サテライトＲＮＡ、同ＲＮＡを有するキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルス、同弱毒ウイルスを接種したキュウリモザイクウイルス抵抗性植物及びキュウリモザイクウイルスの防除法
【課題】家庭園芸で多く栽培され、又、公園においても多く植栽されているインパチェンスから、アブラムシによって後発的に伝搬されるＣＭＶ（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）による病害を、インパチェンス品種に接種した際に副作用を全く示さず、又、接種することによって、これらインパチェンス品種から強毒ＣＭＶの感染を無症状で防除する弱毒ＣＭＶを提供する。
【解決手段】特定の塩基配列からなるサテライトＲＮＡ、該ＲＮＡを有するＣＭＶ弱毒ウイルス、該ＲＮＡを有するＣＭＶ弱毒ウイルスを予め植物苗に接種して得られるＣＭＶ抵抗性植物、該ＲＮＡを有するＣＭＶ弱毒ウイルスを予めインパチェンスに接種して得られるＣＭＶ抵抗性インパチェンス、該ＲＮＡを有するＣＭＶ弱毒ウイルスを予めインパチェンス苗に接種することによるインパチェンスのＣＭＶの防除法。
【解決手段】特定の塩基配列からなるサテライトＲＮＡ、該ＲＮＡを有するＣＭＶ弱毒ウイルス、該ＲＮＡを有するＣＭＶ弱毒ウイルスを予め植物苗に接種して得られるＣＭＶ抵抗性植物、該ＲＮＡを有するＣＭＶ弱毒ウイルスを予めインパチェンスに接種して得られるＣＭＶ抵抗性インパチェンス、該ＲＮＡを有するＣＭＶ弱毒ウイルスを予めインパチェンス苗に接種することによるインパチェンスのＣＭＶの防除法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インパチェンスに病害をもたらすキュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、以下ＣＭＶともいう）に対して優れた防除効果を有するＣＭＶ弱毒ウイルス、当該ＣＭＶ弱毒ウイルスを得るためのサテライトＲＮＡ、該ＣＭＶ弱毒ウイルスを予めインパチェンス苗に接種したＣＭＶ抵抗性インパチェンス、及び該ＣＭＶ弱毒ウイルスを予めインパチェンス苗に接種することによるＣＭＶの防除法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）は、ブロモウイルス（Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）科ククモウイルス（Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ）属の代表的な種であり、温帯地方や熱帯地方における多くの農作物を宿主とする。このウイルスは、ウイルスなかで最も多くの宿主を持つと考えられ、キュウリ、カボチャ、メロン、トマト、ピーマン、トウガラシ、タバコ、ゴボウ、レタス、ダイコン、ハクサイ、ニンジン及びセロリ等のウリ科、ナス科、キク科、アブラナ科、マメ科及びセリ科等の８５科３６５属７７５種もの植物に感染することが報告されている。そして、これらの植物体の矮化や早生と共に、葉にモザイクや奇形を示して、輪点や壊疽症状若しくは葉脈上に葉状突起（ｅｎａｔｉｏｎ）を生ずることもある。又、花にも花弁に斑入りをつくって花の奇形を生じたり、果実もその表面が凹凸になり、モザイク症状若しくは黄色斑点をつくったりして、果実収量を低下させる。
【０００３】
このようなＣＭＶの病害を防除する方法として、弱毒ウイルスによる干渉作用（ｃｒｏｓｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を利用したものがある。これは、ウイルスに感染している植物は、既に感染しているウイルスと同じであるか、極めて近縁のウイルスには感染し難い現象を利用したものであり、植物に予め病原性ウイルスと同系統で病徴がないか、極めて軽微なウイルスを接種し感染させて、病原性ウイルスによる感染を防除するものである。
【０００４】
又ＣＭＶには、４種類のＲＮＡ（ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３及びＲＮＡ４）の他に、ＣＭＶのウイルス症状を緩和するサテライトＲＮＡを有するものがあり、本発明者らは、トマト、ピーマン、唐辛子及びタバコのＣＭＶによる病害を防除するため、このようなサテライトＲＮＡを有する弱毒ＣＭＶをこれまで開発してきた（特許文献１、２、３、４、５及び６参照）。
【特許文献１】特許第２９７５７３９号公報
【特許文献２】特許第３７２８３８１号公報
【特許文献３】特開２００６−３２０３０９号公報
【特許文献４】韓国特許第７４７６４９号
【特許文献５】特開２００７−８２４１６号公報
【特許文献６】特願２００８−８２３４５号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このように特許文献１に係る弱毒ＣＭＶのＫＯ１、ＫＯ２、ＫＯ３、ＫＯ４及びＫＯ５はトマトに、特許文献２に係る弱毒ＣＭＶのＮＤＭ３はピーマンに、特許文献３に係る弱毒ＣＭＶのＮＤＭ０５−１やＮＤＭ０５−２や特許文献６に係る弱毒ＣＭＶのＮＤＭ０８−１は唐辛子に、そして特許文献５に係る弱毒ＣＭＶのＮＤＭ０５−３はタバコにそれぞれ接種することで、ＣＭＶによるナス科植物の病害を防除することができる。しかし現在、家庭園芸で多く栽培され、公園にも植栽されているインパチェンス（アフリカホウセンカ、Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ ｗａｌｌｅｒａｎａ Ｈｏｏｋ．ｆ．）は、アブラムシによってＣＭＶを伝搬されて、矮化やモザイク症状等の多大なる被害を受けており、家庭園芸や公園の農薬による土壌汚染や残留農薬の心配をすることなく、インパチェンスからＣＭＶの病害を防除する方法が長い間希求されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために、日本各地から採取したウイルス症状の微弱なトマトからＣＭＶ弱毒ウイルスを分離し選抜して、検討を重ねた結果、特定塩基配列からなるサテライトＲＮＡを有する弱毒ＣＭＶが、多くのインパチェンスの品種に接種した際にウイルス症状を全く示さず、外界強毒ＣＭＶに高い防除能を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
