ネオフラクトオリゴ糖の製造法
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規に発見した菌の菌体またはその菌が産生する酵素を用いて、フラクトオリゴ糖と共にネオフラクトオリゴ糖を同時に製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】微生物が産生する糖転移酵素または糖加水分解酵素を糖質に作用させることにより、種々のオリゴ糖を製造することがなされている。
【０００３】代表的な例をあげると、シュクロースに、オウレオバシディウム(Aureobacidium) FERM P-4257 、オウレオバシディウム・プルラリア・ヴァル・メラニゲヌム(Aureobacidium pullularia var melanigenum)、オウレオバシディウム(Aureobacidium) ATCC 9348 、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger) ATCC 20611、アスペルギルス・ジャポニクス(Aspergillus japonicus) Mu-2などの微生物が産生するフラクトシルトランスフェラーゼ（フラクトース転移酵素、β-fructo-franosidase)を作用させて、シュクロースのフラクトースにフラクトースがβ−１，２結合で１分子結合した１−ケストース (ＧＦ2)、２分子結合したニストース (ＧＦ3)、３分子結合した１−フラクトシルニストース (ＧＦ4)などのフラクトオリゴ糖が工業的に生産され、機能性を有する甘味料として広く食品加工に利用されている。たとえば、本発明者の出願にかかる特開昭６０−２７３９５号公報（特公平５−４０７１号公報）、特開昭６０−４１４９７号公報（特公平５−４０７０号公報）および特開平７−３１４９２号公報を参照。
【０００４】特公昭４３−１９８３９号公報には、ペニシリウム属に属する微生物をシュクロースを含む培養液に培養するか、またはこれら菌株の菌体、または菌体押出物をシュクロース溶液に接触させるようにした、シュクロースを原料とするフラクトオリゴ糖の製造方法が示されている。特開平２−１６３０９３号公報（特公平４−４１６００号公報）および特開平４−２３５１９２号公報（特公平６−７００７５号公報）には、スコプラリオプシス属に属する微生物を用いてケストースを製造する方法が示されている。
【０００５】フラクトオリゴ糖の製造技術は、（イ）フラクトシルトランスフェラーゼを効率的に産生する技術、（ロ）産生した酵素を使用してフラクトオリゴ糖を生産する技術、（ハ）フラクトオリゴ糖を分離する技術、より成り立っている。特に重要な技術は、加水分解活性が弱くかつ転移活性が強い酵素産生菌の分離と酵素産生技術であり、工業的にはオウレオバシディウム属またはアスペルギルス属の菌が使用されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ネオフラクトオリゴ糖（ネオケストース、ネオニストース、ネオフラクトシルニストース）は、植物、たとえばタマネギ、ニラ、カラスムギ等に含有されているが、微生物の産生するフラクトース転移酵素をシュクロースに作用させてネオフラクトオリゴ糖を生産する方法は確立されていない。
【０００７】従来提案されているオウレオバシディウム属、アスペルギルス属、ペニシリウム属などの菌、あるいはこれらの菌の産生するフラクトシルトランスフェラーゼは、シュクロースから１−ケストース、ニストース、１−フラクトシルニストースなどのフラクトオリゴ糖への転移反応のみを触媒する酵素であり、ネオフラクトオリゴ糖を生産するものではない。
【０００８】本発明は、このような背景下において、自然界から新規に分離した菌を培養して得られる菌体、またはその菌が産生するフラクトシルトランスフェラーゼをシュクロース（またはフラクトオリゴ糖）に作用させて、ネオケストース、ネオニストース、ネオフラクトシルニストースなどのネオフラクトオリゴ糖を製造する方法を提供することを目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明のネオフラクトオリゴ糖の製造法は、基質であるシュクロース(X1)または／およびシュクロースのフラクトースにフラクトースがβ−１，２結合した構造のフラクトオリゴ糖(X2)に、ペニシリウム・シトリヌム(Penicillium citrinum) FERM P-15944 菌の菌体(Y1)または／およびその菌が産生する菌体内または菌体外酵素であるフラクトシルトランスフェラーゼ (β-fructo-franosidase)(Y2)を作用させて、フラクトオリゴ糖と共にネオフラクトオリゴ糖を生成させることを特徴とするものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下本発明を詳細に説明する。
【００１１】本発明においては、基質として、シュクロース(X1)を用いるか、シュクロースのフラクトースにフラクトースがβ−１，２結合（つまりイヌリン型に結合）した構造のフラクトオリゴ糖(X2)を用いる。両者を併用することもできる。
【００１２】後者のフラクトオリゴ糖(X2)としては、従来知られている方法により得た１−ケストース、ニストース、１−フラクトシルニストースなどのフラクトオリゴ糖を用いることができる。また、本発明に従い基質としてシュクロース(X1)を用いたときの中間生成物を用いることもできる。
