インゲンマメの種子貯蔵タンパク質アルセリン２のプロモーター及びその利用
【課題】優れたタンパク質の貯蔵部位である植物種子に外来の有用タンパク質を生産・蓄積させる手段を提供する。
【解決手段】インゲンマメの種子貯蔵タンパク質アルセリン２遺伝子のプロモーター配列を単離し、当該プロモーターの発現制御下に外来有用タンパク質をコードする遺伝子を種子特異的に発現させる。
【解決手段】インゲンマメの種子貯蔵タンパク質アルセリン２遺伝子のプロモーター配列を単離し、当該プロモーターの発現制御下に外来有用タンパク質をコードする遺伝子を種子特異的に発現させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インゲンマメの種子貯蔵タンパク質アルセリン２をコードする遺伝子のプロモーター配列を含む新規なＤＮＡに関する。また、本発明は前記ＤＮＡを含むベクターに関する。さらに、本発明は、前記ＤＮＡ及びベクターの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロモーターは遺伝子の発現を制御する機能を持つＤＮＡであり、植物細胞内で機能することが可能なプロモーターとして各種のプロモーターが知られている。発現させようと所期する構造遺伝子を各種プロモーターの下流に連結し、これをプラスミドベクターに挿入することで組換えベクターを作製することができる。そして、その組換えベクターを植物細胞に導入することによって、植物細胞内で所期の構造遺伝子をプロモーターの特性に応じた態様により発現させることができる。近年、遺伝子組換え技術による植物の品種改良は植物の形質改良のみならず、植物中で医薬原料、健康食品素材、酵素等の有用タンパク質を生産、蓄積させる研究開発がなされている。植物における組換え有用タンパク質の生産に関しては、その生産、蓄積部位として種子及び葉などが用いられているが、特に種子はタンパク質の貯蔵器官として優れており、目的の外来タンパク質を大量に、かつ安定的に蓄積することが可能である。また種子であるため保存安定性が高く、加工も容易である。
【０００３】
一方で、目的とする有用タンパク質を種子特異的に生産、蓄積させるためには種子で遺伝子発現を誘導するプロモーターの制御下に外来遺伝子を発現させることが必要である。これまで知られている種子特異的な遺伝子発現を誘導するプロモーターとしては、イネグルテリンプロモーター（特許文献１参照）、亜麻種子特異的プロモーター（特許文献２参照）、インゲンマメアルセリン５プロモーター（特許文献３参照）が知られている。
【０００４】
しかしながら、イネグルテリンプロモーターを用いて外来タンパク質を発現させた場合、その蓄積部位はでんぷん層である胚乳であり、無胚乳種子であるマメ科植物などには適さない。亜麻種子特異的プロモーターはマメ科植物で使用できることは実証されていない。インゲンマメアルセリン５プロモーターは、組換体におけるプロモーター活性についての報告がなく、実際に種子にどの程度外来タンパク質を蓄積させることができるか不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−１３０８３３号公報
【特許文献２】特表２００３−５２５０３０号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００２／５０２９５号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、マメ科植物の種子特異的なプロモーター活性を有する新規なＤＮＡを提供することである。また、本発明の目的は、当該ＤＮＡを含むベクター、及び該ベクターが導入された形質転換体を提供することである。また、本発明の目的は、優れたタンパク質の貯蔵部位である植物の種子に、外来のタンパク質を高率に発現させることで安価な外来タンパク質の生産方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、マメ科以外の植物においても、目的とする外来遺伝子を種子で発現させて、外来タンパク質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。
その研究の結果、後述される手法によって、インゲンマメの種子貯蔵タンパク質アルセリン２のプロモーター配列を有する新規なＤＮＡを単離することに成功した。さらに、前記のＤＮＡの塩基配列を決定した結果、前記ＤＮＡは、配列表の配列番号１の塩基配列を有する３８６０ｂｐのＤＮＡ断片であることを見出した。
【０００８】
さらに、前記ＤＮＡに含まれる塩基配列をレポーター遺伝子の上流に結合させたベクターを作製し、これをダイズ培養細胞及び種子へ導入した結果、前記塩基配列が種子特異的な遺伝子発現を誘導し、さらに、そのプロモーター活性が既知の種子特異的な発現を誘導するプロモーターと比較して高いことを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、
［１］
下記の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示す塩基配列を含むＤＮＡ：
（Ａ）配列番号１の塩基配列、
（Ｂ）配列番号１の塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたものであって、種子特異的なプロモーター活性を有するＤＮＡをコードする塩基配列、
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）に記載された塩基配列の部分配列であって、種子特異的なプロモーター活性を有するＤＮＡをコードする塩基配列、
［２］
配列番号１の塩基番号１３９９〜３８６０に記載された塩基配列を含むＤＮＡ、
［３］
［１］又は［２］に記載のＤＮＡと、該ＤＮＡの下流に連結された外来タンパク質をコードする外来遺伝子と、該外来遺伝子の下流に連結されたターミネーター活性を有するＤＮＡとを含むベクター、
［４］
前記ターミネーター活性を有するＤＮＡは、配列番号２の塩基配列、又は配列番号２の塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたものであってターミネーター活性を有するＤＮＡをコードする塩基配列を含む、［３］に記載のベクター、
［５］
［３］又は［４］に記載されたベクターが導入された形質転換植物体、
［６］
［３］又は［４］に記載されたベクターが導入された形質転換種子、
［７］
［１］又は［２］に記載のＤＮＡの制御下において、外来タンパク質をコードする外来遺伝子を植物の種子中で発現させることを特徴とする、外来タンパク質の生産方法、
を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のプロモーターは種子特異的なプロモーター活性を有するため、当該プロモーターに外来遺伝子を連結したベクターを用いて植物を形質転換することにより本来的な貯蔵器官である種子にワクチン、抗体、抗生剤、機能性タンパク質、機能性ペプチドなどに代表される、外来遺伝子に由来する有用タンパク質を効率的に生産、蓄積させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ｐＵＨＧＡｒｃ２ＰＣＴを導入した形質転換ダイズの種子におけるアルセリン２タンパク質の蓄積量を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のＣＢＢ染色の写真である。図中の矢印はアルセリン２タンパク質を示す。
【図２】ｐＵＨＧＡｒｃ２ＰＣＴを導入した形質転換ダイズの種子におけるアルセリン２タンパク質の蓄積量を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のウェスタンブロッティングの写真である。図中の矢印はアルセリン２タンパク質を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明に係るプロモーター及び本発明に係るベクターに組み込まれるターミネーター
本発明に係る種子特異的なプロモーター活性を有するＤＮＡ（以下、本発明に係るＤＮＡという）は、インゲンマメアルセリン２遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡであり、具体的には配列番号１の塩基配列又はその部分配列を含むＤＮＡが含まれる。
【００１３】
また、本発明に係るベクターに組み込まれるターミネーター活性を有するＤＮＡは、インゲンマメアルセリン２遺伝子のターミネーター配列を含むＤＮＡであり、具体的には配列番号２の塩基配列を含むＤＮＡが含まれる。
【００１４】
アルセリン遺伝子にはアルセリン１から７までの複数の相同性遺伝子の存在が知られており（非特許文献 Alianら；Plant Physiology 120, 1095-1104（1999））、それらの構造遺伝子をコードする部分の塩基配列の相同性は非常に高い。
【００１５】
一般に特定の構造遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡの単離は、ゲノミックＤＮＡライブラリーからのスクリーニング操作によって単離することができ、該構造遺伝子の塩基配列が明らかな場合、該塩基配列を基にプローブを調製し、ゲノミックＤＮＡライブラリーからスクリーニングを行い、選択されたクローンの塩基配列を決定することにより、プロモーター領域を含むＤＮＡを単離することができる。しかしながら、本発明のアルセリン２遺伝子のプロモーターのようにその構造遺伝子に相同性の高い複数の遺伝子が存在する場合、目的のプロモーター領域を含むクローンが選択される確率は低くなる。
【００１６】
本発明のアルセリン２遺伝子のプロモーター配列及びターミネーター配列を含むＤＮＡの単離は、制限酵素処理を施したゲノッミクＤＮＡにアダプターを結合させ、既知配列とアダプター配列を基にプライマーを設計してＰＣＲを行い未知の領域をクローニングする手法、すなわち、ＰＣＲ技術を使用したゲノムウォーキング法を用いて行うことができる。具体的には、アダプター配列特異的なプライマーと、既知のアルセリン２遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列（GenBank accession No.M28470）をもとに設計したアルセリン２遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、インゲンマメアルセリン２遺伝子の上流域及び下流域を増幅し、これをベクターにクローニングして塩基配列を決定することによって、インゲンマメアルセリン２遺伝子のプロモーター及びターミネーター領域の単離、及び塩基配列の決定を行うことができる。
【００１７】
なお、一般にプロモーター活性を有するＤＮＡ及びターミネーター活性を有するＤＮＡの塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された場合であっても、該プロモーター活性及びターミネーター活性が維持され得ることは当業者において広く認識されるところである。従って、本発明に係るＤＮＡには、配列番号１及びの塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加されて形成された塩基配列を含むＤＮＡであって、種子特異的なプロモーター活性を有するＤＮＡが含まれ、また、本発明に係るベクターに組み込まれるターミネーター活性を有するＤＮＡには、配列番号２の塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加されて形成された塩基配列を含むＤＮＡであって、ターミネーター活性を有するＤＮＡが含まれる。このようなＤＮＡは、部位特異的変異導入法等の当業者に周知の方法を用いて生産することができる。ここでいう「１個もしくは数個」とは、好ましくは１〜９の整数個、より好ましくは１〜４の整数個である。
【００１８】
本発明において、配列番号１の塩基配列の部分配列、又は配列番号１の塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたものであって、種子特異的なプロモーター活性を有するＤＮＡをコードする塩基配列（以下、配列番号１のホモログ配列と呼ぶ）の部分配列とは、配列番号１又は配列番号１のホモログ配列に含まれる連続した塩基配列をいう。当該部分配列を含むＤＮＡのうち、種子特異的なプロモーター活性を有するものが本発明に係るＤＮＡに含まれる。このようなＤＮＡとしては、例えば、配列番号１の塩基番号１３９９〜３８６０に記載された塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。
【００１９】
また、いったん本発明のプロモーター及びターミネーターの塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、あるいはその塩基配列の一部からなるＤＮＡをプライマーとして合成して、インゲンマメの全ＤＮＡを鋳型に該プライマーを用いたＰＣＲによって容易に得ることができる。
【００２０】
（２）プロモーター活性の検定
単離されたＤＮＡが、種子特異的なプロモーター活性を有することの確認は、該ＤＮＡの下流に発現量を定量できるレポーター遺伝子を組込んだベクターを導入した形質転換植物体における、該レポーター遺伝子の発現部位及び発現量を調べることによって行うことができる。
【００２１】
前記レポーター遺伝子としては、例えばβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子や、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子、ＧＦＰ遺伝子などが挙げられる。
【００２２】
ベクターを導入することによる形質転換植物体の作製は、すでに報告され、確立されている種々の方法により行うことができる。その好ましい例としては、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などが挙げられる。
【００２３】
種子特異的なプロモーター活性を測定するために形質転換され得る植物としては、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、ダイズ、インゲン、ナタネ、シロイヌナズナなどが挙げられる。また、形質転換される植物材料としては、例えば、根、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等の植物組織やその切片、未分化のカルス、プロトプラスト等の植物培養細胞が挙げられる。
【００２４】
レポーター遺伝子としてＧＵＳ遺伝子を用いる場合、該遺伝子発現産物の触媒作用による５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−Ｇｌｕｃ）を基質とした組織化学的染色により、プロモーター活性の測定を行うことができる。また、種子特異的であるかどうかの確認は、一過性発現の確認の場合は、種子又はそれ以外の上記各植物組織をベクターにより形質転換し、例えば３〜５日経過したものを組織化学的染色することにより確認できる。さらにはベクターによる形質転換後、それぞれの植物種で報告されている植物体を再生させる工程により形質転換植物体を得、該形質転換植物体により形成された種子を含むそれ以外の組織を調べることによっても確認できる。
