ダブルシグモイドの曲率分析を使用したＰＣＲのエルボー決定
【課題】ＰＣＲ増幅曲線のサイクル閾値（Ｃｔ）などのシグモイド又は成長タイプの曲線のエルボー値などの特徴的な遷移値を決定するシステム及び方法の提供。
【解決手段】Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスによって決定されたパラメータを有するダブルシグモイド関数を使用することにより、ＰＣＲデータセットにフィットする曲線に対する近似を検出する。パラメータの決定が完了したら、決定されたパラメータの１つ又は複数のものを使用して曲線を正規化可能である。正規化の後に、正規化済みの曲線を処理することにより、曲線に沿ったいくつか又はすべてのポイントにおける曲線の曲率を決定し、例えば、曲率対サイクル数を表すデータセット又はプロットを生成する。最大曲率が発生するサイクル数がＣｔ値に対応している。次いで、このＣｔ値が返され、これを表示するか又は更なる処理のために使用可能である。
【解決手段】Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスによって決定されたパラメータを有するダブルシグモイド関数を使用することにより、ＰＣＲデータセットにフィットする曲線に対する近似を検出する。パラメータの決定が完了したら、決定されたパラメータの１つ又は複数のものを使用して曲線を正規化可能である。正規化の後に、正規化済みの曲線を処理することにより、曲線に沿ったいくつか又はすべてのポイントにおける曲線の曲率を決定し、例えば、曲率対サイクル数を表すデータセット又はプロットを生成する。最大曲率が発生するサイクル数がＣｔ値に対応している。次いで、このＣｔ値が返され、これを表示するか又は更なる処理のために使用可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、シグモイド又は成長曲線を表すデータを処理するシステム及び方法に関するものであり、更に詳しくは、ＰＣＲ増幅曲線の特徴的なサイクル閾値（Ｃｙｃｌｅ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：Ｃｔ）又はエルボー値、或いは、その他の成長曲線のエルボー値を決定するシステム及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）は、規定の核酸配列を酵素によって合成又は増幅する体外的な方法である。この反応においては、通常、正反対の鎖にハイブリダイズし、増幅対象のテンプレート又は標的ＤＮＡ配列にフランキングする２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。該プライマーの伸長は、熱安定性を有するＤＮＡポリメラーゼにより触媒される。テンプレートの変性、プライマーのアニーリング、及びアニーリングされたプライマーのポリメラーゼによる伸長を伴う反復的な一連のサイクルの結果として、特定のＤＮＡフラグメントが指数的に蓄積される。通常、このプロセスにおいては、増幅プロセスの検出及び定量化を円滑に実行するべく、蛍光プローブ又はマーカーが使用されている。
【０００３】
図１には、典型的なリアルタイムのＰＣＲ曲線が示されており、典型的なＰＣＲプロセスにおける蛍光強度値がサイクル数に対してプロットされている。このケースにおいては、ＰＣＲプロセスのそれぞれのサイクルにおいて、ＰＣＲ産物の形成がモニタリングされている。増幅は、通常、増幅反応の際に蛍光信号を計測するコンポーネント及び装置を含むサーモサイクラー内において計測される。このようなサーモサイクラーの一例が、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒである（Ｃａｔ． Ｎｏ．２０１１０４６８）。例えば、増幅産物は、標的核酸に結合した際にのみ蛍光信号を放出する蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブによるか、或いは、場合によっては二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光染料により、検出される。
【０００４】
典型的なＰＣＲ曲線において、ベースライン領域の終点における遷移点（これは、一般に、エルボー値又はサイクル閾値（Ｃｔ）と呼ばれている）を識別することは、ＰＣＲ増幅プロセスの特性を理解するのに非常に有用である。Ｃｔ値は、ＰＣＲプロセスの効率の尺度として使用可能である。例えば、通常、分析対象であるすべての反応について規定の信号閾値を決定し、この閾値に到達するのに必要なサイクル数（Ｃｔ）を標的核酸及び標準又はハウスキーピング遺伝子などの基準核酸について決定する。標的核酸及び基準核酸について得られたＣｔ値に基づいて、標的分子の絶対的又は相対的なコピー数を決定可能である（Ｇｉｂｓｏｎ他による「Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」（６巻、９９５〜１００１頁）、Ｂｉｅｃｈｅ他による「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」（５９巻、２７５９〜２７６５頁、１９９９年）、ＷＯ ９７／４６７０７、ＷＯ ９７／４６７１２、ＷＯ ９７／４６７１４）。図１のベースライン領域１５の終点にある領域２０のエルボー値は、サイクル数３０の領域に位置しうる。
【０００５】
ＰＣＲ曲線のエルボー値は、いくつかの既存の方法を使用して決定可能である。例えば、様々な現在の方法においては、ＡＦＬ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｖａｌｕｅ）と呼ばれる既定のレベルに蛍光が到達する値としてエルボーの実際の値を決定している。その他の現在の方法においては、蛍光対サイクル数の二次導関数が極大値に到達するサイクル数を使用することがある。これらの方法は、いずれも欠点を有している。例えば、方法によっては、異常値（雑音）データの影響を非常に受けやすく、ＡＦＬ値法は、高いベースラインを有するデータセットには、十分に機能しない。図１に示されている成長曲線のベースラインの停止点（又は、ベースラインの終点）を決定する従来の方法は、特に、高タイター環境においては、満足に機能することができない。更には、これらのアルゴリズムは、通常、明確に規定されておらず、線形依存性であり、且つ、不可能でないにしても、最適化が非常に困難であるという、多数（例えば、５０個以上）のパラメータを有している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、前述の及びその他の問題点を克服するシグモイドタイプ又は成長曲線などの曲線（特に、ＰＣＲ曲線）のエルボー値を決定するシステム及び方法を提供することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、シグモイド又は成長タイプの曲線のエルボー値などの特徴的な遷移値を決定する新しい効率的なシステム及び方法を提供する。ある実施においては、本発明のシステム及び方法は、ＰＣＲ増幅曲線のサイクル閾値（Ｃｔ）を決定するのに特に有用である。
【０００８】
本発明によれば、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスによって決定されたパラメータを有するダブルシグモイドを使用することにより、ＰＣＲデータセットにフィットする曲線に対する近似を検出している。パラメータの決定が完了したら、決定されたパラメータの１つ又は複数のものを使用し、その曲線を正規化可能である。正規化の後に、正規化済みの曲線を処理することにより、曲線に沿ったいくつか又はすべてのポイントにおける曲線の曲率を決定し、例えば、曲率対サイクル数を表すデータセット又はプロットを生成する。最大曲率が発生するサイクル数がＣｔ値に対応している。この結果、Ｃｔ値が返され、これを表示するか又は更なる処理に使用可能である。
【０００９】
本発明の第１の態様においては、成長曲線のベースライン領域の終点におけるポイントを決定するコンピュータにより実施される方法であって：
−成長曲線を表すデータセットであって、それぞれが座標値のペアを有する複数のデータポイントを含んでいるデータセットを受領する段階と、
−Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用してデータセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、この関数のパラメータを決定する段階と、
−決定されたパラメータを使用して曲線を正規化し、正規化済みの曲線を生成する段階と、
−正規化済みの曲線を処理することにより、長曲線のベースライン領域の終点を表す最大曲率のポイントを決定する段階と、
を含んで成る方法を提供する。
【００１０】
本発明の第２の態様においては、プロセッサを制御して成長曲線のベースライン領域の終点におけるポイントを決定するためのコードを含むコンピュータ読み取り可能な媒体が提供され、このコードは、
−成長曲線を表すデータセットを受領する段階であって、このデータセットは、それぞれが座標値のペアを有する複数のデータポイントを含んでいる、段階と、
−Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用してデータセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、この関数のパラメータを決定する段階と、
−決定されたパラメータを使用して曲線を正規化し、正規化済みの曲線を生成する段階と、
−正規化済みの曲線を処理することにより、最大曲率のポイントを決定する段階であって、この最大曲率のポイントは、成長曲線のベースライン領域の終点を表している、段階と、
を実行する命令を含んでいる。
【００１１】
本発明の更に別の態様においては、動力学的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムであって：
−動力学的なＰＣＲ増幅曲線を表すＰＣＲデータセットを生成する動力学的ＰＣＲ分析モジュールであって、このデータセットは、それぞれが座標値のペアを有する複数のデータポイントを含んでおり、且つ、このデータセットは、サイクル閾値（Ｃｔ）を含む注目の領域内にデータポイントを含んでいる、動力学的ＰＣＲ分析モジュールと；
−ＰＣＲデータセットを、
−Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用してデータセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、この関数のパラメータを決定する段階と、
−決定されたパラメータを使用して曲線を正規化し、正規化済みの曲線を生成する段階と、
−正規化済みの曲線を処理することにより、成長曲線のサイクル閾値（Ｃｔ）を表す最大曲率のポイントを決定する段階と、により、
処理してＣｔ値を決定するべく適合されたインテリジェンスモジュール；
を有している。
【００１２】
添付の図面と請求項を含む本明細書の残りの部分を参照することにより、本発明のその他の特徴及び利点について理解することができよう。以下、添付の図面との関連において、本発明の更なる特徴及び利点、並びに、本発明の様々な実施例の構造及び動作について詳細に説明することとする。尚、添付図面中においては、類似の参照符号により、同一又は機能的に類似した要素を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、ＰＣＲ増幅曲線のベースライン領域の終点又はエルボー値又はＣｔ値などのシグモイド又は成長曲線の遷移値を決定するためのシステム及び方法を提供する。ある態様においては、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスによって決定されたパラメータを有するダブルシグモイド関数を使用することにより、曲線に対する近似を検出している。パラメータの決定が完了したら、決定されたパラメータの１つ又は複数のものを使用して曲線を正規化可能である。正規化の後に、正規化済みの曲線は、曲線に沿ったいくつか又はすべてのポイントにおける曲線の曲率を決定するように、例えば、曲率対サイクル数を表すデータセット又はプロットを生成するように処理される。最大曲率が発生するサイクル数はＣｔ値に対応している。この結果、Ｃｔ値が返され、これを表示するか又は更なる処理に使用可能である。
【００１４】
一例としてＰＣＲプロセスの環境における成長又は増幅曲線１０を図１に示す。図示のように、曲線１０は、遅滞期領域１５と、対数期領域２５と、を含んでいる。遅滞期領域１５は、一般に、ベースライン又はベースライン領域と呼ばれている。このような曲線１０は、遅滞期領域と対数期領域を結びつける注目の遷移領域２０を含んでいる。領域２０は、一般に、エルボー又はエルボー領域と呼ばれている。エルボー領域は、通常、ベースラインの終点と、基礎となっているプロセスの成長又は増幅レートにおける遷移と、を規定する。領域２０内の特定の遷移ポイントを識別することは、基礎となっているプロセスの振る舞いを分析するのに有用であろう。典型的なＰＣＲ曲線において、エルボー値又はサイクル閾値（Ｃｔ）と呼ばれる遷移ポイントを識別することは、ＰＣＲプロセスの効率特性を理解するのに非常に有用である。
【００１５】
同様のシグモイド又は成長曲線を提供可能なその他のプロセスには、細菌的なプロセス、酵素的なプロセス、及び結合のプロセスが含まれる。例えば、細菌増殖曲線において、注目の遷移ポイントは、遅滞期における時点θと称される。本発明に従って分析可能なデータ曲線を生成するその他の具体的なプロセスは、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）プロセス、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）プロセス、及びＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）プロセスを含んでいる。ＳＤＡ及びＮＡＳＢＡプロセスの例及びデータ曲線については、それぞれ、Ｗａｎｇ，Ｓｈａ−Ｓｈａ他による「Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｂｙ Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ Ｅｔ Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ、２００３年、４９（１０）、１５９９頁）と、Ｗｅｕｓｔｅｎ、Ｊｏｓ Ｊ．Ａ．Ｍ．他による「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｌｏａｄｓ Ｕｓｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ」（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００２年、３０（６）、２６）を参照されたい。従って、本明細書の残りの部分においては、ＰＣＲ曲線に対するその適用可能性の観点から本発明の実施例及び態様について説明することとするが、本発明は、その他のプロセスに関係したデータ曲線にも適用可能であることを理解されたい。
【００１６】
図１に示されているように、典型的なＰＣＲ成長曲線のデータは、例えば、ｘ軸を規定するＰＣＲサイクル数と、ｙ軸を規定する蓄積されたポリヌクレオチドの成長のインジケータと、によるものなどの２次元座標系において表現可能である。通常は、蛍光マーカーの使用が、恐らくは、最も広範に使用されている標識の方式であることから、図１に示されているように、蓄積された成長のインジケータは、蛍光の強度値である。但し、使用する特定の標識及び／又は検出の方式に応じて、その他のインジケータを使用することも可能であることを理解されたい。蓄積された信号成長のその他の有用なインジケータの例には、ルミネセンス強度、ケミルミネセンス強度、バイオルミネセンス強度、リン光強度、電荷転送、電圧、電流、電力、エネルギー、温度、粘度、光散乱、放射性強度、反射率、透過率、及び吸光度が含まれている。サイクルの定義も、時間、プロセスサイクル、単位動作サイクル、及び再生サイクルを包含可能である。
【００１７】
（全般的プロセスの概要）
本発明によれば、動力学的なＰＣＲ増幅曲線のエルボー値又はＣｔ値などのシングルシグモイド曲線の遷移値を決定するプロセスの一実施例１００については、図２を参照することにより、簡潔に説明可能である。段階１１０において、曲線を表す実験データセットを受領するか又は取得する。図１には、プロットされたＰＣＲデータセットの一例が示されており、この場合には、ｙ軸とｘ軸は、それぞれ、ＰＣＲ曲線の蛍光強度とサイクル数を表している。ある態様においては、このデータセットは、連続的であって軸に沿って等間隔を有するデータを含むべきである。
【００１８】
本発明の例示的な実施態様においては、本方法は、キーボード、マウス、及びこれらに類似したものなどのデータセットを入力するための入力装置；モニターなどの、曲線の領域内の注目の特定のポイントを表すための表示装置；ＣＰＵなどの本方法のそれぞれの段階を実行するのに必要な処理装置；モデムなどのネットワークインターフェイス；データセットを保存するためのデータストレージ装置；プロセッサ上において稼動するコンピュータコード；及びこれらに類似したものを含む（但し、これらに限定されない）従来のパーソナルコンピュータシステムを使用することによって実施可能である。又、本方法は、ＰＣＲ装置内で実施することも可能である。
【００１９】
図２１には、本発明によるシステムが表示されている。この図は、ソフトウェア及びハードウェア資源間における関係を示す概略的なブロックダイアグラムを示している。本システムは、サーモサイクラー内に配置可能な動力学的ＰＣＲ分析モジュールと、コンピュータシステムの一部であるインテリジェンスモジュールと、を有している。データセット（ＰＣＲデータセット）は、ネットワーク接続又は直接接続を介して分析モジュールからインテリジェンスモジュールに（又は、この逆方向に）転送される。データセットは、プロセッサ上において稼動していると共にインテリジェンスモジュールのストレージ装置内に保存されているコンピュータコードにより、図２に示されている方法に従って処理された後に、分析モジュールのストレージ装置に返送され、変更されたデータを表示装置上に表示可能である。特定の実施態様においては、ＰＣＲデータ取得装置内にインテリジェントモジュールを実装することも可能である。
【００２０】
プロセス１００は、サーモサイクラーなどのＰＣＲデータ取得装置内に位置するインテリジェンスモジュール内で（例えば、プロセッサ実行命令として）実施されているケースにおいては、データの収集に伴って、データセットをリアルタイムでインテリジェンスモジュールに供給可能であり、或いは、メモリユニット又はバッファ内に保存し、実験が完了した後に、インテリジェンスモジュールに供給することも可能である。同様に、データセットは、取得装置に対するネットワーク接続（例えば、ＬＡＮ、ＶＰＮ、イントラネット、インターネットなど）又は直接接続（例えば、ＵＳＢやその他の直接的な有線又は無線接続）を介してデスクトップコンピュータシステムやその他のコンピュータシステムなどの別個のシステムに供給することも可能であり、或いは、ＣＤ、ＤＶＤ、フロッピー（登録商標）ディスク、又はこれらに類似したものなどの携帯型の媒体上において提供することも可能である。ある態様においては、データセットは、座標値のペアを有するデータポイント（又は、２次元ベクトル）を含んでいる。ＰＣＲデータの場合には、座標値のペアは、通常、サイクル数と蛍光強度値を表している。段階１１０においてデータセットの受領又は取得が完了した後に、データセットを分析することにより、ベースライン領域の終点を決定可能である。