よって、本発明は（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるサテライトＲＮＡ、（２）配列番号１に記載のサテライトＲＮＡを有するＣＭＶ弱毒ウイルス、（３）配列番号１に記載のサテライトＲＮＡを有するＣＭＶ弱毒ウイルスを、予め植物苗に接種して得られるＣＭＶ抵抗性植物、（４）配列番号１に記載のサテライトＲＮＡを有するＣＭＶ弱毒ウイルスを、予めインパチェンス苗に接種して得られるＣＭＶ抵抗性インパチェンス、（５）配列番号１に記載のサテライトＲＮＡを有するＣＭＶ弱毒ウイルスを、予め植物苗に接種することによる植物のＣＭＶの防除法、（６）配列番号１に記載のサテライトＲＮＡを有するＣＭＶ弱毒ウイルスを、予めインパチェンス苗に接種することによるインパチェンスのＣＭＶの防除法である。尚、ここで本発明のサテライトＲＮＡは、本発明のＣＭＶ弱毒ウイルスＮＤＭ０８−２から直接採取したものでも、採取したＲＮＡを鋳型としてクローニングしたものでも、又、ＲＮＡ自動合成装置で化学合成したものでも良い。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のＣＭＶ弱毒ウイルスによって、強毒ＣＭＶの病害から多くのインパチェンス品種を防除することができ、強毒ＣＭＶが感染しないインパチェンス苗を大量に生産し販売することができる。更には農薬による土壌汚染や残留農薬を心配することなく、ウイルス症状のない健全なインパチェンスを家庭園芸や公園で安全に栽培することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【実施例】
【００１０】
（１）弱毒ＣＭＶの採取と作出
日本各地で栽培されていたトマトから、ウイルス症状が軽微に発現した約５００枚の葉を採集して、これらの葉に１０倍量のリン酸緩衝液（中性付近の０．１Ｍリン酸緩衝液）を加えて磨砕し、その液をトマト苗（日本デルモンテ（株）製ＴＭＫ６０２８）に接種した。一週間後、各々のエライザー検定を行った結果、１５０系統についてＣＭＶの感染を確認した。これらの中から弱毒ウイルスを選抜すべく、１５０系統のトマトの感染葉をそれぞれトマト苗（ＴＭＫ６０２８）１０株ずつに接種して、一週間後、リボ核酸（ＲＮＡ）分析を行った。その結果、サテライトＲＮＡを有するＣＭＶが５３系統から検出された。そして、これら５３系統について当該トマト苗におけるウイルス症状調査を行なって、ネクロシスやモザイクが発病した系統や感染力を有しない系統を取り除いて、ウイルス症状が軽微でウイルス増殖量の多い弱毒ウイルスを選抜した。この選抜した弱毒ウイルスは遺伝的に均一ではなく、ウイルス症状が異なっていたので、該トマト苗５５株にこれら弱毒ウイルスを接種し、弱いウイルス症状が揃っている株だけを選抜した。更にサテライトＲＮＡの存在が継続されている株だけを採集して、ウイルス接種液の調製を行い、再度該トマト苗に接種し、同じ選抜操作をしてウイルス接種液の調製する作業を５回繰り返し、該トマトで継代接種を行なった。その結果、サテライトＲＮＡを安定して含むＣＭＶ弱毒ウイルス（ＮＤＭ０８−２）を作出した。
【００１１】
（２）サテライトＲＮＡの単離
ＮＤＭ０８−２をトマト苗（ＴＭＫ６０２８）の子葉に接種して感染させて、１〜４週間程度ウイルスを増殖させた後、トマト子葉を採取して−８０℃の冷凍庫で凍結した。次いで、この感染葉を粉砕して、２倍量の
０．１％チオグリコール酸を含む ０．５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）と同量のクロロホルムを加え、ワーリングブレンダー（ワーリング社製）で破砕した。この破砕液を９５００×ｇ、１０分間遠心して、上層（水層）の１０％に当たる重量のポリエチレングリコールを加えて溶解させた後、４０分間静置した。次いで、この溶液を９５００×ｇで２０分間遠心分離して、得られた沈殿に２％トライトンＸ−１００を含む０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて懸濁し均一化した。この粗精製品を１２０００×ｇで遠心分離した上清を２４００００×ｇで４５分間遠心分離して、沈殿を回収した後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この溶液に最終濃度で１％になるように１０％ＳＤＳを加えて、更にこの溶液と等量のフェノールを加えた後、１２０００×ｇで１５分間遠心分離した。この上層（水層）を回収して、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返し、ＲＮＡを単離精製した。その結果、感染葉１００ｇより、約２０ｍｇのＲＮＡを得た。次いで得られたＲＮＡを水に溶解して、１０〜４０％ショ糖密度勾配により超遠心分離(１７５０００×ｇで１６時間)し、得られたサテライトＲＮＡのバンドを採取して、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返し、サテライトＲＮＡを単離精製した。精製が不十分な場合は、６Ｍ尿素を含む９％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行なって、臭化エチジウムの溶液で染色し、サテライトＲＮＡのバンドの部分をカミソリで切り取って、透析チューブに入れ、ＥＤＴＡを含むトリス−酢酸緩衝液中で電気泳動による溶出を行った後、サテライトＲＮＡを回収して、常法に従いエタノール沈殿を繰り返し、サテライトＲＮＡを単離精製した。この電気泳動によるサテライトＲＮＡの溶出の詳細はＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２））に従って行なった。