【００２５】
（３）本発明に係るベクター
本発明に係るベクターは、本発明に係るＤＮＡと、該ＤＮＡの下流に位置する外来タンパク質をコードする外来遺伝子と、該外来遺伝子の下流に位置するターミネーター活性を有するＤＮＡとを含む。該外来遺伝子には、インゲンマメ以外に由来する遺伝子の他、インゲンマメに由来する遺伝子であって、アルセリン２遺伝子と異なる塩基配列を有する遺伝子も含まれる。該外来遺伝子は、ワクチン、酵素、抗体、機能性タンパク質、機能性ペプチド等の有用なタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。これらの遺伝子に、該遺伝子の発現産物を細胞の特定の位置に配置させるためのシグナルペプチドをコードする塩基配列や、該発現産物の単離・精製を容易にするためのタグペプチド（ＧＳＴ、ｈｉｓ−ｔａｇ等）をコードする塩基配列等を結合させ、融合タンパク質として発現されるようにすることもできる。本発明に係るベクターは、さらに選抜マーカーを含むことが好ましい。該選抜マーカーとしては、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子などが例示される。本発明に係るベクターを植物に導入することで、後述する形質転換植物体を作製することができる。
【００２６】
本発明に係るベクターは、当業者に既知の手段を用いて作製することができる。例えば、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡと、その下流に位置する外来遺伝子と、さらにその下流に位置する配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡとを含むベクターは以下のようにして得ることができる。
【００２７】
まず、配列番号１の５’末端から３’側に向けて連続した塩基配列からなる第１のプライマーと、配列番号２の３’末端から５’側に向けて連続した塩基配列の相補鎖からなる第２のプライマーを用いて、インゲンマメのゲノミックＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、配列番号１の塩基配列と配列番号２の塩基配列と、これら２つの配列の間に挟まれたアルセリン２遺伝子から構成されたＤＮＡを得、これをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII
ＳＫ（−）のような市販のクローニングベクターに組み込む。これをホストとなる大腸菌に導入して適宜複製させてから再度抽出し、これをテンプレートとして、配列番号２の５’末端から３’側に向けて連続した塩基配列からなる第３のプライマーと、配列番号１の３’末端から５’末端に向けて連続した塩基配列の相補鎖からなる第４のプライマーを用いて、ＰＣＲを行う。この増幅産物に、別に単離されてきた外来遺伝子を連結して環状プラスミド状のベクターとすれば、本発明に係るベクターを作製することができる。ここで、前記第１〜４のプライマーには、必要に応じて制限酵素認識配列を付加することもできる。
【００２８】
前記第１のプライマーの５’末端を、配列番号１の５’末端より下流に設定すれば、配列番号１の塩基配列の部分配列からなるＤＮＡと、その下流に位置する外来遺伝子と、さらにその下流に位置する配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡとを含むベクターを作製することができる。
【００２９】
上記のように作製したベクター中の塩基配列は、部位特異的変異導入法などの当業者に周知の手法で当該塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列に変異させることができる。
また、選抜マーカーをコードする遺伝子は公知の塩基配列のものを使用することができ、市販のベクターにも種々の選抜マーカー遺伝子を含むベクターが市販されているため、本願発明に係るベクター中への選抜マーカー遺伝子の挿入は、当業者に周知の分子生物学的手法により容易に行うことができる。
【００３０】
（４）本発明に係る形質転換植物体
上記のように調製した組換えベクターを用いて、対象植物を形質転換し、形質転換植物体を調製することができる。形質転換植物体を調製するには、すでに報告され、確立されている種々の方法を利用することができる。その好ましい例としては、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などが挙げられる。
【００３１】
本発明において形質転換に用いられる植物としては、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、ダイズ、インゲン、ナタネ、シロイヌナズナなどの植物が挙げられる。また、形質転換される植物材料としては、例えば、根、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等の植物組織やその切片、未分化のカルス、プロトプラスト等の植物培養細胞が挙げられる。上記組織及び細胞に形質転換した後、選抜マーカー遺伝子によってもたらされる耐性効果を指標に、形質転換植物細胞を選抜する。選抜された細胞から、それぞれの植物種で報告されている植物体を再生させる工程を経て、形質転換植物体を得ることができる。
【００３２】
こうして得られた形質転換植物体の栽培を行い、種子を稔実させることで、本発明に係る形質転換種子を得ることができ、該形質転換種子中に目的とする外来タンパク質が得られる。
【００３３】
遺伝子が植物体に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ウエスタンブロッティング法などによって行うことができる。例えば、形質転換植物体の種子からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロッティングを行う。ウエスタンブロッティング後、生産された外来タンパク質に特異的な一次抗体及び西洋わさび過酸化酵素（ＨＲＰ）などを標識した二次抗体を用いて免疫染色を行うことにより、本発明に係るベクターを用いた外来遺伝子の導入が適切に行われ、該外来遺伝子に由来する有用タンパク質が種子に蓄積されていること、及びその蓄積量を確認することができる。
【実施例】
【００３４】
以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
なお、以下の実施例で行われるアルセリン２遺伝子のプロモーター領域及びターミネーター領域を含むＤＮＡの単離操作は、制限酵素処理を施したゲノミックＤＮＡ断片にアダプターを結合させ、既知配列とアダプター配列に基づいてプライマーを設計し、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行い未知の領域をクローニングするための市販されたキットである、株式会社ベックス製のＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTMを用いて実施した。
【００３５】
［実施例１］
（１）インゲンマメ野生種のゲノミックＤＮＡの調製
インゲンマメ野生種（系統番号：Ｇ１２８６６）の生葉１ｇからＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてゲノミックＤＮＡ５０μｇを抽出した。
【００３６】
（２）インゲンマメ野生種からのアルセリン２遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡの単離
（i）第一回伸長反応
２８０ｎｇの上記ゲノミックＤＮＡを制限酵素ＳａｕIIIＡIで消化した後、ｄＧＴＰを加え、ｋｌｅｎｏｗ ｅｎｚｙｍｅ（プロメガ社製）により１塩基伸張反応を行った。その後、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のＲＷＡ−１アダプターとＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて連結反応を行い、アルセリン２遺伝子の上流域のＤＮＡを単離するためのＰＣＲの鋳型とした。
【００３７】
次に、公知のインゲンマメアルセリン２遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列（GenBank accession No.M28470）に基づき、配列番号４及び配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＳＰ１及びプライマーＳＰ２と命名）を、株式会社ファスマックのカスタム合成受託サービスを利用して作製した。以降、特に記述がない限りプライマーの合成は、同社を利用して行った。
【００３８】
次に、上記で構築したアダプターを連結したゲノミックＤＮＡ２．８ｎｇを鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−１及びプライマーＳＰ１を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃、２分で１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを６５℃で３０秒、及び伸長反応を６８℃で５分を１サイクルとして３５サイクル行った。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、１ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。
【００３９】
ＰＣＲ終了後、反応液を１００倍に希釈し、その１μＬを２回目のＰＣＲの鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−２及びプライマーＳＰ２を用いてＰＣＲを行った。なお、２回目のＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、１回目のＰＣＲと同条件で行った。
【００４０】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。
【００４１】
この反応産物を、Ａｒｃ２Ｐ（i）とし、株式会社ファスマックのＤＮＡシーケンシングサービスを用いて塩基配列を決定した。その結果、アルセリン２遺伝子の開始コドンの上流８４４ｂｐの新規な領域を含むことを確認した。以降、特に記述がない限り塩基配列の決定は同社のシーケンシングサービスを用いて行った。
【００４２】
次に、さらに上流域を単離するため、新たなプライマーを作製し第二回目となる伸長反応を行った。
【００４３】
（ii）第二回伸長反応
２８０ｎｇの上記ゲノミックＤＮＡを制限酵素ＢｇｌIIで消化した後、ｄＧＴＰを加え、ｋｌｅｎｏｗ ｅｎｚｙｍｅ（プロメガ社製）により１塩基伸張反応を行った。反応後、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のＲＷＡ−１アダプターと連結反応を行い、プロモーター単離のためのＰＣＲの鋳型とした。
【００４４】
次に、公知のインゲンマメアルセリン２遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列（GenBank accession No.M28470）に基づき、配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（プライマーｓｅｃｏｎｄＳＰ１と命名）を、また第一回伸長反応で得られた開始コドンの上流８４４ｂｐの塩基配列に基づき配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（プライマーｓｅｃｏｎｄＳＰ２と命名）を作製した。
【００４５】
次に、上記で構築したアダプターを連結したゲノミックＤＮＡ２．８ｎｇを鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−１及びプライマーｓｅｃｏｎｄＳＰ１を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、上記（i）の第一回伸長反応と同条件で行った。
【００４６】
反応終了後、上記ＰＣＲ液を１００倍に希釈し、その１μＬを２回目のＰＣＲの鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−２及びプライマーｓｅｃｏｎｄＳＰ２を用いてＰＣＲを行った。なお、２回目のＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、１回目のＰＣＲと同条件である。
【００４７】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。
【００４８】
反応産物を、Ａｒｃ２Ｐ（ii）とし塩基配列を決定した。その結果、Ａｒｃ２Ｐ（i）の上流１９７ｂｐ（合計１０４１ｂｐ）の新規な領域を含むことを確認した。次に、さらに上流域を単離するため、新たなプライマーを作製し第三回目となる伸長反応を行った。
【００４９】
（iii）第三回伸長反応
２８０ｎｇの上記ゲノミックＤＮＡを制限酵素ＸｂａIで消化した後、ｄＣＴＰを加え、ｋｌｅｎｏｗ ｅｎｚｙｍｅ（プロメガ社製）により１塩基伸張反応を行った。反応後、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のＲＷＡ−２アダプターと連結反応を行い、プロモーター単離のためのＰＣＲの鋳型とした。
【００５０】
次に、第二回伸長反応で得られた１９７ｂｐの塩基配列に基づき、配列番号８及び配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーｔｈｉｒｄＳＰ１及びプライマーｔｈｉｒｄＳＰ２と命名）を作製した。
【００５１】
次に、上記で構築したアダプターを連結したゲノミックＤＮＡ２．８ｎｇを鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−１及びプライマーｔｈｉｒｄＳＰ１を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、上記(i)の第一回伸長反応と同条件で行った。
【００５２】
反応終了後、上記反応液を１００倍に希釈し、その１μＬを２回目のＰＣＲの鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−２及びプライマーｔｈｉｒｄＳＰ２を用いてＰＣＲを行った。なお、２回目のＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、１回目のＰＣＲと同条件である。
【００５３】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。
【００５４】
