タンパク質複合体およびその製造方法
【課題】タンパク質抗原の変性を極力抑制しつつ、該抗原を好適に精製することが可能な包埋タンパク質抗原、およびその製造方法を提供する。
【解決手段】分子中にシステイン残基を２個以上有するタンパク質抗原を疎水化多糖類に包埋させる包埋タンパク質抗原の製造方法。該疎水化多糖類への包埋の前または後に、前記タンパク質抗原を精製する。
【解決手段】分子中にシステイン残基を２個以上有するタンパク質抗原を疎水化多糖類に包埋させる包埋タンパク質抗原の製造方法。該疎水化多糖類への包埋の前または後に、前記タンパク質抗原を精製する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質複合体およびその製造方法、より詳しくは抗癌タンパク質ワクチンのタンパク質抗原およびその製造方法に関する。本発明は、分子中に２個以上のシステイン残基を有する抗癌タンパク質ワクチンの癌特異的タンパク質抗原およびその製造方法に特に好適に適用可能である。一つの態様において、本発明は、例えば、癌精巣抗原（ＣＴＡ）のごとく分子中に２個以上のシステイン残基を有する抗癌タンパク質ワクチンの癌特異的タンパク質抗原のシステイン残基を酸化的スルホ化することにより保護して、効率よく精製する製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、分子中にシステイン残基を２個以上有するタンパク質について、特に制限なく適用することが可能であるが、説明の便宜のため、上記した癌精巣抗原（ＣＴＡ）に関連する背景技術について、先ず説明する。
【０００３】
癌細胞に特異的に発現する抗原を患者の細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が認識して攻撃するらしいことが知られ、メラノーマ癌細胞株からＭＡＧＥ-Ａ１抗原の遺伝子配列がGene Transfection Approachによって初めて同定された（非特許文献１；van der Bruggen P, et al., Science; ２５４:１６４３-７(１９９１)）。このＭＡＧＥ−Ａ１遺伝子に由来するプローブを含むコスミドでDNAライブラリに対してハイブリダイズすることによって、新たに１１種の密接に関連したMAGE ファミリーが同定された。（非特許文献２；De Plaen E，et al.，Immunogenetics；４０：３６０−９（１９９４））。これらの１２種のＭＡＧＥ−Ａ遺伝子の局在はＸ染色体のｑ２８領域に同定された（非特許文献３；Rogner UC，et al.，Genomics．２９：７２５−３１（１９９５））。
【０００４】
その後も癌精巣抗原（CTA）はSEREX法（例えばSahin, U.ら (１９９５) Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９２, １１８１０-３、 Chen YTら（１９９７）Proc Natl Acad Sci U S A.;９４:１９１４-８、 Tureci Oら（１９９６）Cancer Res. ５６:４７６６-７２を参照）等によって引き続き発見された。これらのCTAの多くは正常細胞では精巣細胞内にしか存在せず、癌細胞に高頻度で発現することが明らかになった。こうした性質からＣＴＡは、癌ワクチンの理想的な標的抗原といわれている。実際、CTLがこのＣＴＡ陽性細胞を認識するエピトープ（８−１０残基のアミノ酸よりなるオリゴペプチド）を抗原としたペプチドワクチンの開発がこれまで数多くなされている。
【０００５】
しかしながら、CTLだけを活性化させてもワクチン効果としては不充分であることが多く、更にはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）のタイプによってその認識エピトープは異なるため、ペプチドワクチンの臨床応用には限界があると考えられている。これに対して、CTAの全長もしくは部分長を抗原とするタンパク質性ワクチンでは、抗原中にCTLの認識エピトープだけでなくヘルパーＴ細胞の認識エピトープも含むことにより様々なタイプのＴ細胞を同時に活性化でき、また、異なるＨＬＡに対応する認識エピトープも複数含む、いわゆる多価性ワクチンとして機能し得ることが知られている。
【０００６】
タンパク質性ワクチンでは、癌特異的抗原の抗原提示細胞（例えば樹状細胞）への効率的な送達を図るため、あるいは癌特異的抗原の安定化を図るために、癌特異的抗原をリポソーム等の高分子キャリアに包埋して用いることがある。そうした高分子キャリアの一種として、プルランなどの多糖類にコレステロールなどの疎水性基を付加して得られる疎水化多糖類（例えばＣＨＰ）の会合体がある。ＣＨＰは、これに癌特異的抗原全体を包埋させることによって、抗原提示細胞に抗原提示させやすくする性質を有し、しかもＣＨＰ内にて癌特異的抗原を保護することで製剤としての安定性を向上させる効果も有する。（特許文献１；ＷＯ９８／０９６５０号公報）このような高分子キャリアとしては、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸアジュバントも知られている。（特許文献X；WO２００５０３２４７５）
【０００７】
包埋剤となる高分子キャリアとしては、周知のもの、たとえばリポソームやイスコマトリックスも含まれる。
【０００８】
リポソームはこのような目的には一般的に使われるもので当業者には周知のものであり、リン脂質とそれ以外のコレステロールや様々な物質と組み合わせたり、また抗体や磁性粒子などを用いて目的とする標的部位に集中する機能を付与してDDSシステムに使われているが、たとえば白血病細胞のブタノール抽出物を含むワクチン（Shibata R.ら、(１９９１年)Int J Cancer. May ３０; ４８(３):４３４-４２）や膜タンパクからのワクチン(Sunamoto J.ら、(１９９０年)Ann NY Acad Sci.６１３:１１６-２７)を参照することができる。
【０００９】
イスコマトリックスもがん抗原を包埋してワクチンにすることができる公知の物質で、サポニン、コレステロールおよびリン脂質から構成されている。オーストラリアのＣＳＬ社で開発が進められていて既に臨床試験の報告が出されている。(たとえば、Butts C.ら、(２００５年) J Clin Oncol. ２０;２３(２７):６６７４-８１や、North S.ら、(２００５年) Expert Rev Vaccines. ４(３)：２４９-５７、Davis D.ら、(２００４年) P Natul Acad Sci.１０１(２９)１０６９７ を参照することができる。)
【００１０】
上記ＣＴＡなどの癌特異的抗原は組換え大腸菌によって発現させて製造することが出来るが、医薬品としてのグレードの品質を確保するためには、通常は、いくつかの精製工程を経ることが必要となる。Ｈｉｓ−Ｔａｇと呼ばれる、ヒスチジンが複数個並んだ配列で金属イオンとキレートを形成するタグを癌特異的タンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加し、ニッケルイオンの固定化カラムを用いて癌特異的タンパク質をアフィニティー精製することが多い。(Skerra A.ら、Biotechnology (１９９１年)Mar;９(３)２７３-８やCrowe J ら、Methods Mol Biol. （１９９４年）;３１:３７１-３８７.参照)しかしながら、ＣＴＡ等癌特異的抗原タンパクにはシステインのチオール（−ＳＨ）基が配列の中に複数存在することが多く、タンパク質分子間でジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）結合して多量体を形成する傾向がある。
【００１１】
一部のタンパク質では、リフォールディング操作によって分子内架橋させることで性状改善、すなわち単量体化を図り、純度の良いタンパク質として精製することが出来る。しかし、ＣＴＡ等癌特異的抗原タンパクでは分子内ジスルフィド結合を形成し難く、リフォールディング操作によっても単量体が得られにくい傾向にある。このため、ＣＴＡ等癌特異的抗原タンパクを精製するに際しては、下記のような種々の問題点がある。
【００１２】
（１）システインを含むタンパクは精製工程中に濃縮されると分子間スルフィド結合によって縮合が進み、多量体を形成して収率が低下してしまう。
【００１３】
（２）チオール基を有するタンパク質は、一般に不安定で、医薬品として使用する場合には品質安定性上にも課題がある。
【００１４】
（３）ワクチン製剤のタンパク抗原の場合、チオール基を保護して精製しようとする時、抗原提示されるエピトープのチオール基が復元されなくてはならない。（即ち可逆的保護でなくてはならない。）
【００１５】
ＮＹ−ＥＳＯ−１というＣＴＡを抗原としたワクチンの製造では、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは多量体の割合をコントロールできず、還元ＳＤＳでのみ品質管理を行い、８Ｍ尿素で変性させたまま原薬としている（非特許文献４；Preparative Biochem & Biotech，３５：１１９−１３４，２００５）。しかし、製剤化の段階で尿素を除去する必要があり、恐らくこの操作で多量体形成が再発するために、キャリアであるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸアジュバントに包含すると普通のタンパク質では４０ｎｍのナノ粒子になるところをＮＹ−ＥＳＯ−１の場合には２０００ｎｍの巨大な凝集体になったとの報告（非特許文献５；Clin Cancer Res，１０：２８７９−２８９０，２００４）がある。
【００１６】
上記した問題を解決する試みとして、ＭＡＧＥ−Ａ３というＣＴＡに２−メルカプトエタノールで還元した後にヨウ化アセトアミドを作用させてカルボキシメチル化によってチオール基をブロック保護する方法が考案された（特許文献２；ＷＯ９９／４０１８８公報）。このようなチオール基を選択的に保護する方法として、ヨード酢酸やヨウ化アセトアミドなどによるカルボキシメチル化が一般に行われている。しかしながら、この方法では非可逆的にチオール基をブロックしてしまうためシステインを含むタンパク抗原エピトープの場合には同エピトープを失活させてしまう欠点を有する。
【００１７】
また、大腸菌を宿主としたシステイン含有組み換えたんぱく質の製造にはＲＥＤＯＸ試薬（グルタチオン-グルタチオン酸化体或いはシステイン-システイン等）による再構成（リフォールディング）が必要とされるが、ある種のタンパク質、例えば、GM-CSF（非特許文献６；Behring Inst Mitt．１９８８ Ａｕｇ；（８３）：２４６−９）やインスリン（非特許文献７；J Biol Chem．１９９２ Ｊａｎ ５；２６７（１）：４１９−２５、非特許文献８；Anal Chem．１９９２ Ｍａｒ １；６４（５）：５０７−１１）の製造などでは亜硫酸ナトリウムとテトラチオン酸ナトリウムを作用させてスルフィド（−ＳＨ）基をスルホ（−ＳＳＯ３）化して精製した後にリフォールディングするという方法も報告されている。
【００１８】
スルホ化は免疫グロブリンなどに用いられて当業者には周知の方法である。(例えば、乾燥スルホ化人免疫グロブリン献血ベニロンーI 添付文書参照)
【００１９】
【特許文献１】ＷＯ９８／０９６５０号公報
【特許文献２】ＷＯ９９／４０１８８公報
【００２０】
【非特許文献１】van der Bruggen P，et al.，Science；２５４：１６４３−７（１９９１）
【非特許文献２】De Plaen E，et al.，Immunogenetics；４０：３６０−９（１９９４）
【非特許文献３】Rogner UC，et al.，Genomics．２９：７２５−３１（１９９５）
【００２１】
【非特許文献４】Preparative Biochem & Biotech，３５：１１９−１３４，２００５
【非特許文献５】Clin Cancer Res，１０：２８７９−２８９０，２００４
【非特許文献６】Behring Inst Mitt．１９８８ Ａｕｇ；（８３）：２４６−９
【００２２】
【非特許文献７】J Biol Chem．１９９２ Ｊａｎ ５；２６７（１）：４１９−２５
【非特許文献８】Anal Chem．１９９２ Ｍａｒ １；６４（５）：５０７−１１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明の目的は、上記した従来技術の欠点を解消したタンパク質複合体およびその製造方法を提供することにある。
【００２４】
本発明の目的は、さらに詳しくは、タンパク質抗原の分子間ジスルフィド結合形成による凝集を生じせしめることなく高収率で精製し、複合体を形成するタンパク質抗原の複合体の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明者は鋭意研究の結果、分子中にシステイン残基を２個以上有するタンパク質のチオール基をスルホ化してからカラムクロマトグラフィー等の方法によって単量体を維持しつつ精製し、しかる後に、疎水化多糖類等の微粒子形成物質と複合体を形成させ、さらに必要なら複合体中のスルホ化タンパク質を還元することで上記目的を達成できることを見い出した。
【００２６】
本発明のタンパク質複合体の製造方法は、上記知見に基づくものであり、より詳しくは、分子中にシステイン残基を２個以上有するタンパク質を包埋剤と複合体化させるタンパク質包埋剤複合体の製造方法であって；前記包埋剤への包埋の前に、前記タンパク質のシステイン残基を修飾して精製することを特徴とするものである。
【００２７】
本発明によれば、分子中にシステイン残基を２個以上有するＣＴＡ等癌特異的タンパク質抗原を安定な単量体として高収率で得ることが出来る。
【００２８】
本発明によれば、更に、疎水化多糖類等高分子キャリアに包埋させる前または後に還元して、タンパク質分子間のジスルフィド結合を形成することなくスルホ化リコンビナント癌特異的タンパク質抗原のチオール基を復元させることが出来る。
