塩結晶担体とＦａｂタンパクとの複合体と共培養した樹状細胞によって誘導したＣＤ８陽性細胞のＩＭ−９に対する細胞傷害性は、他に比して有意に高かった。特に尿酸結晶担体とＦａｂを結合させずに共培養したものに比して尿酸塩結晶担体とＦａｂタンパクとの複合体と共培養した樹状細胞によって誘導したＣＤ８陽性細胞のＩＭ−９に対する細胞傷害性は有意に高く、抗原タンパクと尿酸結晶をあらかじめ結合させておくことがＣＴＬを効率的に誘導するのに必要であることが示された。したがって、本発明のイディオタイプワクチンは、腫瘍細胞を標的とするＣＴＬを効率的に誘導することが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、溶液からのＭＳＵ結晶の経時的な生成を示す図である。縦軸は溶液中の尿酸濃度（mg/dL）、横軸は時間（hr）を表す。
【図２】図２は、ＭＳＵ結晶の破砕を示す写真（光学顕微鏡、倍率１００倍）である。パネルＡは処理前、パネルＢ〜Ｆはそれぞれパネルの左下に示した時間、超音波処理を行なったサンプルの顕微鏡像である。
【図３】図３は、一定量のイディオタイプ抗原（Ｆａｂ）を含む溶液を用いて、ＭＳＵ結晶担体量と吸着したＦａｂタンパク量との関係（ＭＳＵ結晶添加によるＦａｂ溶液中におけるタンパク濃度の変化）を示す図である。
【図４】図４は、ＭＳＵ結晶とＦａｂとの結合を示す写真である。パネルＡ、Ｃ、Ｅは光学顕微鏡像、パネルＢ、Ｄ、Ｆは蛍光顕微鏡像と光学顕微鏡像との結合像である（倍率１００倍）。パネルＡ、ＢはＭＳＵ結晶担体とマウスＦＩＴＣ標識ＩｇＧ・Ｆａｂとの結合を、パネルＣ、ＤはあらかじめＭＳＵ結晶を牛胎児血清と混合した後にＭＳＵ結晶担体とマウスＦＩＴＣ標識ＩｇＧ・Ｆａｂとを結合させた結果を、パネルＥ、ＦはＭＳＵ結晶担体とマウスＦＩＴＣ標識ＩｇＧ・Ｆ（ａｂ’）２とを結合させた結果を、それぞれ観察したもの。各パネルの右下のバーは５０μm。
【図５】図５は、ＭＳＵ結晶による樹状細胞の成熟を示す図である。左パネル（Ａ）は対照（ＭＳＵ結晶の添加なし）、右パネルはＭＳＵ結晶添加（Ｂ）の結果（フローサイトメーターで検出した樹状細胞のＣＤ８３の発現量）である。
【図６】図６は、本発明のイディオタイプワクチンを取り込ませた樹状細胞の自己リンパ球増殖刺激作用を示す図である。Ａ＝本発明のイディオタイプワクチン（ＭＳＵ結晶担体とＦａｂとの複合体）、Ｂ＝ＭＳＵ結晶担体のみ、Ｃ＝Ｆａｂのみ、Ｄ＝添加物なし（樹状細胞のみ）で、それぞれ培養した樹状細胞を用いてＴ細胞を誘導したもの。（Ｎ＝３）
【図７】図７は、本発明のイディオタイプワクチンで誘導されたＣＴＬの骨髄性株細胞に対する細胞傷害性を示す図である。Ａ＝本発明のイディオタイプワクチン、Ｂ＝ＭＳＵ結晶担体をあらかじめＦＢＳでブロックしたものとＦａｂの混合物（ＦａｂとＭＳＵ結晶担体とを結合させずにＤＣと共培養するモデル）、Ｃ＝Ｆａｂのみ、Ｄ＝添加物なしで、それぞれ培養した樹状細胞を用いてＴ細胞を誘導したもの。（Ｎ＝３）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫刺激のための特異的抗原の担体、さらに具体的にはがん細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞（以下、ＣＴＬということがある）を効率的に誘導するための、特異的抗原の担体に関する。本発明はまた、これらの担体を用いた抗原複合体およびそれを含む免疫刺激用組成物（ワクチン）、ならびにワクチンの製造方法等にも関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、腫瘍特異抗原の発見や樹状細胞の利用により腫瘍免疫療法が開発されている。がん抗原タンパク（がんワクチン）を用いた腫瘍特異的細胞免疫は、がんの治療や再発予防に応用することが可能である。腫瘍特異的細胞免疫は、（１）特異的抗原（がん抗原タンパク）の作製、（２）抗原提示細胞への抗原感作、（３）抗原提示細胞によるＣＴＬの教育・増殖の、３段階を経て惹起される。
【０００３】
がん細胞が特有な抗原を持っている場合、その抗原タンパクは腫瘍細胞内でペプチドに分解され、一部がＭＨＣクラスＩと複合体を形成し、がん細胞表面に提示される。末梢血中に存在するＣＴＬは、同細胞表面上のＴ細胞抗原レセプターを介してがん細胞のＭＨＣクラスＩ複合体と結合し、がん細胞を非自己と認識した場合には積極的に攻撃する。したがって、クラスＩ分子上に提示されるようながん特異的抗原をがんワクチンとして使用することによりＣＴＬを効率的に誘導することができる。
【０００４】