この反応産物を、Ａｒｃ２Ｐ（iii）とし、塩基配列を決定した。その結果、Ａｒｃ２Ｐ（ii）の上流２８１９ｂｐ（合計３８６０ｂｐ）の新規な領域を含むことを確認した。以上、三回の伸長反応によってアルセリン２遺伝子の開始コドンの上流５′側非翻訳領域を含む３８６０ｂｐの新規なプロモーター配列を含むＤＮＡを取得することができた（配列番号1）。アルセリン２遺伝子と相同性を有する公知の遺伝子であるアルセリン１（GenBank accession No.M68913）、アルセリン３（GenBank accession No.AX463292）、アルセリン４（GenBank accession No.AX463293）及びアルセリン５−１（GenBank accession
No.Z50202）のプロモーター配列との相同性を調べた結果、いずれとの比較においても相同性は５５．４％以下であり、配列番号１に記載のＤＮＡは新規なアルセリンプロモーター配列を含むＤＮＡであることが明らかとなった。
【００５５】
［実施例２］
（１）インゲンマメ野生種からのアルセリン２遺伝子のターミネーター配列を含むＤＮＡの単離
上記実施例１（１）で抽出したゲノミックＤＮＡ２８０ｎｇを制限酵素ＮｈｅIで消化した後、ｄＣＴＰを加え、ｋｌｅｎｏｗ ｅｎｚｙｍｅ（プロメガ社製）により１塩基伸張反応を行った。反応後、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のＲＷＡ−２アダプターとＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて連結反応を行い、ターミネーター遺伝子の単離のためのＰＣＲの鋳型とした。
【００５６】
次に、公知のインゲンマメアルセリン２遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列（GenBank accession No.M28470）に基づき、配列番号１０及び配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＳＰ３及びプライマーＳＰ４と命名）を作製した。
【００５７】
次に、上記で構築したアダプターを連結したゲノミックＤＮＡ２．８ｎｇを鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−１及プライマーＳＰ３を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを６５℃で３０秒、及び伸長反応を６８℃で５分を１サイクルとして３５サイクル行った。なお、反応液は２００μMのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、１ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。
【００５８】
ＰＣＲ終了後、反応液を１００倍に希釈し、その1μＬを２回目のＰＣＲの鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−２及びプライマーＳＰ４を用いてＰＣＲを行った。なお、２回目のＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、１回目のＰＣＲと同条件で行った。
【００５９】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。
【００６０】
反応産物を、Ａｒｃ２Ｔとし、塩基配列を決定した。その結果、アルセリン２遺伝子の３’側非翻訳領域を含む終止コドンの下流７９５ｂｐの新規な領域を含むことを確認した（配列番号２）。公知のアルセリン２遺伝子と相同な遺伝子であるアルセリン１（GenBank accession No.M68913）及びアルセリン５−１（GenBank accession No.Z50202）のターミネーター領域と相同性について検索した結果、いずれとの比較においても相同性は４９．１％以下であり、配列番号２に記載のＤＮＡは新規なターミネーター配列を含むＤＮＡであることが明らかとなった。
【００６１】
［実施例３］
（１）アルセリン２ゲノム遺伝子に相当するＤＮＡの合成と単離
上記実施例１（１）で抽出したゲノミックＤＮＡ８０ｎｇを鋳型として、ＰＣＲを行った。配列番号１及び配列番号２に記載された塩基配列に基づき、配列番号１２及び配列番号１３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＡｒｃ２Ｐ及びプライマーＡｒｃ２Ｔと命名）を作製した。
【００６２】
ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを５７℃で３０秒、及び伸長反応を６８℃で４分を１サイクルとして２５サイクル行った。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、１ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。
【００６３】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。
【００６４】
反応産物を、Ａｒｃ２ＰＣＴとし、塩基配列を決定した。その結果、アルセリン２遺伝子、及びその５’側非翻訳領域を含む開始コドンの上流２４６１ｂｐのプロモーター領域を含み、且つ３’側非翻訳領域を含む終止コドンの下流７９５ｂｐの新規な領域を含むことを確認した（配列番号３）。こうして得られた組換えベクターＡｒｃ２ＰＣＴを導入した大腸菌ＤＨ５α（タカラバイオ株式会社製）は、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α/Ａｒｃ２ＰＣＴと命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに2008年7月30日より、受託番号P-21624 として寄託されている。
【００６５】
（２）植物におけるプロモーター活性検定ベクターの作製
（i）アルセリン２プロモーター活性検定ベクターの作製
上記実施例３（１）で得たＡｒｃ２ＰＣＴの１０ｎｇを鋳型として、プロモーター、ターミネーター及びベクター部分を増幅するＰＣＲを行った。配列番号３に記載された塩基配列に基づき、配列番号１４及び配列番号１５のオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＡｒｃ２Ｐ３及びプライマーＡｒｃ２Ｔ５と命名）を作製した。
【００６６】
ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを５７℃で３０秒、及び伸長反応を６８℃で６分３０秒を１サイクルとして２５サイクル行った。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、1ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。こうして、アルセリン２遺伝子のプロモーター２４６１ｂｐとターミネーター７９５ｂｐ及びそれらの間にベクターの配列を含むＤＮＡ断片Ａｒｃ２ＰＴを得た。
【００６７】
次に、植物細胞形質転換用ベクターｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子のＰＣＲによる増幅反応を行った。
【００６８】
公知のｐＢＩ２２１の塩基配列（GenBank accession No.AF502128）に基づき、配列番号１６及び配列番号１７のオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＧＵＳ５及びプライマーＧＵＳ３と命名）を作製した。
【００６９】
ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを５７℃で３０秒、及び伸長反応を６８℃で２分を１サイクルとして２５サイクル行った。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、１ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。こうして、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子１８１２ｂｐの遺伝子断片ＧＵＳ１を得た。
【００７０】
ＧＵＳ１遺伝子断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、上記Ａｒｃ２ＰＴと連結反応を行った。こうして、β−グルクロニダーゼ遺伝子の上流にアルセリン２遺伝子のプロモーター２４６１ｂｐ及び下流にターミネーター７９５ｂｐを含む、プロモーター活性検定ベクターＡｒｃ２ＰＧＵＳを作製した。
【００７１】
（ii）アルセリン５プロモーター活性検定ベクターの作製
本発明におけるアルセリン２プロモーター配列を含むＤＮＡのプロモーター活性を確認するにあたり、他の種子特異的なプロモーター活性を有するプロモーターとの比較を行うため、種子特異的発現が認められている、公知のアルセリン５プロモーター及びターミネーター（国際公開ＷＯ０２／５０２９５号パンフレット）の単離を行った。
【００７２】
インゲンマメ野生種（系統番号：Ｇ０２７７１）の生葉１ｇからＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてゲノミックＤＮＡ５０μｇを抽出した。該ゲノミックＤＮＡ８０ｎｇを鋳型として、ＰＣＲを行った。公知のインゲンマメアルセリン５−１遺伝子（GenBank accession No.Z50202）の塩基配列に基づき、配列番号１８及び配列番号１９の塩基配列からなる２種類のオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＡｒｃ５Ｐ及びプライマーＡｒｃ５Ｔと命名）を作製した。
【００７３】
ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃３０秒、アニーリングを５７℃３０秒及び伸長反応６８℃４分を１サイクルとして２５サイクル行った。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、１ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。
【００７４】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。反応産物を、Ａｒｃ５ＰＣＴとし、塩基配列を決定した。その結果、アルセリン５遺伝子、及びその５’側非翻訳領域を含む開始コドンの上流１８１８ｂｐのプロモーター領域を含み、且つ３’側非翻訳領域を含む終止コドンの下流１１９２ｂｐの領域を含むことを確認した。
【００７５】
上記で得たＡｒｃ５ＰＣＴの１０ｎｇを鋳型として、ＰＣＲを行った。公知のアルセリン５−１遺伝子の塩基配列より、配列番号２０及び配列番号２１の塩基配列からなる２種類のオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＡｒｃ５Ｐ３及びプライマーＡｒｃ５Ｔ５と命名）を作製した。
【００７６】
ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを５７℃で３０秒、及び伸長反応を６８℃で６分３０秒を１サイクルとして２５サイクル行った。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、1ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。こうして、アルセリン５遺伝子のプロモーター１８１８ｂｐ及びターミネーター１１９２ｂｐを含む遺伝子断片Ａｒｃ５ＰＴを得た。
【００７７】
これに、上記のリン酸化反応済みＧＵＳ１遺伝子断片を連結して、β−グルクロニダーゼ遺伝子の上流にアルセリン５遺伝子のプロモーター１８１８ｂｐ及び下流にターミネーター１１９２ｂｐを含む、プロモーター活性検定ベクターＡｒｃ５ＰＧＵＳを作製した。
【００７８】
［実施例４］
（１）ダイズ種子におけるプロモーター活性の検定
上記実施例３で得られた組換えベクターＡｒｃ２ＰＧＵＳ及び比較区としてＡｒｃ５ＰＧＵＳをダイズの種子へウイスカ法（特許第３３１２８６７号公報）により遺伝子導入した。
【００７９】
ダイズ（品種：Ｊａｃｋ）の開花２５日後の莢を７０％エタノール溶液に１分間、次いで次亜塩素酸ナトリウム０．５％（有効塩素濃度）溶液に３０分間浸漬して莢を殺菌処理した。無菌的に登熟種子を取り出し、次に種皮を取り除いた。種子を、５〜７ｍｍ角に切断し、遺伝子導入サンプルとした。
【００８０】
チタン酸カリウム製ウイスカＬＳ２０（チタン工業社製）５ｇを１．５ｍＬ容のチューブに入れ、１時間放置した後、エタノールを除去し、完全に蒸発させて、殺菌されたウイスカを得た。このウイスカの入ったチューブに滅菌水１ｍｌを入れ、良く攪拌した。ウイスカと滅菌水を遠心分離し、上清の水を捨てた。このようにしてウイスカを洗浄した。このウイスカ洗浄操作を３回行った。その後、同チューブに公知のＭＳ液体培地の０．５ｍｌを加えてウイスカ懸濁液を得た。
【００８１】
上記で得られたウイスカ懸濁液の入ったチューブに、上記の種子２粒分の種子切片を入れて攪拌した後、混合物を１０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離し、種子切片とウイスカを沈殿させ、上清を捨て、種子切片とウイスカの混合物を得た。
【００８２】
この混合物を入れたチューブに、前記の組換えベクター（すなわち前記の組換えベクターＡｒｃ２ＰＧＵＳ、又はＡｒｃ５ＰＧＵＳ）の２０μＬ（２０μｇ）を加え、十分振り混ぜて均一な混合物を得た。次にこの均一な混合物の入ったチューブを１８０００×ｇで５分間遠心分離した。遠心分離した混合物を再度振り混ぜ、この操作を３回反復した。
【００８３】
上記のようにして得られた、種子切片と、ウイスカと、ベクターを収容しているチューブを超音波発生機の浴槽にチューブが十分浸るように設置した。周波数４０ｋＨｚの超音波を強度０．２５Ｗ／ｃｍ2で１分間照射した。照射後、１０分間、４℃でこの混合物を保持した。このように超音波処理した混合物を前記のＭＳ液体培地で洗浄し、形質転換種子切片を得た。
【００８４】
上記で組換えベクターを導入して得た種子切片を、ＭＳ培地にショ糖３０グラム／Ｌ、寒天８ｇ／Ｌを添加して得たＭＳ寒天培地に置床した。その後に、２８℃、２０００ルックス、１６時間日長の条件下で３日間培養を行った。
【００８５】
上記で得られた組換えベクターが形質転換されたダイズ種子におけるＧＵＳ染色を公知の方法（Plant Genetic Transformation and Gene Expression A laboratory manual，324頁〜327頁、Blackwell Scientific Publications LTD）に準じて行った。
【００８６】