【００１２】
（３）サテライトＲＮＡのクローニングとシークエンス
単離精製したサテライトＲＮＡからマイナス鎖（以下−鎖と表記する）ｃＤＮＡを合成するために、サテライトＲＮＡ（約３μｇ）と３’末端塩基配列に相補的なＤＮＡプライマー（８塩基、１μＭ）を９５℃で熱処理した後、徐冷してアニーリングした。この−鎖ｃＤＮＡ合成反応はＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（（株）キアゲン製）を用いて、３７℃、６０分の条件で行なった。次いで、得られたｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させた。即ち、プラス鎖サテライトＲＮＡの５’末端に相同的なＤＮＡプライマーと３’末端塩基配列に相補的なＤＮＡプライマーを用いて、９４℃１分間、３７℃１分間、７２℃２分間の反応を４５回繰り返すことによってＰＣＲ反応を行なった（ＰＣＲ反応液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、２００μＭ ｄＮＴＰ、２．５ｕｎｉｔｓ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ（株）製））。このｃＤＮＡを１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離させた後、ゲルより切り出して、ＤＮＡ回収キットＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）を用いて精製した。得られたｃＤＮＡをＴ−Ａクローニング用ベクターｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（プロメガ（株）製）にクローニングして、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断することによって、ＮＤＭ０８−２のサテライトＲＮＡ由来のｃＤＮＡを確認した。
【００１３】
このサテライトＲＮＡの塩基配列をＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）とＤＮＡシーケンサＤＳＱ−１０００Ｌ（（株）島津製作所製）を用いて決定した。本発明のＣＭＶ弱毒ウイルスであるＮＤＭ０８−２のサテライトＲＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。
【００１４】
尚、本発明のＮＤＭ０８−２は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにおいて受託が拒否されている（寄託受託証不交付通知書における識別のための表示：ＮＤＭ０８−２）。よって、ＮＤＭ０８−２は出願人自らが保管し、特許法施行規則第２７条の３の規定に準じて、譲渡を行う用意がある（保管場所：〒３７８−００１６、群馬県沼田市清水町３７８４番地、日本デルモンテ株式会社、研究開発本部、植物ワクチン開発部）。
【００１５】
（４）弱毒ＣＭＶの選抜
ガラス温室において、挿木増殖したサンパチェンス マジェンダ グランデ、サンパチェンス オレンジ、サンパチェンス 斑入りサーモン、サンパチェンス ホワイト及びサンパチェンス ラベンダー（以上、（株）サカタのタネ製）の苗５品種とインパチェンス品種のエクストリーム・ピンク（タキイ種苗（株）製）の苗に、弱毒ＣＭＶであるＫＯ１、ＫＯ２、ＫＯ３、ＫＯ４及びＫＯ５（特許第２９７５７３９号参照）とＮＤＭ−３（特許第３７２８３８１号参照）、ＮＤＭ０５−１及びＮＤＭ０５−２（特開２００６−３２０３０９号公報参照）、ＮＤＭ０５−３（特開２００７−８２４１６号公報参照）、ＮＤＭ０８−１（特願２００８−８２３４５号）を接種した際の副作用と、これら弱毒ＣＭＶを一次接種後に外界強毒ＣＭＶのＣＭ８５−３を二次接種した際の当該弱毒ＣＭＶの防除効果を予備試験した。その結果、ＫＯ３とＮＤＭ−３が当該サンパチェンス５品種とインパチェンス品種に有効な弱毒ＣＭＶであることが判明した（試験結果は記載せず）。そして、これら２種類の弱毒ＣＭＶと本発明のＮＤＭ０８−２との該サンパチェンス５品種とインパチェンス品種における副作用と、強毒ＣＭＶに対する防除効果を詳細に試験調査した。
【００１６】
尚、上記の予備試験で使用した弱毒ＣＭＶのＫＯ１、ＫＯ２、ＫＯ３、ＫＯ４、ＫＯ５、ＮＤＭ−３、ＮＤＭ０５−１、ＮＤＭ０５−２、ＮＤＭ０５−３及びＮＤＭ０８−１の塩基配列を、それぞれ配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１に示す。
【００１７】
（５）弱毒ＣＭＶ ＮＤＭ０８−２の選抜
上記サンパチェンス苗５品種のうち、サンパチェンス マジェンダ グランデとサンパチェンス オレンジ及びエクストリーム・ピンクの脇芽をセルトレイにそれぞれ挿木して、この挿木の１週間後にこれら挿木苗を１６穴セルトレイ（６０×６０×６０ｍｍ）に植え替えた。そして、この植え替１週間後、該サンパチェンス２品種とインパチェンス品種の挿木苗５株ずつに、弱毒ＣＭＶのＮＤＭ０８−２、ＫＯ３及びＮＤＭ−３をウイルス粒子濃度５０μｇ／ｍｌでそれぞれ１次接種し、温室で２ヶ月間程育苗した（挿木１世代）。次いで当該挿木１世代からウイルス症状が微弱な脇芽をそれぞれ選抜して挿木し、温室で２ヶ月間程育苗して（挿木２世代）、更に挿木２世代からウイルス症状が微弱な脇芽をそれぞれ選抜して挿木し、温室で２ヶ月間程育苗した（挿木３世代）。