がん特異抗原が作製できたら、がん特異的免疫療法の成功のためには、がん特異的抗原をいかに効率的に細胞傷害性リンパ球に認識させるかが課題となる。樹状細胞（以下、ＤＣということがある）は、生体内で最も強力な抗原提示機能を有する細胞であり、自分が取り込んだ抗原をナイーブＴ細胞に提示し、抗原特異的なＣＴＬの増殖活性を誘導し、特異的免疫を機能させる能力を有する。樹状細胞は、抗原を感作させた後にリンパ球と混合培養すると、腫瘍に特異的なＣＴＬを最も効率的に誘導し感作効率を高めることが知られている。したがって、樹状細胞は、がんワクチンを用いた腫瘍特異的細胞免疫療法の司令塔として働く細胞として利用されている。
【０００５】
多発性骨髄腫は、白血病や悪性リンパ腫とならぶ造血器悪性腫瘍のひとつで、白血球の一種であるリンパ球から分化・成熟した形質細胞が、がん化して発症する疾患である。形質細胞は、身体に侵入したウイルスや細菌などの異物を排除する作用をもつタンパク質（抗体＝免疫グロブリン）を産生する。免疫グロブリンは、可変領域を含むＦａｂ領域（ab fraction； Ｆａｂ）部分と定常領域（constant fraction； Ｆｃ）部分とに分かれ、Ｆａｂの可変領域は対象抗原に特異的なイディオタイプ抗原である。形質細胞では１種類の免疫グロブリンしか産生されないため、がん化した形質細胞（骨髄腫細胞）の可変領域部分は腫瘍特異抗原として用いることができる。
【０００６】
既に、本発明者らは、多発性骨髄腫細胞株ＩＭ−９の培養上清よりＩｇＧ可変領域を切り出してイディオタイプ抗原とし、ＩＭ−９細胞とＨＬＡ−Ａが合致したボランティアの単球より誘導した樹状細胞を感作した後、同じボランティアから得たリンパ球と共培養した実験系において、増殖したリンパ球が骨髄腫細胞株ＩＭ−９に対する細胞傷害性を有することを証明した（非特許文献１および２）。すなわち、多発性骨髄腫において、比較的簡単に精製できる免疫グロブリンＦａｂ領域を抗原として樹状細胞を感作することにより、腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を効率的に誘導できる可能性があることが証明されている。
【０００７】
しかし、免疫グロブリンは患者体内に大量に存在しているため、がん抗原として感作されにくいことが予想される。そのため、免疫グロブリンを抗原として用いた場合であっても、抗原が特異的に抗原提示細胞へ取り込まれ、かつ同時に抗原提示細胞を活性化できるような方法を開発することにより、より効率的に腫瘍特異的細胞免疫が惹起されるようにすることが望まれている。
【０００８】
尿酸ナトリウム（ＭＳＵ）結晶は、ヒト体内においては体液中に過剰に存在する尿酸が体内で析出することにより形成され、痛風発作と呼ばれる特異的な関節炎症状を引き起こす物質である。ＭＳＵ結晶は２〜２０μmの長針状または桿状の形状を示し、結晶表面は不規則であり、空間の充填が乏しく催炎性が強いとされる表面構造を示す。結晶表面は陰性荷電を持ち、ＩｇＧを中心とした免疫グロブリンやリポタンパクの付着が認められ、ＩｇＧは陽性に荷電しているＦａｂ部分でＭＳＵ結晶と結合しているとされている（非特許文献３）。
【０００９】
近年、ＭＳＵ結晶が局所における免疫反応の重要物質として働いていると考えられるようになってきた。例えば、Shiらは、局所で傷害された細胞から放出された尿酸が内因性の危険信号（danger signal）として樹状細胞に働くこと、および予め形成させたＭＳＵ結晶をインビボ注射するとアジュバント活性が見られることを報告した(非特許文献４)。また、Huらは、尿酸濃度に依存して免疫拒絶反応が高まることやＭＳＵ結晶の皮下投与により異種移植片の拒絶反応が促進されることを報告した(非特許文献５)。
【００１０】
しかし、ＭＳＵ結晶を特定の抗原と予め結合させることは記載されていない。
【非特許文献１】酒巻一平、上田孝典、高澤ゆみえ、岩崎博道、稲井邦博、津谷 寛：「Ｆａｂを抗原としたmyeloma cell lineに対するallogenic ＣＴＬの誘導」。第６５回日本血液学会総会・第４５回日本臨床血液学会総会、2003.8. 臨床血液 44(8)，874，2003,8。
【非特許文献２】Sakamaki, I., Inai, K., Takazawa, Y., Tsutani, H., ＊Ueda, T.：Clonal expansion of TCR V beta repertoires in CD8 and CD4 T cells in response to idiotype protein. American Association for Cancer Research 95th Annual Meeting,Abstract. 45, 294-295, 2004,3.