ダイズ種子切片を直径３．５ｃｍのシャーレに入れ、染色用バッファー（２ｍＭ Ｘ−Ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β―Ｄ−グルクロン酸）、５０ｍＭ ＮａＰＯ4，ｐＨ７．０）を３ｍＬずつ添加して浸漬した。３７℃で一晩保温した後、染色バッファーを取り除き、７０％エタノールを３ｍＬずつ添加して洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した後、ダイズ種子切片におけるブルースポット数を調査した。結果を表１に示す。
【００８７】
【表１】
【００８８】
上記のように本発明区のＡｒｃ２ＰＧＵＳを導入した種子切片のブルースポット数は、種子特異的発現プロモーターであるアルセリン５−１プロモーターを連結したＡｒｃ５ＰＧＵＳよりブルースポット数が多く、種子において高い発現を示すことが認められた。
【００８９】
（２）ダイズ不定胚におけるプロモーター活性の検定
次に、本発明のプロモーターの発現時期を確認するため、胚発生の初期段階にあたるダイズ球状不定胚に遺伝子導入を行った。また、比較区としてβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子の上流にカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを連結したｐＢＩ２２１(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製)についても遺伝子導入を行った。
【００９０】
公知の方法（K. Nishizawa, Y. Kita, M. Kitayama, M. Ishimoto. (2006) A red fluorescent protein, DsRed2, as a visual reporter for transient expression and stable transformation in soybean. Plant Cell Reports 25:1355-1361）により、ダイズ（品種：Jack）未熟種子から誘導された不定胚塊（直径３ｍｍ以下）３０個を１．５ｍＬ用のチューブに加え、上記実施例４（１）と同様の方法で、遺伝子導入操作を行った。
【００９１】
遺伝子導入後の不定胚塊を直径３．５ｃｍのシャーレに入れ、公知の不定胚増殖培地を３ｍＬ加え、２５℃、５００ルックス、２３時間日長の条件下で３日間培養を行った。上記で得られた組換えベクターが形質転換されたダイズ不定胚におけるＧＵＳ染色を上記（１）の方法でＧＵＳ染色を行った。結果を表２に示す。
【００９２】
【表２】
【００９３】
上記のように本発明区のＡｒｃ２ＰＧＵＳはブルースポットが認められず、胚発生の初期段階にあたるダイズ球状不定胚においては、発現が認められなかった。以上のことから、本発明のアルセリン２プロモーターは、種子の登熟後期において特異的な発現を示す高発現プロモーターであることが証明された。
【００９４】
［実施例５］
（１）インゲンマメのアルセリン２タンパク質の発現プラスミドの構築
アルセリン２遺伝子のプロモーターの制御下で、インゲンマメのアルセリン２貯蔵タンパク質をダイズ種子中で発現させるための発現プラスミドを構築した。
【００９５】
上記、実施例３（１）で得られた、Ａｒｃ２ＰＣＴを公知のｐＵＨＧベクター（Ｙ． Ｋｉｔａ，Ｋ． Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｍ Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｍ. Ｋｉｔａｙａｍａ， Ｍ． Ｉｓｈｉｍｏｔｏ． （２００７）Ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｌｉｎｅｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２６：４３９−４４７）に連結し、アルセリン２遺伝子のプロモーターによりアルセリン２タンパク質を発現するための植物形質転換ベクターの構築を行った。
【００９６】
Ａｒｃ２ＰＣＴを制限酵素ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断を行い、ｐＵＨＧベクターのＳｐｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトに連結反応を行い、植物形質転換ベクターｐＵＨＧＡｒｃ２ＰＣＴを作成した。すなわち、Ａｒｃ２ＰＣＴの２μｇを制限酵素ＳｐｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩの２０単位で３７℃、２時間切断した後、アガロース電気泳動を行い、Ａｒｃ２ＰＣＴにおいて約４．０ｋｂの断片のみを切り出し、ジーンクリーン（Ｂｉｏ１０１社製）により精製した。一方ｐＵＨＧプラスミド２μｇをＳｐｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ２０単位で３７℃、２時間切断した後、ジーンクリーンにより精製した。夫々のＤＮＡフラグメントを、Ｔａｋａｒａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔにて、１６℃、３時間反応させた。
【００９７】
このようにしてプラスミドｐＵＨＧのＳｐｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断ＤＮＡフラグメントに、Ａｒｃ２ＰＣＴ由来の約４．０ｋｂのＳｐｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断フラグメントを組み込んだ植物形質転換ベクターｐＵＨＧＡｒｃ２ＰＣＴを作製した。
【００９８】
（２）インゲンマメのアルセリン２タンパク質の発現プラスミドによるダイズの形質転換
公知の方法（Ｋ． Ｎｉｓｈｉｚａｗａ， Ｙ． Ｋｉｔａ， Ｍ． Ｋｉｔａｙａｍａ， Ｍ． Ｉｓｈｉｍｏｔｏ． （２００６） Ａ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ， ＤｓＲｅｄ２， ａｓ ａ ｖｉｓｕａｌ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２５：１３５５−１３６１）により、ダイズ品種Ｊａｃｋの未熟種子から誘導された不定胚塊（直径３ｍｍ以下）３０個を１．５ｍｌ用のチューブに加え、ウイスカー超音波法（特許第３３１２８６7号）により遺伝子導入操作を行った。
【００９９】
チタン酸カリウム製ウイスカーＬＳ２０（チタン工業社製）５ｍｇを１．５ｍｌ容のチューブに入れ、１時間放置した後、エタノールを除去し、完全に蒸発させて、殺菌されたウイスカーを得た。このウイスカーの入ったチューブに滅菌水１ｍｌを入れ、良く攪拌した。ウイスカーと滅菌水を遠心分離し、上清の水を捨てた。このようにしてウイスカーを洗浄した。このウイスカー洗浄操作を３回行った。その後、同チューブに公知のＭＳ液体培地の０．５ｍｌを加えてウイスカー懸濁液を得た。
【０１００】
上記で得られたウイスカー懸濁液の入ったチューブに、上記の不定胚塊（直径３ｍｍ以下）３０個を入れて攪拌した後、混合物を１０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離し、不定胚塊とウイスカーを沈殿させ、上清を捨て、不定胚塊とウイスカーの混合物を得た。
【０１０１】
この混合物を入れたチューブに、実施例５（１）で作製したｐUHGＡｒｃ２ＰＣＴベクターの２０μｌ（２０μg）を加え、十分振り混ぜて均一な混合物を得た。
【０１０２】
次にこの均一な混合物の入ったチューブを１８０００ｘｇで５分間遠心分離した。遠心分離した混合物を再度振り混ぜ、この操作を３回反復した。
【０１０３】
上記のようにして得られた、不定胚塊と、ウイスカーと、ベクターを収容しているチューブを超音波発生機の浴槽にチューブが十分浸るように設置した。周波数４０ｋＨｚの超音波を強度０．２５Ｗ／ｃｍ2で１分間照射した。照射後、１０分間、４℃でこの混合物を保持した。このように超音波処理した混合物を前記のＭＳ液体培地で洗浄した。
【０１０４】
処理後の不定胚塊を公知の不定胚増殖液体培地で1週間回転振とう培養し（１００ｒｐｍ）、その後にハイグロマイシンB（１５ｍｇ／ｌ）（ロッシュ・ダイアグノスティックス、マンハイム、ドイツ）を含んでいる新鮮な不定胚増殖液体培地で１週間培養した。さらに３０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンBを含んでいる不定胚増殖液体培地で４週間培養（毎週培地を交換する）した後、４５ｍｇ／ｌのハイグロマイシンBを含んだ不定胚増殖液体培地で1週間選抜培養を行った。なお、遺伝子導入は各ベクターごとにマイクロチューブ１２本の処理を行った。
【０１０５】
ハイグロマイシン耐性の不定胚塊を公知の不定胚成熟液体培地へ移し、４週間振とう培養（１００ｒｐｍ）を継続し不定胚を成熟させた。成熟した不定胚を滅菌シャーレ中に３から５日間置き乾燥させた後、公知の発芽固体培地に移した。７から１０日間発芽培養を行った後、公知の発根培地に移し、発芽している幼植物体を成長させた。根と芽が伸びた後に、土壌を含んでいるポットへ植物を移し、順化するまで高湿度に維持した。
【０１０６】
このようにしてＪａｃｋ品種にｐＵＨＧＡｒｃ２ＰＣＴを導入した形質転換ダイズ植物を３個体作出した。これらの形質転換ダイズの植物体は環境湿度に適応させた後、１００００ｌｘ、１６時間日長の環境下で栽培を継続し、すべての個体から種子を収穫した。こうして、形質転換ダイズ植物のＴ1世代の種子を得た。
【０１０７】
（３）形質転換ダイズ種子におけるアルセリン２タンパク質の蓄積量の評価
上記で得た形質転換ダイズ種子より全タンパク質を抽出し、アルセリン２タンパク質の蓄積量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のＣＢＢ（Coomassie Brilliant Blue R−250）染色および特異抗体を用いたウエスタンブロッティング法で評価した。
【０１０８】
形質転換ダイズ種子より抽出した全タンパク質２0μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ラピットＣＢＢ ＫＡＮＴＯ（関東化学株式会社製）による染色を行った（図１）。また、アルセリン２に対する特異抗体（独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 北海道農業研究センターから入手）を反応させた後、ＥＣＬ Ａｄｖａｎｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いて検出を行った。化学発光像を、ＬＡＳ４０００ｍｉｎｉＰＲ（富士フィルム社製）で取り込んだ後、同機付属の解析ソフトウェアＭｕｌｔｉＧａｇｅを用いて解析を行った（図２）。対照として、アルセリン２遺伝子の単離を行ったインゲンマメ野生種（系統番号：Ｇ１２８６６）及び形質転換されてないダイズ品種Jackの種子より抽出した全タンパク質を用いた。
【０１０９】
その結果、上記で得た形質転換ダイズ種子の各系統にインゲンマメのアルセリン２貯蔵タンパク質に相当するシグナルバンドが確認でき、アルセリン２貯蔵タンパク質のダイズ種子中への高濃度蓄積が確認できた。尚、各レーン間を比較すると、アルセリン２貯蔵タンパク質の発現量にばらつきがあるが、遺伝子導入植物において、個体ごとに導入遺伝子の発現量にばらつきが生じることが一般的な現象であることは当業者の技術常識である。また、図１では、形質転換ダイズにおいて、アルセリン２タンパク質の存在がＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のＣＢＢ染色ではっきりと認められているが、通常、植物においては、導入された外来遺伝子の発現産物であるタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のタンパク質染色でメジャーバンドとして検出することが困難であることに鑑みれば、本実施例における該アルセリン２タンパク質の蓄積量が極めて多いことが理解できる。
【０１１０】
以上の結果より、アルセリン２遺伝子のプロモーターが、ダイズ種子において、その下流に連結された目的遺伝子を高発現し、発現したタンパク質の種子中への蓄積をもたらすことが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明により、本来的な貯蔵器官である植物の種子にワクチン、抗体、抗生剤などの有用タンパク質を生産・蓄積させることが可能になり、医薬品原料等の効率的、安定的な供給が可能になる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インゲンマメの種子貯蔵タンパク質アルセリン２をコードする遺伝子のプロモーター配列を含む新規なＤＮＡに関する。また、本発明は前記ＤＮＡを含むベクターに関する。さらに、本発明は、前記ＤＮＡ及びベクターの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロモーターは遺伝子の発現を制御する機能を持つＤＮＡであり、植物細胞内で機能することが可能なプロモーターとして各種のプロモーターが知られている。発現させようと所期する構造遺伝子を各種プロモーターの下流に連結し、これをプラスミドベクターに挿入することで組換えベクターを作製することができる。そして、その組換えベクターを植物細胞に導入することによって、植物細胞内で所期の構造遺伝子をプロモーターの特性に応じた態様により発現させることができる。近年、遺伝子組換え技術による植物の品種改良は植物の形質改良のみならず、植物中で医薬原料、健康食品素材、酵素等の有用タンパク質を生産、蓄積させる研究開発がなされている。植物における組換え有用タンパク質の生産に関しては、その生産、蓄積部位として種子及び葉などが用いられているが、特に種子はタンパク質の貯蔵器官として優れており、目的の外来タンパク質を大量に、かつ安定的に蓄積することが可能である。また種子であるため保存安定性が高く、加工も容易である。
【０００３】
一方で、目的とする有用タンパク質を種子特異的に生産、蓄積させるためには種子で遺伝子発現を誘導するプロモーターの制御下に外来遺伝子を発現させることが必要である。これまで知られている種子特異的な遺伝子発現を誘導するプロモーターとしては、イネグルテリンプロモーター（特許文献１参照）、亜麻種子特異的プロモーター（特許文献２参照）、インゲンマメアルセリン５プロモーター（特許文献３参照）が知られている。
【０００４】
しかしながら、イネグルテリンプロモーターを用いて外来タンパク質を発現させた場合、その蓄積部位はでんぷん層である胚乳であり、無胚乳種子であるマメ科植物などには適さない。亜麻種子特異的プロモーターはマメ科植物で使用できることは実証されていない。インゲンマメアルセリン５プロモーターは、組換体におけるプロモーター活性についての報告がなく、実際に種子にどの程度外来タンパク質を蓄積させることができるか不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−１３０８３３号公報
