イムノクロマトグラフ法用試験具
【課題】二種類以上の被検出物質を検出するための複数の判定領域を有するイムノクロマト用試験具であり、非特異反応を抑制して被検出物質を正確に検出する試験具を提供する。
【解決手段】試料を添加する試料添加部材と、第一被検出物質と抗原抗体反応を生じる第一標識物質、及び第二被検出物質と抗原抗体反応を生じる第二標識物質を担持する標識物質保持部材と、第一被検出物質と抗原抗体反応を生じる第一固定用物質を固定化した第一判定領域と、第一判定領域の試料展開方向下流側に第二被検出物質と抗原抗体反応を生じる第二固定用物質を固定化した第二判定領域とを配置したクロマト媒体とを有し、第一被検出物質、第二被検出物質、第一標識物質、第二標識物質、第一固定用物質及び第二固定用物質の何れに対しても抗原抗体反応を生じないタンパク質と、第二固定用物質とによって第二判定領域が形成されるイムノクロマト用試験具を提供する。
【解決手段】試料を添加する試料添加部材と、第一被検出物質と抗原抗体反応を生じる第一標識物質、及び第二被検出物質と抗原抗体反応を生じる第二標識物質を担持する標識物質保持部材と、第一被検出物質と抗原抗体反応を生じる第一固定用物質を固定化した第一判定領域と、第一判定領域の試料展開方向下流側に第二被検出物質と抗原抗体反応を生じる第二固定用物質を固定化した第二判定領域とを配置したクロマト媒体とを有し、第一被検出物質、第二被検出物質、第一標識物質、第二標識物質、第一固定用物質及び第二固定用物質の何れに対しても抗原抗体反応を生じないタンパク質と、第二固定用物質とによって第二判定領域が形成されるイムノクロマト用試験具を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の複数の被検出物質を抗原抗体反応に基づいて検出するイムノクロマトグラフ法を利用した試験具に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、試料中の被検出物質を抗原抗体反応に基づいて免疫学的に検出するための方法として、イムノクロマトグラフ法が知られている。イムノクロマトグラフ法によると、被検出物質に結合可能な固定用抗体をクロマトグラフ担体の一部に固定して判定領域とし、被検出物質と抗原抗体反応を生じる標識抗体と試料とを、クロマトグラフ媒体において毛細管現象によって移動させる。移動してきた試料及び標識抗体を判定領域に接触させることにより、判定領域において被検出物質が標識抗体及び固定用抗体にサンドイッチ状に結合することにより、標識抗体及び被検出物質が判定領域に捕捉される。標識抗体として、抗体を感作した担体粒子（着色したラテックス粒子やコロイド状金属粒子など）を用いた場合、標識抗体が判定領域に捕捉されると判定領域が発色する。イムノクロマトグラフ法においては、このような判定領域の発色を観察することにより試料中の被検出物質の検出を行うことができる。
【０００３】
上記イムノクロマトグラフ法を用いて被検出物質を検出する際、試料中に被検出物質が含まれていない陰性の試料でも陽性と判定してしまうことがある（偽陽性）。偽陽性の原因の一つとして、標識抗体が非特異的に固定用抗体に結合することが挙げられる。このような非特異反応による偽陽性を抑制するため、ブロッキング剤が用いられる（例えば、特許文献１）。この技術によると、クロマトグラフ媒体に固定用抗体を固定した後、クロマトグラフ媒体を、ブロッキング剤を含む緩衝液に浸漬し、さらに乾燥させることによって、非特異反応を抑制することができる。
【０００４】
しかしながら、二種類以上の被検出物質を検出するために複数の判定領域を有するクロマトグラフ媒体を用いた場合は、特許文献１記載の技術を用いても非特異反応を抑制できないことがある。例えば、試料の展開方向から上流側に第一固定用抗体を固定した第一判定領域と、下流側に第二固定用抗体を固定した第二判定領域とを有するクロマトグラフ媒体を用いた場合、第一判定領域において検出される被検出物質を多く含む試料を展開した際に、標識抗体及び被検出物質と結合した第一固定用抗体が第一判定領域から遊離し、下流に位置する第二判定領域に捕捉されることによって、第二判定領域において偽陽性を呈することがある。
【特許文献１】特開平１０−０６８７３０号公報（第００２６欄）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、二種類以上の被検出物質を検出するための複数の判定領域を有するクロマトグラフ媒体を備えたイムノクロマトグラフ法用試験具であり、第一判定領域において検出される被検出物質を多く含む試料を検体として用いた場合においても、非特異反応による偽陽性を抑制して試料中の被検出物質の検出を正確に行うことができるイムノクロマトグラフ法用試験具を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、試料中の第一被検出物質及び第一被検出物質と異なる第二被検出物質を検出するためのイムノクロマトグラフ法用試験具であって、前記試料を添加する試料添加部材と、前記第一被検出物質と抗原抗体反応を生じる第一標識物質、及び前記第二被検出物質と抗原抗体反応を生じる第二標識物質を担持する標識物質保持部材と、前記第一被検出物質と抗原抗体反応を生じる第一固定用物質を固定化した第一判定領域と、前記第一判定領域の試料展開方向下流側に前記第二被検出物質と抗原抗体反応を生じる第二固定用物質を固定化した第二判定領域とを配置したクロマトグラフ媒体とを有し、ブロッキング剤及び前記第二固定用物質によって前記第二判定領域が形成されるイムノクロマトグラフ法用試験具を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によると、ブロッキング剤及び第二固定用物質を用いて第二判定領域を作成することによって、第一固定用物質が第二判定領域に捕捉されることを妨げ、第一判定領域において検出される被検出物質を多く含む試料を検体として用いた場合においても、非特異反応による偽陽性を抑制して試料中の被検出物質の検出を正確に行うことができるイムノクロマトグラフ用試験具が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。
図１は、本発明の一実施形態による試験具１の上面図である。図２は、試験具１の側面図である。試験具１は、イムノクロマトグラフ法を用いて試料中のＡ型及びＢ型インフルエンザウイルスを同時に検出する試験具である。試料としては鼻汁、鼻腔拭い液、咽頭拭い液などが用いられる。図１及び図２の矢印は試料展開方向を示し、試料はこの矢印の方向に展開される。試験具１は、試料展開方向上流側から順に試料添加部材２、標識物質保持部材３、クロマトグラフ媒体４及び吸収部材５を備えている。試料添加部材２はシート状のレーヨンから構成される。標識物質保持部材３及び吸収部材５はそれぞれシート状のグラスファイバーから構成される。クロマトグラフ媒体４はシート状のニトロセルロースから構成される。
【０００９】
標識物質保持部材３は、Ａ型インフルエンザウイルス抗原と結合可能な標識抗Ａ型インフルエンザウイルス抗原抗体（以下、標識抗Ａ型抗体とする）と、Ｂ型インフルエンザウイルス抗原と結合可能な標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗原抗体（以下、標識抗Ｂ型抗体とする）とを保持している。標識抗Ａ型抗体とは、青色に着色されたポリスチレンラテックス粒子によって標識され、Ａ型インフルエンザウイルス抗原に特異的な抗体を示す。標識抗Ｂ型抗体とは、青色に着色されたポリスチレンラテックス粒子によって標識され、Ｂ型インフルエンザウイルス抗原に特異的な抗体のことを示す。
【００１０】
クロマトグラフ媒体４は、Ａ型インフルエンザウイルス抗原と結合可能な固定用抗Ａ型インフルエンザウイルス抗原抗体（以下、固定用抗Ａ型抗体とする）を固定したＡ型インフルエンザウイルス判定領域６ａ（以下、Ａ型判定領域６ａとする）と、Ｂ型インフルエンザウイルス抗原と結合可能な抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗原抗体（以下、固定用抗Ｂ型抗体とする）を固定したＢ型インフルエンザウイルス判定領域６ｂ（以下、Ｂ型判定領域６ｂとする）とを備えている。
