【課題】組換えインフルエンザワクチンとして好適なインフルエンザウイルスを細胞培養において作製するためのベクターおよび方法を提供する。
【解決手段】多重プラスミドインフルエンザウイルス発現系において使用するための2方向性発現ベクター。さらに、発育鶏卵および／または細胞（例えばVero細胞および／もしくはMDCK）において増強された複製能力を有するインフルエンザウイルスを作製するための方法、ならびにさらに増強された複製特性を有するインフルエンザウイルス。さらに、改善された回収方法を含み、この方法において動物細胞（SF Vero細胞など）に上記プラスミドおよびベクターをエレクトロポレーションする。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
リアソータントインフルエンザウイルスの回収方法であって、該方法は
（i）リボ核タンパク質複合体を形成でき、ヘルパーウイルスの非存在下でウイルス粒子を組み立てることができるように、Vero細胞内にてゲノムまたはアンチゲノムvRNAセグメント、核タンパク質、およびRNA依存性ポリメラーゼを発現するポリヌクレオチドベクターを用いて前記Vero細胞にエレクトロポレーションすること、
ここで、該ポリヌクレオチドベクターの少なくとも１つが、インフルエンザウイルスタンパク質のみをコードするインフルエンザウイルスのゲノムセグメントに対応するウイルスcDNAを含み、該cDNAがRNAポリメラーゼI（polI）プロモータエレメントと的確な3’末端を有するvRNAまたはcRNAの合成調節エレメントとの間に挿入されており、該エレメントがRNAポリメラーゼ II（polII）プロモータとポリアデニル化シグナルとの間に挿入されている、
（ii）該エレクトロポレーションしたVero細胞を別の細胞型と、ウイルス複製が許容される条件下で共培養すること、および
（iii）少なくとも９０％の回収効率で、インフルエンザウイルスを回収すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記Vero細胞が、無血清Vero細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インフルエンザウイルスが好冷ウイルスである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記インフルエンザウイルスが弱毒ウイルスである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ベクターが一組のプラスミドであり、該一組のプラスミドにおける異なるプラスミドの数が８個である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ベクターが一組のプラスミドであり、該一組のプラスミドにおける異なるプラスミドの数が１２個である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記別の細胞型がCEK細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記別の細胞型がMDCK細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記インフルエンザウイルスがA型インフルエンザウイルスである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ベクターがA／PR／8／34に由来する少なくとも一のvRNAセグメントを発現する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ベクターがMDV-Aに由来する少なくとも一のvRNAセグメントを発現する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
MDV-AがA/Ann Arbor/6/60である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記インフルエンザウイルスがB型インフルエンザウイルスである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ベクターがMDV-Bに由来する少なくとも一のvRNAセグメントを発現する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
MDV-BがB/Ann Arbor/1/66である、請求項１４に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５Ａ−Ｂ】

【図５Ｃ−Ｄ】

【図６−１】

【図６−２】

【図７−１】

【図７−２】

【図７−３】

【図７−４】

【図７−５】

【図７−６】

【図７−７】

【図７−８】

【図７−９】

【図７−１０】

【図７−１１】

【図７−１２】

【図７−１３】

【図７−１４】

【図７−１５】

【図７−１６】

【図７−１７】

【図７−１８】

【図７−１９】

【図７−２０】

【図７−２１】

【図７−２２】

【図７−２３】

【図７−２４】

【図７−２５】

【図７−２６】

【図７−２７】

【図７−２８】

【図７−２９】

【図７−３０】

【図７−３１】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０Ａ】

【図２０Ｂ】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【公開番号】特開２０１１−１８８８５９（Ｐ２０１１−１８８８５９Ａ）
【公開日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８４２９７（Ｐ２０１１−８４２９７）
【出願日】平成２３年４月６日（２０１１．４．６）
【分割の表示】特願２００６−５４７１９５（Ｐ２００６−５４７１９５）の分割
【原出願日】平成１６年１２月２２日（２００４．１２．２２）
【出願人】（５０４３３３９７２）メディミューン，エルエルシー (108)
【Ｆターム（参考）】