【００１８】
そして、これら挿木１世代、２世代及び３世代のウイルス症状を観察し、当該弱毒ウイルスによる副作用を調査した。尚、ここでの調査方法は、挿木したサンパチェンス苗とインパチェンス苗のウイルス症状を詳細に観察して、下記のウイルス症状指数として点数化し、品種毎の平均値をウイルス症状度として表わしたものである。その結果を表１、２、３、４及び５に示す。
【００１９】
（ウイルス症状指数）
このウイルス症状指数は、サンパチェンス苗とインパチェンス苗のウイルス症状において「無症状」を０、「症状あり・退色」を１、「葉の先細い・葉の湾曲」を２、「黄化・糸葉・一部モザイク」を３、「モザイク・弱い壊疽」を４、「壊疽」を５として点数化した。
（ウイルス症状度）
ウイルス症状度は、品種毎に調査した挿木苗のウイルス症状指数の合計値を、当該調査した挿木苗の全株数で除した値（ウイルス症状度＝Σ（ウイルス症状指数×株数）／全株数）で表した。
【００２０】
【００２１】
【００２２】
【００２３】
表１から表３の結果より、弱毒ＣＭＶのＫＯ３を接種して、ウイルス症状が微弱な脇芽を選抜して挿木することを３世代行ったサンパチェンス苗２品種において、１〜３世代の全ての世代に軽微なウイルス症状が発現し（サンパチェンス ホワイト（図１））、インパチェンス品種においては、２世代まで軽微なウイルス症状が発現した。
【００２４】
又、ＮＤＭ−３を接種して、同様に脇芽を３世代挿木継代したサンパチェンス苗２品種においても、１〜３世代の全ての世代に軽微なウイルス症状が発現し、インパチェンス品種においては、２世代まで軽微なウイルス症状が発現した。
【００２５】
しかし、ＮＤＭ０８−２を接種して、同様に脇芽を３世代挿木継代したサンパチェンス苗５品種においては、挿木継代３世代目の苗に、ウイルス症状が全く発現せず（サンパチェンス オレンジ（図２））、インパチェンス品種においては、挿木継代２世代目の苗から、ウイルス症状が発現しないことが判明した。
【００２６】
（６）弱毒ＣＭＶ ＮＤＭ０８−２の強毒ＣＭＶに対する防除
上記サンパチェンス苗５品種の脇芽をセルトレイにそれぞれ挿木して、この挿木の１週間後にこれら挿木苗を１６穴セルトレイ（６０×６０×６０ｍｍ）に植え替えた。そしてこの植え替１週間後、当該サンパチェンス５品種の挿木苗５株に、弱毒ＣＭＶのＮＤＭ０８−２、ＫＯ３及びＮＤＭ−３を、ウイルス粒子濃度５０μｇ／ｍｌでそれぞれ１次接種し、次いで、該サンパチェンス苗５品種に、この１次接種から２週間後に、ウイルス粒子濃度４００μｇ／ｍｌで、外界強毒ＣＭＶのＣＭ８５−３を二次接種して、約２ヶ月間温室内で育苗した。そして、サンパチェンス苗５品種のウイルス症状を観察して、当該弱毒ＣＭＶの防除効果を上記（５）副作用の調査方法と同様に、サンパチェンス苗５品種のウイルス症状度の調査をした。その結果を表４に示す。
【００２７】
【００２８】
表４の結果より、ＫＯ３を一次接種後に強毒ＣＭＶのＣＭ８５−３を二次接種した際には、サンパチェンス 斑入りサーモンに一部モザイク症状が、ホワイトとラベンダーにも軽微なウイルス症状が現れた。
【００２９】
又、ＮＤＭ−３を一次接種後にＣＭ８５−３を二次接種した際には、サンパチェンス マジェンダ グランデには壊疽症状が、オレンジには軽微なウイルス症状（図３）が、斑入りサーモンにはモザイクや壊疽症状が、ホワイトとラベンダーには軽微なウイルス症状が現れた。
【００３０】
しかし、ＮＤＭ０８−２を一次接種した後にＣＭ８５−３を二次接種した際には、サンパチェンス５品種にはウイルス症状が全く現れなかった（サンパチェンス オレンジ（図４））。又、比較のため、サンパチェンス オレンジの健全株を図５に、一次接種は無接種で二次接種に強毒ＣＭ８５−３を接種して育苗した株を図６にそれぞれ示す。
【００３１】
以上、表１から表４の結果から、本発明のＮＤＭ０８−２をサンパチェンスに接種して育苗し、その脇芽を挿芽して育苗する挿木継代を３世代行うことによって、副作用を全く示さず、外界の強毒ＣＭＶの感染を無症状で防除することができるサンパチェンスが得られることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】弱毒ＣＭＶのＫＯ３をサンパチェンス ホワイトに接種して３世代挿木継代した際の副作用症状を示す写真である。
【図２】弱毒ＣＭＶのＮＤＭ−３をサンパチェンス オレンジに一次接種した後、強毒ＣＭＶのＣＭ８５−３を二次接種した際のウイルス症状を示す写真である。
【図３】弱毒ＣＭＶのＮＤＭ０８−２をサンパチェンス オレンジに接種して３世代挿木継代した際の副作用症状を示す写真である。
【図４】弱毒ＣＭＶのＮＤＭ０８−２をサンパチェンス オレンジに一次接種した後、強毒ＣＭＶのＣＭ８５−３を二次接種した際のウイルス症状を示す写真である。
【図５】サンパチェンス オレンジの健全株を示す写真である。
【図６】一次接種は無接種で二次接種に強毒ＣＭ８５−３を接種したサンパチェンス オレンジのウイルス症状を示す写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インパチェンスに病害をもたらすキュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、以下ＣＭＶともいう）に対して優れた防除効果を有するＣＭＶ弱毒ウイルス、当該ＣＭＶ弱毒ウイルスを得るためのサテライトＲＮＡ、該ＣＭＶ弱毒ウイルスを予めインパチェンス苗に接種したＣＭＶ抵抗性インパチェンス、及び該ＣＭＶ弱毒ウイルスを予めインパチェンス苗に接種することによるＣＭＶの防除法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）は、ブロモウイルス（Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）科ククモウイルス（Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ）属の代表的な種であり、温帯地方や熱帯地方における多くの農作物を宿主とする。