【００２９】
本発明者の知見によれば、本発明において、分子中にシステイン残基を２個以上有する癌特異的タンパク質抗原を、酸化的スルホ化することにより、該癌特異的タンパク質抗原が安定化されて、該タンパク質抗原の分子間結合形成が効果的に防止され、これにより、タンパク質抗原単量体を収率高く精製することが可能となるものと推定される。
【００３０】
これに対して従来のＣＴＡ（タンパク質抗原の一種）等の癌特異的抗原の精製方法においては、本発明者の知見によれば、多くの癌特異的抗原が奇数個のシステイン残基を含んでおり、これらシステインは分子内ジスルフィド結合を形成せずチオール基のままで存在しているか、または分子間でジスルフィド結合を形成してCTAの多量体形成に寄与しているものが一定量存在するため、このようなチオール基の存在が癌特異的抗原の収率の良い精製を阻害していたものと推定される。
【００３１】
本発明は、ＥｒｂＢ−２タンパク質などの癌遺伝子産物および腫瘍血管の抗原タンパク質（VEGFR）などにも適用可能である。
【００３２】
本発明は、例えば、以下の態様を含む。
【００３３】
［１］ 分子中にシステイン残基を２個以上有するタンパク質を包埋剤と複合体化させるタンパク質包埋剤複合体の製造方法であって；
【００３４】
前記包埋剤への包埋の前に、前記タンパク質のシステイン残基を修飾して精製することを特徴とするタンパク質複合体の製造方法。
【００３５】
［２］ 前記包埋剤が疎水化多糖類である［１］に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【００３６】
［３］ 前記包埋剤がリポソームである［１］に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【００３７】
［４］ 前記包埋剤がイスコマトリックスである［１］に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【００３８】
［５］ 前記修飾が可逆的である［１］〜［４］のいずれかに記載のタンパク質複合体の製造方法。
【００３９】
［６］ 前記修飾がスルホ化である［１］〜［４］のいずれかに記載のタンパク質複合体の製造方法。
【００４０】
［７］ 前記タンパク質が、癌精巣抗原（ＣＴＡ）である［１］〜［６］のいずれかに記載のタンパク質複合体の製造方法。
【００４１】
［８］ 前記癌精巣抗原（ＣＴＡ）が、組換え大腸菌を用いて発現されるリコンビナント精巣抗原である［７］に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【００４２】
［９］ 前記タンパク質の精製後、包埋剤との複合体化の前に精製したタンパク質をスルフィド結合還元剤で還元する工程を含む［１］に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【００４３】
［１０］ 前記タンパク質を包埋剤と複合体化させた後複合体をスルフィド結合還元剤で還元する工程を含む［１］に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【００４４】
［１１］ 前記修飾をタンパク質にチオ硫酸塩とテトラチオン酸塩を作用させて、該タンパク質のチオール基をスルホ化させて保護する［６］に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【００４５】
［１２］ 前記精製をクロマトグラフィーで行う［１］に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【００４６】
［１３］ 疎水化多糖類（Ａ）と、これに包埋された、分子中にシステイン残基を２個以上有するスルホ化リコンビナント精巣抗原（Ｂ）とを少なくとも含むことを特徴とする包埋タンパク質抗原。
【００４７】
［１４］ 前記スルホ化リコンビナント精巣抗原が還元されてなる［１３］に記載の包埋タンパク質抗原。
【００４８】
［１５］ 疎水化多糖類（Ａ）と、これに包埋されたスルホ化リコンビナント精巣抗原（ＣＴＡ）とを少なくとも含むことを特徴とするＣＨＰ−ＣＴＡワクチン。
【００４９】
［１６］ 前記スルホ化リコンビナント精巣抗原が、還元されたスルホ化リコンビナント精巣抗原（ＣＴＡ ＳＨ）である［１５］に記載のＣＨＰ−ＣＴＡワクチン。
【００５０】
［１７］ 前記リコンビナント精巣抗原が、ＭＡＧＥ Ａｌ，ＭＡＧＥ Ａ２，ＭＡＧＥ Ａ３，ＭＡＧＥ Ａ４，ＭＡＧＥ Ａ５，ＭＡＧＥ Ａ６，ＭＡＧＥ Ａ７，ＭＡＧＥ Ａ８，ＭＡＧＥ Ａ９，ＭＡＧＥ Ａ１０，ＭＡＧＥ Ａ１１，ＭＡＧＥ Ａ１２，ＭＡＧＥ Ｂ１，ＭＡＧＥ Ｂ２，ＭＡＧＥ Ｂ３，ＭＡＧＥ Ｂ４，ＭＡＧＥ Ｃ１，ＭＡＧＥ Ｃ２のＭＡＧＥ ファミリーから１ないし複数選択されたＣＴＡである［１５または１６］に記載のＣＨＰ−ＣＴＡワクチン。
【００５１】
［１８］ 前記リコンビナント精巣抗原が、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ ファミリー、ＧＡＧＥ ファミリー、ＳＡＧＥ ファミリー、ＸＡＧＥ ファミリーから１ないし複数選択されたＣＴＡである［１５または１６］に記載のＣＨＰ−ＣＴＡワクチン。
【００５２】
［１９］ 前記リコンビナント精巣抗原が、Ｈｉｓ−Ｔａｇを付加したＨｉｓ−Ｔａｇ−ＣＴＡである［１５または１６］に記載のＣＨＰ−ＣＴＡワクチン。
【発明の効果】
【００５３】
上述したように本発明によれば、癌特異的タンパク質抗原の重合多量体化を極力抑制しつつ、該タンパク質抗原の好適な精製を可能とする癌特異的タンパク質抗原およびその製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
以下、必要に応じて図面を参照しつつ本発明を更に具体的に説明する。以下の記載において量比を表す「部」および「％」は、特に断らない限り質量基準とする。
【００５５】
（抗癌タンパク質ワクチン）
本発明の抗癌タンパク質ワクチンは、分子中にシステイン残基を２個以上有する癌特異的タンパク質抗原を疎水化多糖類等高分子キャリアに包埋させることによって製剤化される。
【００５６】
（チオール基の復元）
本発明において、タンパク質抗原はスルホ化されたまま疎水化多糖類等に包埋してよいが、疎水化多糖類に包埋する直前に還元してもよく、或いは疎水化多糖類に包埋させた後に還元することが出来る。この還元方法に関しては２mM以上の２-メルカプトエタノール、ジチオスライトール、システインなどを作用することで達成できる。
【００５７】
（高分子キャリア）
本発明において使用すべき高分子キャリアは、リポソーム、疎水化多糖類、イスコマトリックス等癌特異的タンパク抗原の疎水性部分を包埋してナノゲル形成性を有するものである限り、任意の高分子キャリアを特に制限なく使用可能である。
【００５８】
疎水化多糖類（「疎水化多糖類集合体微粒子」を包含する意味で用いる；以下同様）は、例えば、Akiyoshi et al.，Macromolecules，６，ｐｐ．３０６２−３０６８，１９９３; Akiyoshi et al.，J．Proc．Japan．Acad.，７１，７１Ｂ，ｐ．１５，１９９５; 特開昭６１−６９８０１号公報、特開平３−２９２３０１号公報、特開平７−９７３３３号公報等に記載された、それ自体公知の方法で製造することができる。
【００５９】
疎水化多糖類における多糖類は、糖残基がグリコシド結合した高分子である限り、特に限定されない。多糖類を構成する糖残基としては、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フコース等の単糖類、または二糖類またはオリゴ糖類などの糖類に由来する残基を用いることができる。糖残基は１，２−、１，３−、１，４−または１，６−グリコシド結合していてもよく、その結合はα−またはβ−型結合のいずれであってもよい。また、多糖類は直鎖状でも分枝鎖状のいずれでもよい。糖残基としてはグルコース残基が好ましく、多糖類としては、天然または合成由来のプルラン、デキストラン、アミロース、アミロペクチン、又はマンナン、好ましくはマンナンまたはプルランなどが使用可能である。
【００６０】
疎水基は特に制限されず、包埋（ないし封入）される抗原の分子量や等電点に応じて封入率の高いものを選択できる。ワクチン製剤としての安全性の観点から、疎水基としては代謝されて安全な１本鎖及び２本鎖のアルキル基またはステロール残基を１００単糖あたり１〜５個（重量比で５％以下）導入したものが望ましい。
【００６１】
ステロール残基としては、例えば、コレステロール、スチグマステロール、β−シトステロール、ラノステロール、エルゴステロール残基などが挙げられるが、ワクチン製剤としての安全性の観点からは、コレステロール残基を用いることが望ましい。また、アルキル基としては、好ましくは炭素数２０以下、さらに好ましくは炭素数１０〜１８のアルキル基を用いることができ、これらは直鎖又は分岐鎖のいずれであってもよい。
【００６２】
好適な疎水化多糖類の一態様としては、例えば、多糖類を構成する糖単位１００個あたり１〜５個の糖単位の１級水酸基が下記式（Ｉ）：
【００６３】
−Ｏ−（ＣＨ2）mＣＯＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ−ＣＯ−Ｏ−Ｒ（Ｉ）
（式中、Ｒはアルキル基またはステロール残基を示し；ｍは０または１を示し；ｎは任意の正の整数を示す）で表されるものを挙げることができる。ここで、アルキル基又はステロール残基としては好ましくは上記のものを用いることができ、ｎは好ましくは１〜８である。なお、疎水化多糖類としては、特開平７−９７３３３号公報に記載されたようなリンカーを介して結合したものであってもよい。
【００６４】
（好適な高分子キャリアの具体例）
より具体的には、本発明においては、下記のような疎水化多糖類（Ａ）を用いることが好ましい。
【００６５】
（１）ＣＨＰ（コレステロール疎水化プルラン）
（２）ＣＨＭ（コレステロール疎水化マンナン）
（３）ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ
【００６６】
上記のＣＨＰ、ＣＨＭ等としては、必要に応じて、市販品（例えば、日本油脂株式会社から商業的に入手可能な製品で、分子量６万、１０万等のもの；糖残基１００個当たり、１．６個程度のコレステロールが存在する）を利用することもできる。
【００６７】
（タンパク質抗原）
本発明において、上記した疎水化多糖類等高分子キャリアに包埋させるべき癌特異的タンパク質抗原としては、その分子中にシステイン残基を２個以上有する癌細胞に特異的に発現するタンパク質抗原を用いる。
【００６８】
（好適な抗原）
本発明においては、上記の癌特異的タンパク質抗原として、例えば、以下のものが好適に使用可能である。
【００６９】
（１）癌精巣抗原（ＣＴＡ）
（２）組換え大腸菌を用いて発現される組み換え癌精巣抗原
例えば、ＭＡＧＥ−Ａｌ，ＭＡＧＥ−Ａ２，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＡＧＥ−Ａ４，ＭＡＧＥ−Ａ５，ＭＡＧＥ−Ａ６，ＭＡＧＥ−Ａ７，ＭＡＧＥ−Ａ８，ＭＡＧＥ−Ａ９，ＭＡＧＥ−Ａ１０，ＭＡＧＥ−Ａ１１，ＭＡＧＥ−Ａ１２，ＭＡＧＥ−Ｂ１，ＭＡＧＥ−Ｂ２，ＭＡＧＥ−Ｂ３，ＭＡＧＥ−Ｂ４，ＭＡＧＥ−Ｃ１，ＭＡＧＥ−Ｃ２のＭＡＧＥファミリーから１ないし複数選択された癌精巣抗原；
【００７０】
ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ ファミリー、ＧＡＧＥ ファミリー、ＳＡＧＥ ファミリー、ＸＡＧＥ ファミリーから１ないし複数選択された癌精巣抗原；
【００７１】
（３）ＥｒｂＢ−２タンパク質などの癌遺伝子産物および腫瘍血管の抗原タンパク質（VEGFR）など
【００７２】
（４）上記（１）、（２）または（３）の抗原にＨｉｓ−Ｔａｇを付加したＨｉｓ−Ｔａｇ−癌特異的抗原
【００７３】
（疎水化多糖類による抗原の包埋方法）
疎水化多糖類と抗原との複合体は、尿素等の変性剤存在下に疎水化多糖類と抗原とを室温で混合した後に、限外ろ過またはゲルクロマトグラフ法で変性剤を除去することにより製造することができる(Nishikawa，Macromolecules，２７，ｐｐ．７６５４−７６５９，１９９４)。或いは変性剤なしでも疎水化多糖類と抗原とを５０−６０℃で混合するだけでも製造可能である。このようにして得られた疎水化多糖類と抗原との複合体は、そのまま本発明のワクチン製剤として用いることができるが、必要に応じて常法に従ってろ過滅菌等の操作を施すことも可能である。
【００７４】
（疎水化多糖類と抗原との複合体による免疫）
本発明により製造可能なワクチン製剤は、他の公知のワクチン製剤等と同様に、その所定量を動物に投与することによって該動物を免疫することができ、同様にしてワクチン製剤の力価を評価することができる。本発明のワクチン製剤の投与経路は皮下または皮内注射が一般的である。免疫感作に必要な本発明のワクチン製剤の投与量は適宜決定できるが、例えば、通常投与量としては抗原として５０〜１５００μｇ／回程度好ましくは１００〜６００μｇ／回の量を目安とし、投与は３〜３０回行うのが適当である。また、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＣｐＧやＯＫ−４３２のごとき免疫賦活剤を併用することも効果的である。
【００７５】
なお、本発明のワクチン製剤を製剤化する際には、それ自体公知の通常使用され得る製剤、担体及び希釈剤を、採用される投与経路にしたがって適宜使用することができる。
【００７６】
（リコンビナント抗原の製造）
組換え大腸菌の調製は一般的なプラスミドにＣＴＡのＤＮＡを組み込むことで達成される。ＣＴＡのＤＮＡ配列は公知であり（米国特許第５３４２７７４号等）、バイオ製造業者にとって容易に達成できる。