【００２１】
段階１２０において、曲線の近似を算出する。この段階において、ある実施態様においては、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセス又はその他の回帰プロセスによって決定されたパラメータを有するダブルシグモイド関数を使用することにより、データセットを表す曲線の近似を検出している。この近似は、異常値又はスパイクポイントが曲線フィットの品質に対して最小限の影響を有していることから、「ロバスト（ｒｏｂｕｓｔ）」と称されている。図１３（これについては、後述する）は、受領したデータセットのプロットと、本発明に従ってＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｄｔｒ回帰プロセスを使用してダブルシグモイド関数のパラメータを決定することによって決定されたデータセットのロバスト近似の一例を示している。
【００２２】
ある態様においては、データセットを処理してベースライン領域の終点を決定する前に、データセット内の異常値又はスパイクポイントを除去又は置換している。スパイクの除去は、段階１１０においてデータセットを取得する前又は後において実行可能である。図３は、ＰＣＲ又はその他の成長曲線を表すデータセット内のスパイクポイントを識別及び置換するためのプロセスフローを示している。
【００２３】
段階１３０において、後述するように、段階１２０において決定されたパラメータを使用して曲線を正規化することにより、例えば、ベースラインスロープを除去している。この方式による正規化によれば、曲線のベースライン領域の終点又はベースラインの停止位置を決定又は規定することを必要とすることなしに、Ｃｔ値を決定可能である。この結果、後述するように、段階１４０において、正規化済みの曲線を処理してＣｔ値を決定する。
【００２４】
（ＬＭ回帰プロセス）
後述するように、図３の段階５０２〜段階５２４も、データセットの曲線を近似すると共に、フィット関数のパラメータを決定するプロセスフロー（段階１２０）を示している。これらのパラメータは、曲線の正規化（段階１３０）に使用可能である（これは、例えば、本発明のある実施態様によれば、ＰＣＲ曲線などのシグモイド又は成長タイプ曲線を表すデータセットのベースラインスロープの変更又は除去である）。データセットの処理によってスパイクポイントが除去又は置換された変更済みのデータセットが生成されたら、段階５０２〜段階５２４に従って、この変更済みのスパイクを有していないデータセットを処理することにより、フィット関数のパラメータを識別可能である。
【００２５】
図示したある実施態様においては、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）法を使用することにより、データセットのロバスト曲線近似を算出している。ＬＭ法は、非線形の回帰プロセスであり、これは、非線形関数とデータセット間の距離を最小化する反復的な技法である。これは、最急降下プロセスとＧａｕｓｓ−Ｎｅｗｔｏｎプロセスの組み合わせのように振舞うプロセスであり、現在の近似が十分にフィットしていない場合には、最急降下プロセスのように振舞うが（これは、低速であるが、相対的に高い信頼性を有する収束である）、現在の近似が正確になるに伴って、Ｇａｕｓｓ−Ｎｅｗｔｏｎプロセスのように振舞うことになる（これは、相対的に高速であるが、相対的に低い信頼性を有する収束である）。ＬＭ回帰法は、非線形の回帰問題を解決するべく、広く使用されている。
【００２６】
一般的に、ＬＭ回帰法は、様々な入力を必要とすると共に出力を供給するアルゴリズムを含んでいる。ある観点においては、入力は、処理の対象であるデータセットと、このデータへのフィットに使用される関数と、この関数のパラメータ又は変数の初期推定値と、を含んでいる。出力は、関数とデータセット間の距離を最小化する関数のパラメータの組を含んでいる。
【００２７】
ある実施態様よれば、フィット関数は、次のようなダブルシグモイドの形態を有している。
【００２８】
ｆ（ｘ）＝ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１＋ｅｘｐ-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ-f(x-g)）） （１）
【００２９】
この式をフィット関数として選択した理由は、典型的なＰＣＲ曲線又はその他の成長曲線が有する様々な曲線形状にフィットするためのその柔軟性とその能力に基づいている。当業者であれば、必要に応じて、前述のフィット関数やその他のフィット関数の変形を使用可能であることを理解するであろう。
【００３０】
ダブルシグモイド式（１）は、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇという７つのパラメータを有している。この式は、定数、スロープ、及びダブルシグモイドの和に分解可能である。ダブルシグモイド自体は、２つのシグモイドの乗算である。図４は、ダブルシグモイド式（１）の分解を示している。パラメータｄ、ｅ、ｆ、及びｇは、２つのシグモイドの形状を決定している。最終的な曲線に対するこれらの影響を示すために、次のシングルシグモイドを検討する。
【００３１】
１／（１＋ｅｘｐ-d(x-e)） （２）
【００３２】
ここで、パラメータｄは、曲線の「シャープネス」を決定しており、パラメータｅは、変曲点のｘ値を決定している。図５は、曲線に対するパラメータｄの影響と、変曲点のｘ値の位置に対するパラメータｅの影響と、を示している。次の表１は、ダブルシグモイド曲線に対するパラメータの影響を示している。
【００３３】
【表１】
【００３４】
ある観点においては、曲線が非現実的な形状を獲得することを防止するべく、ダブルシグモイド式の「シャープネス」パラメータｄ及びｆを制約する必要がある。従って、ある観点においては、ｄ＜−１又はｄ＞１．１、或いは、ｆ＜−１又はｆ＞１．１におけるすべての反復を失敗と見なしている。その他の態様においては、パラメータｄ及びｆに対する異なる制約を使用可能である。
【００３５】
Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムは、反復的なアルゴリズムであるため、通常は、フィットのための関数のパラメータの初期推定値を必要としている。初期推定値が良好であればあるほど、近似も良好になり、アルゴリズムが局所的な最小値に向かって収束する可能性も低くなる。ダブルシグモイド関数の複雑性とＰＣＲ曲線又はその他の成長曲線の様々な形状に起因し、アルゴリズムがしばしば局所的な最小値に収束することを防止するには、すべてのパラメータにおける１つの初期推定値だけでは、十分ではないであろう。従って、ある観点においては、複数（例えば、３つ以上）の初期パラメータの組を入力し、最良の結果を保持している。ある観点においては、使用している複数のパラメータの組にわたって、大部分のパラメータを一定に保持しており、複数のパラメータの組のそれぞれごとに異なってよいのは、パラメータｃ、ｄ、及びｆのみである。図６は、異なるバラメータの組における３つの曲線形状の例を示している。これらの３つのパラメータの組の選択は、ＰＣＲデータを表す曲線の３つの可能な異なる形状を示している。３つを上回る数のパラメータの組を処理して最良のものを保持することも可能であることを理解されたい。
【００３６】
図３に示されているように、段階５１０において、ＬＭ法の初期入力パラメータを識別している。これらのパラメータは、操作者が入力するか又は算出可能である。一態様によれば、これらのパラメータは、後述するように、段階５０２、５０４、及び５０６によって決定又は設定されている。
【００３７】
（初期パラメータ（ａ）の算出）
パラメータ（ａ）は、ベースラインの高さであり、この値は、初期パラメータのすべての組にわたって同一である。ある観点においては、段階５０４において、データセットから、３番目に小さいｙ軸値（例えば、蛍光値）がパラメータ（ａ）に割り当てられている。この結果、安定した計算が可能である。当然のことながら、その他の態様においては、必要に応じて、最小のｙ軸値や２番目に小さい値などの任意のその他の蛍光値をパラメータ（ａ）に割り当て可能である。
【００３８】
（初期パラメータ（ｂ）の算出）
パラメータ（ｂ）は、ベースライン及びプラトーのスロープである。この値は、初期パラメータのすべての組にわたって同一である。理想的には、なんらのスロープも存在するべきではないことから、ある観点においては、段階５０２において、０．０１という固定値を（ｂ）に対して割り当てている。その他の態様においては、例えば、０〜約０．５の範囲の値などの異なる値をパラメータ（ｂ）に対して割り当て可能である。
【００３９】
（初期パラメータ（ｃ）の算出）
パラメータ（ｃ）は、プラトーの高さ−ベースラインの高さを表しており、これは、ＡＦＩ（Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｃｒｅａｓｅ）として表記される。ある観点においては、最初のパラメータの組においては、ｃ＝ＡＦＩ＋２であり、最後の２つのパラメータの組においては、ｃ＝ＡＦＩである。これが図６に示されており、最後の２つのパラメータの組の場合には、ｃ＝ＡＦＩであり、最初のパラメータの組の場合には、ｃ＝ＡＦＩ＋２である。この変化は、パラメータの最初の組によってモデル化された曲線の形状に起因しており、これは、プラトーを有していない。
【００４０】
（パラメータ（ｄ）及び（ｆ）の算出）
パラメータ（ｄ）及び（ｆ）は、２つのシグモイドのシャープネスを定義している。これらのパラメータにおける曲線に基づいて近似を付与する方法は存在していないことから、ある観点においては、段階５０２において、３つの典型的な固定値を使用している。その他の固定した又は固定されていない値をパラメータ（ｄ）及び／又は（ｆ）に使用することも可能であることを理解されたい。これらのペアは、遭遇するＰＣＲ曲線の大部分の共通的な形状をモデル化している。次の表２は、図６に示されているパラメータの異なる組における（ｄ）及び（ｆ）の値を示している。
【００４１】
【表２】
【００４２】
（パラメータ（ｅ）及び（ｇ）の算出）
段階５０６において、パラメータ（ｅ）及び（ｇ）を決定している。パラメータ（ｅ）及び（ｇ）は、２つのシグモイドの変曲点を定義している。ある観点においては、これらは、いずれも、すべての初期パラメータの組にわたって同一の値を有している。パラメータ（ｅ）及び（ｇ）は、同一又は異なる値を具備可能である。近似を検出するべく、ある観点においては、強度の平均を上回る最初のポイントのｘ値を使用している（これは、例えば、蛍光であるが、スパイクではない）。この態様に従って（ｅ）及び（ｇ）の値を決定するプロセスが図７に示されており、以下、これについて説明する。
【００４３】
図７を参照すれば、まず、曲線の平均（例えば、蛍光強度）を決定している。次いで、平均を上回る最初のデータポイントを識別している。次いで、（ａ）そのポイントが、曲線の開始点の近傍（例えば、最初の５サイクル内）に位置していないかどうか、（ｂ）そのポイントが、曲線の終点の近傍（例えば、最後の５つのサイクル内）に位置していないかどうか、及び（ｃ）そのポイントの周り（例えば、その周りの２ポイントの半径内）の導関数が符号の変化を示していないかどうか（変化を示している場合には、そのポイントは、スパイクである可能性が高く、従って、拒絶する必要がある）を決定している。
【００４４】
次の表３は、一態様による図６に使用されている初期パラメータ値の例を示している。
【００４５】
【表３】
【００４６】
再度図３を参照すれば、段階５１０において、すべてのパラメータが設定された後に、入力されたデータセット、関数、及びパラメータを使用してＬＭプロセス５２０を実行する。従来は、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ法を使用することにより、非線形の最小二乗問題を解決している。従来のＬＭ法においては、曲線の近似とデータセット間の誤差の二乗の合計として定義されている距離の尺度を算出している。しかしながら、二乗の合計を最小化する場合には、異常値の距離が、スパイクではないデータポイントの距離を上回っているために、異常値に対して大きな重みが付与されることになり、この結果、しばしば、不適切な曲線や好ましくない曲線が得られることになってしまう。従って、本発明の一態様によれば、絶対誤差の合計を極小化することにより、近似とデータセット間の距離を演算している（この結果、この場合には、異常値に対して大きな重みが付与されない）。この態様においては、近似とデータ間の距離は、次式によって付与される。
【００４７】
距離＝Σ｜ｙdata−ｙapproximation｜ （３）
【００４８】
前述のように、ある観点においては、段階５２２及び段階５２４に示されているように、複数（例えば、３つ）の初期パラメータの組のそれぞれを入力し、処理した後に、最良の結果を保持しており、この最良の結果は、式（３）における最も小さい又は最小の距離を提供するパラメータの組である。ある観点においては、パラメータの大部分を複数のパラメータの組にわたって一定に保持しており、パラメータのそれぞれの組ごとに異なってよいものは、ｃ、ｄ、及びｆのみである。任意の数の初期パラメータの組を使用可能であることを理解されたい。
【００４９】
図８は、本発明によるパラメータの組におけるＬＭプロセス５２０のプロセスフローを示している。前述のように、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ法は、最急降下プロセス又はＧａｕｓｓ−Ｎｅｗｔｏｎプロセスのように動作可能である。この振る舞いは、減衰係数λによって左右される。λが大きいほど、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムは、最急降下プロセスのように振舞うことになる。一方、λが小さいほど、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムは、Ｇａｕｓｓ−Ｎｅｗｔｏｎプロセスのように振舞うことになる。ある観点においては、λは、０．００１から始まっている。λは、約０．０００００１〜約１．０などの任意のその他の値から始まることも可能であることを理解されたい。
【００５０】
前述のように、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ法は、反復的な技法である。一態様によれば、図８に示されているように、それぞれの反復において、次の各段階を実行している。
【００５１】
１．先行する近似のヘッセ行列（Ｈ）を算出する。
【００５２】
２．先行する近似の転置ヤコビ行列（ＪT）を算出する。
【００５３】
３．先行する近似の距離ベクトル（ｄ）を算出する。
【００５４】
４．現在の減衰係数λにより、次のようにヘッセ行列の対角項を増大させる。
【００５５】
Ｈaug＝Ｈλ （４）
【００５６】
５．増大した式を次のように解く。
【００５７】
Ｈaugｘ＝ＪTｄ （５）
【００５８】
６．増大した式の解ｘを関数のパラメータに追加する。
【００５９】
７．新しい近似及び曲線間の距離を算出する。
【００６０】
８．新しいパラメータの組を有する距離が、以前のパラメータの組を有する距離を下回っている場合には、・その反復は成功であると見なされ、・パラメータの新しい組を維持又は保存し、・減衰係数λを（例えば、係数１０だけ）減少させる。新しいパラメータの組を有する距離が、以前のパラメータの組を有する距離を上回っている場合には、・その反復は失敗であると見なされ、・パラメータの新しい組を破棄し、・減衰係数λを（例えば、係数１０だけ）増大させる。
【００６１】
ある観点においては、図８のＬＭプロセスは、次の基準の中の１つが実現されるまで反復される。
【００６２】
１．既定の反復回数Ｎだけ既に実行されている。この第１の基準は、アルゴリズムが無制限に反復されることを防止している。例えば、図１０に示されているある観点においては、既定の反復値Ｎは、１００である。アルゴリズムが収束可能である場合には、１００回の反復は、アルゴリズムが収束するのに十分なものであるはずである。一般に、Ｎは、１０未満〜１００超の範囲をとることができる。
【００６３】
２．２つの成功した反復間の距離の差が閾値（例えば、０．０００１）を下回っている。差が非常に小さくなった場合には、所望の精度が既に実現されており、解がそれ以上大幅に良好になることはないことから、反復を継続するのは無意味である。
【００６４】
３．減衰係数λが既定の値を超過している（例えば、１０20を上回っている）。λが非常に大きくなると、アルゴリズムは、現在の解よりも良好に収束することはなく、従って、反復を継続するのは無意味である。一般に、この規定値は、１０20を大幅に下回る又は上回るものであってよい。
【００６５】
（正規化）
パラメータの決定が完了した後に、ある実施態様においては、決定されたパラメータの１つ又は複数のものを使用して曲線を正規化している（段階１３０）。例えば、ある観点においては、曲線の線形成長部分を減算することにより、ゼロのベースラインスロープを有するように曲線を正規化又は調節可能である。数学的には、これは、次のように表される。
【００６６】
ｄａｔａＮｅｗ（ＢＬＳ）＝ｄａｔａ−（ａ＋ｂｘ） （６）
【００６７】
ここで、ｄａｔａＮｅｗ（ＢＬＳ）は、ベースライン減算の後の正規化された信号であり、これは、例えば、線形成長又はベースラインスロープが減算又は除去されたデータセット（ｄａｔａ）である。パラメータａ及びｂの値は、ＬＭ式を使用して曲線回帰させることによって決定された値であり、ｘは、サイクル数である。従って、ｘ軸に沿ったすべてのデータ値について、定数ａとスロープｂにｘ値を乗算したものをデータから減算することにより、ゼロのベースラインスロープを有するデータ曲線を生成している。ある態様においては、ＬＭ回帰プロセスをデータセットに適用して正規化パラメータを決定する前に、スパイクポイントをデータセットから除去している。
【００６８】
別の態様においては、次式に従って、ゼロのスロープを有するように曲線を正規化又は調節可能である。
【００６９】
ｄａｔａＮｅｗ（ＢＬＳＤ）＝（ｄａｔａ−（ａ＋ｂｘ））／ａ （７ａ）
【００７０】
ここで、ｄａｔａＮｅｗ（ＢＬＳＤ）は、除算を有するベースライン減算の後の正規化された信号であり、これは、例えば、線形成長又はベースラインスロープを減算又は除去し、この結果をａによって除算したデータセット（ｄａｔａ）である。パラメータａ及びｂの値は、ＬＭ式を使用して曲線回帰させることによって決定された値であり、ｘは、サイクル数である。従って、ｘ軸に沿ったすべての値について、定数ａとスロープｂにｘ値を乗算したものをデータから減算し、この結果をパラメータａの値によって除算することにより、ゼロのベースラインスロープを有するデータ曲線を生成している。ある観点においては、式（７ａ）は、パラメータ”ａ”≧１の場合に有効であり、”ａ”＜１の場合には、次の式が使用される。