【非特許文献３】Kozin F. et al., J Lab Clin Med. 1980
【非特許文献４】Shi et al., Nature 425:516-521 (2003)
【非特許文献５】Hu et al., Cancer Res. 64:5059-5062 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、がん特異的免疫療法において、効率よくがん特異的抗原を細胞傷害性リンパ球に認識させるための方法および試薬（担体）、ワクチン等を提供することを目的とする。特に、体内に大量に存在している免疫グロブリンをがん特異的抗原として用いた場合であっても抗原が特異的に効率よく抗原提示細胞へ取り込まれ、かつ同時に抗原提示細胞を活性化することを可能にする方法および試薬（担体）、ワクチン等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ＭＳＵ結晶を抗原担体として用いることにより上記目的が達成されることを見い出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明により、
〔１〕 イディオタイプ抗原と尿酸塩結晶からなる担体とからなる複合体を含むことを特徴とするイディオタイプワクチン；
〔２〕 イディオタイプ抗原が、多発性骨髄腫細胞によって産生される免疫グロブリンまたは可変領域を含むその一部である、前記〔１〕記載のイディオタイプワクチン；
〔３〕 尿酸塩結晶が、針状結晶を超音波処理したものである、前記〔１〕または〔２〕記載のイディオタイプワクチン；
〔４〕 前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載のイディオタイプワクチンを製造する方法であって、イディオタイプ抗原と尿酸塩結晶とを一緒にして静置することによりイディオタイプ抗原と尿酸塩結晶との複合体を形成させる工程を含む方法；
〔５〕 前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載のイディオタイプワクチンを用いて樹状細胞を刺激し、この樹状細胞を用いて細胞傷害性Ｔ細胞を刺激することを特徴とする、特異的細胞傷害性Ｔ細胞の免疫応答を促進する方法；
〔６〕 前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載のイディオタイプワクチンを製造するための担体であって、尿酸ナトリウム結晶からなる担体、が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のイディオタイプ抗原用担体は、樹状細胞にイディオタイプ抗原を効率的に取り込ませることができる。さらに、本発明のイディオタイプ抗原用担体を使用することにより、抗原の取り込み促進と同時に樹状細胞を活性化することができる。すなわち本発明の担体は、抗原取り込み能の優れた未熟樹状細胞に抗原を取り込ませると同時に、従来使用されてきた各種の成熟化物質を使用することなしに抗原提示能の優れた成熟樹状細胞への成熟化を行なうことができるので、非常に有利である。その結果、本発明のイディオタイプ抗原用担体を用いたイディオタイプワクチンは非常に有効性が高く、腫瘍特異的免疫療法が成功する可能性が高くなると期待される。また、本発明のイディオタイプ抗原用担体は生体内に存在しうる物質に基づいているため、予測できない副作用を引き起こす危険がなく、安全性が高い。したがって、本発明の担体に腫瘍由来のイディオタイプ抗原を結合させた複合体は、がんワクチン（抗がん剤）として使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の担体は、尿酸塩結晶からなる。尿酸塩結晶としては各種の形状のものが知られているが、どのような形状のものであってもよく、また、結晶は、公知のいずれの方法で作製してもよい。一般的には、水に難溶性の尿酸をアルカリや加熱により溶解して尿酸を含む溶液を用意し、静置して冷却することにより結晶を析出させる。
【００１６】
結晶のサイズは小さい方が細胞による取り込みのために有利である。例えば、結晶は、貪食されやすいように樹状細胞より小さいサイズ、例えば直径１０μm以下のサイズであることが好ましい。細かい結晶を得るためには、いったん製造した結晶を超音波処理等によって破砕してもよい。この場合、破砕のしやすさの点からは、針状結晶のみまたは針状結晶を主に含む結晶を使用することが好ましい。
【００１７】
尿酸塩として特に好ましいのは尿酸ナトリウム（ＭＳＵ）および尿酸水素ナトリウムであり、最も好ましいのは尿酸一ナトリウム一水和物である。痛風結節内など生体内の尿酸塩結晶は尿酸水素ナトリウムであり、さらに結晶水１分子を含み、尿酸一ナトリウム一水和物が形成される(非特許文献３)。ＭＳＵ結晶は、ピロリン酸カルシウム結晶やヒドロキシアパタイトとともに結晶誘発性関節炎の原因物質であり、催炎性が最も強い結晶である。また、生体への安全性、作製の容易性等の点からも、担体として最も好ましい。
