キシロオリゴ糖の製造方法
【課題】 特定の構造を有するキシロオリゴ糖を容易に製造可能なキシロオリゴ糖の製造方法を提供する。
【解決手段】 キシロオリゴ糖の製造方法は、β１，４−キシランよりなる主鎖に側鎖が結合してなるキシラン誘導体をエキソ型キシラナーゼで分解する工程を備える。キシラナーゼは、アエロモナス・パンクタータＭＥ−１株由来のキシラナーゼＸ（ＸｙｎＸ）であることが特に好ましい。図３（ａ）、（ｂ）は、キシラナーゼＸによりバーチウッドキシランを分解した際の加水分解産物を展開したＴＬＣプレート、及び該加水分解産物を陰イオン交換樹脂で分離した後に展開したＴＬＣプレートを示す。Ｘ２及びＸ４と同じ展開度のスポットはキシロビオース及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースである。
【解決手段】 キシロオリゴ糖の製造方法は、β１，４−キシランよりなる主鎖に側鎖が結合してなるキシラン誘導体をエキソ型キシラナーゼで分解する工程を備える。キシラナーゼは、アエロモナス・パンクタータＭＥ−１株由来のキシラナーゼＸ（ＸｙｎＸ）であることが特に好ましい。図３（ａ）、（ｂ）は、キシラナーゼＸによりバーチウッドキシランを分解した際の加水分解産物を展開したＴＬＣプレート、及び該加水分解産物を陰イオン交換樹脂で分離した後に展開したＴＬＣプレートを示す。Ｘ２及びＸ４と同じ展開度のスポットはキシロビオース及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の構造を有し、整腸作用や免疫賦活作用を発揮し得るキシロオリゴ糖を製造する方法に関する。例えば、キシランを主鎖とする多糖をキシラナーゼにて分解することにより、４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースのような特定の構造を有するキシロオリゴ糖を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、環境問題が注目される中、半永久的に生産され得る再生可能なバイオマス資源の有効利用に大きな期待が寄せられている。現在、木質系バイオマス資源は主に、食糧、燃料、繊維、建築材料等に利用されているが、その量は地球上のバイオマス年間生産量の僅かな量に過ぎない。バイオマス資源として木材を利用する場合、細胞壁の利用が多い。木材の細胞壁には、セルロースが４５％程度、ヘミセルロースが３０％程度、リグニンが２５％程度含まれている。これらのうち、セルロースに次ぐ主要成分であるヘミセルロースに関しては、キシリトール等や一部のキシロオリゴ糖が食品素材として利用されている以外は、工業的な利用がほとんどなされていない。
【０００３】
木材に含まれるヘミセルロースの主な成分としては、キシラン及びその誘導体からなる多糖が挙げられる。キシランは、Ｄ−キシロース残基をβ１，４結合にて直鎖状に結合させた直鎖状重合体である。天然のヘミセルロースには、前記キシランの他にも、キシランからなる直鎖状の主鎖に、Ｌ−アラビノフラノース残基、Ｄ−グルクロン酸残基、４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸残基等の側鎖を結合させたアラビノキシラン、グルクロノキシラン、アラビノグルクロノキシラン、メチルグルクロノキシラン（４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロノキシラン）等のキシラン誘導体が存在する。
【０００４】
キシロオリゴ糖は、２〜７個程度のキシロースをβ１，４→グリコシド結合にて結合させた構造を有するオリゴ糖である。キシロオリゴ糖は、ヒトの消化酵素では加水分解されないが、ビフィズス菌等の腸内有用菌の栄養源となり得るため、高い整腸作用を有することが知られている。特に、キシロオリゴ糖は、他のオリゴ糖よりも一桁程低い濃度で有効性を発揮するという報告もあるうえ、耐熱性に優れるとともに低いｐＨ環境下でも安定であることから、食品添加物等として極めて有用である。キシロオリゴ糖は、トウモロコシ、コーンコブ、バガス、綿実せり等の植物の樹皮等から得られる天然物である。キシロオリゴ糖は、木材成分のキシランから得ることも可能である。現在、日本では年間５０００万トンもの大量の木質廃材が排出されているため、環境問題や廃棄物問題の解決に向けて、このような廃材の工業的な有効利用に大きな期待がかけられている。
【０００５】
一般に、キシラン主鎖をキシロオリゴ糖に分解する酵素をキシラナーゼという。キシラナーゼは、微生物界に広く認められている。多くのキシラナーゼは、広葉樹キシランに作用して、主としてキシロビオースからオリゴキシロースや、アルドビオウロン酸からアルドヘキサオウロン酸等を生成する。キシラナーゼは、キシランの主鎖をランダムに分解するエンド型と、キシランの主鎖を端から切断するエキソ型とに分類することが可能である。エキソ型キシラナーゼは、キシランの主鎖を特定の重合度のオリゴ糖単位で切断するため、分解産物として特定の構造を有するキシロオリゴ糖のみを特異的に生成させる。
【０００６】
キシラナーゼを含むグリコシル加水分解酵素は、立体構造及びアミノ酸配列の疎水性クラスター解析に基づいて、９７ファミリーに分類されている。キシラナーゼのほとんどは１０種のファミリーに跨って分類され、そのほとんどはファミリー１０及びファミリー１１に分類されている。一般に、ファミリー１０は、高い分子量（＞３０ｋＤａ）と低い等電点（ｐＩ）の酸性タンパク質とにより特徴づけられる。ファミリー１０は、（β／α）８バレル構造からなる基本構造を有するとともに、二次構造の約４０％をαへリックスで占有されている。
【０００７】
例えば非特許文献１〜３には、アエロモナス・パンクタータ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｃｔａｔａ、従来名；アエロモナス・カビエ）ＭＥ−１株由来のキシラナーゼであるキシラナーゼＸ（ＸｙｎＸ）について報告されている。キシラナーゼＸは、分子量３８ｋＤａの単量体からなり、５０℃の至適温度、至適ｐＨ８．０のタンパク質である。これらの報告によれば、キシラナーゼＸは、バーチウッドキシランから、キシロビオース（Ｄ−キシロースのダイマー）及びキシロテトラオース（Ｄ−キシロースのテトラマー）を生成させる。また、キシラナーゼＸは、細胞内局在型キシラナーゼであるが、浸透圧の低下ショックにより細胞質内からペリプラズムへと放出されることも報告されている。さらに、キシラナーゼＸは、Ｘ線結晶構造解析より、グリコシル加水分解酵素のファミリー１０に属することも確認されている。
【非特許文献１】臼井、外３名、「アエロモナス・カビエＭＥ−１株のエキソ−キシラナーゼの有力候補であるキシラナーゼＸが、キシランから専らキシロビオース及びキシロテトラオースを生成する（ XynX, a possible exo-xylanase of Aeromonas caviae ME-1 that produces exclusively xylobiose and xylotetraose from xylan. ）」、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６３（８）、１３４６−１３５２（１９９９）
【非特許文献２】臼井、外３名、「アエロモナス・カビエＭＥ−１株の細胞内局在型キシラナーゼ（キシラナーゼＸ）が、浸透圧の低下ショックにより細胞質内からペリプラズムへとリリースされる（ A cytoplasmic xylanase ( XynX ) of Aeromonas caviae ME-1 is released from the cytoplasm to the periplasm by osmotic downshock. ）」、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９５，４８８−４９５（２００３）
【非特許文献３】藤本、外５名、「アエロモナス・パンクタータＭＥ−１株由来のファミリー１０キシラナーゼであるキシラナーゼＸの結晶化及び予備的なＸ線による結晶学的研究（ Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of XynX, a family 10 xylanase from Aeromonas punctata ME-1. ）」、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｆ，６１，２５５−２５６（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、非特許文献１において、キシラナーゼＸが、バーチウッドキシランからキシロビオース及びキシロテトラオースを生成させたことを報告したが、その後の鋭意研究の結果、キシラナーゼＸに特定の構造を有するキシロオリゴ糖を生成させる作用があることを見出した。そして、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。本発明の目的とするところは、特定の構造を有するキシロオリゴ糖を容易に製造することができるキシロオリゴ糖の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明は、キシロオリゴ糖を製造する方法であって、該方法は、キシラン誘導体をエキソ型キシラナーゼで分解する分解工程を備え、前記キシラン誘導体は、β１，４−キシランよりなる主鎖に側鎖が結合してなる構造を有することを要旨とする。
【００１０】
請求項２に記載のキシロオリゴ糖の製造方法は、請求項１に記載の発明において、前記エキソ型キシラナーゼは、グリコシル加水分解酵素のファミリー１０に属し、かつＮ末端から７番目のβシート−αへリックス間に１３以上のアミノ酸残基よりなるループ構造を有する（β／α）８バレル構造を形成していることを要旨とする。
【００１１】
請求項３に記載のキシロオリゴ糖の製造方法は、請求項１又は請求項２に記載の発明において、前記エキソ型キシラナーゼは、メチルグルクロノキシランを基質として反応させると、キシロビオース及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースを生成させる酵素活性を有することを要旨とする。
【００１２】
請求項４に記載のキシロオリゴ糖の製造方法は、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の発明において、前記エキソ型キシラナーゼは、アエロモナス・パンクタータＭＥ−１株（特許微生物寄託センター受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２７）由来のキシラナーゼＸであることを要旨とする。
【００１３】
請求項５に記載のキシロオリゴ糖の製造方法は、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の発明において、前記キシラン誘導体は、メチルグルクロノキシランであることを要旨とする。
【００１４】
請求項６に記載のキシロオリゴ糖の製造方法は、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の発明において、前記キシラン誘導体は、４−Ｏ−メチルグルクロン酸を前記側鎖として備えることを要旨とする。
【００１５】
請求項７に記載のキシロオリゴ糖の製造方法は、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の発明において、当該製造方法はさらに、前記分解工程を経て生成した前記キシロオリゴ糖を分離する工程を備えることを要旨とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、特定の構造を有するキシロオリゴ糖を容易に製造することができるキシロオリゴ糖の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明のキシロオリゴ糖の製造方法を具体化した一実施形態について説明する。
本実施形態のキシロオリゴ糖の製造方法は、β１，４−キシランよりなる主鎖に側鎖が結合してなるキシラン誘導体を、エキソ型キシラナーゼで分解する分解工程を備える。分解工程では、キシラン誘導体がエキソ型キシラナーゼによってオリゴ糖単位で端から順番に切り出される。このため、本実施形態のキシロオリゴ糖の製造方法では、前記側鎖の種類や結合位置等に依存した特定の構造を有するキシロオリゴ糖が製造される。
【００１８】
本実施形態の製造方法で用いられるキシラン誘導体は、具体的には、Ｄ−キシロース残基の直鎖状重合体であるβ１，４−キシランからなる主鎖に、Ｌ−アラビノフラノース残基、Ｄ−グルクロン酸残基、４−Ｏ−メチルグルクロン酸残基等の側鎖を結合させた構造を有する。このようなキシラン誘導体としては、例えば、アラビノキシラン、グルクロノキシラン、アラビノグルクロノキシラン、メチルグルクロノキシラン等が挙げられる。なお、キシラン誘導体としては、上述した側鎖以外にも、フルクトース等を始めとしてあらゆる種類の側鎖を備えたものが使用可能である。
【００１９】
例えば、本実施形態の製造方法において、メチルグルクロノキシランのような４−Ｏ−メチルグルクロン酸を側鎖として備えるキシラン誘導体を用いる場合、製造されるキシロオリゴ糖には、アルドトリオウロン酸（４−Ｏ−メチルグルクロニルキシロビオース）、アルドテトラオウロン酸（４−Ｏ−メチルグルクロニルキシロトリオース）、アルドヘキサオウロン酸（４−Ｏ−メチルグルクロニルキシロペントース）等のアルドオリゴオウロン酸が含まれる。このようなアルドオリゴオウロン酸を製造可能なキシラン誘導体としては、バーチウッドキシラン（白樺キシラン）が特に好適に使用される。