【００１３】本発明において用いるペニシリウム属の菌は、本発明者が自然界から分離した新規な菌であり、すでにペニシリウム・シトリヌム(Penicillium citrinum) FERM P-15944 菌として受託されている。
【００１４】この菌の菌学的特徴を見ると、コロニーは余り多くならず、ビロード状の暗青灰色で、狭い白色の周縁部が見える。裏面はごく淡い黄色から濃黄色にわたって変化し、ツァペック(Czapek)液、その他の液体培地で培養すると培地が黄金色に変わる。
【００１５】本菌をツァペック(Czapek)−イースト(Yeast) 寒天培地（ＣＹＡ）およびマルトエキス寒天培地に接種し、２５℃または３７℃で７日培養し、生育したカビ集落の色調、形状および分生子、さらには分生子形成構造等の形態の観察を行った。このときの本菌の菌学的性状を表１に示す。
【００１６】
【表１】
項 目 性 状 生育速度（25℃／７日間） 集落の直径：３０〜３２mm 生育速度（37℃／７日間） 集落の直径：５〜６mm 集落表面の色 灰緑色〜暗いオレンジ色 集落裏面の色 黄色〜黄褐色 集落表面の組織 羊毛状 分生子柄 滑面 ペニシリ 複輪生〜単輪生 メトレ （12〜15）×(2.5〜3.0)μm ファライド フラスコ形、(7〜12) ×(2〜2.5)μm 分生子 球形〜亜球形、滑面、直径 2.5〜 3.0μm
【００１７】上記の菌を液体培養することにより培養菌体または菌体を含む培養液が得られるが、本発明においてはその菌体（またはそれを含む培養液）自体を菌体内酵素と共にそのまま用いることできるほか、その菌から産生される菌体外酵素（フラクトシルトランスフェラーゼ）も同様に用いることができる。これらの菌体内酵素または菌体外酵素は、可溶化してあるいは固定化して使用することもできる。
【００１８】液体培養を行うときの培養液の培養培地組成としては、たとえば、シュクロース10.0〜 5.0重量％、NaNO3 0.5重量％、 K2HPO4 0.1重量％、KCl 0.1重量％、 MgSO4・H2O 0.01 重量％、 FeSO4・7 H2O 0.002重量％、粉末酵母 0.1〜 0.5重量％があげられるが、他の種々の組成も採用することができる。このような培地を使用して２４時間以上通気撹拌培養すると、フラクトシルトランスフェラーゼが活性な菌体含有培養液が得られる。
【００１９】このとき産生される酵素は、菌体内または菌体外（主として菌体内）に含有されている酵素であり、この酵素は、オウレオバシディウム属やアスペルギルス属の菌の産生する既存のフラクトシルトランスフェラーゼと同様、シュクロースにより誘導される誘導酵素である。
【００２０】基質であるシュクロース(X1)または／およびシュクロースのフラクトースにフラクトースがβ−１，２結合した構造のフラクトオリゴ糖(X2)に、上記の菌の菌体(Y1)や上記のフラクトシルトランスフェラーゼ(Y2)を作用させると、フラクトオリゴ糖と共にネオフラクトオリゴ糖を効率的に得ることができる。菌体(Y1)またはフラクトシルトランスフェラーゼ(Y2)の作用温度は４０〜６０℃、ｐＨは４〜６であることが好ましい。
【００２１】ここでフラクトオリゴ糖とは、先に述べたように、１−ケストース、ニストース、１−フラクトシルニストースなどであり、ネオフラクトオリゴ糖とは、ネオケストース、ネオニストース、ネオフラクトシルニストースなどである。ちなみに、１−ケストースの構造式は次の化１、ネオケストースの構造式は次の化２で示される。
【００２２】
【化１】
【００２３】
【化２】
【００２４】オウレオバシディウム属やアスペルギルス属の菌から産生される既存のフラクトシルトランスフェラーゼは、シュクロース等の基質のフラクトースにフラクトースがβ−１，２結合したイヌリン型のフラクトオリゴ糖のみを生成する。すなわち、G-(F)n → G-(F)n+1 ＋ G-(F)n-1の転移反応を触媒する。なお、基質(G-(F)n)のｎが１の場合（シュクロースの場合）はグルコースが遊離する。この転移反応は、同一分子間のフラクトース転移反応である。
【００２５】これに対し、本発明で用いているペニシリウム・シトリヌム FERM P-15944 の産生するフラクトシルトランスフェラーゼは、シュクロース等の基質から、下記の化３の反応を触媒する。なお、基質(G-(F)n)のｎが１の場合（シュクロースの場合）はグルコースを遊離する。
【００２６】
【化３】
【００２７】そして、上記の(i) のネオフラクトオリゴ糖は、本酵素の転移反応基質にはならない。この点がこの転移反応で重要なことである。
【００２８】基質からのネオフラクトオリゴ糖転移率は基質濃度に依存し、基質濃度が高いほどネオフラクトオリゴ糖の転移率が高くなる。このことは、ネオフラクトオリゴ糖生産上非常に重要なことである。後述の図２は、基質（シュクロース）濃度とネオフラクトオリゴ糖転移率との関係を示したグラフである。基質濃度は、 Brix ３０以上、４０以上、５０以上、６０以上というように、高くなるほど好ましい。基質シュクロース濃度 Brix ７０の場合、フラククトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖との合計転移率は５５〜６０％と非常に高い。
【００２９】本発明の方法によれば、１−ケストース、ニストース、１−フラクトシルニストースなどのフラクトオリゴ糖と同時に、ネオケストース、ネオニストース、ネオフラクトシルニストースなどのネオフラクトオリゴ糖が得られるが、通常は生成したフラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖とを分離するには及ばないので、そのまま種々の用途に用いる。