【００７７】
（抗原のスルホ化）
システイン残基の修飾法の１例として、スルホ化を例として説明する。
【００７８】
本発明において、分子中にシステイン残基を２個以上有する癌特異的タンパク質抗原のスルホ化に際しては、例えば、スルホ化条件として、８Ｍ 尿素または６Ｍグアニジン存在下、３０−３０００ｍＭ（好ましくは２００−５００ｍＭ）の亜硫酸ナトリウム、６−６００ｍＭ（好ましくは３０−１００ｍＭ）のテトラチオン酸を１０〜５０℃で作用させることが好ましい。
【００７９】
（スルホ化タンパク抗原の純度確認方法）
スルホ化したタンパク抗原の純度は逆相HPLCまたは電気泳動でチェックすることが出来る。この安定性は、例えば中性緩衝液中で６０℃、１０分間加熱しても電気泳動で１バンドであることで確認できる。スルホ化保護をしていない場合には重合体・多量体と考えられる高分子のバンドが増加してくる。（後述実施例 に対応する電気泳動パターンを参照）
【００８０】
スルホ化以外にも、グルタチオン化などシステインのーSH基を可逆的に修飾することができる方法は利用可能である。
【００８１】
（疎水化多糖類への包埋方法）
包埋方法の１例として、CHPを用いる場合について説明する。
ＣＨＰに包埋させる方法は、それ自体は既に公知の方法（例えば、ＷＯ９８／０６５０公報）を使用することができる。この包埋方法の概略は、６〜８M尿素または６Mグアニジンなどの変性剤溶液にCHPを溶解させ、もしくはCHPを水または緩衝剤溶液に溶解させて、タンパク質１に対して重量比１０-２０倍量のCHPを混合し、限外ろ過またはゲルろ過などの方法で製剤処方緩衝液に交換し、必要に応じて無菌ろ過処理する方法である。GHPの溶解は常温で十分であるが、加温下に行っても差し支えない。CHPの分子量は、５０−１００ｋｄが望ましい。また、ＣＨＰは、例えば日本油脂株式会社から市販されている。
【００８２】
リポソームやイスコマトリックスとの複合体化については前述の文献などを参照すれば、当業者にとっては容易に実施することが可能である。
【００８３】
（複合体の粒度分布の測定）
本発明の疎水化多糖類（A）と、タンパク抗原（B）との複合体の粒度分布は粒度分布計（DRI）を用いて確認することが出来る。（実施例 図８参照）
【００８４】
（包埋されたことの確認）
包埋は、ＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー；例えば、後述する「ＣＨＰ包埋化」の記載を参照）によりチェックすることができる。ＧＰＣチャートにおいて、ＣＨＰおよび癌特異的抗原タンパク質それぞれのピークが、包埋により完全にＣＨＰピークの位置に移動することで、この「包埋」を確認することが出来る。本発明において、この「包埋」の収率は９５%以上であることが望ましく、更には９９％以上が好ましい。
【００８５】
（好適な「コレステリル多糖−抗原分子」の組合せスクリーニング）
上記したような包埋の確認方法（ＧＰＣ）を利用して、本発明において「コレステリル多糖−抗原分子」の組合せを探索するためのスクリーニングテストに使用することができる。このようなスクリーニングにおいては、「包埋」の収率を求めることができる。本発明においては、この「包埋」の収率は９５%以上であることが望ましく、更には９９％以上が好ましい。
【００８６】
（包埋後の抗原活性）
包埋後の抗原活性を検定する方法は種々あり得るが、例えばin vitroで、抗原提示細胞とキラーまたはヘルパーT細胞を組み合わせた実験系で測定できる。すなわち、包埋タンパク質抗原を例えば樹状細胞などの抗原提示細胞に取り込ませ、その抗原提示細胞によるキラーT細胞の活性化を、インターフェロンγを測定対象とするELISA法（Enzyme-linked immunosorbent assay）やＥＬＩＳＰＯＴ法（Enzyme-linked-ImmunoSPOT）で確認することができる。こうした実験系では、抗原活性を観測することが可能である。
【００８７】
（ワクチン）
本発明の包埋タンパク質抗原は、ワクチンとして使用することができる。このワクチンは、いわゆる「抗原医薬」であるため、通常は、いわゆる「抗体医薬」より、一桁以上少ない量で免疫の効果を得ることができる。
【００８８】
（好適なワクチンの態様）
本発明において、好適なワクチンの態様は、以下の通りである。
（１）組換え大腸菌を用いて発現される組み換え癌特異的タンパク質抗原(以下「ＳＨ抗原」という)に亜硫酸塩、テトラチオン酸塩を作用させて得られるスルホ化組み換え癌特異的タンパク質抗原（以下「スルホ化抗原」という）を精製し、スルホ化リコンビナント精巣抗原を疎水化多糖類に包埋させたＣＨＰ−スルホ化抗原ワクチン。
【００８９】
（２）上記（１）のスルホ化組換え癌精巣抗原を還元したＣＨＰ−ＳＨ抗原ワクチン。
【００９０】
（３）上記（１）または（２）の組換え癌特異的タンパク質抗原が、ＭＡＧＥ−Ａｌ，ＭＡＧＥ−Ａ２，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＡＧＥ−Ａ４，ＭＡＧＥ−Ａ５，ＭＡＧＥ−Ａ６，ＭＡＧＥ−Ａ７，ＭＡＧＥ−Ａ８，ＭＡＧＥ−Ａ９，ＭＡＧＥ−Ａ１０，ＭＡＧＥ−Ａ１１，ＭＡＧＥ−Ａ１２，ＭＡＧＥ−Ｂ１，ＭＡＧＥ−Ｂ２，ＭＡＧＥ−Ｂ３，ＭＡＧＥ−Ｂ４，ＭＡＧＥ−Ｃ１，ＭＡＧＥ−Ｃ２のＭＡＧＥファミリーから１ないし複数選択されたＣＴＡであるＣＨＰ−ＣＴＡ スルホ化抗原ワクチンまたはその還元体であるＣＨＰ−ＣＴＡ SH抗原ワクチン。
【００９１】
（４）上記（１）または（２）のリコンビナント精巣抗原が、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ ファミリー、ＧＡＧＥ ファミリー、ＳＡＧＥ ファミリー、ＸＡＧＥ ファミリーから１ないし複数選択されたＣＴＡであるＣＨＰ−ＣＴＡ スルホ化抗原ワクチンまたはその還元体であるＣＨＰ−ＣＴＡ SH抗原ワクチン。
【００９２】
（５）上記（１）または（２）のリコンビナント癌精巣抗原が、Ｈｉｓ−Ｔａｇを付加したＨｉｓ−Ｔａｇ−ＣＴＡであるＣＨＰ−Ｈｉｓ Ｔａｇ ＣＴＡ スルホ化抗原ワクチンまたはＣＨＰ− Ｈｉｓ Ｔａｇ ＣＴＡ SH抗原ワクチン。
【００９３】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００９４】
製造例１
（１）Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４の組み込みとシードストックの調製
下記配列：
Forward primer: ５’-GGATCCATGTCTTCTGAGCAGAAGAGT-３’
Reverse primer: ５’-AAGCTTCTCATGCTCAGACTCCCTC-３’
【００９５】
をプライマーとして、メラノーマ細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−３７由来のRNAに対してＲＴ−ＰＣＲを実施し、その結果、両端にＢａｍＨＩ部位（ＧＧＡＴＣＣ）および ＨｉｎｄＩＩＩ部位（ＡＡＧＣＴＴ）を有するＭＡＧＥ−Ａ４の全長ｃＤＮＡを得た（米国コーネル大学医学部のDr. Yao-Tseng Chenにより実施）
【００９６】
このｃ-ＤＮＡをＨｉｓ−Ｔａｇ融合タンパク質発現用のｐＱＥ９ベクター（キアゲン）に組み込み、ｐＱＥ９／ＭＡＧＥ−Ａ４プラスミドを得た（米国コーネル大学医学部のDr. Yao-Tseng Chenにより実施）。これをＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ Ｍ１５ ［ｐＲＥＰ４］（キアゲン）に導入した菌株をＤｒ．Ｋｕｚｕｓｈｉｍａ（愛知県がんセンター）より提供を受けた。
【００９７】
発現が確認された形質転換株について、培養プレート上のシングルコロニーを採取して５０ｍＬのＬＢ（２５ μｇ／ｍｌ カナマイシンおよび１００ μｇ／ｍｌ アンピシリンを含む）培地に接種し１６時間培養した。菌体を集めて培地を抗生物質を含まないＬＢ培地に交換した後、終濃度２０％となるようグリセロールを添加し−８０℃で保存した（シードストック）。このシードストックを抗生物質(２５ug/mL カナマイシン, １００ug/mL アンピシリン)含有LB培地に接種し培養を行い、培養後遠心分離にて抗生物質含有培地を除去し，抗生物質不含ＬＢ培地で洗浄し培地交換した後，４０%グリセロール水溶液と等量で混合し-８０℃に保存，MCBとした。
【００９８】
（２）培養
抗生物質不含LB培地 １０Lに対してＭＡＧＥ−Ａ４MCB を５ mL接種した。３７℃、２５０rpm、１vvmで６-１５時間前培養を行い、LB培地２００Lに対して前培養液を１０L接種し、３０℃、６０rpm、１vvmで培養を開始した。OD６００が約１になったらIPTGを終濃度０.３mmol/Lで添加し、誘導を開始し、DO制御は攪拌により約６０％（約４.５ppm）以上に保持して、誘導開始から５hr後、培養を終了した。
【００９９】
（３）菌体回収と菌体破砕
デュラポア PVDF GVPP ０.２２μm（Vスクリーン）０.５ m2の平膜（Millipore）を用いて、使用菌体濃縮（約６-１０倍）後、同量の２０mmol/L Tris-HCl（pH８.０）バッファーを３回以上添加し、菌体洗浄を行い、菌体を湿重量で８００g、２０Lの菌体スラリー液を得た。菌体は冷蔵または冷凍で保存した。
【０１００】
解凍した菌体に２０mM Tris-HCl ( pH ８．０ )１２L を加えて懸濁させて菌体スラリー液を調製し、高圧ホモジナイザーを用いて１０,０００ psiにて透明になるまで破砕した。ゼーター電位フィルター キュノ バイオキャップ２０００ ( ６０M/１２０M ２７００cm2 )（Cuno）および 除菌フィルター ステラシェア （ ０.２μm、１０i nch ８６００cm2 ）（Cuno） を 直列に接続し ≦０.３９L/min （ 上記 フィルター １set 当り ）で破砕液をろ過して、デブリスを除去し清澄化した。
【０１０１】
図１に得られた破砕液上清の電気泳動パターンを示す。
【０１０２】
図１（菌体破砕のパス回数と可溶化）は、ＭＡＧＥ−Ａ４組換え大腸菌を培養して得られる菌体破砕液の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで破砕液上清にＭＡＧＥ−Ａ４が存在することを示す。
【０１０３】
図１中の記号の意味は、以下の通りである。
Ｍ： 分子量マーカー； ＰＣ： 陽性対照； ＣＳ： 培養上清； Ｓ： 上清； Ｐ： 沈殿
【０１０４】
製造例２
（アフィニティカラムクロマト）
Ni-NTAカラム（QIAGEN Ni-NT agarose、２５cm径、約４L）を用いて破砕ろ液からＭＡＧＥ−Ａ４たん白を分離した。次の通りステップ溶出にて実施する。 ( 流速５６cm/h )
【０１０５】
【表１】
【０１０６】
溶出開始後、A２８０のピークを分取した。
【０１０７】
得られた溶出液の電気泳動パターンを図２に示す。
【０１０８】
図２はＨｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４発現大腸菌の菌破砕液とそれをＮｉ−ＮＴＡアフィニティカラムで粗精製した画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、１回の精製で９５％以上の純度のＭＡＧＥ−Ａ４が得られることを示す。
【０１０９】
ミリポア ペリコン２ ウルトラセルPLCGC １０Ｋ ０.１m2 × １枚の平膜（Millipore）を用いてNi-NTAカラム溶出プール液を約５mg/mLまで濃縮し、濃縮後８倍量以上の２０mM Tris-HCl ( pH ８．０)にてバッファー交換を行い、イミダゾールを除去した。
【０１１０】
実施例１
上記濃縮液に終濃度 ８Mになるように 尿素を添加２０mM Tris-HCl (pH ８．０) を用いてメスアップしながら溶解した後、終濃度で６０mMテトラチオン酸二水和物と３００mM亜硫酸ナトリウム を順に加え 室温で一晩撹拌した。反応液を１０mM リン酸ナトリウムバッファー ８mol/L 尿素（pH ８.０）で平衡化したSephadex G-２５ Coarse（GEヘルスケア） ２５cm径 約１２Lに通してバッファーを交換した。
【０１１１】
実施例２
実施例１の反応を８Ｍ尿素の代わりに６Ｍグアニジン存在下でも行ってみた。
結果は、図３（粗精製Ｈｉｓ−Ｔａｇ ＭＡＧＥ−Ａ４とそのスルホ化保護体の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に示すように８Ｍ尿素の場合も６Ｍグアニジンの場合も一つのバンド（４９ｋｄ）に収束した。
【０１１２】
実施例３
実施例１で得た「粗精製Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４」を用いて、以下の実施例３〜実施例８の実験を行った。
【０１１３】
図３は粗精製Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４とそのスルホ化保護体の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで保護反応前の粗精製ＭＡＧＥ−Ａ４が非還元状態では多量体（６０−１１０ｋｄ）や構造異性体（３８−４８ｋｄ）の集合であることを示すとともに、スルホ化保護反応をすることによって一つのバンド（４９ｋｄ）に収束することを示す。
【０１１４】
これはＳＨ体と考えられるバンド（４５ｋｄ）よりも僅かに大きな分子容積となっている。この保護体はＨ2Ｏ2による酸化で変化する傾向が見られたが、熱や凍結融解には未保護のＨｉｓ−Ｔａｇ ＭＡＧＥ−Ａ４と比べて安定であることが示された（図４）。
【０１１５】
図４（粗精製Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４とそのスルホ化保護体の過酷条件で処理したときの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、保護する前には加熱によって高分子化凝集するのに対してスルホ化保護体が熱や凍結融解に安定であることを示す。
