ニューロフィジンを使用する心機能不全の診断および危険性の層化
本発明は、心機能不全の診断および／または危険性の層化のための方法に関し、ここでマーカーであるニューロフィジンまたはそのフラグメントもしくは部分ペプチドの測定が、試験されるべき患者に対して行われる。本発明は、ニューロフィジンを含む、有利なマーカーの組み合わせに関する。さらに、本発明は、診断デバイスおよび上記方法を実施するためのキットに関する。一実施形態において、本発明の方法は、インビトロで実行することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心機能不全（Ｈｅｒｚｉｎｓｕｆｆｉｚｉｅｎｚ）の診断および／または危険性の層化のための方法に関し、ここでマーカーであるニューロフィジンまたはそのフラグメントもしくは部分ペプチドの測定が、試験されるべき患者に対して行われる。本発明は、ニューロフィジンを含む、有利なマーカーの組み合わせに関する。さらに、本発明は、診断デバイスおよび上記方法を実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
欧州では、１年間に約１００万人の患者が、急性呼吸窮迫症（ａｋｕｔｅ Ａｔｅｍｎｏｔ）の症状で病院の救急処置室に運ばれている。呼吸窮迫症は、多くの疾患の症状の特徴を示しており、その症例の約３５〜４７％は、心機能不全に帰する可能性がある（非特許文献１および非特許文献２）。
【０００３】
初期段階では、患者は、しばしば、わずかに心機能不全に気づくに過ぎない。処置されなければ、上記疾患は、概して重篤度が増し、後期段階では、休息時にすら完全な肉体的疲憊をもたらす。心臓自体を含む、身体器官のすべての滋養の欠如は、この段階での死亡をもたらし得る。一旦、上記疾患が進行してしまうと、寿命は、最適の治療によってすら、かなり短くなる（１年間あたりの死亡の約３０％）。従って、心機能不全をできるだけ早期に認識し、その原因に堅実に対処することは重要である。
【０００４】
従って、適切な治療を開始するために、初期診断および根底にある疾患の区別は、初期段階で、ならびに救急救命医療および集中医療のときに必要である。心機能不全を他の疾患から区別することおよび明確に範囲を定めることは、しばしば、非特異的症状（呼吸窮迫症、および咳嗽）によって困難になる。
【０００５】
脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰまたはＮＴｐｒｏＢＮＰ）の血漿濃度の測定を用いる試験が利用可能である。これはまた、心機能不全の診断のための毎日の機械的作業の過程において使用される（Ｍａｉｓｅｌら（前出））。
【０００６】
先行技術において、ニューロフィジンは、ニコチン吸収についてのマーカー（非特許文献３）、ＳＩＡＤＨと関連する癌および非癌（ＡＤＨ不適合分泌症候群）のためのマーカー、ならびに腎性尿崩症のマーカー（非特許文献４；非特許文献５）として記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊａｎｕｚｚｉ ＪＬ Ｊｒ．，Ｃａｍａｒｇｏ ＣＡ，Ａｎｗａｒｕｄｄｉｎ Ｓ．，Ｂａｇｇｉｓｈ ＡＬ，Ｃｈｅｎ ＡＡ，Ｋｒａｕｓｅｒ ＤＧ，Ｔｕｎｇ Ｒ，Ｃａｍｅｒｏｎ Ｒ，Ｎａｇｕｒｎｅｙ ＪＴ，Ｃｈａｅ ＣＵ，Ｌｌｏｙｄ−Ｊｏｎｅｓ ＤＭ，Ｂｒｏｗｎ ＤＦ，Ｆｏｒａｎ−Ｍｅｌａｎｓｏｎ Ｓ，Ｓｌｕｓｓ ＰＭ，Ｌｅｅ−Ｌｅｗａｎｄｒｏｗｓｋｉ Ｅ，Ｌｅｗａｎｄｒｏｗｓｋｉ ＫＢ，Ｔｈｅ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｐｒｏ−ＢＮＰ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｙｓｐｎｅａ ｉｎ ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ （ＰＲＩＤＥ） ｓｔｕｄｙ，Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ．（２００５）９５（８）ｐｐ．９４８−９５４
【非特許文献２】Ｍａｉｓｅｌ ＡＳ，Ｋｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙ Ｐ，Ｎｏｗａｋ ＲＭ，ＭｃＣｏｒｄ Ｊ，Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ ＪＥ，Ｄｕｃ Ｐ，Ｏｍｌａｎｄ Ｔ，Ｓｔｏｒｒｏｗ ＡＢ，Ａｂｒａｈａｍ ＷＴ，Ｗｕ ＡＨ，Ｃｌｏｐｔｏｎ Ｐ，Ｓｔｅｇ ＰＧ，Ｗｅｓｔｈｅｉｍ Ａ，Ｋｎｕｄｓｅｎ ＣＷ，Ｐｅｒｅｚ Ａ，Ｋａｚａｎｅｇｒａ Ｒ，Ｈｅｒｒｍａｎｎ ＨＣ，ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ ＰＡ；Ｂｒｅａｔｈｉｎｇ Ｎｏｔ Ｐｒｏｐｅｒｌｙ Ｍｕｌｔｉｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｕｄｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ，Ｒａｐｉｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｂ−ｔｙｐｅ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．（２００２）３４７（３）ｐｐ．１６１−１６７
【非特許文献３】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＡＧ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， ａｓｓａｙ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｎｓ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（１９７５）５５：３６０−７
【非特許文献４】Ｐｕｌｌａｎ ＰＴ，Ｃｌａｐｐｉｓｏｎ ＢＨ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＣＩ．Ｐｌａｓｍａ ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｎｓ ｉｎ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｔｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ（１９７９）４９；５８０−７
【非特許文献５】Ｎｏｒｔｈ ＷＧ，ＬａＲｏｃｈｅｌｌｅ ＦＴ，Ｊｒ．，Ｍｅｌｔｏｎ Ｊ，Ｍｉｌｌｓ ＲＣ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｎｓ：ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ（１９８０）５１：８８４−９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
先行技術において、心機能不全の徴候のためのさらなるマーカーを同定および提供し、そして臨床現場にそれらを供給する必要が大いにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、心機能不全の診断および／または危険性の層化のための方法を提供することは、本発明の目的である。
【００１０】
しかし、以前に公知の上記マーカーを使用する公知の診断方法の欠点は、危険性のある患者の初期のかつ完全な検出が成功せず、従って、危険性の層化が不満足な程度にしか行われないことである。従って、本発明が基づく１つのさらなる目的は、心機能不全の危険性の層化のための方法を開発することにある。このことは、危険性のある患者の改善された検出を可能にする。