【００３０】得られたネオフラクトオリゴ糖は、そのすぐれた保湿作用、好甘味、低カロリー性、抗う蝕作用、腸内細菌の増殖作用、腸管局所免疫増強作用などの諸機能を生かして、甘味料、機能性食品、飼料、医薬、植物の防疫促進剤をはじめ、多方面に利用することができる。
【００３１】〈作用〉下記の表２は、基質がシュクロースであるときに、その基質にペニシリウム・シトリヌム FERM P-15944 菌の産生するフラクトシルトランスフェラーゼを作用させたときの転移反応をモデル的に示したものである。
【００３２】
【表２】
【００３３】ルートＡは、既存のフラクトシルトランスフェラーゼを用いたときの一連の転移反応を示したものであり、シュクロース→１−ケストース→ニストース→１−フラクトシルニストースを経るというように、より高次のフラクトオリゴ糖が生成していく。
【００３４】これに対し、本発明者が見い出したペニシリウム・シトリヌム FERM P-15944が産生するフラクトシルトランスフェラーゼは、ルートＡの転移反応と共に、ルートＢの転移反応も触媒する。ルートＢは、シュクロース→ネオケストースの転移反応を含むが、その転移反応物であるネオケストースを新たな基質としては反応は進行しない。一段高次のネオニストースは、同時に生成した１−ケストースの転移反応により得られるのである。同様にこのときの転移反応物であるネオニストースを新たな基質としては反応は進行しない。より高次のネオフラクトシルニストースは、ニストースを経て生成した１−フラクトシルニストースの転移反応により得られるのである。
【００３５】基質としてのシュクロースにペニシリウム・シトリヌム FERM P-15944 が産生するフラクトシルトランスフェラーゼを作用させたときの反応経時的な糖組成は後述の図３の通りであり、ネオフラクトオリゴ糖の転移率が高く、フラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖との合計転移率も非常に高いのが特徴である。
【００３６】
【実施例】次に実施例をあげて本発明を詳細に説明する。
【００３７】実施例１、比較例１〜２予備的実験として、オウレオバシディウム FERM P-4257菌（比較例１）、アスペルギルス・ジャポニクス Mu-2 菌（比較例２）、ペニシリウム・シトリヌム FERM P-15944 菌（実施例１）がそれぞれ産生する３種のフラクトシルトランスフェラーゼをシュクロースに作用させ、生成したフラクトオリゴ糖（１−ケストース、ニトース）を高速液体クロマトグラフィー (使用カラム SCR-101N)で経時的に定量して、横軸に１−ケストースを、縦軸にニストース（いずれも重量％）をプロットしたところ、図１に示すようなフラクトオリゴ糖曲線が得られた。なおこのカラムによっては、１−ケストースとネオケストースとは分離できないので、１−ケストースにはネオケストースの分も含まれている。
【００３８】オウレオバシディウム FERM P-4257菌（比較例１）、アスペルギルス・ジャポニクス Mu-2 菌（比較例２）が産生するフラクトシルトランスフェラーゼを用いた場合は、全く同じフラクトオリゴ糖曲線になるが、ペニシリウム・シトリヌムFERM P-15944 菌（実施例１）が産生するフラクトシルトランスフェラーゼを用いた場合は、異なったフラクトオリゴ糖曲線になることを見い出した。
【００３９】本発明者は、図１に示されたフラクトオリゴ糖曲線の相違の原因を、１−ケストースの構造異性体が生成するためと判断して、定性および定量分析した結果、ペニシリウム・シトリヌム FERM P-15944 菌（実施例１）が産生するフラクトシルトランスフェラーゼを用いた場合には、先に述べた表１のルートＢとルートＡの転移反応が同時に行われていることを見い出したのである。
【００４０】実施例２〈菌の培養と酵素の産生〉本発明者が土中から分離したペニシリウム・シトリヌム FERM P-15944 菌を、下記の培地で液体培養した。すなわち、１リットルの水道水に、シュクロース（グラニュー糖）１００ｇ、NaNO3 ２ｇ、 K2HPO4 １ｇ、KCl １ｇ、 MgSO4・H2O１ｇ、 FeSO4・7 H2O 0.02 ｇ、粉末酵母５ｇを加え、ｐＨを 6.4に調整することにより、培地を作った。この培地を容量 1.5リットルの培養槽に入れて１１５℃で２０分間殺菌後、４８時間培養した５０mlの種菌を接種し、３０℃で通気撹拌培養した。通気量は５００ml/minとし、撹拌は１００rpm の回転速度で行った。７２時間培養後、菌体を遠心分離で分取した。得られた菌体は８０ｇ（水分８０重量％）であり、１ｇの菌体の酵素力価は５００u/gr菌体、培養ろ過液中の酵素力価は２u/mlであった。
【００４１】酵素力価の測定は、結晶精製シュクロースを濃度 Brix ５０（重量％）に調整し、ｐＨ 5.0にて、このシュクロース液１００ｇに上記の菌体（水分８０重量％） 0.5ｇを添加し、５５℃、１００rpm で３０分間反応後、高速液体クロマトグラフィーでグルコースを定量することにより行った。液体クロマトグラフィーのカラムとしては、ダイソー株式会社製の「DAISO PAK.sp-120-5.DDS-B」を使用した。酵素力価は、１μ-molグルコース／１分＝１ｕとした。
