ヌクレアーゼ遺伝子を欠失または不活性化させたロドコッカス属細菌
【課題】ロドコッカス属細菌は、その物理的強度が強く、また、酵素等を細胞内に多量に蓄積する能力を有すること等から、産業的に有用な微生物触媒として知られており、ニトリル類の酵素的水和または加水分解によるアミドまたは酸の生産等に利用されている。形質転換効率が優れたロドコッカス属細菌の提供。
【解決手段】ロドコッカス属細菌が有するヌクレアーゼ遺伝子の少なくとも１つ以上を欠失または不活性化した遺伝子欠損宿主。
【解決手段】ロドコッカス属細菌が有するヌクレアーゼ遺伝子の少なくとも１つ以上を欠失または不活性化した遺伝子欠損宿主。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレアーゼ活性が欠失または不活性化されたロドコッカス属細菌、およびこれを利用した形質転換体の作製に関する。
【背景技術】
【０００２】
ロドコッカス属細菌は、その物理的強度が強く、また、酵素等を細胞内に多量に蓄積する能力を有すること等から、産業的に有用な微生物触媒として知られており、ニトリル類の酵素的水和または加水分解によるアミドまたは酸の生産等に利用されている（特許文献１および２）。例えば、ロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１株（Ｊ１菌）は、アクリルアミドの工業的生産に使用されている。これまでに、これらの微生物触媒の有する酵素活性を、遺伝子組換えの方法により改良する試みがなされている（特許文献３〜５）。さらに、ロドコッカス属細菌の遺伝子操作を効率的に進めるために、宿主−ベクター系の開発が進められており、新規なプラスミドの探索（特許文献６〜８および１６）やベクターの開発（特許文献９〜１１および非特許文献１）なども行われている。
【０００３】
ロドコッカス属細菌の形質転換方法としては電気パルス法（特許文献１２〜１４）やプロトプラスト法（非特許文献２および３）が用いられ、これまでに、ロドコッカス ロドクロウス ＡＴＣＣ１２６７４をはじめとして、多くの形質転換体が得られている。本発明者らは、形質転換対象となるロドコッカス属細菌とは異なるロドコッカス属細菌またはその類縁菌から調製したプラスミドを用いることにより、形質転換対象へのプラスミドの形質転換効率が向上することを見出している（特許文献１５）。
【０００４】
また本発明者らはＪ１菌にＧＣＣＧＧＣを認識配列とするＩＩ型制限酵素（ＲｒｈＪ１Ｉ）を見出し、当該制限酵素に対応する修飾酵素を使用したプラスミドの修飾により、形質転換効率が向上することを見出している（特許文献１７）。しかしながら、上記手法によるロドコッカス属細菌の形質転換は煩雑であり、迅速な形質転換は困難であった。
【０００５】
以上のように、ロドコッカス属細菌において、より簡便にかつ高い効率で形質転換を達成できる形質転換方法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平２−４７０号公報
【特許文献２】特開平３−２５１１９２号公報
【特許文献３】特開平４−２１１３７９号公報
【特許文献４】特開平６−２５２９６号公報
【特許文献５】特開平６−３０３９７１号公報
【特許文献６】特開平４−１４８６８５号公報
【特許文献７】特開平４−３３０２８７号公報
【特許文献８】特開平７−２５５４８４号公報
【特許文献９】特開平５−６４５８９号公報
【特許文献１０】特開平８−５６６６９号公報
【特許文献１１】米国特許４９２００５４号公報
【特許文献１２】特開平１０−２４８５７８号公報
【特許文献１３】特開平９−２８３８０号公報
【特許文献１４】特開平５−６８５６６号公報
【特許文献１５】特開２００５−０９５０４１号公報
【特許文献１６】特開２００６−０５０９６７号公報
【特許文献１７】特開２００７−２２８９３４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７０，６３８−６４５（１９８８）
【非特許文献２】Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９８；３８（２）：１０１−６．
【非特許文献３】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８８ Ｆｅｂ；１７０（２）：６３８−４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ロドコッカス属細菌の遺伝子操作を効率的に進めるために、形質転換効率の向上したロドコッカス属細菌を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、菌体内のヌクレアーゼ活性を欠失または不活性化することにより、高効率にロドコッカス属細菌を形質転換できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、ヌクレアーゼ遺伝子が欠失または不活性化されたロドコッカス属細菌に関する。
【００１０】
本発明において、用いられるロドコッカス属細菌は特に限定されないが、例えば、ロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）等を挙げることができる。
【００１１】
本発明において、欠失または不活性化させるヌクレアーゼ遺伝子は、制限酵素遺伝子であることが好ましい。
【００１２】
１つの実施態様において、前記ヌクレアーゼ遺伝子は、配列番号１に示される塩基配列を有するＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素もしくはそのオーソログ、および／または配列番号３に示される塩基配列を有するＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼもしくはそのオーソログである。
【００１３】
前記ヌクレアーゼ遺伝子は、以下の（ａ）〜（ｃ）に示される塩基配列を有するＤＮＡからなる。
（ａ）配列番号１または３記載の塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号１または３記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列と相同性が８０％以上の塩基配列からなり、かつヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１４】
１つの実施態様において、前記ロドコッカス属細菌は、ロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１株またはその変異株である。
【００１５】
また本発明は、ヌクレアーゼ遺伝子が欠失または不活性化されたロドコッカス属細菌を作製し、該ロドコッカス属細菌を形質転換することを特徴とする、ロドコッカス属細菌の形質転換体とその製造方法も提供する。
【００１６】
さらに本発明は、ヌクレアーゼ遺伝子を欠失または不活性化させることを特徴とする、形質転換効率の向上したロドコッカス属細菌の製造方法、ならびに、ヌクレアーゼ遺伝子を欠失または不活性化させることを特徴とする、ロドコッカス属細菌の形質転換効率を向上させる方法も提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、ヌクレアーゼ活性が不活性化したロドコッカス属細菌、およびその形質転換体が提供される。本発明により提供されるロドコッカス属細菌の形質転換効率は、従来のロドコッカス属細菌よりも大幅に向上したものであり、これにより簡便かつ高効率にロドコッカス属細菌の遺伝子操作を行うことができる。本発明により、導入したＤＮＡの効果によりロドコッカス属細菌に新たな性質を付与し、産業上有用な微生物触媒等の開発が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ロドコッカス属細菌のゲノム上から所定の領域を欠失させる方法の一例（接合伝達による遺伝子破壊法）を説明するための模式図である。
【図２】プラスミドｐＫ１９ｍｏｂＳａｃＢ１の構造を示す模式図である。
【図３】プラスミドｐＫ４の構造を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明するが、本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定させるものではない。
【００２０】
１．ヌクレアーゼ遺伝子が欠失または不活性化されたロドコッカス属細菌
本発明に係るヌクレアーゼ遺伝子が欠失または不活性化されたロドコッカス属細菌（以下、「本発明のロドコッカス属細菌」ということがある）は、前述した通りヌクレアーゼ活性を有するロドコッカス属細菌において、ヌクレアーゼ遺伝子が欠失または不活性化したロドコッカス属細菌である。
【００２１】
１．１．ロドコッカス属細菌
本発明で用いられるロドコッカス属細菌は、ヌクレアーゼ活性を有するロドコッカス属細菌（対象微生物）であって、ヌクレアーゼを産生し、その活性を示す限り、特に限定はされない。例えば、ロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）およびロドコッカス エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス ピリジノボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｉｄｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、ロドコッカス オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）、ロドコッカス ジョスティ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊｏｓｔｉｉ）、ロドコッカス エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）等が好ましく挙げられる。特に好ましくはロドコッカス ロドクロウスである。
【００２２】
ロドコッカス ロドクロウスとしては、例えば、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ９９９株、ＡＴＣＣ１２６７４株、ＡＴＣＣ１７８９５株、ＡＴＣＣ１５９９８株、ＡＴＣＣ３３２７５株、ＡＴＣＣ１８４、ＡＴＣＣ４００１株、ＡＴＣＣ４２７３株、ＡＴＣＣ４２７６株、ＡＴＣＣ９３５６株、ＡＴＣＣ１２４８３株、ＡＴＣＣ１４３４１株、ＡＴＣＣ１４３４７株、ＡＴＣＣ１４３５０株、ＡＴＣＣ１５９０５株、ＡＴＣＣ１５９９８株、ＡＴＣＣ１７０４１株、ＡＴＣＣ１９１４９株、ＡＴＣＣ１９１５０株、ＡＴＣＣ２１１９７株、ＡＴＣＣ２１２４３株、ＡＴＣＣ２９６７０株、ＡＴＣＣ２９６７２株、ＡＴＣＣ２９６７５株、ＡＴＣＣ３３２５８株、ＡＴＣＣ１３８０８株、ＡＴＣＣ１７０４３株、ＡＴＣＣ１９０６７株、ＡＴＣＣ２１９９９株、ＡＴＣＣ２１２９１株、ＡＴＣＣ２１７８５株、ＡＴＣＣ２１９２４株、 ＩＦＯ１４８９４株、ＩＦＯ３３３８株、ＮＣＩＭＢ１１２１５株、ＮＣＩＭＢ１１２１６株、ＪＣＭ３２０２株のほか、ロドコッカス ロドクロウスＮＣＩＭＢ４１１６４（国際公開第０５／０５４４５６号）、ロドコッカス ロドクロウスＪ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）、ロドコッカス ロドクロウスＭ８（ＳＵ１７３１８１４）、ロドコッカス ロドクロウスＭ３３（ＶＫＭ Ａｃ−１５１５Ｄ）等が好ましく挙げられ、特に好ましくはロドコッカス ロドクロウスＪ１である。
【００２３】
ロドコッカス エリスロポリスとしては、例えばロドコッカス エリスロポリスＰＲ４，ロドコッカス エリスロポリスＳＫ１２１等が好ましく挙げられる。
ロドコッカス オパカスとしては、例えばロドコッカス オパカスＢ４が好ましく挙げられる。
ロドコッカス ジョスティとしては、例えばロドコッカス ジョスティＲＨＡ１が好ましく挙げられる。
ロドコッカス エクイとしては、例えばロドコッカス エクイＡＴＣＣ３３７３７が好ましく挙げられる。
【００２４】
１．２．ヌクレアーゼ遺伝子
本発明において欠失または不活性化するヌクレアーゼ遺伝子としては、特に限定されないが、形質転換の対象となるロドコッカス属細菌が有するヌクレアーゼ遺伝子のオーソログ、またはそのヌクレアーゼの認識するＤＮＡ配列と同じＤＮＡ配列を認識するヌクレアーゼの遺伝子が好ましい。
【００２５】
欠失または不活性化するヌクアーゼの一例として、ＲｒｈＪ１ＩおよびＲｒｈＪ１ＩＩを挙げることができる。なお、ＲｒｈＪ１ＩとＲｒｈＪ１ＩＩは、いずれも制限酵素活性を有するヌクレアーゼであるが、本明細書中では、両者の混同を避けるために、前者を「ＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素」および後者を「ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ」と記載することとする。
【００２６】
「ＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素」（「Ｊ１菌制限酵素」ともいう）は、ロドコッカス ロドクロウスＪ−１株から単離された制限酵素であり、ＧＣＣＧＧＣの６塩基配列を認識し、ＤＮＡを切断する活性（「ＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素活性」ともいう）を有するヌクレアーゼである（特開２００７−２５９８５３号参照）。ＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、その遺伝子は配列番号１に示される塩基配列を含む（配列番号１：ＯＲＦ（ｃＤＮＡ配列）、配列番号２１：ゲノム配列）。
【００２７】
「ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ」（「Ｊ１菌ヌクレアーゼ」ともいう）は、ロドコッカス ロドクロウスＪ−１株から単離されたヌクレアーゼであり、ｐＢＲ３２２のｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒをｏｐｅｎ ｃｉｒｃｕｌａｒにするｎｉｃｋｉｎｇ活性（「ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ活性」ともいう）を有するヌクレアーゼである。ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、その遺伝子は配列番号３に示される塩基配列を含む（配列番号３：ＯＲＦ（ｃＤＮＡ配列）、配列番号１８：ゲノム配列）。
【００２８】
Ｊ１菌以外のロドコッカス属細菌については、上記Ｊ１菌のＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素およびＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼに対応するオーソログを欠失または不活性化させることができる。
【００２９】
ここで、「オーソログ」とは、異なる生物に存在する相同な機能を有するタンパクをコードする類縁遺伝子であって、ＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素遺伝子の場合であれば、そのオーソログとはＪ１菌以外の生物においてＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素活性を有するタンパクをコードする遺伝子であり、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子の場合であれば、そのオーソログは、Ｊ１菌以外の生物においてＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ活性を有するタンパクをコードする類縁遺伝子である。
【００３０】
上記したＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素遺伝子およびＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼのオーソログは、ＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素遺伝子およびＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子と高い配列相同性を有する。それゆえ、上記配列番号１および配列番号３の塩基配列を有する遺伝子に加えて、これらの配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、さらに特に好ましくは約９５％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列を有するＤＮＡも本発明のヌクレアーゼ遺伝子に含まれる。
【００３１】
また、配列番号１および配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、これがそれぞれＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素やＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼのようなヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、本発明のヌクレアーゼ遺伝子に含まれる。
【００３２】
なお、ストリンジェントな条件としては、例えばＤＮＡを固定したナイロン膜を、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコールを含む溶液中で６５℃にて２０時間プローブとともに保温してハイブリダイゼーションを行う条件を挙げることができるが、これに限定されるわけではない。当業者であれば、このような緩衝液の塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、ハイブリダイゼーションの条件を設定することができる。
【００３３】
１．３．ヌクレアーゼ遺伝子が欠失または不活性化されたロドコッカス属細菌
本発明に係るロドコッカス属細菌は、上述したようなヌクレアーゼ遺伝子のうち１つが欠失または不活性化されたものであっても良いし、複数のヌクレアーゼ遺伝子が欠失または不活性化されたものであってもよい。
【００３４】
なお、「欠失」とは、ヌクレアーゼ遺伝子の一部または全部が欠失し、その結果として当該遺伝子がコードするタンパクのヌクレアーゼ活性の一部または全部が失われることを意味する。また、「不活性化」とは、ヌクレアーゼ遺伝子の欠失以外の理由（例えば、後述する調節領域の修飾など）により、当該遺伝子がコードするタンパクのヌクレアーゼ活性の一部または全部が失われることを意味する。
【００３５】
ここで、「ヌクレアーゼ活性」とは、ＤＮＡを切断する活性を意味する。切断するＤＮＡは二本鎖ＤＮＡでも一本鎖ＤＮＡでも良く、また切断する場所は内部でも末端から順次切断するものも含まれる。さらに、本発明のヌクレアーゼ活性には、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖を切断するｎｉｃｋｉｎｇ活性を含む。
【００３６】
本発明のロドコッカス属細菌のヌクレアーゼ活性の測定方法としては、例えば、該ヌクレアーゼをＤＮＡと接触させ、接触後のＤＮＡの分子量またはＤＮＡ断片数を測定することにより評価することができる。当業者であれば、基質ＤＮＡ，接触時の酵素量、温度、溶液組成または接触時間などの条件を設定することができる。ＤＮＡの分子量は、例えばアガロースゲル電気泳動によって測定することができる。接触前のＤＮＡの分子量と接触後のＤＮＡの分子量、または接触前のＤＮＡの断片数と接触後のＤＮＡの断片数を比較することで、ヌクレアーゼ活性を評価することができる。
【００３７】
ＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素活性は、ＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素をＤＮＡと接触させ、接触後のＤＮＡの分子量またはＤＮＡ断片数を測定することにより評価することができる。また、ＧＣＣＧＧＣを認識する既知の制限酵素を対照として使用してもよい。
【００３８】
またＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ活性は、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼをＤＮＡと接触させ、接触後のＤＮＡの分子量またはＤＮＡ断片数を測定することにより評価することができる。
【００３９】
２．ヌクレアーゼ遺伝子が欠失または不活性化されたロドコッカス属細菌の製造
２．１．ヌクレアーゼ遺伝子の欠失または不活性化
本発明のロドコッカス属細菌は、本来有するヌクレアーゼ遺伝子が欠失または不活性化されたものである。ここで、遺伝子（標的遺伝子）の欠失または不活性化とは、当該遺伝子がコードするタンパク質のヌクレアーゼ活性の一部または全部を失わせるような、対象微生物のゲノムＤＮＡにコードされるヌクレアーゼ遺伝子の一部または全部の欠失、置換、付加；プロモーター配列の一部または全部が欠失、置換、付加；発現調節に関連する遺伝子の一部または全部が欠失、置換、付加等が挙げられる。これらの欠失、置換、付加等された領域は単独でもよいし複数を組み合わせたものでもよい。
【００４０】
例えば、上記対象ロドコッカス属細菌がロドコッカス ロドクロウスＪ１株の場合は、ヌクレアーゼ遺伝子ＲｒｈＪ１ＩおよびＲｒｈＪ１ＩＩ（ｃＤＮＡ配列は配列番号１および３，ゲノム配列は配列番号２１および１８、アミノ酸配列は配列番号２および４）を有しているため、標的遺伝子としては、これらのいずれか一方でもよいし、両方でもよく、限定はされない。
【００４１】
ヌクレアーゼ遺伝子を特異的に欠失または不活性化する手法としては、特に限定されず、従来公知の遺伝子組換技術を適用することができる。
【００４２】
上記のとおり、ヌクレアーゼ遺伝子の欠失または不活性化は、目的とするヌクレアーゼ遺伝子をゲノムから削除する、目的とするヌクレアーゼ遺伝子内に他のＤＮＡ断片を挿入する、または当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与えることにより達成される。
【００４３】
本発明に係るロドコッカス属細菌は、目的とするヌクレアーゼ遺伝子を計画的に欠失または不活性化したものであってもよいし、遺伝子にランダムに変異を与えた結果、上述したヌクレアーゼ遺伝子を欠失または不活性化したものであってもよい。
【００４４】
ヌクレアーゼ遺伝子を欠失または不活性化する方法としては、例えば、相同組換え（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を利用する方法が挙げられる。
【００４５】
具体的には、標的遺伝子の塩基配列中に薬剤耐性マーカー遺伝子等を相同組換えにより挿入し、当該遺伝子が機能発現しない状態にする、または（標的遺伝子を当該遺伝子の一部または全部を含まない配列に置換することにより）標的遺伝子自体を欠失させて、その発現そのものを阻害する方法である。