【００２０】
本実施形態の製造方法で用いられるエキソ型キシラナーゼは、グリコシル加水分解酵素のファミリー１０に属し、かつＮ末端から７番目のβシート−αへリックス間に通常より長いループ構造（所謂、ループ７）を有する（β／α）８バレル構造を形成しているという構造上の特徴を有する。また、同エキソ型キシラナーゼは、メチルグルクロノキシランを基質として反応させると、キシロビオース及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースを生成させる酵素活性を有するという機能上の特徴を有する。即ち、本実施形態のエキソ型キシラナーゼは、上述した構造上の特徴及び機能上の特徴のうちの少なくとも一方、好ましくは両方の特徴を有するものである。このようなキシラナーゼは、キシランの主鎖を特定の重合度のオリゴ糖単位で切断するエキソ型であるため、分解工程で特定の構造を有するキシロオリゴ糖のみを特異的に生成させる。
【００２１】
このようなエキソ型キシラナーゼとしては、アエロモナス・パンクタータＭＥ−１株（特許微生物寄託センター受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２７）由来のキシラナーゼＸ（ＸｙｎＸ）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の細胞内キシラナーゼ（１Ｎ８２Ａ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のキシラナーゼＴ６（１ＨＩＺＡ）等が挙げられる。ＸｙｎＸは、配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子によってコードされ、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、図２に模式的に示す立体構造を有している。なお、ＸｙｎＸについては、非特許文献１〜３に詳細な記載がなされている。１Ｎ８２Ａは、配列番号３で表される塩基配列からなる遺伝子によってコードされ、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。１ＨＩＺＡは、配列番号５で表される塩基配列からなる遺伝子によってコードされ、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００２２】
エキソ型キシラナーゼの構造上の特徴において、前記（β／α）８バレル構造は、図２に模式的に示すように、βシート−αへリックスからなる繰り返し構造を８個備えたバレル形状をなす立体構造である。このバレル構造は、糖加水分解酵素に多く見られるものであり、該酵素の触媒活性の中心を担う触媒ドメインを形成する。ループ７は、エキソ型キシラナーゼのＮ末端から７番目のβシートと、７番目のαへリックスとの間に存在するループ構造である。なお、前記通常より長いループ構造とは、ループ７の場合、１３以上のアミノ酸残基よりなることを意味する。ちなみに、本実施形態のエキソ型キシラナーゼのループ７は、１９〜２０のアミノ酸残基よりなる（図１参照）。ちなみに、図１は、上記各エキソ型キシラナーゼのアミノ酸配列を容易に比較できるように並べて示した図であり、同図にはループ７に相当する位置も示されている。
【００２３】
エキソ型キシラナーゼの機能上の特徴において、これらのエキソ型キシラナーゼはいずれも、メチルグルクロノキシランを基質として反応させると、キシロビオース及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースを生成させる酵素活性を有しており、場合によってはその他のキシロオリゴ糖を生成させることもある。ちなみに、ＸｙｎＸは、メチルグルクロノキシランを基質として反応させると、キシロビオース及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースのみを生成させる。
【００２４】
本実施形態の製造方法により製造されるキシロオリゴ糖としては、２〜７個程度のキシロースをβ１，４−グリコシド結合にて直鎖状に結合させた主鎖のみからなるもの、又は該主鎖に側鎖が結合したものが挙げられる。主鎖のみからなるキシロオリゴ糖としては、キシロビオース（Ｘ２）、キシロトリオース（Ｘ３）、キシロテトラオース（Ｘ４）、キシロペントース（Ｘ５）、キシロヘキサオース（Ｘ６）又はキシロヘプタオース（Ｘ７）が挙げられる。側鎖を有するキシロオリゴ糖としては、前記Ｘ２〜Ｘ７を構成する糖にキシロース以外の単糖又はオリゴ糖が結合したものが挙げられる。前記側鎖は、キシラン誘導体に由来する側鎖であり、具体的には、Ｌ−アラビノフラノース残基、Ｄ−グルクロン酸残基、４−Ｏ−メチルグルクロン酸残基等である。
【００２５】
これらのキシロオリゴ糖は、ビフィズス菌のような腸内有用菌（所謂善玉菌）の栄養源となり、所謂腸内悪玉菌の栄養源とはなり得ないため、善玉菌の増殖を選択的に高めて高い整腸作用を発揮する。また、これらのキシロオリゴ糖は、ミュータンス菌のような虫歯菌の栄養源にならないため、虫歯予防効果を有する甘味料としても利用可能である。さらに、これらのキシロオリゴ糖は、免疫賦活作用も発揮し得る。例えば、キシロオリゴ糖としてのＸ２は、ビフィズス菌に対する増殖作用を有することが報告されている。Ｘ２は、化１に示すように、２個のＤ−キシロース残基をβ１→４結合にて結合させた構造を有するが、ビフィズス菌等の腸内有用菌は、前記β１→４結合を切断する酵素を備えており、切断後のＤ−キシロースを分解して資化することができる。
【００２６】
【化１】
また、キシロオリゴ糖としての４−Ｏ−メチルグルクロン酸１−α１，２−キシロトリオースは、化２に示すように、３個のＤ−キシロース残基をβ１→４結合にて直鎖状に結合させたキシロトリオース残基と、該キシロトリオース残基の端に位置するＤ−キシロース残基にα１→２結合にて結合した４−Ｏ−メチルグルクロン酸残基とよりなる。腸内有用菌の中には、Ｄ−キシロース残基間のβ１→４結合を切断する酵素と、Ｄ−キシロース残基及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸残基間のα１→２結合を切断する酵素とを備えたものが知られている。
【００２７】
【化２】
本実施形態の製造方法はさらに、前記分解工程を経て生成した複数種類のキシロオリゴ糖を分離する分離工程を備えることが好ましい。分離工程では、構造の異なるキシロオリゴ糖をそれぞれ互いに分離可能な公知の分離法が利用される。即ち、この分離工程では、分解工程によって得られた複数種類のキシロオリゴ糖が各種のキシロオリゴ糖に区分（単離）されるのである。
【００２８】
このような分離法としては、ゲルろ過クロマトグラフィー、陽イオン交換樹脂（Ｎａ型、Ｃａ型、Ｋ型、Ｈ型等）又は陰イオン交換樹脂（Ｃｌ型、ＯＨ型等）を担体として用いたイオン交換クロマトグラフィー、レクチンや抗体等を担体に結合させてなるアフィニティークロマトグラフィー、活性炭、シリカゲル、オクタデシルシリル基（ＯＤＳ）を備えた樹脂やゲル等を担体として用いたクロマトグラフィーが適宜選択して利用される。なお、上述したクロマトグラフィーの代わりに同様の担体を用いたバッチ式の分離方法も実施可能である。また、分離法としては、固定床方式（ワンパス方式）、連続方式（疑似移動床方式）又は半連続方式（固定床方式と連続方式の組み合わせ）による分離装置を用いる方法、陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、電気透析膜等を用いて脱塩する方法、限外ろ過、メンブランろ過、珪藻土（あるいはハイフロスーパーセル）ろ過、逆浸透膜ろ過等によるろ過、冷却結晶化法又は煎糖法による結晶化、公知のイースト処理、その他、活性炭又は陰イオン交換樹脂を用いた脱色等が適宜選択されて採用される。
【００２９】
なお、Ｘ２〜Ｘ７のような電荷を有さないキシロオリゴ糖と、４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースのような正電荷を有するキシロオリゴ糖とを分離する場合には、陰イオン交換クロマトグラフィーを利用することが最も簡便かつ有効である。ちなみに、本実施形態の製造方法で製造されるキシロオリゴ糖とは、複数種類のキシロオリゴ糖の混合物、及び単一の種類のキシロオリゴ糖のいずれであってもよい。
【００３０】
前記実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
（１） 本実施形態のキシロオリゴ糖の製造方法では、エキソ型キシラナーゼが用いられる。エンド型のキシラナーゼは、一般に、キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオースのような重合度の連続したキシロオリゴ糖を生成させる性質を有するが、本実施形態のエキソ型キシラナーゼは、不連続な重合度を有し、かつ特定の構造を有するキシロオリゴ糖を生成させるという極めてユニークな性質を有している。このため、本実施形態のエキソ型キシラナーゼを用いて、特定の構造を有するキシラン誘導体を加水分解することにより、該キシラン誘導体の側鎖の構造に依存した特定の構造を有するキシロオリゴ糖を容易に得ることができる。
【００３１】
（２） 本実施形態のキシロオリゴ糖の製造方法では、グリコシル加水分解酵素のファミリー１０に属し、かつ１３以上のアミノ酸残基よりなるループ７を有する（β／α）８バレル構造を形成するという構造上の特徴を備えたエキソ型キシラナーゼが用いられる。また、本実施形態のキシロオリゴ糖の製造方法では、メチルグルクロノキシランを基質として反応させると、キシロビオース及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースを生成させる酵素活性を有するという機能上の特徴を有するエキソ型キシラナーゼが用いられる。なお、本実施形態のエキソ型キシラナーゼは、前記構造上の特徴及び機能上の特徴のうちの少なくとも一方の特徴を有していればよい。即ち、本実施形態では、前記構造上の特徴を有さずに機能上の特徴のみを有するもの、又は前記機能上の特徴を有さずに構造上の特徴のみを有しているものであっても構わない。このようなキシラナーゼを用いる場合、上記（１）と同様に、特定の構造を有するキシロオリゴ糖を容易に得ることができる。特に、本実施形態の製造方法のように、４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースのような特異な構造を有するキシロオリゴ糖を大量かつ安価に製造することが可能な技術は重要である。
【００３２】
（３） 本実施形態のキシロオリゴ糖の製造方法では、分解工程を経て生成した複数種類のキシロオリゴ糖を分離する分離工程を備えているため、特定の構造を有する有用なキシロオリゴ糖を容易に単離することができる。特に、分離工程で陰イオン交換クロマトグラフィーを用いる場合には、４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースのような特異な構造を有するキシロオリゴ糖を極めて容易に単離することができて便利である。
【００３３】
（４） 本実施形態のエキソ型キシラナーゼは、キシラン誘導体を複数のキシロオリゴ糖に分解する。例えば、アエロモナス・パンクタータＭＥ−１株由来のキシラナーゼＸは、白樺由来のキシランをキシロビオース及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースの二つのキシロオリゴ糖に分解する。この場合、本実施形態では、分解工程によって生成された前記複数のキシロオリゴ糖をイオン交換クロマトグラフィーで分離する分離工程をさらに実施することにより、キシロビオース及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースにそれぞれ区分することが可能である。これにより、キシロビオース及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースをそれぞれ高純度で大量に製造することが可能となる。ちなみに、本実施形態のキシロオリゴ糖の製造方法は、キシロビオースのみを製造する場合に適用することが可能であるうえ、４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースのみを製造する場合に適用することも可能である。
【実施例１】
【００３４】
＜ＸｙｎＸの粗酵素溶液の調製＞
非特許文献１の方法にて、配列番号１で表される塩基配列からなるｘｙｎＸ遺伝子がインサートされてなるプラスミドｐＸＯＬ１（３．７ｋｂｐ）を作製した後、大腸菌組換え体ＪＭ１０９／ｐＸＯＬ１を非特許文献１の方法で作製した。なお、ｐＸＯＬ１は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２６にて寄託されている。次に、該組換え体を非特許文献１の方法で前培養（１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地５ｍｌ、３７℃、１２時間、１２０ｒｐｍの振盪培養）及び本培養（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧ含有ＬＢ培地１００ｍｌ、３７℃、５時間、１２０ｒｐｍの振盪培養）した。続いて、本培養後の培養液を６０００×ｇで１０分間遠心することにより、組換え体を集菌した。集菌後の組換え体を水１００ｍｌで洗浄した後、フレンチプレス（大岳製作所）で超音波破砕することにより、ＸｙｎＸの粗酵素溶液を得た。