【００４２】〈転移反応〉上記で得た菌体を、シュクロースに対して１重量％添加し（つまりシュクロース１ｇ当り５ｕの酵素を添加したことになる）、ｐＨ 5.0、温度５０℃で、シュクロース濃度をBrix１０，２０，３０，５０，７０にして反応させた。４０時間後に液体クロマトグラフィーにてネオフラクトオリゴ糖を定量したところ、図２の結果が得られた。基質のシュクロース濃度が高いほどシュクロースからのネオフラクトオリゴ糖の生成量は多くなるが、総オリゴ糖の量（ネオフラクトオリゴ糖とフラクトオリゴ糖との合計量）は、基質シュクロース固形物に対して一定（５５〜６０％）であることがわかる。
【００４３】基質シュクロース濃度 Brix ７０における反応経過時間ごとのネオフラクトオリゴ糖（ネオケストース、ネオニストース、ネオフラクトシルニストース）およびフラクトオリゴ糖（１−ケストース、ニストース、フラクトシルニストース）のシュクロースからの転移率は図３に示す通りである。また反応時間（４０時間）におけるネオフラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖の糖組成は、下記の表３に示す通りである。シュクロースからのネオフラクトオリゴ糖（ネオケストース、ネオニストース、ネオフラクトシルニストース）の転移率は約２０％であった。なお、酵素は菌体を直接使用し、酵素量は５(u)/grシュクロースである。
【００４４】
【表３】
生 成 物 転移率(%) グルコース(G) 31.63 % シュクロース(GF) 11.62 % オリゴ糖 56.74 % ・フラクトオリゴ糖 36.85 % １−ケストース(GF2) 21.80 % ニストース(GF3) 14.05 % １−フラクトシルニストース(GF4) 1.00 % ・ネオフラクトオリゴ糖 19.89 % ネオケストース(FGF) 10.51 % ネオニストース(FGF2) 8.01 % ネオフラクトシルニストース(FGF3) 1.28 % 合計 100.0％
【００４５】Brix ７０で４０時間反応後の液体クロマトグラフィー分析結果を図４に示す。Ｐ1 はネオケストース、Ｐ2 はネオニストース、Ｐ3 はネオフラクトシルニストースのピークを示している。
【００４６】上記で得られたネオフラクトオリゴ糖含有液（Brix７０）を１００ｇ分取して、それにメタノール１００mlを添加し、３０℃でよく撹拌後、０℃で２４時間放置し、その間に沈澱した物質を遠心分離で分取した。分取量は２０ｇであった。減圧乾燥後、蒸留水を加えて２０％溶液とした。この２０％溶液の高速液体クロマトグラフィー分析結果を図５に示す。
【００４７】さらに、高速液体クロマトグラフィー（使用カラム「DAISO PAK.sp-120-5.VDS-B）で、ネオケストース、ネオニストース、ネオフラクトシルニストースをそれぞれ１０mg、５mg、３mg秤取した。これら３種の粉末を各々メチル化アルジトール・アセテート分析、さらには重クロロホルム溶液13Ｃ−ＮＭＲ分析した結果、シュクロース、１−ケストース、ニストースのグルコースにフラクトースが１分子、Fruct β2-６Glu に結合したネオフラクトオリゴ糖であることが明らかになった。
【００４８】
【発明の効果】本発明によれば、次のようなすぐれた効果が奏される。
（ａ）本発明者が分離したペニシリウム・シトリヌム FERM P-15944 菌を液体培養することにより産生されるフラクトシルトランスフェラーゼを、シュクロース（またはシュクロースのフラクトースにフラクトースがβ−１，２結合した構造のフラクトオリゴ糖）に作用させると、ネオフラクトオリゴ糖を２０％も含有する糖液を工業的に生産することができる。
（ｂ）高基質濃度（たとえば Brix ７０）で、ネオフラクトオリゴ糖の転移反応が最大になる転移反応であるため、工業生産上のメリットが大である。
（ｃ）シュクロース（またはシュクロースのフラクトースにフラクトースがβ−１，２結合した構造のフラクトオリゴ糖）から、腸内有用菌の増殖作用、腸管局所免疫増強作用、植物の防疫促進作用をはじめとする特徴ある特性を持つ糖が工業的に得られるので、新しい機能をもつ食品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】アスペルギルス・ジャポニクス Mu-2 菌、オウレオバシディウム FERM P-4257菌、ペニシリウム・シトリヌム FERM P-15944 菌が産生するフラクトシルトランスフェラーゼをシュクロースに作用させたときのフラクトオリゴ糖曲線を示す図である。
【図２】基質（シュクロース）濃度とネオフラクトオリゴ糖への転移率との関係を示す図である。
【図３】基質（シュクロース）濃度 Brix ７０における反応経過時間ごとのネオフラクトオリゴ糖生成との関係を示す図である。
【図４】ネオフラクトオリゴ糖含有糖液の高速液体クロマトグラフィー分析表を示す図である。
【図５】図４で示した糖組成の糖液をメタノールで精製したフラクトオリゴ糖含有液の高速液体クロマトグラフィー分析表を示す図である。
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規に発見した菌の菌体またはその菌が産生する酵素を用いて、フラクトオリゴ糖と共にネオフラクトオリゴ糖を同時に製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】微生物が産生する糖転移酵素または糖加水分解酵素を糖質に作用させることにより、種々のオリゴ糖を製造することがなされている。