【００１８】
また、本発明の担体は、タンパクとの結合能および樹状細胞の感作能等の機能を保持する範囲内で、適宜修飾または改変されていてもよい。
【００１９】
尿酸塩結晶は、陰性に荷電していることが知られている。したがって、本発明の担体は、陽性に荷電している免疫グロブリンＦａｂ部分と電気的に結合するという物理的特性を有する。本発明のイディオタイプワクチンは、このようにして結合した本発明の尿酸塩結晶からなる担体とイディオタイプ抗原とからなる複合体を含む。本発明のイディオタイプワクチンに含まれるイディオタイプ抗原としては、少なくとも可変領域を含むタンパクまたはポリペプチドであればよく、例えば免疫グロブリン全体、または可変領域を含む部分、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、軽鎖、重鎖、および重鎖のＦａｂ部分が挙げられる。ワクチン用として、免疫グロブリンは、ＩｇＧが好ましいが、場合によってはそれ以外の免疫グロブリン等またはそれらに由来する部分であってもよい。このような抗体の調製および抗体フラグメントの調製は当業者には充分公知である。
【００２０】
本発明のイディオタイプワクチンは、多発性骨髄腫を代表とするモノクローナルタンパクを産生する腫瘍などに対して治療目的で適用しうる。したがって、イディオタイプ抗原は、多発性骨髄腫等の患者の血液等から得ることができる。
【００２１】
本発明の担体と、イディオタイプ抗原とを結合させることによりそれらの複合体が得られる。担体と抗原との結合は、適当量の両者を混合して静置するだけで容易に起こすことができる。例えば、尿酸塩結晶：Ｆａｂを重量比０．１：１〜４：１程度でリン酸緩衝生理食塩水中で混合し、４℃〜室温程度で１〜４８時間静置することにより複合体が形成される。特定の条件下での最適な複合体形成条件は後述する方法などによって適宜決定することができる。
【００２２】
本発明のイディオタイプワクチンは、患者に直接投与することができる。投与経路としては、特に制限はないが、非経口経路が好ましく、一般的には皮内投与であり、リンパ節近傍の皮内に投与することが好ましい。したがって、本発明のイディオタイプワクチンは、イディオタイプ抗原と本発明の担体との複合体を含むほか、製造過程で使用されるリン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、塩酸などの緩衝剤とpH調整用試薬が添加されていてもよく、さらに投与経路や剤型等によって必要に応じてベンジルアルコールなどの無痛化剤、乳糖水和物、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−グルタミン、ゼラチンなどの安定剤、フェノール、ホルマリンなどの不活化剤など製剤分野で公知の成分を含んでいてもよい。また、他の抗がん剤等と組み合わせてもよい。
【００２３】
投与量は、患者の状態、投与経路、投薬スケジュール等によって変動するが、一般的には、抗原量として１．０〜２０．０μg/kg体重程度、担体量として２．０〜４０．０μg/kg体重程度（抗原と担体との複合体の量として３．０〜６０．０μg/kg体重）である。このような尿酸塩結晶の投与量は、ごく少量のため痛風患者の皮膚局所でみられる痛風結節のＭＳＵ結晶量の２万分の１〜１０００分の１程度に相当し、肉眼的に認識できる痛風結節を作ることもなく、そもそも皮膚ではみることはない痛風発作も当然惹起されることはないと考えられる。また例えすべて溶解し血液中内に移行したとしても血清尿酸値を０．００２５〜０．０５mg/dl上昇させる程度であり、担体の投与が尿酸塩結晶の組織への沈着を促進するとは考えられない。したがって、尿酸塩結晶による副作用の可能性はほとんどないと考えられる。
【００２４】
また、本発明のイディオタイプワクチンは、直接投与せずに、体外で本発明のイディオタイプワクチンで樹状細胞を感作することにより、がん細胞を標的とする樹状細胞を産生したり、さらにはこの樹状細胞を用いて特異的ＣＴＬを誘導したりするために使用することができる。このような樹状細胞またはＣＴＬを患者に与えることによっても腫瘍の治療を行なうことができる。
【実施例】
【００２５】
１．尿酸ナトリウム（ＭＳＵ）結晶担体の作製（１）
尿酸ナトリウム結晶を、MaCartyらの方法（Lancet 2:682, 1962）に基づいて以下のようにして作製した。
【００２６】
尿酸（ナカライテスク（株）、京都）３３６mgに蒸留水４０mLおよび水酸化ナトリウムを０．０８０mg加えて攪拌した。さらに蒸留水を加えて８０mLとし、加熱沸騰させて尿酸を完全に溶解させた。加熱を終了し、再び溶液量を８０mLに調整し（尿酸濃度４２０mg/dL）、自然冷却下で４５℃となったところでろ過滅菌した（商品名「ステリカップ‐ＧＰフィルターユニット」、日本ミリポア（株）、東京)。ろ過液を速やかに１．５mL容の滅菌済みマイクロチューブに分注し、４℃で５日間以上保存して、針状結晶の生成を最大限に促した。この間、ウリカーゼ・ペルオキシダーゼ法を用いて溶液中の尿酸濃度の減少を経時的にモニタリングした。その結果を図１に示す。