【特許文献２】特表２００３−５２５０３０号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００２／５０２９５号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、マメ科植物の種子特異的なプロモーター活性を有する新規なＤＮＡを提供することである。また、本発明の目的は、当該ＤＮＡを含むベクター、及び該ベクターが導入された形質転換体を提供することである。また、本発明の目的は、優れたタンパク質の貯蔵部位である植物の種子に、外来のタンパク質を高率に発現させることで安価な外来タンパク質の生産方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、マメ科以外の植物においても、目的とする外来遺伝子を種子で発現させて、外来タンパク質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。
その研究の結果、後述される手法によって、インゲンマメの種子貯蔵タンパク質アルセリン２のプロモーター配列を有する新規なＤＮＡを単離することに成功した。さらに、前記のＤＮＡの塩基配列を決定した結果、前記ＤＮＡは、配列表の配列番号１の塩基配列を有する３８６０ｂｐのＤＮＡ断片であることを見出した。
【０００８】
さらに、前記ＤＮＡに含まれる塩基配列をレポーター遺伝子の上流に結合させたベクターを作製し、これをダイズ培養細胞及び種子へ導入した結果、前記塩基配列が種子特異的な遺伝子発現を誘導し、さらに、そのプロモーター活性が既知の種子特異的な発現を誘導するプロモーターと比較して高いことを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、
［１］
下記の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示す塩基配列を含むＤＮＡ：
（Ａ）配列番号１の塩基配列、
（Ｂ）配列番号１の塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたものであって、種子特異的なプロモーター活性を有するＤＮＡをコードする塩基配列、
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）に記載された塩基配列の部分配列であって、種子特異的なプロモーター活性を有するＤＮＡをコードする塩基配列、
［２］
配列番号１の塩基番号１３９９〜３８６０に記載された塩基配列を含むＤＮＡ、
［３］
［１］又は［２］に記載のＤＮＡと、該ＤＮＡの下流に連結された外来タンパク質をコードする外来遺伝子と、該外来遺伝子の下流に連結されたターミネーター活性を有するＤＮＡとを含むベクター、
［４］
前記ターミネーター活性を有するＤＮＡは、配列番号２の塩基配列、又は配列番号２の塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたものであってターミネーター活性を有するＤＮＡをコードする塩基配列を含む、［３］に記載のベクター、
［５］
［３］又は［４］に記載されたベクターが導入された形質転換植物体、
［６］
［３］又は［４］に記載されたベクターが導入された形質転換種子、
［７］
［１］又は［２］に記載のＤＮＡの制御下において、外来タンパク質をコードする外来遺伝子を植物の種子中で発現させることを特徴とする、外来タンパク質の生産方法、
を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のプロモーターは種子特異的なプロモーター活性を有するため、当該プロモーターに外来遺伝子を連結したベクターを用いて植物を形質転換することにより本来的な貯蔵器官である種子にワクチン、抗体、抗生剤、機能性タンパク質、機能性ペプチドなどに代表される、外来遺伝子に由来する有用タンパク質を効率的に生産、蓄積させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ｐＵＨＧＡｒｃ２ＰＣＴを導入した形質転換ダイズの種子におけるアルセリン２タンパク質の蓄積量を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のＣＢＢ染色の写真である。図中の矢印はアルセリン２タンパク質を示す。
【図２】ｐＵＨＧＡｒｃ２ＰＣＴを導入した形質転換ダイズの種子におけるアルセリン２タンパク質の蓄積量を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のウェスタンブロッティングの写真である。図中の矢印はアルセリン２タンパク質を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明に係るプロモーター及び本発明に係るベクターに組み込まれるターミネーター
本発明に係る種子特異的なプロモーター活性を有するＤＮＡ（以下、本発明に係るＤＮＡという）は、インゲンマメアルセリン２遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡであり、具体的には配列番号１の塩基配列又はその部分配列を含むＤＮＡが含まれる。
【００１３】
また、本発明に係るベクターに組み込まれるターミネーター活性を有するＤＮＡは、インゲンマメアルセリン２遺伝子のターミネーター配列を含むＤＮＡであり、具体的には配列番号２の塩基配列を含むＤＮＡが含まれる。
【００１４】
アルセリン遺伝子にはアルセリン１から７までの複数の相同性遺伝子の存在が知られており（非特許文献 Alianら；Plant Physiology 120, 1095-1104（1999））、それらの構造遺伝子をコードする部分の塩基配列の相同性は非常に高い。
【００１５】
一般に特定の構造遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡの単離は、ゲノミックＤＮＡライブラリーからのスクリーニング操作によって単離することができ、該構造遺伝子の塩基配列が明らかな場合、該塩基配列を基にプローブを調製し、ゲノミックＤＮＡライブラリーからスクリーニングを行い、選択されたクローンの塩基配列を決定することにより、プロモーター領域を含むＤＮＡを単離することができる。しかしながら、本発明のアルセリン２遺伝子のプロモーターのようにその構造遺伝子に相同性の高い複数の遺伝子が存在する場合、目的のプロモーター領域を含むクローンが選択される確率は低くなる。
【００１６】
本発明のアルセリン２遺伝子のプロモーター配列及びターミネーター配列を含むＤＮＡの単離は、制限酵素処理を施したゲノッミクＤＮＡにアダプターを結合させ、既知配列とアダプター配列を基にプライマーを設計してＰＣＲを行い未知の領域をクローニングする手法、すなわち、ＰＣＲ技術を使用したゲノムウォーキング法を用いて行うことができる。具体的には、アダプター配列特異的なプライマーと、既知のアルセリン２遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列（GenBank accession No.M28470）をもとに設計したアルセリン２遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、インゲンマメアルセリン２遺伝子の上流域及び下流域を増幅し、これをベクターにクローニングして塩基配列を決定することによって、インゲンマメアルセリン２遺伝子のプロモーター及びターミネーター領域の単離、及び塩基配列の決定を行うことができる。
【００１７】
なお、一般にプロモーター活性を有するＤＮＡ及びターミネーター活性を有するＤＮＡの塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された場合であっても、該プロモーター活性及びターミネーター活性が維持され得ることは当業者において広く認識されるところである。従って、本発明に係るＤＮＡには、配列番号１及びの塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加されて形成された塩基配列を含むＤＮＡであって、種子特異的なプロモーター活性を有するＤＮＡが含まれ、また、本発明に係るベクターに組み込まれるターミネーター活性を有するＤＮＡには、配列番号２の塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加されて形成された塩基配列を含むＤＮＡであって、ターミネーター活性を有するＤＮＡが含まれる。このようなＤＮＡは、部位特異的変異導入法等の当業者に周知の方法を用いて生産することができる。ここでいう「１個もしくは数個」とは、好ましくは１〜９の整数個、より好ましくは１〜４の整数個である。
【００１８】
本発明において、配列番号１の塩基配列の部分配列、又は配列番号１の塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたものであって、種子特異的なプロモーター活性を有するＤＮＡをコードする塩基配列（以下、配列番号１のホモログ配列と呼ぶ）の部分配列とは、配列番号１又は配列番号１のホモログ配列に含まれる連続した塩基配列をいう。当該部分配列を含むＤＮＡのうち、種子特異的なプロモーター活性を有するものが本発明に係るＤＮＡに含まれる。このようなＤＮＡとしては、例えば、配列番号１の塩基番号１３９９〜３８６０に記載された塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。
【００１９】
また、いったん本発明のプロモーター及びターミネーターの塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、あるいはその塩基配列の一部からなるＤＮＡをプライマーとして合成して、インゲンマメの全ＤＮＡを鋳型に該プライマーを用いたＰＣＲによって容易に得ることができる。
【００２０】
（２）プロモーター活性の検定
単離されたＤＮＡが、種子特異的なプロモーター活性を有することの確認は、該ＤＮＡの下流に発現量を定量できるレポーター遺伝子を組込んだベクターを導入した形質転換植物体における、該レポーター遺伝子の発現部位及び発現量を調べることによって行うことができる。
【００２１】
前記レポーター遺伝子としては、例えばβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子や、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子、ＧＦＰ遺伝子などが挙げられる。
【００２２】
ベクターを導入することによる形質転換植物体の作製は、すでに報告され、確立されている種々の方法により行うことができる。その好ましい例としては、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などが挙げられる。
【００２３】
種子特異的なプロモーター活性を測定するために形質転換され得る植物としては、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、ダイズ、インゲン、ナタネ、シロイヌナズナなどが挙げられる。また、形質転換される植物材料としては、例えば、根、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等の植物組織やその切片、未分化のカルス、プロトプラスト等の植物培養細胞が挙げられる。
【００２４】
レポーター遺伝子としてＧＵＳ遺伝子を用いる場合、該遺伝子発現産物の触媒作用による５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−Ｇｌｕｃ）を基質とした組織化学的染色により、プロモーター活性の測定を行うことができる。また、種子特異的であるかどうかの確認は、一過性発現の確認の場合は、種子又はそれ以外の上記各植物組織をベクターにより形質転換し、例えば３〜５日経過したものを組織化学的染色することにより確認できる。さらにはベクターによる形質転換後、それぞれの植物種で報告されている植物体を再生させる工程により形質転換植物体を得、該形質転換植物体により形成された種子を含むそれ以外の組織を調べることによっても確認できる。
【００２５】
（３）本発明に係るベクター
本発明に係るベクターは、本発明に係るＤＮＡと、該ＤＮＡの下流に位置する外来タンパク質をコードする外来遺伝子と、該外来遺伝子の下流に位置するターミネーター活性を有するＤＮＡとを含む。該外来遺伝子には、インゲンマメ以外に由来する遺伝子の他、インゲンマメに由来する遺伝子であって、アルセリン２遺伝子と異なる塩基配列を有する遺伝子も含まれる。該外来遺伝子は、ワクチン、酵素、抗体、機能性タンパク質、機能性ペプチド等の有用なタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。これらの遺伝子に、該遺伝子の発現産物を細胞の特定の位置に配置させるためのシグナルペプチドをコードする塩基配列や、該発現産物の単離・精製を容易にするためのタグペプチド（ＧＳＴ、ｈｉｓ−ｔａｇ等）をコードする塩基配列等を結合させ、融合タンパク質として発現されるようにすることもできる。本発明に係るベクターは、さらに選抜マーカーを含むことが好ましい。該選抜マーカーとしては、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子などが例示される。本発明に係るベクターを植物に導入することで、後述する形質転換植物体を作製することができる。
【００２６】
本発明に係るベクターは、当業者に既知の手段を用いて作製することができる。例えば、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡと、その下流に位置する外来遺伝子と、さらにその下流に位置する配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡとを含むベクターは以下のようにして得ることができる。
【００２７】
まず、配列番号１の５’末端から３’側に向けて連続した塩基配列からなる第１のプライマーと、配列番号２の３’末端から５’側に向けて連続した塩基配列の相補鎖からなる第２のプライマーを用いて、インゲンマメのゲノミックＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、配列番号１の塩基配列と配列番号２の塩基配列と、これら２つの配列の間に挟まれたアルセリン２遺伝子から構成されたＤＮＡを得、これをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII
ＳＫ（−）のような市販のクローニングベクターに組み込む。これをホストとなる大腸菌に導入して適宜複製させてから再度抽出し、これをテンプレートとして、配列番号２の５’末端から３’側に向けて連続した塩基配列からなる第３のプライマーと、配列番号１の３’末端から５’末端に向けて連続した塩基配列の相補鎖からなる第４のプライマーを用いて、ＰＣＲを行う。この増幅産物に、別に単離されてきた外来遺伝子を連結して環状プラスミド状のベクターとすれば、本発明に係るベクターを作製することができる。ここで、前記第１〜４のプライマーには、必要に応じて制限酵素認識配列を付加することもできる。