【００７１】
ｄａｔａＮｅｗ（ＢＬＳＤ）＝ｄａｔａ−（ａ＋ｂｘ） （７ｂ）
【００７２】
ある態様においては、ＬＭ回帰プロセスをデータセットに適用して正規化パラメータを決定する前に、スパイクポイントをデータセットから除去している。
【００７３】
更に別の態様においては、曲線は、次式に従って正規化又は調節可能である。
【００７４】
ｄａｔａＮｅｗ（ＢＬＤ）＝ｄａｔａ／ａ （８ａ）
【００７５】
ここで、ｄａｔａＮｅｗ（ＢＬＤ）は、ベースライン除算の後の正規化済みの信号であり、これは、例えば、パラメータａによって除算されたデータセット（ｄａｔａ）である。パラメータａ及びｂの値は、ＬＭ式を使用して曲線回帰させることによって決定された値であり、ｘは、サイクル数である。ある観点においては、式（８ａ）は、パラメータ”ａ”≧１の場合に有効であり、”ａ”＜１の場合には、次の式が使用される。
【００７６】
ｄａｔａＮｅｗ（ＢＬＤ）＝ｄａｔａ＋（１−ａ） （８ｂ）
【００７７】
ある態様においては、ＬＭ回帰プロセスをデータセットに適用して正規化パラメータを決定する前に、スパイクポイントをデータセットから除去している。
【００７８】
更に別の態様においては、次の式に従って曲線を正規化又は調節可能である。
【００７９】
ｄａｔａＮｅｗ（ＰＧＴ）＝（ｄａｔａ−（ａ＋ｂｘ））／ｃ （９ａ）
【００８０】
この場合に、ｄａｔａＮｅｗ（ＰＧＴ）は、除算を伴うベースライン減算の後の正規化済みの信号であり、これは、例えば、線形成長又はベースラインスロープを減算又は除去し、この結果をｃによって除算したデータセット（ｄａｔａ）である。ａ、ｂ、及びｃの値は、ＬＭ式を使用して曲線回帰させることによって決定された値であり、ｘは、サイクル数である。従って、ｘ軸に沿ったすべてのデータ値について、定数ａとスロープｂにｘ値を乗算したものをデータから除算し、この結果をパラメータｃの値によって除算することにより、ゼロのベースラインスロープを有するデータ曲線を生成している。ある観点においては、式（９ａ）は、パラメータ”ｃ”≧１の場合に有効であり、パラメータ”ｃ”＜１及び”ｃ”≧０の場合には、次の式を使用する。
【００８１】
ｄａｔａＮｅｗ（ＰＧＴ）＝ｄａｔａ−（ａ＋ｂｘ） （９ｂ）
【００８２】
ある態様においては、ＬＭ回帰プロセスをデータセットに適用して正規化パラメータを決定する前に、データセットからスパイクポイントを除去している。
【００８３】
当業者であれば、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ又はその他の回帰プロセスによって決定されたパラメータを使用することにより、その他の正規化式を使用してベースラインを正規化及び／又は変更可能であることを理解するであろう。
【００８４】
（曲率決定）
式（６）、（７）、（８）、又は（９）、或いは、その他の正規化式のいずれかを使用した曲線の正規化が完了した後に、Ｃｔ値を決定可能である。ある観点においては、動力学的ＰＣＲ曲線のエルボー値又はＣｔ値を決定するためのプロセスフローを示している図９を参照して説明するように、曲率決定プロセス又は方法を正規化済みの曲線に適用している。段階９１０において、データセットを取得している。決定プロセスが、サーモサイクラーなどのＰＣＲデータ取得装置内に位置するインテリジェンスモジュール内で（例えば、プロセッサ実行命令として）実施されているケースにおいては、データセットは、データの収集に伴って、インテリジェンスモジュールにリアルタイムで供給可能であり、或いは、メモリユニット又はバッファ内に保存し、実験が完了した後に、モジュールに供給することも可能である。同様に、データセットは、取得装置に対するネットワーク接続（例えば、ＬＡＮ、ＶＰＮ、イントラネット、インターネットなど）又は直接接続（例えば、ＵＳＢ又はその他の直接的な有線又は無線接続）を介してデスクトップコンピュータシステムなどの別個のシステムに供給することも可能であり、或いは、ＣＤ、ＤＶＤ、フロッピー（登録商標）ディスク、又はこれらに類似したものなどの携帯型の媒体上において供給することも可能である。
【００８５】
データセットの受領又は取得が完了した後に、段階９２０において、曲線に対する近似を決定する。この段階においては、ある実施態様においては、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ回帰プロセスによって決定されたパラメータを有するダブルシグモイド関数を使用することにより、データセットを表す曲線の近似を検出している。又、図３を参照して説明したように、段階９２０の前に、スパイクポイントをデータセットから除去することも可能である。例えば、段階９１０において取得されたデータセットは、既にスパイクが除去されているデータセットであってもよい。段階９３０において、曲線を正規化する。ある態様においては、前述の式（６）、（７）、（８）、又は（９）の中のいずれかを使用して曲線を正規化している。例えば、段階９２０において決定したダブルシグモイド式のパラメータを使用し、前述の式（６）に従ってベースラインスロープを減算することにより、ベースラインをゼロスロープに設定可能である。段階９４０において、プロセスを正規化済みの曲線に対して適用することにより、正規化済みの曲線に沿ったポイントにおける曲率を決定している。曲率対サイクル数のプロットを返すと共に／又は表示可能である。最大曲率のポイントがエルボー値又はＣｔ値に対応している。段階９５０において、結果を、例えば、分析を実行したシステム又は分析を要求した別個のシステムに対して返している。段階９６０において、Ｃｔ値を表示している。データセットの全体や曲線の近似などの追加データを表示することも可能である。図９の分析を実行したシステムと結合されているモニター画面又はプリンタなどの表示装置によってグラフィカルな表示をレンダリングすることも可能であり、或いは、表示装置上においてレンダリングするべく別個のシステムにデータを供給することも可能である。
【００８６】
ある実施態様よれば、この曲線のＣｔ値を取得するべく、最大曲率を決定している。ある観点においては、正規化済みの曲線上のいくつか又はすべてのポイントにおける曲率を決定している。曲率対サイクル数のプロットを表示可能である。曲線の曲率は、次式によって付与される。
【００８７】
【数１】
【００８８】
次式によって付与される半径ａの円を検討する。
【００８９】
【数２】
【００９０】
式（１１）の曲率は、ｋａｐｐａ（ｘ）＝−（１／ａ）である。従って、曲率の半径は、曲率の負の逆数に等しい。円の半径が一定であるため、その曲率は、−（１／ａ）によって付与される。ここで、図１０ｂを検討する。これは、図１０ａのＰＣＲデータセットのフィットの曲率のプロットである。Ｃｔ値は、最大曲率の位置において発生すると考えられ、これは、サイクル数Ｃｔ＝２１．８４において発生している。このＣｔ値は、図１０ａに示されているＰＣＲ成長曲線に良好に対応している。
【００９１】
最大曲率（これは、２１．８４のＣｔ値に対応している）における曲率半径は、半径＝１／０．２８１８＝３．５５サイクルである。この半径の円を図１０ａのＰＣＲ成長曲線に重ね合わせたものが図１１に示されている。図１１が示しているように、この最大曲率に対応する半径の円は、曲線に正接した状態で曲線の成長領域の開始点に重ね合わせることができる最大の円を表している。小さな（最大の）曲率半径を有する曲線は、急峻な成長曲線を有することになり、大きな（最大の）曲率半径を有する曲線は、穏やかな成長曲線を有することになる。曲率半径が極端に大きい場合には、これは、明らかな信号を有していない曲線を示している。
【００９２】
曲率の計算において必要な式（１）のダブルシグモイドの１次及び２次導関数を次に示しておく。
【００９３】
（１次導関数）
【数３】
【００９４】
（２次導関数）
【数４】
【実施例】
【００９５】
図１２ａは、成長曲線の未加工のデータの一例を示している。ダブルシグモイド／ＬＭ法を図１２ｂに示されている未加工のデータプロットに適用することにより、次の表４に示されている式（１）の７つのパラメータの値が得られる。
【００９６】
【表４】
【００９７】
図１３には、図１２に示されているデータに対するダブルシグモイドフィットが示されており、これは、データポイントの非常に正確な評価を示している。次いで、これらのデータを式（６）（ベースライン減算）に従って正規化することにより、図１４に示されているグラフが得られる。図１４に示されている実線は、式（６）に従って正規化済みのこのデータセットに対する式（１）のダブルシグモイド／ＬＭの適用結果である。図１５は、図１４の正規化済みの曲線における曲率対サイクル数のプロットを示している。曲率の最大値である０．１３７８の曲率は、サイクル数３４．４２において発生している。従って、この最大曲率におけるサイクル数に基づいて、Ｃｔ＝３４．４２であり、曲率半径＝１／０．１３７８＝７．２５である。この曲率半径を有する円と正規化済みのデータセットを重ね合わせたものが図１６に示されている。
【００９８】
「遅成長（ｓｌｏｗ−ｇｒｏｗｅｒ）」データセットの一例が図１７に示されている。このデータセットに対するダブルシグモイドフィットとベースライン減算（式（６））を使用した正規化により、図１８に示されているフィット結果が得られる。対応する曲率プロットが図１９に示されている。最大曲率である曲率＝０．００１０９２７４は、サイクル数２５．９０において発生しており、これは、曲率半径＝９１５に対応している。この大きな曲率半径は、これが遅成長（ｓｌｏｗ ｇｒｏｗｅｒ）データセットであることを示している。
【００９９】
別の例として、図２０に示されているＰＣＲ成長曲線の組を検討する。既存の方法（「閾値」）を使用して得られたＣｔ値対除算を伴うベースライン減算（ＢＬＳＤ−式（７））を使用して得られたＣｔ値の比較が、次の表５に示されている。
【０１００】
【表５】
【０１０１】
表５は、Ｃｔ値を算出する曲率法（この場合には、ＢＬＳＤによる正規化の後におけるものである）によれば、既存の閾値法と比べて、小さなＣｖ（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）が得られることを示している。又、曲率法によって算出された曲率半径（Ｒａｄｉｕｓ Ｏｆ Ｃｕｒｖａｔｕｒｅ：ＲＯＣ）は、線形曲線と真の成長曲線を弁別するための簡単な方法を提供している。
【０１０２】
（結論）
本発明の一態様によれば、成長曲線のベースラインの終点におけるポイントを決定するコンピュータにより実施される方法が提供される。この方法は、通常、成長曲線を表すデータセットを受領する段階であって、このデータセットは、それぞれが座標値のペアを有する複数のデータポイントを含んでいる、段階と、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用してデータセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、関数のパラメータを決定する段階と、を含んでいる。本方法は、通常、決定されたパラメータを使用して曲線を正規化し、正規化された曲線を生成する段階と、正規化済みの曲線を処理して最大曲率のポイントの座標値を決定する段階と、を更に含んでおり、このポイントは、成長曲線のベースライン領域の終点を表している。ある観点においては、正規化済みの曲線を処理することにより、曲線に沿ったいくつか又はすべてのポイントにおける曲率を決定している。特定の実施態様においては、本方法は、正規化済みの曲線の曲率のプロットを表示する段階を更に含んでいる。
【０１０３】
ある観点においては、データセットは、動力学的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセス、バクテリアプロセス、酵素プロセス、又はバインディングプロセスの成長曲線を表している。特定の実施態様においては、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積は、蛍光強度値、ルミネセンス強度値、ケミルミネセンス強度値、リン光強度値、電荷転送値、バイオルミネセンス強度値、又は吸収値の中の１つによって表されている。
【０１０４】
別の実施例においては、曲線は、動力学的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスの成長曲線を表しており、ベースライン領域の終点におけるポイントは、動力学的なＰＣＲ曲線のエルボー又はサイクル閾値（Ｃｔ）を表しており、この場合に、最大曲率を有するポイントがＣｔ値を表している。ある態様においては、座標値のペアは、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積とサイクル数を表している。別の態様においては、本方法は、Ｃｔ値を返す段階を更に含んでいる。更に別の態様においては、本方法は、Ｃｔ値を表示する段階を更に含んでいる。
【０１０５】
ある態様においては、正規化する段階は、曲線の線形成長部分を減算する段階を含んでいる。ある態様においては、受領したデータセットは、１つ又は複数の異常値又はスパイクポイントを除去するべく処理済みのデータセットを含んでいる。
【０１０６】
ある態様においては、ダブルシグモイド関数は、ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１＋ｅｘｐ-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ-f(x-g)））という形態を有しており、算出段階は、この関数のパラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇの中の１つ又は複数のものを反復的に決定する段階を含んでいる。特定の実施態様においては、少なくともパラメータａ及びｂが決定され、正規化段階は、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算する段階を含んでいる。別の特定の実施態様においては、少なくともパラメータａが決定され、正規化段階は、曲線をパラメータａによって除算する段階を含んでいる。更に別の特定の実施態様においては、少なくともパラメータａ及びｂが決定され、正規化する段階は、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算し、この結果をパラメータａによって除算する段階を含んでいる。
【０１０７】
別の実施例においては、少なくともパラメータａ、ｂ、及びｃが決定され、正規化段階は、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算する段階と、この結果をパラメータｃによって除算する段階と、を含んでいる。
【０１０８】
本発明の別の態様によれば、プロセッサを制御して成長曲線のベースライン領域の終点におけるポイントを決定するためのコードを含むコンピュータ読み取り可能な媒体が提供される。このコードは、通常、成長曲線を表すデータセットを受領し（このデータセットは、それぞれが座標値のペアを有する複数のデータポイントを含んでいる）、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用してデータセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、この関数のパラメータを決定するための命令を含んでいる。又、本コードは、通常、決定されたパラメータを使用して曲線を正規化して正規化済みの曲線を生成し、正規化済みの曲線を処理して最大曲率のポイントの座標値を決定するための命令をも含んでおり、このポイントが成長曲線のベースライン領域の終点を表している。
【０１０９】
特定の実施態様においては、コンピュータ読み取り可能な媒体は、正規化済みの曲線の曲率のプロットを表示するための命令を更に含んでいる。ある態様においては、本コードは、ベースライン領域の終点におけるポイントの座標値を返す又は表示するための命令を更に含んでいる。
【０１１０】
ある観点においては、データセットは、動力学的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセス、バクテリアプロセス、酵素プロセス、又はバインディングプロセスの成長曲線を表している。別の態様においては、コンピュータ読み取り可能な媒体は、Ｃｔ値を表示するための命令を更に含んでいる。更に別の実施例においては、コンピュータ読み取り可能な媒体は、Ｃｔ値を返すための命令を更に含んでいる。
【０１１１】
特定の実施態様においては、データセットは、動力学的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスの成長曲線を表しており、ベースライン領域の終点におけるポイントは、成長曲線のエルボー又はサイクル閾値（Ｃｔ）を表している。別の実施例においては、座標値のペアは、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積とサイクル数を表している。更に別の実施例においては、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積は、蛍光強度値、ルミネセンス強度値、ケミルミネセンス強度値、リン光強度値、電荷転送値、バイオルミネセンス強度値、又は吸収値の中の１つによって表されている。
【０１１２】
ある観点においては、処理するための命令は、正規化済みの曲線に沿ったいくつか又はすべてのポイントにおける曲率を決定するための命令を含んでいる。ある態様においては、正規化するための命令は、データセットから線形成長部分を減算するための命令を含んでいる。別の態様においては、曲線は、動力学的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスの増幅曲線であり、ベースライン領域の終点におけるポイントは、動力学的ＰＣＲ曲線のエルボー又はサイクル閾値（Ｃｔ）を表しており、最大曲率を有するポイントがＣｔ値を表している。
【０１１３】
特定の実施態様においては、ダブルシグモイド関数は、ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１＋ｅｘｐ-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ-f(x-g)））という形態を有しており、算出するための命令は、この関数のパラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇの中の１つ又は複数のものを反復的に決定するための命令を含んでいる。
【０１１４】
ある態様においては、少なくともパラメータａ及びｂが決定され、正規化するための命令は、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算するための命令を含んでいる。別の態様においては、少なくともパラメータａ、ｂ、及びｃが決定され、正規化するための命令は、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算し、この結果をパラメータｃによって除算するための命令を含んでいる。更に別の態様においては、少なくともパラメータａが決定され、正規化するための命令は、曲線をパラメータａによって除算するための命令を含んでいる。更に別の態様においては、少なくともパラメータａ及びｂが決定され、正規化するための命令は、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算し、この結果をパラメータａによって除算するための命令を含んでいる。