【００２７】
生成した尿酸ナトリウム（ＭＳＵ）結晶を、樹状細胞による貪食を容易にするために、イディオタイプ抗原と結合させる直前に１０μm以下になるように破砕した。閉式超音波細胞破砕装置（バイオラプターＵＣＷ２００ＴＭ、東湘電気（株）、横浜）を用い、２００Wにて３０秒間処理を１回とし、計４回断続して無菌的に上記低温保存しＭＳＵ結晶が析出したマイクロチューブを処理し、マイクロチューブ内のＭＳＵ結晶を細かくした。
【００２８】
この操作における破砕の進行状況を顕微鏡観察した（倍率１００倍）。結果を図２に示す。３０秒間の破砕（パネルＤ）で、きれいな断片化が行なわれたが、６０秒間（パネルＥ）では断片サイズが３０秒間より大きそうなものも含まれていたため、安定的に破砕が完了する１２０秒間（３０秒オン、３０秒オフのサイクルを４回；パネルＦ）を標準的に使用する破砕条件とした。
【００２９】
破砕後の溶液を７，０００×gでフラッシングした後、沈降させた結晶を０．１Mリン酸緩衝食塩水(pH７．０)で洗浄して、最終的に同液に沈降させて、イディオタイプ抗原用担体とした。
【００３０】
２．ＭＳＵ結晶担体の作製（２）
０．１Mリン酸緩衝食塩水（pH７．４）８０mLに尿酸１００mgを加えて加熱沸騰させて尿酸を完全に溶解させた。加熱を終了し、再び溶液量を８０mLに調整し、自然冷却下で４５℃となったところでろ過滅菌した（ステリカップ-ＧＰ フィルターユニット、日本ミリポア（株）、東京)。ろ過液を速やかに１．５mLの滅菌済みエッペンチューブに分注し、４℃で５日間以上保存して、針状結晶の生成を最大限に促した。
【００３１】
その後は上記と同様にしてイディオタイプ抗原用担体を調製した。
【００３２】
３．イディオタイプ抗原の作製
ＩｇＧ型多発性骨髄腫の患者血清０．５〜１．０mL（ＩｇＧ ４０mg相当）を採取し、０．１Mリン酸緩衝食塩水(pH７．４)で希釈して、同液にて予め充足させてあるＰｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（商品名「Hitrap protein G 1mL」、アマシャム ファルマシア バイオテク（株）、東京）に注入し、吸着させた。さらに０．１Mリン酸緩衝食塩水(pH７．０)を注入して非吸着成分をカラムより洗い出した。１M グリシン−塩酸緩衝液(pH２．７)３mLを注入して、吸着していたＩｇＧを溶出させ、溶出液に１Mトリス−塩酸緩衝液(pH９．０)を加えてpHを７．４程度に調整した。
【００３３】
溶出させたＩｇＧを、０．１２mg/mLシステインおよび２mM ＥＤＴＡナトリウム(pH７．４)混合液中で０．２５mg/mLパパイン（MERCK社、Darmstadt, Germany）を用いて、３７℃にて１２時間孵置することにより、ＩｇＧをＦａｂ部分とＦｃ部とに切断した。その後、１０．８mMヨードアセタミドで反応を停止した。
【００３４】
プロテインＡカラム（商品名「Hitrap protein A 5mL」、アマシャム ファルマシア バイオテク（株）、東京）に注入してＦｃ部分および消化されていないＩｇＧを吸着し、さらに０．１Mリン酸緩衝食塩水(pH７．４)を注入して非吸着成分であるＦａｂ部分を採取した。次に、遠心濃縮（商品名「アミコンウルトラ‐４ 遠心式フィルターユニット」、日本ミリポア（株）、東京）した後、０．１Mリン酸緩衝食塩水(pH７．４)を透析液として透析膜(ミリポア０．０２５μM ＶＳＷＰ ２５mm、日本ミリポア（株）、東京)を用いたDrop Dialysis法にて９０分間透析し、さらに滅菌済シリンジ加圧式フィルターユニット（商品名「マイレクス−ＧＶ」、０．２２μm、ＰＶＤＦ、日本ミリポア（株）、東京)を通してろ過滅菌し、イディオタイプ抗原液とした。
【００３５】
４．複合体の形成（１）
一定量のイディオタイプ抗原（Ｆａｂ）を含む溶液を用いて、ＭＳＵ結晶担体量と吸着したＦａｂタンパク量との関係を調べた。
【００３６】
上記１で作製したＭＳＵ結晶担体０〜３６０μgが入ったマイクロチューブに、上記３で作製したイディオタイプ抗原（Ｆａｂ）１００μgを含有する０．１Mリン酸緩衝生理食塩水１００μLを加え、４℃にて２４時間静置した。この溶液を７，０００×ｇでフラッシングした後に、上清のタンパク濃度をピロガロールレッド法（商品名「マイクロＴＰ−テスト」、和光純薬（株）、東京）で測定した。
【００３７】
結果を図３に示す。添加ＭＳＵ結晶担体量が多いほど緩衝液中のタンパク量は少なくなり、ＭＳＵ結晶担体がＦａｂタンパクを吸着していることが推測された。また、ＭＳＵ結晶担体１００μgではおよそ５０μgのＦａｂタンパクが吸着していることが計算より推定されるため、０．１Mリン酸緩衝生理食塩水１００μL中では、１００μgのＭＳＵ結晶担体に対して倍量のＦａｂタンパクを加えることにより、ＭＳＵ結晶担体が５０μg以上のＦａｂタンパクの吸着を確保できると考えられた。