【０１１６】
実施例４
（陰イオンクロマト）
１０mM リン酸ナトリウムバッファー ８mol/L 尿素（pH ８.０）で平衡化したDEAE Sepharose Fast Flow １３cm径 約２L（GEヘルスケア）にてさらに精製した。カラム操作は以下の通り、グラジエント溶出で行った。流速は、アプライおよび洗浄２５cm/h、その他７５cm/hにて実施した。
【０１１７】
【表２】
【０１１８】
実施例５
（ハイドロキシアパタイトカラムクロマト）
ペリコン２ ウルトラセルPLCGC １０Ｋ ０.１m2×１枚の平膜（Millipore）を用いてDEAE溶出プール液を約３mg/mLまで濃縮し、濃縮後 ６倍量以上の１/２ D-PBS ８mol/L 尿素にてバッファー交換脱塩を行った。これを１/２ D-PBS ８mol/L 尿素 で平衡化したHA ULTROGEL １０cm径 約３L （ポール）に載せ更に精製した。
【０１１９】
クロマトの条件は、次の通りグラジエント溶出にて実施した。流速は、平衡化から溶出２５cm/h、その他４０cm/hにて実施した。
【０１２０】
【表３】
【０１２１】
菌体破砕液上清（総タンパク量５７g）からの各精製ステップでの不純物プロファイルを下記の表に示す。Ｎｉ−ＮＴＡ粗精製タンパクから効率的にエンドトキシン、宿主由来タンパク、ＤＮＡなどの不純物が除去されていることが示された。
【０１２２】
【表４】
【０１２３】
実施例６
（ＣＨＰ包埋化）
こうして得られたスルホ化保護Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４に重量比１２倍のＣＨＰ ６０Ｔまたは１００Ｔ（日本油脂社製）を６Ｍ尿素存在下、または６Ｍ尿素＋２‐メルカプトエタノール（２ＭＥ）存在下に混合した。これを一度緩衝液で希釈した後、限外ろ過によって濃縮・希釈を繰り返すことによって緩衝液交換とともに過剰の試薬を除去した。得られた原液を無菌ろ過した後にバイアルに分注しワクチン製剤とした。
【０１２４】
得られた「ＣＨＰとタンパク質を混合した直後のＳＥ−ＨＰＬＣチャート」において、ＵＶ（２８０ｎｍ）検出で９．７分に現れるタンパク質ピークは認められず、ＣＨＰのピークに一致して６．５分に移動した。１４．１分のピークは尿素のピークであった。
【０１２５】
他方、希釈・濃縮によって緩衝液を交換（尿素の除去）後の「ＳＥ−ＨＰＬＣチャート」においては、１４．１分の尿素ピークが消え、６．５分のＣＨＰ−Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４ピークが認められた。
【０１２６】
実施例７
（ワクチン効果の確認）
こうして得られたＣＨＰ−Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４ワクチンの免疫活性を以下のようにＥＬＩＳＰＯＴ法を用いて確認した。
【０１２７】
Ｄａｙ−７にＨＬＡ−Ａ２４陽性健常人ドナーより末梢血を採取し、抗ＣＤ１４抗体をコートしたマグネットビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いてＣＤ１４陽性単球細胞を分離し、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４の存在下で培養した。これらCD１４陽性単球細胞は培養中に樹状細胞に分化するが、Ｄａｙ １にこれらを回収し、１×１０6 個／ｍＬの濃度になるように培地に懸濁した。
【０１２８】
この樹状細胞にＣＨＰ−Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４ （７．５〜１１ μｇ 蛋白質／ｍＬ）， ＣＨＰ−Ｈｉｓ−Ｔａｇ−Ｈｅｒ２ （２０ μｇ 蛋白質／ｍＬ）またはＭＡＧＥ−Ａ４由来ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド（ｐ１４３， １０ μｇ／ｍＬ）を添加し、３７°Ｃ、５％ ＣＯ２で３時間インキュベートした。 これらの細胞を新しい培地で洗浄した後、あらかじめ抗ヒトＩＦＮ−γ抗体をコートして１０％ ウシ胎児血清含有培地でブロックしたＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア）に５×１０4 個／ウェルの濃度で播種した。これに様々な濃度のＭＡＧＥ−Ａ４−CTLクローン２−２８（Ｒｅｆ． Ｍｉｙａｈａｒａ Ｙ．ら、 Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００５ １１（１５）：５５８１−９．）を添加し、 ３７°Ｃ、５％ ＣＯ２で培養した。
【０１２９】
２４時間後に０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ビオチン化抗ヒトＩＦＮ−γ抗体を添加して４℃で一晩インキュベートした。０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで洗浄後、ストレプトアビジン標識アルカリフォスファターゼを加え、室温で１時間半反応させた。さらに０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで洗浄後、アルカリフォスファターゼ用の発色基質（バイオラッド）を添加し、発色反応を数分間行った。プレートを蒸留水で洗浄して発色反応を停止し、得られたＩＦＮ−γ特異的スポットをカウントした。
【０１３０】
得られた結果を、図６、図７に示す。図６、７において、ＣＨＰ-Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４投与群では陰性対照（Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔまたはＣＨＰ−Ｈｉｓ−Ｔａｇ−Ｈｅｒ２投与群）に比べてより多くのIFN−γスポットが認められ、ＣＨＰ−Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４が樹状細胞に取り込まれてCTLを活性化させていることが確認された。
【０１３１】
実施例８
（サイズ分布の測定）
包埋生成物のサイズ分布を測定した。測定条件は、以下の表５に示す通りである。
【０１３２】
【表５】
【０１３３】
測定結果を、図８のグラフに示す。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図１はＭＡＧＥ−Ａ４組換え大腸菌を培養して得られる菌体破砕液の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで破砕液上清にＭＡＧＥ−Ａ４が存在することを示す。
【図２】図２はＨｉｓ−Ｔａｇ-ＭＡＧＥ−Ａ４発現大腸菌の菌破砕液とそれをＮｉ−アフィニティカラムで粗画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、１回の精製で９５％以上の純度のＭＡＧＥ−Ａ４が得られることを示す。
【図３】図３は粗精製Ｈｉｓ−Ｔａｇ-ＭＡＧＥ−Ａ４とそのスルホ化保護体の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。保護反応前の粗精製ＭＡＧＥ−Ａ４が非還元状態では多量体（６０−１１０ｋｄ）や構造異性体（３８−４８ｋｄ）の集合であることを示すとともにスルホ化保護反応をすることによって一つのバンド（４９ｋｄ）に収束することを示す。
【図４】図４は粗精製Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４とそのスルホ化保護体の過酷条件で処理したときの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。図４は、保護する前には加熱によって高分子化凝集するのに対してスルホ化保護体が熱や凍結融解に安定であることを示す。
【図５】ＤＥＡＥカラムによる精製チャートである。ここで溶出ピークが２本認められたが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，ＲＰＣでは区別がつかず、コンフォメーションの違いによるものと推測された。
【図６】ＣＨＰ−Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイ結果を示すチャートである。Negative Control（Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔ，ＣＨＰ−Ｈｅｒ２）に比べて有意に多くのＩＮＦ−γスポットが認められ、ＣＨＰ−ＭＡＧＥがＤＣに取り込まれてＣＴＬを活性化させていることが確認された。
【図７】ＣＨＰ−ＭＡＧＥ−Ａ４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイ結果を示すチャートである。Negative Control（Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔ，ＣＨＰ−Ｈｅｒ２）に比べて有意に多くのIFN−γスポットが認められ、ＣＨＰ−Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４が樹状細胞に取り込まれてＣＴＬを活性化させていることが確認された。
【図８】表２に示した、包埋生成物のサイズ分布（定ピーク強度による）を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質複合体およびその製造方法、より詳しくは抗癌タンパク質ワクチンのタンパク質抗原およびその製造方法に関する。本発明は、分子中に２個以上のシステイン残基を有する抗癌タンパク質ワクチンの癌特異的タンパク質抗原およびその製造方法に特に好適に適用可能である。一つの態様において、本発明は、例えば、癌精巣抗原（ＣＴＡ）のごとく分子中に２個以上のシステイン残基を有する抗癌タンパク質ワクチンの癌特異的タンパク質抗原のシステイン残基を酸化的スルホ化することにより保護して、効率よく精製する製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、分子中にシステイン残基を２個以上有するタンパク質について、特に制限なく適用することが可能であるが、説明の便宜のため、上記した癌精巣抗原（ＣＴＡ）に関連する背景技術について、先ず説明する。
【０００３】
癌細胞に特異的に発現する抗原を患者の細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が認識して攻撃するらしいことが知られ、メラノーマ癌細胞株からＭＡＧＥ-Ａ１抗原の遺伝子配列がGene Transfection Approachによって初めて同定された（非特許文献１；van der Bruggen P, et al., Science; ２５４:１６４３-７(１９９１)）。このＭＡＧＥ−Ａ１遺伝子に由来するプローブを含むコスミドでDNAライブラリに対してハイブリダイズすることによって、新たに１１種の密接に関連したMAGE ファミリーが同定された。（非特許文献２；De Plaen E，et al.，Immunogenetics；４０：３６０−９（１９９４））。これらの１２種のＭＡＧＥ−Ａ遺伝子の局在はＸ染色体のｑ２８領域に同定された（非特許文献３；Rogner UC，et al.，Genomics．２９：７２５−３１（１９９５））。
【０００４】
その後も癌精巣抗原（CTA）はSEREX法（例えばSahin, U.ら (１９９５) Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９２, １１８１０-３、 Chen YTら（１９９７）Proc Natl Acad Sci U S A.;９４:１９１４-８、 Tureci Oら（１９９６）Cancer Res. ５６:４７６６-７２を参照）等によって引き続き発見された。これらのCTAの多くは正常細胞では精巣細胞内にしか存在せず、癌細胞に高頻度で発現することが明らかになった。こうした性質からＣＴＡは、癌ワクチンの理想的な標的抗原といわれている。実際、CTLがこのＣＴＡ陽性細胞を認識するエピトープ（８−１０残基のアミノ酸よりなるオリゴペプチド）を抗原としたペプチドワクチンの開発がこれまで数多くなされている。
【０００５】
しかしながら、CTLだけを活性化させてもワクチン効果としては不充分であることが多く、更にはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）のタイプによってその認識エピトープは異なるため、ペプチドワクチンの臨床応用には限界があると考えられている。これに対して、CTAの全長もしくは部分長を抗原とするタンパク質性ワクチンでは、抗原中にCTLの認識エピトープだけでなくヘルパーＴ細胞の認識エピトープも含むことにより様々なタイプのＴ細胞を同時に活性化でき、また、異なるＨＬＡに対応する認識エピトープも複数含む、いわゆる多価性ワクチンとして機能し得ることが知られている。
【０００６】
タンパク質性ワクチンでは、癌特異的抗原の抗原提示細胞（例えば樹状細胞）への効率的な送達を図るため、あるいは癌特異的抗原の安定化を図るために、癌特異的抗原をリポソーム等の高分子キャリアに包埋して用いることがある。そうした高分子キャリアの一種として、プルランなどの多糖類にコレステロールなどの疎水性基を付加して得られる疎水化多糖類（例えばＣＨＰ）の会合体がある。ＣＨＰは、これに癌特異的抗原全体を包埋させることによって、抗原提示細胞に抗原提示させやすくする性質を有し、しかもＣＨＰ内にて癌特異的抗原を保護することで製剤としての安定性を向上させる効果も有する。（特許文献１；ＷＯ９８／０９６５０号公報）このような高分子キャリアとしては、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸアジュバントも知られている。（特許文献X；WO２００５０３２４７５）