【００４６】
２．２．接合伝達による遺伝子破壊法
以下にヌクレアーゼ遺伝子を欠失または不活性化する方法の一例として、接合伝達による遺伝子破壊法について図１を参照して説明する。本方法はすなわち、ドナー微生物からヌクレアーゼ活性を有するレシピエント微生物（ロドコッカス属細菌）への接合伝達を利用した形質転換方法を用いることを含む、ヌクレアーゼ遺伝子の欠失または不活性化方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含むものである。
【００４７】
（ａ）レシピエント微生物として、前述接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性が強化されたロドコッカス属細菌を作製する工程；
（ｂ）ドナー微生物として、下記（ｉ）〜（ｖ）：
（ｉ）レシピエント微生物中のヌクレアーゼ遺伝子（標的遺伝子）とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該耐性遺伝子を欠失または不活性化させた配列、
（ｉｉ）当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、
（ｉｉｉ）当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、
（ｉｖ）レシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子、および、
（ｖ）レシピエント微生物に対する致死遺伝子
を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で作製されたドナー微生物から工程（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程；並びに
（ｄ）工程（ｃ）で作製された形質転換体を、前述致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。
【００４８】
上記欠失または不活性化方法において用いるレシピエント微生物としては、ヌクレアーゼ遺伝子を有するロドコッカス属細菌であれば限定されない。ロドコッカス属細菌等の具体例については、前述と同様のものが挙げられる。
【００４９】
一方、ドナー微生物としては、上記レシピエント微生物と接合伝達可能な微生物であれば限定はされない。例えば、大腸菌が好ましい。
【００５０】
工程（ａ）
工程（ａ）では、接合伝達に供するレシピエント微生物として、接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性を強化したロドコッカス属細菌を作製する。「薬剤への耐性を強化する」とは、レシピエント微生物が薬剤耐性を有していない場合には、薬剤耐性を付与することをいい、レシピエント微生物が薬剤耐性の乏しい場合には、当該耐性をより強くすることをいう。
【００５１】
接合伝達法を使用する場合、レシピエント微生物となるロドコッカス属細菌には薬剤耐性マーカーが必要である。よって、薬剤耐性を有していないロドコッカス属細菌、または薬剤耐性の乏しいロドコッカス属細菌をレシピエント微生物として使用する場合、薬剤選択可能な程度の十分な薬剤耐性を有する株の作製が必要となる。ここで、薬剤としては、接合伝達法を使用することを考慮し、接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤が好ましい。当該薬剤としては、クロラムフェニコール、アンピシリン、カナマイシン、トリメトプリム、ゲンタマイシン、ナルジクス酸、カルベニシン、チオストレプトン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等が好ましく、クロラムフェニコール、アンピシリンがより好ましい。
【００５２】
上述のように薬剤耐性を強化したレシピエント微生物を作製する方法としては、特に限定はされない。例えば、自然変異誘発法、紫外線照射や変異誘発剤を用いる突然変異誘発法、ＥＺ−ＴＮ５（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）のようなランダム変異導入ツール等を用いることにより、本来レシピエントが持たない薬剤耐性遺伝子を人為的に当該微生物ゲノム上に導入する方法、あらかじめ遺伝子改変用プラスミドとは別の、抗生物質耐性獲得用のプラスミドを導入する方法等が好ましい。これらの中でも自然変異誘発法がより好ましい。
【００５３】
自然変異誘発法は、所望の薬剤を含有する培地中で対象とする微生物を継代培養等することにより、もともとは当該培地中で生育不可または困難な微生物に自然変異を誘発させて、より高濃度の薬剤を含有する当該培地中でも生育し得る株を取得する方法である。どの程度まで薬剤耐性を強化するかは、使用するレシピエント微生物、ドナー微生物、選択する薬剤により異なるが、レシピエント微生物の生育が抑制されない、且つ、ドナー微生物の生育が阻害される薬剤濃度を選ぶことが好ましい。例えば、レシピエント微生物としてロドコッカス属細菌を、ドナー微生物として大腸菌を、選択用薬剤としてクロラムフェニコールを用いる場合、自然突然変異によりクロラムフェニコール１〜２００ｍｇ／ｌ，好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｌを含有する培地において生育可能なレシピエント微生物（クロラムフェニコール耐性強化株）を得ることが望ましい。
【００５４】
工程（ｂ）
工程（ｂ）では、接合伝達に供するドナー微生物として、所定の遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する。遺伝子改変用プラスミド、すなわちレシピエント微生物中のヌクレアーゼ遺伝子を改変するためのプラスミドＤＮＡとしては、前述の（ｉ）〜（ｖ）の構成（遺伝子・塩基配列）を含むものを用いる。
【００５５】
ここで、前述（ｉ）の配列は、改変の対象とするレシピエント微生物中のヌクレアーゼ遺伝子と当該遺伝子の周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該ヌクレアーゼ遺伝子を欠失または不活性化させた配列である。当該配列の作製は、レシピエント微生物のゲノムから、ヌクレアーゼ遺伝子と当該遺伝子の周辺の塩基配列とを含む塩基配列の単離（クローニング）、遺伝子ライブラリ作製やＰＣＲ等の公知技術を用いて行うことができる。
【００５６】
なお、ヌクレアーゼ遺伝子の周辺の塩基配列としては、限定はされない。例えば、当該遺伝子に加え、発現調節に関連する遺伝子の上流および下流の相同領域が両端からそれぞれ１００〜３０００ｂｐの塩基配列を含む配列であることが好ましい。より好ましくは５００〜２０００ｂｐの塩基配列を含む配列である。単離した塩基配列を用いて、前述（ｉ）を作製する方法は特に限定されず、ＰＣＲ法や制限酵素を用いた標的遺伝子部分の切除もしくは置換等の公知技術を用いて行うことができる。
【００５７】
前述（ｉｉ）の接合伝達開始領域は、使用するドナー微生物中において接合伝達の開始点となる塩基配列を含む領域であれば、限定はされない。例えば、プラスミドＰＲ４由来のｏｒｉＴが好ましい。
【００５８】
前述（ｉｉｉ）の複製開始領域は、使用するドナー微生物中において前述遺伝子改変用プラスミドの自己複製起点として機能し得る塩基配列を含む領域であれば、限定はされない。例えば、ｏｒｉＶが好ましい。
【００５９】
前述（ｉｖ）の薬剤耐性遺伝子は、前述工程（ａ）で作製した、接合伝達に供するレシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子であれば、限定はされない。例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、トリメトプリム耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、ナルジクス酸耐性遺伝子、カルベニシン耐性遺伝子、チオストレプトン耐性遺伝子等が好ましく挙げられる。
【００６０】
前述（ｖ）の致死遺伝子は、レシピエント微生物のゲノム上に導入された場合に、当該微生物を死に至らしめる作用を有し得る遺伝子であれば、限定はされない。例えば、ｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓL遺伝子、ｃｃｄＢ遺伝子等が挙げられるが、ｓａｃＢ遺伝子が好ましい。ｓａｃＢ遺伝子は、当該遺伝子を保有し発現する微生物（例えばロドコッカス属細菌）をスクロース含有培地で培養した場合に、スクロースを基質とし当該微生物に対して致死作用を有する有害物質を産生する酵素（レバンスクラーゼ）をコードする遺伝子である。
【００６１】
接合伝達に用いる前述遺伝子改変用プラスミドは、如何なるベクターをベースとして構築されたものであってもよく、限定はされない。例えば、レシピエント微生物がロドコッカス属細菌の場合は、ｐＫ１９ｍｏｂベクター（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｌ，ｖｏｌ．４５，ｐ．６９−７３（１９９４））等を用いることが好ましい。
【００６２】
前述遺伝子改変用プラスミドにおける（ｉ）〜（ｖ）の構成は、例えば、上流から順に、前述（ｉ）の配列、前述（ｉｖ）の耐性遺伝子、前述（ｖ）の致死遺伝子、前述（ｉｉ）の接合伝達開始領域、前述（ｉｉｉ）の複製開始領域の順で配されていることが好ましい。前述（ｉ）〜（ｖ）の構成を含む遺伝子改変用プラスミドの構築は、公知の遺伝子組換え技術を用いて実施することができる。
【００６３】
上述の各構成を有する遺伝子改変用プラスミドをドナー微生物内に導入して形質転換し、接合伝達に供するドナー微生物を作製する。その際、形質転換の方法としては、微生物の形質転換方法として公知の方法を用いることができる。例えば大腸菌をドナー微生物とする場合は、エレクトロポレーション法やカルシウム法等を用いることができる。
【００６４】
工程（ｃ）
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で作製されたドナー微生物から工程（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行う。通常は、ドナー微生物およびレシピエント微生物のそれぞれの細胞懸濁液を混合し、適当なプレート培地（ＬＢ培地等）上に均一に広げて、両微生物の接合を行わせる。
【００６５】
当該接合においては、ドナー微生物中の遺伝子改変用プラスミドがレシピエント微生物内に移動し、レシピエント微生物のゲノムと上記プラスミドとの相同配列で二重交叉が起こり当該ゲノム中のヌクレアーゼ遺伝子が欠失される。この接合により、レシピエント微生物の形質転換体が作製される。すなわち、当該形質転換体は、ドナー微生物中の遺伝子改変用プラスミドの一部が相同組換えによりレシピエント微生物のゲノム上に導入されたものである。
【００６６】
所望の形質転換体であるかどうかの確認は、レシピエント微生物自体の薬剤耐性、および前述遺伝子改変用プラスミド由来の薬剤耐性を利用して行うことができる。具体的には、両薬剤を含む培地（例えば、カナマイシンおよびクロラムフェニコール含有培地等）において上記接合後の微生物を培養することにより、所望の形質転換体を選択することができる。
【００６７】
工程（ｄ）
工程（ｄ）では、工程（ｃ）で作製されたレシピエント微生物の形質転換体（形質転換微生物）を、前述遺伝子改変用プラスミド由来の致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養（継代培養）する。致死遺伝子が機能し得る培養条件としては、限定はされないが、例えば致死遺伝子がｓａｃＢ遺伝子の場合は、スクロース含有培地を用いた培養が好ましく挙げられる。
【００６８】
当該培養においては、上記致死遺伝子を有する形質転換微生物は生育困難であるため、継代培養により、自然誘発的に、当該微生物のゲノム上から相同組換えにより上記致死遺伝子を含む塩基配列領域が除かれた（脱落した）形質転換微生物を得ることができる。
【００６９】
ただし、当該得られた微生物の中には、レシピエント微生物中のヌクレアーゼ遺伝子が、当初の目的通り欠失または不活性化しているものと、そうでないもの（上記脱落の際の相同組換えにより元のヌクレアーゼ遺伝子の機能が復活したもの）が含まれている。
【００７０】
よって、通常は、当該得られた微生物のゲノムＤＮＡを抽出し、例えばＰＣＲ法などによりヌクレアーゼ遺伝子が、当初の目的どおり欠失していることを確認し、所望の形質転換微生物を選択することがより好ましい。
【００７１】
３．ヌクレアーゼ遺伝子が欠失または不活性化されたロドコッカス属細菌の形質転換方法
本発明のロドコッカス属細菌に導入するためのプラスミドは、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌で複製増殖可能なＤＮＡ領域を有するプラスミドであれば良い。
【００７２】
例えば、ロドコッカス属細菌で複製増殖可能なＤＮＡ領域としては、プラスミドｐＡＮ１２，ｐＮＣ９０３，ｐＦＡＪ２６００，ｐＲＣ１０，ｐＲＣ２０，ｐＲＣ００１，ｐＲＣ００２，ｐＲＣ００３またはｐＲＣ００４等に含まれる複製増殖可能なＤＮＡ領域が挙げられる。好ましくは、プラスミドｐＲＣ００１，ｐＲＣ００２，ｐＲＣ００３またはｐＲＣ００４に含まれる複製増殖可能なＤＮＡ領域が挙げられる。プラスミドｐＲＣ００１，ｐＲＣ００２，ｐＲＣ００３またはｐＲＣ００４は、各々ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ４２７６，ＡＴＣＣ１４３４９，ＡＴＣＣ１４３４８，ＩＦＯ３３３８株由来のプラスミドであり、特開平２−８４１９８号公報、特開平４−１４８６８５号公報、特開平５−６４５８９号公報、特開平５−６８５６６号公報に記載されている。
【００７３】
また、上記ｐＲＣ００４を含むベクターであるｐＳＪ０２３（特開平１０−３３７１８５号）およびｐＳＪ０３４も使用することができる。
【００７４】
当該プラスミドは、アルカリ−ＳＤＳ法で調製したものが使用でき、好ましくは不純物の少ない高純度なＤＮＡを使用する。ベクターを高純度に精製する方法としては、密度勾配遠心法、市販精製キットを使用することができる。密度勾配遠心法は、例えばＣｓＣｌやＣＦ3ＣＯＯＣｓを使用して、１０００００Ｇで２〜４８時間遠心した後、目的とするＤＮＡのバンドを抽出することにより、ベクターを精製することができる。
【００７５】
プラスミドの調製に使用する宿主は、特に限定されず、例えば、大腸菌（エシェリヒア・コリ）、枯草菌（バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis））、放線菌などの細菌、酵母、カビ、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。プラスミドの調製の好ましい宿主は大腸菌である。
【００７６】
形質転換に使用する宿主細菌は、上記２の方法で調製したヌクレアーゼ欠失または不活性化ロドコッカス属細菌である。宿主細菌は培養液を洗浄してそのまま使用したり、または細胞壁の構造を変化させたりすることにより、プラスミドＤＮＡの導入効率を高めることが可能である。細胞壁の構造を変化させる方法としては、培養時にグリシン、ペニシリンＧまたはイソニコチン酸ヒドラジドで処理する方法が好ましい。また、培養液の１０％から２０％のショ糖を添加して培養する方法も用いることができる。このようにして調製した宿主細菌はコンピテントセルと呼ばれる。
【００７７】
以上のように調製したプラスミドＤＮＡと宿主細菌を使用して形質転換を行う。形質転換手法は、当業者に公知の形質転換手法であれば特に限定されず、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を利用することができる。
【００７８】
例えば、電気パルス法を使用し、適量のプラスミドＤＮＡとコンピテントセルを混合してキュベットに入れ、電気パルスを印加する。電気パルスの印加条件は、電圧として１０〜２５ＫＶ／ｃｍ、好ましくは２０ＫＶ／ｃｍ、抵抗値として５０〜４００Ω、好ましくは１００−２００Ωを使用する。電気パルスを印加した後、３７℃で数分ヒートショックを行い、その後、適当な培地を適量加え、約３０℃にて数時間培養を行う。この培養を行うことにより、上述のように薬剤添加によって変化した細胞壁が正常な構造に回復すると共に、プラスミド由来の薬剤耐性遺伝子の発現が起こる。この培養時間は、１時間以上が好ましく、１２時間以上がより好ましい。
【００７９】
形質転換を確認するためのマーカー薬剤または選択培地の薬剤としては、形質転換体の取得が可能であり、かつ、宿主細菌と形質転換体を区別することができるものであれば特に制限されないが、例えばカナマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、トリメトプリム、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等が挙げられる。
【００８０】
薬剤の濃度は、形質転換体を効率よく取得するためには、選択培地に対して必要最少量とすることが好ましい。この濃度は、各種濃度の薬剤を含む寒天培地に宿主細菌をプレートし、コロニーの生育の有無を調べることによって設定することができる。例えば、プラスミドＤＮＡとしてｐＫ１、ｐＫ２、ｐＫ３、ｐＫ４、ｐＳＪ０２３、ｐＳＪ００２などを使用する場合には、カナマイシン濃度は１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜５０μｇ／ｍｌである。
【００８１】
なお、形質転換効率は、例えば、形質転換に用いたベクター量あたりの形質転換体コロニー数（ｃｆｕ）（＝ｃｆｕ／μｇ）あるいは形質転換に用いた宿主の量あたりの形質転換体量などにより算出することができる。
【００８２】
本発明のロドコッカス属細菌は形質転換効率が野生型に比較して顕著に高く、簡便かつ高効率に目的遺伝子を導入することができる。これにより、ロドコッカス属細菌に新たな性質を付与し、産業上有用な微生物触媒等を開発することが可能になる。
【実施例】
【００８３】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８４】
［実施例１］
ＲｒｈＪ１Ｉ欠失用プラスミド、ＲｒｈＪ１ＩＩ欠失用プラスミドの作製
（１）接合伝達プラスミドベクター（ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１）の作製
ｐＤＮＲ−１ｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）中のｓａｃＢ遺伝子を、ＮｓｐＶ切断サイトを付加したプライマーＳＡＣ−０１（配列番号５）およびＳＡＣ−０２（配列番号６）を使用したＰＣＲにより増幅し、約１．９ｋｂのｓａｃＢ遺伝子断片を得た。増幅条件は以下の通りである。
【００８５】
反応液組成：
滅菌水 ２２μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（タカラバイオ社製） ２５μｌ
ＳＡＣ−０１（配列番号５） １μｌ
ＳＡＣ−０２（配列番号６） １μｌ
ｐＤＮＲ−１ｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）（１００倍希釈） １μｌ
総量 ５０μｌ
【００８６】
温度サイクル：
９８℃：１０秒、５５℃：５秒および７２℃：１０秒の反応を３０サイクル
【００８７】
プライマー：
ＳＡＣ−０１：ＧＧＴＴＣＧＡＡＴＡＣＣＴＧＣＣＧＴＴＣＡＣＴＡＴＴＡＴＴＴＡＧＴＧ（配列番号５）
ＳＡＣ−０２：ＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＧＧＣＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＧ（配列番号６）
【００８８】
ＰＣＲ産物の２μｌを０．７％アガロースゲル電気泳動に供して増幅を確認した後、反応液をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ｂａｎｄ ａｎｄ ＧｅｌＢａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）で精製した。
【００８９】
精製したｓａｃＢ遺伝子断片、およびｐＫ１９ｍｏｂを制限酵素ＮｓｐＶ（タカラバイオ社製）で消化後、それぞれの切断断片をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ｂａｎｄ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製した。
ｓａｃＢのＮｓｐＶ切断断片とｐＫ１９ｍｏｂのＮｓｐＶ切断断片を、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いて連結した。反応条件は以下の通りである。
【００９０】
反応液組成：
ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｇｈｔｙ ｍｉｘ（タカラバイオ社製） ５μｌ
ｓａｃＢ／ＮｓｐＶ切断断片 ４μｌ
ｐＫ１９ｍｏｂ／ＮｓｐＶ切断断片 １μｌ
総量 １０μｌ
【００９１】
反応：
１６℃，１時間
【００９２】
上記ライゲーション産物の全量を、後述の方法で調製した大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル２００μｌに加え、０℃で３０分放置した。続いて、前述コンピテントセルに４２℃で４５秒間ヒートショックを与え、０℃で２分間冷却した。その後、ＳＯＣ培地（２０ｍＭグルコース、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＳＯ4，１ｍＭ ＭｇＣｌ2）を１ｍｌ添加し、３７℃にて１時間振盪培養した。培養後の培養液を２００μｌずつ、ＬＢ Ｋｍ寒天培地（カナマイシン５０ｍｇ／ｌ，２％寒天を含有するＬＢ培地（１％バクトトリプトン、１％ＮａＣｌ，０．５％バクトイーストエキス））に塗布し、３７℃で一晩培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニー複数個を、１．５ｍｌのＬＢ Ｋｍ培地（カナマイシン５０ｍｇ／ｌを含有するＬＢ培地）にて３７℃で一晩培養した。得られた培養液を集菌後、ＱＩＡｐｒｅｐ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて組換えプラスミドを回収した。キャピラリーＤＮＡシーケンサーＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて、添付のマニュアルに従って、プラスミド中にクローニングされているＰＣＲ増幅産物の塩基配列と方向を解析した。ＳａｃＢ遺伝子が正方向に導入されたプラスミドベクターをｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１と命名した。図２にｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１の構造を示す。
【００９３】