【００１１】
図２に示すように、試料添加部材２、標識物質保持部材３、クロマトグラフ媒体４及び吸収部材５は、プラスチック製の基板８に接着されており、それぞれ毛細管現象による試料の展開が途切れることのないように連結されている。標識物質保持部材３の下流側の下面はクロマトグラフ媒体４のＡ型判定領域６ａよりも上流側の上面と接して配置される。試料添加部材２の下流側の下面は標識物質保持部材３の上流側の上面と接して配置される。吸収部材５の上流側の下面はクロマトグラフ媒体４のＢ型判定領域６ｂよりも下流側の上面と接触して配置される。
【００１２】
Ａ型判定領域６ａは、固定用抗Ａ型抗体及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む溶液をドッティングマシーンなどを用いて塗布することにより作製される。これにより、検体として被検出物質を含まない試料（陰性検体）を検体として用いた場合に稀に生じるＡ型判定領域６ａの偽陽性を抑制することができる。
【００１３】
Ｂ型判定領域６ｂは、固定用抗Ｂ型抗体及びＢＳＡを含む溶液をドッティングマシーンなどを用いて塗布することにより作製される。これにより、Ａ型インフルエンザウイルスを多く含む試料を試験具１に展開した場合に、上流からの試料の移動によって固定用抗Ａ型抗体がＡ型判定領域６ａから遊離してＡ型インフルエンザウイルス抗原と共にＢ型判定領域６ｂに捕捉されることを妨げることができ、Ｂ型判定領域６ｂにおける偽陽性を抑制することができる。
【００１４】
なお、本実施形態では、被検出物質はインフルエンザウイルスであるが、被検出物質としては抗原抗体反応を生じる物質であれば特に限定されず、細菌、原生生物や真菌等の細胞、その他のウイルス、タンパク質、多糖類などが挙げられる。例えば、パラインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、マイコプラズマニューモニエ、ロタウイルス、カルシウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、重症急性呼吸器症候群の病原ウイルス、大腸菌、スタフィロコッカスアウレウス、ストレプトコッカスニューモニエ、ストレプトコッカスピヨゲネス、マラリア原虫、その他消化器系疾患、中枢神経径疾患、出血熱等の様々な疾患の病原体、これらの代謝産物、癌胎児性抗原やシフラなどの腫瘍マーカー、ホルモンなどが検出対象となる。上述の病原体及びこれらの代謝産物のうち二種以上の被検出物質を同時に検出して疾患の診断を行うために用いることができるが、同種の被検出物質の型別診断に用いられるのが好ましい。同種の被検出物質の型別診断の例としては、Ａ〜Ｅ型肝炎ウイルスの同時検出や１型及び２型ヒト免疫不全ウイルスの同時検出などが挙げられる。
【００１５】
また、本実施形態では、試料添加部材２はレーヨンからなっているが、試料添加部材２の材質としては毛細管現象を生じる多孔質の吸水性物質であれば特に限定されない。例えば、グラスファイバー、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレンなどを用いることも可能である。
【００１６】
また、標識物質保持部材３及び吸収部材５はグラスファイバーからなっているが、これらの材質としては毛細管現象を生じる多孔質の吸水性物質であれば特に限定されない。例えば、レーヨン、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレンなどを用いることも可能である。
【００１７】
また、クロマトグラフ媒体４はニトロセルロースからなっているが、クロマトグラフ媒体４の材質としては抗原や抗体を固定でき、毛細管現象を生じる多孔質の吸水性物質であり、クロマトグラフィーによって液体を展開できる材質であれば特に限定されない。例えば、ポリビニリデンフロライド、ポリアミド、ポリエーテルスルホンなどを用いることも可能である。
【００１８】
また、本実施形態では、Ａ型判定領域６ａ及びＢ型判定領域６ｂを、ブロッキング剤としてＢＳＡを含有する抗体溶液を用いてそれぞれ作製しているが、この抗体溶液に含有させるブロッキング剤としては、Ａ型インフルエンザウイルス抗原、Ｂ型インフルエンザウイルス抗原、標識抗Ａ型抗体、標識抗Ｂ型抗体、固定用抗Ａ型抗体及び固定用抗Ｂ型抗体の何れに対しても抗原抗体反応を生じないブロッキング剤であれば、特に限定されない。ＢＳＡ以外には、前記ブロッキング剤としてヤギ、トリなどの血清アルブミン、グロブリン、カゼイン、ゼラチン、スキムミルク、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどを例示することができる。また、ＢＳＡの代わりにウシ、ヤギ、トリなどの動物から採取した血清を上述の抗体溶液に添加しても同様の効果を得ることができる。
上述したブロッキング剤の中では、ＢＳＡ、カゼイン、ゼラチン、又はスキムミルクを用いることが好ましい。
【００１９】
また、本実施形態に用いられる抗体としては、被検出物質と結合可能なものであれば特に限定されない。即ち抗体としては、マウスやラットなどの動物に被検出物質を免疫して作製されるポリクローナル抗体でも、ハイブリドーマなどによって産生されるモノクローナル抗体（Kohler & Milstein, 1975, Nature, vol.256, 495）でもよく、これらを単独又は適宜組み合わせて用いることができる。
また、同一の抗原を認識できるものであれば、標識抗Ａ型抗体の抗原結合部と固定用抗Ａ型抗体の抗原結合部とは同一であっても異なっていてもよい。同様に、標識抗Ｂ型抗体の抗原結合部と固定用抗Ｂ型抗体の抗原結合部とは同一であっても異なっていてもよい。
【００２０】
また、本実施形態では、担体粒子としてポリスチレンラテックス粒子を用いているが、抗原又は抗体を感作できる粒子であれば特に限定されない。例えばポリスチレン以外のラテックス粒子、金、銀、白金のようなコロイド状金属粒子、酸化鉄のようなコロイド状金属酸化物粒子などを用いることができる。ラテックス粒子は、種々のモノマーを重合又は共重合させることによって得ることができる。例えば、モノマーとしては、重合性不飽和芳香族類（例えば、クロルスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、ビニルトルエンなど）、重合性不飽和カルボン酸類（例えば、（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマル酸など）、重合性カルボン酸エステル類（例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニルなど）、不飽和カルボン酸アミド類（例えば、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチロール（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、臭化ビニルなど）、重合性不飽和ニトリル類、ハロゲン化ビニル類、共役ジエン類などを例示することができ、これらのうち一種又は二種以上を用いることができる。
【００２１】
また、クロマトグラフ媒体４のＢ型判定領域６ｂよりも下流に、試料が適切に展開されたかどうかを確認するためのコントロール領域を作製してもよい。コントロール領域には、例えば、ビオチン（又はアビジン）を固定することができる。この場合、標識物質保持部材３には有色の担体粒子によって標識されたアビジン（又はビオチン）を保持させる。標識物質保持部材３に保持された標識アビジン（又は標識ビオチン）は、試料が展開されると試料と共に試料展開方向下流にクロマトグラフ的に移動し、コントロール領域に達すると固定されているビオチン（又はアビジン）と結合してコントロール領域に捕捉され、コントロール領域が発色する。この発色を観察することにより試料が適切に展開されたかどうかを確認することができる。
【００２２】
また、試験具１は、図２ａに示すように、試料添加部材２の下流側の下面が標識物質保持部材３の上面全部と接触する構造を有していてもよい。