【００３５】
＜バーチウッドキシランの加水分解産物の検討１＞
ＸｙｎＸの粗酵素溶液によるキシランの加水分解産物を調べるために、０．５％バーチウッドキシラン（ＳＩＧＭＡ）及び０．０２％ナトリウムアザイド含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に、ＸｙｎＸの粗酵素溶液を等量加えて３７℃で１２時間又は２４時間反応させた。反応終了後、１００℃で５分間煮沸して酵素を失活させた後、未分解キシランなどの不要物を取り除くため、１２０００ｒｐｍで５分間遠心した。遠心後の上清を回収し、遠心エバポレーターで凍結乾燥させた。乾燥後の加水分解産物をメタノール４０μｌに溶解させた後、再度不要物を取り除くために１２０００ｒｐｍで５分間遠心した。遠心後の各上清を用いて薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を行った。
【００３６】
ＴＬＣの実施は、まず、ＴＬＣプレート（ＴＬＣ ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｓｈｅｅｔｓ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０Ｆ（ＭＥＲＣＫ））に上清１０μｌずつをスポットした後、クロロホルム：酢酸：水＝５：７：１の展開溶媒１にて展開させた。展開後のＴＬＣプレートを十分に乾燥させた後、硫酸：メタノール＝１：１の発色試薬１をＴＬＣプレートに噴霧し、ホットプレート上で加熱することにより、展開後の加水分解産物を可視化させた。結果を図３（ａ）に示す。
【００３７】
図３（ａ）のレーン１にはＸ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４を混合したスタンダードキシロオリゴ糖マーカーが展開され、レーン２には１２時間反応させたときの加水分解産物が展開され、レーン３には２４時間反応させたときの加水分解産物が展開されている。図３（ａ）より、ＸｙｎＸは、バーチウッドキシランからキシロビオース（以下、プロダクトＡと記載する）及びキシロテトラオース（以下、プロダクトＢと記載する）のみを特異的に生成させることが確認された。通常、エンド型のキシラナーゼは、キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオースのような重合度の連続したキシロオリゴ糖を生成させるため、ＸｙｎＸのキシラナーゼ活性は非常にユニークである。
【実施例２】
【００３８】
＜ＸｙｎＸ分離標品（精製標品）の調製＞
上記プラスミドｐＸＯＬ１にインサートされているｘｙｎＸ遺伝子をＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにて切り出した後、ｐＴＴＱ１８ベクターにサブクローニングすることにより、ｔａｃプロモーター及びｌａｃＩｑの制御下で発現するプラスミドｐＸＬＩＱ１（５．６ｋｂｐ）を構築した。なお、ｐＸＬＩＱ１は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２８にて寄託されている。プラスミドｐＸＬＩＱ１を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入して形質転換することにより、大腸菌組換え体ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＸＬＩＱ１を作製した（非特許文献３参照）。
【００３９】
次に、該組換え体を非特許文献３の方法にて前培養（１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地５ｍｌ、３７℃、１２時間、１２０ｒｐｍの振盪培養）及び本培養（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧ含有ＬＢ培地１００ｍｌ、３７℃、１２０ｒｐｍの振盪培養）した。続いて、非特許文献２に記載の浸透圧ショック法を用いて、本培養にて得られた組換え体のペリプラズムからＸｙｎＸタンパク質を含む粗酵素溶液を回収した。
【００４０】
得られた粗酵素溶液を非特許文献３の方法（Ｈｉ ＴｒａｐＱ陰イオン交換クロマトグラフィー→（HiPrep Sephacryl HRゲルろ過→ＰＯＲＯＳ ＨＱ陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー）により分離した。分離時のキシラナーゼ活性はジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法にて還元糖を生成させることにより測定し、タンパク質の存在はＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認した。分離条件を以下に示す。
【００４１】
［Ｈｉ Ｔｒａｐ Ｑ］
カラム ；Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ陰イオン交換カラム（Amersham Biosciences）
溶出液 ；緩衝液Ａ＝２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）
緩衝液Ｂ＝２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）／１Ｍ ＮａＣｌ
グラジエント；緩衝液Ｂ濃度 ０％→１００％（０分→３０分）
流速 ；５ｍｌ／分
検出波長 ；２８０ｎｍ
カラム温度 ；４℃
分画容量 ；５ｍｌ
［Ｈｉ Ｐｒｅｐ２６／６０］
カラム ；Ｈｉ Ｐｒｅｐ２６／６０ゲル濾過カラム（Amersham Biosciences）
溶出液 ；２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）
流速 ；１ｍｌ／分
検出波長 ；２８０ｎｍ
カラム温度 ；４℃
分画容量 ；５ｍｌ
［ＰＯＲＯＳ ＨＱ］
カラム ；ＰＯＲＯＳ ＨＱ陰イオン交換カラム（PerSeptive Biosystems）
溶出液 ；緩衝液ａ＝２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）
緩衝液ｂ＝２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）／１Ｍ ＮａＣｌ
グラジエント；緩衝液ｂ濃度 ０％ （ ０分→ ５分）
０％→ ３０％（ ５分→１５分）
３０％→１００％（１５分→２０分）
流速 ；４ｍｌ／分
検出波長 ；２８０ｎｍ
カラム温度 ；室温
分画容量 ；１ｍｌ
＜ＸｙｎＸ分離標品のキャラクタライゼーション＞
分離後の活性画分を２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）に対して透析した。透析後のＸｙｎＸ（以下、ＸｙｎＸ分離標品と記載する）は、分子量３８ｋＤａの単量体として存在し、５０℃の至適温度及び８．０の至適ｐＨを有し、かつ４０℃以下の温度で安定なタンパク質であった。また、基質特異性は、バーチウッドキシランに対するキシラナーゼ活性を１００％とすると、オートスペルトキシランに対して１９５％、カルボキシメチルセルロース及び可溶性デンプンに対してはいずれも０％のキシラナーゼ活性を有していた。
【００４２】
ＸｙｎＸ分離標品を用いて、プロテインシーケンサーによるアミノ酸配列の決定を行ったところ、配列番号２における２〜３３３番目のアミノ酸配列からなるタンパク質であることが確認された。また、ＸｙｎＸは、図１に示すように、既知構造のファミリー１０エンド型キシラナーゼとの相同性が高く、かつ活性部位のアミノ酸が高い割合で保存されていたことも判明した。
【００４３】
次に、得られたアミノ酸配列を利用してホモロジーモデリング法で立体構造予測を行ったところ、（β／α）８バレル構造を形成し得ることが示唆されるとともに、通常より長いアミノ酸残基よりなるループ７の存在が示唆された。続いて、Ｘ線結晶回析にて立体構造解析を行ったところ、図２に模式的に示す立体構造を形成していることが判明した。なお、図２に示す符号２０は、ＸｙｎＸを示す。このＸｙｎＸにおいて、濃く色付けした螺旋状リボン２１はαへリックス、薄く色付けした帯状リボン２２はβシート、ハッチングで示す帯状領域はループ７を表している。
【００４４】
次に、ＸｙｎＸの活性中心の求核触媒残基及び酸塩基触媒残基を決定するために、Ｅ１３３Ａ及びＥ２４０Ａ（配列番号２で表されるアミノ酸配列においては、１３４番目及び２４１番目のＥをそれぞれＡに置換したもの）の２種類のアミノ酸置換変異体についてアザイド試験を行った。その結果、Ｅ２４０が求核触媒残基、Ｅ１３３が酸塩基触媒残基であることが判明した（図２参照）。
【００４５】
＜バーチウッドキシランの加水分解産物の検討２＞
ＸｙｎＸ分離標品によるキシランの加水分解産物を詳細に調べた。まず、０．５％バーチウッドキシラン含有２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、ＸｙｎＸ分離標品を１０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１２時間反応させた。反応終了後、１００℃で５分間煮沸して酵素を失活させた後、未分解キシランなどの不要物を取り除くため、１２０００ｒｐｍで５分間遠心した。遠心後の上清を回収し、遠心エバポレーターで凍結乾燥させた。乾燥後の加水分解産物をメタノールに溶解させた後、再度不要物を取り除くために１２０００ｒｐｍで５分間遠心した。遠心後の上清を回収し、遠心エバポレーターで凍結乾燥させた。
【００４６】
次に、凍結乾燥後の加水分解産物の一部を用いて、糖の酸加水分解を行った。まず、加水分解産物５ｍｇに０．５Ｍ硫酸５００ｍｌを加え、１０５℃で２時間インキュベートし、水酸化ナトリウムで中和した後、凍結乾燥を行った。乾燥後の酸加水分解物をメタノールに溶解させた。
【００４７】
上記凍結乾燥後の加水分解産物の残りと、前記酸加水分解物とを用いて、ＴＬＣを行った。ＴＬＣの実施は、まず、４枚のＴＬＣプレートに加水分解産物及び酸加水分解物の各サンプル液１０μｌずつをそれぞれスポットした。２枚のＴＬＣプレートは上記展開溶媒１にて展開し、残り２枚のＴＬＣプレートは１−ブタノール：酢酸：水＝２：１：１の展開溶媒２にて展開した。展開後の各ＴＬＣプレートを十分に乾燥させた後、展開溶媒１で展開したＴＬＣプレートの１枚、及び展開溶媒２で展開したＴＬＣプレートの１枚に対してそれぞれ発色試薬１を噴霧し、ホットプレート上で加熱した。また、残りのＴＬＣプレートに対して、ジフェニルアミン−アニリン試薬（ジフェニルアミン１ｇ、アニリン１ｍｌ、アセトン５０ｍｌ及び８０％リン酸）からなる発色試薬２を噴霧し、ホットプレート上で加熱した。結果を図４及び図５に示す。
【００４８】
図４（ａ）、（ｂ）は、いずれもクロロホルム系の展開溶媒１で展開されたＴＬＣプレートであって、図４（ａ）は硫酸／メタノールの発色試薬１で可視化させたものであり、図４（ｂ）はジフェニルアミン−アニリン試薬からなる発色試薬２で可視化させたものである。図４（ａ）、（ｂ）のレーン１には、スタンダードキシロオリゴ糖マーカーが展開され、レーン２には加水分解産物が展開され、レーン３には酸加水分解物が展開され、レーン４〜７にはグルクロン酸、グルコース、フルクトース及びアラビノースがそれぞれ展開されている。図５（ａ）、（ｂ）は、いずれもブタノール系の展開溶媒２で展開されたＴＬＣプレートであって、図５（ａ）は発色試薬１で可視化させたものであり、図５（ｂ）は発色試薬２で可視化させたものである。図５（ａ）、（ｂ）の各レーン１に展開されているサンプルは、図４の場合と同じである。
【００４９】
その結果、図４（ａ）のレーン２においてＸ４とほぼ同じ位置に検出されたスポット（プロダクトＢ）は、図５（ａ）のレーン２ではマーカーのＸ４と異なる位置に検出された。さらに、図４（ａ）及び図５（ａ）のレーン３には、いずれもＸ１以外にＸ２の位置にもスポットが検出された。バーチウッドキシランからＸ２及びＸ４のみを特異的に生成させる場合、それらの加水分解産物を酸加水分解すれば、Ｘ１しか検出されないはずである。よって、ＸｙｎＸによりバーチウッドキシランを加水分解したときの加水分解産物、即ちプロダクトＡ及びＢは、Ｘ２及びＸ４ではないことが示唆された。
【００５０】
一方、ＴＬＣプレートをジフェニルアミン−アニリン試薬からなる発色試薬２で可視化させる場合、アルドヘキソースを青紫色、ペントースを褐紫色、ケトヘキソースを黄赤色、ウロン酸を紫褐色に発色させることが知られている。図４（ｂ）及び図５（ｂ）のレーン２に示すＸ２のスポット（プロダクトＡ）及びＸ４付近のスポット（プロダクトＢ）は、いずれも異なる色に発色されており、プロダクトＡはキシロースの褐紫色に似ており、プロダクトＢはグルクロン酸の紫褐色に似ていた。また、図４（ｂ）及び図５（ｂ）のレーン３（酸加水分解物）に示すＸ１のスポット及びＸ２付近のスポットは、いずれも異なる色に発色されており、Ｘ１のスポットはキシロースの褐紫色に似ており、Ｘ２付近のスポットはグルクロン酸の紫褐色に似ていた。よって、図４（ｂ）及び図５（ｂ）のレーン３に示すＸ２付近のスポットは、不完全酸加水分解物ではなく、ウロン酸物質であることが示唆された。従って、ＸｙｎＸによりバーチウッドキシランを加水分解すると、Ｘ２からなるプロダクトＡと、ウロン酸を含む物質からなるプロダクトＢとを特異的に生成させることが強く示唆される。