【００２８】
前記第１のプライマーの５’末端を、配列番号１の５’末端より下流に設定すれば、配列番号１の塩基配列の部分配列からなるＤＮＡと、その下流に位置する外来遺伝子と、さらにその下流に位置する配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡとを含むベクターを作製することができる。
【００２９】
上記のように作製したベクター中の塩基配列は、部位特異的変異導入法などの当業者に周知の手法で当該塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列に変異させることができる。
また、選抜マーカーをコードする遺伝子は公知の塩基配列のものを使用することができ、市販のベクターにも種々の選抜マーカー遺伝子を含むベクターが市販されているため、本願発明に係るベクター中への選抜マーカー遺伝子の挿入は、当業者に周知の分子生物学的手法により容易に行うことができる。
【００３０】
（４）本発明に係る形質転換植物体
上記のように調製した組換えベクターを用いて、対象植物を形質転換し、形質転換植物体を調製することができる。形質転換植物体を調製するには、すでに報告され、確立されている種々の方法を利用することができる。その好ましい例としては、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などが挙げられる。
【００３１】
本発明において形質転換に用いられる植物としては、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、ダイズ、インゲン、ナタネ、シロイヌナズナなどの植物が挙げられる。また、形質転換される植物材料としては、例えば、根、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等の植物組織やその切片、未分化のカルス、プロトプラスト等の植物培養細胞が挙げられる。上記組織及び細胞に形質転換した後、選抜マーカー遺伝子によってもたらされる耐性効果を指標に、形質転換植物細胞を選抜する。選抜された細胞から、それぞれの植物種で報告されている植物体を再生させる工程を経て、形質転換植物体を得ることができる。
【００３２】
こうして得られた形質転換植物体の栽培を行い、種子を稔実させることで、本発明に係る形質転換種子を得ることができ、該形質転換種子中に目的とする外来タンパク質が得られる。
【００３３】
遺伝子が植物体に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ウエスタンブロッティング法などによって行うことができる。例えば、形質転換植物体の種子からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロッティングを行う。ウエスタンブロッティング後、生産された外来タンパク質に特異的な一次抗体及び西洋わさび過酸化酵素（ＨＲＰ）などを標識した二次抗体を用いて免疫染色を行うことにより、本発明に係るベクターを用いた外来遺伝子の導入が適切に行われ、該外来遺伝子に由来する有用タンパク質が種子に蓄積されていること、及びその蓄積量を確認することができる。
【実施例】
【００３４】
以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
なお、以下の実施例で行われるアルセリン２遺伝子のプロモーター領域及びターミネーター領域を含むＤＮＡの単離操作は、制限酵素処理を施したゲノミックＤＮＡ断片にアダプターを結合させ、既知配列とアダプター配列に基づいてプライマーを設計し、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行い未知の領域をクローニングするための市販されたキットである、株式会社ベックス製のＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTMを用いて実施した。
【００３５】
［実施例１］
（１）インゲンマメ野生種のゲノミックＤＮＡの調製
インゲンマメ野生種（系統番号：Ｇ１２８６６）の生葉１ｇからＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてゲノミックＤＮＡ５０μｇを抽出した。
【００３６】
（２）インゲンマメ野生種からのアルセリン２遺伝子のプロモーター配列を含むＤＮＡの単離
（i）第一回伸長反応
２８０ｎｇの上記ゲノミックＤＮＡを制限酵素ＳａｕIIIＡIで消化した後、ｄＧＴＰを加え、ｋｌｅｎｏｗ ｅｎｚｙｍｅ（プロメガ社製）により１塩基伸張反応を行った。その後、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のＲＷＡ−１アダプターとＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて連結反応を行い、アルセリン２遺伝子の上流域のＤＮＡを単離するためのＰＣＲの鋳型とした。
【００３７】
次に、公知のインゲンマメアルセリン２遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列（GenBank accession No.M28470）に基づき、配列番号４及び配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＳＰ１及びプライマーＳＰ２と命名）を、株式会社ファスマックのカスタム合成受託サービスを利用して作製した。以降、特に記述がない限りプライマーの合成は、同社を利用して行った。
【００３８】
次に、上記で構築したアダプターを連結したゲノミックＤＮＡ２．８ｎｇを鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−１及びプライマーＳＰ１を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃、２分で１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを６５℃で３０秒、及び伸長反応を６８℃で５分を１サイクルとして３５サイクル行った。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、１ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。
【００３９】
ＰＣＲ終了後、反応液を１００倍に希釈し、その１μＬを２回目のＰＣＲの鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−２及びプライマーＳＰ２を用いてＰＣＲを行った。なお、２回目のＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、１回目のＰＣＲと同条件で行った。
【００４０】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。
【００４１】
この反応産物を、Ａｒｃ２Ｐ（i）とし、株式会社ファスマックのＤＮＡシーケンシングサービスを用いて塩基配列を決定した。その結果、アルセリン２遺伝子の開始コドンの上流８４４ｂｐの新規な領域を含むことを確認した。以降、特に記述がない限り塩基配列の決定は同社のシーケンシングサービスを用いて行った。
【００４２】
次に、さらに上流域を単離するため、新たなプライマーを作製し第二回目となる伸長反応を行った。
【００４３】
（ii）第二回伸長反応
２８０ｎｇの上記ゲノミックＤＮＡを制限酵素ＢｇｌIIで消化した後、ｄＧＴＰを加え、ｋｌｅｎｏｗ ｅｎｚｙｍｅ（プロメガ社製）により１塩基伸張反応を行った。反応後、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のＲＷＡ−１アダプターと連結反応を行い、プロモーター単離のためのＰＣＲの鋳型とした。
【００４４】
次に、公知のインゲンマメアルセリン２遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列（GenBank accession No.M28470）に基づき、配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（プライマーｓｅｃｏｎｄＳＰ１と命名）を、また第一回伸長反応で得られた開始コドンの上流８４４ｂｐの塩基配列に基づき配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（プライマーｓｅｃｏｎｄＳＰ２と命名）を作製した。
【００４５】
次に、上記で構築したアダプターを連結したゲノミックＤＮＡ２．８ｎｇを鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−１及びプライマーｓｅｃｏｎｄＳＰ１を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、上記（i）の第一回伸長反応と同条件で行った。
【００４６】
反応終了後、上記ＰＣＲ液を１００倍に希釈し、その１μＬを２回目のＰＣＲの鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−２及びプライマーｓｅｃｏｎｄＳＰ２を用いてＰＣＲを行った。なお、２回目のＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、１回目のＰＣＲと同条件である。
【００４７】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。
【００４８】
反応産物を、Ａｒｃ２Ｐ（ii）とし塩基配列を決定した。その結果、Ａｒｃ２Ｐ（i）の上流１９７ｂｐ（合計１０４１ｂｐ）の新規な領域を含むことを確認した。次に、さらに上流域を単離するため、新たなプライマーを作製し第三回目となる伸長反応を行った。
【００４９】
（iii）第三回伸長反応
２８０ｎｇの上記ゲノミックＤＮＡを制限酵素ＸｂａIで消化した後、ｄＣＴＰを加え、ｋｌｅｎｏｗ ｅｎｚｙｍｅ（プロメガ社製）により１塩基伸張反応を行った。反応後、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のＲＷＡ−２アダプターと連結反応を行い、プロモーター単離のためのＰＣＲの鋳型とした。
【００５０】
次に、第二回伸長反応で得られた１９７ｂｐの塩基配列に基づき、配列番号８及び配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーｔｈｉｒｄＳＰ１及びプライマーｔｈｉｒｄＳＰ２と命名）を作製した。
【００５１】
次に、上記で構築したアダプターを連結したゲノミックＤＮＡ２．８ｎｇを鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−１及びプライマーｔｈｉｒｄＳＰ１を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、上記(i)の第一回伸長反応と同条件で行った。
【００５２】
反応終了後、上記反応液を１００倍に希釈し、その１μＬを２回目のＰＣＲの鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−２及びプライマーｔｈｉｒｄＳＰ２を用いてＰＣＲを行った。なお、２回目のＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、１回目のＰＣＲと同条件である。
【００５３】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。
【００５４】
この反応産物を、Ａｒｃ２Ｐ（iii）とし、塩基配列を決定した。その結果、Ａｒｃ２Ｐ（ii）の上流２８１９ｂｐ（合計３８６０ｂｐ）の新規な領域を含むことを確認した。以上、三回の伸長反応によってアルセリン２遺伝子の開始コドンの上流５′側非翻訳領域を含む３８６０ｂｐの新規なプロモーター配列を含むＤＮＡを取得することができた（配列番号1）。アルセリン２遺伝子と相同性を有する公知の遺伝子であるアルセリン１（GenBank accession No.M68913）、アルセリン３（GenBank accession No.AX463292）、アルセリン４（GenBank accession No.AX463293）及びアルセリン５−１（GenBank accession
No.Z50202）のプロモーター配列との相同性を調べた結果、いずれとの比較においても相同性は５５．４％以下であり、配列番号１に記載のＤＮＡは新規なアルセリンプロモーター配列を含むＤＮＡであることが明らかとなった。
【００５５】
［実施例２］
（１）インゲンマメ野生種からのアルセリン２遺伝子のターミネーター配列を含むＤＮＡの単離
上記実施例１（１）で抽出したゲノミックＤＮＡ２８０ｎｇを制限酵素ＮｈｅIで消化した後、ｄＣＴＰを加え、ｋｌｅｎｏｗ ｅｎｚｙｍｅ（プロメガ社製）により１塩基伸張反応を行った。反応後、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のＲＷＡ−２アダプターとＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて連結反応を行い、ターミネーター遺伝子の単離のためのＰＣＲの鋳型とした。
【００５６】
次に、公知のインゲンマメアルセリン２遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列（GenBank accession No.M28470）に基づき、配列番号１０及び配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＳＰ３及びプライマーＳＰ４と命名）を作製した。
【００５７】
次に、上記で構築したアダプターを連結したゲノミックＤＮＡ２．８ｎｇを鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−１及プライマーＳＰ３を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを６５℃で３０秒、及び伸長反応を６８℃で５分を１サイクルとして３５サイクル行った。なお、反応液は２００μMのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、１ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。
【００５８】
ＰＣＲ終了後、反応液を１００倍に希釈し、その1μＬを２回目のＰＣＲの鋳型とし、ＲｉｇｈｔＷａｌｋ ＫｉｔTM付属のプライマーＷＰ−２及びプライマーＳＰ４を用いてＰＣＲを行った。なお、２回目のＰＣＲの溶液組成及び温度条件は、鋳型とプライマー以外、１回目のＰＣＲと同条件で行った。
【００５９】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。