また、試験具１は、図２ｂに示すように、クロマトグラフ媒体４と標識物質保持部材３とが間隔を介して配置され、試料添加部材２の下面が標識物質保持部材３を覆い、試料添加部材２の下流側の下面がクロマトグラフ媒体４のＡ型判定領域６ａよりも上流側の上面と接触する構造を有していてもよい。
また、試験具１は、図２ｃに示すように、試料添加部材２の下面が標識物質保持部材３の上面全部と接触し、試料添加部材２の下流側の末端がクロマトグラフ媒体４のＡ型判定領域６ａよりも上流側の一部と接触する構造を有していてもよい。
【００２３】
また、本実施形態では、標識抗体及び固定用抗体を用いて試料中の抗原を検出することにより被検出物質の有無を判定するが、標識抗原及び固定用抗原を用いて試料中の抗体を検出することにより被検出物質の有無を判定してもよい。この場合、標識抗原として試料中の抗体と抗原抗体反応を生じる抗原を感作した担体粒子を用い、クロマトグラフ媒体４の判定領域には試料中の抗体と抗原抗体反応を生じる固定用抗原を感作する。
【００２４】
以下、試験具１を用いたＡ型及びＢ型インフルエンザウイルスの検出について説明する。
先ず、生体から採取した試料には、前処理が施される。前処理を施すことによって、インフルエンザウイルスはより検出に適した状態となり、検出感度を高めることができる。前処理は、前処理液に試料を添加し、フィルターで濾過することによって行われる。前処理液としては、非イオン系界面活性剤及びアルカリ金属イオンなどを含む水溶液を用いることができる。
【００２５】
前処理を施された試料（以下、被検試料とする）は試験具１の試料添加部材２に添加される。被検試料が添加されると毛細管現象によって試料添加部材２から下流に向かって移動し、標識物質保持部材３に到達する。被検試料は標識物質保持部材３に担持されている標識抗体と共にクロマトグラフ媒体４に移動する。クロマトグラフ媒体４のＡ型判定領域６ａに被検試料及び標識抗体が到達すると、被検試料中にＡ型インフルエンザウイルスが存在する場合は、Ａ型判定領域においてＡ型インフルエンザウイルス抗原が標識抗Ａ型抗体及び固定用抗Ａ型抗体にサンドイッチ状に結合する。標識抗Ａ型抗体は標識物として青色のポリスチレンラテックス粒子を備えているため、Ａ型判定領域６ａに捕捉されると、Ａ型判定領域６ａは青色に発色する。この発色が観察されるか否かによって、被検試料中のＡ型インフルエンザウイルスの存否を判定できる。同様に、Ｂ型判定領域６ｂに被検試料及び標識抗体が到達すると、被検試料中にＢ型インフルエンザウイルスが存在する場合は、Ｂ型判定領域においてＢ型インフルエンザウイルス抗原が標識抗Ｂ型抗体及び固定用抗Ｂ型抗体にサンドイッチ状に結合する。標識抗Ｂ型抗体は標識物として青色のポリスチレンラテックス粒子を備えているため、Ｂ型判定領域６ｂに捕捉されると、Ｂ型判定領域６ｂは青色に発色する。この発色が観察されるか否かによって、試料中のＢ型インフルエンザウイルスの存否を判定できる。被検試料及び各判定領域に捕捉されなかった標識抗体は、試験具１の最下流に位置する吸収部材５によって吸収される。
【００２６】
＜比較例＞
（クロマトグラフ媒体Ａの作製）
クロマトグラフ媒体Ａにはニトロセルロース膜（日本ミリポア社製）を用いた。
【００２７】
Ａ型判定領域には固定用抗Ａ型インフルエンザ抗原抗体が固定される。ＰＢＳに、固定用抗Ａ型インフルエンザ抗原抗体を２．０ｍｇ／ｍｌ、ＢＳＡを１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含有させて調製した固定用抗Ａ型抗体溶液（ｐＨ７．０）をニトロセルロース膜に線状に塗布し、この線をＡ型判定領域とした。
【００２８】
Ｂ型判定領域には固定用抗Ｂ型インフルエンザ抗原抗体が固定される。上記ニトロセルロース膜のＡ型判定領域よりも下流に、ＰＢＳに固定用抗Ｂ型インフルエンザ抗原抗体を１．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含有させて調整した固定用抗Ｂ型抗体溶液（ｐＨ７．０）を線状に塗布し、この線をＢ型判定領域とした。
【００２９】
なお、固定用Ａ型抗体溶液及び固定用Ｂ型抗体溶液のニトロセルロース膜への塗布は、バイオドット社製ＸＹＺ３０００を用いて行った。
【００３０】
固定用抗Ａ型抗体溶液及び固定用抗Ｂ型抗体溶液をニトロセルロース膜へ塗布した後、ニトロセルロース膜を乾燥させた。その後、ブロッキング溶液（リン酸１ナトリウム、１０ｍＭ；アジ化ナトリウム、０．１ｗ／ｖ％；ＢＳＡ、１．０ｗ／ｖ％；ｐＨ７．０）に浸漬してブロッキング処理を行い、さらに乾燥させ、クロマトグラフ媒体Ａとした。
【００３１】
（標識物質保持部材の作製）
ｐＨ８．０のＰＢＳに平均粒径０．３μｍの青色ポリスチレンラテックス粒子を添加し、さらにグルタルアルデヒドを最終濃度が０．１ｗ／ｖ％となるよう添加し、２５℃で一時間攪拌を行った。攪拌された混合液を遠心して上清を除去し、沈渣にｐＨ８．０のＰＢＳを添加した。次に、ポリスチレンラテックス粒子を分散させ、Ａ型インフルエンザウイルス抗原に結合可能なモノクローナル抗体１００μｇ／ｍｌを添加し、これを２５℃で二時間攪拌した。これを遠心して、上清を除去した。得られた沈渣にＢＳＡを１０ｗ／ｖ％含有するｐＨ８．０のＰＢＳを加え、混和して分散させた後、３７℃で一晩静置した。このようにして調製された混合液を遠心して上清を除去し、沈渣にＢＳＡを５ｗ／ｖ％含有するｐＨ８．０のＰＢＳを添加した。これを混和して分散させた後、０．８μｍメッシュのフィルターで濾過し、得られた濾過液を標識抗Ａ型抗体溶液とした。
【００３２】
標識抗Ｂ型抗体溶液は、Ａ型インフルエンザウイルス抗原に結合可能なモノクローナル抗体に代えて、Ｂ型インフルエンザウイルス抗原に結合可能なモノクローナル抗体を用いること以外、標識抗Ａ型抗体溶液と同様にして調製された。
【００３３】
上記のようにして調製された標識抗Ａ型抗体及び標識抗Ｂ型抗体を１：１の混合比で混合し、これをグラスファイバーに含浸させた後乾燥させ、標識物質保持部材を得た。
【００３４】
（試験具Ａの作製）
図２において、クロマトグラフ媒体４としてクロマトグラフ媒体Ａを用いて試験具Ａを作製した。
【００３５】
＜実施例＞
（クロマトグラフ媒体Ｂ及びＣの作製）
ＢＳＡを１．０ｍｇ／ｍｌ含有する固定用抗Ｂ型抗体溶液を用いてＢ型判定領域を作製すること以外は、クロマトグラフ媒体Ａと同様にしてクロマトグラフ媒体Ｂを作製した。
ＢＳＡを２．０ｍｇ／ｍｌ含有する固定用抗Ｂ型抗体溶液を用いてＢ型判定領域を作製すること以外は、クロマトグラフ媒体Ａと同様にしてクロマトグラフ媒体Ｃを作製した。
【００３６】
（試験具Ｂ及びＣの作製）
図２において、クロマトグラフ媒体４としてクロマトグラフ媒体Ｂを用いて試験具Ｂを作製した。
図２において、クロマトグラフ媒体４としてクロマトグラフ媒体Ｃを用いて試験具Ｃを作製した。
【００３７】
＜固定用抗Ｂ型抗体溶液へのＢＳＡ添加による効果＞
（試験具Ａ〜Ｃを用いたインフルエンザウイルスの検出）
試料としては、Ａ型インフルエンザウイルスもＢ型インフルエンザウイルスも含まれていない試料（陰性試料）、Ａ型インフルエンザウイルス弱陽性試料（試料１）及びＡ型インフルエンザウイルス強陽性試料（試料２）を用いた。
【００３８】
次に、これらの試料に前処理を施した。試料と０．３ｗ／ｖ％のノニデットＰ−４０（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニールエーテルの商品名）を含む前処理液（ｐＨ７．８）とを混合し、試料と前処理液の混合液をフィルターで濾過することによって被検試料を得た。陰性被検試料を前処理したものを陰性被検試料とし、試料１を前処理したものを被検試料１とし、試料２を前処理したものを被検試料２とした。
【００３９】
これらの被検試料をそれぞれ試験具Ａ〜Ｃの試料添加部材に添加し、インフルエンザウイルスの検出を行った。検証結果を表１に示す。
【表１】
【００４０】
表１中、＋の数が多いほど判定領域において発色が強いことを示し、即ち陽性の程度が強いことを示す。
−は判定領域において発色が観察されなかったことを示し、即ち陰性であることを示す。
【００４１】