【００５１】
バーチウッドキシランは、β１，４結合したキシロース主鎖（Ｘｎ）と、該主鎖を構成するキシロース残基に対してα１，２結合した４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸からなる側鎖とを備えたキシラン誘導体を高い割合で含有していることが知られている。さらに、前記側鎖は、主鎖を構成するキシロース残基１０個に対して１個程度の割合でランダムに分布しているものと考えられている。このようなキシラン誘導体をＸｙｎＸが加水分解する場合を仮定すると、図４及び図５の各レーン２のＸ４付近に検出されたスポット（プロダクトＢ）は、Ｘｎに４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸残基を結合させた構造を有していると推定される。
【実施例３】
【００５２】
＜プロダクトＡ，Ｂの単離＞
実施例１で調製したＸｙｎＸの粗酵素溶液１００ｍｌに、１．０％バーチウッドキシラン溶液１００ｍｌを加え、３７℃で１２時間反応させた後、プロダクトＡ，Ｂを含む加水分解産物をメタノール抽出した。次に、加水分解産物を含むメタノール抽出液に陰イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ（Ｃｌ−）（ムロマチテクノス）を加えて一晩攪拌した後、１．５ｃｍ×１５ｃｍのエコノカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に充填し、３００ｍｌの水でカラム内を洗浄することにより、非吸着画分を溶出させた。次に、該カラム内に０．５Ｍ塩化ナトリウム１００ｍｌを流すことにより、吸着画分を溶出させた。非吸着画分はエバポレートした後に次の試験に供した。吸着画分は、エバポレートした後にゲル濾過樹脂Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を充填したエコノカラム内で脱塩処理し、溶媒を水に置換した後に次の試験に供した。
【００５３】
最終的に、非吸着画分２５ｍｇと、吸着画分１２ｍｇとが得られた。また、陰イオン交換樹脂に供される前の加水分解産物、非吸着画分及び吸着画分をＴＬＣプレートにスポットし、上記実施例１と同じ条件でＴＬＣを行った。結果を図３（ｂ）に示す。図３（ｂ）のレーン１にはスタンダードキシロオリゴ糖マーカーが展開され、レーン２には加水分解産物が展開され、レーン３には非吸着画分が展開され、レーン４には吸着画分が展開されている。同図に示すように、陰イオン交換樹脂を用いた分離方法により、プロダクトＡ，Ｂを単離することができた。
【実施例４】
【００５４】
＜プロダクトＡ，Ｂの同定＞
非吸着画分（プロダクトＡ）及び吸着画分（プロダクトＢ）について、それぞれ１Ｈ−ＮＭＲを測定した。その結果、プロダクトＡはＸ２であると同定された。一方、プロダクトＢは、複雑な化合物であるうえ、測定時に多くのノイズが検出されたために同定に至るような解析を行うことができなかった。
【００５５】
次に、プロダクトＢについて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる質量分析を行った。その結果、プロダクトＢの分子量は約６２７であることが判明した。この分子量は、Ｘ３に４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸及びナトリウム塩を加えた分子量と一致した。よって、プロダクトＢは、４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロニルキシロトリオース（アルドヘキサオウロン酸）であることが判明した。
【００５６】
次に、４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸残基がＸ３のどの位置に結合しているかを調べるために、プロダクトＢについてメチル化分析を行った。メチル化分析では、まず、プロダクトＢをメチル化した後、酸加水分解し、続いてアセチル化した後、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）に供した。その結果、４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸残基の結合位置において検出予測されるアルジトールアセテートとＧＣとの結果は、非還元末端側の位置に４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸残基が結合している場合のパターンと一致した。
【００５７】
これを確認するために、プロダクトＢを還元化した後、メチル化、酸加水分解及びアセチル化を行った後にＧＣに供したところ、検出されたアルジトールアセテートは、４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロニルキシロトリオースを還元した場合に推測されるアルジトールアセテートと一致した。さらに、プロダクトＢを還元化した後、メチル化、酸加水分解及びアセチル化を行った後にＧＣ−ＭＳ分析にて解析したところ、４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロニルキシロトリオースを還元した場合に推測されるアルジトールアセテートと一致した。従って、プロダクトＢは、Ｘ３の非還元末端側のキシロピラノースの２位に４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸残基が結合した構造、即ち上記化２に示す構造を有していると結論づけられた。そして、本実施例のキシロオリゴ糖の製造方法によれば、キシロビオース及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースを高純度で大量に製造可能であることが示された。
【実施例５】
【００５８】
＜オートスペルトキシランの加水分解＞
実施例２で調製したＸｙｎＸ分離標品を１０μｇ／ｍｌの濃度で含有する２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、基質としての０．５％オートスペルトキシラン溶液５００μｌを加え、３７℃で６時間又は１２時間反応させることにより加水分解産物を得た。また、得られた各加水分解産物を上記実施例２と同様に酸加水分解することにより、酸加水分解物を得た。これらの加水分解産物及び酸加水分解物について、上記実施例２と同じ条件でＴＬＣを行った。
【００５９】
その結果、６時間及び１２時間反応させたときの加水分解産物では、互いにほぼ同じ位置、大きさ及び濃さのスポットが確認された。ちなみに、確認されたスポットには、Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４，Ｘ５付近に位置するものが含まれていた。即ち、これらオートスペルトキシラン（アラビノグルクロノキシラン）を基質として生成されたスポットのパターンは、上記各実施例のバーチウッドキシランを基質とした場合のパターンとは異なっていた。従って、ＸｙｎＸは、キシラン誘導体の側鎖の構造に応じて、異なるキシロオリゴ糖を生成させるものであることが確認された。
【実施例６】
【００６０】
＜ループ７のキシラナーゼ活性への影響＞
配列番号１で表される塩基配列の９１９〜９７５番目のヌクレオチドを取り除いたｘｙｎＸのループ７欠失遺伝子（ｍＬ７）を作製した。次に、ｍＬ７をｐＴ７ベクターにＴＡクローニングした後、ｐＴＴＱ１８ベクターにサブクローニングすることにより、ｔａｃプロモーター及びｌａｃＩｑの制御下で発現するプラスミドｐＸＬＩＱ１（ｍＬ７）（５．６ｋｂｐ）を構築した。プラスミドｐＸＬＩＱ１（ｍＬ７）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入して形質転換することにより、大腸菌組換え体ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＸＬＩＱ１（ｍＬ７）を作製した後、実施例１と同様に前培養及び本培養した。続いて、本培養後の培養液を実施例１と同様に超音波破砕することにより、ＸｙｎＸのループ７欠失タンパク質（ＸｙｎＸ ｍＬ７）を含む粗酵素溶液を得た。
【００６１】
得られた粗酵素溶液を、反応温度を４０℃、反応時間を２時間とした以外は、実施例１と同様にバーチウッドキシランと反応させた後、ＴＬＣにて分析した。なお、実施例１で得られた野生型のＸｙｎＸの粗酵素溶液についても同様に反応させた後、ＴＬＣにて分析した。その結果、野生型のＸｙｎＸでは、ＴＬＣプレート上でＸ２（プロダクトＡ）及び４−Ｏ−メチルグルクロニルキシロトリオース（プロダクトＢ）が明確に検出されたのに対し、ＸｙｎＸ ｍＬ７では、ＴＬＣプレート上でキシロオリゴ糖が全く検出されなかった。
【００６２】
よって、ＸｙｎＸによるユニークなキシラナーゼ活性（バーチウッドキシランからプロダクトＡ，Ｂを生成させる活性）の発現には、１３以上のアミノ酸残基よりなるループ７の存在が重要であることが予想され得る。さらに、立体構造より推測すると、ＸｙｎＸに見られる通常より長いループ７は、キシラン誘導体の主鎖の末端を覆い被せるように保持することで、該キシラン誘導体をオリゴ糖単位で端から順番に切り出すエキソ型の酵素活性に直接的に寄与していることが示唆され得る。従って、グリコシル加水分解酵素のファミリー１０に属し、かつ１３以上のアミノ酸残基よりなるループ７を有する（β／α）８バレル構造を形成しているエキソ型キシラナーゼを用いて、キシランを主鎖とする多糖を分解することにより、特定の構造を有するキシロオリゴ糖の製造が可能であることが強く示唆され得る。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】複数のキシラナーゼのアミノ酸配列を比較した図。
【図２】キシラナーゼＸの立体構造を模式的に示す図。
【図３】（ａ）は実施例１においてバーチウッドキシランをＸｙｎＸで加水分解した加水分解産物を展開したＴＬＣプレートを示し、（ｂ）は実施例３において加水分解産物をイオン交換樹脂で分離した後に展開したＴＬＣプレートを示す。
【図４】実施例２において、加水分解産物をクロロホルム系の展開溶媒で展開したＴＬＣプレートであって、（ａ）は硫酸／メタノールで可視化させたものであり、（ｂ）はジフェニルアミン−アニリン試薬で可視化させたものである。
【図５】実施例２において、加水分解産物をブタノール系の展開溶媒で展開したＴＬＣプレートであって、（ａ）は硫酸／メタノールで可視化させたものであり、（ｂ）はジフェニルアミン−アニリン試薬で可視化させたものである。
【符号の説明】
【００６４】
２０…キシラナーゼＸ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の構造を有し、整腸作用や免疫賦活作用を発揮し得るキシロオリゴ糖を製造する方法に関する。例えば、キシランを主鎖とする多糖をキシラナーゼにて分解することにより、４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースのような特定の構造を有するキシロオリゴ糖を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、環境問題が注目される中、半永久的に生産され得る再生可能なバイオマス資源の有効利用に大きな期待が寄せられている。現在、木質系バイオマス資源は主に、食糧、燃料、繊維、建築材料等に利用されているが、その量は地球上のバイオマス年間生産量の僅かな量に過ぎない。バイオマス資源として木材を利用する場合、細胞壁の利用が多い。木材の細胞壁には、セルロースが４５％程度、ヘミセルロースが３０％程度、リグニンが２５％程度含まれている。これらのうち、セルロースに次ぐ主要成分であるヘミセルロースに関しては、キシリトール等や一部のキシロオリゴ糖が食品素材として利用されている以外は、工業的な利用がほとんどなされていない。
【０００３】
木材に含まれるヘミセルロースの主な成分としては、キシラン及びその誘導体からなる多糖が挙げられる。キシランは、Ｄ−キシロース残基をβ１，４結合にて直鎖状に結合させた直鎖状重合体である。天然のヘミセルロースには、前記キシランの他にも、キシランからなる直鎖状の主鎖に、Ｌ−アラビノフラノース残基、Ｄ−グルクロン酸残基、４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸残基等の側鎖を結合させたアラビノキシラン、グルクロノキシラン、アラビノグルクロノキシラン、メチルグルクロノキシラン（４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロノキシラン）等のキシラン誘導体が存在する。
【０００４】
キシロオリゴ糖は、２〜７個程度のキシロースをβ１，４→グリコシド結合にて結合させた構造を有するオリゴ糖である。キシロオリゴ糖は、ヒトの消化酵素では加水分解されないが、ビフィズス菌等の腸内有用菌の栄養源となり得るため、高い整腸作用を有することが知られている。特に、キシロオリゴ糖は、他のオリゴ糖よりも一桁程低い濃度で有効性を発揮するという報告もあるうえ、耐熱性に優れるとともに低いｐＨ環境下でも安定であることから、食品添加物等として極めて有用である。キシロオリゴ糖は、トウモロコシ、コーンコブ、バガス、綿実せり等の植物の樹皮等から得られる天然物である。キシロオリゴ糖は、木材成分のキシランから得ることも可能である。現在、日本では年間５０００万トンもの大量の木質廃材が排出されているため、環境問題や廃棄物問題の解決に向けて、このような廃材の工業的な有効利用に大きな期待がかけられている。