【００６０】
反応産物を、Ａｒｃ２Ｔとし、塩基配列を決定した。その結果、アルセリン２遺伝子の３’側非翻訳領域を含む終止コドンの下流７９５ｂｐの新規な領域を含むことを確認した（配列番号２）。公知のアルセリン２遺伝子と相同な遺伝子であるアルセリン１（GenBank accession No.M68913）及びアルセリン５−１（GenBank accession No.Z50202）のターミネーター領域と相同性について検索した結果、いずれとの比較においても相同性は４９．１％以下であり、配列番号２に記載のＤＮＡは新規なターミネーター配列を含むＤＮＡであることが明らかとなった。
【００６１】
［実施例３］
（１）アルセリン２ゲノム遺伝子に相当するＤＮＡの合成と単離
上記実施例１（１）で抽出したゲノミックＤＮＡ８０ｎｇを鋳型として、ＰＣＲを行った。配列番号１及び配列番号２に記載された塩基配列に基づき、配列番号１２及び配列番号１３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＡｒｃ２Ｐ及びプライマーＡｒｃ２Ｔと命名）を作製した。
【００６２】
ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを５７℃で３０秒、及び伸長反応を６８℃で４分を１サイクルとして２５サイクル行った。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、１ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。
【００６３】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。
【００６４】
反応産物を、Ａｒｃ２ＰＣＴとし、塩基配列を決定した。その結果、アルセリン２遺伝子、及びその５’側非翻訳領域を含む開始コドンの上流２４６１ｂｐのプロモーター領域を含み、且つ３’側非翻訳領域を含む終止コドンの下流７９５ｂｐの新規な領域を含むことを確認した（配列番号３）。こうして得られた組換えベクターＡｒｃ２ＰＣＴを導入した大腸菌ＤＨ５α（タカラバイオ株式会社製）は、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α/Ａｒｃ２ＰＣＴと命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに2008年7月30日より、受託番号P-21624 として寄託されている。
【００６５】
（２）植物におけるプロモーター活性検定ベクターの作製
（i）アルセリン２プロモーター活性検定ベクターの作製
上記実施例３（１）で得たＡｒｃ２ＰＣＴの１０ｎｇを鋳型として、プロモーター、ターミネーター及びベクター部分を増幅するＰＣＲを行った。配列番号３に記載された塩基配列に基づき、配列番号１４及び配列番号１５のオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＡｒｃ２Ｐ３及びプライマーＡｒｃ２Ｔ５と命名）を作製した。
【００６６】
ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを５７℃で３０秒、及び伸長反応を６８℃で６分３０秒を１サイクルとして２５サイクル行った。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、1ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。こうして、アルセリン２遺伝子のプロモーター２４６１ｂｐとターミネーター７９５ｂｐ及びそれらの間にベクターの配列を含むＤＮＡ断片Ａｒｃ２ＰＴを得た。
【００６７】
次に、植物細胞形質転換用ベクターｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子のＰＣＲによる増幅反応を行った。
【００６８】
公知のｐＢＩ２２１の塩基配列（GenBank accession No.AF502128）に基づき、配列番号１６及び配列番号１７のオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＧＵＳ５及びプライマーＧＵＳ３と命名）を作製した。
【００６９】
ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを５７℃で３０秒、及び伸長反応を６８℃で２分を１サイクルとして２５サイクル行った。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、１ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。こうして、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子１８１２ｂｐの遺伝子断片ＧＵＳ１を得た。
【００７０】
ＧＵＳ１遺伝子断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、上記Ａｒｃ２ＰＴと連結反応を行った。こうして、β−グルクロニダーゼ遺伝子の上流にアルセリン２遺伝子のプロモーター２４６１ｂｐ及び下流にターミネーター７９５ｂｐを含む、プロモーター活性検定ベクターＡｒｃ２ＰＧＵＳを作製した。
【００７１】
（ii）アルセリン５プロモーター活性検定ベクターの作製
本発明におけるアルセリン２プロモーター配列を含むＤＮＡのプロモーター活性を確認するにあたり、他の種子特異的なプロモーター活性を有するプロモーターとの比較を行うため、種子特異的発現が認められている、公知のアルセリン５プロモーター及びターミネーター（国際公開ＷＯ０２／５０２９５号パンフレット）の単離を行った。
【００７２】
インゲンマメ野生種（系統番号：Ｇ０２７７１）の生葉１ｇからＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてゲノミックＤＮＡ５０μｇを抽出した。該ゲノミックＤＮＡ８０ｎｇを鋳型として、ＰＣＲを行った。公知のインゲンマメアルセリン５−１遺伝子（GenBank accession No.Z50202）の塩基配列に基づき、配列番号１８及び配列番号１９の塩基配列からなる２種類のオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＡｒｃ５Ｐ及びプライマーＡｒｃ５Ｔと命名）を作製した。
【００７３】
ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃３０秒、アニーリングを５７℃３０秒及び伸長反応６８℃４分を１サイクルとして２５サイクル行った。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、１ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。
【００７４】
増幅されたＤＮＡ断片は、最終濃度１ｍＭのＡＴＰ存在下でＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）でリン酸化反応を行った後、予めＳｍａIで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）と連結反応を行った。反応産物を、Ａｒｃ５ＰＣＴとし、塩基配列を決定した。その結果、アルセリン５遺伝子、及びその５’側非翻訳領域を含む開始コドンの上流１８１８ｂｐのプロモーター領域を含み、且つ３’側非翻訳領域を含む終止コドンの下流１１９２ｂｐの領域を含むことを確認した。
【００７５】
上記で得たＡｒｃ５ＰＣＴの１０ｎｇを鋳型として、ＰＣＲを行った。公知のアルセリン５−１遺伝子の塩基配列より、配列番号２０及び配列番号２１の塩基配列からなる２種類のオリゴヌクレオチド（それぞれプライマーＡｒｃ５Ｐ３及びプライマーＡｒｃ５Ｔ５と命名）を作製した。
【００７６】
ＰＣＲは、一反応あたり５０μＬの反応液を用い、変性反応を９４℃で２分、１サイクル実施後、変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを５７℃で３０秒、及び伸長反応を６８℃で６分３０秒を１サイクルとして２５サイクル行った。なお、反応液は２００μＭのｄＮＴＰ混合液、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液、１μＭの上記各プライマー、1ユニットのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を含むＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２バッファーを含んでいる。こうして、アルセリン５遺伝子のプロモーター１８１８ｂｐ及びターミネーター１１９２ｂｐを含む遺伝子断片Ａｒｃ５ＰＴを得た。
【００７７】
これに、上記のリン酸化反応済みＧＵＳ１遺伝子断片を連結して、β−グルクロニダーゼ遺伝子の上流にアルセリン５遺伝子のプロモーター１８１８ｂｐ及び下流にターミネーター１１９２ｂｐを含む、プロモーター活性検定ベクターＡｒｃ５ＰＧＵＳを作製した。
【００７８】
［実施例４］
（１）ダイズ種子におけるプロモーター活性の検定
上記実施例３で得られた組換えベクターＡｒｃ２ＰＧＵＳ及び比較区としてＡｒｃ５ＰＧＵＳをダイズの種子へウイスカ法（特許第３３１２８６７号公報）により遺伝子導入した。
【００７９】
ダイズ（品種：Ｊａｃｋ）の開花２５日後の莢を７０％エタノール溶液に１分間、次いで次亜塩素酸ナトリウム０．５％（有効塩素濃度）溶液に３０分間浸漬して莢を殺菌処理した。無菌的に登熟種子を取り出し、次に種皮を取り除いた。種子を、５〜７ｍｍ角に切断し、遺伝子導入サンプルとした。
【００８０】
チタン酸カリウム製ウイスカＬＳ２０（チタン工業社製）５ｇを１．５ｍＬ容のチューブに入れ、１時間放置した後、エタノールを除去し、完全に蒸発させて、殺菌されたウイスカを得た。このウイスカの入ったチューブに滅菌水１ｍｌを入れ、良く攪拌した。ウイスカと滅菌水を遠心分離し、上清の水を捨てた。このようにしてウイスカを洗浄した。このウイスカ洗浄操作を３回行った。その後、同チューブに公知のＭＳ液体培地の０．５ｍｌを加えてウイスカ懸濁液を得た。
【００８１】
上記で得られたウイスカ懸濁液の入ったチューブに、上記の種子２粒分の種子切片を入れて攪拌した後、混合物を１０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離し、種子切片とウイスカを沈殿させ、上清を捨て、種子切片とウイスカの混合物を得た。
【００８２】
この混合物を入れたチューブに、前記の組換えベクター（すなわち前記の組換えベクターＡｒｃ２ＰＧＵＳ、又はＡｒｃ５ＰＧＵＳ）の２０μＬ（２０μｇ）を加え、十分振り混ぜて均一な混合物を得た。次にこの均一な混合物の入ったチューブを１８０００×ｇで５分間遠心分離した。遠心分離した混合物を再度振り混ぜ、この操作を３回反復した。
【００８３】
上記のようにして得られた、種子切片と、ウイスカと、ベクターを収容しているチューブを超音波発生機の浴槽にチューブが十分浸るように設置した。周波数４０ｋＨｚの超音波を強度０．２５Ｗ／ｃｍ2で１分間照射した。照射後、１０分間、４℃でこの混合物を保持した。このように超音波処理した混合物を前記のＭＳ液体培地で洗浄し、形質転換種子切片を得た。
【００８４】
上記で組換えベクターを導入して得た種子切片を、ＭＳ培地にショ糖３０グラム／Ｌ、寒天８ｇ／Ｌを添加して得たＭＳ寒天培地に置床した。その後に、２８℃、２０００ルックス、１６時間日長の条件下で３日間培養を行った。
【００８５】
上記で得られた組換えベクターが形質転換されたダイズ種子におけるＧＵＳ染色を公知の方法（Plant Genetic Transformation and Gene Expression A laboratory manual，324頁〜327頁、Blackwell Scientific Publications LTD）に準じて行った。
【００８６】
ダイズ種子切片を直径３．５ｃｍのシャーレに入れ、染色用バッファー（２ｍＭ Ｘ−Ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β―Ｄ−グルクロン酸）、５０ｍＭ ＮａＰＯ4，ｐＨ７．０）を３ｍＬずつ添加して浸漬した。３７℃で一晩保温した後、染色バッファーを取り除き、７０％エタノールを３ｍＬずつ添加して洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した後、ダイズ種子切片におけるブルースポット数を調査した。結果を表１に示す。
【００８７】
【表１】
【００８８】
上記のように本発明区のＡｒｃ２ＰＧＵＳを導入した種子切片のブルースポット数は、種子特異的発現プロモーターであるアルセリン５−１プロモーターを連結したＡｒｃ５ＰＧＵＳよりブルースポット数が多く、種子において高い発現を示すことが認められた。
【００８９】
（２）ダイズ不定胚におけるプロモーター活性の検定
次に、本発明のプロモーターの発現時期を確認するため、胚発生の初期段階にあたるダイズ球状不定胚に遺伝子導入を行った。また、比較区としてβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子の上流にカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを連結したｐＢＩ２２１(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製)についても遺伝子導入を行った。
【００９０】
公知の方法（K. Nishizawa, Y. Kita, M. Kitayama, M. Ishimoto. (2006) A red fluorescent protein, DsRed2, as a visual reporter for transient expression and stable transformation in soybean. Plant Cell Reports 25:1355-1361）により、ダイズ（品種：Jack）未熟種子から誘導された不定胚塊（直径３ｍｍ以下）３０個を１．５ｍＬ用のチューブに加え、上記実施例４（１）と同様の方法で、遺伝子導入操作を行った。
【００９１】
遺伝子導入後の不定胚塊を直径３．５ｃｍのシャーレに入れ、公知の不定胚増殖培地を３ｍＬ加え、２５℃、５００ルックス、２３時間日長の条件下で３日間培養を行った。上記で得られた組換えベクターが形質転換されたダイズ不定胚におけるＧＵＳ染色を上記（１）の方法でＧＵＳ染色を行った。結果を表２に示す。
【００９２】
【表２】
【００９３】
上記のように本発明区のＡｒｃ２ＰＧＵＳはブルースポットが認められず、胚発生の初期段階にあたるダイズ球状不定胚においては、発現が認められなかった。以上のことから、本発明のアルセリン２プロモーターは、種子の登熟後期において特異的な発現を示す高発現プロモーターであることが証明された。
【００９４】
［実施例５］