表１より、何れの試験具を用いても陰性被検試料を検体として用いた場合は各判定領域においてインフルエンザウイルスは検出されなかった。
【００４２】
被検試料１を検体として用いた場合は、何れの試験具を用いてもＡ型判定領域が発色し、Ｂ型判定領域は発色しなかった。即ち、Ａ型インフルエンザウイルスが陽性であると判定された。
【００４３】
被検試料２を検体として用いた場合は、何れの試験具を用いてもＡ型判定領域が濃く発色し、Ａ型インフルエンザウイルスが強陽性であると判定された。しかしながら、試験具Ａにおいて、Ｂ型インフルエンザを含まない被検試料２を検体として用いたにもかかわらず、Ｂ型判定領域が発色した。Ａ型インフルエンザウイルスを高濃度に含む試料を用いたときに生じるこの現象は、固定用抗Ａ型抗体がＡ型判定領域から遊離し、Ａ型インフルエンザウイルス抗原と共にＢ型判定領域に捕捉されることによって起こる偽陽性反応である。
【００４４】
試験具Ｂ及びＣにおいて、被検試料２を検体として用いた場合、Ｂ型判定領域は発色せず、正確にインフルエンザウイルスの検出が行われた。このことから、ＢＳＡを含有させた固定用抗Ｂ型抗体溶液を用いて試験具Ｂ及びＣのＢ型判定領域を作製することによって、試験具Ｂ及びＣのＢ型判定領域における偽陽性反応を完全に抑制できることが判明した。
【００４５】
＜固定用抗Ａ型抗体溶液へのＢＳＡの添加による効果＞
ＢＳＡを添加した固定用抗Ａ型抗体溶液を用いてＡ型判定領域を作製することによって、陰性試料を用いた場合にどのような効果が得られるかを、試験具Ｂを用いて検証した。また、対照として、ＢＳＡを含まない固定用抗Ａ型抗体溶液を用いてＡ型判定領域を作製すること以外は試験具Ａと同様にして作製した試験具Ｄを用いた。
検出には検体として陰性被検試料１〜４０を用いた。
【００４６】
検証結果を表２に示す。
【表２】
【００４７】
表２中、ｗは判定領域において薄い発色が観察されたことを示し、即ち弱陽性であることを示す。
−は判定領域において発色が観察されなかったことを示し、即ち陰性であることを示す。
【００４８】
表２より、試験具Ｄでは陰性被検試料１〜４０のうち、２検体でＡ型判定領域に薄い発色が観察された。これはＡ型判定領域での非特異的反応によって起こった偽陽性である。しかしながら、試験具Ｄではすべての検体においてＡ型判定領域における発色は見られず、偽陽性を抑制することができた。
【００４９】
以上の結果より、ＢＳＡを含有する固定用抗Ａ型抗体溶液を用いてＡ型判定領域を作製することにより、陰性被検試料を検体として用いた場合にＡ型判定領域で起こる偽陽性を抑制できることが判明した。
【００５０】
＜固定用抗Ｂ型抗体溶液へのＢＳＡ以外のタンパク質の添加による効果＞
ＢＳＡ以外のタンパク質を添加した固定用抗Ｂ型抗体溶液を用いてＢ型判定領域を作製することによってどのような効果が得られるかを検証した。
【００５１】
カゼインを１．０ｍｇ／ｍｌ含有する固定用抗Ｂ型抗体溶液を用いてＢ型判定領域を作製すること以外は、試験具Ａと同様にして試験具Ｅを作製した。
ゼラチンを１．０ｍｇ／ｍｌ含有する固定用抗Ｂ型抗体溶液を用いてＢ型判定領域を作製すること以外は、試験具Ａと同様にして試験具Ｆを作製した。
スキムミルクを１．０ｍｇ／ｍｌ含有する固定用抗Ｂ型抗体溶液を用いてＢ型判定領域を作製すること以外は、試験具Ａと同様にして試験具Ｇを作製した。
【００５２】
ここでは、試験具Ｅ〜Ｇを用い、さらに対照として試験具Ｄを用いて、陰性被検試料、被検試料１及び被検試料２のインフルエンザウイルスの検出を行った。
【００５３】
検証結果を表３に示す。
【表３】
【００５４】
表３中、＋の数が多いほど判定領域において発色が強いことを示し、即ち陽性の程度が強いことを示す。
ｗは判定領域において薄い発色が観察されたことを示し、即ち弱陽性であることを示す。
±は判定領域において極めて薄い発色が観察されたことを示す。
−は判定領域において発色が観察されなかったことを示し、即ち陰性であることを示す。
【００５５】
表３より、何れの試験具を用いても陰性被検試料を検体として用いた場合は各判定領域においてインフルエンザウイルスは検出されなかった。
【００５６】
被検試料１を検体として用いた場合は、何れの試験具を用いてもＡ型判定領域が発色し、Ｂ型判定領域は発色しなかった。即ち、Ａ型インフルエンザウイルスが陽性であると判定された。
【００５７】
被検試料２を検体として用いた場合は、何れの試験具を用いてもＡ型判定領域が濃く発色し、Ａ型インフルエンザウイルスが強陽性であると判定された。しかしながら、対照として用いた試験具Ｄにおいては、Ｂ型判定領域が発色し、偽陽性を呈した。一方、試験具Ｅ〜Ｇにおいては、Ｂ型判定領域が発色したが、試験具Ａにおける発色よりも極めて薄い発色であった。このことより、カゼイン、ゼラチン又はスキムミルクを含む固定用抗Ｂ型抗体溶液を用いて試験具Ｅ〜ＧのＢ型判定領域を作製することによって、試験具Ｅ〜ＧのＢ型判定領域における偽陽性反応を抑制できることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】試験具１の上面図である。
【図２】試験具１の側面図である。
【図３】図２とは異なる構造を有する試験具１の態様である。
【符号の説明】
【００５９】
１ 試験具
２ 試料添加部材
３ 標識物質保持部材
４ クロマトグラフ媒体
５ 吸収部材
６ａ Ａ型判定領域
６ｂ Ｂ型判定領域
８ 基板
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の複数の被検出物質を抗原抗体反応に基づいて検出するイムノクロマトグラフ法を利用した試験具に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、試料中の被検出物質を抗原抗体反応に基づいて免疫学的に検出するための方法として、イムノクロマトグラフ法が知られている。イムノクロマトグラフ法によると、被検出物質に結合可能な固定用抗体をクロマトグラフ担体の一部に固定して判定領域とし、被検出物質と抗原抗体反応を生じる標識抗体と試料とを、クロマトグラフ媒体において毛細管現象によって移動させる。移動してきた試料及び標識抗体を判定領域に接触させることにより、判定領域において被検出物質が標識抗体及び固定用抗体にサンドイッチ状に結合することにより、標識抗体及び被検出物質が判定領域に捕捉される。標識抗体として、抗体を感作した担体粒子（着色したラテックス粒子やコロイド状金属粒子など）を用いた場合、標識抗体が判定領域に捕捉されると判定領域が発色する。イムノクロマトグラフ法においては、このような判定領域の発色を観察することにより試料中の被検出物質の検出を行うことができる。
【０００３】
上記イムノクロマトグラフ法を用いて被検出物質を検出する際、試料中に被検出物質が含まれていない陰性の試料でも陽性と判定してしまうことがある（偽陽性）。偽陽性の原因の一つとして、標識抗体が非特異的に固定用抗体に結合することが挙げられる。このような非特異反応による偽陽性を抑制するため、ブロッキング剤が用いられる（例えば、特許文献１）。この技術によると、クロマトグラフ媒体に固定用抗体を固定した後、クロマトグラフ媒体を、ブロッキング剤を含む緩衝液に浸漬し、さらに乾燥させることによって、非特異反応を抑制することができる。
【０００４】
しかしながら、二種類以上の被検出物質を検出するために複数の判定領域を有するクロマトグラフ媒体を用いた場合は、特許文献１記載の技術を用いても非特異反応を抑制できないことがある。例えば、試料の展開方向から上流側に第一固定用抗体を固定した第一判定領域と、下流側に第二固定用抗体を固定した第二判定領域とを有するクロマトグラフ媒体を用いた場合、第一判定領域において検出される被検出物質を多く含む試料を展開した際に、標識抗体及び被検出物質と結合した第一固定用抗体が第一判定領域から遊離し、下流に位置する第二判定領域に捕捉されることによって、第二判定領域において偽陽性を呈することがある。