なお、大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルは以下の方法で調製した。
大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ培地１ｍｌに接種し、３７℃で５時間好気的に前培養した。次に、前培養液０．４ｍｌをＳＯＢ培地４０ｍｌ（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＳＯ4，１ｍＭ ＭｇＣｌ2）に加え、１８℃で２０時間培養した。得られた培養物を遠心分離（３，７００×ｇ，１０分間、４℃）により集菌した後、冷ＴＦ溶液（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．０），２００ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ2，４０ｍＭ ＭｎＣｌ2）を１３ｍｌ加え、０℃で１０分間放置し、再度遠心分離（３，７００×ｇ，１０分間、４℃）して上清を除いた。得られた大腸菌菌体を冷ＴＦ溶液３．２ｍｌに懸濁し、０．２２ｍｌのジメチルスルホキシドを加え、０℃で１０分間放置した後、液体窒素を用いて凍結したものをコンピテントセルとした。
【００９４】
（２）Ｊ１株ゲノムＤＮＡの調製
ロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１株を１００ｍｌのＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％Ｋ2ＨＰＯ4，０．２％ＫＨ2ＰＯ4，ｐＨ７．０）中、３０℃にて７２時間振盪培養した。
【００９５】
培養後、集菌し、集菌された菌体をＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．１Ｍ ＥＤＴＡ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））４ｍｌに懸濁した。懸濁液に４０ｍｇのリゾチームを加えて、３７℃で１〜２時間振盪したのち、−２０℃で凍結した。
【００９６】
次に、１０ｍｌのＴｒｉｓ−ＳＤＳ液（１％ＳＤＳ，０．１Ｍ ＮａＣｌ，０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を穏やかに振盪しながら加え、さらにプロテイナーゼＫ（メルク社）を１０μｌ（終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）加えて３７℃で１時間振盪した。
【００９７】
次に、等量のＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））飽和フェノールを加え、撹拌した後遠心した。遠心後、上層をとり２倍量のエタノールを加えた後、ガラス棒でＤＮＡを巻きとり、９０％，８０％，７０％のエタノールで順次フェノールを取り除いた。
【００９８】
次に、ＤＮＡを３ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼＡ溶液（１００℃，１５分間の加熱処理済）を１０μｇ／ｍｌになるよう加え、３７℃で３０分間振盪した。さらに、プロテイナーゼＫを加え３７℃で３０分間振盪した後、等量のＴＥ飽和フェノールを加えて遠心し、上層と下層に分離させた。
【００９９】
上層についてこの操作を２回繰り返した後、同量のクロロホルム（４％イソアミルアルコール含有）を加え、同様の抽出操作を繰り返した。その後、上層に２倍量のエタノールを加え、ガラス棒でＤＮＡを巻きとり回収し、Ｊ１株ゲノムＤＮＡ溶液を得た。このゲノムＤＮＡは、配列番号１に示すＲｒｈＪ１Ｉ遺伝子、および配列番号２に示すＲｒｈＪ１ＩＩ遺伝子を有している。
【０１００】
（３）ＲｒｈＪ１Ｉ遺伝子欠失用プラスミドの構築
ＲｒｈＪ１Ｉ遺伝子の上流域と下流域を含んだ配列を取得するため、以下に示す反応液組成およびプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【０１０１】
反応液組成：
鋳型ＤＮＡ（Ｊ１株ゲノムＤＮＡ） １μｌ
プライマーＪ０５（配列番号７） １μｌ
プライマーＪ０６（配列番号８） １μｌ
滅菌水 ２２μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（タカラバイオ社製） ２５μｌ
総量 ５０μｌ
【０１０２】
温度サイクル：
９８℃：１０秒、５５℃：５秒および７２℃：１０秒の反応を３０サイクル
【０１０３】
プライマー：
Ｊ０５：ｃｔｃａａｇｇｃａａａｇｇｔｃｔｃｔｃａｃｃ（配列番号７）
Ｊ０６：ａｃｔｇｃａｃａｃｃｃａａｔｇｃｃｇｃｇｔｔｃｃｔｇｇｃｔｇ（配列番号８）
【０１０４】
同様にプライマーＪ０７（配列番号９）、Ｊ０８（配列番号１０）を使用し、上記と同じ条件でＰＣＲを実施した。
Ｊ０７：ｃｇｃｇｇｃａｔｔｇｇｇｔｇｔｇｃａｇｔｇｇｔｇａｇｇｇａａ（配列番号９）
Ｊ０８：ｇａａｃｇｃｃｇｔａｇｔｃｃｇａｔｇｃｇ（配列番号１０）
【０１０５】
ＰＣＲ終了後、反応液２μｌを０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、約２ｋｂｐのＰＣＲ産物の検出を行った。ＰＣＲ産物を確認した後、反応液をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ｂａｎｄ ａｎｄ ＧｅｌＢａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）で精製した。
【０１０６】
次に上記で増幅した２つのＰＣＲ断片を連結するため、以下の条件でＡｓｓｅｍｂｌｙ ＰＣＲを行った。
【０１０７】
反応液組成：
鋳型ＤＮＡ１（Ｊ０５とＪ０６の増幅産物） ０．５μｌ
鋳型ＤＮＡ２（Ｊ０７とＪ０８の増幅産物） ０．５μｌ
プライマーＪ０５（配列番号７） １ μｌ
プライマーＪ０８（配列番号１０） １ μｌ
滅菌水 ２２ μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（タカラバイオ社製） ２５ μｌ
総量 ５０ μｌ
【０１０８】
温度サイクル：
９８℃：１０秒、５５℃：５秒および７２℃：２０秒の反応を３０サイクル
【０１０９】
ＰＣＲ終了後、約４ｋｂｐの増幅産物を０．７％アガロース電気泳動で確認し、Ｍｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｂｌｕｎｔ Ｅｎｄ）（タカラバイオ社製）を使用してｐＵＣ１１８に連結した。このようにして得たプラスミドをｐＵＣ１１８／ΔＲと命名した。
【０１１０】
続いて、上記プラスミドｐＵＣ１１８／ΔＲおよびプラスミドベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１を制限酵素ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。
【０１１１】
反応液組成１：
プラスミドｐＵＣ１１８／ΔＲ ２０μｌ
ＸｂａＩ（タカラバイオ社製） １μｌ
ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製） １μｌ
１０×Ｍ Ｂｕｆｆｅｒ（酵素に添付） ５μｌ
１０×ＢＳＡ（酵素に添付） ５μｌ
滅菌水 １８μｌ
総量 ５０μｌ
【０１１２】
反応液組成２：
プラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１ ５μｌ
ＸｂａＩ（タカラバイオ社製） ０．５μｌ
ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製） ０．５μｌ
１０×Ｍ Ｂｕｆｆｅｒ（酵素に添付） ２μｌ
１０×ＢＳＡ（酵素に添付） ２μｌ
滅菌水 １０μｌ
総量 ２０μｌ
【０１１３】
反応：
３７℃，２．５時間
【０１１４】
反応終了後、プラスミドｐＵＣ１１８／ΔＲについては反応液の全量を０．７％アガロースゲル電気泳動に供して約４ｋｂの断片を切り出し、ＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ｂａｎｄ ａｎｄ ＧｅｌＢａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）で回収してΔＲ／ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩとした。
【０１１５】
プラスミドベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１については、反応液に２μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、５０μｌの９９．５％エタノールを加えてよく混和し、−２０℃で１時間冷却した。冷却後の溶液を１５，０００ｒｐｍ，４℃，１０分遠心して上清を除去し、減圧乾燥にて溶媒を除去した。その後、乾燥させたペレットに５０μｌの滅菌水を加えて再度溶解させ、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１／ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩのベクター溶液を得た。
次に回収したΔＲ断片とベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１／ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩを連結した。
【０１１６】
反応液組成：
Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｇｈｔｙ ｍｉｘ（タカラバイオ社製） ５μｌ
ΔＲ／ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ４μｌ
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１／ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ １μｌ
総量 １０μｌ
【０１１７】
反応：
１６℃，１時間
【０１１８】
反応終了後、（１）と同様にして大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ＲｒｈＪ１Ｉ遺伝子欠失プラスミドを得た。本プラスミドをｐＫ１９ΔＲと名付けた。
【０１１９】
（４）ＲｒｈＪ１ＩＩ遺伝子欠失用プラスミドの構築
ＲｒｈＪ１ＩＩ遺伝子の上流域と下流域を含んだ配列を取得するため、以下に示す反応液組成およびプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【０１２０】
反応液組成：
鋳型ＤＮＡ（Ｊ１株ゲノムＤＮＡ） １μｌ
プライマーＪＭ５６（配列番号１１） １μｌ
プライマーＪＭ５７（配列番号１２） １μｌ
滅菌水 ２２μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（タカラバイオ社製） ２５μｌ
総量 ５０μｌ
【０１２１】
温度サイクル：
９８℃：１０秒、５５℃：５秒および７２℃：１０秒の反応を３０サイクル
【０１２２】
プライマー：
ＪＭ５６：ＧＧｔｃｔａｇａＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＧＧＣＴＡＣＴＣＣＧ（配列番号１１）
ＪＭ５７：ＧＣａｃｔａｇｔＧＣＣＧＡＡＣＴＣＧＴＡＣＴＣＧＡＴＣＧ（配列番号１２）
【０１２３】
同様にプライマーＪＭ５８（配列番号１３）、ＪＭ５９（配列番号１４）を使用し、上記と同じ条件でＰＣＲを実施した。
ＪＭ５８：ＧＣａｃｔａｇｔＴＣＧＡＣＧＴＣＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＣＣ（配列番号１３）
ＪＭ５９：ＧＣａａｇｃｔｔＧＣＴＴＣＧＧＡＣＴＧＡＣＧＴＣＣＧＡＣ（配列番号１４）
【０１２４】
ＰＣＲ終了後、反応液２μｌを０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、約２ｋｂｐのＰＣＲ産物の検出を行った。ＰＣＲ産物を確認した後、反応液をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ｂａｎｄ ａｎｄ ＧｅｌＢａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）で精製した。
【０１２５】
次に上記で増幅した２つのＰＣＲ断片を連結するため、以下の条件でＡｓｓｅｍｂｌｙ ＰＣＲを行った。
【０１２６】
反応液組成：
鋳型ＤＮＡ１（ＪＭ５６とＪＭ５７の増幅産物） ０．５μｌ
鋳型ＤＮＡ２（ＪＭ５８とＪＭ５９の増幅産物） ０．５μｌ
プライマーＪＭ５６（配列番号１１） １ μｌ
プライマーＪＭ５９（配列番号１４） １ μｌ
滅菌水 ２２ μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（タカラバイオ社製） ２５ μｌ
総量 ５０ μｌ
【０１２７】
温度サイクル：
９８℃：１０秒、５５℃：５秒および７２℃：２０秒の反応を３０サイクル
【０１２８】
ＰＣＲ終了後、約４ｋｂｐの増幅産物をアガロース電気泳動で確認し、（３）と同様の手順でＲｒｈＪ１Ｉ遺伝子欠失プラスミドを得た。本プラスミドをｐＫ１９ΔＲｒｈＪ１ＩＩと名付けた。
【０１２９】
［実施例２］
薬剤耐性を有するＪ１株の作製
接合伝達に使用するドナーは、遺伝子欠失株のセレクションに薬剤耐性が必要である。そこで、種々の薬剤耐性株の取得を試み、クロラムフェニコール耐性を有するＪ１株の変異株を下記の方法で取得した。
【０１３０】
２ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含んだＭＹＫプレート（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％マルツエキス、０．２％ＫＨ2ＰＯ4，０．２％Ｋ2ＨＰＯ4，２％寒天）にＪ１株をストリークし、コロニーが生育するまで３０℃で保温した。約２週間後、生育してきたクロラムフェニコール耐性株を、再度２ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールプレートにストリークして、３０℃で保温した。
【０１３１】
次に、２ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールプレートから生育したコロニーを、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールプレートにストリークし、耐性株が出現するまで３０℃で保温した。以下、同様の操作をクロラムフェニコール濃度１０ｍｇ／ｌに高めて繰り返し、１０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコール濃度で生育するクロラムフェニコール耐性株（Ｊ１−Ｃｍ株）を得た。
【０１３２】
［実施例３］
接合伝達によるＲｒｈＪ１Ｉ遺伝子の欠失
（１）ドナーの調製
乾熱滅菌した試験管に大腸菌Ｓ１７−１λｐｉｒのコンピテントセル２０μｌにプラスミドｐＫ１９ΔＲ １μｌを加え、氷上で３０分静置した。４２℃で３０秒ヒートショック後、ＳＯＣ培地を１８０μｌ添加し、３７℃で1時間振とう培養を行った。その後、ＬＢ Ｋｍプレートに塗布し、３７℃で一晩静置した。
【０１３３】
翌日、プレートに生育したコロニーをＬＢ培地１ｍｌで回収し、遠心分離により菌体を回収し、遠心上清を除去した。同様の操作をもう一度繰り返し、最後に０．５ｍｌのＬＢ培地を添加し、菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液をドナー溶液とした。
【０１３４】
（２）レシピエントの調製
Ｊ１−Ｃｍ株をＭＹＫプレートにストリークし、３０℃で２日生育させた。生育したコロニーを実施例３（１）と同様の方法で回収、洗浄し、レシピエントとなる菌体懸濁液を調製した。
【０１３５】
（３）接合伝達
実施例３（１）で調製したドナー溶液と、（２）で調製したレシピエント溶液を１００μｌずつ混合し、抗生物質を含まないＭＹＫプレートに塗布し、３０℃で一晩静置した。
【０１３６】
翌日、生育したコロニーを１ｍｌのＬＢ培地で回収し、１００μｌを、カナマイシン１０ｍｇ／ｌ，クロラムフェニコール１０ｍｇ／ｌを含むＭＹＫプレートに塗布した。塗布したプレートを組換菌コロニーが出現するまで３０℃で１週間保温した。
【０１３７】
１週間後、プレート上に２個のコロニーが出現した。得られたコロニーの１つを＃ＲｒｈＪ１Ｉ−１と命名し、以後の実験に使用した。
【０１３８】
（４）ＲｒｈＪ１Ｉ遺伝子の欠失
接合伝達により得られた組換菌＃Ｒ１は、ゲノム上のＲｒｈＪ１Ｉ遺伝子の領域に相同組換えによりプラスミドが挿入されているが、ＲｒｈＪ１Ｉ遺伝子を欠失するには２段階の相同組換えが必要である。そこで次に、ｓａｃＢ遺伝子を利用した選抜を実施した。
【０１３９】
１０％ショ糖を含んだＭＹＫプレートを作製し、＃ＲｒｈＪ１Ｉ−１のコロニーを滅菌水に懸濁した液を適度に希釈して塗布し、３０℃で静置した。生育したコロニーについて１０個のコロニーからゲノムＤＮＡを調製し、ＰＣＲ断片のサイズを電気泳動で調べた。
【０１４０】
反応液組成：
鋳型ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ） ０．５μｌ
プライマーＪ０５（配列番号７） ０．２μｌ
プライマーＪ０８（配列番号１０） ０．２μｌ
滅菌水 ４．１μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（タカラバイオ社製） ５ μｌ
総量 １０ μｌ
【０１４１】
温度サイクル：
９８℃：１０秒、５５℃：５秒および７２℃：２０秒の反応を３０サイクル
【０１４２】
その結果、１０個の内、４個のコロニーはＲｒｈＪ１Ｉ遺伝子が欠失していることが確認された。得られたＲｒｈＪ１Ｉ遺伝子欠失株をΔＲｒｈＪ１Ｉ−１〜４と命名した。
【０１４３】
［実施例４］
形質転換効率の評価
（１）ΔＲｒｈＪ１Ｉ−１株およびＪ１株の培養・コンピテントセルの作製
ＭＹＫＧ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％マルツエキス、０．２％ＫＨ2ＰＯ4，０．２％Ｋ2ＨＰＯ4，１％グルコース）をΦ２４ｍｍ×１６５ｍｍ試験管に１０ｍｌずつ分注し、各試験管にΔＲｒｈＪ１Ｉ−１株および対照とするＪ１株のコロニーをそれぞれ植菌した。３０℃，３５０ｒｐｍで１日培養した後、得られた培養液各３ｍｌをＭＹＫＧ−２０％Ｓｕｃｒｏｓｅ培地（５００ｍｌ三角フラスコ中の１００ｍｌ）に植菌し、３０℃、２３０ｒｐｍで２０時間培養した。得られた培養液を全量５０ｍｌ容のチューブに移し、遠心分離（５０００ｒｐｍ，１０分間、４℃）により各菌体を回収した。回収した各菌体を１０ｍｌのＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（２ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4，１０％スクロース、ｐＨ８．３；以降ＥＢと省略することがある）で２回洗浄した後、菌濃度が同一となるように、それぞれＥＢに懸濁し、−８０℃で凍結してコンピテントセルとした。
【０１４４】
（２）プラスミドｐＫ４の調製
形質転換効率を評価するために使用するプラスミドｐＫ４（図３）を下記の方法で調製した。大腸菌ＳＣＳ１１０株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）およびＪＭ１０９株のコンピテントセルは実施例１（１）に記載の方法で調製した。
【０１４５】
次に、コンピテントセル各１００μｌに対してプラスミドｐＫ４を各２μｌ加え、実施例１（１）に記載の方法で形質転換した。形質転換後の各培養液をＬＢ Ｋｍ寒天培地（カナマイシン５０ｍｇ／ｌ，寒天２％を含有するＬＢ培地）に塗布し、３７℃で一晩培養した。寒天培地上に出現した各形質転換体のコロニーを２ｍｌ ＬＢ Ｋｍ液体培地に植菌し、３７℃，１８０ｒｐｍにて一晩振盪培養した。培養後の各培養液全量からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを回収し、それぞれを形質転換効率評価用プラスミドとした。
【０１４６】
（３）ΔＲｒｈＪ１Ｉ−１株への形質転換
実施例４（１）にて調製したコンピテントセル１０μｌに対してプラスミドｐＫ４を２μｌ加え、氷上で２０分間放置した。続いて、当該コンピテントセルの全量をギャップ１ｍｍのエレクトロポレーション用キュベットに移し、印加条件１．５ｋＶ，４００Ω，２５μＦにてエレクトロポレーションした。その後、氷上で１０分間放置し、続いて３７℃で１０分間放置した。キュベットにＭＹＫ液体培地０．５ｍｌを加えてよく混和し、懸濁液を全量Φ１０×１０５ｍｍワッセルマン試験管に移して３０℃，１８０ｒｐｍで一晩振盪し、復帰培養を行った。復帰培養後の培養液全量をＭＹＫ寒天培地（１０ｍｇ／ｌカナマイシン含有）に塗布し、３０℃で３日間培養した。寒天培地上に出現したコロニー数を数えて算出した形質転換効率を表１に示す。
【０１４７】
形質転換効率は以下の式で算出した。
形質転換効率＝出現コロニー数÷[添加ＤＮＡ（プラスミド）量［μｇ］]
【０１４８】
【表１】
【０１４９】
表１に示されるように、ヌクレアーゼを欠失させたΔＲｒｈＪ１Ｉ−１株は野生型（Ｊ１）に比較して、有意に高い形質転換効率を示した。
【０１５０】
［実施例５］
接合伝達によるＲｒｈＪ１ＩＩ遺伝子の欠失
［実施例１］（４）で調製したＲｒｈＪ１ＩＩ欠失用プラスミドｐＫ１９ΔＲｒｈＪ１ＩＩを使用し、［実施例３]（１）〜（４）と同様の手順で接合伝達・ＲｒｈＪ１ＩＩ遺伝子欠失を行った。
最終的に１４個のコロニーからＲｒｈＪ１ＩＩ遺伝子欠失株が４個得られた。得られたＲｒｈＪ１ＩＩ遺伝子欠失株をΔＲｒｈＪ１ＩＩ−１〜４と命名した。
【０１５１】
［実施例６］
接合伝達による、ΔＲｒｈＪ１Ｉ株からのＲｒｈＪ１ＩＩ遺伝子の欠失
［実施例１］（４）で調製したＲｒｈＪ１ＩＩ欠失用プラスミドｐＫ１９ΔＲｒｈＪ１ＩＩと、レシピエントとしてΔＲｒｈＪ１Ｉ−１株を使用し、［実施例３］（１）〜（４）と同様の手順で接合伝達・ＲｒｈＪ１ＩＩ遺伝子欠失を行った。
最終的に１４個のコロニーからＲｒｈＪ１ＩＩ遺伝子欠失株が３個得られた。得られたＲｒｈＪ１ＩＩ遺伝子欠失株をΔＲｒｈＪ１ＩΔＲｒｈＪ１ＩＩ−１〜３と命名した。
【０１５２】
［実施例７］
形質転換効率の評価
［実施例５］［実施例６］で作製したΔＲｒｈＪ１ＩＩ−１株，ΔＲｒｈＪ１ＩΔＲｒｈＪ１ＩＩ−１株を使用し、［実施例４］（１）〜（３）と同様の手順でこれら２株の形質転換効率を評価した。［実施例４］（３）に記載の式に従って算出した各株の形質転換効率を表２に示す。
【０１５３】
【表２】
【０１５４】
表２に示されるように、ヌクレアーゼを欠失させたΔＲｒｈＪ１ＩＩ−１，ΔＲｒｈＪ１ＩΔＲｒｈＪ１ＩＩ−１の両株は野生型に比較して高い形質転換効率を示した。
【０１５５】
［参考例１］
Ｊ１菌染色体ＤＮＡの調製
ロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株を１００ｍｌのＭＹＫＧ培地中、３０℃にて７２時間振盪培養した。