【００１１】
上記目的は、心機能不全の診断および／または危険性の層化のための方法を介して達成される。ここで、マーカーであるニューロフィジンまたはそのフラグメントもしくは部分ペプチドの測定は、試験されるべき患者に対して行われる（本明細書中以降、本発明に従う方法といわれる）。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１である。
【図２】図２である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の範囲内で、「心機能不全」は、急性的および慢性的に、心臓が、休息時またはストレス下で組織代謝を確実にするために組織に十分な血液を供給できず、その結果として、十分な酸素を供給できないことを意味することが理解される。臨床的には、心機能不全は、本来は心収縮機能障害もしくは心拡張機能障害に関して心機能障害に基づいている代表的な症状（呼吸困難、疲労、液体保持）が存在する場合に、存在する。慢性的な心機能不全（ＣＨＦ）は、同様に、本発明に従って網羅される（Ｋａｒｄｉｏｌｏｇｉｅ ｃｏｍｐａｃｔ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃｈｒｉｓｉａｎ Ｍｅｗｉｓ， Ｒｅｉｍｅｒ Ｒｉｅｓｓｅｎ ａｎｄ Ｉｏａｋｉｍ Ｓｐｙｒｉｄｏｐｏｕｏｌｏｓ， ２ｎｄ ｕｎａｍｅｎｄｅｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｈｉｅｍｅ ２００６）。心機能不全の原因は、以下であり得る：心臓弁欠損（例えば、リウマチ熱の後期症状として）、心筋炎（心筋の炎症）、心不整脈、過度の高血圧（緊張亢進）を伴う心筋梗塞および／または冠状血管の動脈硬化症（石灰化）（冠状動脈性心疾患）。さらには、以下が、本発明に従って網羅される：（欝血性）心機能不全を有する高血圧性心疾患、高血圧性心疾患および（欝血性）心機能不全を有する腎疾患、原発性右胸心性機能不全、二次的右胸心性機能不全、症状がない左心室性機能不全（ＮＹＨＡ段階Ｉ）、大きなストレスにより症状を有する左心室機能不全（ＮＹＨＡ段階ＩＩ）、わずかなストレスにより症状を有する左心室機能不全（ＮＹＨＡ段階ＩＩＩ）、休息時に症状を有する左心室機能不全（ＮＹＨＡ段階ＩＶ）ならびに心原性ショック。
【００１４】
従って、本発明に従う方法は、同様に、上記の適応症を網羅する。さらに、例えば、Ｐｓｃｈｙｒｅｍｂｅｌ，Ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ ２００４において、引用される適応症のすべてが記載されている。
【００１５】
本発明によれば、用語「危険性の層化」とは、心機能不全のより集中的な診断および治療／処置の最も有利な考えられる推移を可能にする目的で、より悪い予後を有する患者特に、救急救命患者および危険性のある患者を発見することを包含する。本発明に従う危険性の層化は、心機能不全に関して与えられる有効な処置方法を結果的に可能にする。
【００１６】
特に有利なことには、特に、救急救命医療および／または集中医療の場合に、信頼性のある診断は、本発明に従う方法によって行われ得る。本発明に従う方法は、迅速な治療的成功をもたらす、考えられる臨床的決定を与える。このタイプの臨床的決定は、同様に、心機能不全の処置もしくは治療のための医薬品（例えば、ＡＣＥインヒビター、ＡＴ１アンタゴニスト：アンジオテンシンＩＩレセプター（サブタイプ１）のブロッカー、β遮断薬であるビソプロロール、カルベジロール、メトプロロールおよびネビボロール、バソプレッシンレセプターアンタゴニスト、ＮＹＨＡ段階ＩＩＩからアルドステロンアンタゴニスト、カルシウム感受性増強剤（Ｌｅｖｏｓｉｍｅｎｄａｎ））によるさらなる処置を含む。
【００１７】
従って、さらに好ましい実施形態において、本発明に従う方法は、心機能不全の治療的制御に関する。
【００１８】
従って、本発明は、同様に、患者の危険性の層化のため、特に、臨床的決定のための、特に、時間が重要な集中医療もしくは救急救命医療において、ならびに患者の入院についての患者の層化のための方法に関する。
【００１９】
本発明に従う方法のさらに好ましい実施形態において、上記診断は、予後のため、鑑別診断的初期検出および検出のため、重篤度の程度の評価のため、ならびに心機能不全に付随する治療の過程の評価のために行われる。
【００２０】
本発明に従う方法のさらなる実施形態において、体液、特に血液、必要に応じて、全血もしくは血清は、試験されるべき患者から採取され、上記診断が、インビトロ／エキソビボ（すなわち、ヒトもしくは動物の身体の外で）で行われる。上記診断は、少なくとも１種の患者サンプル中に存在するマーカーであるニューロフィジンの測定およびその量に基づいて行われ得る。
【００２１】
本発明の範囲内において、「ニューロフィジン」（またはニューロフィジン ＩＩ）（フラグメント：プレプロバソプレッシンのアミノ酸配列３２〜１２４；図２を参照のこと）は、遊離の９３アミノ酸（９３ＡＳ：配列番号１：ＡＭＳＤＬＥＬＲＱＣ ＬＰＣＧＰＧＧＫＧＲ ＣＦＧＰＳＩＣＣＡＤ ＥＬＧＣＦＶＧＴＡＥ ＡＬＲＣＱＥＥＮＹＬ ＰＳＰＣＱＳＧＱＫＡ ＣＧＳＧＧＲＣＡＡＦ ＧＶＣＣＮＤＥＳＣＶ ＴＥＰＥＣＲＥＧＦＨ ＲＲＡ）またはそのフラグメントもしくは部分ペプチドを含むポリペプチド／タンパク質であることが理解される。さらに、本発明に従うこのポリペプチドは、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、脂質化もしくは誘導体化を有し得る。ニューロフィジンは、驚くべきことに、血漿中で安定である。
【００２２】
さらなる実施形態において、上記ニューロフィジンの測定は、さらなるマーカー、すなわち、好ましくは、心機能不全を既に示しかつ、本発明に従う方法においてニューロフィジンを含むマーカー組み合わせの相乗効果を可能にし得るものを用いてさらに行われ得る。
【００２３】
従って、本発明は、本発明に従う方法のこのような実施形態に関し、ここで上記測定は、炎症性マーカー、心血管マーカー、神経ホルモンマーカー、もしくは虚血マーカーの群から選択される少なくとも１種のさらなるマーカーを用いて、試験されるべき患者に対してさらに行われる。
【００２４】
本発明によれば、上記炎症性マーカーは、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、サイトカイニン（例えば、ＴＮＦ−α）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−６）、プロカルシトニン（１−１１６、３−１１６）、およびアドヘシン（例えば、ＶＣＡＭもしくはＩＣＡＭ）の群からの少なくとも１種のマーカーから選択され得る。そして上記心血管マーカーは、クレアチンキナーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、コペプチン、ミオグロブリン、ナトリウム利尿タンパク質、特に、ＡＮＰ（またはＡＮＦ）、プロＡＮＰ、ＮＴ−プロＡＮＰ、ＢＮＰ、プロＢＮＰ、ＮＴ−プロＢＮＰまたはそれぞれの部分配列、心筋トロポニン、ＣＲＰの群からの少なくとも１種のマーカーから選択され得る。さらに、これらは、同様に、循環を制御する（プロ）ホルモン、特に、類似のプロガストリン放出ペプチド（プロＧＲＰ）、プロエンドセリン（プロＥｎｄ）、プロレプチン、プロニューロペプチド−Ｙ、プロソマトスタチン、プロニューロペプチド−ＹＹ、プロオピオメラノコルチン、プロアドレノメデュリン（プロＡＤＭ）、コペプチン、もしくはそれぞれの部分配列を含むことが理解される。