【特許文献１】特開平１０−０６８７３０号公報（第００２６欄）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、二種類以上の被検出物質を検出するための複数の判定領域を有するクロマトグラフ媒体を備えたイムノクロマトグラフ法用試験具であり、第一判定領域において検出される被検出物質を多く含む試料を検体として用いた場合においても、非特異反応による偽陽性を抑制して試料中の被検出物質の検出を正確に行うことができるイムノクロマトグラフ法用試験具を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、試料中の第一被検出物質及び第一被検出物質と異なる第二被検出物質を検出するためのイムノクロマトグラフ法用試験具であって、前記試料を添加する試料添加部材と、前記第一被検出物質と抗原抗体反応を生じる第一標識物質、及び前記第二被検出物質と抗原抗体反応を生じる第二標識物質を担持する標識物質保持部材と、前記第一被検出物質と抗原抗体反応を生じる第一固定用物質を固定化した第一判定領域と、前記第一判定領域の試料展開方向下流側に前記第二被検出物質と抗原抗体反応を生じる第二固定用物質を固定化した第二判定領域とを配置したクロマトグラフ媒体とを有し、ブロッキング剤及び前記第二固定用物質によって前記第二判定領域が形成されるイムノクロマトグラフ法用試験具を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によると、ブロッキング剤及び第二固定用物質を用いて第二判定領域を作成することによって、第一固定用物質が第二判定領域に捕捉されることを妨げ、第一判定領域において検出される被検出物質を多く含む試料を検体として用いた場合においても、非特異反応による偽陽性を抑制して試料中の被検出物質の検出を正確に行うことができるイムノクロマトグラフ用試験具が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。
図１は、本発明の一実施形態による試験具１の上面図である。図２は、試験具１の側面図である。試験具１は、イムノクロマトグラフ法を用いて試料中のＡ型及びＢ型インフルエンザウイルスを同時に検出する試験具である。試料としては鼻汁、鼻腔拭い液、咽頭拭い液などが用いられる。図１及び図２の矢印は試料展開方向を示し、試料はこの矢印の方向に展開される。試験具１は、試料展開方向上流側から順に試料添加部材２、標識物質保持部材３、クロマトグラフ媒体４及び吸収部材５を備えている。試料添加部材２はシート状のレーヨンから構成される。標識物質保持部材３及び吸収部材５はそれぞれシート状のグラスファイバーから構成される。クロマトグラフ媒体４はシート状のニトロセルロースから構成される。
【０００９】
標識物質保持部材３は、Ａ型インフルエンザウイルス抗原と結合可能な標識抗Ａ型インフルエンザウイルス抗原抗体（以下、標識抗Ａ型抗体とする）と、Ｂ型インフルエンザウイルス抗原と結合可能な標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗原抗体（以下、標識抗Ｂ型抗体とする）とを保持している。標識抗Ａ型抗体とは、青色に着色されたポリスチレンラテックス粒子によって標識され、Ａ型インフルエンザウイルス抗原に特異的な抗体を示す。標識抗Ｂ型抗体とは、青色に着色されたポリスチレンラテックス粒子によって標識され、Ｂ型インフルエンザウイルス抗原に特異的な抗体のことを示す。
【００１０】
クロマトグラフ媒体４は、Ａ型インフルエンザウイルス抗原と結合可能な固定用抗Ａ型インフルエンザウイルス抗原抗体（以下、固定用抗Ａ型抗体とする）を固定したＡ型インフルエンザウイルス判定領域６ａ（以下、Ａ型判定領域６ａとする）と、Ｂ型インフルエンザウイルス抗原と結合可能な抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗原抗体（以下、固定用抗Ｂ型抗体とする）を固定したＢ型インフルエンザウイルス判定領域６ｂ（以下、Ｂ型判定領域６ｂとする）とを備えている。
【００１１】
図２に示すように、試料添加部材２、標識物質保持部材３、クロマトグラフ媒体４及び吸収部材５は、プラスチック製の基板８に接着されており、それぞれ毛細管現象による試料の展開が途切れることのないように連結されている。標識物質保持部材３の下流側の下面はクロマトグラフ媒体４のＡ型判定領域６ａよりも上流側の上面と接して配置される。試料添加部材２の下流側の下面は標識物質保持部材３の上流側の上面と接して配置される。吸収部材５の上流側の下面はクロマトグラフ媒体４のＢ型判定領域６ｂよりも下流側の上面と接触して配置される。
【００１２】
Ａ型判定領域６ａは、固定用抗Ａ型抗体及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む溶液をドッティングマシーンなどを用いて塗布することにより作製される。これにより、検体として被検出物質を含まない試料（陰性検体）を検体として用いた場合に稀に生じるＡ型判定領域６ａの偽陽性を抑制することができる。
【００１３】
Ｂ型判定領域６ｂは、固定用抗Ｂ型抗体及びＢＳＡを含む溶液をドッティングマシーンなどを用いて塗布することにより作製される。これにより、Ａ型インフルエンザウイルスを多く含む試料を試験具１に展開した場合に、上流からの試料の移動によって固定用抗Ａ型抗体がＡ型判定領域６ａから遊離してＡ型インフルエンザウイルス抗原と共にＢ型判定領域６ｂに捕捉されることを妨げることができ、Ｂ型判定領域６ｂにおける偽陽性を抑制することができる。
【００１４】
なお、本実施形態では、被検出物質はインフルエンザウイルスであるが、被検出物質としては抗原抗体反応を生じる物質であれば特に限定されず、細菌、原生生物や真菌等の細胞、その他のウイルス、タンパク質、多糖類などが挙げられる。例えば、パラインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、マイコプラズマニューモニエ、ロタウイルス、カルシウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、重症急性呼吸器症候群の病原ウイルス、大腸菌、スタフィロコッカスアウレウス、ストレプトコッカスニューモニエ、ストレプトコッカスピヨゲネス、マラリア原虫、その他消化器系疾患、中枢神経径疾患、出血熱等の様々な疾患の病原体、これらの代謝産物、癌胎児性抗原やシフラなどの腫瘍マーカー、ホルモンなどが検出対象となる。上述の病原体及びこれらの代謝産物のうち二種以上の被検出物質を同時に検出して疾患の診断を行うために用いることができるが、同種の被検出物質の型別診断に用いられるのが好ましい。同種の被検出物質の型別診断の例としては、Ａ〜Ｅ型肝炎ウイルスの同時検出や１型及び２型ヒト免疫不全ウイルスの同時検出などが挙げられる。
【００１５】
また、本実施形態では、試料添加部材２はレーヨンからなっているが、試料添加部材２の材質としては毛細管現象を生じる多孔質の吸水性物質であれば特に限定されない。例えば、グラスファイバー、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレンなどを用いることも可能である。
【００１６】
また、標識物質保持部材３及び吸収部材５はグラスファイバーからなっているが、これらの材質としては毛細管現象を生じる多孔質の吸水性物質であれば特に限定されない。例えば、レーヨン、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレンなどを用いることも可能である。
【００１７】
また、クロマトグラフ媒体４はニトロセルロースからなっているが、クロマトグラフ媒体４の材質としては抗原や抗体を固定でき、毛細管現象を生じる多孔質の吸水性物質であり、クロマトグラフィーによって液体を展開できる材質であれば特に限定されない。例えば、ポリビニリデンフロライド、ポリアミド、ポリエーテルスルホンなどを用いることも可能である。
【００１８】