【０００５】
一般に、キシラン主鎖をキシロオリゴ糖に分解する酵素をキシラナーゼという。キシラナーゼは、微生物界に広く認められている。多くのキシラナーゼは、広葉樹キシランに作用して、主としてキシロビオースからオリゴキシロースや、アルドビオウロン酸からアルドヘキサオウロン酸等を生成する。キシラナーゼは、キシランの主鎖をランダムに分解するエンド型と、キシランの主鎖を端から切断するエキソ型とに分類することが可能である。エキソ型キシラナーゼは、キシランの主鎖を特定の重合度のオリゴ糖単位で切断するため、分解産物として特定の構造を有するキシロオリゴ糖のみを特異的に生成させる。
【０００６】
キシラナーゼを含むグリコシル加水分解酵素は、立体構造及びアミノ酸配列の疎水性クラスター解析に基づいて、９７ファミリーに分類されている。キシラナーゼのほとんどは１０種のファミリーに跨って分類され、そのほとんどはファミリー１０及びファミリー１１に分類されている。一般に、ファミリー１０は、高い分子量（＞３０ｋＤａ）と低い等電点（ｐＩ）の酸性タンパク質とにより特徴づけられる。ファミリー１０は、（β／α）８バレル構造からなる基本構造を有するとともに、二次構造の約４０％をαへリックスで占有されている。
【０００７】
例えば非特許文献１〜３には、アエロモナス・パンクタータ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｃｔａｔａ、従来名；アエロモナス・カビエ）ＭＥ−１株由来のキシラナーゼであるキシラナーゼＸ（ＸｙｎＸ）について報告されている。キシラナーゼＸは、分子量３８ｋＤａの単量体からなり、５０℃の至適温度、至適ｐＨ８．０のタンパク質である。これらの報告によれば、キシラナーゼＸは、バーチウッドキシランから、キシロビオース（Ｄ−キシロースのダイマー）及びキシロテトラオース（Ｄ−キシロースのテトラマー）を生成させる。また、キシラナーゼＸは、細胞内局在型キシラナーゼであるが、浸透圧の低下ショックにより細胞質内からペリプラズムへと放出されることも報告されている。さらに、キシラナーゼＸは、Ｘ線結晶構造解析より、グリコシル加水分解酵素のファミリー１０に属することも確認されている。
【非特許文献１】臼井、外３名、「アエロモナス・カビエＭＥ−１株のエキソ−キシラナーゼの有力候補であるキシラナーゼＸが、キシランから専らキシロビオース及びキシロテトラオースを生成する（ XynX, a possible exo-xylanase of Aeromonas caviae ME-1 that produces exclusively xylobiose and xylotetraose from xylan. ）」、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６３（８）、１３４６−１３５２（１９９９）
【非特許文献２】臼井、外３名、「アエロモナス・カビエＭＥ−１株の細胞内局在型キシラナーゼ（キシラナーゼＸ）が、浸透圧の低下ショックにより細胞質内からペリプラズムへとリリースされる（ A cytoplasmic xylanase ( XynX ) of Aeromonas caviae ME-1 is released from the cytoplasm to the periplasm by osmotic downshock. ）」、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９５，４８８−４９５（２００３）
【非特許文献３】藤本、外５名、「アエロモナス・パンクタータＭＥ−１株由来のファミリー１０キシラナーゼであるキシラナーゼＸの結晶化及び予備的なＸ線による結晶学的研究（ Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of XynX, a family 10 xylanase from Aeromonas punctata ME-1. ）」、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｆ，６１，２５５−２５６（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、非特許文献１において、キシラナーゼＸが、バーチウッドキシランからキシロビオース及びキシロテトラオースを生成させたことを報告したが、その後の鋭意研究の結果、キシラナーゼＸに特定の構造を有するキシロオリゴ糖を生成させる作用があることを見出した。そして、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。本発明の目的とするところは、特定の構造を有するキシロオリゴ糖を容易に製造することができるキシロオリゴ糖の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明は、キシロオリゴ糖を製造する方法であって、該方法は、キシラン誘導体をエキソ型キシラナーゼで分解する分解工程を備え、前記キシラン誘導体は、β１，４−キシランよりなる主鎖に側鎖が結合してなる構造を有することを要旨とする。
【００１０】
請求項２に記載のキシロオリゴ糖の製造方法は、請求項１に記載の発明において、前記エキソ型キシラナーゼは、グリコシル加水分解酵素のファミリー１０に属し、かつＮ末端から７番目のβシート−αへリックス間に１３以上のアミノ酸残基よりなるループ構造を有する（β／α）８バレル構造を形成していることを要旨とする。
【００１１】
請求項３に記載のキシロオリゴ糖の製造方法は、請求項１又は請求項２に記載の発明において、前記エキソ型キシラナーゼは、メチルグルクロノキシランを基質として反応させると、キシロビオース及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースを生成させる酵素活性を有することを要旨とする。
【００１２】
請求項４に記載のキシロオリゴ糖の製造方法は、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の発明において、前記エキソ型キシラナーゼは、アエロモナス・パンクタータＭＥ−１株（特許微生物寄託センター受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２７）由来のキシラナーゼＸであることを要旨とする。
【００１３】
請求項５に記載のキシロオリゴ糖の製造方法は、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の発明において、前記キシラン誘導体は、メチルグルクロノキシランであることを要旨とする。
【００１４】
請求項６に記載のキシロオリゴ糖の製造方法は、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の発明において、前記キシラン誘導体は、４−Ｏ−メチルグルクロン酸を前記側鎖として備えることを要旨とする。
【００１５】
請求項７に記載のキシロオリゴ糖の製造方法は、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の発明において、当該製造方法はさらに、前記分解工程を経て生成した前記キシロオリゴ糖を分離する工程を備えることを要旨とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、特定の構造を有するキシロオリゴ糖を容易に製造することができるキシロオリゴ糖の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明のキシロオリゴ糖の製造方法を具体化した一実施形態について説明する。
本実施形態のキシロオリゴ糖の製造方法は、β１，４−キシランよりなる主鎖に側鎖が結合してなるキシラン誘導体を、エキソ型キシラナーゼで分解する分解工程を備える。分解工程では、キシラン誘導体がエキソ型キシラナーゼによってオリゴ糖単位で端から順番に切り出される。このため、本実施形態のキシロオリゴ糖の製造方法では、前記側鎖の種類や結合位置等に依存した特定の構造を有するキシロオリゴ糖が製造される。
【００１８】
本実施形態の製造方法で用いられるキシラン誘導体は、具体的には、Ｄ−キシロース残基の直鎖状重合体であるβ１，４−キシランからなる主鎖に、Ｌ−アラビノフラノース残基、Ｄ−グルクロン酸残基、４−Ｏ−メチルグルクロン酸残基等の側鎖を結合させた構造を有する。このようなキシラン誘導体としては、例えば、アラビノキシラン、グルクロノキシラン、アラビノグルクロノキシラン、メチルグルクロノキシラン等が挙げられる。なお、キシラン誘導体としては、上述した側鎖以外にも、フルクトース等を始めとしてあらゆる種類の側鎖を備えたものが使用可能である。
【００１９】
例えば、本実施形態の製造方法において、メチルグルクロノキシランのような４−Ｏ−メチルグルクロン酸を側鎖として備えるキシラン誘導体を用いる場合、製造されるキシロオリゴ糖には、アルドトリオウロン酸（４−Ｏ−メチルグルクロニルキシロビオース）、アルドテトラオウロン酸（４−Ｏ−メチルグルクロニルキシロトリオース）、アルドヘキサオウロン酸（４−Ｏ−メチルグルクロニルキシロペントース）等のアルドオリゴオウロン酸が含まれる。このようなアルドオリゴオウロン酸を製造可能なキシラン誘導体としては、バーチウッドキシラン（白樺キシラン）が特に好適に使用される。
【００２０】
本実施形態の製造方法で用いられるエキソ型キシラナーゼは、グリコシル加水分解酵素のファミリー１０に属し、かつＮ末端から７番目のβシート−αへリックス間に通常より長いループ構造（所謂、ループ７）を有する（β／α）８バレル構造を形成しているという構造上の特徴を有する。また、同エキソ型キシラナーゼは、メチルグルクロノキシランを基質として反応させると、キシロビオース及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースを生成させる酵素活性を有するという機能上の特徴を有する。即ち、本実施形態のエキソ型キシラナーゼは、上述した構造上の特徴及び機能上の特徴のうちの少なくとも一方、好ましくは両方の特徴を有するものである。このようなキシラナーゼは、キシランの主鎖を特定の重合度のオリゴ糖単位で切断するエキソ型であるため、分解工程で特定の構造を有するキシロオリゴ糖のみを特異的に生成させる。
【００２１】
このようなエキソ型キシラナーゼとしては、アエロモナス・パンクタータＭＥ−１株（特許微生物寄託センター受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２７）由来のキシラナーゼＸ（ＸｙｎＸ）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の細胞内キシラナーゼ（１Ｎ８２Ａ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のキシラナーゼＴ６（１ＨＩＺＡ）等が挙げられる。ＸｙｎＸは、配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子によってコードされ、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、図２に模式的に示す立体構造を有している。なお、ＸｙｎＸについては、非特許文献１〜３に詳細な記載がなされている。１Ｎ８２Ａは、配列番号３で表される塩基配列からなる遺伝子によってコードされ、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。１ＨＩＺＡは、配列番号５で表される塩基配列からなる遺伝子によってコードされ、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００２２】
エキソ型キシラナーゼの構造上の特徴において、前記（β／α）８バレル構造は、図２に模式的に示すように、βシート−αへリックスからなる繰り返し構造を８個備えたバレル形状をなす立体構造である。このバレル構造は、糖加水分解酵素に多く見られるものであり、該酵素の触媒活性の中心を担う触媒ドメインを形成する。ループ７は、エキソ型キシラナーゼのＮ末端から７番目のβシートと、７番目のαへリックスとの間に存在するループ構造である。なお、前記通常より長いループ構造とは、ループ７の場合、１３以上のアミノ酸残基よりなることを意味する。ちなみに、本実施形態のエキソ型キシラナーゼのループ７は、１９〜２０のアミノ酸残基よりなる（図１参照）。ちなみに、図１は、上記各エキソ型キシラナーゼのアミノ酸配列を容易に比較できるように並べて示した図であり、同図にはループ７に相当する位置も示されている。
【００２３】
エキソ型キシラナーゼの機能上の特徴において、これらのエキソ型キシラナーゼはいずれも、メチルグルクロノキシランを基質として反応させると、キシロビオース及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースを生成させる酵素活性を有しており、場合によってはその他のキシロオリゴ糖を生成させることもある。ちなみに、ＸｙｎＸは、メチルグルクロノキシランを基質として反応させると、キシロビオース及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースのみを生成させる。