【０００３】代表的な例をあげると、シュクロースに、オウレオバシディウム(Aureobacidium) FERM P-4257 、オウレオバシディウム・プルラリア・ヴァル・メラニゲヌム(Aureobacidium pullularia var melanigenum)、オウレオバシディウム(Aureobacidium) ATCC 9348 、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger) ATCC 20611、アスペルギルス・ジャポニクス(Aspergillus japonicus) Mu-2などの微生物が産生するフラクトシルトランスフェラーゼ（フラクトース転移酵素、β-fructo-franosidase)を作用させて、シュクロースのフラクトースにフラクトースがβ−１，２結合で１分子結合した１−ケストース (ＧＦ2)、２分子結合したニストース (ＧＦ3)、３分子結合した１−フラクトシルニストース (ＧＦ4)などのフラクトオリゴ糖が工業的に生産され、機能性を有する甘味料として広く食品加工に利用されている。たとえば、本発明者の出願にかかる特開昭６０−２７３９５号公報（特公平５−４０７１号公報）、特開昭６０−４１４９７号公報（特公平５−４０７０号公報）および特開平７−３１４９２号公報を参照。
【０００４】特公昭４３−１９８３９号公報には、ペニシリウム属に属する微生物をシュクロースを含む培養液に培養するか、またはこれら菌株の菌体、または菌体押出物をシュクロース溶液に接触させるようにした、シュクロースを原料とするフラクトオリゴ糖の製造方法が示されている。特開平２−１６３０９３号公報（特公平４−４１６００号公報）および特開平４−２３５１９２号公報（特公平６−７００７５号公報）には、スコプラリオプシス属に属する微生物を用いてケストースを製造する方法が示されている。
【０００５】フラクトオリゴ糖の製造技術は、（イ）フラクトシルトランスフェラーゼを効率的に産生する技術、（ロ）産生した酵素を使用してフラクトオリゴ糖を生産する技術、（ハ）フラクトオリゴ糖を分離する技術、より成り立っている。特に重要な技術は、加水分解活性が弱くかつ転移活性が強い酵素産生菌の分離と酵素産生技術であり、工業的にはオウレオバシディウム属またはアスペルギルス属の菌が使用されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ネオフラクトオリゴ糖（ネオケストース、ネオニストース、ネオフラクトシルニストース）は、植物、たとえばタマネギ、ニラ、カラスムギ等に含有されているが、微生物の産生するフラクトース転移酵素をシュクロースに作用させてネオフラクトオリゴ糖を生産する方法は確立されていない。
【０００７】従来提案されているオウレオバシディウム属、アスペルギルス属、ペニシリウム属などの菌、あるいはこれらの菌の産生するフラクトシルトランスフェラーゼは、シュクロースから１−ケストース、ニストース、１−フラクトシルニストースなどのフラクトオリゴ糖への転移反応のみを触媒する酵素であり、ネオフラクトオリゴ糖を生産するものではない。
【０００８】本発明は、このような背景下において、自然界から新規に分離した菌を培養して得られる菌体、またはその菌が産生するフラクトシルトランスフェラーゼをシュクロース（またはフラクトオリゴ糖）に作用させて、ネオケストース、ネオニストース、ネオフラクトシルニストースなどのネオフラクトオリゴ糖を製造する方法を提供することを目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明のネオフラクトオリゴ糖の製造法は、基質であるシュクロース(X1)または／およびシュクロースのフラクトースにフラクトースがβ−１，２結合した構造のフラクトオリゴ糖(X2)に、ペニシリウム・シトリヌム(Penicillium citrinum) FERM P-15944 菌の菌体(Y1)または／およびその菌が産生する菌体内または菌体外酵素であるフラクトシルトランスフェラーゼ (β-fructo-franosidase)(Y2)を作用させて、フラクトオリゴ糖と共にネオフラクトオリゴ糖を生成させることを特徴とするものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下本発明を詳細に説明する。
【００１１】本発明においては、基質として、シュクロース(X1)を用いるか、シュクロースのフラクトースにフラクトースがβ−１，２結合（つまりイヌリン型に結合）した構造のフラクトオリゴ糖(X2)を用いる。両者を併用することもできる。
【００１２】後者のフラクトオリゴ糖(X2)としては、従来知られている方法により得た１−ケストース、ニストース、１−フラクトシルニストースなどのフラクトオリゴ糖を用いることができる。また、本発明に従い基質としてシュクロース(X1)を用いたときの中間生成物を用いることもできる。
【００１３】本発明において用いるペニシリウム属の菌は、本発明者が自然界から分離した新規な菌であり、すでにペニシリウム・シトリヌム(Penicillium citrinum) FERM P-15944 菌として受託されている。
【００１４】この菌の菌学的特徴を見ると、コロニーは余り多くならず、ビロード状の暗青灰色で、狭い白色の周縁部が見える。裏面はごく淡い黄色から濃黄色にわたって変化し、ツァペック(Czapek)液、その他の液体培地で培養すると培地が黄金色に変わる。
【００１５】本菌をツァペック(Czapek)−イースト(Yeast) 寒天培地（ＣＹＡ）およびマルトエキス寒天培地に接種し、２５℃または３７℃で７日培養し、生育したカビ集落の色調、形状および分生子、さらには分生子形成構造等の形態の観察を行った。このときの本菌の菌学的性状を表１に示す。