また、本実施形態では、Ａ型判定領域６ａ及びＢ型判定領域６ｂを、ブロッキング剤としてＢＳＡを含有する抗体溶液を用いてそれぞれ作製しているが、この抗体溶液に含有させるブロッキング剤としては、Ａ型インフルエンザウイルス抗原、Ｂ型インフルエンザウイルス抗原、標識抗Ａ型抗体、標識抗Ｂ型抗体、固定用抗Ａ型抗体及び固定用抗Ｂ型抗体の何れに対しても抗原抗体反応を生じないブロッキング剤であれば、特に限定されない。ＢＳＡ以外には、前記ブロッキング剤としてヤギ、トリなどの血清アルブミン、グロブリン、カゼイン、ゼラチン、スキムミルク、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどを例示することができる。また、ＢＳＡの代わりにウシ、ヤギ、トリなどの動物から採取した血清を上述の抗体溶液に添加しても同様の効果を得ることができる。
上述したブロッキング剤の中では、ＢＳＡ、カゼイン、ゼラチン、又はスキムミルクを用いることが好ましい。
【００１９】
また、本実施形態に用いられる抗体としては、被検出物質と結合可能なものであれば特に限定されない。即ち抗体としては、マウスやラットなどの動物に被検出物質を免疫して作製されるポリクローナル抗体でも、ハイブリドーマなどによって産生されるモノクローナル抗体（Kohler & Milstein, 1975, Nature, vol.256, 495）でもよく、これらを単独又は適宜組み合わせて用いることができる。
また、同一の抗原を認識できるものであれば、標識抗Ａ型抗体の抗原結合部と固定用抗Ａ型抗体の抗原結合部とは同一であっても異なっていてもよい。同様に、標識抗Ｂ型抗体の抗原結合部と固定用抗Ｂ型抗体の抗原結合部とは同一であっても異なっていてもよい。
【００２０】
また、本実施形態では、担体粒子としてポリスチレンラテックス粒子を用いているが、抗原又は抗体を感作できる粒子であれば特に限定されない。例えばポリスチレン以外のラテックス粒子、金、銀、白金のようなコロイド状金属粒子、酸化鉄のようなコロイド状金属酸化物粒子などを用いることができる。ラテックス粒子は、種々のモノマーを重合又は共重合させることによって得ることができる。例えば、モノマーとしては、重合性不飽和芳香族類（例えば、クロルスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、ビニルトルエンなど）、重合性不飽和カルボン酸類（例えば、（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマル酸など）、重合性カルボン酸エステル類（例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニルなど）、不飽和カルボン酸アミド類（例えば、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチロール（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、臭化ビニルなど）、重合性不飽和ニトリル類、ハロゲン化ビニル類、共役ジエン類などを例示することができ、これらのうち一種又は二種以上を用いることができる。
【００２１】
また、クロマトグラフ媒体４のＢ型判定領域６ｂよりも下流に、試料が適切に展開されたかどうかを確認するためのコントロール領域を作製してもよい。コントロール領域には、例えば、ビオチン（又はアビジン）を固定することができる。この場合、標識物質保持部材３には有色の担体粒子によって標識されたアビジン（又はビオチン）を保持させる。標識物質保持部材３に保持された標識アビジン（又は標識ビオチン）は、試料が展開されると試料と共に試料展開方向下流にクロマトグラフ的に移動し、コントロール領域に達すると固定されているビオチン（又はアビジン）と結合してコントロール領域に捕捉され、コントロール領域が発色する。この発色を観察することにより試料が適切に展開されたかどうかを確認することができる。
【００２２】
また、試験具１は、図２ａに示すように、試料添加部材２の下流側の下面が標識物質保持部材３の上面全部と接触する構造を有していてもよい。
また、試験具１は、図２ｂに示すように、クロマトグラフ媒体４と標識物質保持部材３とが間隔を介して配置され、試料添加部材２の下面が標識物質保持部材３を覆い、試料添加部材２の下流側の下面がクロマトグラフ媒体４のＡ型判定領域６ａよりも上流側の上面と接触する構造を有していてもよい。
また、試験具１は、図２ｃに示すように、試料添加部材２の下面が標識物質保持部材３の上面全部と接触し、試料添加部材２の下流側の末端がクロマトグラフ媒体４のＡ型判定領域６ａよりも上流側の一部と接触する構造を有していてもよい。
【００２３】
また、本実施形態では、標識抗体及び固定用抗体を用いて試料中の抗原を検出することにより被検出物質の有無を判定するが、標識抗原及び固定用抗原を用いて試料中の抗体を検出することにより被検出物質の有無を判定してもよい。この場合、標識抗原として試料中の抗体と抗原抗体反応を生じる抗原を感作した担体粒子を用い、クロマトグラフ媒体４の判定領域には試料中の抗体と抗原抗体反応を生じる固定用抗原を感作する。
【００２４】
以下、試験具１を用いたＡ型及びＢ型インフルエンザウイルスの検出について説明する。
先ず、生体から採取した試料には、前処理が施される。前処理を施すことによって、インフルエンザウイルスはより検出に適した状態となり、検出感度を高めることができる。前処理は、前処理液に試料を添加し、フィルターで濾過することによって行われる。前処理液としては、非イオン系界面活性剤及びアルカリ金属イオンなどを含む水溶液を用いることができる。
【００２５】
前処理を施された試料（以下、被検試料とする）は試験具１の試料添加部材２に添加される。被検試料が添加されると毛細管現象によって試料添加部材２から下流に向かって移動し、標識物質保持部材３に到達する。被検試料は標識物質保持部材３に担持されている標識抗体と共にクロマトグラフ媒体４に移動する。クロマトグラフ媒体４のＡ型判定領域６ａに被検試料及び標識抗体が到達すると、被検試料中にＡ型インフルエンザウイルスが存在する場合は、Ａ型判定領域においてＡ型インフルエンザウイルス抗原が標識抗Ａ型抗体及び固定用抗Ａ型抗体にサンドイッチ状に結合する。標識抗Ａ型抗体は標識物として青色のポリスチレンラテックス粒子を備えているため、Ａ型判定領域６ａに捕捉されると、Ａ型判定領域６ａは青色に発色する。この発色が観察されるか否かによって、被検試料中のＡ型インフルエンザウイルスの存否を判定できる。同様に、Ｂ型判定領域６ｂに被検試料及び標識抗体が到達すると、被検試料中にＢ型インフルエンザウイルスが存在する場合は、Ｂ型判定領域においてＢ型インフルエンザウイルス抗原が標識抗Ｂ型抗体及び固定用抗Ｂ型抗体にサンドイッチ状に結合する。標識抗Ｂ型抗体は標識物として青色のポリスチレンラテックス粒子を備えているため、Ｂ型判定領域６ｂに捕捉されると、Ｂ型判定領域６ｂは青色に発色する。この発色が観察されるか否かによって、試料中のＢ型インフルエンザウイルスの存否を判定できる。被検試料及び各判定領域に捕捉されなかった標識抗体は、試験具１の最下流に位置する吸収部材５によって吸収される。
【００２６】
＜比較例＞
（クロマトグラフ媒体Ａの作製）
クロマトグラフ媒体Ａにはニトロセルロース膜（日本ミリポア社製）を用いた。
【００２７】
Ａ型判定領域には固定用抗Ａ型インフルエンザ抗原抗体が固定される。ＰＢＳに、固定用抗Ａ型インフルエンザ抗原抗体を２．０ｍｇ／ｍｌ、ＢＳＡを１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含有させて調製した固定用抗Ａ型抗体溶液（ｐＨ７．０）をニトロセルロース膜に線状に塗布し、この線をＡ型判定領域とした。
【００２８】
Ｂ型判定領域には固定用抗Ｂ型インフルエンザ抗原抗体が固定される。上記ニトロセルロース膜のＡ型判定領域よりも下流に、ＰＢＳに固定用抗Ｂ型インフルエンザ抗原抗体を１．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含有させて調整した固定用抗Ｂ型抗体溶液（ｐＨ７．０）を線状に塗布し、この線をＢ型判定領域とした。
【００２９】
なお、固定用Ａ型抗体溶液及び固定用Ｂ型抗体溶液のニトロセルロース膜への塗布は、バイオドット社製ＸＹＺ３０００を用いて行った。
【００３０】
固定用抗Ａ型抗体溶液及び固定用抗Ｂ型抗体溶液をニトロセルロース膜へ塗布した後、ニトロセルロース膜を乾燥させた。その後、ブロッキング溶液（リン酸１ナトリウム、１０ｍＭ；アジ化ナトリウム、０．１ｗ／ｖ％；ＢＳＡ、１．０ｗ／ｖ％；ｐＨ７．０）に浸漬してブロッキング処理を行い、さらに乾燥させ、クロマトグラフ媒体Ａとした。