【００２４】
本実施形態の製造方法により製造されるキシロオリゴ糖としては、２〜７個程度のキシロースをβ１，４−グリコシド結合にて直鎖状に結合させた主鎖のみからなるもの、又は該主鎖に側鎖が結合したものが挙げられる。主鎖のみからなるキシロオリゴ糖としては、キシロビオース（Ｘ２）、キシロトリオース（Ｘ３）、キシロテトラオース（Ｘ４）、キシロペントース（Ｘ５）、キシロヘキサオース（Ｘ６）又はキシロヘプタオース（Ｘ７）が挙げられる。側鎖を有するキシロオリゴ糖としては、前記Ｘ２〜Ｘ７を構成する糖にキシロース以外の単糖又はオリゴ糖が結合したものが挙げられる。前記側鎖は、キシラン誘導体に由来する側鎖であり、具体的には、Ｌ−アラビノフラノース残基、Ｄ−グルクロン酸残基、４−Ｏ−メチルグルクロン酸残基等である。
【００２５】
これらのキシロオリゴ糖は、ビフィズス菌のような腸内有用菌（所謂善玉菌）の栄養源となり、所謂腸内悪玉菌の栄養源とはなり得ないため、善玉菌の増殖を選択的に高めて高い整腸作用を発揮する。また、これらのキシロオリゴ糖は、ミュータンス菌のような虫歯菌の栄養源にならないため、虫歯予防効果を有する甘味料としても利用可能である。さらに、これらのキシロオリゴ糖は、免疫賦活作用も発揮し得る。例えば、キシロオリゴ糖としてのＸ２は、ビフィズス菌に対する増殖作用を有することが報告されている。Ｘ２は、化１に示すように、２個のＤ−キシロース残基をβ１→４結合にて結合させた構造を有するが、ビフィズス菌等の腸内有用菌は、前記β１→４結合を切断する酵素を備えており、切断後のＤ−キシロースを分解して資化することができる。
【００２６】
【化１】
また、キシロオリゴ糖としての４−Ｏ−メチルグルクロン酸１−α１，２−キシロトリオースは、化２に示すように、３個のＤ−キシロース残基をβ１→４結合にて直鎖状に結合させたキシロトリオース残基と、該キシロトリオース残基の端に位置するＤ−キシロース残基にα１→２結合にて結合した４−Ｏ−メチルグルクロン酸残基とよりなる。腸内有用菌の中には、Ｄ−キシロース残基間のβ１→４結合を切断する酵素と、Ｄ−キシロース残基及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸残基間のα１→２結合を切断する酵素とを備えたものが知られている。
【００２７】
【化２】
本実施形態の製造方法はさらに、前記分解工程を経て生成した複数種類のキシロオリゴ糖を分離する分離工程を備えることが好ましい。分離工程では、構造の異なるキシロオリゴ糖をそれぞれ互いに分離可能な公知の分離法が利用される。即ち、この分離工程では、分解工程によって得られた複数種類のキシロオリゴ糖が各種のキシロオリゴ糖に区分（単離）されるのである。
【００２８】
このような分離法としては、ゲルろ過クロマトグラフィー、陽イオン交換樹脂（Ｎａ型、Ｃａ型、Ｋ型、Ｈ型等）又は陰イオン交換樹脂（Ｃｌ型、ＯＨ型等）を担体として用いたイオン交換クロマトグラフィー、レクチンや抗体等を担体に結合させてなるアフィニティークロマトグラフィー、活性炭、シリカゲル、オクタデシルシリル基（ＯＤＳ）を備えた樹脂やゲル等を担体として用いたクロマトグラフィーが適宜選択して利用される。なお、上述したクロマトグラフィーの代わりに同様の担体を用いたバッチ式の分離方法も実施可能である。また、分離法としては、固定床方式（ワンパス方式）、連続方式（疑似移動床方式）又は半連続方式（固定床方式と連続方式の組み合わせ）による分離装置を用いる方法、陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、電気透析膜等を用いて脱塩する方法、限外ろ過、メンブランろ過、珪藻土（あるいはハイフロスーパーセル）ろ過、逆浸透膜ろ過等によるろ過、冷却結晶化法又は煎糖法による結晶化、公知のイースト処理、その他、活性炭又は陰イオン交換樹脂を用いた脱色等が適宜選択されて採用される。
【００２９】
なお、Ｘ２〜Ｘ７のような電荷を有さないキシロオリゴ糖と、４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースのような正電荷を有するキシロオリゴ糖とを分離する場合には、陰イオン交換クロマトグラフィーを利用することが最も簡便かつ有効である。ちなみに、本実施形態の製造方法で製造されるキシロオリゴ糖とは、複数種類のキシロオリゴ糖の混合物、及び単一の種類のキシロオリゴ糖のいずれであってもよい。
【００３０】
前記実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
（１） 本実施形態のキシロオリゴ糖の製造方法では、エキソ型キシラナーゼが用いられる。エンド型のキシラナーゼは、一般に、キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオースのような重合度の連続したキシロオリゴ糖を生成させる性質を有するが、本実施形態のエキソ型キシラナーゼは、不連続な重合度を有し、かつ特定の構造を有するキシロオリゴ糖を生成させるという極めてユニークな性質を有している。このため、本実施形態のエキソ型キシラナーゼを用いて、特定の構造を有するキシラン誘導体を加水分解することにより、該キシラン誘導体の側鎖の構造に依存した特定の構造を有するキシロオリゴ糖を容易に得ることができる。
【００３１】
（２） 本実施形態のキシロオリゴ糖の製造方法では、グリコシル加水分解酵素のファミリー１０に属し、かつ１３以上のアミノ酸残基よりなるループ７を有する（β／α）８バレル構造を形成するという構造上の特徴を備えたエキソ型キシラナーゼが用いられる。また、本実施形態のキシロオリゴ糖の製造方法では、メチルグルクロノキシランを基質として反応させると、キシロビオース及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースを生成させる酵素活性を有するという機能上の特徴を有するエキソ型キシラナーゼが用いられる。なお、本実施形態のエキソ型キシラナーゼは、前記構造上の特徴及び機能上の特徴のうちの少なくとも一方の特徴を有していればよい。即ち、本実施形態では、前記構造上の特徴を有さずに機能上の特徴のみを有するもの、又は前記機能上の特徴を有さずに構造上の特徴のみを有しているものであっても構わない。このようなキシラナーゼを用いる場合、上記（１）と同様に、特定の構造を有するキシロオリゴ糖を容易に得ることができる。特に、本実施形態の製造方法のように、４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースのような特異な構造を有するキシロオリゴ糖を大量かつ安価に製造することが可能な技術は重要である。
【００３２】
（３） 本実施形態のキシロオリゴ糖の製造方法では、分解工程を経て生成した複数種類のキシロオリゴ糖を分離する分離工程を備えているため、特定の構造を有する有用なキシロオリゴ糖を容易に単離することができる。特に、分離工程で陰イオン交換クロマトグラフィーを用いる場合には、４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースのような特異な構造を有するキシロオリゴ糖を極めて容易に単離することができて便利である。
【００３３】
（４） 本実施形態のエキソ型キシラナーゼは、キシラン誘導体を複数のキシロオリゴ糖に分解する。例えば、アエロモナス・パンクタータＭＥ−１株由来のキシラナーゼＸは、白樺由来のキシランをキシロビオース及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースの二つのキシロオリゴ糖に分解する。この場合、本実施形態では、分解工程によって生成された前記複数のキシロオリゴ糖をイオン交換クロマトグラフィーで分離する分離工程をさらに実施することにより、キシロビオース及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースにそれぞれ区分することが可能である。これにより、キシロビオース及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースをそれぞれ高純度で大量に製造することが可能となる。ちなみに、本実施形態のキシロオリゴ糖の製造方法は、キシロビオースのみを製造する場合に適用することが可能であるうえ、４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースのみを製造する場合に適用することも可能である。
【実施例１】
【００３４】
＜ＸｙｎＸの粗酵素溶液の調製＞
非特許文献１の方法にて、配列番号１で表される塩基配列からなるｘｙｎＸ遺伝子がインサートされてなるプラスミドｐＸＯＬ１（３．７ｋｂｐ）を作製した後、大腸菌組換え体ＪＭ１０９／ｐＸＯＬ１を非特許文献１の方法で作製した。なお、ｐＸＯＬ１は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２６にて寄託されている。次に、該組換え体を非特許文献１の方法で前培養（１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地５ｍｌ、３７℃、１２時間、１２０ｒｐｍの振盪培養）及び本培養（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧ含有ＬＢ培地１００ｍｌ、３７℃、５時間、１２０ｒｐｍの振盪培養）した。続いて、本培養後の培養液を６０００×ｇで１０分間遠心することにより、組換え体を集菌した。集菌後の組換え体を水１００ｍｌで洗浄した後、フレンチプレス（大岳製作所）で超音波破砕することにより、ＸｙｎＸの粗酵素溶液を得た。
【００３５】
＜バーチウッドキシランの加水分解産物の検討１＞
ＸｙｎＸの粗酵素溶液によるキシランの加水分解産物を調べるために、０．５％バーチウッドキシラン（ＳＩＧＭＡ）及び０．０２％ナトリウムアザイド含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に、ＸｙｎＸの粗酵素溶液を等量加えて３７℃で１２時間又は２４時間反応させた。反応終了後、１００℃で５分間煮沸して酵素を失活させた後、未分解キシランなどの不要物を取り除くため、１２０００ｒｐｍで５分間遠心した。遠心後の上清を回収し、遠心エバポレーターで凍結乾燥させた。乾燥後の加水分解産物をメタノール４０μｌに溶解させた後、再度不要物を取り除くために１２０００ｒｐｍで５分間遠心した。遠心後の各上清を用いて薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を行った。
【００３６】
ＴＬＣの実施は、まず、ＴＬＣプレート（ＴＬＣ ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｓｈｅｅｔｓ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０Ｆ（ＭＥＲＣＫ））に上清１０μｌずつをスポットした後、クロロホルム：酢酸：水＝５：７：１の展開溶媒１にて展開させた。展開後のＴＬＣプレートを十分に乾燥させた後、硫酸：メタノール＝１：１の発色試薬１をＴＬＣプレートに噴霧し、ホットプレート上で加熱することにより、展開後の加水分解産物を可視化させた。結果を図３（ａ）に示す。
【００３７】
図３（ａ）のレーン１にはＸ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４を混合したスタンダードキシロオリゴ糖マーカーが展開され、レーン２には１２時間反応させたときの加水分解産物が展開され、レーン３には２４時間反応させたときの加水分解産物が展開されている。図３（ａ）より、ＸｙｎＸは、バーチウッドキシランからキシロビオース（以下、プロダクトＡと記載する）及びキシロテトラオース（以下、プロダクトＢと記載する）のみを特異的に生成させることが確認された。通常、エンド型のキシラナーゼは、キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオースのような重合度の連続したキシロオリゴ糖を生成させるため、ＸｙｎＸのキシラナーゼ活性は非常にユニークである。
【実施例２】
【００３８】
＜ＸｙｎＸ分離標品（精製標品）の調製＞
上記プラスミドｐＸＯＬ１にインサートされているｘｙｎＸ遺伝子をＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにて切り出した後、ｐＴＴＱ１８ベクターにサブクローニングすることにより、ｔａｃプロモーター及びｌａｃＩｑの制御下で発現するプラスミドｐＸＬＩＱ１（５．６ｋｂｐ）を構築した。なお、ｐＸＬＩＱ１は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２８にて寄託されている。プラスミドｐＸＬＩＱ１を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入して形質転換することにより、大腸菌組換え体ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＸＬＩＱ１を作製した（非特許文献３参照）。
【００３９】