【０１１５】
本発明の更に別の態様によれば、動力学的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムが提供される。本システムは、通常、動力学的なＰＣＲ増幅曲線を表すＰＣＲデータセットを生成する動力学的ＰＣＲ分析モジュール（このデータセットは、それぞれが座標値のペアを有する複数のデータポイントを含んでおり、且つ、本データセットは、サイクル閾値（Ｃｔ）を含む注目の領域内にデータポイントを含んでいる）と、ＰＣＲデータセットを処理してＣｔ値を決定するべく適合されたインテリジェンスモジュールと、を含んでいる。インテリジェンスモジュールは、通常、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用してデータセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、関数のパラメータを決定し、決定されたパラメータを使用して曲線を正規化して正規化済みの曲線を生成すると共に、正規化済みの曲線を処理して最大曲率のポイントの座標値を決定することにより（このポイントは、成長曲線のサイクル閾値（Ｃｔ）を表している）、ＰＣＲデータセットを処理する。
【０１１６】
ある態様においては、ダブルシグモイド関数は、ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１＋ｅｘｐ-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ-f(x-g)））という形態を有しており、算出段階は、この関数のパラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇの中の１つ又は複数のものを反復的に決定する段階を含んでいる。特定の実施態様においては、少なくともパラメータａ及びｂが決定され、正規化段階は、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算する段階を含んでいる。別の特定の実施態様においては、パラメータａ及びｂが決定され、正規化する段階は、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算する段階と、この結果をパラメータａによって除算する段階を含んでいる。更に別の特定の実施態様においては、少なくともパラメータａが決定され、正規化する段階は、パラメータａによって曲線を除算する段階を含んでいる。
【０１１７】
別のある態様においては、少なくともパラメータａ、ｂ、及びｃが決定され、正規化する段階は、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算する段階と、この結果をパラメータｃによって除算する段階と、を含んでいる。
【０１１８】
ある観点においては、正規化済みの曲線を処理することにより、曲線に沿ったいくつか又はすべてのポイントにおける曲率を決定しており、この場合に、最大曲率を有するポイントがＣｔ値を表している。特定の実施態様においては、インテリジェンスモジュールは、正規化済みの曲線の曲率のプロットの表示をレンダリングするべく更に適合されている。
【０１１９】
ある態様においては、正規化する段階は、データセットから線形成長部分を減算する段階を含んでいる。特定の実施態様においては、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算することによって曲線フィットを正規化している。
【０１２０】
特定の実施態様においては、インテリジェンスモジュールは、Ｃｔ値を返すべく更に適合されている。別の実施例においては、インテリジェンスモジュールは、Ｃｔ値を表示するべく更に適合されている。
【０１２１】
別の態様においては、座標値のペアは、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積とサイクル数を表している。特定の実施態様においては、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積は、蛍光強度値、ルミネセンス強度値、ケミルミネセンス強度値、リン光強度値、電荷転送値、ケミルミネセンス強度値、又は吸収値の中の１つによって表されている。
【０１２２】
特定の実施態様においては、動力学的ＰＣＲ分析モジュールは、動力学的なサーモサイクラー装置内に存在しており、インテリジェンスモジュールは、分析モジュールに通信可能に結合されたプロセッサを含んでいる。別の特定の実施態様においては、インテリジェンスモジュールは、ネットワーク接続又は直接接続のいずれかによって分析モジュールに結合されたコンピュータシステム内に存在するプロセッサを含んでいる。
【０１２３】
曲線フィッティング及び曲率決定プロセスを含むＣｔ決定プロセスは、コンピュータシステムのプロセッサ上において稼動するコンピュータコードとして実施可能であることを理解されたい。このコードは、プロセッサを制御してＣｔ決定プロセスの様々な態様及び段階を実施するための命令を含んでいる。本コードは、通常、ハードディスク、ＲＡＭ、或いは、ＣＤやＤＶＤなどの携帯型の媒体上に保存される。同様に、これらのプロセスは、プロセッサに結合されたメモリユニット内に保存されているプロセッサ実行命令を含むサーモサイクラーなどのＰＣＲ装置内で実施することも可能である。このような命令を含むコードは、周知のように、コード供給源に対するネットワーク接続又は直接的な接続を介して、或いは、携帯型の媒体を使用することにより、ＰＣＲ装置のメモリにダウンロード可能である。
【０１２４】
当業者であれば、本発明のエルボー決定プロセスは、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｆｏｒｔｒａｎ、ＶｉｓｕａｌＢａｓｉｃなどの様々なプログラミング言語、並びに、データの視覚化及び分析に有用な事前パッケージングされたルーチン、関数、及び手順を提供するＭａｔｈｅｍａｔｉｃａなどのアプリケーションを使用してコーディング可能であることを理解するであろう。後者の更なる例がＭＡＴＬＡＢ（登録商標）である。
【０１２５】
以上、一例として、特定の実施態様の観点から本発明について説明したが、本発明は開示された実施例に限定されるものではないことを理解されたい。逆に、本発明は、当業者には明らかな様々な変更及び類似の構成を包含することを意図するものである。従って、添付の請求項の範囲には、これらのあらゆる変更及び類似の構成を包含するべく、最も広範な解釈を付与することを要するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】蛍光強度対サイクル数としてプロットされた典型的なＰＣＲ成長曲線の一例を示している。
【図２】成長曲線のベースライン領域の終点（又は、ＰＣＲ曲線のＣｔ値）を決定するためのプロセスフローを示している。
【図３Ａ】本発明のある実施態様によるスパイクの識別及び置換プロセスの詳細なプロセスフローを示している。
【図３Ｂ】本発明のある実施態様によるスパイクの識別及び置換プロセスの詳細なプロセスフローを示している。
【図３Ｃ】本発明のある実施態様によるスパイクの識別及び置換プロセスの詳細なプロセスフローを示している。
【図３Ｄ】本発明のある実施態様によるスパイクの識別及び置換プロセスの詳細なプロセスフローを示している。
【図３Ｅ】本発明のある実施態様によるスパイクの識別及び置換プロセスの詳細なプロセスフローを示している。
【図３Ｆ】本発明のある実施態様によるスパイクの識別及び置換プロセスの詳細なプロセスフローを示している。
【図４】パラメータａ〜ｇを含むダブルシグモイド式の分解を示している。
【図５】曲線に対するパラメータ（ｄ）の影響と、変曲点のｘ値の位置に対する（ｅ）の影響を示している。図５のすべての曲線は、パラメータ（ｄ）を除いて同一のパラメータを有している。
【図６】異なるパラメータの組における３つの曲線形状の一例を示している。
【図７Ａ】一態様に従ってダブルシグモイド式のパラメータ（ｅ）及び（ｇ）の値を決定するプロセスを示している。
【図７Ｂ】一態様に従ってダブルシグモイド式のパラメータ（ｅ）及び（ｇ）の値を決定するプロセスを示している。
【図８Ａ】初期のパラメータの組におけるＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ回帰プロセスのプロセスフローを示している。
【図８Ｂ】初期のパラメータの組におけるＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ回帰プロセスのプロセスフローを示している。
【図８Ｃ】初期のパラメータの組におけるＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ回帰プロセスのプロセスフローを示している。
【図８Ｄ】初期のパラメータの組におけるＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ回帰プロセスのプロセスフローを示している。
【図９】ある実施態様従ってＰＣＲプロセスのエルボー値を決定する更に詳細なプロセスフローを示している。
【図１０】図１０ａは、ダブルシグモイドを使用して実験データにフィットされた典型的な成長曲線を示している。図１０ｂは、図１０ａのダブルシグモイド曲線の曲率のプロットを示している。
【図１１】図１０ａの成長曲線に重ね合わせられた最大曲率のポイントに正接する円を示している。
【図１２ａ】成長曲線のデータセットの一例を示している。
【図１２ｂ】図１２ａのデータセットのプロットを示している。
【図１３】図１２のデータセットに対するダブルシグモイドフィットを示している。
【図１４】式（６）のベースライン減算法を使用した正規化の後の図１２（図１３）のデータセット(並びに、ダブルシグモイドフィット）を示している。
【図１５】図１４の正規化済みのデータセットにおける曲率対サイクル数のプロットを示している。
【図１６】最大曲率半径を有する円と図１４の正規化済みのデータセットの重ね合わせを示している。
【図１７】「遅成長（ｓｌｏｗ−ｇｒｏｗｅｒ）」データセットの一例を示している。
【図１８】式（６）のベースライン減算法を使用した正規化の後の図１７のデータセット及びダブルシグモイドフィットを示している。
【図１９】図１８の正規化済みのデータセットにおける曲率対サイクル数のプロットを示している。
【図２０】反復ラン及び負サンプルを含むＰＣＲ成長曲線の組のプロットを示している。
【図２１】ソフトウェア及びハードウェア資源間における関係を示す概略的なブロックダイアグラムを示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、シグモイド又は成長曲線を表すデータを処理するシステム及び方法に関するものであり、更に詳しくは、ＰＣＲ増幅曲線の特徴的なサイクル閾値（Ｃｙｃｌｅ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：Ｃｔ）又はエルボー値、或いは、その他の成長曲線のエルボー値を決定するシステム及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）は、規定の核酸配列を酵素によって合成又は増幅する体外的な方法である。この反応においては、通常、正反対の鎖にハイブリダイズし、増幅対象のテンプレート又は標的ＤＮＡ配列にフランキングする２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。該プライマーの伸長は、熱安定性を有するＤＮＡポリメラーゼにより触媒される。テンプレートの変性、プライマーのアニーリング、及びアニーリングされたプライマーのポリメラーゼによる伸長を伴う反復的な一連のサイクルの結果として、特定のＤＮＡフラグメントが指数的に蓄積される。通常、このプロセスにおいては、増幅プロセスの検出及び定量化を円滑に実行するべく、蛍光プローブ又はマーカーが使用されている。
【０００３】
図１には、典型的なリアルタイムのＰＣＲ曲線が示されており、典型的なＰＣＲプロセスにおける蛍光強度値がサイクル数に対してプロットされている。このケースにおいては、ＰＣＲプロセスのそれぞれのサイクルにおいて、ＰＣＲ産物の形成がモニタリングされている。増幅は、通常、増幅反応の際に蛍光信号を計測するコンポーネント及び装置を含むサーモサイクラー内において計測される。このようなサーモサイクラーの一例が、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒである（Ｃａｔ． Ｎｏ．２０１１０４６８）。例えば、増幅産物は、標的核酸に結合した際にのみ蛍光信号を放出する蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブによるか、或いは、場合によっては二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光染料により、検出される。
【０００４】
典型的なＰＣＲ曲線において、ベースライン領域の終点における遷移点（これは、一般に、エルボー値又はサイクル閾値（Ｃｔ）と呼ばれている）を識別することは、ＰＣＲ増幅プロセスの特性を理解するのに非常に有用である。Ｃｔ値は、ＰＣＲプロセスの効率の尺度として使用可能である。例えば、通常、分析対象であるすべての反応について規定の信号閾値を決定し、この閾値に到達するのに必要なサイクル数（Ｃｔ）を標的核酸及び標準又はハウスキーピング遺伝子などの基準核酸について決定する。標的核酸及び基準核酸について得られたＣｔ値に基づいて、標的分子の絶対的又は相対的なコピー数を決定可能である（Ｇｉｂｓｏｎ他による「Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」（６巻、９９５〜１００１頁）、Ｂｉｅｃｈｅ他による「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」（５９巻、２７５９〜２７６５頁、１９９９年）、ＷＯ ９７／４６７０７、ＷＯ ９７／４６７１２、ＷＯ ９７／４６７１４）。図１のベースライン領域１５の終点にある領域２０のエルボー値は、サイクル数３０の領域に位置しうる。
【０００５】
ＰＣＲ曲線のエルボー値は、いくつかの既存の方法を使用して決定可能である。例えば、様々な現在の方法においては、ＡＦＬ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｖａｌｕｅ）と呼ばれる既定のレベルに蛍光が到達する値としてエルボーの実際の値を決定している。その他の現在の方法においては、蛍光対サイクル数の二次導関数が極大値に到達するサイクル数を使用することがある。これらの方法は、いずれも欠点を有している。例えば、方法によっては、異常値（雑音）データの影響を非常に受けやすく、ＡＦＬ値法は、高いベースラインを有するデータセットには、十分に機能しない。図１に示されている成長曲線のベースラインの停止点（又は、ベースラインの終点）を決定する従来の方法は、特に、高タイター環境においては、満足に機能することができない。更には、これらのアルゴリズムは、通常、明確に規定されておらず、線形依存性であり、且つ、不可能でないにしても、最適化が非常に困難であるという、多数（例えば、５０個以上）のパラメータを有している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、前述の及びその他の問題点を克服するシグモイドタイプ又は成長曲線などの曲線（特に、ＰＣＲ曲線）のエルボー値を決定するシステム及び方法を提供することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、シグモイド又は成長タイプの曲線のエルボー値などの特徴的な遷移値を決定する新しい効率的なシステム及び方法を提供する。ある実施においては、本発明のシステム及び方法は、ＰＣＲ増幅曲線のサイクル閾値（Ｃｔ）を決定するのに特に有用である。
【０００８】
本発明によれば、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスによって決定されたパラメータを有するダブルシグモイドを使用することにより、ＰＣＲデータセットにフィットする曲線に対する近似を検出している。パラメータの決定が完了したら、決定されたパラメータの１つ又は複数のものを使用し、その曲線を正規化可能である。正規化の後に、正規化済みの曲線を処理することにより、曲線に沿ったいくつか又はすべてのポイントにおける曲線の曲率を決定し、例えば、曲率対サイクル数を表すデータセット又はプロットを生成する。最大曲率が発生するサイクル数がＣｔ値に対応している。この結果、Ｃｔ値が返され、これを表示するか又は更なる処理に使用可能である。
【０００９】
本発明の第１の態様においては、成長曲線のベースライン領域の終点におけるポイントを決定するコンピュータにより実施される方法であって：
−成長曲線を表すデータセットであって、それぞれが座標値のペアを有する複数のデータポイントを含んでいるデータセットを受領する段階と、
−Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用してデータセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、この関数のパラメータを決定する段階と、
−決定されたパラメータを使用して曲線を正規化し、正規化済みの曲線を生成する段階と、
−正規化済みの曲線を処理することにより、長曲線のベースライン領域の終点を表す最大曲率のポイントを決定する段階と、
を含んで成る方法を提供する。
【００１０】
本発明の第２の態様においては、プロセッサを制御して成長曲線のベースライン領域の終点におけるポイントを決定するためのコードを含むコンピュータ読み取り可能な媒体が提供され、このコードは、
−成長曲線を表すデータセットを受領する段階であって、このデータセットは、それぞれが座標値のペアを有する複数のデータポイントを含んでいる、段階と、
−Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用してデータセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、この関数のパラメータを決定する段階と、
−決定されたパラメータを使用して曲線を正規化し、正規化済みの曲線を生成する段階と、
−正規化済みの曲線を処理することにより、最大曲率のポイントを決定する段階であって、この最大曲率のポイントは、成長曲線のベースライン領域の終点を表している、段階と、
を実行する命令を含んでいる。
【００１１】
本発明の更に別の態様においては、動力学的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムであって：