【００１６】
【表１】
項 目 性 状 生育速度（25℃／７日間） 集落の直径：３０〜３２mm 生育速度（37℃／７日間） 集落の直径：５〜６mm 集落表面の色 灰緑色〜暗いオレンジ色 集落裏面の色 黄色〜黄褐色 集落表面の組織 羊毛状 分生子柄 滑面 ペニシリ 複輪生〜単輪生 メトレ （12〜15）×(2.5〜3.0)μm ファライド フラスコ形、(7〜12) ×(2〜2.5)μm 分生子 球形〜亜球形、滑面、直径 2.5〜 3.0μm
【００１７】上記の菌を液体培養することにより培養菌体または菌体を含む培養液が得られるが、本発明においてはその菌体（またはそれを含む培養液）自体を菌体内酵素と共にそのまま用いることできるほか、その菌から産生される菌体外酵素（フラクトシルトランスフェラーゼ）も同様に用いることができる。これらの菌体内酵素または菌体外酵素は、可溶化してあるいは固定化して使用することもできる。
【００１８】液体培養を行うときの培養液の培養培地組成としては、たとえば、シュクロース10.0〜 5.0重量％、NaNO3 0.5重量％、 K2HPO4 0.1重量％、KCl 0.1重量％、 MgSO4・H2O 0.01 重量％、 FeSO4・7 H2O 0.002重量％、粉末酵母 0.1〜 0.5重量％があげられるが、他の種々の組成も採用することができる。このような培地を使用して２４時間以上通気撹拌培養すると、フラクトシルトランスフェラーゼが活性な菌体含有培養液が得られる。
【００１９】このとき産生される酵素は、菌体内または菌体外（主として菌体内）に含有されている酵素であり、この酵素は、オウレオバシディウム属やアスペルギルス属の菌の産生する既存のフラクトシルトランスフェラーゼと同様、シュクロースにより誘導される誘導酵素である。
【００２０】基質であるシュクロース(X1)または／およびシュクロースのフラクトースにフラクトースがβ−１，２結合した構造のフラクトオリゴ糖(X2)に、上記の菌の菌体(Y1)や上記のフラクトシルトランスフェラーゼ(Y2)を作用させると、フラクトオリゴ糖と共にネオフラクトオリゴ糖を効率的に得ることができる。菌体(Y1)またはフラクトシルトランスフェラーゼ(Y2)の作用温度は４０〜６０℃、ｐＨは４〜６であることが好ましい。
【００２１】ここでフラクトオリゴ糖とは、先に述べたように、１−ケストース、ニストース、１−フラクトシルニストースなどであり、ネオフラクトオリゴ糖とは、ネオケストース、ネオニストース、ネオフラクトシルニストースなどである。ちなみに、１−ケストースの構造式は次の化１、ネオケストースの構造式は次の化２で示される。
【００２２】
【化１】
【００２３】
【化２】
【００２４】オウレオバシディウム属やアスペルギルス属の菌から産生される既存のフラクトシルトランスフェラーゼは、シュクロース等の基質のフラクトースにフラクトースがβ−１，２結合したイヌリン型のフラクトオリゴ糖のみを生成する。すなわち、G-(F)n → G-(F)n+1 ＋ G-(F)n-1の転移反応を触媒する。なお、基質(G-(F)n)のｎが１の場合（シュクロースの場合）はグルコースが遊離する。この転移反応は、同一分子間のフラクトース転移反応である。
【００２５】これに対し、本発明で用いているペニシリウム・シトリヌム FERM P-15944 の産生するフラクトシルトランスフェラーゼは、シュクロース等の基質から、下記の化３の反応を触媒する。なお、基質(G-(F)n)のｎが１の場合（シュクロースの場合）はグルコースを遊離する。
【００２６】
【化３】
【００２７】そして、上記の(i) のネオフラクトオリゴ糖は、本酵素の転移反応基質にはならない。この点がこの転移反応で重要なことである。
【００２８】基質からのネオフラクトオリゴ糖転移率は基質濃度に依存し、基質濃度が高いほどネオフラクトオリゴ糖の転移率が高くなる。このことは、ネオフラクトオリゴ糖生産上非常に重要なことである。後述の図２は、基質（シュクロース）濃度とネオフラクトオリゴ糖転移率との関係を示したグラフである。基質濃度は、 Brix ３０以上、４０以上、５０以上、６０以上というように、高くなるほど好ましい。基質シュクロース濃度 Brix ７０の場合、フラククトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖との合計転移率は５５〜６０％と非常に高い。
【００２９】本発明の方法によれば、１−ケストース、ニストース、１−フラクトシルニストースなどのフラクトオリゴ糖と同時に、ネオケストース、ネオニストース、ネオフラクトシルニストースなどのネオフラクトオリゴ糖が得られるが、通常は生成したフラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖とを分離するには及ばないので、そのまま種々の用途に用いる。
【００３０】得られたネオフラクトオリゴ糖は、そのすぐれた保湿作用、好甘味、低カロリー性、抗う蝕作用、腸内細菌の増殖作用、腸管局所免疫増強作用などの諸機能を生かして、甘味料、機能性食品、飼料、医薬、植物の防疫促進剤をはじめ、多方面に利用することができる。
【００３１】〈作用〉下記の表２は、基質がシュクロースであるときに、その基質にペニシリウム・シトリヌム FERM P-15944 菌の産生するフラクトシルトランスフェラーゼを作用させたときの転移反応をモデル的に示したものである。
【００３２】
【表２】