【００２５】
上記虚血マーカーは、トロポニンＩおよびトロポニンＴ、ＣＫ−ＭＢの群からの少なくとも１種のマーカーから選択され得る。さらに、上記神経ホルモンマーカーは、少なくとも１種のナトリウム利尿タンパク質、特に、ＡＮＰ（またはＡＮＦ）、プロＡＮＰ、ＮＴ−プロＡＮＰ、ＢＮＰ、プロＢＮＰ、ＮＴ−プロＢＮＰまたはそれぞれの部分配列であり得る。
【００２６】
ニューロフィジンと、プロホルモン、特に、コペプチン、および／またはＢＮＰ、プロＢＮＰ、ＮＴ−プロＢＮＰとのマーカー組み合わせが、特に好ましい。
【００２７】
本発明のさらなる実施形態において、本発明に従う方法は、上記マーカーの並行測定もしくは同時測定（例えば、９６穴以上を有するマルチタイタープレート）によって行われ得る。ここで、上記測定は、少なくとも１種の患者サンプルに対して行われる。
【００２８】
さらに、本発明に従う方法およびその測定は、自動分析機で、特に、Ｋｒｙｐｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｒｙｐｔｏｒ．ｎｅｔ／）によって行われ得る。
【００２９】
別の実施形態において、本発明に従う方法およびその測定は、単一パラメーターもしくは複数パラメーター測定に拘わらず、迅速な試験（例えば、側方流試験（ｌａｔｅｒａｌ−ｆｌｏｗ ｔｅｓｔ））によって行われうる。
【００３０】
さらに、本発明は、心機能不全の診断および／または危険性の層化のための、ニューロフィジンまたはそのフラグメントもしくは部分ペプチド、および必要に応じて、上記に列挙されるようなさらなるマーカーの使用に関する。
【００３１】
本発明の別の目的は、対応する診断デバイスまたは本発明に従う方法を行うためのその使用の提供である。
【００３２】
本発明の範囲内において、診断デバイス、特に、アレイもしくはアッセイ（例えば、イムノアッセイ、ＥＬＩＳＡなど）は、最も広い意味において、本発明に従う方法を行うためのデバイスであると理解される。
【００３３】
本発明はさらに、マーカーであるニューロフィジンまたはそのフラグメントもしくは部分ペプチドを測定するための分析試薬、および必要に応じて、上記に列挙されたマーカーを含む、心機能不全の診断または危険性の層化のためのキットに関する。このタイプの分析試薬は、例えば、抗体、抗体蛍光物質などを含む。
【００３４】
以下の実施例および図面は、本発明をより詳細に説明するために使用されるが、本発明をこれら実施例および図面に限定しない。
【実施例】
【００３５】
（実施例および図面）
血液サンプルを、初期試験の間に呼吸窮迫症の症状を示していると病院の救急処置室に報告された患者から採取した。遠心分離から得られたＥＤＴＡ血漿をアリコートに分け、ニューロフィジンを測定するときまで、−８０℃で保存した。以前の記載（Ｐｕｌｌａｎ（前出））に従って、ラジオイムノアッセイをニューロフィジン用に開発した：神経下垂体のニューロフィジンを単離し、定量した。ウサギを上記ニューロフィジンで免疫し、このようにして、高い力価の抗ニューロフィジン抗血清を得た。イムノアッセイのために、最高の力価の抗血清を、１：１００，０００の濃度で使用した。精製ニューロフィジンを、クロラミンＴ法で放射性ヨウ素化し、このアッセイにおけるトレーサーとして使用した。正常ウマ血清中での精製ニューロフィジンの希釈液を、標準物質として使用した。上記アッセイを、以下のように行った：５０μｌのサンプルまたは標準物質を、１００μｌのトレーサー（１２，０００ｄｐｍ／測定）および１００μｌの希釈抗ニューロフィジン抗血清と混合し、２４時間、４℃でインキュベートした。１００ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、０．１％ ＢＳＡを、緩衝液として使用した。抗体と結合したトレーサーを、遊離トレーサーから分離した。それに、６０％ エタノールを添加し、次いで、４℃で１５分間、５，０００ｇで遠心分離した。上清を捨て、そのペレット中に残っている放射活性を、測定した。その評価を、Ｍｕｌｔｉｃａｌｃソフトウェアの補助により行った。上記アッセイは、２２ｐｇ／ｍｌの分析検出限界および最大４００ｐｇ／ｍｌまでの測定範囲を有した。種々の患者の血漿サンプルを、以下に説明するように、上記アッセイで測定した。測定値が＞４００ｐｇ／ｍｌであったサンプルを、上記測定範囲内で測定値が得られるように、適切な希釈液で測定した。
【００３６】
試験した患者での心機能不全の診断は、心機能不全に関するフラミンガムスコア（ＭｃＫｅｅ ＰＡ，Ｃａｓｔｅｌｌｉ ＷＰ，ＭｃＮａｍａｒａ Ｐ ａｎｄ Ｋａｎｎｅｌ ＷＢ，Ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ：ｔｈｅ Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ ｓｔｕｄｙ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２８５（１９７１），ｐｐ．１４４１−１４４６）と、収縮期機能不全または拡張期機能不全の超音波検査による証拠とに基づいていた。
【００３７】
さらに、既知の疾患を有しない健康な患者から血液を採取し、ＥＤＴＡ血漿を、遠心分離によって得た。
【００３８】
臨床的有用性
正常範囲
ニューロフィジン濃度を、健康なコントロール被験体に由来するサンプル（ｎ＝２００）中で測定した。メジアンは、７０．３ｐｇ／ｍｌであり、測定された最低値は、８．８であり、最高値は、２２０ｐｇ／ｍｌであった。９５％パーセンタイルは、３６．５もしくは１３５ｐｇ／ｍｌであった。
【００３９】
心機能不全／重篤度の程度
ニューロフィジン濃度を、慢性もしくは急性の代償不全性心機能不全を有する患者において測定した。ニューロフィジン濃度は、心機能不全の重篤度の程度と関連していた：重篤度Ｉ〜ＩＶの程度の４つのＮＹＨＡ分類におけるニューロフィジン濃度の平均値は、それぞれ、１７１．４ｐｇ／ｍｌ、２４３．４ｐｇ／ｍｌ、３４６．９ｐｇ／ｍｌおよび９１８．１ｐｇ／ｍｌであった（図１を参照のこと）。
【００４０】
慢性心機能不全／診断
慢性心機能不全を有する２５８名の患者の群および２００名の健康なコントロールから、ニューロフィジン値を測定した。ＲＯＣ解析（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ-Ｏｐｅｒａｔｏｒ-Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｅ）によって、０．８９のＡＵＣを得た。２１３ｐｇ／ｍｌのカットオフ値を用いると、４８％の感度が、９８％の特異性とともに生じた。１３６．１ｐｇ／ｍｌのカットオフ値を用いると、６８．２％の感度が、９５％の特異性とともに生じた。
【００４１】
慢性心機能不全／予後
慢性心機能不全を有する２５８名の患者から、ニューロフィジン値を測定した。上記患者を、３６０日間の平均期間にわたって観察した。この期間内に、８０名の患者が死亡し、１７８名が生存していた。死亡率の予後についての最も良いカットオフ値（感度と特異性との最大の積として定義される）を、ＲＯＣ解析から決定した：２４７ｐｇ／ｍｌ。このカットオフ値を用いると、予後の感度は５９．５％であった。特異性は６５．２％であった。２４７ｐｇ／ｍｌのカットオフ値による尤度比は、１．７であった（以下の表を参照のこと）。
【００４２】
【表１】
急性心機能不全／診断
急性呼吸窮迫症を有する１２５名の患者の群から、ニューロフィジン値を決定した。上記１２５名の患者のうちの６９名の患者が、心機能不全を有した。心機能不全の鑑別診断のためのＲＯＣ解析によって、０．６１のＡＵＣを得た。４９４０ｐｇ／ｍｌのカットオフ値を用いると、６．６％の感度が、９８％の特異性とともに生じた。３０００ｐｇ／ｍｌのカットオフ値を用いると、１１．７％の感度が、９５％の特異性とともに生じた。