−動力学的なＰＣＲ増幅曲線を表すＰＣＲデータセットを生成する動力学的ＰＣＲ分析モジュールであって、このデータセットは、それぞれが座標値のペアを有する複数のデータポイントを含んでおり、且つ、このデータセットは、サイクル閾値（Ｃｔ）を含む注目の領域内にデータポイントを含んでいる、動力学的ＰＣＲ分析モジュールと；
−ＰＣＲデータセットを、
−Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用してデータセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、この関数のパラメータを決定する段階と、
−決定されたパラメータを使用して曲線を正規化し、正規化済みの曲線を生成する段階と、
−正規化済みの曲線を処理することにより、成長曲線のサイクル閾値（Ｃｔ）を表す最大曲率のポイントを決定する段階と、により、
処理してＣｔ値を決定するべく適合されたインテリジェンスモジュール；
を有している。
【００１２】
添付の図面と請求項を含む本明細書の残りの部分を参照することにより、本発明のその他の特徴及び利点について理解することができよう。以下、添付の図面との関連において、本発明の更なる特徴及び利点、並びに、本発明の様々な実施例の構造及び動作について詳細に説明することとする。尚、添付図面中においては、類似の参照符号により、同一又は機能的に類似した要素を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、ＰＣＲ増幅曲線のベースライン領域の終点又はエルボー値又はＣｔ値などのシグモイド又は成長曲線の遷移値を決定するためのシステム及び方法を提供する。ある態様においては、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスによって決定されたパラメータを有するダブルシグモイド関数を使用することにより、曲線に対する近似を検出している。パラメータの決定が完了したら、決定されたパラメータの１つ又は複数のものを使用して曲線を正規化可能である。正規化の後に、正規化済みの曲線は、曲線に沿ったいくつか又はすべてのポイントにおける曲線の曲率を決定するように、例えば、曲率対サイクル数を表すデータセット又はプロットを生成するように処理される。最大曲率が発生するサイクル数はＣｔ値に対応している。この結果、Ｃｔ値が返され、これを表示するか又は更なる処理に使用可能である。
【００１４】
一例としてＰＣＲプロセスの環境における成長又は増幅曲線１０を図１に示す。図示のように、曲線１０は、遅滞期領域１５と、対数期領域２５と、を含んでいる。遅滞期領域１５は、一般に、ベースライン又はベースライン領域と呼ばれている。このような曲線１０は、遅滞期領域と対数期領域を結びつける注目の遷移領域２０を含んでいる。領域２０は、一般に、エルボー又はエルボー領域と呼ばれている。エルボー領域は、通常、ベースラインの終点と、基礎となっているプロセスの成長又は増幅レートにおける遷移と、を規定する。領域２０内の特定の遷移ポイントを識別することは、基礎となっているプロセスの振る舞いを分析するのに有用であろう。典型的なＰＣＲ曲線において、エルボー値又はサイクル閾値（Ｃｔ）と呼ばれる遷移ポイントを識別することは、ＰＣＲプロセスの効率特性を理解するのに非常に有用である。
【００１５】
同様のシグモイド又は成長曲線を提供可能なその他のプロセスには、細菌的なプロセス、酵素的なプロセス、及び結合のプロセスが含まれる。例えば、細菌増殖曲線において、注目の遷移ポイントは、遅滞期における時点θと称される。本発明に従って分析可能なデータ曲線を生成するその他の具体的なプロセスは、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）プロセス、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）プロセス、及びＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）プロセスを含んでいる。ＳＤＡ及びＮＡＳＢＡプロセスの例及びデータ曲線については、それぞれ、Ｗａｎｇ，Ｓｈａ−Ｓｈａ他による「Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｂｙ Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ Ｅｔ Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ、２００３年、４９（１０）、１５９９頁）と、Ｗｅｕｓｔｅｎ、Ｊｏｓ Ｊ．Ａ．Ｍ．他による「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｌｏａｄｓ Ｕｓｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ」（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００２年、３０（６）、２６）を参照されたい。従って、本明細書の残りの部分においては、ＰＣＲ曲線に対するその適用可能性の観点から本発明の実施例及び態様について説明することとするが、本発明は、その他のプロセスに関係したデータ曲線にも適用可能であることを理解されたい。
【００１６】
図１に示されているように、典型的なＰＣＲ成長曲線のデータは、例えば、ｘ軸を規定するＰＣＲサイクル数と、ｙ軸を規定する蓄積されたポリヌクレオチドの成長のインジケータと、によるものなどの２次元座標系において表現可能である。通常は、蛍光マーカーの使用が、恐らくは、最も広範に使用されている標識の方式であることから、図１に示されているように、蓄積された成長のインジケータは、蛍光の強度値である。但し、使用する特定の標識及び／又は検出の方式に応じて、その他のインジケータを使用することも可能であることを理解されたい。蓄積された信号成長のその他の有用なインジケータの例には、ルミネセンス強度、ケミルミネセンス強度、バイオルミネセンス強度、リン光強度、電荷転送、電圧、電流、電力、エネルギー、温度、粘度、光散乱、放射性強度、反射率、透過率、及び吸光度が含まれている。サイクルの定義も、時間、プロセスサイクル、単位動作サイクル、及び再生サイクルを包含可能である。
【００１７】
（全般的プロセスの概要）
本発明によれば、動力学的なＰＣＲ増幅曲線のエルボー値又はＣｔ値などのシングルシグモイド曲線の遷移値を決定するプロセスの一実施例１００については、図２を参照することにより、簡潔に説明可能である。段階１１０において、曲線を表す実験データセットを受領するか又は取得する。図１には、プロットされたＰＣＲデータセットの一例が示されており、この場合には、ｙ軸とｘ軸は、それぞれ、ＰＣＲ曲線の蛍光強度とサイクル数を表している。ある態様においては、このデータセットは、連続的であって軸に沿って等間隔を有するデータを含むべきである。
【００１８】
本発明の例示的な実施態様においては、本方法は、キーボード、マウス、及びこれらに類似したものなどのデータセットを入力するための入力装置；モニターなどの、曲線の領域内の注目の特定のポイントを表すための表示装置；ＣＰＵなどの本方法のそれぞれの段階を実行するのに必要な処理装置；モデムなどのネットワークインターフェイス；データセットを保存するためのデータストレージ装置；プロセッサ上において稼動するコンピュータコード；及びこれらに類似したものを含む（但し、これらに限定されない）従来のパーソナルコンピュータシステムを使用することによって実施可能である。又、本方法は、ＰＣＲ装置内で実施することも可能である。
【００１９】
図２１には、本発明によるシステムが表示されている。この図は、ソフトウェア及びハードウェア資源間における関係を示す概略的なブロックダイアグラムを示している。本システムは、サーモサイクラー内に配置可能な動力学的ＰＣＲ分析モジュールと、コンピュータシステムの一部であるインテリジェンスモジュールと、を有している。データセット（ＰＣＲデータセット）は、ネットワーク接続又は直接接続を介して分析モジュールからインテリジェンスモジュールに（又は、この逆方向に）転送される。データセットは、プロセッサ上において稼動していると共にインテリジェンスモジュールのストレージ装置内に保存されているコンピュータコードにより、図２に示されている方法に従って処理された後に、分析モジュールのストレージ装置に返送され、変更されたデータを表示装置上に表示可能である。特定の実施態様においては、ＰＣＲデータ取得装置内にインテリジェントモジュールを実装することも可能である。
【００２０】
プロセス１００は、サーモサイクラーなどのＰＣＲデータ取得装置内に位置するインテリジェンスモジュール内で（例えば、プロセッサ実行命令として）実施されているケースにおいては、データの収集に伴って、データセットをリアルタイムでインテリジェンスモジュールに供給可能であり、或いは、メモリユニット又はバッファ内に保存し、実験が完了した後に、インテリジェンスモジュールに供給することも可能である。同様に、データセットは、取得装置に対するネットワーク接続（例えば、ＬＡＮ、ＶＰＮ、イントラネット、インターネットなど）又は直接接続（例えば、ＵＳＢやその他の直接的な有線又は無線接続）を介してデスクトップコンピュータシステムやその他のコンピュータシステムなどの別個のシステムに供給することも可能であり、或いは、ＣＤ、ＤＶＤ、フロッピー（登録商標）ディスク、又はこれらに類似したものなどの携帯型の媒体上において提供することも可能である。ある態様においては、データセットは、座標値のペアを有するデータポイント（又は、２次元ベクトル）を含んでいる。ＰＣＲデータの場合には、座標値のペアは、通常、サイクル数と蛍光強度値を表している。段階１１０においてデータセットの受領又は取得が完了した後に、データセットを分析することにより、ベースライン領域の終点を決定可能である。
【００２１】
段階１２０において、曲線の近似を算出する。この段階において、ある実施態様においては、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセス又はその他の回帰プロセスによって決定されたパラメータを有するダブルシグモイド関数を使用することにより、データセットを表す曲線の近似を検出している。この近似は、異常値又はスパイクポイントが曲線フィットの品質に対して最小限の影響を有していることから、「ロバスト（ｒｏｂｕｓｔ）」と称されている。図１３（これについては、後述する）は、受領したデータセットのプロットと、本発明に従ってＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｄｔｒ回帰プロセスを使用してダブルシグモイド関数のパラメータを決定することによって決定されたデータセットのロバスト近似の一例を示している。
【００２２】
ある態様においては、データセットを処理してベースライン領域の終点を決定する前に、データセット内の異常値又はスパイクポイントを除去又は置換している。スパイクの除去は、段階１１０においてデータセットを取得する前又は後において実行可能である。図３は、ＰＣＲ又はその他の成長曲線を表すデータセット内のスパイクポイントを識別及び置換するためのプロセスフローを示している。
【００２３】
段階１３０において、後述するように、段階１２０において決定されたパラメータを使用して曲線を正規化することにより、例えば、ベースラインスロープを除去している。この方式による正規化によれば、曲線のベースライン領域の終点又はベースラインの停止位置を決定又は規定することを必要とすることなしに、Ｃｔ値を決定可能である。この結果、後述するように、段階１４０において、正規化済みの曲線を処理してＣｔ値を決定する。
【００２４】
（ＬＭ回帰プロセス）
後述するように、図３の段階５０２〜段階５２４も、データセットの曲線を近似すると共に、フィット関数のパラメータを決定するプロセスフロー（段階１２０）を示している。これらのパラメータは、曲線の正規化（段階１３０）に使用可能である（これは、例えば、本発明のある実施態様によれば、ＰＣＲ曲線などのシグモイド又は成長タイプ曲線を表すデータセットのベースラインスロープの変更又は除去である）。データセットの処理によってスパイクポイントが除去又は置換された変更済みのデータセットが生成されたら、段階５０２〜段階５２４に従って、この変更済みのスパイクを有していないデータセットを処理することにより、フィット関数のパラメータを識別可能である。
【００２５】
図示したある実施態様においては、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）法を使用することにより、データセットのロバスト曲線近似を算出している。ＬＭ法は、非線形の回帰プロセスであり、これは、非線形関数とデータセット間の距離を最小化する反復的な技法である。これは、最急降下プロセスとＧａｕｓｓ−Ｎｅｗｔｏｎプロセスの組み合わせのように振舞うプロセスであり、現在の近似が十分にフィットしていない場合には、最急降下プロセスのように振舞うが（これは、低速であるが、相対的に高い信頼性を有する収束である）、現在の近似が正確になるに伴って、Ｇａｕｓｓ−Ｎｅｗｔｏｎプロセスのように振舞うことになる（これは、相対的に高速であるが、相対的に低い信頼性を有する収束である）。ＬＭ回帰法は、非線形の回帰問題を解決するべく、広く使用されている。
【００２６】
一般的に、ＬＭ回帰法は、様々な入力を必要とすると共に出力を供給するアルゴリズムを含んでいる。ある観点においては、入力は、処理の対象であるデータセットと、このデータへのフィットに使用される関数と、この関数のパラメータ又は変数の初期推定値と、を含んでいる。出力は、関数とデータセット間の距離を最小化する関数のパラメータの組を含んでいる。
【００２７】
ある実施態様よれば、フィット関数は、次のようなダブルシグモイドの形態を有している。
【００２８】
ｆ（ｘ）＝ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１＋ｅｘｐ-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ-f(x-g)）） （１）
【００２９】
この式をフィット関数として選択した理由は、典型的なＰＣＲ曲線又はその他の成長曲線が有する様々な曲線形状にフィットするためのその柔軟性とその能力に基づいている。当業者であれば、必要に応じて、前述のフィット関数やその他のフィット関数の変形を使用可能であることを理解するであろう。
【００３０】
ダブルシグモイド式（１）は、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇという７つのパラメータを有している。この式は、定数、スロープ、及びダブルシグモイドの和に分解可能である。ダブルシグモイド自体は、２つのシグモイドの乗算である。図４は、ダブルシグモイド式（１）の分解を示している。パラメータｄ、ｅ、ｆ、及びｇは、２つのシグモイドの形状を決定している。最終的な曲線に対するこれらの影響を示すために、次のシングルシグモイドを検討する。
【００３１】
１／（１＋ｅｘｐ-d(x-e)） （２）
【００３２】
ここで、パラメータｄは、曲線の「シャープネス」を決定しており、パラメータｅは、変曲点のｘ値を決定している。図５は、曲線に対するパラメータｄの影響と、変曲点のｘ値の位置に対するパラメータｅの影響と、を示している。次の表１は、ダブルシグモイド曲線に対するパラメータの影響を示している。
【００３３】
【表１】
【００３４】
ある観点においては、曲線が非現実的な形状を獲得することを防止するべく、ダブルシグモイド式の「シャープネス」パラメータｄ及びｆを制約する必要がある。従って、ある観点においては、ｄ＜−１又はｄ＞１．１、或いは、ｆ＜−１又はｆ＞１．１におけるすべての反復を失敗と見なしている。その他の態様においては、パラメータｄ及びｆに対する異なる制約を使用可能である。
【００３５】
Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムは、反復的なアルゴリズムであるため、通常は、フィットのための関数のパラメータの初期推定値を必要としている。初期推定値が良好であればあるほど、近似も良好になり、アルゴリズムが局所的な最小値に向かって収束する可能性も低くなる。ダブルシグモイド関数の複雑性とＰＣＲ曲線又はその他の成長曲線の様々な形状に起因し、アルゴリズムがしばしば局所的な最小値に収束することを防止するには、すべてのパラメータにおける１つの初期推定値だけでは、十分ではないであろう。従って、ある観点においては、複数（例えば、３つ以上）の初期パラメータの組を入力し、最良の結果を保持している。ある観点においては、使用している複数のパラメータの組にわたって、大部分のパラメータを一定に保持しており、複数のパラメータの組のそれぞれごとに異なってよいのは、パラメータｃ、ｄ、及びｆのみである。図６は、異なるバラメータの組における３つの曲線形状の例を示している。これらの３つのパラメータの組の選択は、ＰＣＲデータを表す曲線の３つの可能な異なる形状を示している。３つを上回る数のパラメータの組を処理して最良のものを保持することも可能であることを理解されたい。
【００３６】
図３に示されているように、段階５１０において、ＬＭ法の初期入力パラメータを識別している。これらのパラメータは、操作者が入力するか又は算出可能である。一態様によれば、これらのパラメータは、後述するように、段階５０２、５０４、及び５０６によって決定又は設定されている。
【００３７】
（初期パラメータ（ａ）の算出）
パラメータ（ａ）は、ベースラインの高さであり、この値は、初期パラメータのすべての組にわたって同一である。ある観点においては、段階５０４において、データセットから、３番目に小さいｙ軸値（例えば、蛍光値）がパラメータ（ａ）に割り当てられている。この結果、安定した計算が可能である。当然のことながら、その他の態様においては、必要に応じて、最小のｙ軸値や２番目に小さい値などの任意のその他の蛍光値をパラメータ（ａ）に割り当て可能である。
【００３８】
（初期パラメータ（ｂ）の算出）
パラメータ（ｂ）は、ベースライン及びプラトーのスロープである。この値は、初期パラメータのすべての組にわたって同一である。理想的には、なんらのスロープも存在するべきではないことから、ある観点においては、段階５０２において、０．０１という固定値を（ｂ）に対して割り当てている。その他の態様においては、例えば、０〜約０．５の範囲の値などの異なる値をパラメータ（ｂ）に対して割り当て可能である。
【００３９】
（初期パラメータ（ｃ）の算出）
パラメータ（ｃ）は、プラトーの高さ−ベースラインの高さを表しており、これは、ＡＦＩ（Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｃｒｅａｓｅ）として表記される。ある観点においては、最初のパラメータの組においては、ｃ＝ＡＦＩ＋２であり、最後の２つのパラメータの組においては、ｃ＝ＡＦＩである。これが図６に示されており、最後の２つのパラメータの組の場合には、ｃ＝ＡＦＩであり、最初のパラメータの組の場合には、ｃ＝ＡＦＩ＋２である。この変化は、パラメータの最初の組によってモデル化された曲線の形状に起因しており、これは、プラトーを有していない。
【００４０】