【０００７】
包埋剤となる高分子キャリアとしては、周知のもの、たとえばリポソームやイスコマトリックスも含まれる。
【０００８】
リポソームはこのような目的には一般的に使われるもので当業者には周知のものであり、リン脂質とそれ以外のコレステロールや様々な物質と組み合わせたり、また抗体や磁性粒子などを用いて目的とする標的部位に集中する機能を付与してDDSシステムに使われているが、たとえば白血病細胞のブタノール抽出物を含むワクチン（Shibata R.ら、(１９９１年)Int J Cancer. May ３０; ４８(３):４３４-４２）や膜タンパクからのワクチン(Sunamoto J.ら、(１９９０年)Ann NY Acad Sci.６１３:１１６-２７)を参照することができる。
【０００９】
イスコマトリックスもがん抗原を包埋してワクチンにすることができる公知の物質で、サポニン、コレステロールおよびリン脂質から構成されている。オーストラリアのＣＳＬ社で開発が進められていて既に臨床試験の報告が出されている。(たとえば、Butts C.ら、(２００５年) J Clin Oncol. ２０;２３(２７):６６７４-８１や、North S.ら、(２００５年) Expert Rev Vaccines. ４(３)：２４９-５７、Davis D.ら、(２００４年) P Natul Acad Sci.１０１(２９)１０６９７ を参照することができる。)
【００１０】
上記ＣＴＡなどの癌特異的抗原は組換え大腸菌によって発現させて製造することが出来るが、医薬品としてのグレードの品質を確保するためには、通常は、いくつかの精製工程を経ることが必要となる。Ｈｉｓ−Ｔａｇと呼ばれる、ヒスチジンが複数個並んだ配列で金属イオンとキレートを形成するタグを癌特異的タンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加し、ニッケルイオンの固定化カラムを用いて癌特異的タンパク質をアフィニティー精製することが多い。(Skerra A.ら、Biotechnology (１９９１年)Mar;９(３)２７３-８やCrowe J ら、Methods Mol Biol. （１９９４年）;３１:３７１-３８７.参照)しかしながら、ＣＴＡ等癌特異的抗原タンパクにはシステインのチオール（−ＳＨ）基が配列の中に複数存在することが多く、タンパク質分子間でジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）結合して多量体を形成する傾向がある。
【００１１】
一部のタンパク質では、リフォールディング操作によって分子内架橋させることで性状改善、すなわち単量体化を図り、純度の良いタンパク質として精製することが出来る。しかし、ＣＴＡ等癌特異的抗原タンパクでは分子内ジスルフィド結合を形成し難く、リフォールディング操作によっても単量体が得られにくい傾向にある。このため、ＣＴＡ等癌特異的抗原タンパクを精製するに際しては、下記のような種々の問題点がある。
【００１２】
（１）システインを含むタンパクは精製工程中に濃縮されると分子間スルフィド結合によって縮合が進み、多量体を形成して収率が低下してしまう。
【００１３】
（２）チオール基を有するタンパク質は、一般に不安定で、医薬品として使用する場合には品質安定性上にも課題がある。
【００１４】
（３）ワクチン製剤のタンパク抗原の場合、チオール基を保護して精製しようとする時、抗原提示されるエピトープのチオール基が復元されなくてはならない。（即ち可逆的保護でなくてはならない。）
【００１５】
ＮＹ−ＥＳＯ−１というＣＴＡを抗原としたワクチンの製造では、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは多量体の割合をコントロールできず、還元ＳＤＳでのみ品質管理を行い、８Ｍ尿素で変性させたまま原薬としている（非特許文献４；Preparative Biochem & Biotech，３５：１１９−１３４，２００５）。しかし、製剤化の段階で尿素を除去する必要があり、恐らくこの操作で多量体形成が再発するために、キャリアであるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸアジュバントに包含すると普通のタンパク質では４０ｎｍのナノ粒子になるところをＮＹ−ＥＳＯ−１の場合には２０００ｎｍの巨大な凝集体になったとの報告（非特許文献５；Clin Cancer Res，１０：２８７９−２８９０，２００４）がある。
【００１６】
上記した問題を解決する試みとして、ＭＡＧＥ−Ａ３というＣＴＡに２−メルカプトエタノールで還元した後にヨウ化アセトアミドを作用させてカルボキシメチル化によってチオール基をブロック保護する方法が考案された（特許文献２；ＷＯ９９／４０１８８公報）。このようなチオール基を選択的に保護する方法として、ヨード酢酸やヨウ化アセトアミドなどによるカルボキシメチル化が一般に行われている。しかしながら、この方法では非可逆的にチオール基をブロックしてしまうためシステインを含むタンパク抗原エピトープの場合には同エピトープを失活させてしまう欠点を有する。
【００１７】
また、大腸菌を宿主としたシステイン含有組み換えたんぱく質の製造にはＲＥＤＯＸ試薬（グルタチオン-グルタチオン酸化体或いはシステイン-システイン等）による再構成（リフォールディング）が必要とされるが、ある種のタンパク質、例えば、GM-CSF（非特許文献６；Behring Inst Mitt．１９８８ Ａｕｇ；（８３）：２４６−９）やインスリン（非特許文献７；J Biol Chem．１９９２ Ｊａｎ ５；２６７（１）：４１９−２５、非特許文献８；Anal Chem．１９９２ Ｍａｒ １；６４（５）：５０７−１１）の製造などでは亜硫酸ナトリウムとテトラチオン酸ナトリウムを作用させてスルフィド（−ＳＨ）基をスルホ（−ＳＳＯ３）化して精製した後にリフォールディングするという方法も報告されている。
【００１８】
スルホ化は免疫グロブリンなどに用いられて当業者には周知の方法である。(例えば、乾燥スルホ化人免疫グロブリン献血ベニロンーI 添付文書参照)
【００１９】
【特許文献１】ＷＯ９８／０９６５０号公報
【特許文献２】ＷＯ９９／４０１８８公報
【００２０】
【非特許文献１】van der Bruggen P，et al.，Science；２５４：１６４３−７（１９９１）
【非特許文献２】De Plaen E，et al.，Immunogenetics；４０：３６０−９（１９９４）
【非特許文献３】Rogner UC，et al.，Genomics．２９：７２５−３１（１９９５）
【００２１】
【非特許文献４】Preparative Biochem & Biotech，３５：１１９−１３４，２００５
【非特許文献５】Clin Cancer Res，１０：２８７９−２８９０，２００４
【非特許文献６】Behring Inst Mitt．１９８８ Ａｕｇ；（８３）：２４６−９
【００２２】
【非特許文献７】J Biol Chem．１９９２ Ｊａｎ ５；２６７（１）：４１９−２５
【非特許文献８】Anal Chem．１９９２ Ｍａｒ １；６４（５）：５０７−１１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明の目的は、上記した従来技術の欠点を解消したタンパク質複合体およびその製造方法を提供することにある。
【００２４】
本発明の目的は、さらに詳しくは、タンパク質抗原の分子間ジスルフィド結合形成による凝集を生じせしめることなく高収率で精製し、複合体を形成するタンパク質抗原の複合体の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明者は鋭意研究の結果、分子中にシステイン残基を２個以上有するタンパク質のチオール基をスルホ化してからカラムクロマトグラフィー等の方法によって単量体を維持しつつ精製し、しかる後に、疎水化多糖類等の微粒子形成物質と複合体を形成させ、さらに必要なら複合体中のスルホ化タンパク質を還元することで上記目的を達成できることを見い出した。
【００２６】
本発明のタンパク質複合体の製造方法は、上記知見に基づくものであり、より詳しくは、分子中にシステイン残基を２個以上有するタンパク質を包埋剤と複合体化させるタンパク質包埋剤複合体の製造方法であって；前記包埋剤への包埋の前に、前記タンパク質のシステイン残基を修飾して精製することを特徴とするものである。
【００２７】
本発明によれば、分子中にシステイン残基を２個以上有するＣＴＡ等癌特異的タンパク質抗原を安定な単量体として高収率で得ることが出来る。
【００２８】
本発明によれば、更に、疎水化多糖類等高分子キャリアに包埋させる前または後に還元して、タンパク質分子間のジスルフィド結合を形成することなくスルホ化リコンビナント癌特異的タンパク質抗原のチオール基を復元させることが出来る。
【００２９】
本発明者の知見によれば、本発明において、分子中にシステイン残基を２個以上有する癌特異的タンパク質抗原を、酸化的スルホ化することにより、該癌特異的タンパク質抗原が安定化されて、該タンパク質抗原の分子間結合形成が効果的に防止され、これにより、タンパク質抗原単量体を収率高く精製することが可能となるものと推定される。
【００３０】
これに対して従来のＣＴＡ（タンパク質抗原の一種）等の癌特異的抗原の精製方法においては、本発明者の知見によれば、多くの癌特異的抗原が奇数個のシステイン残基を含んでおり、これらシステインは分子内ジスルフィド結合を形成せずチオール基のままで存在しているか、または分子間でジスルフィド結合を形成してCTAの多量体形成に寄与しているものが一定量存在するため、このようなチオール基の存在が癌特異的抗原の収率の良い精製を阻害していたものと推定される。
【００３１】
本発明は、ＥｒｂＢ−２タンパク質などの癌遺伝子産物および腫瘍血管の抗原タンパク質（VEGFR）などにも適用可能である。
【００３２】
本発明は、例えば、以下の態様を含む。
【００３３】
［１］ 分子中にシステイン残基を２個以上有するタンパク質を包埋剤と複合体化させるタンパク質包埋剤複合体の製造方法であって；
【００３４】
前記包埋剤への包埋の前に、前記タンパク質のシステイン残基を修飾して精製することを特徴とするタンパク質複合体の製造方法。
【００３５】
［２］ 前記包埋剤が疎水化多糖類である［１］に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【００３６】
［３］ 前記包埋剤がリポソームである［１］に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【００３７】
［４］ 前記包埋剤がイスコマトリックスである［１］に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【００３８】
［５］ 前記修飾が可逆的である［１］〜［４］のいずれかに記載のタンパク質複合体の製造方法。
【００３９】
［６］ 前記修飾がスルホ化である［１］〜［４］のいずれかに記載のタンパク質複合体の製造方法。
【００４０】
［７］ 前記タンパク質が、癌精巣抗原（ＣＴＡ）である［１］〜［６］のいずれかに記載のタンパク質複合体の製造方法。
【００４１】
［８］ 前記癌精巣抗原（ＣＴＡ）が、組換え大腸菌を用いて発現されるリコンビナント精巣抗原である［７］に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【００４２】
［９］ 前記タンパク質の精製後、包埋剤との複合体化の前に精製したタンパク質をスルフィド結合還元剤で還元する工程を含む［１］に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【００４３】
［１０］ 前記タンパク質を包埋剤と複合体化させた後複合体をスルフィド結合還元剤で還元する工程を含む［１］に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【００４４】
［１１］ 前記修飾をタンパク質にチオ硫酸塩とテトラチオン酸塩を作用させて、該タンパク質のチオール基をスルホ化させて保護する［６］に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【００４５】
［１２］ 前記精製をクロマトグラフィーで行う［１］に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【００４６】
［１３］ 疎水化多糖類（Ａ）と、これに包埋された、分子中にシステイン残基を２個以上有するスルホ化リコンビナント精巣抗原（Ｂ）とを少なくとも含むことを特徴とする包埋タンパク質抗原。
【００４７】
［１４］ 前記スルホ化リコンビナント精巣抗原が還元されてなる［１３］に記載の包埋タンパク質抗原。
【００４８】
［１５］ 疎水化多糖類（Ａ）と、これに包埋されたスルホ化リコンビナント精巣抗原（ＣＴＡ）とを少なくとも含むことを特徴とするＣＨＰ−ＣＴＡワクチン。
【００４９】
［１６］ 前記スルホ化リコンビナント精巣抗原が、還元されたスルホ化リコンビナント精巣抗原（ＣＴＡ ＳＨ）である［１５］に記載のＣＨＰ−ＣＴＡワクチン。
【００５０】
［１７］ 前記リコンビナント精巣抗原が、ＭＡＧＥ Ａｌ，ＭＡＧＥ Ａ２，ＭＡＧＥ Ａ３，ＭＡＧＥ Ａ４，ＭＡＧＥ Ａ５，ＭＡＧＥ Ａ６，ＭＡＧＥ Ａ７，ＭＡＧＥ Ａ８，ＭＡＧＥ Ａ９，ＭＡＧＥ Ａ１０，ＭＡＧＥ Ａ１１，ＭＡＧＥ Ａ１２，ＭＡＧＥ Ｂ１，ＭＡＧＥ Ｂ２，ＭＡＧＥ Ｂ３，ＭＡＧＥ Ｂ４，ＭＡＧＥ Ｃ１，ＭＡＧＥ Ｃ２のＭＡＧＥ ファミリーから１ないし複数選択されたＣＴＡである［１５または１６］に記載のＣＨＰ−ＣＴＡワクチン。
【００５１】