このウイルスは、ウイルスなかで最も多くの宿主を持つと考えられ、キュウリ、カボチャ、メロン、トマト、ピーマン、トウガラシ、タバコ、ゴボウ、レタス、ダイコン、ハクサイ、ニンジン及びセロリ等のウリ科、ナス科、キク科、アブラナ科、マメ科及びセリ科等の８５科３６５属７７５種もの植物に感染することが報告されている。そして、これらの植物体の矮化や早生と共に、葉にモザイクや奇形を示して、輪点や壊疽症状若しくは葉脈上に葉状突起（ｅｎａｔｉｏｎ）を生ずることもある。又、花にも花弁に斑入りをつくって花の奇形を生じたり、果実もその表面が凹凸になり、モザイク症状若しくは黄色斑点をつくったりして、果実収量を低下させる。
【０００３】
このようなＣＭＶの病害を防除する方法として、弱毒ウイルスによる干渉作用（ｃｒｏｓｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を利用したものがある。これは、ウイルスに感染している植物は、既に感染しているウイルスと同じであるか、極めて近縁のウイルスには感染し難い現象を利用したものであり、植物に予め病原性ウイルスと同系統で病徴がないか、極めて軽微なウイルスを接種し感染させて、病原性ウイルスによる感染を防除するものである。
【０００４】
又ＣＭＶには、４種類のＲＮＡ（ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３及びＲＮＡ４）の他に、ＣＭＶのウイルス症状を緩和するサテライトＲＮＡを有するものがあり、本発明者らは、トマト、ピーマン、唐辛子及びタバコのＣＭＶによる病害を防除するため、このようなサテライトＲＮＡを有する弱毒ＣＭＶをこれまで開発してきた（特許文献１、２、３、４、５及び６参照）。
【特許文献１】特許第２９７５７３９号公報
【特許文献２】特許第３７２８３８１号公報
【特許文献３】特開２００６−３２０３０９号公報
【特許文献４】韓国特許第７４７６４９号
【特許文献５】特開２００７−８２４１６号公報
【特許文献６】特願２００８−８２３４５号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このように特許文献１に係る弱毒ＣＭＶのＫＯ１、ＫＯ２、ＫＯ３、ＫＯ４及びＫＯ５はトマトに、特許文献２に係る弱毒ＣＭＶのＮＤＭ３はピーマンに、特許文献３に係る弱毒ＣＭＶのＮＤＭ０５−１やＮＤＭ０５−２や特許文献６に係る弱毒ＣＭＶのＮＤＭ０８−１は唐辛子に、そして特許文献５に係る弱毒ＣＭＶのＮＤＭ０５−３はタバコにそれぞれ接種することで、ＣＭＶによるナス科植物の病害を防除することができる。しかし現在、家庭園芸で多く栽培され、公園にも植栽されているインパチェンス（アフリカホウセンカ、Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ ｗａｌｌｅｒａｎａ Ｈｏｏｋ．ｆ．）は、アブラムシによってＣＭＶを伝搬されて、矮化やモザイク症状等の多大なる被害を受けており、家庭園芸や公園の農薬による土壌汚染や残留農薬の心配をすることなく、インパチェンスからＣＭＶの病害を防除する方法が長い間希求されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために、日本各地から採取したウイルス症状の微弱なトマトからＣＭＶ弱毒ウイルスを分離し選抜して、検討を重ねた結果、特定塩基配列からなるサテライトＲＮＡを有する弱毒ＣＭＶが、多くのインパチェンスの品種に接種した際にウイルス症状を全く示さず、外界強毒ＣＭＶに高い防除能を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
よって、本発明は（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるサテライトＲＮＡ、（２）配列番号１に記載のサテライトＲＮＡを有するＣＭＶ弱毒ウイルス、（３）配列番号１に記載のサテライトＲＮＡを有するＣＭＶ弱毒ウイルスを、予め植物苗に接種して得られるＣＭＶ抵抗性植物、（４）配列番号１に記載のサテライトＲＮＡを有するＣＭＶ弱毒ウイルスを、予めインパチェンス苗に接種して得られるＣＭＶ抵抗性インパチェンス、（５）配列番号１に記載のサテライトＲＮＡを有するＣＭＶ弱毒ウイルスを、予め植物苗に接種することによる植物のＣＭＶの防除法、（６）配列番号１に記載のサテライトＲＮＡを有するＣＭＶ弱毒ウイルスを、予めインパチェンス苗に接種することによるインパチェンスのＣＭＶの防除法である。尚、ここで本発明のサテライトＲＮＡは、本発明のＣＭＶ弱毒ウイルスＮＤＭ０８−２から直接採取したものでも、採取したＲＮＡを鋳型としてクローニングしたものでも、又、ＲＮＡ自動合成装置で化学合成したものでも良い。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のＣＭＶ弱毒ウイルスによって、強毒ＣＭＶの病害から多くのインパチェンス品種を防除することができ、強毒ＣＭＶが感染しないインパチェンス苗を大量に生産し販売することができる。更には農薬による土壌汚染や残留農薬を心配することなく、ウイルス症状のない健全なインパチェンスを家庭園芸や公園で安全に栽培することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【実施例】
【００１０】
（１）弱毒ＣＭＶの採取と作出