（パラメータ（ｄ）及び（ｆ）の算出）
パラメータ（ｄ）及び（ｆ）は、２つのシグモイドのシャープネスを定義している。これらのパラメータにおける曲線に基づいて近似を付与する方法は存在していないことから、ある観点においては、段階５０２において、３つの典型的な固定値を使用している。その他の固定した又は固定されていない値をパラメータ（ｄ）及び／又は（ｆ）に使用することも可能であることを理解されたい。これらのペアは、遭遇するＰＣＲ曲線の大部分の共通的な形状をモデル化している。次の表２は、図６に示されているパラメータの異なる組における（ｄ）及び（ｆ）の値を示している。
【００４１】
【表２】
【００４２】
（パラメータ（ｅ）及び（ｇ）の算出）
段階５０６において、パラメータ（ｅ）及び（ｇ）を決定している。パラメータ（ｅ）及び（ｇ）は、２つのシグモイドの変曲点を定義している。ある観点においては、これらは、いずれも、すべての初期パラメータの組にわたって同一の値を有している。パラメータ（ｅ）及び（ｇ）は、同一又は異なる値を具備可能である。近似を検出するべく、ある観点においては、強度の平均を上回る最初のポイントのｘ値を使用している（これは、例えば、蛍光であるが、スパイクではない）。この態様に従って（ｅ）及び（ｇ）の値を決定するプロセスが図７に示されており、以下、これについて説明する。
【００４３】
図７を参照すれば、まず、曲線の平均（例えば、蛍光強度）を決定している。次いで、平均を上回る最初のデータポイントを識別している。次いで、（ａ）そのポイントが、曲線の開始点の近傍（例えば、最初の５サイクル内）に位置していないかどうか、（ｂ）そのポイントが、曲線の終点の近傍（例えば、最後の５つのサイクル内）に位置していないかどうか、及び（ｃ）そのポイントの周り（例えば、その周りの２ポイントの半径内）の導関数が符号の変化を示していないかどうか（変化を示している場合には、そのポイントは、スパイクである可能性が高く、従って、拒絶する必要がある）を決定している。
【００４４】
次の表３は、一態様による図６に使用されている初期パラメータ値の例を示している。
【００４５】
【表３】
【００４６】
再度図３を参照すれば、段階５１０において、すべてのパラメータが設定された後に、入力されたデータセット、関数、及びパラメータを使用してＬＭプロセス５２０を実行する。従来は、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ法を使用することにより、非線形の最小二乗問題を解決している。従来のＬＭ法においては、曲線の近似とデータセット間の誤差の二乗の合計として定義されている距離の尺度を算出している。しかしながら、二乗の合計を最小化する場合には、異常値の距離が、スパイクではないデータポイントの距離を上回っているために、異常値に対して大きな重みが付与されることになり、この結果、しばしば、不適切な曲線や好ましくない曲線が得られることになってしまう。従って、本発明の一態様によれば、絶対誤差の合計を極小化することにより、近似とデータセット間の距離を演算している（この結果、この場合には、異常値に対して大きな重みが付与されない）。この態様においては、近似とデータ間の距離は、次式によって付与される。
【００４７】
距離＝Σ｜ｙdata−ｙapproximation｜ （３）
【００４８】
前述のように、ある観点においては、段階５２２及び段階５２４に示されているように、複数（例えば、３つ）の初期パラメータの組のそれぞれを入力し、処理した後に、最良の結果を保持しており、この最良の結果は、式（３）における最も小さい又は最小の距離を提供するパラメータの組である。ある観点においては、パラメータの大部分を複数のパラメータの組にわたって一定に保持しており、パラメータのそれぞれの組ごとに異なってよいものは、ｃ、ｄ、及びｆのみである。任意の数の初期パラメータの組を使用可能であることを理解されたい。
【００４９】
図８は、本発明によるパラメータの組におけるＬＭプロセス５２０のプロセスフローを示している。前述のように、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ法は、最急降下プロセス又はＧａｕｓｓ−Ｎｅｗｔｏｎプロセスのように動作可能である。この振る舞いは、減衰係数λによって左右される。λが大きいほど、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムは、最急降下プロセスのように振舞うことになる。一方、λが小さいほど、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムは、Ｇａｕｓｓ−Ｎｅｗｔｏｎプロセスのように振舞うことになる。ある観点においては、λは、０．００１から始まっている。λは、約０．０００００１〜約１．０などの任意のその他の値から始まることも可能であることを理解されたい。
【００５０】
前述のように、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ法は、反復的な技法である。一態様によれば、図８に示されているように、それぞれの反復において、次の各段階を実行している。
【００５１】
１．先行する近似のヘッセ行列（Ｈ）を算出する。
【００５２】
２．先行する近似の転置ヤコビ行列（ＪT）を算出する。
【００５３】
３．先行する近似の距離ベクトル（ｄ）を算出する。
【００５４】
４．現在の減衰係数λにより、次のようにヘッセ行列の対角項を増大させる。
【００５５】
Ｈaug＝Ｈλ （４）
【００５６】
５．増大した式を次のように解く。
【００５７】
Ｈaugｘ＝ＪTｄ （５）
【００５８】
６．増大した式の解ｘを関数のパラメータに追加する。
【００５９】
７．新しい近似及び曲線間の距離を算出する。
【００６０】
８．新しいパラメータの組を有する距離が、以前のパラメータの組を有する距離を下回っている場合には、・その反復は成功であると見なされ、・パラメータの新しい組を維持又は保存し、・減衰係数λを（例えば、係数１０だけ）減少させる。新しいパラメータの組を有する距離が、以前のパラメータの組を有する距離を上回っている場合には、・その反復は失敗であると見なされ、・パラメータの新しい組を破棄し、・減衰係数λを（例えば、係数１０だけ）増大させる。
【００６１】
ある観点においては、図８のＬＭプロセスは、次の基準の中の１つが実現されるまで反復される。
【００６２】
１．既定の反復回数Ｎだけ既に実行されている。この第１の基準は、アルゴリズムが無制限に反復されることを防止している。例えば、図１０に示されているある観点においては、既定の反復値Ｎは、１００である。アルゴリズムが収束可能である場合には、１００回の反復は、アルゴリズムが収束するのに十分なものであるはずである。一般に、Ｎは、１０未満〜１００超の範囲をとることができる。
【００６３】
２．２つの成功した反復間の距離の差が閾値（例えば、０．０００１）を下回っている。差が非常に小さくなった場合には、所望の精度が既に実現されており、解がそれ以上大幅に良好になることはないことから、反復を継続するのは無意味である。
【００６４】
３．減衰係数λが既定の値を超過している（例えば、１０20を上回っている）。λが非常に大きくなると、アルゴリズムは、現在の解よりも良好に収束することはなく、従って、反復を継続するのは無意味である。一般に、この規定値は、１０20を大幅に下回る又は上回るものであってよい。
【００６５】
（正規化）
パラメータの決定が完了した後に、ある実施態様においては、決定されたパラメータの１つ又は複数のものを使用して曲線を正規化している（段階１３０）。例えば、ある観点においては、曲線の線形成長部分を減算することにより、ゼロのベースラインスロープを有するように曲線を正規化又は調節可能である。数学的には、これは、次のように表される。
【００６６】
ｄａｔａＮｅｗ（ＢＬＳ）＝ｄａｔａ−（ａ＋ｂｘ） （６）
【００６７】
ここで、ｄａｔａＮｅｗ（ＢＬＳ）は、ベースライン減算の後の正規化された信号であり、これは、例えば、線形成長又はベースラインスロープが減算又は除去されたデータセット（ｄａｔａ）である。パラメータａ及びｂの値は、ＬＭ式を使用して曲線回帰させることによって決定された値であり、ｘは、サイクル数である。従って、ｘ軸に沿ったすべてのデータ値について、定数ａとスロープｂにｘ値を乗算したものをデータから減算することにより、ゼロのベースラインスロープを有するデータ曲線を生成している。ある態様においては、ＬＭ回帰プロセスをデータセットに適用して正規化パラメータを決定する前に、スパイクポイントをデータセットから除去している。
【００６８】
別の態様においては、次式に従って、ゼロのスロープを有するように曲線を正規化又は調節可能である。
【００６９】
ｄａｔａＮｅｗ（ＢＬＳＤ）＝（ｄａｔａ−（ａ＋ｂｘ））／ａ （７ａ）
【００７０】
ここで、ｄａｔａＮｅｗ（ＢＬＳＤ）は、除算を有するベースライン減算の後の正規化された信号であり、これは、例えば、線形成長又はベースラインスロープを減算又は除去し、この結果をａによって除算したデータセット（ｄａｔａ）である。パラメータａ及びｂの値は、ＬＭ式を使用して曲線回帰させることによって決定された値であり、ｘは、サイクル数である。従って、ｘ軸に沿ったすべての値について、定数ａとスロープｂにｘ値を乗算したものをデータから減算し、この結果をパラメータａの値によって除算することにより、ゼロのベースラインスロープを有するデータ曲線を生成している。ある観点においては、式（７ａ）は、パラメータ”ａ”≧１の場合に有効であり、”ａ”＜１の場合には、次の式が使用される。
【００７１】
ｄａｔａＮｅｗ（ＢＬＳＤ）＝ｄａｔａ−（ａ＋ｂｘ） （７ｂ）
【００７２】
ある態様においては、ＬＭ回帰プロセスをデータセットに適用して正規化パラメータを決定する前に、スパイクポイントをデータセットから除去している。
【００７３】
更に別の態様においては、曲線は、次式に従って正規化又は調節可能である。
【００７４】
ｄａｔａＮｅｗ（ＢＬＤ）＝ｄａｔａ／ａ （８ａ）
【００７５】
ここで、ｄａｔａＮｅｗ（ＢＬＤ）は、ベースライン除算の後の正規化済みの信号であり、これは、例えば、パラメータａによって除算されたデータセット（ｄａｔａ）である。パラメータａ及びｂの値は、ＬＭ式を使用して曲線回帰させることによって決定された値であり、ｘは、サイクル数である。ある観点においては、式（８ａ）は、パラメータ”ａ”≧１の場合に有効であり、”ａ”＜１の場合には、次の式が使用される。
【００７６】
ｄａｔａＮｅｗ（ＢＬＤ）＝ｄａｔａ＋（１−ａ） （８ｂ）
【００７７】
ある態様においては、ＬＭ回帰プロセスをデータセットに適用して正規化パラメータを決定する前に、スパイクポイントをデータセットから除去している。
【００７８】
更に別の態様においては、次の式に従って曲線を正規化又は調節可能である。
【００７９】
ｄａｔａＮｅｗ（ＰＧＴ）＝（ｄａｔａ−（ａ＋ｂｘ））／ｃ （９ａ）
【００８０】
この場合に、ｄａｔａＮｅｗ（ＰＧＴ）は、除算を伴うベースライン減算の後の正規化済みの信号であり、これは、例えば、線形成長又はベースラインスロープを減算又は除去し、この結果をｃによって除算したデータセット（ｄａｔａ）である。ａ、ｂ、及びｃの値は、ＬＭ式を使用して曲線回帰させることによって決定された値であり、ｘは、サイクル数である。従って、ｘ軸に沿ったすべてのデータ値について、定数ａとスロープｂにｘ値を乗算したものをデータから除算し、この結果をパラメータｃの値によって除算することにより、ゼロのベースラインスロープを有するデータ曲線を生成している。ある観点においては、式（９ａ）は、パラメータ”ｃ”≧１の場合に有効であり、パラメータ”ｃ”＜１及び”ｃ”≧０の場合には、次の式を使用する。
【００８１】
ｄａｔａＮｅｗ（ＰＧＴ）＝ｄａｔａ−（ａ＋ｂｘ） （９ｂ）
【００８２】
ある態様においては、ＬＭ回帰プロセスをデータセットに適用して正規化パラメータを決定する前に、データセットからスパイクポイントを除去している。
【００８３】
当業者であれば、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ又はその他の回帰プロセスによって決定されたパラメータを使用することにより、その他の正規化式を使用してベースラインを正規化及び／又は変更可能であることを理解するであろう。
【００８４】
（曲率決定）
式（６）、（７）、（８）、又は（９）、或いは、その他の正規化式のいずれかを使用した曲線の正規化が完了した後に、Ｃｔ値を決定可能である。ある観点においては、動力学的ＰＣＲ曲線のエルボー値又はＣｔ値を決定するためのプロセスフローを示している図９を参照して説明するように、曲率決定プロセス又は方法を正規化済みの曲線に適用している。段階９１０において、データセットを取得している。決定プロセスが、サーモサイクラーなどのＰＣＲデータ取得装置内に位置するインテリジェンスモジュール内で（例えば、プロセッサ実行命令として）実施されているケースにおいては、データセットは、データの収集に伴って、インテリジェンスモジュールにリアルタイムで供給可能であり、或いは、メモリユニット又はバッファ内に保存し、実験が完了した後に、モジュールに供給することも可能である。同様に、データセットは、取得装置に対するネットワーク接続（例えば、ＬＡＮ、ＶＰＮ、イントラネット、インターネットなど）又は直接接続（例えば、ＵＳＢ又はその他の直接的な有線又は無線接続）を介してデスクトップコンピュータシステムなどの別個のシステムに供給することも可能であり、或いは、ＣＤ、ＤＶＤ、フロッピー（登録商標）ディスク、又はこれらに類似したものなどの携帯型の媒体上において供給することも可能である。
【００８５】
データセットの受領又は取得が完了した後に、段階９２０において、曲線に対する近似を決定する。この段階においては、ある実施態様においては、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ回帰プロセスによって決定されたパラメータを有するダブルシグモイド関数を使用することにより、データセットを表す曲線の近似を検出している。又、図３を参照して説明したように、段階９２０の前に、スパイクポイントをデータセットから除去することも可能である。例えば、段階９１０において取得されたデータセットは、既にスパイクが除去されているデータセットであってもよい。段階９３０において、曲線を正規化する。ある態様においては、前述の式（６）、（７）、（８）、又は（９）の中のいずれかを使用して曲線を正規化している。例えば、段階９２０において決定したダブルシグモイド式のパラメータを使用し、前述の式（６）に従ってベースラインスロープを減算することにより、ベースラインをゼロスロープに設定可能である。段階９４０において、プロセスを正規化済みの曲線に対して適用することにより、正規化済みの曲線に沿ったポイントにおける曲率を決定している。曲率対サイクル数のプロットを返すと共に／又は表示可能である。最大曲率のポイントがエルボー値又はＣｔ値に対応している。段階９５０において、結果を、例えば、分析を実行したシステム又は分析を要求した別個のシステムに対して返している。段階９６０において、Ｃｔ値を表示している。データセットの全体や曲線の近似などの追加データを表示することも可能である。図９の分析を実行したシステムと結合されているモニター画面又はプリンタなどの表示装置によってグラフィカルな表示をレンダリングすることも可能であり、或いは、表示装置上においてレンダリングするべく別個のシステムにデータを供給することも可能である。
【００８６】
ある実施態様よれば、この曲線のＣｔ値を取得するべく、最大曲率を決定している。ある観点においては、正規化済みの曲線上のいくつか又はすべてのポイントにおける曲率を決定している。曲率対サイクル数のプロットを表示可能である。曲線の曲率は、次式によって付与される。
【００８７】
【数１】
【００８８】
次式によって付与される半径ａの円を検討する。
【００８９】
【数２】
【００９０】
式（１１）の曲率は、ｋａｐｐａ（ｘ）＝−（１／ａ）である。従って、曲率の半径は、曲率の負の逆数に等しい。円の半径が一定であるため、その曲率は、−（１／ａ）によって付与される。ここで、図１０ｂを検討する。これは、図１０ａのＰＣＲデータセットのフィットの曲率のプロットである。Ｃｔ値は、最大曲率の位置において発生すると考えられ、これは、サイクル数Ｃｔ＝２１．８４において発生している。このＣｔ値は、図１０ａに示されているＰＣＲ成長曲線に良好に対応している。
【００９１】
最大曲率（これは、２１．８４のＣｔ値に対応している）における曲率半径は、半径＝１／０．２８１８＝３．５５サイクルである。この半径の円を図１０ａのＰＣＲ成長曲線に重ね合わせたものが図１１に示されている。図１１が示しているように、この最大曲率に対応する半径の円は、曲線に正接した状態で曲線の成長領域の開始点に重ね合わせることができる最大の円を表している。小さな（最大の）曲率半径を有する曲線は、急峻な成長曲線を有することになり、大きな（最大の）曲率半径を有する曲線は、穏やかな成長曲線を有することになる。曲率半径が極端に大きい場合には、これは、明らかな信号を有していない曲線を示している。
【００９２】
曲率の計算において必要な式（１）のダブルシグモイドの１次及び２次導関数を次に示しておく。
【００９３】
（１次導関数）
【数３】
【００９４】
（２次導関数）
【数４】
【実施例】
【００９５】
図１２ａは、成長曲線の未加工のデータの一例を示している。ダブルシグモイド／ＬＭ法を図１２ｂに示されている未加工のデータプロットに適用することにより、次の表４に示されている式（１）の７つのパラメータの値が得られる。
【００９６】
【表４】
【００９７】
図１３には、図１２に示されているデータに対するダブルシグモイドフィットが示されており、これは、データポイントの非常に正確な評価を示している。次いで、これらのデータを式（６）（ベースライン減算）に従って正規化することにより、図１４に示されているグラフが得られる。図１４に示されている実線は、式（６）に従って正規化済みのこのデータセットに対する式（１）のダブルシグモイド／ＬＭの適用結果である。図１５は、図１４の正規化済みの曲線における曲率対サイクル数のプロットを示している。曲率の最大値である０．１３７８の曲率は、サイクル数３４．４２において発生している。従って、この最大曲率におけるサイクル数に基づいて、Ｃｔ＝３４．４２であり、曲率半径＝１／０．１３７８＝７．２５である。この曲率半径を有する円と正規化済みのデータセットを重ね合わせたものが図１６に示されている。
【００９８】
「遅成長（ｓｌｏｗ−ｇｒｏｗｅｒ）」データセットの一例が図１７に示されている。このデータセットに対するダブルシグモイドフィットとベースライン減算（式（６））を使用した正規化により、図１８に示されているフィット結果が得られる。対応する曲率プロットが図１９に示されている。最大曲率である曲率＝０．００１０９２７４は、サイクル数２５．９０において発生しており、これは、曲率半径＝９１５に対応している。この大きな曲率半径は、これが遅成長（ｓｌｏｗ ｇｒｏｗｅｒ）データセットであることを示している。
【００９９】
別の例として、図２０に示されているＰＣＲ成長曲線の組を検討する。既存の方法（「閾値」）を使用して得られたＣｔ値対除算を伴うベースライン減算（ＢＬＳＤ−式（７））を使用して得られたＣｔ値の比較が、次の表５に示されている。
【０１００】
【表５】