［１８］ 前記リコンビナント精巣抗原が、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ ファミリー、ＧＡＧＥ ファミリー、ＳＡＧＥ ファミリー、ＸＡＧＥ ファミリーから１ないし複数選択されたＣＴＡである［１５または１６］に記載のＣＨＰ−ＣＴＡワクチン。
【００５２】
［１９］ 前記リコンビナント精巣抗原が、Ｈｉｓ−Ｔａｇを付加したＨｉｓ−Ｔａｇ−ＣＴＡである［１５または１６］に記載のＣＨＰ−ＣＴＡワクチン。
【発明の効果】
【００５３】
上述したように本発明によれば、癌特異的タンパク質抗原の重合多量体化を極力抑制しつつ、該タンパク質抗原の好適な精製を可能とする癌特異的タンパク質抗原およびその製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
以下、必要に応じて図面を参照しつつ本発明を更に具体的に説明する。以下の記載において量比を表す「部」および「％」は、特に断らない限り質量基準とする。
【００５５】
（抗癌タンパク質ワクチン）
本発明の抗癌タンパク質ワクチンは、分子中にシステイン残基を２個以上有する癌特異的タンパク質抗原を疎水化多糖類等高分子キャリアに包埋させることによって製剤化される。
【００５６】
（チオール基の復元）
本発明において、タンパク質抗原はスルホ化されたまま疎水化多糖類等に包埋してよいが、疎水化多糖類に包埋する直前に還元してもよく、或いは疎水化多糖類に包埋させた後に還元することが出来る。この還元方法に関しては２mM以上の２-メルカプトエタノール、ジチオスライトール、システインなどを作用することで達成できる。
【００５７】
（高分子キャリア）
本発明において使用すべき高分子キャリアは、リポソーム、疎水化多糖類、イスコマトリックス等癌特異的タンパク抗原の疎水性部分を包埋してナノゲル形成性を有するものである限り、任意の高分子キャリアを特に制限なく使用可能である。
【００５８】
疎水化多糖類（「疎水化多糖類集合体微粒子」を包含する意味で用いる；以下同様）は、例えば、Akiyoshi et al.，Macromolecules，６，ｐｐ．３０６２−３０６８，１９９３; Akiyoshi et al.，J．Proc．Japan．Acad.，７１，７１Ｂ，ｐ．１５，１９９５; 特開昭６１−６９８０１号公報、特開平３−２９２３０１号公報、特開平７−９７３３３号公報等に記載された、それ自体公知の方法で製造することができる。
【００５９】
疎水化多糖類における多糖類は、糖残基がグリコシド結合した高分子である限り、特に限定されない。多糖類を構成する糖残基としては、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フコース等の単糖類、または二糖類またはオリゴ糖類などの糖類に由来する残基を用いることができる。糖残基は１，２−、１，３−、１，４−または１，６−グリコシド結合していてもよく、その結合はα−またはβ−型結合のいずれであってもよい。また、多糖類は直鎖状でも分枝鎖状のいずれでもよい。糖残基としてはグルコース残基が好ましく、多糖類としては、天然または合成由来のプルラン、デキストラン、アミロース、アミロペクチン、又はマンナン、好ましくはマンナンまたはプルランなどが使用可能である。
【００６０】
疎水基は特に制限されず、包埋（ないし封入）される抗原の分子量や等電点に応じて封入率の高いものを選択できる。ワクチン製剤としての安全性の観点から、疎水基としては代謝されて安全な１本鎖及び２本鎖のアルキル基またはステロール残基を１００単糖あたり１〜５個（重量比で５％以下）導入したものが望ましい。
【００６１】
ステロール残基としては、例えば、コレステロール、スチグマステロール、β−シトステロール、ラノステロール、エルゴステロール残基などが挙げられるが、ワクチン製剤としての安全性の観点からは、コレステロール残基を用いることが望ましい。また、アルキル基としては、好ましくは炭素数２０以下、さらに好ましくは炭素数１０〜１８のアルキル基を用いることができ、これらは直鎖又は分岐鎖のいずれであってもよい。
【００６２】
好適な疎水化多糖類の一態様としては、例えば、多糖類を構成する糖単位１００個あたり１〜５個の糖単位の１級水酸基が下記式（Ｉ）：
【００６３】
−Ｏ−（ＣＨ2）mＣＯＮＨ（ＣＨ2）nＮＨ−ＣＯ−Ｏ−Ｒ（Ｉ）
（式中、Ｒはアルキル基またはステロール残基を示し；ｍは０または１を示し；ｎは任意の正の整数を示す）で表されるものを挙げることができる。ここで、アルキル基又はステロール残基としては好ましくは上記のものを用いることができ、ｎは好ましくは１〜８である。なお、疎水化多糖類としては、特開平７−９７３３３号公報に記載されたようなリンカーを介して結合したものであってもよい。
【００６４】
（好適な高分子キャリアの具体例）
より具体的には、本発明においては、下記のような疎水化多糖類（Ａ）を用いることが好ましい。
【００６５】
（１）ＣＨＰ（コレステロール疎水化プルラン）
（２）ＣＨＭ（コレステロール疎水化マンナン）
（３）ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ
【００６６】
上記のＣＨＰ、ＣＨＭ等としては、必要に応じて、市販品（例えば、日本油脂株式会社から商業的に入手可能な製品で、分子量６万、１０万等のもの；糖残基１００個当たり、１．６個程度のコレステロールが存在する）を利用することもできる。
【００６７】
（タンパク質抗原）
本発明において、上記した疎水化多糖類等高分子キャリアに包埋させるべき癌特異的タンパク質抗原としては、その分子中にシステイン残基を２個以上有する癌細胞に特異的に発現するタンパク質抗原を用いる。
【００６８】
（好適な抗原）
本発明においては、上記の癌特異的タンパク質抗原として、例えば、以下のものが好適に使用可能である。
【００６９】
（１）癌精巣抗原（ＣＴＡ）
（２）組換え大腸菌を用いて発現される組み換え癌精巣抗原
例えば、ＭＡＧＥ−Ａｌ，ＭＡＧＥ−Ａ２，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＡＧＥ−Ａ４，ＭＡＧＥ−Ａ５，ＭＡＧＥ−Ａ６，ＭＡＧＥ−Ａ７，ＭＡＧＥ−Ａ８，ＭＡＧＥ−Ａ９，ＭＡＧＥ−Ａ１０，ＭＡＧＥ−Ａ１１，ＭＡＧＥ−Ａ１２，ＭＡＧＥ−Ｂ１，ＭＡＧＥ−Ｂ２，ＭＡＧＥ−Ｂ３，ＭＡＧＥ−Ｂ４，ＭＡＧＥ−Ｃ１，ＭＡＧＥ−Ｃ２のＭＡＧＥファミリーから１ないし複数選択された癌精巣抗原；
【００７０】
ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ ファミリー、ＧＡＧＥ ファミリー、ＳＡＧＥ ファミリー、ＸＡＧＥ ファミリーから１ないし複数選択された癌精巣抗原；
【００７１】
（３）ＥｒｂＢ−２タンパク質などの癌遺伝子産物および腫瘍血管の抗原タンパク質（VEGFR）など
【００７２】
（４）上記（１）、（２）または（３）の抗原にＨｉｓ−Ｔａｇを付加したＨｉｓ−Ｔａｇ−癌特異的抗原
【００７３】
（疎水化多糖類による抗原の包埋方法）
疎水化多糖類と抗原との複合体は、尿素等の変性剤存在下に疎水化多糖類と抗原とを室温で混合した後に、限外ろ過またはゲルクロマトグラフ法で変性剤を除去することにより製造することができる(Nishikawa，Macromolecules，２７，ｐｐ．７６５４−７６５９，１９９４)。或いは変性剤なしでも疎水化多糖類と抗原とを５０−６０℃で混合するだけでも製造可能である。このようにして得られた疎水化多糖類と抗原との複合体は、そのまま本発明のワクチン製剤として用いることができるが、必要に応じて常法に従ってろ過滅菌等の操作を施すことも可能である。
【００７４】
（疎水化多糖類と抗原との複合体による免疫）
本発明により製造可能なワクチン製剤は、他の公知のワクチン製剤等と同様に、その所定量を動物に投与することによって該動物を免疫することができ、同様にしてワクチン製剤の力価を評価することができる。本発明のワクチン製剤の投与経路は皮下または皮内注射が一般的である。免疫感作に必要な本発明のワクチン製剤の投与量は適宜決定できるが、例えば、通常投与量としては抗原として５０〜１５００μｇ／回程度好ましくは１００〜６００μｇ／回の量を目安とし、投与は３〜３０回行うのが適当である。また、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＣｐＧやＯＫ−４３２のごとき免疫賦活剤を併用することも効果的である。
【００７５】
なお、本発明のワクチン製剤を製剤化する際には、それ自体公知の通常使用され得る製剤、担体及び希釈剤を、採用される投与経路にしたがって適宜使用することができる。
【００７６】
（リコンビナント抗原の製造）
組換え大腸菌の調製は一般的なプラスミドにＣＴＡのＤＮＡを組み込むことで達成される。ＣＴＡのＤＮＡ配列は公知であり（米国特許第５３４２７７４号等）、バイオ製造業者にとって容易に達成できる。
【００７７】
（抗原のスルホ化）
システイン残基の修飾法の１例として、スルホ化を例として説明する。
【００７８】
本発明において、分子中にシステイン残基を２個以上有する癌特異的タンパク質抗原のスルホ化に際しては、例えば、スルホ化条件として、８Ｍ 尿素または６Ｍグアニジン存在下、３０−３０００ｍＭ（好ましくは２００−５００ｍＭ）の亜硫酸ナトリウム、６−６００ｍＭ（好ましくは３０−１００ｍＭ）のテトラチオン酸を１０〜５０℃で作用させることが好ましい。
【００７９】
（スルホ化タンパク抗原の純度確認方法）
スルホ化したタンパク抗原の純度は逆相HPLCまたは電気泳動でチェックすることが出来る。この安定性は、例えば中性緩衝液中で６０℃、１０分間加熱しても電気泳動で１バンドであることで確認できる。スルホ化保護をしていない場合には重合体・多量体と考えられる高分子のバンドが増加してくる。（後述実施例 に対応する電気泳動パターンを参照）
【００８０】
スルホ化以外にも、グルタチオン化などシステインのーSH基を可逆的に修飾することができる方法は利用可能である。
【００８１】
（疎水化多糖類への包埋方法）
包埋方法の１例として、CHPを用いる場合について説明する。
ＣＨＰに包埋させる方法は、それ自体は既に公知の方法（例えば、ＷＯ９８／０６５０公報）を使用することができる。この包埋方法の概略は、６〜８M尿素または６Mグアニジンなどの変性剤溶液にCHPを溶解させ、もしくはCHPを水または緩衝剤溶液に溶解させて、タンパク質１に対して重量比１０-２０倍量のCHPを混合し、限外ろ過またはゲルろ過などの方法で製剤処方緩衝液に交換し、必要に応じて無菌ろ過処理する方法である。GHPの溶解は常温で十分であるが、加温下に行っても差し支えない。CHPの分子量は、５０−１００ｋｄが望ましい。また、ＣＨＰは、例えば日本油脂株式会社から市販されている。
【００８２】
リポソームやイスコマトリックスとの複合体化については前述の文献などを参照すれば、当業者にとっては容易に実施することが可能である。
【００８３】
（複合体の粒度分布の測定）
本発明の疎水化多糖類（A）と、タンパク抗原（B）との複合体の粒度分布は粒度分布計（DRI）を用いて確認することが出来る。（実施例 図８参照）
【００８４】
（包埋されたことの確認）
包埋は、ＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー；例えば、後述する「ＣＨＰ包埋化」の記載を参照）によりチェックすることができる。ＧＰＣチャートにおいて、ＣＨＰおよび癌特異的抗原タンパク質それぞれのピークが、包埋により完全にＣＨＰピークの位置に移動することで、この「包埋」を確認することが出来る。本発明において、この「包埋」の収率は９５%以上であることが望ましく、更には９９％以上が好ましい。
【００８５】
（好適な「コレステリル多糖−抗原分子」の組合せスクリーニング）
上記したような包埋の確認方法（ＧＰＣ）を利用して、本発明において「コレステリル多糖−抗原分子」の組合せを探索するためのスクリーニングテストに使用することができる。このようなスクリーニングにおいては、「包埋」の収率を求めることができる。本発明においては、この「包埋」の収率は９５%以上であることが望ましく、更には９９％以上が好ましい。
【００８６】
（包埋後の抗原活性）
包埋後の抗原活性を検定する方法は種々あり得るが、例えばin vitroで、抗原提示細胞とキラーまたはヘルパーT細胞を組み合わせた実験系で測定できる。すなわち、包埋タンパク質抗原を例えば樹状細胞などの抗原提示細胞に取り込ませ、その抗原提示細胞によるキラーT細胞の活性化を、インターフェロンγを測定対象とするELISA法（Enzyme-linked immunosorbent assay）やＥＬＩＳＰＯＴ法（Enzyme-linked-ImmunoSPOT）で確認することができる。こうした実験系では、抗原活性を観測することが可能である。
【００８７】
（ワクチン）
本発明の包埋タンパク質抗原は、ワクチンとして使用することができる。このワクチンは、いわゆる「抗原医薬」であるため、通常は、いわゆる「抗体医薬」より、一桁以上少ない量で免疫の効果を得ることができる。
【００８８】
（好適なワクチンの態様）
本発明において、好適なワクチンの態様は、以下の通りである。
（１）組換え大腸菌を用いて発現される組み換え癌特異的タンパク質抗原(以下「ＳＨ抗原」という)に亜硫酸塩、テトラチオン酸塩を作用させて得られるスルホ化組み換え癌特異的タンパク質抗原（以下「スルホ化抗原」という）を精製し、スルホ化リコンビナント精巣抗原を疎水化多糖類に包埋させたＣＨＰ−スルホ化抗原ワクチン。
【００８９】
（２）上記（１）のスルホ化組換え癌精巣抗原を還元したＣＨＰ−ＳＨ抗原ワクチン。
【００９０】