【００４３】
急性心機能不全／予後
急性代償性心機能不全を有する６９名の患者の群から、ニューロフィジン値を測定した。上記患者を、３６０日間の平均期間にわたって観察した。この期間内に、２１名の患者が死亡し、４８名が生存していた。最も良いカットオフ値（感度と特異性との最大の積として定義される）を、死亡率の予後について、ＲＯＣ解析から決定した：８８５ｐｇ／ｍｌ。このカットオフ値を用いると、上記予後の感度は５７．１％であり、特異性は７５％であった。８８５ｐｇ／ｍｌのカットオフ値による尤度比は、２．３であった（以下の表を参照のこと）。
【００４４】
【表２】
表：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）の分類
ＮＹＨＡ Ｉ 肉体的活動の制限無し。通常の肉体的活動は、過労も、動悸も、呼吸困難（息切れ）も、狭心症も引き起こさない。
ＮＹＨＡ ＩＩ 肉体的活動のわずかな制限。休息時には苦痛がないが、通常の肉体的活動は、疲労、動悸、呼吸困難または狭心症を生じる。
ＮＹＨＡ ＩＩＩ 肉体的活動の顕著な制限。休息時には苦痛がないが、通常未満の活動でも、疲労、動悸、呼吸困難または狭心症を生じる。
ＮＹＨＡ ＩＶ いかなる活動でも、休息時でも、心機能不全の症状。ベッドに拘束される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心機能不全（Ｈｅｒｚｉｎｓｕｆｆｉｚｉｅｎｚ）の診断および／または危険性の層化のための方法に関し、ここでマーカーであるニューロフィジンまたはそのフラグメントもしくは部分ペプチドの測定が、試験されるべき患者に対して行われる。本発明は、ニューロフィジンを含む、有利なマーカーの組み合わせに関する。さらに、本発明は、診断デバイスおよび上記方法を実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
欧州では、１年間に約１００万人の患者が、急性呼吸窮迫症（ａｋｕｔｅ Ａｔｅｍｎｏｔ）の症状で病院の救急処置室に運ばれている。呼吸窮迫症は、多くの疾患の症状の特徴を示しており、その症例の約３５〜４７％は、心機能不全に帰する可能性がある（非特許文献１および非特許文献２）。
【０００３】
初期段階では、患者は、しばしば、わずかに心機能不全に気づくに過ぎない。処置されなければ、上記疾患は、概して重篤度が増し、後期段階では、休息時にすら完全な肉体的疲憊をもたらす。心臓自体を含む、身体器官のすべての滋養の欠如は、この段階での死亡をもたらし得る。一旦、上記疾患が進行してしまうと、寿命は、最適の治療によってすら、かなり短くなる（１年間あたりの死亡の約３０％）。従って、心機能不全をできるだけ早期に認識し、その原因に堅実に対処することは重要である。
【０００４】
従って、適切な治療を開始するために、初期診断および根底にある疾患の区別は、初期段階で、ならびに救急救命医療および集中医療のときに必要である。心機能不全を他の疾患から区別することおよび明確に範囲を定めることは、しばしば、非特異的症状（呼吸窮迫症、および咳嗽）によって困難になる。
【０００５】
脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰまたはＮＴｐｒｏＢＮＰ）の血漿濃度の測定を用いる試験が利用可能である。これはまた、心機能不全の診断のための毎日の機械的作業の過程において使用される（Ｍａｉｓｅｌら（前出））。
【０００６】
先行技術において、ニューロフィジンは、ニコチン吸収についてのマーカー（非特許文献３）、ＳＩＡＤＨと関連する癌および非癌（ＡＤＨ不適合分泌症候群）のためのマーカー、ならびに腎性尿崩症のマーカー（非特許文献４；非特許文献５）として記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊａｎｕｚｚｉ ＪＬ Ｊｒ．，Ｃａｍａｒｇｏ ＣＡ，Ａｎｗａｒｕｄｄｉｎ Ｓ．，Ｂａｇｇｉｓｈ ＡＬ，Ｃｈｅｎ ＡＡ，Ｋｒａｕｓｅｒ ＤＧ，Ｔｕｎｇ Ｒ，Ｃａｍｅｒｏｎ Ｒ，Ｎａｇｕｒｎｅｙ ＪＴ，Ｃｈａｅ ＣＵ，Ｌｌｏｙｄ−Ｊｏｎｅｓ ＤＭ，Ｂｒｏｗｎ ＤＦ，Ｆｏｒａｎ−Ｍｅｌａｎｓｏｎ Ｓ，Ｓｌｕｓｓ ＰＭ，Ｌｅｅ−Ｌｅｗａｎｄｒｏｗｓｋｉ Ｅ，Ｌｅｗａｎｄｒｏｗｓｋｉ ＫＢ，Ｔｈｅ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｐｒｏ−ＢＮＰ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｙｓｐｎｅａ ｉｎ ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ （ＰＲＩＤＥ） ｓｔｕｄｙ，Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ．（２００５）９５（８）ｐｐ．９４８−９５４
【非特許文献２】Ｍａｉｓｅｌ ＡＳ，Ｋｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙ Ｐ，Ｎｏｗａｋ ＲＭ，ＭｃＣｏｒｄ Ｊ，Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ ＪＥ，Ｄｕｃ Ｐ，Ｏｍｌａｎｄ Ｔ，Ｓｔｏｒｒｏｗ ＡＢ，Ａｂｒａｈａｍ ＷＴ，Ｗｕ ＡＨ，Ｃｌｏｐｔｏｎ Ｐ，Ｓｔｅｇ ＰＧ，Ｗｅｓｔｈｅｉｍ Ａ，Ｋｎｕｄｓｅｎ ＣＷ，Ｐｅｒｅｚ Ａ，Ｋａｚａｎｅｇｒａ Ｒ，Ｈｅｒｒｍａｎｎ ＨＣ，ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ ＰＡ；Ｂｒｅａｔｈｉｎｇ Ｎｏｔ Ｐｒｏｐｅｒｌｙ Ｍｕｌｔｉｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｕｄｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ，Ｒａｐｉｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｂ−ｔｙｐｅ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．（２００２）３４７（３）ｐｐ．１６１−１６７
【非特許文献３】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＡＧ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， ａｓｓａｙ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｎｓ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（１９７５）５５：３６０−７
【非特許文献４】Ｐｕｌｌａｎ ＰＴ，Ｃｌａｐｐｉｓｏｎ ＢＨ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＣＩ．Ｐｌａｓｍａ ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｎｓ ｉｎ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｔｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ（１９７９）４９；５８０−７
【非特許文献５】Ｎｏｒｔｈ ＷＧ，ＬａＲｏｃｈｅｌｌｅ ＦＴ，Ｊｒ．，Ｍｅｌｔｏｎ Ｊ，Ｍｉｌｌｓ ＲＣ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｎｓ：ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ（１９８０）５１：８８４−９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