日本各地で栽培されていたトマトから、ウイルス症状が軽微に発現した約５００枚の葉を採集して、これらの葉に１０倍量のリン酸緩衝液（中性付近の０．１Ｍリン酸緩衝液）を加えて磨砕し、その液をトマト苗（日本デルモンテ（株）製ＴＭＫ６０２８）に接種した。一週間後、各々のエライザー検定を行った結果、１５０系統についてＣＭＶの感染を確認した。これらの中から弱毒ウイルスを選抜すべく、１５０系統のトマトの感染葉をそれぞれトマト苗（ＴＭＫ６０２８）１０株ずつに接種して、一週間後、リボ核酸（ＲＮＡ）分析を行った。その結果、サテライトＲＮＡを有するＣＭＶが５３系統から検出された。そして、これら５３系統について当該トマト苗におけるウイルス症状調査を行なって、ネクロシスやモザイクが発病した系統や感染力を有しない系統を取り除いて、ウイルス症状が軽微でウイルス増殖量の多い弱毒ウイルスを選抜した。この選抜した弱毒ウイルスは遺伝的に均一ではなく、ウイルス症状が異なっていたので、該トマト苗５５株にこれら弱毒ウイルスを接種し、弱いウイルス症状が揃っている株だけを選抜した。更にサテライトＲＮＡの存在が継続されている株だけを採集して、ウイルス接種液の調製を行い、再度該トマト苗に接種し、同じ選抜操作をしてウイルス接種液の調製する作業を５回繰り返し、該トマトで継代接種を行なった。その結果、サテライトＲＮＡを安定して含むＣＭＶ弱毒ウイルス（ＮＤＭ０８−２）を作出した。
【００１１】
（２）サテライトＲＮＡの単離
ＮＤＭ０８−２をトマト苗（ＴＭＫ６０２８）の子葉に接種して感染させて、１〜４週間程度ウイルスを増殖させた後、トマト子葉を採取して−８０℃の冷凍庫で凍結した。次いで、この感染葉を粉砕して、２倍量の
０．１％チオグリコール酸を含む ０．５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）と同量のクロロホルムを加え、ワーリングブレンダー（ワーリング社製）で破砕した。この破砕液を９５００×ｇ、１０分間遠心して、上層（水層）の１０％に当たる重量のポリエチレングリコールを加えて溶解させた後、４０分間静置した。次いで、この溶液を９５００×ｇで２０分間遠心分離して、得られた沈殿に２％トライトンＸ−１００を含む０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて懸濁し均一化した。この粗精製品を１２０００×ｇで遠心分離した上清を２４００００×ｇで４５分間遠心分離して、沈殿を回収した後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この溶液に最終濃度で１％になるように１０％ＳＤＳを加えて、更にこの溶液と等量のフェノールを加えた後、１２０００×ｇで１５分間遠心分離した。この上層（水層）を回収して、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返し、ＲＮＡを単離精製した。その結果、感染葉１００ｇより、約２０ｍｇのＲＮＡを得た。次いで得られたＲＮＡを水に溶解して、１０〜４０％ショ糖密度勾配により超遠心分離(１７５０００×ｇで１６時間)し、得られたサテライトＲＮＡのバンドを採取して、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返し、サテライトＲＮＡを単離精製した。精製が不十分な場合は、６Ｍ尿素を含む９％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行なって、臭化エチジウムの溶液で染色し、サテライトＲＮＡのバンドの部分をカミソリで切り取って、透析チューブに入れ、ＥＤＴＡを含むトリス−酢酸緩衝液中で電気泳動による溶出を行った後、サテライトＲＮＡを回収して、常法に従いエタノール沈殿を繰り返し、サテライトＲＮＡを単離精製した。この電気泳動によるサテライトＲＮＡの溶出の詳細はＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２））に従って行なった。
【００１２】
（３）サテライトＲＮＡのクローニングとシークエンス
単離精製したサテライトＲＮＡからマイナス鎖（以下−鎖と表記する）ｃＤＮＡを合成するために、サテライトＲＮＡ（約３μｇ）と３’末端塩基配列に相補的なＤＮＡプライマー（８塩基、１μＭ）を９５℃で熱処理した後、徐冷してアニーリングした。この−鎖ｃＤＮＡ合成反応はＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（（株）キアゲン製）を用いて、３７℃、６０分の条件で行なった。次いで、得られたｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させた。即ち、プラス鎖サテライトＲＮＡの５’末端に相同的なＤＮＡプライマーと３’末端塩基配列に相補的なＤＮＡプライマーを用いて、９４℃１分間、３７℃１分間、７２℃２分間の反応を４５回繰り返すことによってＰＣＲ反応を行なった（ＰＣＲ反応液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、２００μＭ ｄＮＴＰ、２．５ｕｎｉｔｓ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ（株）製））。このｃＤＮＡを１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離させた後、ゲルより切り出して、ＤＮＡ回収キットＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）を用いて精製した。得られたｃＤＮＡをＴ−Ａクローニング用ベクターｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（プロメガ（株）製）にクローニングして、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断することによって、ＮＤＭ０８−２のサテライトＲＮＡ由来のｃＤＮＡを確認した。
【００１３】