（１）インゲンマメのアルセリン２タンパク質の発現プラスミドの構築
アルセリン２遺伝子のプロモーターの制御下で、インゲンマメのアルセリン２貯蔵タンパク質をダイズ種子中で発現させるための発現プラスミドを構築した。
【００９５】
上記、実施例３（１）で得られた、Ａｒｃ２ＰＣＴを公知のｐＵＨＧベクター（Ｙ． Ｋｉｔａ，Ｋ． Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｍ Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｍ. Ｋｉｔａｙａｍａ， Ｍ． Ｉｓｈｉｍｏｔｏ． （２００７）Ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｌｉｎｅｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２６：４３９−４４７）に連結し、アルセリン２遺伝子のプロモーターによりアルセリン２タンパク質を発現するための植物形質転換ベクターの構築を行った。
【００９６】
Ａｒｃ２ＰＣＴを制限酵素ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断を行い、ｐＵＨＧベクターのＳｐｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトに連結反応を行い、植物形質転換ベクターｐＵＨＧＡｒｃ２ＰＣＴを作成した。すなわち、Ａｒｃ２ＰＣＴの２μｇを制限酵素ＳｐｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩの２０単位で３７℃、２時間切断した後、アガロース電気泳動を行い、Ａｒｃ２ＰＣＴにおいて約４．０ｋｂの断片のみを切り出し、ジーンクリーン（Ｂｉｏ１０１社製）により精製した。一方ｐＵＨＧプラスミド２μｇをＳｐｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ２０単位で３７℃、２時間切断した後、ジーンクリーンにより精製した。夫々のＤＮＡフラグメントを、Ｔａｋａｒａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔにて、１６℃、３時間反応させた。
【００９７】
このようにしてプラスミドｐＵＨＧのＳｐｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断ＤＮＡフラグメントに、Ａｒｃ２ＰＣＴ由来の約４．０ｋｂのＳｐｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断フラグメントを組み込んだ植物形質転換ベクターｐＵＨＧＡｒｃ２ＰＣＴを作製した。
【００９８】
（２）インゲンマメのアルセリン２タンパク質の発現プラスミドによるダイズの形質転換
公知の方法（Ｋ． Ｎｉｓｈｉｚａｗａ， Ｙ． Ｋｉｔａ， Ｍ． Ｋｉｔａｙａｍａ， Ｍ． Ｉｓｈｉｍｏｔｏ． （２００６） Ａ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ， ＤｓＲｅｄ２， ａｓ ａ ｖｉｓｕａｌ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２５：１３５５−１３６１）により、ダイズ品種Ｊａｃｋの未熟種子から誘導された不定胚塊（直径３ｍｍ以下）３０個を１．５ｍｌ用のチューブに加え、ウイスカー超音波法（特許第３３１２８６7号）により遺伝子導入操作を行った。
【００９９】
チタン酸カリウム製ウイスカーＬＳ２０（チタン工業社製）５ｍｇを１．５ｍｌ容のチューブに入れ、１時間放置した後、エタノールを除去し、完全に蒸発させて、殺菌されたウイスカーを得た。このウイスカーの入ったチューブに滅菌水１ｍｌを入れ、良く攪拌した。ウイスカーと滅菌水を遠心分離し、上清の水を捨てた。このようにしてウイスカーを洗浄した。このウイスカー洗浄操作を３回行った。その後、同チューブに公知のＭＳ液体培地の０．５ｍｌを加えてウイスカー懸濁液を得た。
【０１００】
上記で得られたウイスカー懸濁液の入ったチューブに、上記の不定胚塊（直径３ｍｍ以下）３０個を入れて攪拌した後、混合物を１０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離し、不定胚塊とウイスカーを沈殿させ、上清を捨て、不定胚塊とウイスカーの混合物を得た。
【０１０１】
この混合物を入れたチューブに、実施例５（１）で作製したｐUHGＡｒｃ２ＰＣＴベクターの２０μｌ（２０μg）を加え、十分振り混ぜて均一な混合物を得た。
【０１０２】
次にこの均一な混合物の入ったチューブを１８０００ｘｇで５分間遠心分離した。遠心分離した混合物を再度振り混ぜ、この操作を３回反復した。
【０１０３】
上記のようにして得られた、不定胚塊と、ウイスカーと、ベクターを収容しているチューブを超音波発生機の浴槽にチューブが十分浸るように設置した。周波数４０ｋＨｚの超音波を強度０．２５Ｗ／ｃｍ2で１分間照射した。照射後、１０分間、４℃でこの混合物を保持した。このように超音波処理した混合物を前記のＭＳ液体培地で洗浄した。
【０１０４】
処理後の不定胚塊を公知の不定胚増殖液体培地で1週間回転振とう培養し（１００ｒｐｍ）、その後にハイグロマイシンB（１５ｍｇ／ｌ）（ロッシュ・ダイアグノスティックス、マンハイム、ドイツ）を含んでいる新鮮な不定胚増殖液体培地で１週間培養した。さらに３０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンBを含んでいる不定胚増殖液体培地で４週間培養（毎週培地を交換する）した後、４５ｍｇ／ｌのハイグロマイシンBを含んだ不定胚増殖液体培地で1週間選抜培養を行った。なお、遺伝子導入は各ベクターごとにマイクロチューブ１２本の処理を行った。
【０１０５】
ハイグロマイシン耐性の不定胚塊を公知の不定胚成熟液体培地へ移し、４週間振とう培養（１００ｒｐｍ）を継続し不定胚を成熟させた。成熟した不定胚を滅菌シャーレ中に３から５日間置き乾燥させた後、公知の発芽固体培地に移した。７から１０日間発芽培養を行った後、公知の発根培地に移し、発芽している幼植物体を成長させた。根と芽が伸びた後に、土壌を含んでいるポットへ植物を移し、順化するまで高湿度に維持した。
【０１０６】
このようにしてＪａｃｋ品種にｐＵＨＧＡｒｃ２ＰＣＴを導入した形質転換ダイズ植物を３個体作出した。これらの形質転換ダイズの植物体は環境湿度に適応させた後、１００００ｌｘ、１６時間日長の環境下で栽培を継続し、すべての個体から種子を収穫した。こうして、形質転換ダイズ植物のＴ1世代の種子を得た。
【０１０７】
（３）形質転換ダイズ種子におけるアルセリン２タンパク質の蓄積量の評価
上記で得た形質転換ダイズ種子より全タンパク質を抽出し、アルセリン２タンパク質の蓄積量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のＣＢＢ（Coomassie Brilliant Blue R−250）染色および特異抗体を用いたウエスタンブロッティング法で評価した。
【０１０８】
形質転換ダイズ種子より抽出した全タンパク質２0μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ラピットＣＢＢ ＫＡＮＴＯ（関東化学株式会社製）による染色を行った（図１）。また、アルセリン２に対する特異抗体（独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 北海道農業研究センターから入手）を反応させた後、ＥＣＬ Ａｄｖａｎｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いて検出を行った。化学発光像を、ＬＡＳ４０００ｍｉｎｉＰＲ（富士フィルム社製）で取り込んだ後、同機付属の解析ソフトウェアＭｕｌｔｉＧａｇｅを用いて解析を行った（図２）。対照として、アルセリン２遺伝子の単離を行ったインゲンマメ野生種（系統番号：Ｇ１２８６６）及び形質転換されてないダイズ品種Jackの種子より抽出した全タンパク質を用いた。
【０１０９】
その結果、上記で得た形質転換ダイズ種子の各系統にインゲンマメのアルセリン２貯蔵タンパク質に相当するシグナルバンドが確認でき、アルセリン２貯蔵タンパク質のダイズ種子中への高濃度蓄積が確認できた。尚、各レーン間を比較すると、アルセリン２貯蔵タンパク質の発現量にばらつきがあるが、遺伝子導入植物において、個体ごとに導入遺伝子の発現量にばらつきが生じることが一般的な現象であることは当業者の技術常識である。また、図１では、形質転換ダイズにおいて、アルセリン２タンパク質の存在がＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のＣＢＢ染色ではっきりと認められているが、通常、植物においては、導入された外来遺伝子の発現産物であるタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のタンパク質染色でメジャーバンドとして検出することが困難であることに鑑みれば、本実施例における該アルセリン２タンパク質の蓄積量が極めて多いことが理解できる。
【０１１０】
以上の結果より、アルセリン２遺伝子のプロモーターが、ダイズ種子において、その下流に連結された目的遺伝子を高発現し、発現したタンパク質の種子中への蓄積をもたらすことが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明により、本来的な貯蔵器官である植物の種子にワクチン、抗体、抗生剤などの有用タンパク質を生産・蓄積させることが可能になり、医薬品原料等の効率的、安定的な供給が可能になる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示す塩基配列を含むＤＮＡ：
（Ａ）配列番号１の塩基配列、
（Ｂ）配列番号１の塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたものであって、種子特異的なプロモーター活性を有するＤＮＡをコードする塩基配列、
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）に記載された塩基配列の部分配列であって、種子特異的なプロモーター活性を有するＤＮＡをコードする塩基配列。
【請求項２】
配列番号１の塩基番号１３９９〜３８６０に記載された塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＤＮＡと、該ＤＮＡの下流に連結された外来タンパク質をコードする外来遺伝子と、該外来遺伝子の下流に連結されたターミネーター活性を有するＤＮＡとを含むベクター。
【請求項４】
前記ターミネーター活性を有するＤＮＡは、配列番号２の塩基配列、又は配列番号２の塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたものであってターミネーター活性を有するＤＮＡをコードする塩基配列を含む、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
請求項３又は４に記載されたベクターが導入された形質転換植物体。
【請求項６】
請求項３又は４に記載されたベクターが導入された形質転換種子。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のＤＮＡの制御下において、外来タンパク質をコードする外来遺伝子を植物の種子中で発現させることを特徴とする、外来タンパク質の生産方法。
【請求項１】
下記の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示す塩基配列を含むＤＮＡ：
（Ａ）配列番号１の塩基配列、
（Ｂ）配列番号１の塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたものであって、種子特異的なプロモーター活性を有するＤＮＡをコードする塩基配列、
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）に記載された塩基配列の部分配列であって、種子特異的なプロモーター活性を有するＤＮＡをコードする塩基配列。
【請求項２】
配列番号１の塩基番号１３９９〜３８６０に記載された塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＤＮＡと、該ＤＮＡの下流に連結された外来タンパク質をコードする外来遺伝子と、該外来遺伝子の下流に連結されたターミネーター活性を有するＤＮＡとを含むベクター。
【請求項４】
前記ターミネーター活性を有するＤＮＡは、配列番号２の塩基配列、又は配列番号２の塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたものであってターミネーター活性を有するＤＮＡをコードする塩基配列を含む、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
請求項３又は４に記載されたベクターが導入された形質転換植物体。
【請求項６】
請求項３又は４に記載されたベクターが導入された形質転換種子。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のＤＮＡの制御下において、外来タンパク質をコードする外来遺伝子を植物の種子中で発現させることを特徴とする、外来タンパク質の生産方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−１０４３６３（Ｐ２０１０−１０４３６３Ａ）
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２１３０４９（Ｐ２００９−２１３０４９）
【出願日】平成２１年９月１５日（２００９．９．１５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、経済産業省、植物機能を活用した高度モノづくり基盤技術開発／植物利用高付加価値物質製造基盤技術開発委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００２４２００２）北興化学工業株式会社 (182)
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１５日（２００９．９．１５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、経済産業省、植物機能を活用した高度モノづくり基盤技術開発／植物利用高付加価値物質製造基盤技術開発委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００２４２００２）北興化学工業株式会社 (182)
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
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