本発明は、MDCK細胞などのイヌ細胞中での核酸配列の発現にとって有用な新規イヌpol I調節核酸配列を提供する。本発明はさらに、そのような核酸を含む発現ベクターおよび細胞ならびに感染性インフルエンザウイルスなどの、インフルエンザウイルスを作製するためのそのような核酸の使用方法を提供する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌRNAポリメラーゼI調節配列を含む単離された核酸。
【請求項２】
前記調節配列がプロモーターである、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記RNAポリメラーゼI調節配列が、配列番号26のヌクレオチド1〜469、その相補体、その逆相補体、またはその機能的に活性な断片を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
前記調節配列が、マイナス鎖ウイルスゲノムRNAまたは対応するcRNAをコードするcDNAに機能し得る形で連結されている、請求項１、２または３に記載の核酸。
【請求項５】
前記核酸が、転写終結配列をさらに含む、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
前記マイナス鎖ウイルスゲノムRNAがインフルエンザゲノムRNAである、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項８】
細胞中で請求項６に記載の核酸を転写させることによって、インフルエンザゲノムRNAを製造することを含む、インフルエンザゲノムRNAの製造方法。
【請求項９】
請求項７に記載の発現ベクターならびにPB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1、およびNS2からなる群より選択される1種以上のインフルエンザポリペプチドをコードするmRNAを発現する1個以上の発現ベクターを含むイヌ細胞を培養すること；ならびに組換えインフルエンザウイルスを単離することを含む、組換えインフルエンザウイルスの製造方法。
【請求項１０】
(a)イヌ細胞の集団中に、該細胞中でインフルエンザウイルスの完全なゲノムvRNA断片を提供するゲノムvRNA断片を発現することができる発現ベクターであって、配列番号２６のヌクレオチド1〜469、またはその機能的に活性な断片を含む前記ベクターを導入すること；(b)該細胞中に、該ウイルスの1種以上のポリペプチドをコードするmRNAを発現することができる発現ベクターを導入すること；ならびに(c)該細胞を培養することによって、インフルエンザウイルス粒子を産生させることを含む、組換えインフルエンザウイルスの製造方法。
【請求項１１】
48〜72時間、前記細胞を培養する際に産生されたインフルエンザウイルス粒子の力価が、少なくとも1.0 x 10⁴PFU/mlである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
48〜72時間、前記細胞を培養する際に産生されたインフルエンザウイルス粒子の力価が、少なくとも1.0 x 10⁵PFU/mlである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
産生されるインフルエンザウイルス粒子が感染性である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
産生されるインフルエンザウイルス粒子が感染性である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
請求項７に記載の発現ベクターを含む細胞。
【請求項１６】
前記細胞はイヌ細胞である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
前記イヌ細胞が腎臓細胞である、請求項１６に記載のイヌ細胞。
【請求項１８】
前記イヌ腎臓細胞がMDCK細胞である、請求項１７に記載のイヌ腎臓細胞。
【請求項１９】
培養されたイヌ細胞中で、4個以上のゲノムvRNA断片を有する組換え断片化されたマイナス鎖RNAウイルスを生成させる方法であって、(a)イヌ細胞の集団中に、該細胞中で該ウイルスの完全なゲノムvRNA断片を提供するゲノムvRNA断片を発現することができる第1の発現ベクターセットを導入すること；(b)該細胞中に、該ウイルスの1種以上のポリペプチドをコードするmRNAを発現することができる第2の発現ベクターセットを導入すること；ならびに(c)該細胞を培養することによって、ウイルス粒子を産生させることを含む、前記方法。
【請求項２０】
組換えインフルエンザウイルスを製造する方法であって、
i)イヌ細胞の集団中に、
a)該細胞中で、該ウイルスの完全なゲノムvRNA断片を提供するゲノムvRNA断片を発現することができる発現ベクターであって、1個以上の該発現ベクターが配列番号26のヌクレオチド1〜469、もしくはその機能的に活性な断片を含む、前記発現ベクター、ならびに、
b)該細胞中で、PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1、およびNS2からなる群より選択される1種以上のインフルエンザポリペプチドをコードするmRNAを発現することもできる発現ベクター、
を導入すること；ならびに、
ii)該細胞を培養することによって、インフルエンザウイルス粒子を産生させること、
を含む、前記方法。
【請求項２１】
前記細胞を48〜72時間培養する際に産生されるインフルエンザウイルス粒子の力価が、少なくとも1.0 x 10⁴PFU/mlである、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞を48〜72時間培養する際に産生されるインフルエンザウイルス粒子の力価が、少なくとも1.0 x 10⁵PFU/mlである、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２３】
請求項２０に記載の方法により製造されたインフルエンザウイルス。
【請求項２４】
ヘルパーウイルスを用いる、請求項１０、１９または２０に記載の方法。
【請求項２５】
配列番号２９に記載の発現ベクターpAD4000。
【請求項２６】
配列番号２６に記載の配列の少なくとも250、または少なくとも350、または少なくとも450個の連続するヌクレオチドを含む単離された核酸配列であって、該核酸配列が、インフルエンザvRNAをコードするcDNAに機能し得る形で連結され、MDCK細胞中に導入された場合、該インフルエンザvRNAの発現を指令することができる、前記核酸配列。
【請求項２７】
配列番号２６に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも80％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸配列であって、該核酸配列が、インフルエンザvRNAをコードするcDNAに機能し得る形で連結され、MDCK細胞中に導入された場合、該インフルエンザvRNAの発現を指令することができる、前記核酸配列。
【請求項２８】
配列番号１〜２６からなる群より選択される核酸に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸配列であって、該核酸配列が、インフルエンザvRNAをコードするcDNAに機能し得る形で連結され、MDCK細胞中に導入された場合、該インフルエンザvRNAの発現を指令することができる、前記核酸配列。
【請求項２９】
請求項２６、２７または２８に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項３０】
細胞中に請求項２９に記載の発現ベクターを導入することによって、インフルエンザゲノムRNAを産生させることを含む、インフルエンザゲノムRNAの製造方法。
【請求項３１】
細胞中に請求項７に記載の発現ベクターを導入することによって、インフルエンザゲノムRNAを産生させることを含む、インフルエンザゲノムRNAの製造方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図９Ｃ】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１４】

【図１５】

【図１６Ａ】

【図１６Ｂ】

【公表番号】特表２００９−５３４０３９（Ｐ２００９−５３４０３９Ａ）
【公表日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０６７５２（Ｐ２００９−５０６７５２）
【出願日】平成１９年４月１８日（２００７．４．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６６８９５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２４３２７
【国際公開日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【出願人】（５０４３３３９７２）メディミューン，エルエルシー (108)
【Ｆターム（参考）】