（３）上記（１）または（２）の組換え癌特異的タンパク質抗原が、ＭＡＧＥ−Ａｌ，ＭＡＧＥ−Ａ２，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＡＧＥ−Ａ４，ＭＡＧＥ−Ａ５，ＭＡＧＥ−Ａ６，ＭＡＧＥ−Ａ７，ＭＡＧＥ−Ａ８，ＭＡＧＥ−Ａ９，ＭＡＧＥ−Ａ１０，ＭＡＧＥ−Ａ１１，ＭＡＧＥ−Ａ１２，ＭＡＧＥ−Ｂ１，ＭＡＧＥ−Ｂ２，ＭＡＧＥ−Ｂ３，ＭＡＧＥ−Ｂ４，ＭＡＧＥ−Ｃ１，ＭＡＧＥ−Ｃ２のＭＡＧＥファミリーから１ないし複数選択されたＣＴＡであるＣＨＰ−ＣＴＡ スルホ化抗原ワクチンまたはその還元体であるＣＨＰ−ＣＴＡ SH抗原ワクチン。
【００９１】
（４）上記（１）または（２）のリコンビナント精巣抗原が、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ ファミリー、ＧＡＧＥ ファミリー、ＳＡＧＥ ファミリー、ＸＡＧＥ ファミリーから１ないし複数選択されたＣＴＡであるＣＨＰ−ＣＴＡ スルホ化抗原ワクチンまたはその還元体であるＣＨＰ−ＣＴＡ SH抗原ワクチン。
【００９２】
（５）上記（１）または（２）のリコンビナント癌精巣抗原が、Ｈｉｓ−Ｔａｇを付加したＨｉｓ−Ｔａｇ−ＣＴＡであるＣＨＰ−Ｈｉｓ Ｔａｇ ＣＴＡ スルホ化抗原ワクチンまたはＣＨＰ− Ｈｉｓ Ｔａｇ ＣＴＡ SH抗原ワクチン。
【００９３】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００９４】
製造例１
（１）Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４の組み込みとシードストックの調製
下記配列：
Forward primer: ５’-GGATCCATGTCTTCTGAGCAGAAGAGT-３’
Reverse primer: ５’-AAGCTTCTCATGCTCAGACTCCCTC-３’
【００９５】
をプライマーとして、メラノーマ細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−３７由来のRNAに対してＲＴ−ＰＣＲを実施し、その結果、両端にＢａｍＨＩ部位（ＧＧＡＴＣＣ）および ＨｉｎｄＩＩＩ部位（ＡＡＧＣＴＴ）を有するＭＡＧＥ−Ａ４の全長ｃＤＮＡを得た（米国コーネル大学医学部のDr. Yao-Tseng Chenにより実施）
【００９６】
このｃ-ＤＮＡをＨｉｓ−Ｔａｇ融合タンパク質発現用のｐＱＥ９ベクター（キアゲン）に組み込み、ｐＱＥ９／ＭＡＧＥ−Ａ４プラスミドを得た（米国コーネル大学医学部のDr. Yao-Tseng Chenにより実施）。これをＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ Ｍ１５ ［ｐＲＥＰ４］（キアゲン）に導入した菌株をＤｒ．Ｋｕｚｕｓｈｉｍａ（愛知県がんセンター）より提供を受けた。
【００９７】
発現が確認された形質転換株について、培養プレート上のシングルコロニーを採取して５０ｍＬのＬＢ（２５ μｇ／ｍｌ カナマイシンおよび１００ μｇ／ｍｌ アンピシリンを含む）培地に接種し１６時間培養した。菌体を集めて培地を抗生物質を含まないＬＢ培地に交換した後、終濃度２０％となるようグリセロールを添加し−８０℃で保存した（シードストック）。このシードストックを抗生物質(２５ug/mL カナマイシン, １００ug/mL アンピシリン)含有LB培地に接種し培養を行い、培養後遠心分離にて抗生物質含有培地を除去し，抗生物質不含ＬＢ培地で洗浄し培地交換した後，４０%グリセロール水溶液と等量で混合し-８０℃に保存，MCBとした。
【００９８】
（２）培養
抗生物質不含LB培地 １０Lに対してＭＡＧＥ−Ａ４MCB を５ mL接種した。３７℃、２５０rpm、１vvmで６-１５時間前培養を行い、LB培地２００Lに対して前培養液を１０L接種し、３０℃、６０rpm、１vvmで培養を開始した。OD６００が約１になったらIPTGを終濃度０.３mmol/Lで添加し、誘導を開始し、DO制御は攪拌により約６０％（約４.５ppm）以上に保持して、誘導開始から５hr後、培養を終了した。
【００９９】
（３）菌体回収と菌体破砕
デュラポア PVDF GVPP ０.２２μm（Vスクリーン）０.５ m2の平膜（Millipore）を用いて、使用菌体濃縮（約６-１０倍）後、同量の２０mmol/L Tris-HCl（pH８.０）バッファーを３回以上添加し、菌体洗浄を行い、菌体を湿重量で８００g、２０Lの菌体スラリー液を得た。菌体は冷蔵または冷凍で保存した。
【０１００】
解凍した菌体に２０mM Tris-HCl ( pH ８．０ )１２L を加えて懸濁させて菌体スラリー液を調製し、高圧ホモジナイザーを用いて１０,０００ psiにて透明になるまで破砕した。ゼーター電位フィルター キュノ バイオキャップ２０００ ( ６０M/１２０M ２７００cm2 )（Cuno）および 除菌フィルター ステラシェア （ ０.２μm、１０i nch ８６００cm2 ）（Cuno） を 直列に接続し ≦０.３９L/min （ 上記 フィルター １set 当り ）で破砕液をろ過して、デブリスを除去し清澄化した。
【０１０１】
図１に得られた破砕液上清の電気泳動パターンを示す。
【０１０２】
図１（菌体破砕のパス回数と可溶化）は、ＭＡＧＥ−Ａ４組換え大腸菌を培養して得られる菌体破砕液の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで破砕液上清にＭＡＧＥ−Ａ４が存在することを示す。
【０１０３】
図１中の記号の意味は、以下の通りである。
Ｍ： 分子量マーカー； ＰＣ： 陽性対照； ＣＳ： 培養上清； Ｓ： 上清； Ｐ： 沈殿
【０１０４】
製造例２
（アフィニティカラムクロマト）
Ni-NTAカラム（QIAGEN Ni-NT agarose、２５cm径、約４L）を用いて破砕ろ液からＭＡＧＥ−Ａ４たん白を分離した。次の通りステップ溶出にて実施する。 ( 流速５６cm/h )
【０１０５】
【表１】
【０１０６】
溶出開始後、A２８０のピークを分取した。
【０１０７】
得られた溶出液の電気泳動パターンを図２に示す。
【０１０８】
図２はＨｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４発現大腸菌の菌破砕液とそれをＮｉ−ＮＴＡアフィニティカラムで粗精製した画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、１回の精製で９５％以上の純度のＭＡＧＥ−Ａ４が得られることを示す。
【０１０９】
ミリポア ペリコン２ ウルトラセルPLCGC １０Ｋ ０.１m2 × １枚の平膜（Millipore）を用いてNi-NTAカラム溶出プール液を約５mg/mLまで濃縮し、濃縮後８倍量以上の２０mM Tris-HCl ( pH ８．０)にてバッファー交換を行い、イミダゾールを除去した。
【０１１０】
実施例１
上記濃縮液に終濃度 ８Mになるように 尿素を添加２０mM Tris-HCl (pH ８．０) を用いてメスアップしながら溶解した後、終濃度で６０mMテトラチオン酸二水和物と３００mM亜硫酸ナトリウム を順に加え 室温で一晩撹拌した。反応液を１０mM リン酸ナトリウムバッファー ８mol/L 尿素（pH ８.０）で平衡化したSephadex G-２５ Coarse（GEヘルスケア） ２５cm径 約１２Lに通してバッファーを交換した。
【０１１１】
実施例２
実施例１の反応を８Ｍ尿素の代わりに６Ｍグアニジン存在下でも行ってみた。
結果は、図３（粗精製Ｈｉｓ−Ｔａｇ ＭＡＧＥ−Ａ４とそのスルホ化保護体の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に示すように８Ｍ尿素の場合も６Ｍグアニジンの場合も一つのバンド（４９ｋｄ）に収束した。
【０１１２】
実施例３
実施例１で得た「粗精製Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４」を用いて、以下の実施例３〜実施例８の実験を行った。
【０１１３】
図３は粗精製Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４とそのスルホ化保護体の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで保護反応前の粗精製ＭＡＧＥ−Ａ４が非還元状態では多量体（６０−１１０ｋｄ）や構造異性体（３８−４８ｋｄ）の集合であることを示すとともに、スルホ化保護反応をすることによって一つのバンド（４９ｋｄ）に収束することを示す。
【０１１４】
これはＳＨ体と考えられるバンド（４５ｋｄ）よりも僅かに大きな分子容積となっている。この保護体はＨ2Ｏ2による酸化で変化する傾向が見られたが、熱や凍結融解には未保護のＨｉｓ−Ｔａｇ ＭＡＧＥ−Ａ４と比べて安定であることが示された（図４）。
【０１１５】
図４（粗精製Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４とそのスルホ化保護体の過酷条件で処理したときの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、保護する前には加熱によって高分子化凝集するのに対してスルホ化保護体が熱や凍結融解に安定であることを示す。
【０１１６】
実施例４
（陰イオンクロマト）
１０mM リン酸ナトリウムバッファー ８mol/L 尿素（pH ８.０）で平衡化したDEAE Sepharose Fast Flow １３cm径 約２L（GEヘルスケア）にてさらに精製した。カラム操作は以下の通り、グラジエント溶出で行った。流速は、アプライおよび洗浄２５cm/h、その他７５cm/hにて実施した。
【０１１７】
【表２】
【０１１８】
実施例５
（ハイドロキシアパタイトカラムクロマト）
ペリコン２ ウルトラセルPLCGC １０Ｋ ０.１m2×１枚の平膜（Millipore）を用いてDEAE溶出プール液を約３mg/mLまで濃縮し、濃縮後 ６倍量以上の１/２ D-PBS ８mol/L 尿素にてバッファー交換脱塩を行った。これを１/２ D-PBS ８mol/L 尿素 で平衡化したHA ULTROGEL １０cm径 約３L （ポール）に載せ更に精製した。
【０１１９】
クロマトの条件は、次の通りグラジエント溶出にて実施した。流速は、平衡化から溶出２５cm/h、その他４０cm/hにて実施した。
【０１２０】
【表３】
【０１２１】
菌体破砕液上清（総タンパク量５７g）からの各精製ステップでの不純物プロファイルを下記の表に示す。Ｎｉ−ＮＴＡ粗精製タンパクから効率的にエンドトキシン、宿主由来タンパク、ＤＮＡなどの不純物が除去されていることが示された。
【０１２２】
【表４】
【０１２３】
実施例６
（ＣＨＰ包埋化）
こうして得られたスルホ化保護Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４に重量比１２倍のＣＨＰ ６０Ｔまたは１００Ｔ（日本油脂社製）を６Ｍ尿素存在下、または６Ｍ尿素＋２‐メルカプトエタノール（２ＭＥ）存在下に混合した。これを一度緩衝液で希釈した後、限外ろ過によって濃縮・希釈を繰り返すことによって緩衝液交換とともに過剰の試薬を除去した。得られた原液を無菌ろ過した後にバイアルに分注しワクチン製剤とした。
【０１２４】
得られた「ＣＨＰとタンパク質を混合した直後のＳＥ−ＨＰＬＣチャート」において、ＵＶ（２８０ｎｍ）検出で９．７分に現れるタンパク質ピークは認められず、ＣＨＰのピークに一致して６．５分に移動した。１４．１分のピークは尿素のピークであった。
【０１２５】
他方、希釈・濃縮によって緩衝液を交換（尿素の除去）後の「ＳＥ−ＨＰＬＣチャート」においては、１４．１分の尿素ピークが消え、６．５分のＣＨＰ−Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４ピークが認められた。
【０１２６】
実施例７
（ワクチン効果の確認）
こうして得られたＣＨＰ−Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４ワクチンの免疫活性を以下のようにＥＬＩＳＰＯＴ法を用いて確認した。
【０１２７】
Ｄａｙ−７にＨＬＡ−Ａ２４陽性健常人ドナーより末梢血を採取し、抗ＣＤ１４抗体をコートしたマグネットビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いてＣＤ１４陽性単球細胞を分離し、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４の存在下で培養した。これらCD１４陽性単球細胞は培養中に樹状細胞に分化するが、Ｄａｙ １にこれらを回収し、１×１０6 個／ｍＬの濃度になるように培地に懸濁した。
【０１２８】
この樹状細胞にＣＨＰ−Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４ （７．５〜１１ μｇ 蛋白質／ｍＬ）， ＣＨＰ−Ｈｉｓ−Ｔａｇ−Ｈｅｒ２ （２０ μｇ 蛋白質／ｍＬ）またはＭＡＧＥ−Ａ４由来ＨＬＡ−Ａ２４拘束性抗原ペプチド（ｐ１４３， １０ μｇ／ｍＬ）を添加し、３７°Ｃ、５％ ＣＯ２で３時間インキュベートした。 これらの細胞を新しい培地で洗浄した後、あらかじめ抗ヒトＩＦＮ−γ抗体をコートして１０％ ウシ胎児血清含有培地でブロックしたＥＬＩＳＰＯＴプレート（ミリポア）に５×１０4 個／ウェルの濃度で播種した。これに様々な濃度のＭＡＧＥ−Ａ４−CTLクローン２−２８（Ｒｅｆ． Ｍｉｙａｈａｒａ Ｙ．ら、 Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００５ １１（１５）：５５８１−９．）を添加し、 ３７°Ｃ、５％ ＣＯ２で培養した。
【０１２９】
２４時間後に０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ビオチン化抗ヒトＩＦＮ−γ抗体を添加して４℃で一晩インキュベートした。０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで洗浄後、ストレプトアビジン標識アルカリフォスファターゼを加え、室温で１時間半反応させた。さらに０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで洗浄後、アルカリフォスファターゼ用の発色基質（バイオラッド）を添加し、発色反応を数分間行った。プレートを蒸留水で洗浄して発色反応を停止し、得られたＩＦＮ−γ特異的スポットをカウントした。