このサテライトＲＮＡの塩基配列をＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）とＤＮＡシーケンサＤＳＱ−１０００Ｌ（（株）島津製作所製）を用いて決定した。本発明のＣＭＶ弱毒ウイルスであるＮＤＭ０８−２のサテライトＲＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。
【００１４】
尚、本発明のＮＤＭ０８−２は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにおいて受託が拒否されている（寄託受託証不交付通知書における識別のための表示：ＮＤＭ０８−２）。よって、ＮＤＭ０８−２は出願人自らが保管し、特許法施行規則第２７条の３の規定に準じて、譲渡を行う用意がある（保管場所：〒３７８−００１６、群馬県沼田市清水町３７８４番地、日本デルモンテ株式会社、研究開発本部、植物ワクチン開発部）。
【００１５】
（４）弱毒ＣＭＶの選抜
ガラス温室において、挿木増殖したサンパチェンス マジェンダ グランデ、サンパチェンス オレンジ、サンパチェンス 斑入りサーモン、サンパチェンス ホワイト及びサンパチェンス ラベンダー（以上、（株）サカタのタネ製）の苗５品種とインパチェンス品種のエクストリーム・ピンク（タキイ種苗（株）製）の苗に、弱毒ＣＭＶであるＫＯ１、ＫＯ２、ＫＯ３、ＫＯ４及びＫＯ５（特許第２９７５７３９号参照）とＮＤＭ−３（特許第３７２８３８１号参照）、ＮＤＭ０５−１及びＮＤＭ０５−２（特開２００６−３２０３０９号公報参照）、ＮＤＭ０５−３（特開２００７−８２４１６号公報参照）、ＮＤＭ０８−１（特願２００８−８２３４５号）を接種した際の副作用と、これら弱毒ＣＭＶを一次接種後に外界強毒ＣＭＶのＣＭ８５−３を二次接種した際の当該弱毒ＣＭＶの防除効果を予備試験した。その結果、ＫＯ３とＮＤＭ−３が当該サンパチェンス５品種とインパチェンス品種に有効な弱毒ＣＭＶであることが判明した（試験結果は記載せず）。そして、これら２種類の弱毒ＣＭＶと本発明のＮＤＭ０８−２との該サンパチェンス５品種とインパチェンス品種における副作用と、強毒ＣＭＶに対する防除効果を詳細に試験調査した。
【００１６】
尚、上記の予備試験で使用した弱毒ＣＭＶのＫＯ１、ＫＯ２、ＫＯ３、ＫＯ４、ＫＯ５、ＮＤＭ−３、ＮＤＭ０５−１、ＮＤＭ０５−２、ＮＤＭ０５−３及びＮＤＭ０８−１の塩基配列を、それぞれ配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１に示す。
【００１７】
（５）弱毒ＣＭＶ ＮＤＭ０８−２の選抜
上記サンパチェンス苗５品種のうち、サンパチェンス マジェンダ グランデとサンパチェンス オレンジ及びエクストリーム・ピンクの脇芽をセルトレイにそれぞれ挿木して、この挿木の１週間後にこれら挿木苗を１６穴セルトレイ（６０×６０×６０ｍｍ）に植え替えた。そして、この植え替１週間後、該サンパチェンス２品種とインパチェンス品種の挿木苗５株ずつに、弱毒ＣＭＶのＮＤＭ０８−２、ＫＯ３及びＮＤＭ−３をウイルス粒子濃度５０μｇ／ｍｌでそれぞれ１次接種し、温室で２ヶ月間程育苗した（挿木１世代）。次いで当該挿木１世代からウイルス症状が微弱な脇芽をそれぞれ選抜して挿木し、温室で２ヶ月間程育苗して（挿木２世代）、更に挿木２世代からウイルス症状が微弱な脇芽をそれぞれ選抜して挿木し、温室で２ヶ月間程育苗した（挿木３世代）。
【００１８】
そして、これら挿木１世代、２世代及び３世代のウイルス症状を観察し、当該弱毒ウイルスによる副作用を調査した。尚、ここでの調査方法は、挿木したサンパチェンス苗とインパチェンス苗のウイルス症状を詳細に観察して、下記のウイルス症状指数として点数化し、品種毎の平均値をウイルス症状度として表わしたものである。その結果を表１、２、３、４及び５に示す。
【００１９】
（ウイルス症状指数）
このウイルス症状指数は、サンパチェンス苗とインパチェンス苗のウイルス症状において「無症状」を０、「症状あり・退色」を１、「葉の先細い・葉の湾曲」を２、「黄化・糸葉・一部モザイク」を３、「モザイク・弱い壊疽」を４、「壊疽」を５として点数化した。
（ウイルス症状度）
ウイルス症状度は、品種毎に調査した挿木苗のウイルス症状指数の合計値を、当該調査した挿木苗の全株数で除した値（ウイルス症状度＝Σ（ウイルス症状指数×株数）／全株数）で表した。
【００２０】
【００２１】
【００２２】
【００２３】
表１から表３の結果より、弱毒ＣＭＶのＫＯ３を接種して、ウイルス症状が微弱な脇芽を選抜して挿木することを３世代行ったサンパチェンス苗２品種において、１〜３世代の全ての世代に軽微なウイルス症状が発現し（サンパチェンス ホワイト（図１））、インパチェンス品種においては、２世代まで軽微なウイルス症状が発現した。
【００２４】
又、ＮＤＭ−３を接種して、同様に脇芽を３世代挿木継代したサンパチェンス苗２品種においても、１〜３世代の全ての世代に軽微なウイルス症状が発現し、インパチェンス品種においては、２世代まで軽微なウイルス症状が発現した。
【００２５】
しかし、ＮＤＭ０８−２を接種して、同様に脇芽を３世代挿木継代したサンパチェンス苗５品種においては、挿木継代３世代目の苗に、ウイルス症状が全く発現せず（サンパチェンス オレンジ（図２））、インパチェンス品種においては、挿木継代２世代目の苗から、ウイルス症状が発現しないことが判明した。
【００２６】
（６）弱毒ＣＭＶ ＮＤＭ０８−２の強毒ＣＭＶに対する防除
上記サンパチェンス苗５品種の脇芽をセルトレイにそれぞれ挿木して、この挿木の１週間後にこれら挿木苗を１６穴セルトレイ（６０×６０×６０ｍｍ）に植え替えた。そしてこの植え替１週間後、当該サンパチェンス５品種の挿木苗５株に、弱毒ＣＭＶのＮＤＭ０８−２、ＫＯ３及びＮＤＭ−３を、ウイルス粒子濃度５０μｇ／ｍｌでそれぞれ１次接種し、次いで、該サンパチェンス苗５品種に、この１次接種から２週間後に、ウイルス粒子濃度４００μｇ／ｍｌで、外界強毒ＣＭＶのＣＭ８５−３を二次接種して、約２ヶ月間温室内で育苗した。そして、サンパチェンス苗５品種のウイルス症状を観察して、当該弱毒ＣＭＶの防除効果を上記（５）副作用の調査方法と同様に、サンパチェンス苗５品種のウイルス症状度の調査をした。その結果を表４に示す。