【０１０１】
表５は、Ｃｔ値を算出する曲率法（この場合には、ＢＬＳＤによる正規化の後におけるものである）によれば、既存の閾値法と比べて、小さなＣｖ（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）が得られることを示している。又、曲率法によって算出された曲率半径（Ｒａｄｉｕｓ Ｏｆ Ｃｕｒｖａｔｕｒｅ：ＲＯＣ）は、線形曲線と真の成長曲線を弁別するための簡単な方法を提供している。
【０１０２】
（結論）
本発明の一態様によれば、成長曲線のベースラインの終点におけるポイントを決定するコンピュータにより実施される方法が提供される。この方法は、通常、成長曲線を表すデータセットを受領する段階であって、このデータセットは、それぞれが座標値のペアを有する複数のデータポイントを含んでいる、段階と、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用してデータセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、関数のパラメータを決定する段階と、を含んでいる。本方法は、通常、決定されたパラメータを使用して曲線を正規化し、正規化された曲線を生成する段階と、正規化済みの曲線を処理して最大曲率のポイントの座標値を決定する段階と、を更に含んでおり、このポイントは、成長曲線のベースライン領域の終点を表している。ある観点においては、正規化済みの曲線を処理することにより、曲線に沿ったいくつか又はすべてのポイントにおける曲率を決定している。特定の実施態様においては、本方法は、正規化済みの曲線の曲率のプロットを表示する段階を更に含んでいる。
【０１０３】
ある観点においては、データセットは、動力学的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセス、バクテリアプロセス、酵素プロセス、又はバインディングプロセスの成長曲線を表している。特定の実施態様においては、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積は、蛍光強度値、ルミネセンス強度値、ケミルミネセンス強度値、リン光強度値、電荷転送値、バイオルミネセンス強度値、又は吸収値の中の１つによって表されている。
【０１０４】
別の実施例においては、曲線は、動力学的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスの成長曲線を表しており、ベースライン領域の終点におけるポイントは、動力学的なＰＣＲ曲線のエルボー又はサイクル閾値（Ｃｔ）を表しており、この場合に、最大曲率を有するポイントがＣｔ値を表している。ある態様においては、座標値のペアは、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積とサイクル数を表している。別の態様においては、本方法は、Ｃｔ値を返す段階を更に含んでいる。更に別の態様においては、本方法は、Ｃｔ値を表示する段階を更に含んでいる。
【０１０５】
ある態様においては、正規化する段階は、曲線の線形成長部分を減算する段階を含んでいる。ある態様においては、受領したデータセットは、１つ又は複数の異常値又はスパイクポイントを除去するべく処理済みのデータセットを含んでいる。
【０１０６】
ある態様においては、ダブルシグモイド関数は、ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１＋ｅｘｐ-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ-f(x-g)））という形態を有しており、算出段階は、この関数のパラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇの中の１つ又は複数のものを反復的に決定する段階を含んでいる。特定の実施態様においては、少なくともパラメータａ及びｂが決定され、正規化段階は、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算する段階を含んでいる。別の特定の実施態様においては、少なくともパラメータａが決定され、正規化段階は、曲線をパラメータａによって除算する段階を含んでいる。更に別の特定の実施態様においては、少なくともパラメータａ及びｂが決定され、正規化する段階は、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算し、この結果をパラメータａによって除算する段階を含んでいる。
【０１０７】
別の実施例においては、少なくともパラメータａ、ｂ、及びｃが決定され、正規化段階は、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算する段階と、この結果をパラメータｃによって除算する段階と、を含んでいる。
【０１０８】
本発明の別の態様によれば、プロセッサを制御して成長曲線のベースライン領域の終点におけるポイントを決定するためのコードを含むコンピュータ読み取り可能な媒体が提供される。このコードは、通常、成長曲線を表すデータセットを受領し（このデータセットは、それぞれが座標値のペアを有する複数のデータポイントを含んでいる）、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用してデータセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、この関数のパラメータを決定するための命令を含んでいる。又、本コードは、通常、決定されたパラメータを使用して曲線を正規化して正規化済みの曲線を生成し、正規化済みの曲線を処理して最大曲率のポイントの座標値を決定するための命令をも含んでおり、このポイントが成長曲線のベースライン領域の終点を表している。
【０１０９】
特定の実施態様においては、コンピュータ読み取り可能な媒体は、正規化済みの曲線の曲率のプロットを表示するための命令を更に含んでいる。ある態様においては、本コードは、ベースライン領域の終点におけるポイントの座標値を返す又は表示するための命令を更に含んでいる。
【０１１０】
ある観点においては、データセットは、動力学的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセス、バクテリアプロセス、酵素プロセス、又はバインディングプロセスの成長曲線を表している。別の態様においては、コンピュータ読み取り可能な媒体は、Ｃｔ値を表示するための命令を更に含んでいる。更に別の実施例においては、コンピュータ読み取り可能な媒体は、Ｃｔ値を返すための命令を更に含んでいる。
【０１１１】
特定の実施態様においては、データセットは、動力学的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスの成長曲線を表しており、ベースライン領域の終点におけるポイントは、成長曲線のエルボー又はサイクル閾値（Ｃｔ）を表している。別の実施例においては、座標値のペアは、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積とサイクル数を表している。更に別の実施例においては、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積は、蛍光強度値、ルミネセンス強度値、ケミルミネセンス強度値、リン光強度値、電荷転送値、バイオルミネセンス強度値、又は吸収値の中の１つによって表されている。
【０１１２】
ある観点においては、処理するための命令は、正規化済みの曲線に沿ったいくつか又はすべてのポイントにおける曲率を決定するための命令を含んでいる。ある態様においては、正規化するための命令は、データセットから線形成長部分を減算するための命令を含んでいる。別の態様においては、曲線は、動力学的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスの増幅曲線であり、ベースライン領域の終点におけるポイントは、動力学的ＰＣＲ曲線のエルボー又はサイクル閾値（Ｃｔ）を表しており、最大曲率を有するポイントがＣｔ値を表している。
【０１１３】
特定の実施態様においては、ダブルシグモイド関数は、ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１＋ｅｘｐ-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ-f(x-g)））という形態を有しており、算出するための命令は、この関数のパラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇの中の１つ又は複数のものを反復的に決定するための命令を含んでいる。
【０１１４】
ある態様においては、少なくともパラメータａ及びｂが決定され、正規化するための命令は、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算するための命令を含んでいる。別の態様においては、少なくともパラメータａ、ｂ、及びｃが決定され、正規化するための命令は、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算し、この結果をパラメータｃによって除算するための命令を含んでいる。更に別の態様においては、少なくともパラメータａが決定され、正規化するための命令は、曲線をパラメータａによって除算するための命令を含んでいる。更に別の態様においては、少なくともパラメータａ及びｂが決定され、正規化するための命令は、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算し、この結果をパラメータａによって除算するための命令を含んでいる。
【０１１５】
本発明の更に別の態様によれば、動力学的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムが提供される。本システムは、通常、動力学的なＰＣＲ増幅曲線を表すＰＣＲデータセットを生成する動力学的ＰＣＲ分析モジュール（このデータセットは、それぞれが座標値のペアを有する複数のデータポイントを含んでおり、且つ、本データセットは、サイクル閾値（Ｃｔ）を含む注目の領域内にデータポイントを含んでいる）と、ＰＣＲデータセットを処理してＣｔ値を決定するべく適合されたインテリジェンスモジュールと、を含んでいる。インテリジェンスモジュールは、通常、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用してデータセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、関数のパラメータを決定し、決定されたパラメータを使用して曲線を正規化して正規化済みの曲線を生成すると共に、正規化済みの曲線を処理して最大曲率のポイントの座標値を決定することにより（このポイントは、成長曲線のサイクル閾値（Ｃｔ）を表している）、ＰＣＲデータセットを処理する。
【０１１６】
ある態様においては、ダブルシグモイド関数は、ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１＋ｅｘｐ-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ-f(x-g)））という形態を有しており、算出段階は、この関数のパラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇの中の１つ又は複数のものを反復的に決定する段階を含んでいる。特定の実施態様においては、少なくともパラメータａ及びｂが決定され、正規化段階は、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算する段階を含んでいる。別の特定の実施態様においては、パラメータａ及びｂが決定され、正規化する段階は、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算する段階と、この結果をパラメータａによって除算する段階を含んでいる。更に別の特定の実施態様においては、少なくともパラメータａが決定され、正規化する段階は、パラメータａによって曲線を除算する段階を含んでいる。
【０１１７】
別のある態様においては、少なくともパラメータａ、ｂ、及びｃが決定され、正規化する段階は、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算する段階と、この結果をパラメータｃによって除算する段階と、を含んでいる。
【０１１８】
ある観点においては、正規化済みの曲線を処理することにより、曲線に沿ったいくつか又はすべてのポイントにおける曲率を決定しており、この場合に、最大曲率を有するポイントがＣｔ値を表している。特定の実施態様においては、インテリジェンスモジュールは、正規化済みの曲線の曲率のプロットの表示をレンダリングするべく更に適合されている。
【０１１９】
ある態様においては、正規化する段階は、データセットから線形成長部分を減算する段階を含んでいる。特定の実施態様においては、曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算することによって曲線フィットを正規化している。
【０１２０】
特定の実施態様においては、インテリジェンスモジュールは、Ｃｔ値を返すべく更に適合されている。別の実施例においては、インテリジェンスモジュールは、Ｃｔ値を表示するべく更に適合されている。
【０１２１】
別の態様においては、座標値のペアは、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積とサイクル数を表している。特定の実施態様においては、増幅されたポリヌクレオチドの蓄積は、蛍光強度値、ルミネセンス強度値、ケミルミネセンス強度値、リン光強度値、電荷転送値、ケミルミネセンス強度値、又は吸収値の中の１つによって表されている。
【０１２２】
特定の実施態様においては、動力学的ＰＣＲ分析モジュールは、動力学的なサーモサイクラー装置内に存在しており、インテリジェンスモジュールは、分析モジュールに通信可能に結合されたプロセッサを含んでいる。別の特定の実施態様においては、インテリジェンスモジュールは、ネットワーク接続又は直接接続のいずれかによって分析モジュールに結合されたコンピュータシステム内に存在するプロセッサを含んでいる。
【０１２３】
曲線フィッティング及び曲率決定プロセスを含むＣｔ決定プロセスは、コンピュータシステムのプロセッサ上において稼動するコンピュータコードとして実施可能であることを理解されたい。このコードは、プロセッサを制御してＣｔ決定プロセスの様々な態様及び段階を実施するための命令を含んでいる。本コードは、通常、ハードディスク、ＲＡＭ、或いは、ＣＤやＤＶＤなどの携帯型の媒体上に保存される。同様に、これらのプロセスは、プロセッサに結合されたメモリユニット内に保存されているプロセッサ実行命令を含むサーモサイクラーなどのＰＣＲ装置内で実施することも可能である。このような命令を含むコードは、周知のように、コード供給源に対するネットワーク接続又は直接的な接続を介して、或いは、携帯型の媒体を使用することにより、ＰＣＲ装置のメモリにダウンロード可能である。
【０１２４】
当業者であれば、本発明のエルボー決定プロセスは、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｆｏｒｔｒａｎ、ＶｉｓｕａｌＢａｓｉｃなどの様々なプログラミング言語、並びに、データの視覚化及び分析に有用な事前パッケージングされたルーチン、関数、及び手順を提供するＭａｔｈｅｍａｔｉｃａなどのアプリケーションを使用してコーディング可能であることを理解するであろう。後者の更なる例がＭＡＴＬＡＢ（登録商標）である。
【０１２５】
以上、一例として、特定の実施態様の観点から本発明について説明したが、本発明は開示された実施例に限定されるものではないことを理解されたい。逆に、本発明は、当業者には明らかな様々な変更及び類似の構成を包含することを意図するものである。従って、添付の請求項の範囲には、これらのあらゆる変更及び類似の構成を包含するべく、最も広範な解釈を付与することを要するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】蛍光強度対サイクル数としてプロットされた典型的なＰＣＲ成長曲線の一例を示している。
【図２】成長曲線のベースライン領域の終点（又は、ＰＣＲ曲線のＣｔ値）を決定するためのプロセスフローを示している。
【図３Ａ】本発明のある実施態様によるスパイクの識別及び置換プロセスの詳細なプロセスフローを示している。
【図３Ｂ】本発明のある実施態様によるスパイクの識別及び置換プロセスの詳細なプロセスフローを示している。
【図３Ｃ】本発明のある実施態様によるスパイクの識別及び置換プロセスの詳細なプロセスフローを示している。
【図３Ｄ】本発明のある実施態様によるスパイクの識別及び置換プロセスの詳細なプロセスフローを示している。
【図３Ｅ】本発明のある実施態様によるスパイクの識別及び置換プロセスの詳細なプロセスフローを示している。
【図３Ｆ】本発明のある実施態様によるスパイクの識別及び置換プロセスの詳細なプロセスフローを示している。
【図４】パラメータａ〜ｇを含むダブルシグモイド式の分解を示している。
【図５】曲線に対するパラメータ（ｄ）の影響と、変曲点のｘ値の位置に対する（ｅ）の影響を示している。図５のすべての曲線は、パラメータ（ｄ）を除いて同一のパラメータを有している。
【図６】異なるパラメータの組における３つの曲線形状の一例を示している。
【図７Ａ】一態様に従ってダブルシグモイド式のパラメータ（ｅ）及び（ｇ）の値を決定するプロセスを示している。
【図７Ｂ】一態様に従ってダブルシグモイド式のパラメータ（ｅ）及び（ｇ）の値を決定するプロセスを示している。
【図８Ａ】初期のパラメータの組におけるＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ回帰プロセスのプロセスフローを示している。
【図８Ｂ】初期のパラメータの組におけるＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ回帰プロセスのプロセスフローを示している。
【図８Ｃ】初期のパラメータの組におけるＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ回帰プロセスのプロセスフローを示している。
【図８Ｄ】初期のパラメータの組におけるＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ回帰プロセスのプロセスフローを示している。
【図９】ある実施態様従ってＰＣＲプロセスのエルボー値を決定する更に詳細なプロセスフローを示している。
【図１０】図１０ａは、ダブルシグモイドを使用して実験データにフィットされた典型的な成長曲線を示している。図１０ｂは、図１０ａのダブルシグモイド曲線の曲率のプロットを示している。
【図１１】図１０ａの成長曲線に重ね合わせられた最大曲率のポイントに正接する円を示している。
【図１２ａ】成長曲線のデータセットの一例を示している。
【図１２ｂ】図１２ａのデータセットのプロットを示している。