【００３３】ルートＡは、既存のフラクトシルトランスフェラーゼを用いたときの一連の転移反応を示したものであり、シュクロース→１−ケストース→ニストース→１−フラクトシルニストースを経るというように、より高次のフラクトオリゴ糖が生成していく。
【００３４】これに対し、本発明者が見い出したペニシリウム・シトリヌム FERM P-15944が産生するフラクトシルトランスフェラーゼは、ルートＡの転移反応と共に、ルートＢの転移反応も触媒する。ルートＢは、シュクロース→ネオケストースの転移反応を含むが、その転移反応物であるネオケストースを新たな基質としては反応は進行しない。一段高次のネオニストースは、同時に生成した１−ケストースの転移反応により得られるのである。同様にこのときの転移反応物であるネオニストースを新たな基質としては反応は進行しない。より高次のネオフラクトシルニストースは、ニストースを経て生成した１−フラクトシルニストースの転移反応により得られるのである。
【００３５】基質としてのシュクロースにペニシリウム・シトリヌム FERM P-15944 が産生するフラクトシルトランスフェラーゼを作用させたときの反応経時的な糖組成は後述の図３の通りであり、ネオフラクトオリゴ糖の転移率が高く、フラクトオリゴ糖とネオフラクトオリゴ糖との合計転移率も非常に高いのが特徴である。
【００３６】
【実施例】次に実施例をあげて本発明を詳細に説明する。
【００３７】実施例１、比較例１〜２予備的実験として、オウレオバシディウム FERM P-4257菌（比較例１）、アスペルギルス・ジャポニクス Mu-2 菌（比較例２）、ペニシリウム・シトリヌム FERM P-15944 菌（実施例１）がそれぞれ産生する３種のフラクトシルトランスフェラーゼをシュクロースに作用させ、生成したフラクトオリゴ糖（１−ケストース、ニトース）を高速液体クロマトグラフィー (使用カラム SCR-101N)で経時的に定量して、横軸に１−ケストースを、縦軸にニストース（いずれも重量％）をプロットしたところ、図１に示すようなフラクトオリゴ糖曲線が得られた。なおこのカラムによっては、１−ケストースとネオケストースとは分離できないので、１−ケストースにはネオケストースの分も含まれている。
【００３８】オウレオバシディウム FERM P-4257菌（比較例１）、アスペルギルス・ジャポニクス Mu-2 菌（比較例２）が産生するフラクトシルトランスフェラーゼを用いた場合は、全く同じフラクトオリゴ糖曲線になるが、ペニシリウム・シトリヌムFERM P-15944 菌（実施例１）が産生するフラクトシルトランスフェラーゼを用いた場合は、異なったフラクトオリゴ糖曲線になることを見い出した。
【００３９】本発明者は、図１に示されたフラクトオリゴ糖曲線の相違の原因を、１−ケストースの構造異性体が生成するためと判断して、定性および定量分析した結果、ペニシリウム・シトリヌム FERM P-15944 菌（実施例１）が産生するフラクトシルトランスフェラーゼを用いた場合には、先に述べた表１のルートＢとルートＡの転移反応が同時に行われていることを見い出したのである。
【００４０】実施例２〈菌の培養と酵素の産生〉本発明者が土中から分離したペニシリウム・シトリヌム FERM P-15944 菌を、下記の培地で液体培養した。すなわち、１リットルの水道水に、シュクロース（グラニュー糖）１００ｇ、NaNO3 ２ｇ、 K2HPO4 １ｇ、KCl １ｇ、 MgSO4・H2O１ｇ、 FeSO4・7 H2O 0.02 ｇ、粉末酵母５ｇを加え、ｐＨを 6.4に調整することにより、培地を作った。この培地を容量 1.5リットルの培養槽に入れて１１５℃で２０分間殺菌後、４８時間培養した５０mlの種菌を接種し、３０℃で通気撹拌培養した。通気量は５００ml/minとし、撹拌は１００rpm の回転速度で行った。７２時間培養後、菌体を遠心分離で分取した。得られた菌体は８０ｇ（水分８０重量％）であり、１ｇの菌体の酵素力価は５００u/gr菌体、培養ろ過液中の酵素力価は２u/mlであった。
【００４１】酵素力価の測定は、結晶精製シュクロースを濃度 Brix ５０（重量％）に調整し、ｐＨ 5.0にて、このシュクロース液１００ｇに上記の菌体（水分８０重量％） 0.5ｇを添加し、５５℃、１００rpm で３０分間反応後、高速液体クロマトグラフィーでグルコースを定量することにより行った。液体クロマトグラフィーのカラムとしては、ダイソー株式会社製の「DAISO PAK.sp-120-5.DDS-B」を使用した。酵素力価は、１μ-molグルコース／１分＝１ｕとした。
【００４２】〈転移反応〉上記で得た菌体を、シュクロースに対して１重量％添加し（つまりシュクロース１ｇ当り５ｕの酵素を添加したことになる）、ｐＨ 5.0、温度５０℃で、シュクロース濃度をBrix１０，２０，３０，５０，７０にして反応させた。４０時間後に液体クロマトグラフィーにてネオフラクトオリゴ糖を定量したところ、図２の結果が得られた。基質のシュクロース濃度が高いほどシュクロースからのネオフラクトオリゴ糖の生成量は多くなるが、総オリゴ糖の量（ネオフラクトオリゴ糖とフラクトオリゴ糖との合計量）は、基質シュクロース固形物に対して一定（５５〜６０％）であることがわかる。
【００４３】基質シュクロース濃度 Brix ７０における反応経過時間ごとのネオフラクトオリゴ糖（ネオケストース、ネオニストース、ネオフラクトシルニストース）およびフラクトオリゴ糖（１−ケストース、ニストース、フラクトシルニストース）のシュクロースからの転移率は図３に示す通りである。また反応時間（４０時間）におけるネオフラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖の糖組成は、下記の表３に示す通りである。シュクロースからのネオフラクトオリゴ糖（ネオケストース、ネオニストース、ネオフラクトシルニストース）の転移率は約２０％であった。なお、酵素は菌体を直接使用し、酵素量は５(u)/grシュクロースである。