【００２７】
【００２８】
表４の結果より、ＫＯ３を一次接種後に強毒ＣＭＶのＣＭ８５−３を二次接種した際には、サンパチェンス 斑入りサーモンに一部モザイク症状が、ホワイトとラベンダーにも軽微なウイルス症状が現れた。
【００２９】
又、ＮＤＭ−３を一次接種後にＣＭ８５−３を二次接種した際には、サンパチェンス マジェンダ グランデには壊疽症状が、オレンジには軽微なウイルス症状（図３）が、斑入りサーモンにはモザイクや壊疽症状が、ホワイトとラベンダーには軽微なウイルス症状が現れた。
【００３０】
しかし、ＮＤＭ０８−２を一次接種した後にＣＭ８５−３を二次接種した際には、サンパチェンス５品種にはウイルス症状が全く現れなかった（サンパチェンス オレンジ（図４））。又、比較のため、サンパチェンス オレンジの健全株を図５に、一次接種は無接種で二次接種に強毒ＣＭ８５−３を接種して育苗した株を図６にそれぞれ示す。
【００３１】
以上、表１から表４の結果から、本発明のＮＤＭ０８−２をサンパチェンスに接種して育苗し、その脇芽を挿芽して育苗する挿木継代を３世代行うことによって、副作用を全く示さず、外界の強毒ＣＭＶの感染を無症状で防除することができるサンパチェンスが得られることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】弱毒ＣＭＶのＫＯ３をサンパチェンス ホワイトに接種して３世代挿木継代した際の副作用症状を示す写真である。
【図２】弱毒ＣＭＶのＮＤＭ−３をサンパチェンス オレンジに一次接種した後、強毒ＣＭＶのＣＭ８５−３を二次接種した際のウイルス症状を示す写真である。
【図３】弱毒ＣＭＶのＮＤＭ０８−２をサンパチェンス オレンジに接種して３世代挿木継代した際の副作用症状を示す写真である。
【図４】弱毒ＣＭＶのＮＤＭ０８−２をサンパチェンス オレンジに一次接種した後、強毒ＣＭＶのＣＭ８５−３を二次接種した際のウイルス症状を示す写真である。
【図５】サンパチェンス オレンジの健全株を示す写真である。
【図６】一次接種は無接種で二次接種に強毒ＣＭ８５−３を接種したサンパチェンス オレンジのウイルス症状を示す写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の塩基配列からなるサテライトＲＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のサテライトＲＮＡを有するキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルス。
【請求項３】
請求項２に記載のキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスを、予め植物苗に接種して得られるキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。
【請求項４】
植物苗がインパチェンス苗である請求項３に記載のキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。
【請求項５】
請求項２に記載のキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを、予め植物苗に接種することによる植物のキュウリモザイクウイルスの防除法。
【請求項６】
植物苗がインパチェンス苗である請求項５に記載の植物のキュウリモザイクウイルスの防除法。
【請求項１】
配列番号１に記載の塩基配列からなるサテライトＲＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のサテライトＲＮＡを有するキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルス。
【請求項３】
請求項２に記載のキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスを、予め植物苗に接種して得られるキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。
【請求項４】
植物苗がインパチェンス苗である請求項３に記載のキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。
【請求項５】
請求項２に記載のキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを、予め植物苗に接種することによる植物のキュウリモザイクウイルスの防除法。
【請求項６】
植物苗がインパチェンス苗である請求項５に記載の植物のキュウリモザイクウイルスの防除法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−８８３２８（Ｐ２０１０−８８３２８Ａ）
【公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２６０２４２（Ｐ２００８−２６０２４２）
【出願日】平成２０年１０月７日（２００８．１０．７）
【出願人】（０００１０４５５９）日本デルモンテ株式会社 (44)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月７日（２００８．１０．７）
【出願人】（０００１０４５５９）日本デルモンテ株式会社 (44)
【Ｆターム（参考）】
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