【００３８】
５．複合体の形成（２）
結合の様子を確認するために、上記１と同様に作製したイディオタイプ抗原用担体混濁液４００μ1（ＭＳＵ結晶１．４mg相当；但し、３０秒間の超音波処理を行ったもの）を、マウスＦＩＴＣ標識ＩｇＧ・Ｆ（ａｂ’）２（ダコ・ジャパン、京都）１００μLと、あるいは等量の上記３の方法でマウスＦＩＴＣ標識ＩｇＧ・Ｆ（ａｂ’）２より作製したマウスＦＩＴＣ標識ＩｇＧ・Ｆａｂと混合し、４℃で１時間静置した。希塩酸液（pH６．５〜７．０）で３回洗浄し、光学顕微鏡下でＭＳＵ結晶の透過像を得た後で、励起波長４８８nmによる蛍光顕微鏡像を観察した。
【００３９】
無添加のＭＳＵ結晶は輪郭のみが識別できるのみで蛍光顕微鏡下で無色透明であった（結果は示さず）。一方、マウスＦＩＴＣ標識ＩｇＧ・ＦａｂまたはマウスＦＩＴＣ標識ＩｇＧ・Ｆ（ａｂ’）２を混合したＭＳＵ結晶は、蛍光検鏡下で緑色に輝いて見えた。図４、パネルＡ、ＢにＭＳＵ結晶担体とマウスＦＩＴＣ標識ＩｇＧ・Ｆａｂとの結合を、またパネルＥ、ＦにマウスＦＩＴＣ標識ＩｇＧ・Ｆ（ａｂ’）２との結合の結果を示す。パネルＡ、Ｅは光学顕微鏡像、パネルＢ、Ｆは蛍光顕微鏡像と光学顕微鏡像との結合像である。さらに、あらかじめＭＳＵ結晶を牛胎児血清と混合した後にＭＳＵ結晶担体とマウスＦＩＴＣ標識ＩｇＧ・Ｆａｂと混合すると、蛍光顕微鏡下での緑色の輝きは減弱した。
【００４０】
６．単球よりの未熟樹状細胞の作製
健常人ドナーよりヘパリン採血し、「RosetteSep Human Monocyte Enrichment Cocktail」（商品名；StemCell Technologies Inc, Vancouver, Canada)を用いて単球を取り出した。この単球（末梢血単球）を、ＧＭ−ＣＳＦ(PEPRO TECH INC, Rocky Hill, NJ)（１００ng/mL）、ＩＬ−４(PEPRO TECH EC, London, UK)（１００ng/mL）を加えた１０％ＡＢ血清含有ＲＰＭＩ１６４０培養液にて３７℃、５％ＣＯ２で６日間培養し、未熟樹状細胞を作製した。
【００４１】
７．尿酸塩結晶による樹状細胞の成熟化
２０μgの上記３で作製したイディオタイプ抗原（Ｆａｂ）と２０μgの上記１で作製したＭＳＵ結晶担体とを４℃、３時間静置して複合体を形成させた後、未熟樹状細胞（１×１０５個/ウェル）と１００μLの１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培養液中で４８時間培養した。同様に、未熟樹状細胞のみを４８時間培養した。これらの樹状細胞について、成熟化の指標であるＣＤ８３の発現強度を、ＰＥ標識した抗ＣＤ８３抗体（PE COULTER；Coulter-Immunotec, Krefeld, Germany）を用いてフローサイトメトリー（ＥＰＩＣＳ）(Coulter-Immunotec, Krefeld, Germany)にてsingle color条件にて測定した。
【００４２】
結果を図５に示す。あらかじめ尿酸塩結晶担体と抗原との複合体と共培養した樹状細胞のＣＤ８３発現強度（パネルＢ）は、樹状細胞のみで培養したもののＣＤ８３発現強度（パネルＡ）よりも明らかに高かった。したがって、尿酸塩結晶担体と抗原との複合体は未熟樹状細胞の成熟を促進することが確認された。
【００４３】
樹状細胞は、未熟な状態では抗原の取り込みには優れているが、抗原提示能、Ｔ細胞への刺激能については成熟樹状細胞の方が優れていると考えられている。樹状細胞の成熟化を促すために、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６といったサイトカインやプロスタグランディンＥ２、またピシバニール等の使用が報告されているが、尿酸塩結晶担体と抗原との複合体を用いることで、抗原タンパクの取り込みと同時に樹状細胞を成熟化させることができ、また上記のような成熟化物質を使用することなしに抗原提示能を上昇させることができることがわかった。
【００４４】
８．自己Ｔ細胞増殖試験
上記６におけるのと同様に、２０μgの上記３で作製した患者由来ＩｇＧのＦａｂと２０μgのＭＳＵ結晶担体とを４℃、３時間静置後、１×１０５個の未熟樹状細胞と４８時間共培養した。また、Ｆａｂタンパクのみ、尿酸塩結晶のみ、のいずれかを添加し、または刺激なしで、未熟樹状細胞と４８時間培養した。このうちのそれぞれ１×１０４個の樹状細胞に対して１×１０５個のＴ細胞を混合し、１００μL/ウェルで５日間培養した。
【００４５】