【００３１】
（標識物質保持部材の作製）
ｐＨ８．０のＰＢＳに平均粒径０．３μｍの青色ポリスチレンラテックス粒子を添加し、さらにグルタルアルデヒドを最終濃度が０．１ｗ／ｖ％となるよう添加し、２５℃で一時間攪拌を行った。攪拌された混合液を遠心して上清を除去し、沈渣にｐＨ８．０のＰＢＳを添加した。次に、ポリスチレンラテックス粒子を分散させ、Ａ型インフルエンザウイルス抗原に結合可能なモノクローナル抗体１００μｇ／ｍｌを添加し、これを２５℃で二時間攪拌した。これを遠心して、上清を除去した。得られた沈渣にＢＳＡを１０ｗ／ｖ％含有するｐＨ８．０のＰＢＳを加え、混和して分散させた後、３７℃で一晩静置した。このようにして調製された混合液を遠心して上清を除去し、沈渣にＢＳＡを５ｗ／ｖ％含有するｐＨ８．０のＰＢＳを添加した。これを混和して分散させた後、０．８μｍメッシュのフィルターで濾過し、得られた濾過液を標識抗Ａ型抗体溶液とした。
【００３２】
標識抗Ｂ型抗体溶液は、Ａ型インフルエンザウイルス抗原に結合可能なモノクローナル抗体に代えて、Ｂ型インフルエンザウイルス抗原に結合可能なモノクローナル抗体を用いること以外、標識抗Ａ型抗体溶液と同様にして調製された。
【００３３】
上記のようにして調製された標識抗Ａ型抗体及び標識抗Ｂ型抗体を１：１の混合比で混合し、これをグラスファイバーに含浸させた後乾燥させ、標識物質保持部材を得た。
【００３４】
（試験具Ａの作製）
図２において、クロマトグラフ媒体４としてクロマトグラフ媒体Ａを用いて試験具Ａを作製した。
【００３５】
＜実施例＞
（クロマトグラフ媒体Ｂ及びＣの作製）
ＢＳＡを１．０ｍｇ／ｍｌ含有する固定用抗Ｂ型抗体溶液を用いてＢ型判定領域を作製すること以外は、クロマトグラフ媒体Ａと同様にしてクロマトグラフ媒体Ｂを作製した。
ＢＳＡを２．０ｍｇ／ｍｌ含有する固定用抗Ｂ型抗体溶液を用いてＢ型判定領域を作製すること以外は、クロマトグラフ媒体Ａと同様にしてクロマトグラフ媒体Ｃを作製した。
【００３６】
（試験具Ｂ及びＣの作製）
図２において、クロマトグラフ媒体４としてクロマトグラフ媒体Ｂを用いて試験具Ｂを作製した。
図２において、クロマトグラフ媒体４としてクロマトグラフ媒体Ｃを用いて試験具Ｃを作製した。
【００３７】
＜固定用抗Ｂ型抗体溶液へのＢＳＡ添加による効果＞
（試験具Ａ〜Ｃを用いたインフルエンザウイルスの検出）
試料としては、Ａ型インフルエンザウイルスもＢ型インフルエンザウイルスも含まれていない試料（陰性試料）、Ａ型インフルエンザウイルス弱陽性試料（試料１）及びＡ型インフルエンザウイルス強陽性試料（試料２）を用いた。
【００３８】
次に、これらの試料に前処理を施した。試料と０．３ｗ／ｖ％のノニデットＰ−４０（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニールエーテルの商品名）を含む前処理液（ｐＨ７．８）とを混合し、試料と前処理液の混合液をフィルターで濾過することによって被検試料を得た。陰性被検試料を前処理したものを陰性被検試料とし、試料１を前処理したものを被検試料１とし、試料２を前処理したものを被検試料２とした。
【００３９】
これらの被検試料をそれぞれ試験具Ａ〜Ｃの試料添加部材に添加し、インフルエンザウイルスの検出を行った。検証結果を表１に示す。
【表１】
【００４０】
表１中、＋の数が多いほど判定領域において発色が強いことを示し、即ち陽性の程度が強いことを示す。
−は判定領域において発色が観察されなかったことを示し、即ち陰性であることを示す。
【００４１】
表１より、何れの試験具を用いても陰性被検試料を検体として用いた場合は各判定領域においてインフルエンザウイルスは検出されなかった。
【００４２】
被検試料１を検体として用いた場合は、何れの試験具を用いてもＡ型判定領域が発色し、Ｂ型判定領域は発色しなかった。即ち、Ａ型インフルエンザウイルスが陽性であると判定された。
【００４３】
被検試料２を検体として用いた場合は、何れの試験具を用いてもＡ型判定領域が濃く発色し、Ａ型インフルエンザウイルスが強陽性であると判定された。しかしながら、試験具Ａにおいて、Ｂ型インフルエンザを含まない被検試料２を検体として用いたにもかかわらず、Ｂ型判定領域が発色した。Ａ型インフルエンザウイルスを高濃度に含む試料を用いたときに生じるこの現象は、固定用抗Ａ型抗体がＡ型判定領域から遊離し、Ａ型インフルエンザウイルス抗原と共にＢ型判定領域に捕捉されることによって起こる偽陽性反応である。
【００４４】
試験具Ｂ及びＣにおいて、被検試料２を検体として用いた場合、Ｂ型判定領域は発色せず、正確にインフルエンザウイルスの検出が行われた。このことから、ＢＳＡを含有させた固定用抗Ｂ型抗体溶液を用いて試験具Ｂ及びＣのＢ型判定領域を作製することによって、試験具Ｂ及びＣのＢ型判定領域における偽陽性反応を完全に抑制できることが判明した。
【００４５】
＜固定用抗Ａ型抗体溶液へのＢＳＡの添加による効果＞
ＢＳＡを添加した固定用抗Ａ型抗体溶液を用いてＡ型判定領域を作製することによって、陰性試料を用いた場合にどのような効果が得られるかを、試験具Ｂを用いて検証した。また、対照として、ＢＳＡを含まない固定用抗Ａ型抗体溶液を用いてＡ型判定領域を作製すること以外は試験具Ａと同様にして作製した試験具Ｄを用いた。
検出には検体として陰性被検試料１〜４０を用いた。
【００４６】
検証結果を表２に示す。
【表２】
【００４７】
表２中、ｗは判定領域において薄い発色が観察されたことを示し、即ち弱陽性であることを示す。
−は判定領域において発色が観察されなかったことを示し、即ち陰性であることを示す。
【００４８】
表２より、試験具Ｄでは陰性被検試料１〜４０のうち、２検体でＡ型判定領域に薄い発色が観察された。これはＡ型判定領域での非特異的反応によって起こった偽陽性である。しかしながら、試験具Ｄではすべての検体においてＡ型判定領域における発色は見られず、偽陽性を抑制することができた。
【００４９】
以上の結果より、ＢＳＡを含有する固定用抗Ａ型抗体溶液を用いてＡ型判定領域を作製することにより、陰性被検試料を検体として用いた場合にＡ型判定領域で起こる偽陽性を抑制できることが判明した。
【００５０】
＜固定用抗Ｂ型抗体溶液へのＢＳＡ以外のタンパク質の添加による効果＞
ＢＳＡ以外のタンパク質を添加した固定用抗Ｂ型抗体溶液を用いてＢ型判定領域を作製することによってどのような効果が得られるかを検証した。
【００５１】
カゼインを１．０ｍｇ／ｍｌ含有する固定用抗Ｂ型抗体溶液を用いてＢ型判定領域を作製すること以外は、試験具Ａと同様にして試験具Ｅを作製した。
ゼラチンを１．０ｍｇ／ｍｌ含有する固定用抗Ｂ型抗体溶液を用いてＢ型判定領域を作製すること以外は、試験具Ａと同様にして試験具Ｆを作製した。
スキムミルクを１．０ｍｇ／ｍｌ含有する固定用抗Ｂ型抗体溶液を用いてＢ型判定領域を作製すること以外は、試験具Ａと同様にして試験具Ｇを作製した。
【００５２】
ここでは、試験具Ｅ〜Ｇを用い、さらに対照として試験具Ｄを用いて、陰性被検試料、被検試料１及び被検試料２のインフルエンザウイルスの検出を行った。
【００５３】
検証結果を表３に示す。
【表３】
【００５４】
表３中、＋の数が多いほど判定領域において発色が強いことを示し、即ち陽性の程度が強いことを示す。
ｗは判定領域において薄い発色が観察されたことを示し、即ち弱陽性であることを示す。
±は判定領域において極めて薄い発色が観察されたことを示す。
−は判定領域において発色が観察されなかったことを示し、即ち陰性であることを示す。
【００５５】
表３より、何れの試験具を用いても陰性被検試料を検体として用いた場合は各判定領域においてインフルエンザウイルスは検出されなかった。
【００５６】
被検試料１を検体として用いた場合は、何れの試験具を用いてもＡ型判定領域が発色し、Ｂ型判定領域は発色しなかった。即ち、Ａ型インフルエンザウイルスが陽性であると判定された。
【００５７】