【０１５６】
培養後、集菌し、集菌された菌体をＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．１Ｍ ＥＤＴＡ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））４ｍｌに懸濁した。懸濁液にリゾチーム４０ｍｇを加えて３７℃で１〜２時間振盪した後、−２０℃で凍結した。
【０１５７】
次に、１０ｍｌのＴｒｉｓ−ＳＤＳ液（１%ＳＤＳ，０．１Ｍ ＮａＣｌ，０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を穏やかに振盪しながら加え、さらにプロテイナーゼＫ（メルク社）（１０ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌ加えて３７℃で１時間振盪した。
【０１５８】
次に、等量のＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））飽和フェノールを加え、攪拌後、遠心した。上層を採取し、２倍量のエタノールを加えた後、ガラス棒でＤＮＡを巻き取り、９０％，８０％，７０％のエタノールで順次フェノールを取り除いた。
【０１５９】
次に、ＤＮＡを３ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼＡ溶液（１００℃，１５分間の加熱処理済）を１０μｇ／ｍｌになるように加え、３７℃で３０分間振盪した。さらに、プロテイナーゼＫを加え３７℃で３０分間振盪した後、等量のＴＥ飽和フェノールを加えて遠心し、上層と下層に分離させた。
【０１６０】
上層についてこの操作を２回繰り返した後、同量のクロロホルム（４％イソアミルアルコール含有）を加え、同様の抽出操作を繰り返した。その後、上層に２倍量のエタノールを加え、ガラス棒でＤＮＡを巻き取り回収し、染色体ＤＮＡ標品を得た。
【０１６１】
［参考例２］
ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子のＰＣＲ
ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子をＰＣＲで増幅するためのプライマーを以下の方法で設計した。
【０１６２】
ロドコッカス属細菌の産生するヌクレアーゼのアミノ酸ホモロジー解析から、特に保存されている２つの領域を選んで配列番号１５および配列番号１６のデジェネレイトプライマーを設計し、参考例１で調製したＪ１菌ゲノムＤＮＡを鋳型としてデジェネレイトＰＣＲを以下の条件で実施した。その結果、約３５０ｂのバンドの増幅が確認された。
【０１６３】
反応液組成
鋳型ＤＮＡ（Ｊ１菌染色体ＤＮＡ，参考例１） １μｌ
１０×Ｅｘ Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社） １０μｌ
１５０μＭプライマーＤＧ−０１（配列番号１５） １μｌ
１５０μＭプライマーＤＧ−０２（配列番号１６） １μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ８μｌ
ＤＭＳＯ １０μｌ
滅菌水 １８μｌ
ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社） １μｌ
総量 ５０μｌ
【０１６４】
温度サイクル：
９４℃：３０秒、６５℃：３０秒および７２℃：１分の反応を３０サイクル
【０１６５】
プライマー
ＤＧ−０１：５’−ＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＣＣＩＧＣＩＡＣＩＴＣＩＧＣＩＣＧＩＡＴＧ−３’（配列番号１５）
ＤＧ−０２：５’−ＣＣＡＩＡＣＩＣＧＩＡＣＩＡＣＩＧＴＣＣＡ−３’（配列番号１６）
【０１６６】
次に、増幅された配列のダイレクトシークエンシングをＰＣＲで使用したプライマーを用いて実施した。その結果、配列番号１７に示す配列が得られ、ホモロジー検索の結果、前述のエンドヌクレアーゼとの相同性が認められた。
【０１６７】
［参考例３］
ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子のクローニング
（１）ゲノミックサザンハイブリダイゼーション
ＡｐａＬＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，Ｅｃｏ５２Ｉ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＫｐｎＩ，ＭｌｕＩ，ＮｃｏＩ，ＮｏｔＩ，ＰｖｕＩ，ＳａｃＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩそれぞれで消化したＪ１菌ゲノムＤＮＡに対し、後述の方法で調製したＲｒｈＪ１ＩＩのプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、Ｅｃｏ５２Ｉで消化した断片から、約１．２ｋｂの単一シグナルが得られた。
【０１６８】
なお、ＲｒｈＪ１ＩＩのプローブは以下のようにして調製した。
参考例２で調製したＰＣＲ産物をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ｂａｎｄ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物に対してＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）を用い、添付のマニュアルにしたがってラベリングを行い、ＲｒｈＪ１ＩＩのプローブとした。
【０１６９】
（２）コロニーハイブリダイゼーション
Ｊ１菌ゲノムＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉで分解して０．７％アガロースゲル電気泳動で分離し、ゲルからＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ｂａｎｄ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）を使用して約１．２ｋｂの断片を回収した。得られた断片は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いて連結した。反応条件は以下の通りである。
【０１７０】
反応液組成：
ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｇｈｔｙ ｍｉｘ（タカラバイオ社製） ５μｌ
Ｊ１菌ゲノムＤＮＡ／Ｅｃｏ５２Ｉ切断断片 ４μｌ
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）／Ｅｃｏ５２Ｉ切断断片 １μｌ
総量 １０μｌ
【０１７１】
反応：
１６℃，１時間
【０１７２】
上記ライゲーション産物の全量を、後述の方法で調製した大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル２００μｌに加え、０℃で３０分放置した。続いて、前述コンピテントセルに４２℃で４５秒間ヒートショックを与え、０℃で２分間冷却した。その後、ＳＯＣ培地（２０ｍＭグルコース、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＳＯ４，１ｍＭ ＭｇＣｌ２）を１ｍｌ添加し、３７℃にて１時間振盪培養した。培養後の培養液を２００μｌずつ、ＬＢ ＡＩＸプレート（１００μｇ／ｌアンピシリン、１００μＭ ＩＰＴＧ，５０μｇ／ｌ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地）に塗布し、３７℃で一晩放置した。プレート上に生育した白色の組換コロニーを新しいＬＢ ＡＩＸプレートに、プレート１枚に付き９４個、プレート１０枚分単離した。各プレートにはインサートを含まないｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）で形質転換したＪＭ１０９株を２コロニー／プレート植菌した。コロニー単離したプレートを３７℃で一晩放置した後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ+（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）膜にコロニーを写し取り、参考例３（１）で調製したＲｒｈＪ１ＩＩのプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行った。
【０１７３】
検出されたコロニーを培養して得られた培養液を集菌後、ＱＩＡｐｒｅｐ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて組換えプラスミドを回収した。キャピラリーＤＮＡシーケンサーＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて、添付のマニュアルに従って、プラスミド中にクローニングされているゲノムＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。その結果、配列番号１８に示される塩基配列が得られた。配列番号１８に示される塩基配列中に、配列番号４に示す４５０ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）を見出した。このＯＲＦ１のコードするアミノ酸配列は、アライメントしたロドコッカス属細菌由来エンドヌクレアーゼに対して８７％〜８９％の相同性を持っていることから、ＯＲＦ１はエンドヌクレアーゼをコードしていることが推定されたため、ＯＲＦ１のコードするエンドヌクレアーゼをＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼと命名した。また、本参考例３（２）で得られたＯＲＦ１を含むプラスミドをｐＢＲｒｈＪ１ＩＩと命名した。
【０１７４】
なお、大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルは以下の方法で調製した。
大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ培地１ｍｌに接種し、３７℃で５時間好気的に前培養した。
次に、前培養液０．４ｍｌをＳＯＢ培地４０ｍｌ（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＳＯ４，１ｍＭ ＭｇＣｌ２）に加え、１８℃で２０時間培養した。得られた培養物を遠心分離（３，７００×ｇ，１０分間、４℃）により集菌した後、冷ＴＦ溶液（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．０），２００ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ２，４０ｍＭ ＭｎＣｌ２）を１３ｍｌ加え、０℃で１０分間放置し、再度遠心分離（３，７００×ｇ，１０分間、４℃）して上清を除いた。得られた大腸菌菌体を冷ＴＦ溶液３．２ｍｌに懸濁し、０．２２ｍｌのジメチルスルホキシドを加え、０℃で１０分間放置した後、液体窒素を用いて凍結したものをコンピテントセルとした。
【０１７５】
［参考例４］
大腸菌組換体によるＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼの生産
（１）ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ発現プラスミドの構築
ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼを得るために、実施例１で得られたＪ１菌染色体ＤＮＡを鋳型として使用し、以下に示す反応液組成およびプライマーを用いてＰＣＲを行った。この際、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼをＨｉｓ−ｔａｇ融合タンパクとして発現させるため、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子上流にＳＤ配列とＨｉｓ−ｔａｇ配列を付加した。
【０１７６】
反応液組成
鋳型ＤＮＡ（Ｊ１菌染色体ＤＮＡ） １μｌ
２×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡） ２５μｌ
１０μＭプライマーＮ（配列番号１９） １．５μｌ
１０μＭプライマーＣ（配列番号２０） １．５μｌ
２ｍＭ ｄＮＴＰ １０μｌ
ＫＯＤ ＦＸ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡） １μｌ
総量 ５０μｌ
【０１７７】
温度サイクル：９４℃：１２０秒、９８℃：１０秒および６８℃：１分の反応を３０サイクル
【０１７８】
プライマー
Ｎ：５'−ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＡＴＧＧＣＧＴＣＧＴＣＧＧＡＴ−３'（配列番号１９）
Ｃ：５'−ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＣＣＣＣＧＣＧＣＣＧＧＴＴＴ−３'（配列番号２０）
【０１７９】
反応終了後、反応液５μｌを１％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約０．５ｋｂのＰＣＲ産物の検出を行った。ＰＣＲ産物を確認した後、反応液からＰＣＲ産物をＤＮＡ／ＲＮＡ ｅｘｔａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＶＩＯＧＥＮＥ社）で精製した。得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断した。制限酵素処理を行ったＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約０．５ｋｂ付近のバンドを回収した。回収したＰＣＲ産物をベクターｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結し、プラスミドを作製した。得られたプラスミドをｐＲＲ０１と名づけた。
【０１８０】
このプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１ｍＭ ＩＰＴＧ，５０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上でコロニーを形成させた。得られた白色のコロニーを１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩培養した後Ｍｉｎｉ Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＶＩＯＧＥＮＥ社）を使用してプラスミドを回収し、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩによる切断とシークエンス解析を行って目的のＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。
【０１８１】
（２）精製酵素の調製
（１）で作製したＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ発現ベクターを含む大腸菌組換体（ＪＭ１０９／ｐＲＲ０１）を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地１０ｍｌで３７℃，５時間培養した後、１ｍｌを１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢ液体培地１００ｍｌ×１本に植菌し、３７℃，１８時間培養した。培養液を遠心分離によって回収し、回収した菌体を破砕用緩衝液（組成 ２０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，０．５Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ イミダゾール、１０％ グリセロール、ｐＨ７．４）に懸濁した後４℃で１０分間超音波による破砕を行った。破砕液を遠心分離し、得られた上清を無細胞抽出液とした。この無細胞抽出液をＨｉｓ−ｔａｇ精製カラム（Ｈｉｓ Ｔｒａｐ ＨＰ：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。精製タンパク質はＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（０．５Ｍ ＮａＣｌ，０．５Ｍ イミダゾール、２０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１０％グリセロール、ｐＨ７．４）にて溶出し、２つのフラクションに分画してフラクション１，フラクション２とした。
【０１８２】
得られた精製サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨｉｓ−ｔａｇ特異的抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたウェスタンブロッティングに供し、目的タンパク質が精製されていることを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、フラクション１とフラクション２で約２５ｋＤａ付近にバンドが出現し、Ｈｉｓ−ｔａｇ特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、目的タンパク質であることを確認した。
【０１８３】
（３）酵素活性の測定
（２）で調製した精製酵素を用いて、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ活性を調べた。活性は片方の鎖の５'末端にビオチン標識を持ち、配列内にＴ／Ｇミスマッチを１箇所持つ二本鎖オリゴＤＮＡを種々用いてそのニッキング活性を測定した。
【０１８４】
反応液組成
１.５μＭ基質ＤＮＡ ２μｌ
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５） ２μｌ
１００ｍＭ ＭｇＣｌ2 ２μｌ
１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ ２μｌ
総量 ２０μｌ
【０１８５】
反応温度：２０℃，６０分
【０１８６】
反応終了後、反応液と等量のフェノールでＤＮＡを抽出し、ホルムアミド（終濃度１Ｍ）の存在下、１００℃で２分間加熱後氷上にて急冷処理し、ＤＮＡを一本鎖に変性させた。変性後の一本鎖ＤＮＡサンプルを、８Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、Ｉｍａｇｉｎｇ ｈｉｇｈ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉ ｋｉｔ（東洋紡）を使用して化学発光による検出を行って泳動パターンを比較した結果、いくつかのオリゴヌクレオチドにおいて約２０ｍｅｒの１本鎖が生成したことから、得られた精製酵素はＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼ活性を持つことを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１８７】
本発明により、ロドコッカス属細菌の形質転換方法が提供される。本発明に係る形質転換方法により得られたロドコッカス属細菌の形質転換体は、導入したＤＮＡの効果により新たな性質を付与することが可能であるため、産業上有用な微生物触媒等の開発に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１８８】
配列番号５：プライマーＳＡＣ−０１
配列番号６：プライマーＳＡＣ−０２
配列番号７：プライマーＪ０５
配列番号８：プライマーＪ０６
配列番号９：プライマーＪ０７
配列番号１０：プライマーＪ０８
配列番号１１：プライマーＪＭ５６
配列番号１２：プライマーＪＭ５７
配列番号１３：プライマーＪＭ５８
配列番号１４：プライマーＪＭ５９
配列番号１５：プライマーＤＧ−０１
配列番号１６：プライマーＤＧ−０２
配列番号１９：プライマーＮ
配列番号２０：プライマーＣ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレアーゼ活性が欠失または不活性化されたロドコッカス属細菌、およびこれを利用した形質転換体の作製に関する。
【背景技術】
【０００２】
ロドコッカス属細菌は、その物理的強度が強く、また、酵素等を細胞内に多量に蓄積する能力を有すること等から、産業的に有用な微生物触媒として知られており、ニトリル類の酵素的水和または加水分解によるアミドまたは酸の生産等に利用されている（特許文献１および２）。例えば、ロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１株（Ｊ１菌）は、アクリルアミドの工業的生産に使用されている。これまでに、これらの微生物触媒の有する酵素活性を、遺伝子組換えの方法により改良する試みがなされている（特許文献３〜５）。さらに、ロドコッカス属細菌の遺伝子操作を効率的に進めるために、宿主−ベクター系の開発が進められており、新規なプラスミドの探索（特許文献６〜８および１６）やベクターの開発（特許文献９〜１１および非特許文献１）なども行われている。
【０００３】
ロドコッカス属細菌の形質転換方法としては電気パルス法（特許文献１２〜１４）やプロトプラスト法（非特許文献２および３）が用いられ、これまでに、ロドコッカス ロドクロウス ＡＴＣＣ１２６７４をはじめとして、多くの形質転換体が得られている。本発明者らは、形質転換対象となるロドコッカス属細菌とは異なるロドコッカス属細菌またはその類縁菌から調製したプラスミドを用いることにより、形質転換対象へのプラスミドの形質転換効率が向上することを見出している（特許文献１５）。
【０００４】
また本発明者らはＪ１菌にＧＣＣＧＧＣを認識配列とするＩＩ型制限酵素（ＲｒｈＪ１Ｉ）を見出し、当該制限酵素に対応する修飾酵素を使用したプラスミドの修飾により、形質転換効率が向上することを見出している（特許文献１７）。しかしながら、上記手法によるロドコッカス属細菌の形質転換は煩雑であり、迅速な形質転換は困難であった。
【０００５】
以上のように、ロドコッカス属細菌において、より簡便にかつ高い効率で形質転換を達成できる形質転換方法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平２−４７０号公報
【特許文献２】特開平３−２５１１９２号公報
【特許文献３】特開平４−２１１３７９号公報
【特許文献４】特開平６−２５２９６号公報
【特許文献５】特開平６−３０３９７１号公報
【特許文献６】特開平４−１４８６８５号公報
【特許文献７】特開平４−３３０２８７号公報
【特許文献８】特開平７−２５５４８４号公報
【特許文献９】特開平５−６４５８９号公報
【特許文献１０】特開平８−５６６６９号公報
【特許文献１１】米国特許４９２００５４号公報
【特許文献１２】特開平１０−２４８５７８号公報
【特許文献１３】特開平９−２８３８０号公報