次に、該組換え体を非特許文献３の方法にて前培養（１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地５ｍｌ、３７℃、１２時間、１２０ｒｐｍの振盪培養）及び本培養（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧ含有ＬＢ培地１００ｍｌ、３７℃、１２０ｒｐｍの振盪培養）した。続いて、非特許文献２に記載の浸透圧ショック法を用いて、本培養にて得られた組換え体のペリプラズムからＸｙｎＸタンパク質を含む粗酵素溶液を回収した。
【００４０】
得られた粗酵素溶液を非特許文献３の方法（Ｈｉ ＴｒａｐＱ陰イオン交換クロマトグラフィー→（HiPrep Sephacryl HRゲルろ過→ＰＯＲＯＳ ＨＱ陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー）により分離した。分離時のキシラナーゼ活性はジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法にて還元糖を生成させることにより測定し、タンパク質の存在はＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認した。分離条件を以下に示す。
【００４１】
［Ｈｉ Ｔｒａｐ Ｑ］
カラム ；Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ陰イオン交換カラム（Amersham Biosciences）
溶出液 ；緩衝液Ａ＝２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）
緩衝液Ｂ＝２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）／１Ｍ ＮａＣｌ
グラジエント；緩衝液Ｂ濃度 ０％→１００％（０分→３０分）
流速 ；５ｍｌ／分
検出波長 ；２８０ｎｍ
カラム温度 ；４℃
分画容量 ；５ｍｌ
［Ｈｉ Ｐｒｅｐ２６／６０］
カラム ；Ｈｉ Ｐｒｅｐ２６／６０ゲル濾過カラム（Amersham Biosciences）
溶出液 ；２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）
流速 ；１ｍｌ／分
検出波長 ；２８０ｎｍ
カラム温度 ；４℃
分画容量 ；５ｍｌ
［ＰＯＲＯＳ ＨＱ］
カラム ；ＰＯＲＯＳ ＨＱ陰イオン交換カラム（PerSeptive Biosystems）
溶出液 ；緩衝液ａ＝２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）
緩衝液ｂ＝２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）／１Ｍ ＮａＣｌ
グラジエント；緩衝液ｂ濃度 ０％ （ ０分→ ５分）
０％→ ３０％（ ５分→１５分）
３０％→１００％（１５分→２０分）
流速 ；４ｍｌ／分
検出波長 ；２８０ｎｍ
カラム温度 ；室温
分画容量 ；１ｍｌ
＜ＸｙｎＸ分離標品のキャラクタライゼーション＞
分離後の活性画分を２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）に対して透析した。透析後のＸｙｎＸ（以下、ＸｙｎＸ分離標品と記載する）は、分子量３８ｋＤａの単量体として存在し、５０℃の至適温度及び８．０の至適ｐＨを有し、かつ４０℃以下の温度で安定なタンパク質であった。また、基質特異性は、バーチウッドキシランに対するキシラナーゼ活性を１００％とすると、オートスペルトキシランに対して１９５％、カルボキシメチルセルロース及び可溶性デンプンに対してはいずれも０％のキシラナーゼ活性を有していた。
【００４２】
ＸｙｎＸ分離標品を用いて、プロテインシーケンサーによるアミノ酸配列の決定を行ったところ、配列番号２における２〜３３３番目のアミノ酸配列からなるタンパク質であることが確認された。また、ＸｙｎＸは、図１に示すように、既知構造のファミリー１０エンド型キシラナーゼとの相同性が高く、かつ活性部位のアミノ酸が高い割合で保存されていたことも判明した。
【００４３】
次に、得られたアミノ酸配列を利用してホモロジーモデリング法で立体構造予測を行ったところ、（β／α）８バレル構造を形成し得ることが示唆されるとともに、通常より長いアミノ酸残基よりなるループ７の存在が示唆された。続いて、Ｘ線結晶回析にて立体構造解析を行ったところ、図２に模式的に示す立体構造を形成していることが判明した。なお、図２に示す符号２０は、ＸｙｎＸを示す。このＸｙｎＸにおいて、濃く色付けした螺旋状リボン２１はαへリックス、薄く色付けした帯状リボン２２はβシート、ハッチングで示す帯状領域はループ７を表している。
【００４４】
次に、ＸｙｎＸの活性中心の求核触媒残基及び酸塩基触媒残基を決定するために、Ｅ１３３Ａ及びＥ２４０Ａ（配列番号２で表されるアミノ酸配列においては、１３４番目及び２４１番目のＥをそれぞれＡに置換したもの）の２種類のアミノ酸置換変異体についてアザイド試験を行った。その結果、Ｅ２４０が求核触媒残基、Ｅ１３３が酸塩基触媒残基であることが判明した（図２参照）。
【００４５】
＜バーチウッドキシランの加水分解産物の検討２＞
ＸｙｎＸ分離標品によるキシランの加水分解産物を詳細に調べた。まず、０．５％バーチウッドキシラン含有２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、ＸｙｎＸ分離標品を１０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１２時間反応させた。反応終了後、１００℃で５分間煮沸して酵素を失活させた後、未分解キシランなどの不要物を取り除くため、１２０００ｒｐｍで５分間遠心した。遠心後の上清を回収し、遠心エバポレーターで凍結乾燥させた。乾燥後の加水分解産物をメタノールに溶解させた後、再度不要物を取り除くために１２０００ｒｐｍで５分間遠心した。遠心後の上清を回収し、遠心エバポレーターで凍結乾燥させた。
【００４６】
次に、凍結乾燥後の加水分解産物の一部を用いて、糖の酸加水分解を行った。まず、加水分解産物５ｍｇに０．５Ｍ硫酸５００ｍｌを加え、１０５℃で２時間インキュベートし、水酸化ナトリウムで中和した後、凍結乾燥を行った。乾燥後の酸加水分解物をメタノールに溶解させた。
【００４７】
上記凍結乾燥後の加水分解産物の残りと、前記酸加水分解物とを用いて、ＴＬＣを行った。ＴＬＣの実施は、まず、４枚のＴＬＣプレートに加水分解産物及び酸加水分解物の各サンプル液１０μｌずつをそれぞれスポットした。２枚のＴＬＣプレートは上記展開溶媒１にて展開し、残り２枚のＴＬＣプレートは１−ブタノール：酢酸：水＝２：１：１の展開溶媒２にて展開した。展開後の各ＴＬＣプレートを十分に乾燥させた後、展開溶媒１で展開したＴＬＣプレートの１枚、及び展開溶媒２で展開したＴＬＣプレートの１枚に対してそれぞれ発色試薬１を噴霧し、ホットプレート上で加熱した。また、残りのＴＬＣプレートに対して、ジフェニルアミン−アニリン試薬（ジフェニルアミン１ｇ、アニリン１ｍｌ、アセトン５０ｍｌ及び８０％リン酸）からなる発色試薬２を噴霧し、ホットプレート上で加熱した。結果を図４及び図５に示す。
【００４８】
図４（ａ）、（ｂ）は、いずれもクロロホルム系の展開溶媒１で展開されたＴＬＣプレートであって、図４（ａ）は硫酸／メタノールの発色試薬１で可視化させたものであり、図４（ｂ）はジフェニルアミン−アニリン試薬からなる発色試薬２で可視化させたものである。図４（ａ）、（ｂ）のレーン１には、スタンダードキシロオリゴ糖マーカーが展開され、レーン２には加水分解産物が展開され、レーン３には酸加水分解物が展開され、レーン４〜７にはグルクロン酸、グルコース、フルクトース及びアラビノースがそれぞれ展開されている。図５（ａ）、（ｂ）は、いずれもブタノール系の展開溶媒２で展開されたＴＬＣプレートであって、図５（ａ）は発色試薬１で可視化させたものであり、図５（ｂ）は発色試薬２で可視化させたものである。図５（ａ）、（ｂ）の各レーン１に展開されているサンプルは、図４の場合と同じである。
【００４９】
その結果、図４（ａ）のレーン２においてＸ４とほぼ同じ位置に検出されたスポット（プロダクトＢ）は、図５（ａ）のレーン２ではマーカーのＸ４と異なる位置に検出された。さらに、図４（ａ）及び図５（ａ）のレーン３には、いずれもＸ１以外にＸ２の位置にもスポットが検出された。バーチウッドキシランからＸ２及びＸ４のみを特異的に生成させる場合、それらの加水分解産物を酸加水分解すれば、Ｘ１しか検出されないはずである。よって、ＸｙｎＸによりバーチウッドキシランを加水分解したときの加水分解産物、即ちプロダクトＡ及びＢは、Ｘ２及びＸ４ではないことが示唆された。
【００５０】
一方、ＴＬＣプレートをジフェニルアミン−アニリン試薬からなる発色試薬２で可視化させる場合、アルドヘキソースを青紫色、ペントースを褐紫色、ケトヘキソースを黄赤色、ウロン酸を紫褐色に発色させることが知られている。図４（ｂ）及び図５（ｂ）のレーン２に示すＸ２のスポット（プロダクトＡ）及びＸ４付近のスポット（プロダクトＢ）は、いずれも異なる色に発色されており、プロダクトＡはキシロースの褐紫色に似ており、プロダクトＢはグルクロン酸の紫褐色に似ていた。また、図４（ｂ）及び図５（ｂ）のレーン３（酸加水分解物）に示すＸ１のスポット及びＸ２付近のスポットは、いずれも異なる色に発色されており、Ｘ１のスポットはキシロースの褐紫色に似ており、Ｘ２付近のスポットはグルクロン酸の紫褐色に似ていた。よって、図４（ｂ）及び図５（ｂ）のレーン３に示すＸ２付近のスポットは、不完全酸加水分解物ではなく、ウロン酸物質であることが示唆された。従って、ＸｙｎＸによりバーチウッドキシランを加水分解すると、Ｘ２からなるプロダクトＡと、ウロン酸を含む物質からなるプロダクトＢとを特異的に生成させることが強く示唆される。
【００５１】
バーチウッドキシランは、β１，４結合したキシロース主鎖（Ｘｎ）と、該主鎖を構成するキシロース残基に対してα１，２結合した４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸からなる側鎖とを備えたキシラン誘導体を高い割合で含有していることが知られている。さらに、前記側鎖は、主鎖を構成するキシロース残基１０個に対して１個程度の割合でランダムに分布しているものと考えられている。このようなキシラン誘導体をＸｙｎＸが加水分解する場合を仮定すると、図４及び図５の各レーン２のＸ４付近に検出されたスポット（プロダクトＢ）は、Ｘｎに４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸残基を結合させた構造を有していると推定される。
【実施例３】
【００５２】
＜プロダクトＡ，Ｂの単離＞
実施例１で調製したＸｙｎＸの粗酵素溶液１００ｍｌに、１．０％バーチウッドキシラン溶液１００ｍｌを加え、３７℃で１２時間反応させた後、プロダクトＡ，Ｂを含む加水分解産物をメタノール抽出した。次に、加水分解産物を含むメタノール抽出液に陰イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ（Ｃｌ−）（ムロマチテクノス）を加えて一晩攪拌した後、１．５ｃｍ×１５ｃｍのエコノカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に充填し、３００ｍｌの水でカラム内を洗浄することにより、非吸着画分を溶出させた。次に、該カラム内に０．５Ｍ塩化ナトリウム１００ｍｌを流すことにより、吸着画分を溶出させた。非吸着画分はエバポレートした後に次の試験に供した。吸着画分は、エバポレートした後にゲル濾過樹脂Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を充填したエコノカラム内で脱塩処理し、溶媒を水に置換した後に次の試験に供した。
【００５３】
最終的に、非吸着画分２５ｍｇと、吸着画分１２ｍｇとが得られた。また、陰イオン交換樹脂に供される前の加水分解産物、非吸着画分及び吸着画分をＴＬＣプレートにスポットし、上記実施例１と同じ条件でＴＬＣを行った。結果を図３（ｂ）に示す。図３（ｂ）のレーン１にはスタンダードキシロオリゴ糖マーカーが展開され、レーン２には加水分解産物が展開され、レーン３には非吸着画分が展開され、レーン４には吸着画分が展開されている。同図に示すように、陰イオン交換樹脂を用いた分離方法により、プロダクトＡ，Ｂを単離することができた。
【実施例４】
【００５４】
＜プロダクトＡ，Ｂの同定＞
非吸着画分（プロダクトＡ）及び吸着画分（プロダクトＢ）について、それぞれ１Ｈ−ＮＭＲを測定した。その結果、プロダクトＡはＸ２であると同定された。一方、プロダクトＢは、複雑な化合物であるうえ、測定時に多くのノイズが検出されたために同定に至るような解析を行うことができなかった。
【００５５】
次に、プロダクトＢについて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる質量分析を行った。その結果、プロダクトＢの分子量は約６２７であることが判明した。この分子量は、Ｘ３に４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸及びナトリウム塩を加えた分子量と一致した。よって、プロダクトＢは、４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロニルキシロトリオース（アルドヘキサオウロン酸）であることが判明した。
【００５６】