【図１３】図１２のデータセットに対するダブルシグモイドフィットを示している。
【図１４】式（６）のベースライン減算法を使用した正規化の後の図１２（図１３）のデータセット(並びに、ダブルシグモイドフィット）を示している。
【図１５】図１４の正規化済みのデータセットにおける曲率対サイクル数のプロットを示している。
【図１６】最大曲率半径を有する円と図１４の正規化済みのデータセットの重ね合わせを示している。
【図１７】「遅成長（ｓｌｏｗ−ｇｒｏｗｅｒ）」データセットの一例を示している。
【図１８】式（６）のベースライン減算法を使用した正規化の後の図１７のデータセット及びダブルシグモイドフィットを示している。
【図１９】図１８の正規化済みのデータセットにおける曲率対サイクル数のプロットを示している。
【図２０】反復ラン及び負サンプルを含むＰＣＲ成長曲線の組のプロットを示している。
【図２１】ソフトウェア及びハードウェア資源間における関係を示す概略的なブロックダイアグラムを示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長曲線のベースライン領域の終点におけるポイントを決定するためのコンピュータにより実施される方法において、
成長曲線を表すデータセットであって、それぞれが座標値のペアを有する複数のデータポイントを含んでいるデータセットを受領する段階と、
Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用して前記データセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、前記関数のパラメータを決定する段階と、
前記の決定したパラメータを使用して前記曲線を正規化し、正規化した曲線を生成する段階と、
前記正規化済みの曲線を処理することにより、前記成長曲線の前記ベースライン領域の前記終点を表す、最大曲率のポイントを決定する段階と、
を有する方法。
【請求項２】
正規化する段階が、前記データセットから線形成長部分を減算する段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
処理する段階が、前記正規化済みの曲線に沿ったいくつか又はすべてのポイントにおける前記曲率を決定する段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記正規化済みの曲線の前記曲率のプロットを表示する段階を更に含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記ダブルシグモイド関数が、ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１+ｅｘｐ-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ-f(x-g)））という形態を有しており、算出する段階が、前記関数のパラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇの中の１つ又は複数のものを反復的に決定する段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
少なくとも前記パラメータａ及びｂが決定され、正規化する段階が、前記曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算する段階を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
少なくとも前記パラメータａが決定され、正規化する段階が、前記曲線をパラメータａによって除算する段階を含む、請求項５記載の方法。
【請求項８】
少なくとも前記パラメータａ及びｂが決定され、正規化する段階が、前記曲線から前記線形成長部分ａ＋ｂｘを減算する段階と、この結果を前記パラメータａによって除算する段階と、を含む、請求項５記載の方法。
【請求項９】
少なくとも前記パラメータａ、ｂ、及びｃが決定され、正規化する段階が、前記曲線から前記線形成長部分ａ＋ｂｘを減算する段階と、この結果をパラメータｃによって除算する段階と、を含む請求項５記載の方法。
【請求項１０】
前記データセットが、動力学的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスの成長曲線を表しており、前記ベースライン領域の前記終点における前記ポイントが、前記成長曲線のエルボー又はサイクル閾値（Ｃｔ）を表している、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｃｔ値を返す段階を更に含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｃｔ値を表示する段階を更に含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
プロセッサを制御して成長曲線のベースライン領域の終点におけるポイントを決定するためのコードを含むコンピュータ読み取り可能な媒体であって、
前記コードが、
成長曲線を表すデータセットであって、それぞれが座標値のペアを有する複数のデータポイントを含んでいるデータセットを受領する段階と、
Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用して前記データセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、前記関数のパラメータを決定する段階と、
前記決定されたパラメータを使用して前記曲線を正規化し、正規化済みの曲線を生成する段階と、
前記正規化済みの曲線を処理することにより、前記成長曲線の前記ベースライン領域の前記終点を表す、最大曲率のポイントを決定する段階と、
を実行するための命令を含んでいる、コンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項１４】
前記処理するための命令が、前記正規化済みの曲線に沿っていくつか又はすべてのポイントにおける前記曲率を決定するための命令を含む、請求項１３記載のコンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項１５】
前記ダブルシグモイド関数は、ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１+ｅｘｐ-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ-f(x-g)））という形態を有しており、前記算出するための命令が、前記関数のパラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇの中の１つ又は複数のものを反復的に決定するための命令を含む、請求項１３記載のコンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項１６】
前記コードが、前記ベースライン領域の前記終点における前記ポイントの前記座標値を返す又は表示するための命令を更に含む、請求項１３記載のコンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項１７】
動力学的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムにおいて、
動力学的ＰＣＲ増幅曲線を表すＰＣＲデータセットであって、それぞれが座標値のペアを有する複数のデータポイントを含んでおり、且つ、サイクル閾値（Ｃｔ）を含む注目の領域内にデータポイントを含んでいるデータセットを生成する動力学的ＰＣＲ分析モジュールと；
Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用して前記データセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、前記関数のパラメータを決定する段階と、
前記決定されたパラメータを使用して前記曲線を正規化し、正規化された曲線を生成する段階と、
前記正規化済みの曲線を処理することにより、前記成長曲線の前記サイクル閾値（Ｃｔ）を表す最大曲率のポイントを決定する段階と、
により、前記ＰＣＲデータセットを処理して前記Ｃｔ値を決定するべく適合されたインテリジェンスモジュールと；
を有するシステム。
【請求項１８】
前記ダブルシグモイド関数が、ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１+ｅｘｐ-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ-f(x-g)））という形態を有しており、算出する段階が、前記関数のパラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇの中の１つ又は複数のものを反復的に決定する段階を含む、請求項１７記載のシステム。
【請求項１９】
処理する段階が、前記正規化済みの曲線に沿っていくつか又はすべてのポイントにおける前記曲率を決定する段階を含む、請求項１７記載のシステム。
【請求項２０】
前記インテリジェンスモジュールが、前記正規化済みの曲線の前記曲率のプロットの表示をレンダリングするべく適合されている、請求項１９記載のシステム。
【請求項２１】
前記動力学的ＰＣＲ分析モジュールが、動力学的サーモサイクラー装置内に存在しており、前記インテリジェンスモジュールが、前記分析モジュールに通信可能に結合されたプロセッサを含む、請求項１７記載のシステム。
【請求項２２】
前記インテリジェンスモジュールが、ネットワーク接続又は直接接続のいずれかによって前記分析モジュールに結合されたコンピュータシステム内に存在するプロセッサを含む、請求項１７記載のシステム。
【請求項１】
成長曲線のベースライン領域の終点におけるポイントを決定するためのコンピュータにより実施される方法において、
成長曲線を表すデータセットであって、それぞれが座標値のペアを有する複数のデータポイントを含んでいるデータセットを受領する段階と、
Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用して前記データセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、前記関数のパラメータを決定する段階と、
前記の決定したパラメータを使用して前記曲線を正規化し、正規化した曲線を生成する段階と、
前記正規化済みの曲線を処理することにより、前記成長曲線の前記ベースライン領域の前記終点を表す、最大曲率のポイントを決定する段階と、
を有する方法。
【請求項２】
正規化する段階が、前記データセットから線形成長部分を減算する段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
処理する段階が、前記正規化済みの曲線に沿ったいくつか又はすべてのポイントにおける前記曲率を決定する段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記正規化済みの曲線の前記曲率のプロットを表示する段階を更に含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記ダブルシグモイド関数が、ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１+ｅｘｐ-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ-f(x-g)））という形態を有しており、算出する段階が、前記関数のパラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇの中の１つ又は複数のものを反復的に決定する段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
少なくとも前記パラメータａ及びｂが決定され、正規化する段階が、前記曲線から線形成長部分ａ＋ｂｘを減算する段階を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
少なくとも前記パラメータａが決定され、正規化する段階が、前記曲線をパラメータａによって除算する段階を含む、請求項５記載の方法。
【請求項８】
少なくとも前記パラメータａ及びｂが決定され、正規化する段階が、前記曲線から前記線形成長部分ａ＋ｂｘを減算する段階と、この結果を前記パラメータａによって除算する段階と、を含む、請求項５記載の方法。
【請求項９】
少なくとも前記パラメータａ、ｂ、及びｃが決定され、正規化する段階が、前記曲線から前記線形成長部分ａ＋ｂｘを減算する段階と、この結果をパラメータｃによって除算する段階と、を含む請求項５記載の方法。
【請求項１０】
前記データセットが、動力学的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスの成長曲線を表しており、前記ベースライン領域の前記終点における前記ポイントが、前記成長曲線のエルボー又はサイクル閾値（Ｃｔ）を表している、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｃｔ値を返す段階を更に含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｃｔ値を表示する段階を更に含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
プロセッサを制御して成長曲線のベースライン領域の終点におけるポイントを決定するためのコードを含むコンピュータ読み取り可能な媒体であって、
前記コードが、
成長曲線を表すデータセットであって、それぞれが座標値のペアを有する複数のデータポイントを含んでいるデータセットを受領する段階と、
Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用して前記データセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、前記関数のパラメータを決定する段階と、
前記決定されたパラメータを使用して前記曲線を正規化し、正規化済みの曲線を生成する段階と、
前記正規化済みの曲線を処理することにより、前記成長曲線の前記ベースライン領域の前記終点を表す、最大曲率のポイントを決定する段階と、
を実行するための命令を含んでいる、コンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項１４】
前記処理するための命令が、前記正規化済みの曲線に沿っていくつか又はすべてのポイントにおける前記曲率を決定するための命令を含む、請求項１３記載のコンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項１５】
前記ダブルシグモイド関数は、ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１+ｅｘｐ-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ-f(x-g)））という形態を有しており、前記算出するための命令が、前記関数のパラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇの中の１つ又は複数のものを反復的に決定するための命令を含む、請求項１３記載のコンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項１６】
前記コードが、前記ベースライン領域の前記終点における前記ポイントの前記座標値を返す又は表示するための命令を更に含む、請求項１３記載のコンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項１７】
動力学的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムにおいて、
動力学的ＰＣＲ増幅曲線を表すＰＣＲデータセットであって、それぞれが座標値のペアを有する複数のデータポイントを含んでおり、且つ、サイクル閾値（Ｃｔ）を含む注目の領域内にデータポイントを含んでいるデータセットを生成する動力学的ＰＣＲ分析モジュールと；
Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ（ＬＭ）回帰プロセスをダブルシグモイド関数に適用して前記データセットにフィットする曲線の近似を算出することにより、前記関数のパラメータを決定する段階と、
前記決定されたパラメータを使用して前記曲線を正規化し、正規化された曲線を生成する段階と、
前記正規化済みの曲線を処理することにより、前記成長曲線の前記サイクル閾値（Ｃｔ）を表す最大曲率のポイントを決定する段階と、
により、前記ＰＣＲデータセットを処理して前記Ｃｔ値を決定するべく適合されたインテリジェンスモジュールと；
を有するシステム。
【請求項１８】
前記ダブルシグモイド関数が、ａ＋ｂｘ＋ｃ／（（１+ｅｘｐ-d(x-e)）（１＋ｅｘｐ-f(x-g)））という形態を有しており、算出する段階が、前記関数のパラメータａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びｇの中の１つ又は複数のものを反復的に決定する段階を含む、請求項１７記載のシステム。
【請求項１９】
処理する段階が、前記正規化済みの曲線に沿っていくつか又はすべてのポイントにおける前記曲率を決定する段階を含む、請求項１７記載のシステム。
【請求項２０】
前記インテリジェンスモジュールが、前記正規化済みの曲線の前記曲率のプロットの表示をレンダリングするべく適合されている、請求項１９記載のシステム。
【請求項２１】
前記動力学的ＰＣＲ分析モジュールが、動力学的サーモサイクラー装置内に存在しており、前記インテリジェンスモジュールが、前記分析モジュールに通信可能に結合されたプロセッサを含む、請求項１７記載のシステム。
【請求項２２】
前記インテリジェンスモジュールが、ネットワーク接続又は直接接続のいずれかによって前記分析モジュールに結合されたコンピュータシステム内に存在するプロセッサを含む、請求項１７記載のシステム。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公開番号】特開２００７−２２６７７１（Ｐ２００７−２２６７７１Ａ）
【公開日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００６−３４１４２０（Ｐ２００６−３４１４２０）
【出願日】平成１８年１２月１９日（２００６．１２．１９）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【公開日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３４１４２０（Ｐ２００６−３４１４２０）
【出願日】平成１８年１２月１９日（２００６．１２．１９）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
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