先行技術において、心機能不全の徴候のためのさらなるマーカーを同定および提供し、そして臨床現場にそれらを供給する必要が大いにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、心機能不全の診断および／または危険性の層化のための方法を提供することは、本発明の目的である。
【００１０】
しかし、以前に公知の上記マーカーを使用する公知の診断方法の欠点は、危険性のある患者の初期のかつ完全な検出が成功せず、従って、危険性の層化が不満足な程度にしか行われないことである。従って、本発明が基づく１つのさらなる目的は、心機能不全の危険性の層化のための方法を開発することにある。このことは、危険性のある患者の改善された検出を可能にする。
【００１１】
上記目的は、心機能不全の診断および／または危険性の層化のための方法を介して達成される。ここで、マーカーであるニューロフィジンまたはそのフラグメントもしくは部分ペプチドの測定は、試験されるべき患者に対して行われる（本明細書中以降、本発明に従う方法といわれる）。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１である。
【図２】図２である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の範囲内で、「心機能不全」は、急性的および慢性的に、心臓が、休息時またはストレス下で組織代謝を確実にするために組織に十分な血液を供給できず、その結果として、十分な酸素を供給できないことを意味することが理解される。臨床的には、心機能不全は、本来は心収縮機能障害もしくは心拡張機能障害に関して心機能障害に基づいている代表的な症状（呼吸困難、疲労、液体保持）が存在する場合に、存在する。慢性的な心機能不全（ＣＨＦ）は、同様に、本発明に従って網羅される（Ｋａｒｄｉｏｌｏｇｉｅ ｃｏｍｐａｃｔ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃｈｒｉｓｉａｎ Ｍｅｗｉｓ， Ｒｅｉｍｅｒ Ｒｉｅｓｓｅｎ ａｎｄ Ｉｏａｋｉｍ Ｓｐｙｒｉｄｏｐｏｕｏｌｏｓ， ２ｎｄ ｕｎａｍｅｎｄｅｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｈｉｅｍｅ ２００６）。心機能不全の原因は、以下であり得る：心臓弁欠損（例えば、リウマチ熱の後期症状として）、心筋炎（心筋の炎症）、心不整脈、過度の高血圧（緊張亢進）を伴う心筋梗塞および／または冠状血管の動脈硬化症（石灰化）（冠状動脈性心疾患）。さらには、以下が、本発明に従って網羅される：（欝血性）心機能不全を有する高血圧性心疾患、高血圧性心疾患および（欝血性）心機能不全を有する腎疾患、原発性右胸心性機能不全、二次的右胸心性機能不全、症状がない左心室性機能不全（ＮＹＨＡ段階Ｉ）、大きなストレスにより症状を有する左心室機能不全（ＮＹＨＡ段階ＩＩ）、わずかなストレスにより症状を有する左心室機能不全（ＮＹＨＡ段階ＩＩＩ）、休息時に症状を有する左心室機能不全（ＮＹＨＡ段階ＩＶ）ならびに心原性ショック。
【００１４】
従って、本発明に従う方法は、同様に、上記の適応症を網羅する。さらに、例えば、Ｐｓｃｈｙｒｅｍｂｅｌ，Ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ ２００４において、引用される適応症のすべてが記載されている。
【００１５】
本発明によれば、用語「危険性の層化」とは、心機能不全のより集中的な診断および治療／処置の最も有利な考えられる推移を可能にする目的で、より悪い予後を有する患者特に、救急救命患者および危険性のある患者を発見することを包含する。本発明に従う危険性の層化は、心機能不全に関して与えられる有効な処置方法を結果的に可能にする。
【００１６】
特に有利なことには、特に、救急救命医療および／または集中医療の場合に、信頼性のある診断は、本発明に従う方法によって行われ得る。本発明に従う方法は、迅速な治療的成功をもたらす、考えられる臨床的決定を与える。このタイプの臨床的決定は、同様に、心機能不全の処置もしくは治療のための医薬品（例えば、ＡＣＥインヒビター、ＡＴ１アンタゴニスト：アンジオテンシンＩＩレセプター（サブタイプ１）のブロッカー、β遮断薬であるビソプロロール、カルベジロール、メトプロロールおよびネビボロール、バソプレッシンレセプターアンタゴニスト、ＮＹＨＡ段階ＩＩＩからアルドステロンアンタゴニスト、カルシウム感受性増強剤（Ｌｅｖｏｓｉｍｅｎｄａｎ））によるさらなる処置を含む。
【００１７】
従って、さらに好ましい実施形態において、本発明に従う方法は、心機能不全の治療的制御に関する。
【００１８】
従って、本発明は、同様に、患者の危険性の層化のため、特に、臨床的決定のための、特に、時間が重要な集中医療もしくは救急救命医療において、ならびに患者の入院についての患者の層化のための方法に関する。
【００１９】
本発明に従う方法のさらに好ましい実施形態において、上記診断は、予後のため、鑑別診断的初期検出および検出のため、重篤度の程度の評価のため、ならびに心機能不全に付随する治療の過程の評価のために行われる。
【００２０】
本発明に従う方法のさらなる実施形態において、体液、特に血液、必要に応じて、全血もしくは血清は、試験されるべき患者から採取され、上記診断が、インビトロ／エキソビボ（すなわち、ヒトもしくは動物の身体の外で）で行われる。上記診断は、少なくとも１種の患者サンプル中に存在するマーカーであるニューロフィジンの測定およびその量に基づいて行われ得る。
【００２１】
本発明の範囲内において、「ニューロフィジン」（またはニューロフィジン ＩＩ）（フラグメント：プレプロバソプレッシンのアミノ酸配列３２〜１２４；図２を参照のこと）は、遊離の９３アミノ酸（９３ＡＳ：配列番号１：ＡＭＳＤＬＥＬＲＱＣ ＬＰＣＧＰＧＧＫＧＲ ＣＦＧＰＳＩＣＣＡＤ ＥＬＧＣＦＶＧＴＡＥ ＡＬＲＣＱＥＥＮＹＬ ＰＳＰＣＱＳＧＱＫＡ ＣＧＳＧＧＲＣＡＡＦ ＧＶＣＣＮＤＥＳＣＶ ＴＥＰＥＣＲＥＧＦＨ ＲＲＡ）またはそのフラグメントもしくは部分ペプチドを含むポリペプチド／タンパク質であることが理解される。さらに、本発明に従うこのポリペプチドは、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、脂質化もしくは誘導体化を有し得る。ニューロフィジンは、驚くべきことに、血漿中で安定である。
【００２２】
さらなる実施形態において、上記ニューロフィジンの測定は、さらなるマーカー、すなわち、好ましくは、心機能不全を既に示しかつ、本発明に従う方法においてニューロフィジンを含むマーカー組み合わせの相乗効果を可能にし得るものを用いてさらに行われ得る。
【００２３】
従って、本発明は、本発明に従う方法のこのような実施形態に関し、ここで上記測定は、炎症性マーカー、心血管マーカー、神経ホルモンマーカー、もしくは虚血マーカーの群から選択される少なくとも１種のさらなるマーカーを用いて、試験されるべき患者に対してさらに行われる。
【００２４】