【特許文献１４】特開平５−６８５６６号公報
【特許文献１５】特開２００５−０９５０４１号公報
【特許文献１６】特開２００６−０５０９６７号公報
【特許文献１７】特開２００７−２２８９３４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７０，６３８−６４５（１９８８）
【非特許文献２】Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９８；３８（２）：１０１−６．
【非特許文献３】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８８ Ｆｅｂ；１７０（２）：６３８−４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ロドコッカス属細菌の遺伝子操作を効率的に進めるために、形質転換効率の向上したロドコッカス属細菌を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、菌体内のヌクレアーゼ活性を欠失または不活性化することにより、高効率にロドコッカス属細菌を形質転換できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、ヌクレアーゼ遺伝子が欠失または不活性化されたロドコッカス属細菌に関する。
【００１０】
本発明において、用いられるロドコッカス属細菌は特に限定されないが、例えば、ロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）等を挙げることができる。
【００１１】
本発明において、欠失または不活性化させるヌクレアーゼ遺伝子は、制限酵素遺伝子であることが好ましい。
【００１２】
１つの実施態様において、前記ヌクレアーゼ遺伝子は、配列番号１に示される塩基配列を有するＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素もしくはそのオーソログ、および／または配列番号３に示される塩基配列を有するＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼもしくはそのオーソログである。
【００１３】
前記ヌクレアーゼ遺伝子は、以下の（ａ）〜（ｃ）に示される塩基配列を有するＤＮＡからなる。
（ａ）配列番号１または３記載の塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号１または３記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列と相同性が８０％以上の塩基配列からなり、かつヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１４】
１つの実施態様において、前記ロドコッカス属細菌は、ロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１株またはその変異株である。
【００１５】
また本発明は、ヌクレアーゼ遺伝子が欠失または不活性化されたロドコッカス属細菌を作製し、該ロドコッカス属細菌を形質転換することを特徴とする、ロドコッカス属細菌の形質転換体とその製造方法も提供する。
【００１６】
さらに本発明は、ヌクレアーゼ遺伝子を欠失または不活性化させることを特徴とする、形質転換効率の向上したロドコッカス属細菌の製造方法、ならびに、ヌクレアーゼ遺伝子を欠失または不活性化させることを特徴とする、ロドコッカス属細菌の形質転換効率を向上させる方法も提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、ヌクレアーゼ活性が不活性化したロドコッカス属細菌、およびその形質転換体が提供される。本発明により提供されるロドコッカス属細菌の形質転換効率は、従来のロドコッカス属細菌よりも大幅に向上したものであり、これにより簡便かつ高効率にロドコッカス属細菌の遺伝子操作を行うことができる。本発明により、導入したＤＮＡの効果によりロドコッカス属細菌に新たな性質を付与し、産業上有用な微生物触媒等の開発が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ロドコッカス属細菌のゲノム上から所定の領域を欠失させる方法の一例（接合伝達による遺伝子破壊法）を説明するための模式図である。
【図２】プラスミドｐＫ１９ｍｏｂＳａｃＢ１の構造を示す模式図である。
【図３】プラスミドｐＫ４の構造を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明するが、本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定させるものではない。
【００２０】
１．ヌクレアーゼ遺伝子が欠失または不活性化されたロドコッカス属細菌
本発明に係るヌクレアーゼ遺伝子が欠失または不活性化されたロドコッカス属細菌（以下、「本発明のロドコッカス属細菌」ということがある）は、前述した通りヌクレアーゼ活性を有するロドコッカス属細菌において、ヌクレアーゼ遺伝子が欠失または不活性化したロドコッカス属細菌である。
【００２１】
１．１．ロドコッカス属細菌
本発明で用いられるロドコッカス属細菌は、ヌクレアーゼ活性を有するロドコッカス属細菌（対象微生物）であって、ヌクレアーゼを産生し、その活性を示す限り、特に限定はされない。例えば、ロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）およびロドコッカス エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス ピリジノボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｉｄｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、ロドコッカス オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）、ロドコッカス ジョスティ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊｏｓｔｉｉ）、ロドコッカス エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）等が好ましく挙げられる。特に好ましくはロドコッカス ロドクロウスである。
【００２２】
ロドコッカス ロドクロウスとしては、例えば、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ９９９株、ＡＴＣＣ１２６７４株、ＡＴＣＣ１７８９５株、ＡＴＣＣ１５９９８株、ＡＴＣＣ３３２７５株、ＡＴＣＣ１８４、ＡＴＣＣ４００１株、ＡＴＣＣ４２７３株、ＡＴＣＣ４２７６株、ＡＴＣＣ９３５６株、ＡＴＣＣ１２４８３株、ＡＴＣＣ１４３４１株、ＡＴＣＣ１４３４７株、ＡＴＣＣ１４３５０株、ＡＴＣＣ１５９０５株、ＡＴＣＣ１５９９８株、ＡＴＣＣ１７０４１株、ＡＴＣＣ１９１４９株、ＡＴＣＣ１９１５０株、ＡＴＣＣ２１１９７株、ＡＴＣＣ２１２４３株、ＡＴＣＣ２９６７０株、ＡＴＣＣ２９６７２株、ＡＴＣＣ２９６７５株、ＡＴＣＣ３３２５８株、ＡＴＣＣ１３８０８株、ＡＴＣＣ１７０４３株、ＡＴＣＣ１９０６７株、ＡＴＣＣ２１９９９株、ＡＴＣＣ２１２９１株、ＡＴＣＣ２１７８５株、ＡＴＣＣ２１９２４株、 ＩＦＯ１４８９４株、ＩＦＯ３３３８株、ＮＣＩＭＢ１１２１５株、ＮＣＩＭＢ１１２１６株、ＪＣＭ３２０２株のほか、ロドコッカス ロドクロウスＮＣＩＭＢ４１１６４（国際公開第０５／０５４４５６号）、ロドコッカス ロドクロウスＪ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）、ロドコッカス ロドクロウスＭ８（ＳＵ１７３１８１４）、ロドコッカス ロドクロウスＭ３３（ＶＫＭ Ａｃ−１５１５Ｄ）等が好ましく挙げられ、特に好ましくはロドコッカス ロドクロウスＪ１である。
【００２３】
ロドコッカス エリスロポリスとしては、例えばロドコッカス エリスロポリスＰＲ４，ロドコッカス エリスロポリスＳＫ１２１等が好ましく挙げられる。
ロドコッカス オパカスとしては、例えばロドコッカス オパカスＢ４が好ましく挙げられる。
ロドコッカス ジョスティとしては、例えばロドコッカス ジョスティＲＨＡ１が好ましく挙げられる。
ロドコッカス エクイとしては、例えばロドコッカス エクイＡＴＣＣ３３７３７が好ましく挙げられる。
【００２４】
１．２．ヌクレアーゼ遺伝子
本発明において欠失または不活性化するヌクレアーゼ遺伝子としては、特に限定されないが、形質転換の対象となるロドコッカス属細菌が有するヌクレアーゼ遺伝子のオーソログ、またはそのヌクレアーゼの認識するＤＮＡ配列と同じＤＮＡ配列を認識するヌクレアーゼの遺伝子が好ましい。
【００２５】
欠失または不活性化するヌクアーゼの一例として、ＲｒｈＪ１ＩおよびＲｒｈＪ１ＩＩを挙げることができる。なお、ＲｒｈＪ１ＩとＲｒｈＪ１ＩＩは、いずれも制限酵素活性を有するヌクレアーゼであるが、本明細書中では、両者の混同を避けるために、前者を「ＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素」および後者を「ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ」と記載することとする。
【００２６】
「ＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素」（「Ｊ１菌制限酵素」ともいう）は、ロドコッカス ロドクロウスＪ−１株から単離された制限酵素であり、ＧＣＣＧＧＣの６塩基配列を認識し、ＤＮＡを切断する活性（「ＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素活性」ともいう）を有するヌクレアーゼである（特開２００７−２５９８５３号参照）。ＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、その遺伝子は配列番号１に示される塩基配列を含む（配列番号１：ＯＲＦ（ｃＤＮＡ配列）、配列番号２１：ゲノム配列）。
【００２７】
「ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ」（「Ｊ１菌ヌクレアーゼ」ともいう）は、ロドコッカス ロドクロウスＪ−１株から単離されたヌクレアーゼであり、ｐＢＲ３２２のｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒをｏｐｅｎ ｃｉｒｃｕｌａｒにするｎｉｃｋｉｎｇ活性（「ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ活性」ともいう）を有するヌクレアーゼである。ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、その遺伝子は配列番号３に示される塩基配列を含む（配列番号３：ＯＲＦ（ｃＤＮＡ配列）、配列番号１８：ゲノム配列）。
【００２８】
Ｊ１菌以外のロドコッカス属細菌については、上記Ｊ１菌のＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素およびＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼに対応するオーソログを欠失または不活性化させることができる。
【００２９】
ここで、「オーソログ」とは、異なる生物に存在する相同な機能を有するタンパクをコードする類縁遺伝子であって、ＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素遺伝子の場合であれば、そのオーソログとはＪ１菌以外の生物においてＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素活性を有するタンパクをコードする遺伝子であり、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子の場合であれば、そのオーソログは、Ｊ１菌以外の生物においてＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ活性を有するタンパクをコードする類縁遺伝子である。
【００３０】
上記したＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素遺伝子およびＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼのオーソログは、ＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素遺伝子およびＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子と高い配列相同性を有する。それゆえ、上記配列番号１および配列番号３の塩基配列を有する遺伝子に加えて、これらの配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、さらに特に好ましくは約９５％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列を有するＤＮＡも本発明のヌクレアーゼ遺伝子に含まれる。
【００３１】
また、配列番号１および配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、これがそれぞれＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素やＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼのようなヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、本発明のヌクレアーゼ遺伝子に含まれる。
【００３２】
なお、ストリンジェントな条件としては、例えばＤＮＡを固定したナイロン膜を、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコールを含む溶液中で６５℃にて２０時間プローブとともに保温してハイブリダイゼーションを行う条件を挙げることができるが、これに限定されるわけではない。当業者であれば、このような緩衝液の塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、ハイブリダイゼーションの条件を設定することができる。
【００３３】
１．３．ヌクレアーゼ遺伝子が欠失または不活性化されたロドコッカス属細菌
本発明に係るロドコッカス属細菌は、上述したようなヌクレアーゼ遺伝子のうち１つが欠失または不活性化されたものであっても良いし、複数のヌクレアーゼ遺伝子が欠失または不活性化されたものであってもよい。
【００３４】
なお、「欠失」とは、ヌクレアーゼ遺伝子の一部または全部が欠失し、その結果として当該遺伝子がコードするタンパクのヌクレアーゼ活性の一部または全部が失われることを意味する。また、「不活性化」とは、ヌクレアーゼ遺伝子の欠失以外の理由（例えば、後述する調節領域の修飾など）により、当該遺伝子がコードするタンパクのヌクレアーゼ活性の一部または全部が失われることを意味する。
【００３５】
ここで、「ヌクレアーゼ活性」とは、ＤＮＡを切断する活性を意味する。切断するＤＮＡは二本鎖ＤＮＡでも一本鎖ＤＮＡでも良く、また切断する場所は内部でも末端から順次切断するものも含まれる。さらに、本発明のヌクレアーゼ活性には、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖を切断するｎｉｃｋｉｎｇ活性を含む。
【００３６】
本発明のロドコッカス属細菌のヌクレアーゼ活性の測定方法としては、例えば、該ヌクレアーゼをＤＮＡと接触させ、接触後のＤＮＡの分子量またはＤＮＡ断片数を測定することにより評価することができる。当業者であれば、基質ＤＮＡ，接触時の酵素量、温度、溶液組成または接触時間などの条件を設定することができる。ＤＮＡの分子量は、例えばアガロースゲル電気泳動によって測定することができる。接触前のＤＮＡの分子量と接触後のＤＮＡの分子量、または接触前のＤＮＡの断片数と接触後のＤＮＡの断片数を比較することで、ヌクレアーゼ活性を評価することができる。
【００３７】
ＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素活性は、ＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素をＤＮＡと接触させ、接触後のＤＮＡの分子量またはＤＮＡ断片数を測定することにより評価することができる。また、ＧＣＣＧＧＣを認識する既知の制限酵素を対照として使用してもよい。
【００３８】
またＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ活性は、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼをＤＮＡと接触させ、接触後のＤＮＡの分子量またはＤＮＡ断片数を測定することにより評価することができる。
【００３９】
２．ヌクレアーゼ遺伝子が欠失または不活性化されたロドコッカス属細菌の製造
２．１．ヌクレアーゼ遺伝子の欠失または不活性化
本発明のロドコッカス属細菌は、本来有するヌクレアーゼ遺伝子が欠失または不活性化されたものである。ここで、遺伝子（標的遺伝子）の欠失または不活性化とは、当該遺伝子がコードするタンパク質のヌクレアーゼ活性の一部または全部を失わせるような、対象微生物のゲノムＤＮＡにコードされるヌクレアーゼ遺伝子の一部または全部の欠失、置換、付加；プロモーター配列の一部または全部が欠失、置換、付加；発現調節に関連する遺伝子の一部または全部が欠失、置換、付加等が挙げられる。これらの欠失、置換、付加等された領域は単独でもよいし複数を組み合わせたものでもよい。
【００４０】
例えば、上記対象ロドコッカス属細菌がロドコッカス ロドクロウスＪ１株の場合は、ヌクレアーゼ遺伝子ＲｒｈＪ１ＩおよびＲｒｈＪ１ＩＩ（ｃＤＮＡ配列は配列番号１および３，ゲノム配列は配列番号２１および１８、アミノ酸配列は配列番号２および４）を有しているため、標的遺伝子としては、これらのいずれか一方でもよいし、両方でもよく、限定はされない。
【００４１】
ヌクレアーゼ遺伝子を特異的に欠失または不活性化する手法としては、特に限定されず、従来公知の遺伝子組換技術を適用することができる。
【００４２】
上記のとおり、ヌクレアーゼ遺伝子の欠失または不活性化は、目的とするヌクレアーゼ遺伝子をゲノムから削除する、目的とするヌクレアーゼ遺伝子内に他のＤＮＡ断片を挿入する、または当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与えることにより達成される。
【００４３】
本発明に係るロドコッカス属細菌は、目的とするヌクレアーゼ遺伝子を計画的に欠失または不活性化したものであってもよいし、遺伝子にランダムに変異を与えた結果、上述したヌクレアーゼ遺伝子を欠失または不活性化したものであってもよい。
【００４４】
ヌクレアーゼ遺伝子を欠失または不活性化する方法としては、例えば、相同組換え（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を利用する方法が挙げられる。
【００４５】
具体的には、標的遺伝子の塩基配列中に薬剤耐性マーカー遺伝子等を相同組換えにより挿入し、当該遺伝子が機能発現しない状態にする、または（標的遺伝子を当該遺伝子の一部または全部を含まない配列に置換することにより）標的遺伝子自体を欠失させて、その発現そのものを阻害する方法である。
【００４６】
２．２．接合伝達による遺伝子破壊法
以下にヌクレアーゼ遺伝子を欠失または不活性化する方法の一例として、接合伝達による遺伝子破壊法について図１を参照して説明する。本方法はすなわち、ドナー微生物からヌクレアーゼ活性を有するレシピエント微生物（ロドコッカス属細菌）への接合伝達を利用した形質転換方法を用いることを含む、ヌクレアーゼ遺伝子の欠失または不活性化方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含むものである。
【００４７】
（ａ）レシピエント微生物として、前述接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性が強化されたロドコッカス属細菌を作製する工程；
（ｂ）ドナー微生物として、下記（ｉ）〜（ｖ）：
（ｉ）レシピエント微生物中のヌクレアーゼ遺伝子（標的遺伝子）とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該耐性遺伝子を欠失または不活性化させた配列、
（ｉｉ）当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、
（ｉｉｉ）当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、
（ｉｖ）レシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子、および、
（ｖ）レシピエント微生物に対する致死遺伝子
を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で作製されたドナー微生物から工程（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程；並びに
（ｄ）工程（ｃ）で作製された形質転換体を、前述致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。
【００４８】
上記欠失または不活性化方法において用いるレシピエント微生物としては、ヌクレアーゼ遺伝子を有するロドコッカス属細菌であれば限定されない。ロドコッカス属細菌等の具体例については、前述と同様のものが挙げられる。
【００４９】
一方、ドナー微生物としては、上記レシピエント微生物と接合伝達可能な微生物であれば限定はされない。例えば、大腸菌が好ましい。
【００５０】
工程（ａ）
工程（ａ）では、接合伝達に供するレシピエント微生物として、接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性を強化したロドコッカス属細菌を作製する。「薬剤への耐性を強化する」とは、レシピエント微生物が薬剤耐性を有していない場合には、薬剤耐性を付与することをいい、レシピエント微生物が薬剤耐性の乏しい場合には、当該耐性をより強くすることをいう。
【００５１】
接合伝達法を使用する場合、レシピエント微生物となるロドコッカス属細菌には薬剤耐性マーカーが必要である。よって、薬剤耐性を有していないロドコッカス属細菌、または薬剤耐性の乏しいロドコッカス属細菌をレシピエント微生物として使用する場合、薬剤選択可能な程度の十分な薬剤耐性を有する株の作製が必要となる。ここで、薬剤としては、接合伝達法を使用することを考慮し、接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤が好ましい。当該薬剤としては、クロラムフェニコール、アンピシリン、カナマイシン、トリメトプリム、ゲンタマイシン、ナルジクス酸、カルベニシン、チオストレプトン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等が好ましく、クロラムフェニコール、アンピシリンがより好ましい。