【０１３０】
得られた結果を、図６、図７に示す。図６、７において、ＣＨＰ-Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４投与群では陰性対照（Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔまたはＣＨＰ−Ｈｉｓ−Ｔａｇ−Ｈｅｒ２投与群）に比べてより多くのIFN−γスポットが認められ、ＣＨＰ−Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４が樹状細胞に取り込まれてCTLを活性化させていることが確認された。
【０１３１】
実施例８
（サイズ分布の測定）
包埋生成物のサイズ分布を測定した。測定条件は、以下の表５に示す通りである。
【０１３２】
【表５】
【０１３３】
測定結果を、図８のグラフに示す。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図１はＭＡＧＥ−Ａ４組換え大腸菌を培養して得られる菌体破砕液の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで破砕液上清にＭＡＧＥ−Ａ４が存在することを示す。
【図２】図２はＨｉｓ−Ｔａｇ-ＭＡＧＥ−Ａ４発現大腸菌の菌破砕液とそれをＮｉ−アフィニティカラムで粗画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、１回の精製で９５％以上の純度のＭＡＧＥ−Ａ４が得られることを示す。
【図３】図３は粗精製Ｈｉｓ−Ｔａｇ-ＭＡＧＥ−Ａ４とそのスルホ化保護体の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。保護反応前の粗精製ＭＡＧＥ−Ａ４が非還元状態では多量体（６０−１１０ｋｄ）や構造異性体（３８−４８ｋｄ）の集合であることを示すとともにスルホ化保護反応をすることによって一つのバンド（４９ｋｄ）に収束することを示す。
【図４】図４は粗精製Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４とそのスルホ化保護体の過酷条件で処理したときの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。図４は、保護する前には加熱によって高分子化凝集するのに対してスルホ化保護体が熱や凍結融解に安定であることを示す。
【図５】ＤＥＡＥカラムによる精製チャートである。ここで溶出ピークが２本認められたが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，ＲＰＣでは区別がつかず、コンフォメーションの違いによるものと推測された。
【図６】ＣＨＰ−Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイ結果を示すチャートである。Negative Control（Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔ，ＣＨＰ−Ｈｅｒ２）に比べて有意に多くのＩＮＦ−γスポットが認められ、ＣＨＰ−ＭＡＧＥがＤＣに取り込まれてＣＴＬを活性化させていることが確認された。
【図７】ＣＨＰ−ＭＡＧＥ−Ａ４のＥＬＩＳＰＯＴアッセイ結果を示すチャートである。Negative Control（Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔ，ＣＨＰ−Ｈｅｒ２）に比べて有意に多くのIFN−γスポットが認められ、ＣＨＰ−Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＭＡＧＥ−Ａ４が樹状細胞に取り込まれてＣＴＬを活性化させていることが確認された。
【図８】表２に示した、包埋生成物のサイズ分布（定ピーク強度による）を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子中にシステイン残基を２個以上有するタンパク質を包埋剤と複合体化させるタンパク質包埋剤複合体の製造方法であって；
前記包埋剤への包埋の前に、前記タンパク質のシステイン残基を修飾して精製することを特徴とするタンパク質複合体の製造方法。
【請求項２】
前記包埋剤が疎水化多糖類である請求項１に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【請求項３】
前記包埋剤がリポソームである請求項１に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【請求項４】
前記包埋剤がイスコマトリックスである請求項１に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【請求項５】
前記修飾が可逆的である請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質複合体の製造方法。
【請求項６】
前記修飾がスルホ化である請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質複合体の製造方法。
【請求項７】
前記タンパク質が、癌精巣抗原（ＣＴＡ）である請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質複合体の製造方法。
【請求項８】
前記癌精巣抗原（ＣＴＡ）が、組換え大腸菌を用いて発現されるリコンビナント精巣抗原である請求項７に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【請求項９】
前記タンパク質の精製後、包埋剤との複合体化の前に精製したタンパク質をスルフィド結合還元剤で還元する工程を含む請求項１に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【請求項１０】
前記タンパク質を包埋剤と複合体化させた後複合体をスルフィド結合還元剤で還元する工程を含む請求項１に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【請求項１１】
前記修飾をタンパク質にチオ硫酸塩とテトラチオン酸塩を作用させて、該タンパク質のチオール基をスルホ化させて保護する請求項６に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【請求項１２】
前記精製をクロマトグラフィーで行う請求項１に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【請求項１３】
疎水化多糖類（Ａ）と、これに包埋された、分子中にシステイン残基を２個以上有するスルホ化リコンビナント精巣抗原（Ｂ）とを少なくとも含むことを特徴とする包埋タンパク質抗原。
【請求項１４】
前記スルホ化リコンビナント精巣抗原が還元されてなる請求項１３に記載の包埋タンパク質抗原。
【請求項１５】
疎水化多糖類（Ａ）と、これに包埋されたスルホ化リコンビナント精巣抗原（ＣＴＡ）とを少なくとも含むことを特徴とするＣＨＰ−ＣＴＡワクチン。
【請求項１６】
前記スルホ化リコンビナント精巣抗原が、還元されたスルホ化リコンビナント精巣抗原（ＣＴＡ ＳＨ）である請求項１５に記載のＣＨＰ−ＣＴＡワクチン。
【請求項１７】
前記リコンビナント精巣抗原が、ＭＡＧＥ Ａｌ，ＭＡＧＥ Ａ２，ＭＡＧＥ Ａ３，ＭＡＧＥ Ａ４，ＭＡＧＥ Ａ５，ＭＡＧＥ Ａ６，ＭＡＧＥ Ａ７，ＭＡＧＥ Ａ８，ＭＡＧＥ Ａ９，ＭＡＧＥ Ａ１０，ＭＡＧＥ Ａ１１，ＭＡＧＥ Ａ１２，ＭＡＧＥ Ｂ１，ＭＡＧＥ Ｂ２，ＭＡＧＥ Ｂ３，ＭＡＧＥ Ｂ４，ＭＡＧＥ Ｃ１，ＭＡＧＥ Ｃ２のＭＡＧＥ ファミリーから１ないし複数選択されたＣＴＡである請求項１５または１６に記載のＣＨＰ−ＣＴＡワクチン。
【請求項１８】
前記リコンビナント精巣抗原が、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ ファミリー、ＧＡＧＥ ファミリー、ＳＡＧＥ ファミリー、ＸＡＧＥ ファミリーから１ないし複数選択されたＣＴＡである請求項１５または１６に記載のＣＨＰ−ＣＴＡワクチン。
【請求項１９】
前記リコンビナント精巣抗原が、Ｈｉｓ−Ｔａｇを付加したＨｉｓ−Ｔａｇ−ＣＴＡである請求項１５または１６に記載のＣＨＰ−ＣＴＡワクチン。
【請求項１】
分子中にシステイン残基を２個以上有するタンパク質を包埋剤と複合体化させるタンパク質包埋剤複合体の製造方法であって；
前記包埋剤への包埋の前に、前記タンパク質のシステイン残基を修飾して精製することを特徴とするタンパク質複合体の製造方法。
【請求項２】
前記包埋剤が疎水化多糖類である請求項１に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【請求項３】
前記包埋剤がリポソームである請求項１に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【請求項４】
前記包埋剤がイスコマトリックスである請求項１に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【請求項５】
前記修飾が可逆的である請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質複合体の製造方法。
【請求項６】
前記修飾がスルホ化である請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質複合体の製造方法。
【請求項７】
前記タンパク質が、癌精巣抗原（ＣＴＡ）である請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質複合体の製造方法。
【請求項８】
前記癌精巣抗原（ＣＴＡ）が、組換え大腸菌を用いて発現されるリコンビナント精巣抗原である請求項７に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【請求項９】
前記タンパク質の精製後、包埋剤との複合体化の前に精製したタンパク質をスルフィド結合還元剤で還元する工程を含む請求項１に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【請求項１０】
前記タンパク質を包埋剤と複合体化させた後複合体をスルフィド結合還元剤で還元する工程を含む請求項１に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【請求項１１】
前記修飾をタンパク質にチオ硫酸塩とテトラチオン酸塩を作用させて、該タンパク質のチオール基をスルホ化させて保護する請求項６に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【請求項１２】
前記精製をクロマトグラフィーで行う請求項１に記載のタンパク質複合体の製造方法。
【請求項１３】
疎水化多糖類（Ａ）と、これに包埋された、分子中にシステイン残基を２個以上有するスルホ化リコンビナント精巣抗原（Ｂ）とを少なくとも含むことを特徴とする包埋タンパク質抗原。
【請求項１４】
前記スルホ化リコンビナント精巣抗原が還元されてなる請求項１３に記載の包埋タンパク質抗原。
【請求項１５】
疎水化多糖類（Ａ）と、これに包埋されたスルホ化リコンビナント精巣抗原（ＣＴＡ）とを少なくとも含むことを特徴とするＣＨＰ−ＣＴＡワクチン。
【請求項１６】
前記スルホ化リコンビナント精巣抗原が、還元されたスルホ化リコンビナント精巣抗原（ＣＴＡ ＳＨ）である請求項１５に記載のＣＨＰ−ＣＴＡワクチン。
【請求項１７】
前記リコンビナント精巣抗原が、ＭＡＧＥ Ａｌ，ＭＡＧＥ Ａ２，ＭＡＧＥ Ａ３，ＭＡＧＥ Ａ４，ＭＡＧＥ Ａ５，ＭＡＧＥ Ａ６，ＭＡＧＥ Ａ７，ＭＡＧＥ Ａ８，ＭＡＧＥ Ａ９，ＭＡＧＥ Ａ１０，ＭＡＧＥ Ａ１１，ＭＡＧＥ Ａ１２，ＭＡＧＥ Ｂ１，ＭＡＧＥ Ｂ２，ＭＡＧＥ Ｂ３，ＭＡＧＥ Ｂ４，ＭＡＧＥ Ｃ１，ＭＡＧＥ Ｃ２のＭＡＧＥ ファミリーから１ないし複数選択されたＣＴＡである請求項１５または１６に記載のＣＨＰ−ＣＴＡワクチン。
【請求項１８】
前記リコンビナント精巣抗原が、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ ファミリー、ＧＡＧＥ ファミリー、ＳＡＧＥ ファミリー、ＸＡＧＥ ファミリーから１ないし複数選択されたＣＴＡである請求項１５または１６に記載のＣＨＰ−ＣＴＡワクチン。
【請求項１９】
前記リコンビナント精巣抗原が、Ｈｉｓ−Ｔａｇを付加したＨｉｓ−Ｔａｇ−ＣＴＡである請求項１５または１６に記載のＣＨＰ−ＣＴＡワクチン。
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００７−２７７２０２（Ｐ２００７−２７７２０２Ａ）
【公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１０８６６８（Ｐ２００６−１０８６６８）
【出願日】平成１８年４月１１日（２００６．４．１１）
【出願人】（５０４４２０６１８）株式会社イミュノフロンティア (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月１１日（２００６．４．１１）
【出願人】（５０４４２０６１８）株式会社イミュノフロンティア (4)
【Ｆターム（参考）】
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