本発明によれば、上記炎症性マーカーは、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、サイトカイニン（例えば、ＴＮＦ−α）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−６）、プロカルシトニン（１−１１６、３−１１６）、およびアドヘシン（例えば、ＶＣＡＭもしくはＩＣＡＭ）の群からの少なくとも１種のマーカーから選択され得る。そして上記心血管マーカーは、クレアチンキナーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、コペプチン、ミオグロブリン、ナトリウム利尿タンパク質、特に、ＡＮＰ（またはＡＮＦ）、プロＡＮＰ、ＮＴ−プロＡＮＰ、ＢＮＰ、プロＢＮＰ、ＮＴ−プロＢＮＰまたはそれぞれの部分配列、心筋トロポニン、ＣＲＰの群からの少なくとも１種のマーカーから選択され得る。さらに、これらは、同様に、循環を制御する（プロ）ホルモン、特に、類似のプロガストリン放出ペプチド（プロＧＲＰ）、プロエンドセリン（プロＥｎｄ）、プロレプチン、プロニューロペプチド−Ｙ、プロソマトスタチン、プロニューロペプチド−ＹＹ、プロオピオメラノコルチン、プロアドレノメデュリン（プロＡＤＭ）、コペプチン、もしくはそれぞれの部分配列を含むことが理解される。
【００２５】
上記虚血マーカーは、トロポニンＩおよびトロポニンＴ、ＣＫ−ＭＢの群からの少なくとも１種のマーカーから選択され得る。さらに、上記神経ホルモンマーカーは、少なくとも１種のナトリウム利尿タンパク質、特に、ＡＮＰ（またはＡＮＦ）、プロＡＮＰ、ＮＴ−プロＡＮＰ、ＢＮＰ、プロＢＮＰ、ＮＴ−プロＢＮＰまたはそれぞれの部分配列であり得る。
【００２６】
ニューロフィジンと、プロホルモン、特に、コペプチン、および／またはＢＮＰ、プロＢＮＰ、ＮＴ−プロＢＮＰとのマーカー組み合わせが、特に好ましい。
【００２７】
本発明のさらなる実施形態において、本発明に従う方法は、上記マーカーの並行測定もしくは同時測定（例えば、９６穴以上を有するマルチタイタープレート）によって行われ得る。ここで、上記測定は、少なくとも１種の患者サンプルに対して行われる。
【００２８】
さらに、本発明に従う方法およびその測定は、自動分析機で、特に、Ｋｒｙｐｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｒｙｐｔｏｒ．ｎｅｔ／）によって行われ得る。
【００２９】
別の実施形態において、本発明に従う方法およびその測定は、単一パラメーターもしくは複数パラメーター測定に拘わらず、迅速な試験（例えば、側方流試験（ｌａｔｅｒａｌ−ｆｌｏｗ ｔｅｓｔ））によって行われうる。
【００３０】
さらに、本発明は、心機能不全の診断および／または危険性の層化のための、ニューロフィジンまたはそのフラグメントもしくは部分ペプチド、および必要に応じて、上記に列挙されるようなさらなるマーカーの使用に関する。
【００３１】
本発明の別の目的は、対応する診断デバイスまたは本発明に従う方法を行うためのその使用の提供である。
【００３２】
本発明の範囲内において、診断デバイス、特に、アレイもしくはアッセイ（例えば、イムノアッセイ、ＥＬＩＳＡなど）は、最も広い意味において、本発明に従う方法を行うためのデバイスであると理解される。
【００３３】
本発明はさらに、マーカーであるニューロフィジンまたはそのフラグメントもしくは部分ペプチドを測定するための分析試薬、および必要に応じて、上記に列挙されたマーカーを含む、心機能不全の診断または危険性の層化のためのキットに関する。このタイプの分析試薬は、例えば、抗体、抗体蛍光物質などを含む。
【００３４】
以下の実施例および図面は、本発明をより詳細に説明するために使用されるが、本発明をこれら実施例および図面に限定しない。
【実施例】
【００３５】
（実施例および図面）
血液サンプルを、初期試験の間に呼吸窮迫症の症状を示していると病院の救急処置室に報告された患者から採取した。遠心分離から得られたＥＤＴＡ血漿をアリコートに分け、ニューロフィジンを測定するときまで、−８０℃で保存した。以前の記載（Ｐｕｌｌａｎ（前出））に従って、ラジオイムノアッセイをニューロフィジン用に開発した：神経下垂体のニューロフィジンを単離し、定量した。ウサギを上記ニューロフィジンで免疫し、このようにして、高い力価の抗ニューロフィジン抗血清を得た。イムノアッセイのために、最高の力価の抗血清を、１：１００，０００の濃度で使用した。精製ニューロフィジンを、クロラミンＴ法で放射性ヨウ素化し、このアッセイにおけるトレーサーとして使用した。正常ウマ血清中での精製ニューロフィジンの希釈液を、標準物質として使用した。上記アッセイを、以下のように行った：５０μｌのサンプルまたは標準物質を、１００μｌのトレーサー（１２，０００ｄｐｍ／測定）および１００μｌの希釈抗ニューロフィジン抗血清と混合し、２４時間、４℃でインキュベートした。１００ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、０．１％ ＢＳＡを、緩衝液として使用した。抗体と結合したトレーサーを、遊離トレーサーから分離した。それに、６０％ エタノールを添加し、次いで、４℃で１５分間、５，０００ｇで遠心分離した。上清を捨て、そのペレット中に残っている放射活性を、測定した。その評価を、Ｍｕｌｔｉｃａｌｃソフトウェアの補助により行った。上記アッセイは、２２ｐｇ／ｍｌの分析検出限界および最大４００ｐｇ／ｍｌまでの測定範囲を有した。種々の患者の血漿サンプルを、以下に説明するように、上記アッセイで測定した。測定値が＞４００ｐｇ／ｍｌであったサンプルを、上記測定範囲内で測定値が得られるように、適切な希釈液で測定した。
【００３６】
試験した患者での心機能不全の診断は、心機能不全に関するフラミンガムスコア（ＭｃＫｅｅ ＰＡ，Ｃａｓｔｅｌｌｉ ＷＰ，ＭｃＮａｍａｒａ Ｐ ａｎｄ Ｋａｎｎｅｌ ＷＢ，Ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ：ｔｈｅ Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ ｓｔｕｄｙ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２８５（１９７１），ｐｐ．１４４１−１４４６）と、収縮期機能不全または拡張期機能不全の超音波検査による証拠とに基づいていた。
【００３７】
さらに、既知の疾患を有しない健康な患者から血液を採取し、ＥＤＴＡ血漿を、遠心分離によって得た。
【００３８】
臨床的有用性
正常範囲
ニューロフィジン濃度を、健康なコントロール被験体に由来するサンプル（ｎ＝２００）中で測定した。メジアンは、７０．３ｐｇ／ｍｌであり、測定された最低値は、８．８であり、最高値は、２２０ｐｇ／ｍｌであった。９５％パーセンタイルは、３６．５もしくは１３５ｐｇ／ｍｌであった。
【００３９】
心機能不全／重篤度の程度
ニューロフィジン濃度を、慢性もしくは急性の代償不全性心機能不全を有する患者において測定した。ニューロフィジン濃度は、心機能不全の重篤度の程度と関連していた：重篤度Ｉ〜ＩＶの程度の４つのＮＹＨＡ分類におけるニューロフィジン濃度の平均値は、それぞれ、１７１．４ｐｇ／ｍｌ、２４３．４ｐｇ／ｍｌ、３４６．９ｐｇ／ｍｌおよび９１８．１ｐｇ／ｍｌであった（図１を参照のこと）。
【００４０】
慢性心機能不全／診断
慢性心機能不全を有する２５８名の患者の群および２００名の健康なコントロールから、ニューロフィジン値を測定した。ＲＯＣ解析（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ-Ｏｐｅｒａｔｏｒ-Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｅ）によって、０．８９のＡＵＣを得た。２１３ｐｇ／ｍｌのカットオフ値を用いると、４８％の感度が、９８％の特異性とともに生じた。１３６．１ｐｇ／ｍｌのカットオフ値を用いると、６８．２％の感度が、９５％の特異性とともに生じた。
【００４１】
慢性心機能不全／予後