【００５２】
上述のように薬剤耐性を強化したレシピエント微生物を作製する方法としては、特に限定はされない。例えば、自然変異誘発法、紫外線照射や変異誘発剤を用いる突然変異誘発法、ＥＺ−ＴＮ５（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）のようなランダム変異導入ツール等を用いることにより、本来レシピエントが持たない薬剤耐性遺伝子を人為的に当該微生物ゲノム上に導入する方法、あらかじめ遺伝子改変用プラスミドとは別の、抗生物質耐性獲得用のプラスミドを導入する方法等が好ましい。これらの中でも自然変異誘発法がより好ましい。
【００５３】
自然変異誘発法は、所望の薬剤を含有する培地中で対象とする微生物を継代培養等することにより、もともとは当該培地中で生育不可または困難な微生物に自然変異を誘発させて、より高濃度の薬剤を含有する当該培地中でも生育し得る株を取得する方法である。どの程度まで薬剤耐性を強化するかは、使用するレシピエント微生物、ドナー微生物、選択する薬剤により異なるが、レシピエント微生物の生育が抑制されない、且つ、ドナー微生物の生育が阻害される薬剤濃度を選ぶことが好ましい。例えば、レシピエント微生物としてロドコッカス属細菌を、ドナー微生物として大腸菌を、選択用薬剤としてクロラムフェニコールを用いる場合、自然突然変異によりクロラムフェニコール１〜２００ｍｇ／ｌ，好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｌを含有する培地において生育可能なレシピエント微生物（クロラムフェニコール耐性強化株）を得ることが望ましい。
【００５４】
工程（ｂ）
工程（ｂ）では、接合伝達に供するドナー微生物として、所定の遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する。遺伝子改変用プラスミド、すなわちレシピエント微生物中のヌクレアーゼ遺伝子を改変するためのプラスミドＤＮＡとしては、前述の（ｉ）〜（ｖ）の構成（遺伝子・塩基配列）を含むものを用いる。
【００５５】
ここで、前述（ｉ）の配列は、改変の対象とするレシピエント微生物中のヌクレアーゼ遺伝子と当該遺伝子の周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該ヌクレアーゼ遺伝子を欠失または不活性化させた配列である。当該配列の作製は、レシピエント微生物のゲノムから、ヌクレアーゼ遺伝子と当該遺伝子の周辺の塩基配列とを含む塩基配列の単離（クローニング）、遺伝子ライブラリ作製やＰＣＲ等の公知技術を用いて行うことができる。
【００５６】
なお、ヌクレアーゼ遺伝子の周辺の塩基配列としては、限定はされない。例えば、当該遺伝子に加え、発現調節に関連する遺伝子の上流および下流の相同領域が両端からそれぞれ１００〜３０００ｂｐの塩基配列を含む配列であることが好ましい。より好ましくは５００〜２０００ｂｐの塩基配列を含む配列である。単離した塩基配列を用いて、前述（ｉ）を作製する方法は特に限定されず、ＰＣＲ法や制限酵素を用いた標的遺伝子部分の切除もしくは置換等の公知技術を用いて行うことができる。
【００５７】
前述（ｉｉ）の接合伝達開始領域は、使用するドナー微生物中において接合伝達の開始点となる塩基配列を含む領域であれば、限定はされない。例えば、プラスミドＰＲ４由来のｏｒｉＴが好ましい。
【００５８】
前述（ｉｉｉ）の複製開始領域は、使用するドナー微生物中において前述遺伝子改変用プラスミドの自己複製起点として機能し得る塩基配列を含む領域であれば、限定はされない。例えば、ｏｒｉＶが好ましい。
【００５９】
前述（ｉｖ）の薬剤耐性遺伝子は、前述工程（ａ）で作製した、接合伝達に供するレシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子であれば、限定はされない。例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、トリメトプリム耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、ナルジクス酸耐性遺伝子、カルベニシン耐性遺伝子、チオストレプトン耐性遺伝子等が好ましく挙げられる。
【００６０】
前述（ｖ）の致死遺伝子は、レシピエント微生物のゲノム上に導入された場合に、当該微生物を死に至らしめる作用を有し得る遺伝子であれば、限定はされない。例えば、ｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓL遺伝子、ｃｃｄＢ遺伝子等が挙げられるが、ｓａｃＢ遺伝子が好ましい。ｓａｃＢ遺伝子は、当該遺伝子を保有し発現する微生物（例えばロドコッカス属細菌）をスクロース含有培地で培養した場合に、スクロースを基質とし当該微生物に対して致死作用を有する有害物質を産生する酵素（レバンスクラーゼ）をコードする遺伝子である。
【００６１】
接合伝達に用いる前述遺伝子改変用プラスミドは、如何なるベクターをベースとして構築されたものであってもよく、限定はされない。例えば、レシピエント微生物がロドコッカス属細菌の場合は、ｐＫ１９ｍｏｂベクター（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｌ，ｖｏｌ．４５，ｐ．６９−７３（１９９４））等を用いることが好ましい。
【００６２】
前述遺伝子改変用プラスミドにおける（ｉ）〜（ｖ）の構成は、例えば、上流から順に、前述（ｉ）の配列、前述（ｉｖ）の耐性遺伝子、前述（ｖ）の致死遺伝子、前述（ｉｉ）の接合伝達開始領域、前述（ｉｉｉ）の複製開始領域の順で配されていることが好ましい。前述（ｉ）〜（ｖ）の構成を含む遺伝子改変用プラスミドの構築は、公知の遺伝子組換え技術を用いて実施することができる。
【００６３】
上述の各構成を有する遺伝子改変用プラスミドをドナー微生物内に導入して形質転換し、接合伝達に供するドナー微生物を作製する。その際、形質転換の方法としては、微生物の形質転換方法として公知の方法を用いることができる。例えば大腸菌をドナー微生物とする場合は、エレクトロポレーション法やカルシウム法等を用いることができる。
【００６４】
工程（ｃ）
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で作製されたドナー微生物から工程（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行う。通常は、ドナー微生物およびレシピエント微生物のそれぞれの細胞懸濁液を混合し、適当なプレート培地（ＬＢ培地等）上に均一に広げて、両微生物の接合を行わせる。
【００６５】
当該接合においては、ドナー微生物中の遺伝子改変用プラスミドがレシピエント微生物内に移動し、レシピエント微生物のゲノムと上記プラスミドとの相同配列で二重交叉が起こり当該ゲノム中のヌクレアーゼ遺伝子が欠失される。この接合により、レシピエント微生物の形質転換体が作製される。すなわち、当該形質転換体は、ドナー微生物中の遺伝子改変用プラスミドの一部が相同組換えによりレシピエント微生物のゲノム上に導入されたものである。
【００６６】
所望の形質転換体であるかどうかの確認は、レシピエント微生物自体の薬剤耐性、および前述遺伝子改変用プラスミド由来の薬剤耐性を利用して行うことができる。具体的には、両薬剤を含む培地（例えば、カナマイシンおよびクロラムフェニコール含有培地等）において上記接合後の微生物を培養することにより、所望の形質転換体を選択することができる。
【００６７】
工程（ｄ）
工程（ｄ）では、工程（ｃ）で作製されたレシピエント微生物の形質転換体（形質転換微生物）を、前述遺伝子改変用プラスミド由来の致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養（継代培養）する。致死遺伝子が機能し得る培養条件としては、限定はされないが、例えば致死遺伝子がｓａｃＢ遺伝子の場合は、スクロース含有培地を用いた培養が好ましく挙げられる。
【００６８】
当該培養においては、上記致死遺伝子を有する形質転換微生物は生育困難であるため、継代培養により、自然誘発的に、当該微生物のゲノム上から相同組換えにより上記致死遺伝子を含む塩基配列領域が除かれた（脱落した）形質転換微生物を得ることができる。
【００６９】
ただし、当該得られた微生物の中には、レシピエント微生物中のヌクレアーゼ遺伝子が、当初の目的通り欠失または不活性化しているものと、そうでないもの（上記脱落の際の相同組換えにより元のヌクレアーゼ遺伝子の機能が復活したもの）が含まれている。
【００７０】
よって、通常は、当該得られた微生物のゲノムＤＮＡを抽出し、例えばＰＣＲ法などによりヌクレアーゼ遺伝子が、当初の目的どおり欠失していることを確認し、所望の形質転換微生物を選択することがより好ましい。
【００７１】
３．ヌクレアーゼ遺伝子が欠失または不活性化されたロドコッカス属細菌の形質転換方法
本発明のロドコッカス属細菌に導入するためのプラスミドは、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌で複製増殖可能なＤＮＡ領域を有するプラスミドであれば良い。
【００７２】
例えば、ロドコッカス属細菌で複製増殖可能なＤＮＡ領域としては、プラスミドｐＡＮ１２，ｐＮＣ９０３，ｐＦＡＪ２６００，ｐＲＣ１０，ｐＲＣ２０，ｐＲＣ００１，ｐＲＣ００２，ｐＲＣ００３またはｐＲＣ００４等に含まれる複製増殖可能なＤＮＡ領域が挙げられる。好ましくは、プラスミドｐＲＣ００１，ｐＲＣ００２，ｐＲＣ００３またはｐＲＣ００４に含まれる複製増殖可能なＤＮＡ領域が挙げられる。プラスミドｐＲＣ００１，ｐＲＣ００２，ｐＲＣ００３またはｐＲＣ００４は、各々ロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ４２７６，ＡＴＣＣ１４３４９，ＡＴＣＣ１４３４８，ＩＦＯ３３３８株由来のプラスミドであり、特開平２−８４１９８号公報、特開平４−１４８６８５号公報、特開平５−６４５８９号公報、特開平５−６８５６６号公報に記載されている。
【００７３】
また、上記ｐＲＣ００４を含むベクターであるｐＳＪ０２３（特開平１０−３３７１８５号）およびｐＳＪ０３４も使用することができる。
【００７４】
当該プラスミドは、アルカリ−ＳＤＳ法で調製したものが使用でき、好ましくは不純物の少ない高純度なＤＮＡを使用する。ベクターを高純度に精製する方法としては、密度勾配遠心法、市販精製キットを使用することができる。密度勾配遠心法は、例えばＣｓＣｌやＣＦ3ＣＯＯＣｓを使用して、１０００００Ｇで２〜４８時間遠心した後、目的とするＤＮＡのバンドを抽出することにより、ベクターを精製することができる。
【００７５】
プラスミドの調製に使用する宿主は、特に限定されず、例えば、大腸菌（エシェリヒア・コリ）、枯草菌（バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis））、放線菌などの細菌、酵母、カビ、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。プラスミドの調製の好ましい宿主は大腸菌である。
【００７６】
形質転換に使用する宿主細菌は、上記２の方法で調製したヌクレアーゼ欠失または不活性化ロドコッカス属細菌である。宿主細菌は培養液を洗浄してそのまま使用したり、または細胞壁の構造を変化させたりすることにより、プラスミドＤＮＡの導入効率を高めることが可能である。細胞壁の構造を変化させる方法としては、培養時にグリシン、ペニシリンＧまたはイソニコチン酸ヒドラジドで処理する方法が好ましい。また、培養液の１０％から２０％のショ糖を添加して培養する方法も用いることができる。このようにして調製した宿主細菌はコンピテントセルと呼ばれる。
【００７７】
以上のように調製したプラスミドＤＮＡと宿主細菌を使用して形質転換を行う。形質転換手法は、当業者に公知の形質転換手法であれば特に限定されず、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を利用することができる。
【００７８】
例えば、電気パルス法を使用し、適量のプラスミドＤＮＡとコンピテントセルを混合してキュベットに入れ、電気パルスを印加する。電気パルスの印加条件は、電圧として１０〜２５ＫＶ／ｃｍ、好ましくは２０ＫＶ／ｃｍ、抵抗値として５０〜４００Ω、好ましくは１００−２００Ωを使用する。電気パルスを印加した後、３７℃で数分ヒートショックを行い、その後、適当な培地を適量加え、約３０℃にて数時間培養を行う。この培養を行うことにより、上述のように薬剤添加によって変化した細胞壁が正常な構造に回復すると共に、プラスミド由来の薬剤耐性遺伝子の発現が起こる。この培養時間は、１時間以上が好ましく、１２時間以上がより好ましい。
【００７９】
形質転換を確認するためのマーカー薬剤または選択培地の薬剤としては、形質転換体の取得が可能であり、かつ、宿主細菌と形質転換体を区別することができるものであれば特に制限されないが、例えばカナマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、トリメトプリム、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等が挙げられる。
【００８０】
薬剤の濃度は、形質転換体を効率よく取得するためには、選択培地に対して必要最少量とすることが好ましい。この濃度は、各種濃度の薬剤を含む寒天培地に宿主細菌をプレートし、コロニーの生育の有無を調べることによって設定することができる。例えば、プラスミドＤＮＡとしてｐＫ１、ｐＫ２、ｐＫ３、ｐＫ４、ｐＳＪ０２３、ｐＳＪ００２などを使用する場合には、カナマイシン濃度は１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜５０μｇ／ｍｌである。
【００８１】
なお、形質転換効率は、例えば、形質転換に用いたベクター量あたりの形質転換体コロニー数（ｃｆｕ）（＝ｃｆｕ／μｇ）あるいは形質転換に用いた宿主の量あたりの形質転換体量などにより算出することができる。
【００８２】
本発明のロドコッカス属細菌は形質転換効率が野生型に比較して顕著に高く、簡便かつ高効率に目的遺伝子を導入することができる。これにより、ロドコッカス属細菌に新たな性質を付与し、産業上有用な微生物触媒等を開発することが可能になる。
【実施例】
【００８３】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８４】
［実施例１］
ＲｒｈＪ１Ｉ欠失用プラスミド、ＲｒｈＪ１ＩＩ欠失用プラスミドの作製
（１）接合伝達プラスミドベクター（ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１）の作製
ｐＤＮＲ−１ｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）中のｓａｃＢ遺伝子を、ＮｓｐＶ切断サイトを付加したプライマーＳＡＣ−０１（配列番号５）およびＳＡＣ−０２（配列番号６）を使用したＰＣＲにより増幅し、約１．９ｋｂのｓａｃＢ遺伝子断片を得た。増幅条件は以下の通りである。
【００８５】
反応液組成：
滅菌水 ２２μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（タカラバイオ社製） ２５μｌ
ＳＡＣ−０１（配列番号５） １μｌ
ＳＡＣ−０２（配列番号６） １μｌ
ｐＤＮＲ−１ｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）（１００倍希釈） １μｌ
総量 ５０μｌ
【００８６】
温度サイクル：
９８℃：１０秒、５５℃：５秒および７２℃：１０秒の反応を３０サイクル
【００８７】
プライマー：
ＳＡＣ−０１：ＧＧＴＴＣＧＡＡＴＡＣＣＴＧＣＣＧＴＴＣＡＣＴＡＴＴＡＴＴＴＡＧＴＧ（配列番号５）
ＳＡＣ−０２：ＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＧＧＣＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＧ（配列番号６）
【００８８】
ＰＣＲ産物の２μｌを０．７％アガロースゲル電気泳動に供して増幅を確認した後、反応液をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ｂａｎｄ ａｎｄ ＧｅｌＢａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）で精製した。
【００８９】
精製したｓａｃＢ遺伝子断片、およびｐＫ１９ｍｏｂを制限酵素ＮｓｐＶ（タカラバイオ社製）で消化後、それぞれの切断断片をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ｂａｎｄ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製した。
ｓａｃＢのＮｓｐＶ切断断片とｐＫ１９ｍｏｂのＮｓｐＶ切断断片を、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いて連結した。反応条件は以下の通りである。
【００９０】
反応液組成：
ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｇｈｔｙ ｍｉｘ（タカラバイオ社製） ５μｌ
ｓａｃＢ／ＮｓｐＶ切断断片 ４μｌ
ｐＫ１９ｍｏｂ／ＮｓｐＶ切断断片 １μｌ
総量 １０μｌ
【００９１】
反応：
１６℃，１時間
【００９２】
上記ライゲーション産物の全量を、後述の方法で調製した大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル２００μｌに加え、０℃で３０分放置した。続いて、前述コンピテントセルに４２℃で４５秒間ヒートショックを与え、０℃で２分間冷却した。その後、ＳＯＣ培地（２０ｍＭグルコース、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＳＯ4，１ｍＭ ＭｇＣｌ2）を１ｍｌ添加し、３７℃にて１時間振盪培養した。培養後の培養液を２００μｌずつ、ＬＢ Ｋｍ寒天培地（カナマイシン５０ｍｇ／ｌ，２％寒天を含有するＬＢ培地（１％バクトトリプトン、１％ＮａＣｌ，０．５％バクトイーストエキス））に塗布し、３７℃で一晩培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニー複数個を、１．５ｍｌのＬＢ Ｋｍ培地（カナマイシン５０ｍｇ／ｌを含有するＬＢ培地）にて３７℃で一晩培養した。得られた培養液を集菌後、ＱＩＡｐｒｅｐ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて組換えプラスミドを回収した。キャピラリーＤＮＡシーケンサーＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて、添付のマニュアルに従って、プラスミド中にクローニングされているＰＣＲ増幅産物の塩基配列と方向を解析した。ＳａｃＢ遺伝子が正方向に導入されたプラスミドベクターをｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１と命名した。図２にｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１の構造を示す。
【００９３】
なお、大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルは以下の方法で調製した。
大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ培地１ｍｌに接種し、３７℃で５時間好気的に前培養した。次に、前培養液０．４ｍｌをＳＯＢ培地４０ｍｌ（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＳＯ4，１ｍＭ ＭｇＣｌ2）に加え、１８℃で２０時間培養した。得られた培養物を遠心分離（３，７００×ｇ，１０分間、４℃）により集菌した後、冷ＴＦ溶液（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．０），２００ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ2，４０ｍＭ ＭｎＣｌ2）を１３ｍｌ加え、０℃で１０分間放置し、再度遠心分離（３，７００×ｇ，１０分間、４℃）して上清を除いた。得られた大腸菌菌体を冷ＴＦ溶液３．２ｍｌに懸濁し、０．２２ｍｌのジメチルスルホキシドを加え、０℃で１０分間放置した後、液体窒素を用いて凍結したものをコンピテントセルとした。
【００９４】
（２）Ｊ１株ゲノムＤＮＡの調製
ロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１株を１００ｍｌのＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％Ｋ2ＨＰＯ4，０．２％ＫＨ2ＰＯ4，ｐＨ７．０）中、３０℃にて７２時間振盪培養した。
【００９５】
培養後、集菌し、集菌された菌体をＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．１Ｍ ＥＤＴＡ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））４ｍｌに懸濁した。懸濁液に４０ｍｇのリゾチームを加えて、３７℃で１〜２時間振盪したのち、−２０℃で凍結した。
【００９６】
次に、１０ｍｌのＴｒｉｓ−ＳＤＳ液（１％ＳＤＳ，０．１Ｍ ＮａＣｌ，０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を穏やかに振盪しながら加え、さらにプロテイナーゼＫ（メルク社）を１０μｌ（終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）加えて３７℃で１時間振盪した。
【００９７】
次に、等量のＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））飽和フェノールを加え、撹拌した後遠心した。遠心後、上層をとり２倍量のエタノールを加えた後、ガラス棒でＤＮＡを巻きとり、９０％，８０％，７０％のエタノールで順次フェノールを取り除いた。
【００９８】
次に、ＤＮＡを３ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼＡ溶液（１００℃，１５分間の加熱処理済）を１０μｇ／ｍｌになるよう加え、３７℃で３０分間振盪した。さらに、プロテイナーゼＫを加え３７℃で３０分間振盪した後、等量のＴＥ飽和フェノールを加えて遠心し、上層と下層に分離させた。
【００９９】
上層についてこの操作を２回繰り返した後、同量のクロロホルム（４％イソアミルアルコール含有）を加え、同様の抽出操作を繰り返した。その後、上層に２倍量のエタノールを加え、ガラス棒でＤＮＡを巻きとり回収し、Ｊ１株ゲノムＤＮＡ溶液を得た。このゲノムＤＮＡは、配列番号１に示すＲｒｈＪ１Ｉ遺伝子、および配列番号２に示すＲｒｈＪ１ＩＩ遺伝子を有している。