これら樹状細胞を冷ＰＢＳにて２回洗浄後、同じ健常人ドナーより「RosetteSep Human T cell Enrichment Cocktail」（商品名；StemCell Technologies Inc, Vancouver, Canada）を用いて採取したＴ細胞（１×１０６/mL ＣＤ３陽性細胞＞９５％）とともに、Ｔ細胞：樹状細胞の細胞数の比が１０：１となるようにして（すなわち１×１０４個の樹状細胞に対して１×１０５個のＴ細胞）、最終的に１００μLとなるように９６ウェル平底プレートにて１０％ＡＢ血清含有ＡＩＭ−Ｖ培養液（SIGMA）で５日間培養した。Ｔ細胞の増殖は、「CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay」（商品名；Promega, WI, USA）を用いて測定した。増殖比率（Stimulation Index；ＳＩ）を、樹状細胞と共培養したＴ細胞の各ウェルの測定値／樹状細胞で刺激しないＴ細胞の測定値として計算した。各データは３人の健常人の結果の平均±標準偏差で示した。
【００４６】
結果を、図６に示す。尿酸塩結晶担体とＦａｂタンパクとの複合体と共培養した樹状細胞で刺激したＴ細胞の増殖（カラムＡ；ＳＩ＝２．４４±０．１５）は、Ｆａｂのみと共培養した樹状細胞で刺激したＴ細胞の増殖（カラムＣ；ＳＩ＝１．７３±０．２４）に比して優位に高かった。尿酸塩結晶のみと共培養した樹状細胞で刺激したＴ細胞の増殖（カラムＢ；ＳＩ＝２．２７±０．２３）は、樹状細胞のみで刺激したＴ細胞の増殖（カラムＤ；ＳＩ＝１．２９±０．１３）に比して優位に高かった。
【００４７】
９．細胞傷害性試験
ＨＬＡ−Ａ２陽性の健常人ドナーより「RosetteSep Human Monocyte Enrichment Cocktail」（StemCell Technologies Inc）を用いて単球を取り出し、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ng/mL）、ＩＬ−４（１００ng/mL）を加えた１０％ＡＢ血清含有ＲＰＭＩ１６４０培養液にて３７℃、５％ＣＯ２で６日間培養し、未熟樹状細胞を作製した。
【００４８】
ＨＬＡ−Ａ２陽性のＩｇＧ産生骨髄腫細胞株ＩＭ−９の培養上清より上記３と同様にして同株細胞が分泌した単クローン性ＩｇＧを精製した後、Ｆａｂ領域を切り出してイディオタイプ抗原（Ｆａｂタンパク）を作製した。このＦａｂタンパクと上記１または２で作製した尿酸塩結晶担体とを結合させてから４８時間共培養した樹状細胞（Ａ）、共培養の際に用いるＦＢＳ(ウシ血清)と尿酸結晶担体とを結合させてからＦａｂと共に共培養した樹状細胞(Ｆａｂと尿酸結晶担体とを結合させずにＤＣと共培養するモデル)（Ｂ）、Ｆａｂのみと４８時間共培養した樹状細胞（Ｃ）、樹状細胞のみ（Ｄ）を用いて、同じドナーより採取したＴ細胞を上記７と同様にして刺激した。７日間培養後、再度同様に樹状細胞にて刺激し、さらに７日間培養後、「ＭＡＣＳ」（商品名；Miltenyi Biotec, Bergisch Glanbach, Germany）を使用してＣＤ８陽性細胞を取り出した。ＣＤ８陽性細胞：腫瘍細胞を５：１として（すなわち１×１０４個の腫瘍細胞に対してＣＤ８陽性細胞を１×１０５個）混合して１００μL中で４時間培養後、「CytoTox 96」（登録商標）Non-Radioactive Cytotoxicity Assay（Promega, WI, USA）にてＩＭ−９細胞に対するＴ細胞の細胞傷害性を測定した。
【００４９】
結果を図７に示す。尿酸塩結晶担体とＦａｂタンパクとの複合体と共培養した樹状細胞によって誘導したＣＤ８陽性細胞のＩＭ−９に対する細胞傷害性は、他に比して有意に高かった。特に尿酸結晶担体とＦａｂを結合させずに共培養したものに比して尿酸塩結晶担体とＦａｂタンパクとの複合体と共培養した樹状細胞によって誘導したＣＤ８陽性細胞のＩＭ−９に対する細胞傷害性は有意に高く、抗原タンパクと尿酸結晶をあらかじめ結合させておくことがＣＴＬを効率的に誘導するのに必要であることが示された。したがって、本発明のイディオタイプワクチンは、腫瘍細胞を標的とするＣＴＬを効率的に誘導することが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、溶液からのＭＳＵ結晶の経時的な生成を示す図である。縦軸は溶液中の尿酸濃度（mg/dL）、横軸は時間（hr）を表す。
【図２】図２は、ＭＳＵ結晶の破砕を示す写真（光学顕微鏡、倍率１００倍）である。パネルＡは処理前、パネルＢ〜Ｆはそれぞれパネルの左下に示した時間、超音波処理を行なったサンプルの顕微鏡像である。
【図３】図３は、一定量のイディオタイプ抗原（Ｆａｂ）を含む溶液を用いて、ＭＳＵ結晶担体量と吸着したＦａｂタンパク量との関係（ＭＳＵ結晶添加によるＦａｂ溶液中におけるタンパク濃度の変化）を示す図である。
【図４】図４は、ＭＳＵ結晶とＦａｂとの結合を示す写真である。パネルＡ、Ｃ、Ｅは光学顕微鏡像、パネルＢ、Ｄ、Ｆは蛍光顕微鏡像と光学顕微鏡像との結合像である（倍率１００倍）。パネルＡ、ＢはＭＳＵ結晶担体とマウスＦＩＴＣ標識ＩｇＧ・Ｆａｂとの結合を、パネルＣ、ＤはあらかじめＭＳＵ結晶を牛胎児血清と混合した後にＭＳＵ結晶担体とマウスＦＩＴＣ標識ＩｇＧ・Ｆａｂとを結合させた結果を、パネルＥ、ＦはＭＳＵ結晶担体とマウスＦＩＴＣ標識ＩｇＧ・Ｆ（ａｂ’）２とを結合させた結果を、それぞれ観察したもの。各パネルの右下のバーは５０μm。