次に、４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸残基がＸ３のどの位置に結合しているかを調べるために、プロダクトＢについてメチル化分析を行った。メチル化分析では、まず、プロダクトＢをメチル化した後、酸加水分解し、続いてアセチル化した後、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）に供した。その結果、４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸残基の結合位置において検出予測されるアルジトールアセテートとＧＣとの結果は、非還元末端側の位置に４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸残基が結合している場合のパターンと一致した。
【００５７】
これを確認するために、プロダクトＢを還元化した後、メチル化、酸加水分解及びアセチル化を行った後にＧＣに供したところ、検出されたアルジトールアセテートは、４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロニルキシロトリオースを還元した場合に推測されるアルジトールアセテートと一致した。さらに、プロダクトＢを還元化した後、メチル化、酸加水分解及びアセチル化を行った後にＧＣ−ＭＳ分析にて解析したところ、４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロニルキシロトリオースを還元した場合に推測されるアルジトールアセテートと一致した。従って、プロダクトＢは、Ｘ３の非還元末端側のキシロピラノースの２位に４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸残基が結合した構造、即ち上記化２に示す構造を有していると結論づけられた。そして、本実施例のキシロオリゴ糖の製造方法によれば、キシロビオース及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースを高純度で大量に製造可能であることが示された。
【実施例５】
【００５８】
＜オートスペルトキシランの加水分解＞
実施例２で調製したＸｙｎＸ分離標品を１０μｇ／ｍｌの濃度で含有する２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、基質としての０．５％オートスペルトキシラン溶液５００μｌを加え、３７℃で６時間又は１２時間反応させることにより加水分解産物を得た。また、得られた各加水分解産物を上記実施例２と同様に酸加水分解することにより、酸加水分解物を得た。これらの加水分解産物及び酸加水分解物について、上記実施例２と同じ条件でＴＬＣを行った。
【００５９】
その結果、６時間及び１２時間反応させたときの加水分解産物では、互いにほぼ同じ位置、大きさ及び濃さのスポットが確認された。ちなみに、確認されたスポットには、Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４，Ｘ５付近に位置するものが含まれていた。即ち、これらオートスペルトキシラン（アラビノグルクロノキシラン）を基質として生成されたスポットのパターンは、上記各実施例のバーチウッドキシランを基質とした場合のパターンとは異なっていた。従って、ＸｙｎＸは、キシラン誘導体の側鎖の構造に応じて、異なるキシロオリゴ糖を生成させるものであることが確認された。
【実施例６】
【００６０】
＜ループ７のキシラナーゼ活性への影響＞
配列番号１で表される塩基配列の９１９〜９７５番目のヌクレオチドを取り除いたｘｙｎＸのループ７欠失遺伝子（ｍＬ７）を作製した。次に、ｍＬ７をｐＴ７ベクターにＴＡクローニングした後、ｐＴＴＱ１８ベクターにサブクローニングすることにより、ｔａｃプロモーター及びｌａｃＩｑの制御下で発現するプラスミドｐＸＬＩＱ１（ｍＬ７）（５．６ｋｂｐ）を構築した。プラスミドｐＸＬＩＱ１（ｍＬ７）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入して形質転換することにより、大腸菌組換え体ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＸＬＩＱ１（ｍＬ７）を作製した後、実施例１と同様に前培養及び本培養した。続いて、本培養後の培養液を実施例１と同様に超音波破砕することにより、ＸｙｎＸのループ７欠失タンパク質（ＸｙｎＸ ｍＬ７）を含む粗酵素溶液を得た。
【００６１】
得られた粗酵素溶液を、反応温度を４０℃、反応時間を２時間とした以外は、実施例１と同様にバーチウッドキシランと反応させた後、ＴＬＣにて分析した。なお、実施例１で得られた野生型のＸｙｎＸの粗酵素溶液についても同様に反応させた後、ＴＬＣにて分析した。その結果、野生型のＸｙｎＸでは、ＴＬＣプレート上でＸ２（プロダクトＡ）及び４−Ｏ−メチルグルクロニルキシロトリオース（プロダクトＢ）が明確に検出されたのに対し、ＸｙｎＸ ｍＬ７では、ＴＬＣプレート上でキシロオリゴ糖が全く検出されなかった。
【００６２】
よって、ＸｙｎＸによるユニークなキシラナーゼ活性（バーチウッドキシランからプロダクトＡ，Ｂを生成させる活性）の発現には、１３以上のアミノ酸残基よりなるループ７の存在が重要であることが予想され得る。さらに、立体構造より推測すると、ＸｙｎＸに見られる通常より長いループ７は、キシラン誘導体の主鎖の末端を覆い被せるように保持することで、該キシラン誘導体をオリゴ糖単位で端から順番に切り出すエキソ型の酵素活性に直接的に寄与していることが示唆され得る。従って、グリコシル加水分解酵素のファミリー１０に属し、かつ１３以上のアミノ酸残基よりなるループ７を有する（β／α）８バレル構造を形成しているエキソ型キシラナーゼを用いて、キシランを主鎖とする多糖を分解することにより、特定の構造を有するキシロオリゴ糖の製造が可能であることが強く示唆され得る。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】複数のキシラナーゼのアミノ酸配列を比較した図。
【図２】キシラナーゼＸの立体構造を模式的に示す図。
【図３】（ａ）は実施例１においてバーチウッドキシランをＸｙｎＸで加水分解した加水分解産物を展開したＴＬＣプレートを示し、（ｂ）は実施例３において加水分解産物をイオン交換樹脂で分離した後に展開したＴＬＣプレートを示す。
【図４】実施例２において、加水分解産物をクロロホルム系の展開溶媒で展開したＴＬＣプレートであって、（ａ）は硫酸／メタノールで可視化させたものであり、（ｂ）はジフェニルアミン−アニリン試薬で可視化させたものである。
【図５】実施例２において、加水分解産物をブタノール系の展開溶媒で展開したＴＬＣプレートであって、（ａ）は硫酸／メタノールで可視化させたものであり、（ｂ）はジフェニルアミン−アニリン試薬で可視化させたものである。
【符号の説明】
【００６４】
２０…キシラナーゼＸ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシロオリゴ糖を製造する方法であって、
該方法は、キシラン誘導体をエキソ型キシラナーゼで分解する分解工程を備え、
前記キシラン誘導体は、β１，４−キシランよりなる主鎖に側鎖が結合してなる構造を有することを特徴とするキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項２】
前記エキソ型キシラナーゼは、グリコシル加水分解酵素のファミリー１０に属し、かつＮ末端から７番目のβシート−αへリックス間に１３以上のアミノ酸残基よりなるループ構造を有する（β／α）８バレル構造を形成していることを特徴とする請求項１に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項３】
前記エキソ型キシラナーゼは、メチルグルクロノキシランを基質として反応させると、キシロビオース及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースを生成させる酵素活性を有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項４】
前記エキソ型キシラナーゼは、アエロモナス・パンクタータＭＥ−１株（特許微生物寄託センター受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２７）由来のキシラナーゼＸであることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項５】
前記キシラン誘導体は、メチルグルクロノキシランである請求項１から請求項４のいずれか一項に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項６】
前記キシラン誘導体は、４−Ｏ−メチルグルクロン酸を前記側鎖として備える請求項１から請求項５のいずれか一項に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項７】
当該製造方法はさらに、前記分解工程を経て生成した前記キシロオリゴ糖を分離する工程を備えることを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか一項に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項１】
キシロオリゴ糖を製造する方法であって、
該方法は、キシラン誘導体をエキソ型キシラナーゼで分解する分解工程を備え、
前記キシラン誘導体は、β１，４−キシランよりなる主鎖に側鎖が結合してなる構造を有することを特徴とするキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項２】
前記エキソ型キシラナーゼは、グリコシル加水分解酵素のファミリー１０に属し、かつＮ末端から７番目のβシート−αへリックス間に１３以上のアミノ酸残基よりなるループ構造を有する（β／α）８バレル構造を形成していることを特徴とする請求項１に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項３】
前記エキソ型キシラナーゼは、メチルグルクロノキシランを基質として反応させると、キシロビオース及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸−α１，２−キシロトリオースを生成させる酵素活性を有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項４】
前記エキソ型キシラナーゼは、アエロモナス・パンクタータＭＥ−１株（特許微生物寄託センター受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２７）由来のキシラナーゼＸであることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項５】
前記キシラン誘導体は、メチルグルクロノキシランである請求項１から請求項４のいずれか一項に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項６】
前記キシラン誘導体は、４−Ｏ−メチルグルクロン酸を前記側鎖として備える請求項１から請求項５のいずれか一項に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項７】
当該製造方法はさらに、前記分解工程を経て生成した前記キシロオリゴ糖を分離する工程を備えることを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか一項に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【図１】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００７−４９９１４（Ｐ２００７−４９９１４Ａ）
【公開日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２３６１５７（Ｐ２００５−２３６１５７）
【出願日】平成１７年８月１６日（２００５．８．１６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１７年２月１７日から２月１８日 国立大学法人岐阜大学主催の「平成１６年度 修士論文発表会」において文書をもって発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年３月５日 社団法人日本農芸化学会発行の「日本農芸化学会 ２００５年度（平成１７年度）大会講演要旨集」に発表
【出願人】（３０４０１９３９９）国立大学法人岐阜大学 (289)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１６日（２００５．８．１６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１７年２月１７日から２月１８日 国立大学法人岐阜大学主催の「平成１６年度 修士論文発表会」において文書をもって発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年３月５日 社団法人日本農芸化学会発行の「日本農芸化学会 ２００５年度（平成１７年度）大会講演要旨集」に発表
【出願人】（３０４０１９３９９）国立大学法人岐阜大学 (289)
【Ｆターム（参考）】
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