【０１００】
（３）ＲｒｈＪ１Ｉ遺伝子欠失用プラスミドの構築
ＲｒｈＪ１Ｉ遺伝子の上流域と下流域を含んだ配列を取得するため、以下に示す反応液組成およびプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【０１０１】
反応液組成：
鋳型ＤＮＡ（Ｊ１株ゲノムＤＮＡ） １μｌ
プライマーＪ０５（配列番号７） １μｌ
プライマーＪ０６（配列番号８） １μｌ
滅菌水 ２２μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（タカラバイオ社製） ２５μｌ
総量 ５０μｌ
【０１０２】
温度サイクル：
９８℃：１０秒、５５℃：５秒および７２℃：１０秒の反応を３０サイクル
【０１０３】
プライマー：
Ｊ０５：ｃｔｃａａｇｇｃａａａｇｇｔｃｔｃｔｃａｃｃ（配列番号７）
Ｊ０６：ａｃｔｇｃａｃａｃｃｃａａｔｇｃｃｇｃｇｔｔｃｃｔｇｇｃｔｇ（配列番号８）
【０１０４】
同様にプライマーＪ０７（配列番号９）、Ｊ０８（配列番号１０）を使用し、上記と同じ条件でＰＣＲを実施した。
Ｊ０７：ｃｇｃｇｇｃａｔｔｇｇｇｔｇｔｇｃａｇｔｇｇｔｇａｇｇｇａａ（配列番号９）
Ｊ０８：ｇａａｃｇｃｃｇｔａｇｔｃｃｇａｔｇｃｇ（配列番号１０）
【０１０５】
ＰＣＲ終了後、反応液２μｌを０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、約２ｋｂｐのＰＣＲ産物の検出を行った。ＰＣＲ産物を確認した後、反応液をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ｂａｎｄ ａｎｄ ＧｅｌＢａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）で精製した。
【０１０６】
次に上記で増幅した２つのＰＣＲ断片を連結するため、以下の条件でＡｓｓｅｍｂｌｙ ＰＣＲを行った。
【０１０７】
反応液組成：
鋳型ＤＮＡ１（Ｊ０５とＪ０６の増幅産物） ０．５μｌ
鋳型ＤＮＡ２（Ｊ０７とＪ０８の増幅産物） ０．５μｌ
プライマーＪ０５（配列番号７） １ μｌ
プライマーＪ０８（配列番号１０） １ μｌ
滅菌水 ２２ μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（タカラバイオ社製） ２５ μｌ
総量 ５０ μｌ
【０１０８】
温度サイクル：
９８℃：１０秒、５５℃：５秒および７２℃：２０秒の反応を３０サイクル
【０１０９】
ＰＣＲ終了後、約４ｋｂｐの増幅産物を０．７％アガロース電気泳動で確認し、Ｍｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｂｌｕｎｔ Ｅｎｄ）（タカラバイオ社製）を使用してｐＵＣ１１８に連結した。このようにして得たプラスミドをｐＵＣ１１８／ΔＲと命名した。
【０１１０】
続いて、上記プラスミドｐＵＣ１１８／ΔＲおよびプラスミドベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１を制限酵素ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。
【０１１１】
反応液組成１：
プラスミドｐＵＣ１１８／ΔＲ ２０μｌ
ＸｂａＩ（タカラバイオ社製） １μｌ
ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製） １μｌ
１０×Ｍ Ｂｕｆｆｅｒ（酵素に添付） ５μｌ
１０×ＢＳＡ（酵素に添付） ５μｌ
滅菌水 １８μｌ
総量 ５０μｌ
【０１１２】
反応液組成２：
プラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１ ５μｌ
ＸｂａＩ（タカラバイオ社製） ０．５μｌ
ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製） ０．５μｌ
１０×Ｍ Ｂｕｆｆｅｒ（酵素に添付） ２μｌ
１０×ＢＳＡ（酵素に添付） ２μｌ
滅菌水 １０μｌ
総量 ２０μｌ
【０１１３】
反応：
３７℃，２．５時間
【０１１４】
反応終了後、プラスミドｐＵＣ１１８／ΔＲについては反応液の全量を０．７％アガロースゲル電気泳動に供して約４ｋｂの断片を切り出し、ＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ｂａｎｄ ａｎｄ ＧｅｌＢａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）で回収してΔＲ／ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩとした。
【０１１５】
プラスミドベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１については、反応液に２μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、５０μｌの９９．５％エタノールを加えてよく混和し、−２０℃で１時間冷却した。冷却後の溶液を１５，０００ｒｐｍ，４℃，１０分遠心して上清を除去し、減圧乾燥にて溶媒を除去した。その後、乾燥させたペレットに５０μｌの滅菌水を加えて再度溶解させ、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１／ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩのベクター溶液を得た。
次に回収したΔＲ断片とベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１／ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩを連結した。
【０１１６】
反応液組成：
Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｇｈｔｙ ｍｉｘ（タカラバイオ社製） ５μｌ
ΔＲ／ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ４μｌ
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１／ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ １μｌ
総量 １０μｌ
【０１１７】
反応：
１６℃，１時間
【０１１８】
反応終了後、（１）と同様にして大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ＲｒｈＪ１Ｉ遺伝子欠失プラスミドを得た。本プラスミドをｐＫ１９ΔＲと名付けた。
【０１１９】
（４）ＲｒｈＪ１ＩＩ遺伝子欠失用プラスミドの構築
ＲｒｈＪ１ＩＩ遺伝子の上流域と下流域を含んだ配列を取得するため、以下に示す反応液組成およびプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【０１２０】
反応液組成：
鋳型ＤＮＡ（Ｊ１株ゲノムＤＮＡ） １μｌ
プライマーＪＭ５６（配列番号１１） １μｌ
プライマーＪＭ５７（配列番号１２） １μｌ
滅菌水 ２２μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（タカラバイオ社製） ２５μｌ
総量 ５０μｌ
【０１２１】
温度サイクル：
９８℃：１０秒、５５℃：５秒および７２℃：１０秒の反応を３０サイクル
【０１２２】
プライマー：
ＪＭ５６：ＧＧｔｃｔａｇａＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＧＧＣＴＡＣＴＣＣＧ（配列番号１１）
ＪＭ５７：ＧＣａｃｔａｇｔＧＣＣＧＡＡＣＴＣＧＴＡＣＴＣＧＡＴＣＧ（配列番号１２）
【０１２３】
同様にプライマーＪＭ５８（配列番号１３）、ＪＭ５９（配列番号１４）を使用し、上記と同じ条件でＰＣＲを実施した。
ＪＭ５８：ＧＣａｃｔａｇｔＴＣＧＡＣＧＴＣＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＣＣ（配列番号１３）
ＪＭ５９：ＧＣａａｇｃｔｔＧＣＴＴＣＧＧＡＣＴＧＡＣＧＴＣＣＧＡＣ（配列番号１４）
【０１２４】
ＰＣＲ終了後、反応液２μｌを０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、約２ｋｂｐのＰＣＲ産物の検出を行った。ＰＣＲ産物を確認した後、反応液をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ｂａｎｄ ａｎｄ ＧｅｌＢａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）で精製した。
【０１２５】
次に上記で増幅した２つのＰＣＲ断片を連結するため、以下の条件でＡｓｓｅｍｂｌｙ ＰＣＲを行った。
【０１２６】
反応液組成：
鋳型ＤＮＡ１（ＪＭ５６とＪＭ５７の増幅産物） ０．５μｌ
鋳型ＤＮＡ２（ＪＭ５８とＪＭ５９の増幅産物） ０．５μｌ
プライマーＪＭ５６（配列番号１１） １ μｌ
プライマーＪＭ５９（配列番号１４） １ μｌ
滅菌水 ２２ μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（タカラバイオ社製） ２５ μｌ
総量 ５０ μｌ
【０１２７】
温度サイクル：
９８℃：１０秒、５５℃：５秒および７２℃：２０秒の反応を３０サイクル
【０１２８】
ＰＣＲ終了後、約４ｋｂｐの増幅産物をアガロース電気泳動で確認し、（３）と同様の手順でＲｒｈＪ１Ｉ遺伝子欠失プラスミドを得た。本プラスミドをｐＫ１９ΔＲｒｈＪ１ＩＩと名付けた。
【０１２９】
［実施例２］
薬剤耐性を有するＪ１株の作製
接合伝達に使用するドナーは、遺伝子欠失株のセレクションに薬剤耐性が必要である。そこで、種々の薬剤耐性株の取得を試み、クロラムフェニコール耐性を有するＪ１株の変異株を下記の方法で取得した。
【０１３０】
２ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含んだＭＹＫプレート（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％マルツエキス、０．２％ＫＨ2ＰＯ4，０．２％Ｋ2ＨＰＯ4，２％寒天）にＪ１株をストリークし、コロニーが生育するまで３０℃で保温した。約２週間後、生育してきたクロラムフェニコール耐性株を、再度２ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールプレートにストリークして、３０℃で保温した。
【０１３１】
次に、２ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールプレートから生育したコロニーを、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールプレートにストリークし、耐性株が出現するまで３０℃で保温した。以下、同様の操作をクロラムフェニコール濃度１０ｍｇ／ｌに高めて繰り返し、１０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコール濃度で生育するクロラムフェニコール耐性株（Ｊ１−Ｃｍ株）を得た。
【０１３２】
［実施例３］
接合伝達によるＲｒｈＪ１Ｉ遺伝子の欠失
（１）ドナーの調製
乾熱滅菌した試験管に大腸菌Ｓ１７−１λｐｉｒのコンピテントセル２０μｌにプラスミドｐＫ１９ΔＲ １μｌを加え、氷上で３０分静置した。４２℃で３０秒ヒートショック後、ＳＯＣ培地を１８０μｌ添加し、３７℃で1時間振とう培養を行った。その後、ＬＢ Ｋｍプレートに塗布し、３７℃で一晩静置した。
【０１３３】
翌日、プレートに生育したコロニーをＬＢ培地１ｍｌで回収し、遠心分離により菌体を回収し、遠心上清を除去した。同様の操作をもう一度繰り返し、最後に０．５ｍｌのＬＢ培地を添加し、菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液をドナー溶液とした。
【０１３４】
（２）レシピエントの調製
Ｊ１−Ｃｍ株をＭＹＫプレートにストリークし、３０℃で２日生育させた。生育したコロニーを実施例３（１）と同様の方法で回収、洗浄し、レシピエントとなる菌体懸濁液を調製した。
【０１３５】
（３）接合伝達
実施例３（１）で調製したドナー溶液と、（２）で調製したレシピエント溶液を１００μｌずつ混合し、抗生物質を含まないＭＹＫプレートに塗布し、３０℃で一晩静置した。
【０１３６】
翌日、生育したコロニーを１ｍｌのＬＢ培地で回収し、１００μｌを、カナマイシン１０ｍｇ／ｌ，クロラムフェニコール１０ｍｇ／ｌを含むＭＹＫプレートに塗布した。塗布したプレートを組換菌コロニーが出現するまで３０℃で１週間保温した。
【０１３７】
１週間後、プレート上に２個のコロニーが出現した。得られたコロニーの１つを＃ＲｒｈＪ１Ｉ−１と命名し、以後の実験に使用した。
【０１３８】
（４）ＲｒｈＪ１Ｉ遺伝子の欠失
接合伝達により得られた組換菌＃Ｒ１は、ゲノム上のＲｒｈＪ１Ｉ遺伝子の領域に相同組換えによりプラスミドが挿入されているが、ＲｒｈＪ１Ｉ遺伝子を欠失するには２段階の相同組換えが必要である。そこで次に、ｓａｃＢ遺伝子を利用した選抜を実施した。
【０１３９】
１０％ショ糖を含んだＭＹＫプレートを作製し、＃ＲｒｈＪ１Ｉ−１のコロニーを滅菌水に懸濁した液を適度に希釈して塗布し、３０℃で静置した。生育したコロニーについて１０個のコロニーからゲノムＤＮＡを調製し、ＰＣＲ断片のサイズを電気泳動で調べた。
【０１４０】
反応液組成：
鋳型ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ） ０．５μｌ
プライマーＪ０５（配列番号７） ０．２μｌ
プライマーＪ０８（配列番号１０） ０．２μｌ
滅菌水 ４．１μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（タカラバイオ社製） ５ μｌ
総量 １０ μｌ
【０１４１】
温度サイクル：
９８℃：１０秒、５５℃：５秒および７２℃：２０秒の反応を３０サイクル
【０１４２】
その結果、１０個の内、４個のコロニーはＲｒｈＪ１Ｉ遺伝子が欠失していることが確認された。得られたＲｒｈＪ１Ｉ遺伝子欠失株をΔＲｒｈＪ１Ｉ−１〜４と命名した。
【０１４３】
［実施例４］
形質転換効率の評価
（１）ΔＲｒｈＪ１Ｉ−１株およびＪ１株の培養・コンピテントセルの作製
ＭＹＫＧ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％マルツエキス、０．２％ＫＨ2ＰＯ4，０．２％Ｋ2ＨＰＯ4，１％グルコース）をΦ２４ｍｍ×１６５ｍｍ試験管に１０ｍｌずつ分注し、各試験管にΔＲｒｈＪ１Ｉ−１株および対照とするＪ１株のコロニーをそれぞれ植菌した。３０℃，３５０ｒｐｍで１日培養した後、得られた培養液各３ｍｌをＭＹＫＧ−２０％Ｓｕｃｒｏｓｅ培地（５００ｍｌ三角フラスコ中の１００ｍｌ）に植菌し、３０℃、２３０ｒｐｍで２０時間培養した。得られた培養液を全量５０ｍｌ容のチューブに移し、遠心分離（５０００ｒｐｍ，１０分間、４℃）により各菌体を回収した。回収した各菌体を１０ｍｌのＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（２ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4，１０％スクロース、ｐＨ８．３；以降ＥＢと省略することがある）で２回洗浄した後、菌濃度が同一となるように、それぞれＥＢに懸濁し、−８０℃で凍結してコンピテントセルとした。
【０１４４】
（２）プラスミドｐＫ４の調製
形質転換効率を評価するために使用するプラスミドｐＫ４（図３）を下記の方法で調製した。大腸菌ＳＣＳ１１０株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）およびＪＭ１０９株のコンピテントセルは実施例１（１）に記載の方法で調製した。
【０１４５】
次に、コンピテントセル各１００μｌに対してプラスミドｐＫ４を各２μｌ加え、実施例１（１）に記載の方法で形質転換した。形質転換後の各培養液をＬＢ Ｋｍ寒天培地（カナマイシン５０ｍｇ／ｌ，寒天２％を含有するＬＢ培地）に塗布し、３７℃で一晩培養した。寒天培地上に出現した各形質転換体のコロニーを２ｍｌ ＬＢ Ｋｍ液体培地に植菌し、３７℃，１８０ｒｐｍにて一晩振盪培養した。培養後の各培養液全量からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを回収し、それぞれを形質転換効率評価用プラスミドとした。
【０１４６】
（３）ΔＲｒｈＪ１Ｉ−１株への形質転換
実施例４（１）にて調製したコンピテントセル１０μｌに対してプラスミドｐＫ４を２μｌ加え、氷上で２０分間放置した。続いて、当該コンピテントセルの全量をギャップ１ｍｍのエレクトロポレーション用キュベットに移し、印加条件１．５ｋＶ，４００Ω，２５μＦにてエレクトロポレーションした。その後、氷上で１０分間放置し、続いて３７℃で１０分間放置した。キュベットにＭＹＫ液体培地０．５ｍｌを加えてよく混和し、懸濁液を全量Φ１０×１０５ｍｍワッセルマン試験管に移して３０℃，１８０ｒｐｍで一晩振盪し、復帰培養を行った。復帰培養後の培養液全量をＭＹＫ寒天培地（１０ｍｇ／ｌカナマイシン含有）に塗布し、３０℃で３日間培養した。寒天培地上に出現したコロニー数を数えて算出した形質転換効率を表１に示す。
【０１４７】
形質転換効率は以下の式で算出した。
形質転換効率＝出現コロニー数÷[添加ＤＮＡ（プラスミド）量［μｇ］]
【０１４８】
【表１】
【０１４９】
表１に示されるように、ヌクレアーゼを欠失させたΔＲｒｈＪ１Ｉ−１株は野生型（Ｊ１）に比較して、有意に高い形質転換効率を示した。
【０１５０】
［実施例５］
接合伝達によるＲｒｈＪ１ＩＩ遺伝子の欠失
［実施例１］（４）で調製したＲｒｈＪ１ＩＩ欠失用プラスミドｐＫ１９ΔＲｒｈＪ１ＩＩを使用し、［実施例３]（１）〜（４）と同様の手順で接合伝達・ＲｒｈＪ１ＩＩ遺伝子欠失を行った。
最終的に１４個のコロニーからＲｒｈＪ１ＩＩ遺伝子欠失株が４個得られた。得られたＲｒｈＪ１ＩＩ遺伝子欠失株をΔＲｒｈＪ１ＩＩ−１〜４と命名した。
【０１５１】
［実施例６］
接合伝達による、ΔＲｒｈＪ１Ｉ株からのＲｒｈＪ１ＩＩ遺伝子の欠失
［実施例１］（４）で調製したＲｒｈＪ１ＩＩ欠失用プラスミドｐＫ１９ΔＲｒｈＪ１ＩＩと、レシピエントとしてΔＲｒｈＪ１Ｉ−１株を使用し、［実施例３］（１）〜（４）と同様の手順で接合伝達・ＲｒｈＪ１ＩＩ遺伝子欠失を行った。
最終的に１４個のコロニーからＲｒｈＪ１ＩＩ遺伝子欠失株が３個得られた。得られたＲｒｈＪ１ＩＩ遺伝子欠失株をΔＲｒｈＪ１ＩΔＲｒｈＪ１ＩＩ−１〜３と命名した。
【０１５２】
［実施例７］
形質転換効率の評価
［実施例５］［実施例６］で作製したΔＲｒｈＪ１ＩＩ−１株，ΔＲｒｈＪ１ＩΔＲｒｈＪ１ＩＩ−１株を使用し、［実施例４］（１）〜（３）と同様の手順でこれら２株の形質転換効率を評価した。［実施例４］（３）に記載の式に従って算出した各株の形質転換効率を表２に示す。
【０１５３】
【表２】
【０１５４】
表２に示されるように、ヌクレアーゼを欠失させたΔＲｒｈＪ１ＩＩ−１，ΔＲｒｈＪ１ＩΔＲｒｈＪ１ＩＩ−１の両株は野生型に比較して高い形質転換効率を示した。
【０１５５】
［参考例１］
Ｊ１菌染色体ＤＮＡの調製
ロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株を１００ｍｌのＭＹＫＧ培地中、３０℃にて７２時間振盪培養した。
【０１５６】
培養後、集菌し、集菌された菌体をＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．１Ｍ ＥＤＴＡ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））４ｍｌに懸濁した。懸濁液にリゾチーム４０ｍｇを加えて３７℃で１〜２時間振盪した後、−２０℃で凍結した。
【０１５７】
次に、１０ｍｌのＴｒｉｓ−ＳＤＳ液（１%ＳＤＳ，０．１Ｍ ＮａＣｌ，０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を穏やかに振盪しながら加え、さらにプロテイナーゼＫ（メルク社）（１０ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌ加えて３７℃で１時間振盪した。
【０１５８】
次に、等量のＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））飽和フェノールを加え、攪拌後、遠心した。上層を採取し、２倍量のエタノールを加えた後、ガラス棒でＤＮＡを巻き取り、９０％，８０％，７０％のエタノールで順次フェノールを取り除いた。
【０１５９】
次に、ＤＮＡを３ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼＡ溶液（１００℃，１５分間の加熱処理済）を１０μｇ／ｍｌになるように加え、３７℃で３０分間振盪した。さらに、プロテイナーゼＫを加え３７℃で３０分間振盪した後、等量のＴＥ飽和フェノールを加えて遠心し、上層と下層に分離させた。
【０１６０】
上層についてこの操作を２回繰り返した後、同量のクロロホルム（４％イソアミルアルコール含有）を加え、同様の抽出操作を繰り返した。その後、上層に２倍量のエタノールを加え、ガラス棒でＤＮＡを巻き取り回収し、染色体ＤＮＡ標品を得た。
【０１６１】
［参考例２］
ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子のＰＣＲ
ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子をＰＣＲで増幅するためのプライマーを以下の方法で設計した。
【０１６２】
ロドコッカス属細菌の産生するヌクレアーゼのアミノ酸ホモロジー解析から、特に保存されている２つの領域を選んで配列番号１５および配列番号１６のデジェネレイトプライマーを設計し、参考例１で調製したＪ１菌ゲノムＤＮＡを鋳型としてデジェネレイトＰＣＲを以下の条件で実施した。その結果、約３５０ｂのバンドの増幅が確認された。
【０１６３】
反応液組成
鋳型ＤＮＡ（Ｊ１菌染色体ＤＮＡ，参考例１） １μｌ
１０×Ｅｘ Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社） １０μｌ
１５０μＭプライマーＤＧ−０１（配列番号１５） １μｌ
１５０μＭプライマーＤＧ−０２（配列番号１６） １μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ８μｌ
ＤＭＳＯ １０μｌ
滅菌水 １８μｌ
ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社） １μｌ
総量 ５０μｌ
【０１６４】
温度サイクル：
９４℃：３０秒、６５℃：３０秒および７２℃：１分の反応を３０サイクル
【０１６５】
プライマー