被検試料２を検体として用いた場合は、何れの試験具を用いてもＡ型判定領域が濃く発色し、Ａ型インフルエンザウイルスが強陽性であると判定された。しかしながら、対照として用いた試験具Ｄにおいては、Ｂ型判定領域が発色し、偽陽性を呈した。一方、試験具Ｅ〜Ｇにおいては、Ｂ型判定領域が発色したが、試験具Ａにおける発色よりも極めて薄い発色であった。このことより、カゼイン、ゼラチン又はスキムミルクを含む固定用抗Ｂ型抗体溶液を用いて試験具Ｅ〜ＧのＢ型判定領域を作製することによって、試験具Ｅ〜ＧのＢ型判定領域における偽陽性反応を抑制できることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】試験具１の上面図である。
【図２】試験具１の側面図である。
【図３】図２とは異なる構造を有する試験具１の態様である。
【符号の説明】
【００５９】
１ 試験具
２ 試料添加部材
３ 標識物質保持部材
４ クロマトグラフ媒体
５ 吸収部材
６ａ Ａ型判定領域
６ｂ Ｂ型判定領域
８ 基板
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の第一被検出物質及び第一被検出物質と異なる第二被検出物質を検出するためのイムノクロマトグラフ法用試験具であって、前記試料を添加する試料添加部材と、前記第一被検出物質と抗原抗体反応を生じる第一標識物質、及び前記第二被検出物質と抗原抗体反応を生じる第二標識物質を担持する標識物質保持部材と、前記第一被検出物質と抗原抗体反応を生じる第一固定用物質を固定化した第一判定領域と、前記第一判定領域の試料展開方向下流側に前記第二被検出物質と抗原抗体反応を生じる第二固定用物質を固定化した第二判定領域とを配置したクロマトグラフ媒体とを有し、ブロッキング剤及び前記第二固定用物質によって前記第二判定領域が形成されるイムノクロマトグラフ法用試験具。
【請求項２】
前記ブロッキング剤及び前記第二固定用物質を含む溶液を塗布することによって前記第二判定領域が形成される請求項１記載のイムノクロマトグラフ法用試験具。
【請求項３】
第二ブロッキング剤及び第一固定用物質によって前記第一判定領域が形成される請求項１記載のイムノクロマトグラフ法用試験具。
【請求項４】
前記第二ブロッキング剤及び前記第一固定用物質を含む溶液を塗布することによって前記第一判定領域が形成される請求項３記載のイムノクロマトグラフ法用試験具。
【請求項５】
前記ブロッキング剤がグロブリン、アルブミン、カゼイン、ゼラチン、スキムミルク、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドンからなる群から選択される少なくとも一種である請求項１記載のイムノクロマトグラフ法用試験具。
【請求項６】
前記第二ブロッキング剤がグロブリン、アルブミン、カゼイン、ゼラチン、スキムミルク、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドンからなる群から選択される少なくとも一種である請求項３記載のイムノクロマトグラフ法用試験具。
【請求項７】
前記ブロッキング剤と、前記第二ブロッキング剤とが同じである請求項３記載のイムノクロマトグラフ法用試験具。
【請求項８】
前記クロマトグラフ媒体が、第三ブロッキング剤を含む溶液に浸漬されることによりブロッキングされる請求項１〜７の何れかに記載のイムノクロマトグラフ法用試験具。
【請求項９】
前記第三ブロッキング剤がグロブリン、アルブミン、カゼイン、ゼラチン、スキムミルク、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドンからなる群から選択される少なくとも一種である請求項８記載のイムノクロマトグラフ法用試験具。
【請求項１０】
前記第一被検出物質及び／又は前記第二被検出物質がウイルス、細菌、原生生物、真菌、腫瘍マーカー又はホルモンである請求項１〜９の何れかに記載のイムノクロマトグラフ法用試験具。
【請求項１１】
前記第一標識物質が着色ラテックス粒子及び第一被検出物質と抗原抗体反応を生じる第一物質を備え、前記第二標識物質が着色ラテックス粒子及び第二被検出物質と抗原抗体反応を生じる第二物質を備える請求項１〜１０の何れかに記載のイムノクロマトグラフ法用試験具。
【請求項１】
試料中の第一被検出物質及び第一被検出物質と異なる第二被検出物質を検出するためのイムノクロマトグラフ法用試験具であって、前記試料を添加する試料添加部材と、前記第一被検出物質と抗原抗体反応を生じる第一標識物質、及び前記第二被検出物質と抗原抗体反応を生じる第二標識物質を担持する標識物質保持部材と、前記第一被検出物質と抗原抗体反応を生じる第一固定用物質を固定化した第一判定領域と、前記第一判定領域の試料展開方向下流側に前記第二被検出物質と抗原抗体反応を生じる第二固定用物質を固定化した第二判定領域とを配置したクロマトグラフ媒体とを有し、ブロッキング剤及び前記第二固定用物質によって前記第二判定領域が形成されるイムノクロマトグラフ法用試験具。
【請求項２】
前記ブロッキング剤及び前記第二固定用物質を含む溶液を塗布することによって前記第二判定領域が形成される請求項１記載のイムノクロマトグラフ法用試験具。
【請求項３】
第二ブロッキング剤及び第一固定用物質によって前記第一判定領域が形成される請求項１記載のイムノクロマトグラフ法用試験具。
【請求項４】
前記第二ブロッキング剤及び前記第一固定用物質を含む溶液を塗布することによって前記第一判定領域が形成される請求項３記載のイムノクロマトグラフ法用試験具。
【請求項５】
前記ブロッキング剤がグロブリン、アルブミン、カゼイン、ゼラチン、スキムミルク、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドンからなる群から選択される少なくとも一種である請求項１記載のイムノクロマトグラフ法用試験具。
【請求項６】
前記第二ブロッキング剤がグロブリン、アルブミン、カゼイン、ゼラチン、スキムミルク、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドンからなる群から選択される少なくとも一種である請求項３記載のイムノクロマトグラフ法用試験具。
【請求項７】
前記ブロッキング剤と、前記第二ブロッキング剤とが同じである請求項３記載のイムノクロマトグラフ法用試験具。
【請求項８】
前記クロマトグラフ媒体が、第三ブロッキング剤を含む溶液に浸漬されることによりブロッキングされる請求項１〜７の何れかに記載のイムノクロマトグラフ法用試験具。
【請求項９】
前記第三ブロッキング剤がグロブリン、アルブミン、カゼイン、ゼラチン、スキムミルク、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドンからなる群から選択される少なくとも一種である請求項８記載のイムノクロマトグラフ法用試験具。
【請求項１０】
前記第一被検出物質及び／又は前記第二被検出物質がウイルス、細菌、原生生物、真菌、腫瘍マーカー又はホルモンである請求項１〜９の何れかに記載のイムノクロマトグラフ法用試験具。
【請求項１１】
前記第一標識物質が着色ラテックス粒子及び第一被検出物質と抗原抗体反応を生じる第一物質を備え、前記第二標識物質が着色ラテックス粒子及び第二被検出物質と抗原抗体反応を生じる第二物質を備える請求項１〜１０の何れかに記載のイムノクロマトグラフ法用試験具。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−１８９３１７（Ｐ２００６−１８９３１７Ａ）
【公開日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１１８２（Ｐ２００５−１１８２）
【出願日】平成１７年１月６日（２００５．１．６）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【公開日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月６日（２００５．１．６）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
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