【図５】図５は、ＭＳＵ結晶による樹状細胞の成熟を示す図である。左パネル（Ａ）は対照（ＭＳＵ結晶の添加なし）、右パネルはＭＳＵ結晶添加（Ｂ）の結果（フローサイトメーターで検出した樹状細胞のＣＤ８３の発現量）である。
【図６】図６は、本発明のイディオタイプワクチンを取り込ませた樹状細胞の自己リンパ球増殖刺激作用を示す図である。Ａ＝本発明のイディオタイプワクチン（ＭＳＵ結晶担体とＦａｂとの複合体）、Ｂ＝ＭＳＵ結晶担体のみ、Ｃ＝Ｆａｂのみ、Ｄ＝添加物なし（樹状細胞のみ）で、それぞれ培養した樹状細胞を用いてＴ細胞を誘導したもの。（Ｎ＝３）
【図７】図７は、本発明のイディオタイプワクチンで誘導されたＣＴＬの骨髄性株細胞に対する細胞傷害性を示す図である。Ａ＝本発明のイディオタイプワクチン、Ｂ＝ＭＳＵ結晶担体をあらかじめＦＢＳでブロックしたものとＦａｂの混合物（ＦａｂとＭＳＵ結晶担体とを結合させずにＤＣと共培養するモデル）、Ｃ＝Ｆａｂのみ、Ｄ＝添加物なしで、それぞれ培養した樹状細胞を用いてＴ細胞を誘導したもの。（Ｎ＝３）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イディオタイプ抗原と尿酸塩結晶からなる担体とからなる複合体を含むことを特徴とするイディオタイプワクチン。
【請求項２】
イディオタイプ抗原が、多発性骨髄腫細胞によって産生される免疫グロブリンまたは可変領域を含むその一部である、請求項１記載のイディオタイプワクチン。
【請求項３】
尿酸塩結晶が、針状結晶を超音波処理したものである、請求項１または２記載のイディオタイプワクチン。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のイディオタイプワクチンを製造する方法であって、イディオタイプ抗原と尿酸塩結晶とを一緒にして静置することによりイディオタイプ抗原と尿酸塩結晶との複合体を形成させる工程を含む方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項記載のイディオタイプワクチンを用いて樹状細胞を刺激し、この樹状細胞を用いて細胞傷害性Ｔ細胞を刺激することを特徴とする、特異的細胞傷害性Ｔ細胞の免疫応答を促進する方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載のイディオタイプワクチンを製造するための担体であって、尿酸ナトリウム結晶からなる担体。
【請求項１】
イディオタイプ抗原と尿酸塩結晶からなる担体とからなる複合体を含むことを特徴とするイディオタイプワクチン。
【請求項２】
イディオタイプ抗原が、多発性骨髄腫細胞によって産生される免疫グロブリンまたは可変領域を含むその一部である、請求項１記載のイディオタイプワクチン。
【請求項３】
尿酸塩結晶が、針状結晶を超音波処理したものである、請求項１または２記載のイディオタイプワクチン。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のイディオタイプワクチンを製造する方法であって、イディオタイプ抗原と尿酸塩結晶とを一緒にして静置することによりイディオタイプ抗原と尿酸塩結晶との複合体を形成させる工程を含む方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項記載のイディオタイプワクチンを用いて樹状細胞を刺激し、この樹状細胞を用いて細胞傷害性Ｔ細胞を刺激することを特徴とする、特異的細胞傷害性Ｔ細胞の免疫応答を促進する方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載のイディオタイプワクチンを製造するための担体であって、尿酸ナトリウム結晶からなる担体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００８−１７４４６６（Ｐ２００８−１７４４６６Ａ）
【公開日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−７５６１（Ｐ２００７−７５６１）
【出願日】平成１９年１月１７日（２００７．１．１７）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【出願人】（５０４１４５３２０）国立大学法人福井大学 (287)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月１７日（２００７．１．１７）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【出願人】（５０４１４５３２０）国立大学法人福井大学 (287)
【Ｆターム（参考）】
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