慢性心機能不全を有する２５８名の患者から、ニューロフィジン値を測定した。上記患者を、３６０日間の平均期間にわたって観察した。この期間内に、８０名の患者が死亡し、１７８名が生存していた。死亡率の予後についての最も良いカットオフ値（感度と特異性との最大の積として定義される）を、ＲＯＣ解析から決定した：２４７ｐｇ／ｍｌ。このカットオフ値を用いると、予後の感度は５９．５％であった。特異性は６５．２％であった。２４７ｐｇ／ｍｌのカットオフ値による尤度比は、１．７であった（以下の表を参照のこと）。
【００４２】
【表１】
急性心機能不全／診断
急性呼吸窮迫症を有する１２５名の患者の群から、ニューロフィジン値を決定した。上記１２５名の患者のうちの６９名の患者が、心機能不全を有した。心機能不全の鑑別診断のためのＲＯＣ解析によって、０．６１のＡＵＣを得た。４９４０ｐｇ／ｍｌのカットオフ値を用いると、６．６％の感度が、９８％の特異性とともに生じた。３０００ｐｇ／ｍｌのカットオフ値を用いると、１１．７％の感度が、９５％の特異性とともに生じた。
【００４３】
急性心機能不全／予後
急性代償性心機能不全を有する６９名の患者の群から、ニューロフィジン値を測定した。上記患者を、３６０日間の平均期間にわたって観察した。この期間内に、２１名の患者が死亡し、４８名が生存していた。最も良いカットオフ値（感度と特異性との最大の積として定義される）を、死亡率の予後について、ＲＯＣ解析から決定した：８８５ｐｇ／ｍｌ。このカットオフ値を用いると、上記予後の感度は５７．１％であり、特異性は７５％であった。８８５ｐｇ／ｍｌのカットオフ値による尤度比は、２．３であった（以下の表を参照のこと）。
【００４４】
【表２】
表：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）の分類
ＮＹＨＡ Ｉ 肉体的活動の制限無し。通常の肉体的活動は、過労も、動悸も、呼吸困難（息切れ）も、狭心症も引き起こさない。
ＮＹＨＡ ＩＩ 肉体的活動のわずかな制限。休息時には苦痛がないが、通常の肉体的活動は、疲労、動悸、呼吸困難または狭心症を生じる。
ＮＹＨＡ ＩＩＩ 肉体的活動の顕著な制限。休息時には苦痛がないが、通常未満の活動でも、疲労、動悸、呼吸困難または狭心症を生じる。
ＮＹＨＡ ＩＶ いかなる活動でも、休息時でも、心機能不全の症状。ベッドに拘束される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心機能不全の診断および／または危険性の層化のための方法であって、該方法は、マーカーであるニューロフィジンまたはそのフラグメントもしくは部分ペプチドの測定が試験されるべき患者に対して実行されることで特徴づけられる、方法。
【請求項２】
前記方法はインビトロ診断であることで特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記心機能不全は、慢性心機能不全、（欝血性）心機能不全を有する高血圧性心疾患、高血圧性心疾患、および（欝血性）心機能不全を有する腎疾患、原発性右胸心性機能不全、二次的右胸心性機能不全、症状がない左心室機能不全（ＮＹＨＡ 段階Ｉ）、大きなストレスにより症状を有する左心室機能不全（ＮＹＨＡ段階ＩＩ）、わずかなストレスにより症状を有する左心室機能不全（ＮＹＨＡ段階ＩＩＩ）、休息時に症状を有する左心室機能不全（ＮＹＨＡ段階ＩＶ）、心原性ショック、心筋炎、心不整脈および／または緊張亢進を包含することで特徴づけられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
医薬品によって、特に、集中医療もしくは救急救命医療において、臨床的決定、特に、さらなる処置および治療を行うための、ならびに前記患者の入院のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の、心機能不全の診断および／または危険性の層化のための方法。
【請求項５】
予後のため、鑑別診断的初期検出および検出のため、重篤度の程度の評価のため、ならびに心機能不全に付随する治療の過程の評価のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の心機能不全の診断のための方法。
【請求項６】
炎症性マーカー、心血管マーカー、神経ホルモンマーカーまたは虚血マーカーの群から選択される少なくとも１種のさらなるマーカーでの、さらに、試験されるべき患者に対して測定が行われることで特徴づけられる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記炎症性マーカーは、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、例えば、ＴＮＦ−αのようなサイトカイニン、例えば、ＩＬ−６のようなインターロイキン、プロカルシトニン（１−１１６、３−１１６）、およびＶＣＡＭもしくはＩＣＡＭのようなアドヘシンの群からの少なくとも１種のマーカーから選択されることで特徴づけられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記心血管マーカーは、クレアチンキナーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、コペプチン、ミオグロブリン、ナトリウム利尿タンパク質、特に、ＡＮＰ（またはＡＮＦ）、プロＡＮＰ、ＮＴ−プロＡＮＰ、ＢＮＰ、プロＢＮＰ、ＮＴ−プロＢＮＰまたはそれぞれの部分配列、心筋トロポニン、ＣＲＰおよび循環を制御する（プロ）ホルモン、類似のプロガストリン放出ペプチド（プロＧＲＰ）、プロ−エンドセリン−１、プロレプチン、プロニューロペプチド−Ｙ、プロ−ソマトスタチン、プロニューロペプチド−ＹＹ、プロオピオメラノコルチン、プロアドレノメデュリン（プロＡＤＭ）、コペプチンもしくはそれぞれの部分配列の群からの少なくとも１種のマーカーから選択されることで特徴づけられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記虚血性マーカーは、トロポニンＩおよびトロポニンＴ、ＣＫ−ＭＢの群からの少なくとも１種のマーカーから選択されることで特徴づけられる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記神経ホルモンマーカーは、少なくとも１種のナトリウム利尿タンパク質、特に、ＡＮＰ（またはＡＮＦ）、プロＡＮＰ、ＮＴ−プロＡＮＰ、ＢＮＰ、プロＢＮＰ、ＮＴ−プロＢＮＰまたはその部分配列であることで特徴づけられる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記マーカーの並行測定または同時測定が行われることで特徴づけられる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記測定は、少なくとも１種の患者サンプルで行われることで特徴づけられる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記測定は、自動化分析器で、特に、Ｋｒｙｐｔｏｒによって行われることで特徴づけられる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記測定は、迅速試験、特に、単一パラメーターまたは複数パラメーターの測定によって行われることで特徴づけられる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
心機能不全の診断および／または危険性の層化のための、ニューロフィジンまたはそのフラグメントもしくは部分ペプチド、および必要に応じて、請求項６〜１０のいずれか１項に記載のさらなるマーカーの使用。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法を行うための診断剤。
【請求項１７】