ＤＧ−０１：５’−ＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＣＣＩＧＣＩＡＣＩＴＣＩＧＣＩＣＧＩＡＴＧ−３’（配列番号１５）
ＤＧ−０２：５’−ＣＣＡＩＡＣＩＣＧＩＡＣＩＡＣＩＧＴＣＣＡ−３’（配列番号１６）
【０１６６】
次に、増幅された配列のダイレクトシークエンシングをＰＣＲで使用したプライマーを用いて実施した。その結果、配列番号１７に示す配列が得られ、ホモロジー検索の結果、前述のエンドヌクレアーゼとの相同性が認められた。
【０１６７】
［参考例３］
ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子のクローニング
（１）ゲノミックサザンハイブリダイゼーション
ＡｐａＬＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，Ｅｃｏ５２Ｉ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＫｐｎＩ，ＭｌｕＩ，ＮｃｏＩ，ＮｏｔＩ，ＰｖｕＩ，ＳａｃＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩそれぞれで消化したＪ１菌ゲノムＤＮＡに対し、後述の方法で調製したＲｒｈＪ１ＩＩのプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、Ｅｃｏ５２Ｉで消化した断片から、約１．２ｋｂの単一シグナルが得られた。
【０１６８】
なお、ＲｒｈＪ１ＩＩのプローブは以下のようにして調製した。
参考例２で調製したＰＣＲ産物をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ｂａｎｄ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物に対してＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）を用い、添付のマニュアルにしたがってラベリングを行い、ＲｒｈＪ１ＩＩのプローブとした。
【０１６９】
（２）コロニーハイブリダイゼーション
Ｊ１菌ゲノムＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉで分解して０．７％アガロースゲル電気泳動で分離し、ゲルからＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ｂａｎｄ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）を使用して約１．２ｋｂの断片を回収した。得られた断片は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いて連結した。反応条件は以下の通りである。
【０１７０】
反応液組成：
ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｇｈｔｙ ｍｉｘ（タカラバイオ社製） ５μｌ
Ｊ１菌ゲノムＤＮＡ／Ｅｃｏ５２Ｉ切断断片 ４μｌ
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）／Ｅｃｏ５２Ｉ切断断片 １μｌ
総量 １０μｌ
【０１７１】
反応：
１６℃，１時間
【０１７２】
上記ライゲーション産物の全量を、後述の方法で調製した大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル２００μｌに加え、０℃で３０分放置した。続いて、前述コンピテントセルに４２℃で４５秒間ヒートショックを与え、０℃で２分間冷却した。その後、ＳＯＣ培地（２０ｍＭグルコース、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＳＯ４，１ｍＭ ＭｇＣｌ２）を１ｍｌ添加し、３７℃にて１時間振盪培養した。培養後の培養液を２００μｌずつ、ＬＢ ＡＩＸプレート（１００μｇ／ｌアンピシリン、１００μＭ ＩＰＴＧ，５０μｇ／ｌ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地）に塗布し、３７℃で一晩放置した。プレート上に生育した白色の組換コロニーを新しいＬＢ ＡＩＸプレートに、プレート１枚に付き９４個、プレート１０枚分単離した。各プレートにはインサートを含まないｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）で形質転換したＪＭ１０９株を２コロニー／プレート植菌した。コロニー単離したプレートを３７℃で一晩放置した後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ+（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）膜にコロニーを写し取り、参考例３（１）で調製したＲｒｈＪ１ＩＩのプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行った。
【０１７３】
検出されたコロニーを培養して得られた培養液を集菌後、ＱＩＡｐｒｅｐ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて組換えプラスミドを回収した。キャピラリーＤＮＡシーケンサーＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて、添付のマニュアルに従って、プラスミド中にクローニングされているゲノムＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。その結果、配列番号１８に示される塩基配列が得られた。配列番号１８に示される塩基配列中に、配列番号４に示す４５０ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）を見出した。このＯＲＦ１のコードするアミノ酸配列は、アライメントしたロドコッカス属細菌由来エンドヌクレアーゼに対して８７％〜８９％の相同性を持っていることから、ＯＲＦ１はエンドヌクレアーゼをコードしていることが推定されたため、ＯＲＦ１のコードするエンドヌクレアーゼをＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼと命名した。また、本参考例３（２）で得られたＯＲＦ１を含むプラスミドをｐＢＲｒｈＪ１ＩＩと命名した。
【０１７４】
なお、大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルは以下の方法で調製した。
大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ培地１ｍｌに接種し、３７℃で５時間好気的に前培養した。
次に、前培養液０．４ｍｌをＳＯＢ培地４０ｍｌ（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＳＯ４，１ｍＭ ＭｇＣｌ２）に加え、１８℃で２０時間培養した。得られた培養物を遠心分離（３，７００×ｇ，１０分間、４℃）により集菌した後、冷ＴＦ溶液（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．０），２００ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ２，４０ｍＭ ＭｎＣｌ２）を１３ｍｌ加え、０℃で１０分間放置し、再度遠心分離（３，７００×ｇ，１０分間、４℃）して上清を除いた。得られた大腸菌菌体を冷ＴＦ溶液３．２ｍｌに懸濁し、０．２２ｍｌのジメチルスルホキシドを加え、０℃で１０分間放置した後、液体窒素を用いて凍結したものをコンピテントセルとした。
【０１７５】
［参考例４］
大腸菌組換体によるＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼの生産
（１）ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ発現プラスミドの構築
ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼを得るために、実施例１で得られたＪ１菌染色体ＤＮＡを鋳型として使用し、以下に示す反応液組成およびプライマーを用いてＰＣＲを行った。この際、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼをＨｉｓ−ｔａｇ融合タンパクとして発現させるため、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子上流にＳＤ配列とＨｉｓ−ｔａｇ配列を付加した。
【０１７６】
反応液組成
鋳型ＤＮＡ（Ｊ１菌染色体ＤＮＡ） １μｌ
２×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡） ２５μｌ
１０μＭプライマーＮ（配列番号１９） １．５μｌ
１０μＭプライマーＣ（配列番号２０） １．５μｌ
２ｍＭ ｄＮＴＰ １０μｌ
ＫＯＤ ＦＸ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡） １μｌ
総量 ５０μｌ
【０１７７】
温度サイクル：９４℃：１２０秒、９８℃：１０秒および６８℃：１分の反応を３０サイクル
【０１７８】
プライマー
Ｎ：５'−ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＡＴＧＧＣＧＴＣＧＴＣＧＧＡＴ−３'（配列番号１９）
Ｃ：５'−ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＣＣＣＣＧＣＧＣＣＧＧＴＴＴ−３'（配列番号２０）
【０１７９】
反応終了後、反応液５μｌを１％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約０．５ｋｂのＰＣＲ産物の検出を行った。ＰＣＲ産物を確認した後、反応液からＰＣＲ産物をＤＮＡ／ＲＮＡ ｅｘｔａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＶＩＯＧＥＮＥ社）で精製した。得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断した。制限酵素処理を行ったＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約０．５ｋｂ付近のバンドを回収した。回収したＰＣＲ産物をベクターｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結し、プラスミドを作製した。得られたプラスミドをｐＲＲ０１と名づけた。
【０１８０】
このプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１ｍＭ ＩＰＴＧ，５０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上でコロニーを形成させた。得られた白色のコロニーを１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩培養した後Ｍｉｎｉ Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＶＩＯＧＥＮＥ社）を使用してプラスミドを回収し、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩによる切断とシークエンス解析を行って目的のＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。
【０１８１】
（２）精製酵素の調製
（１）で作製したＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ発現ベクターを含む大腸菌組換体（ＪＭ１０９／ｐＲＲ０１）を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地１０ｍｌで３７℃，５時間培養した後、１ｍｌを１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢ液体培地１００ｍｌ×１本に植菌し、３７℃，１８時間培養した。培養液を遠心分離によって回収し、回収した菌体を破砕用緩衝液（組成 ２０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，０．５Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ イミダゾール、１０％ グリセロール、ｐＨ７．４）に懸濁した後４℃で１０分間超音波による破砕を行った。破砕液を遠心分離し、得られた上清を無細胞抽出液とした。この無細胞抽出液をＨｉｓ−ｔａｇ精製カラム（Ｈｉｓ Ｔｒａｐ ＨＰ：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。精製タンパク質はＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（０．５Ｍ ＮａＣｌ，０．５Ｍ イミダゾール、２０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１０％グリセロール、ｐＨ７．４）にて溶出し、２つのフラクションに分画してフラクション１，フラクション２とした。
【０１８２】
得られた精製サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨｉｓ−ｔａｇ特異的抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたウェスタンブロッティングに供し、目的タンパク質が精製されていることを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、フラクション１とフラクション２で約２５ｋＤａ付近にバンドが出現し、Ｈｉｓ−ｔａｇ特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、目的タンパク質であることを確認した。
【０１８３】
（３）酵素活性の測定
（２）で調製した精製酵素を用いて、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ活性を調べた。活性は片方の鎖の５'末端にビオチン標識を持ち、配列内にＴ／Ｇミスマッチを１箇所持つ二本鎖オリゴＤＮＡを種々用いてそのニッキング活性を測定した。
【０１８４】
反応液組成
１.５μＭ基質ＤＮＡ ２μｌ
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５） ２μｌ
１００ｍＭ ＭｇＣｌ2 ２μｌ
１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ ２μｌ
総量 ２０μｌ
【０１８５】
反応温度：２０℃，６０分
【０１８６】
反応終了後、反応液と等量のフェノールでＤＮＡを抽出し、ホルムアミド（終濃度１Ｍ）の存在下、１００℃で２分間加熱後氷上にて急冷処理し、ＤＮＡを一本鎖に変性させた。変性後の一本鎖ＤＮＡサンプルを、８Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、Ｉｍａｇｉｎｇ ｈｉｇｈ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉ ｋｉｔ（東洋紡）を使用して化学発光による検出を行って泳動パターンを比較した結果、いくつかのオリゴヌクレオチドにおいて約２０ｍｅｒの１本鎖が生成したことから、得られた精製酵素はＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼ活性を持つことを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１８７】
本発明により、ロドコッカス属細菌の形質転換方法が提供される。本発明に係る形質転換方法により得られたロドコッカス属細菌の形質転換体は、導入したＤＮＡの効果により新たな性質を付与することが可能であるため、産業上有用な微生物触媒等の開発に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１８８】
配列番号５：プライマーＳＡＣ−０１
配列番号６：プライマーＳＡＣ−０２
配列番号７：プライマーＪ０５
配列番号８：プライマーＪ０６
配列番号９：プライマーＪ０７
配列番号１０：プライマーＪ０８
配列番号１１：プライマーＪＭ５６
配列番号１２：プライマーＪＭ５７
配列番号１３：プライマーＪＭ５８
配列番号１４：プライマーＪＭ５９
配列番号１５：プライマーＤＧ−０１
配列番号１６：プライマーＤＧ−０２
配列番号１９：プライマーＮ
配列番号２０：プライマーＣ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレアーゼ遺伝子を欠失または不活性化させたロドコッカス属細菌。
【請求項２】
ロドコッカス属細菌が、ロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）である、請求項１記載のロドコッカス属細菌。
【請求項３】
欠失または不活性化させるヌクレアーゼ遺伝子が制限酵素遺伝子である、請求項１または２記載のロドコッカス属細菌。
【請求項４】
欠失または不活性化させるヌクレアーゼ遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を有するＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素もしくはそのオーソログ、および／または配列番号３に示される塩基配列を有するＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼもしくはそのオーソログである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のロドコッカス属細菌。
【請求項５】
欠失または不活性化させるヌクレアーゼ遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）に示される塩基配列を有するＤＮＡからなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のロドコッカス属細菌。
（ａ）配列番号１または３記載の塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号１または３記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列と相同性が８０％以上の塩基配列からなり、かつヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項６】
ロドコッカス属細菌が、ロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１株またはその変異株である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のロドコッカス属細菌。
【請求項７】
請求項１〜６記載のロドコッカス属細菌を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項８】
ヌクレアーゼ遺伝子が欠失または不活性化されたロドコッカス属細菌を作製し、該ロドコッカス属細菌を形質転換することを特徴とする、ロドコッカス属細菌の形質転換体の製造方法。
【請求項９】
ヌクレアーゼ遺伝子を欠失または不活性化させることを特徴とする、ロドコッカス属細菌の形質転換効率を向上させる方法。
【請求項１】
ヌクレアーゼ遺伝子を欠失または不活性化させたロドコッカス属細菌。
【請求項２】
ロドコッカス属細菌が、ロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）である、請求項１記載のロドコッカス属細菌。
【請求項３】
欠失または不活性化させるヌクレアーゼ遺伝子が制限酵素遺伝子である、請求項１または２記載のロドコッカス属細菌。
【請求項４】
欠失または不活性化させるヌクレアーゼ遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を有するＲｒｈＪ１Ｉ制限酵素もしくはそのオーソログ、および／または配列番号３に示される塩基配列を有するＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼもしくはそのオーソログである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のロドコッカス属細菌。
【請求項５】
欠失または不活性化させるヌクレアーゼ遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）に示される塩基配列を有するＤＮＡからなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のロドコッカス属細菌。
（ａ）配列番号１または３記載の塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号１または３記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列と相同性が８０％以上の塩基配列からなり、かつヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項６】
ロドコッカス属細菌が、ロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１株またはその変異株である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のロドコッカス属細菌。
【請求項７】
請求項１〜６記載のロドコッカス属細菌を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項８】
ヌクレアーゼ遺伝子が欠失または不活性化されたロドコッカス属細菌を作製し、該ロドコッカス属細菌を形質転換することを特徴とする、ロドコッカス属細菌の形質転換体の製造方法。
【請求項９】
ヌクレアーゼ遺伝子を欠失または不活性化させることを特徴とする、ロドコッカス属細菌の形質転換効率を向上させる方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１３−５７９２（Ｐ２０１３−５７９２Ａ）
【公開日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−６２４５８（Ｐ２０１２−６２４５８）
【出願日】平成２４年３月１９日（２０１２．３．１９）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年３月１９日（２０１２．３．１９）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
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