心機能不全の診断および／または危険性の層化のためのキットであって、該キットは、マーカーであるニューロフィジンまたはそのフラグメントもしくは部分ペプチドおよび必要に応じて、請求項６〜１０のいずれか１項に記載のさらなるマーカーを測定するための分析試薬、ならびに補助物質（Ｈｉｌｆｓｍｉｔｔｅｌ）を含む、キット。
【請求項１】
心機能不全の診断および／または危険性の層化のための方法であって、該方法は、マーカーであるニューロフィジンまたはそのフラグメントもしくは部分ペプチドの測定が試験されるべき患者に対して実行されることで特徴づけられる、方法。
【請求項２】
前記方法はインビトロ診断であることで特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記心機能不全は、慢性心機能不全、（欝血性）心機能不全を有する高血圧性心疾患、高血圧性心疾患、および（欝血性）心機能不全を有する腎疾患、原発性右胸心性機能不全、二次的右胸心性機能不全、症状がない左心室機能不全（ＮＹＨＡ 段階Ｉ）、大きなストレスにより症状を有する左心室機能不全（ＮＹＨＡ段階ＩＩ）、わずかなストレスにより症状を有する左心室機能不全（ＮＹＨＡ段階ＩＩＩ）、休息時に症状を有する左心室機能不全（ＮＹＨＡ段階ＩＶ）、心原性ショック、心筋炎、心不整脈および／または緊張亢進を包含することで特徴づけられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
医薬品によって、特に、集中医療もしくは救急救命医療において、臨床的決定、特に、さらなる処置および治療を行うための、ならびに前記患者の入院のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の、心機能不全の診断および／または危険性の層化のための方法。
【請求項５】
予後のため、鑑別診断的初期検出および検出のため、重篤度の程度の評価のため、ならびに心機能不全に付随する治療の過程の評価のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の心機能不全の診断のための方法。
【請求項６】
炎症性マーカー、心血管マーカー、神経ホルモンマーカーまたは虚血マーカーの群から選択される少なくとも１種のさらなるマーカーでの、さらに、試験されるべき患者に対して測定が行われることで特徴づけられる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記炎症性マーカーは、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、例えば、ＴＮＦ−αのようなサイトカイニン、例えば、ＩＬ−６のようなインターロイキン、プロカルシトニン（１−１１６、３−１１６）、およびＶＣＡＭもしくはＩＣＡＭのようなアドヘシンの群からの少なくとも１種のマーカーから選択されることで特徴づけられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記心血管マーカーは、クレアチンキナーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、コペプチン、ミオグロブリン、ナトリウム利尿タンパク質、特に、ＡＮＰ（またはＡＮＦ）、プロＡＮＰ、ＮＴ−プロＡＮＰ、ＢＮＰ、プロＢＮＰ、ＮＴ−プロＢＮＰまたはそれぞれの部分配列、心筋トロポニン、ＣＲＰおよび循環を制御する（プロ）ホルモン、類似のプロガストリン放出ペプチド（プロＧＲＰ）、プロ−エンドセリン−１、プロレプチン、プロニューロペプチド−Ｙ、プロ−ソマトスタチン、プロニューロペプチド−ＹＹ、プロオピオメラノコルチン、プロアドレノメデュリン（プロＡＤＭ）、コペプチンもしくはそれぞれの部分配列の群からの少なくとも１種のマーカーから選択されることで特徴づけられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記虚血性マーカーは、トロポニンＩおよびトロポニンＴ、ＣＫ−ＭＢの群からの少なくとも１種のマーカーから選択されることで特徴づけられる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記神経ホルモンマーカーは、少なくとも１種のナトリウム利尿タンパク質、特に、ＡＮＰ（またはＡＮＦ）、プロＡＮＰ、ＮＴ−プロＡＮＰ、ＢＮＰ、プロＢＮＰ、ＮＴ−プロＢＮＰまたはその部分配列であることで特徴づけられる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記マーカーの並行測定または同時測定が行われることで特徴づけられる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記測定は、少なくとも１種の患者サンプルで行われることで特徴づけられる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記測定は、自動化分析器で、特に、Ｋｒｙｐｔｏｒによって行われることで特徴づけられる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記測定は、迅速試験、特に、単一パラメーターまたは複数パラメーターの測定によって行われることで特徴づけられる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
心機能不全の診断および／または危険性の層化のための、ニューロフィジンまたはそのフラグメントもしくは部分ペプチド、および必要に応じて、請求項６〜１０のいずれか１項に記載のさらなるマーカーの使用。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法を行うための診断剤。
【請求項１７】
心機能不全の診断および／または危険性の層化のためのキットであって、該キットは、マーカーであるニューロフィジンまたはそのフラグメントもしくは部分ペプチドおよび必要に応じて、請求項６〜１０のいずれか１項に記載のさらなるマーカーを測定するための分析試薬、ならびに補助物質（Ｈｉｌｆｓｍｉｔｔｅｌ）を含む、キット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１０−５１１８７７（Ｐ２０１０−５１１８７７Ａ）
【公表日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３９６０４（Ｐ２００９−５３９６０４）
【出願日】平成１９年１２月１０日（２００７．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＥ２００７／００２２１５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６７８０６
【国際公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【出願人】（５０９０９１３３２）ブラームズ アクチェンゲゼルシャフト (12)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１０日（２００７．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＥ２００７／００２２１５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６７８０６
【国際公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【出願人】（５０９０９１３３２）ブラームズ アクチェンゲゼルシャフト (12)
【Ｆターム（参考）】
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