【００４４】
【表３】
生 成 物 転移率(%) グルコース(G) 31.63 % シュクロース(GF) 11.62 % オリゴ糖 56.74 % ・フラクトオリゴ糖 36.85 % １−ケストース(GF2) 21.80 % ニストース(GF3) 14.05 % １−フラクトシルニストース(GF4) 1.00 % ・ネオフラクトオリゴ糖 19.89 % ネオケストース(FGF) 10.51 % ネオニストース(FGF2) 8.01 % ネオフラクトシルニストース(FGF3) 1.28 % 合計 100.0％
【００４５】Brix ７０で４０時間反応後の液体クロマトグラフィー分析結果を図４に示す。Ｐ1 はネオケストース、Ｐ2 はネオニストース、Ｐ3 はネオフラクトシルニストースのピークを示している。
【００４６】上記で得られたネオフラクトオリゴ糖含有液（Brix７０）を１００ｇ分取して、それにメタノール１００mlを添加し、３０℃でよく撹拌後、０℃で２４時間放置し、その間に沈澱した物質を遠心分離で分取した。分取量は２０ｇであった。減圧乾燥後、蒸留水を加えて２０％溶液とした。この２０％溶液の高速液体クロマトグラフィー分析結果を図５に示す。
【００４７】さらに、高速液体クロマトグラフィー（使用カラム「DAISO PAK.sp-120-5.VDS-B）で、ネオケストース、ネオニストース、ネオフラクトシルニストースをそれぞれ１０mg、５mg、３mg秤取した。これら３種の粉末を各々メチル化アルジトール・アセテート分析、さらには重クロロホルム溶液13Ｃ−ＮＭＲ分析した結果、シュクロース、１−ケストース、ニストースのグルコースにフラクトースが１分子、Fruct β2-６Glu に結合したネオフラクトオリゴ糖であることが明らかになった。
【００４８】
【発明の効果】本発明によれば、次のようなすぐれた効果が奏される。
（ａ）本発明者が分離したペニシリウム・シトリヌム FERM P-15944 菌を液体培養することにより産生されるフラクトシルトランスフェラーゼを、シュクロース（またはシュクロースのフラクトースにフラクトースがβ−１，２結合した構造のフラクトオリゴ糖）に作用させると、ネオフラクトオリゴ糖を２０％も含有する糖液を工業的に生産することができる。
（ｂ）高基質濃度（たとえば Brix ７０）で、ネオフラクトオリゴ糖の転移反応が最大になる転移反応であるため、工業生産上のメリットが大である。
（ｃ）シュクロース（またはシュクロースのフラクトースにフラクトースがβ−１，２結合した構造のフラクトオリゴ糖）から、腸内有用菌の増殖作用、腸管局所免疫増強作用、植物の防疫促進作用をはじめとする特徴ある特性を持つ糖が工業的に得られるので、新しい機能をもつ食品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】アスペルギルス・ジャポニクス Mu-2 菌、オウレオバシディウム FERM P-4257菌、ペニシリウム・シトリヌム FERM P-15944 菌が産生するフラクトシルトランスフェラーゼをシュクロースに作用させたときのフラクトオリゴ糖曲線を示す図である。
【図２】基質（シュクロース）濃度とネオフラクトオリゴ糖への転移率との関係を示す図である。
【図３】基質（シュクロース）濃度 Brix ７０における反応経過時間ごとのネオフラクトオリゴ糖生成との関係を示す図である。
【図４】ネオフラクトオリゴ糖含有糖液の高速液体クロマトグラフィー分析表を示す図である。
【図５】図４で示した糖組成の糖液をメタノールで精製したフラクトオリゴ糖含有液の高速液体クロマトグラフィー分析表を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】基質であるシュクロース(X1)または／およびシュクロースのフラクトースにフラクトースがβ−１，２結合した構造のフラクトオリゴ糖(X2)に、ペニシリウム・シトリヌム(Penicillium citrinum) FERM P-15944 菌の菌体(Y1)または／およびその菌が産生する菌体内または菌体外酵素であるフラクトシルトランスフェラーゼ (β-fructo-franosidase)(Y2)を作用させて、フラクトオリゴ糖と共にネオフラクトオリゴ糖を生成させることを特徴とするネオフラクトオリゴ糖の製造法。
【請求項２】ネオフラクトオリゴ糖が、ネオケストース(6G-β-fructofranosyl-Sucrose)、ネオニストース(6G-β-fructofranosyl-Kestose)およびネオフラクトシルニストース(6G-β-fructofranosyl-Nystose)の少なくとも１種である請求項１記載の製造法。
【請求項３】基質濃度が Brix ３０以上である請求項１記載の製造法。
【請求項１】基質であるシュクロース(X1)または／およびシュクロースのフラクトースにフラクトースがβ−１，２結合した構造のフラクトオリゴ糖(X2)に、ペニシリウム・シトリヌム(Penicillium citrinum) FERM P-15944 菌の菌体(Y1)または／およびその菌が産生する菌体内または菌体外酵素であるフラクトシルトランスフェラーゼ (β-fructo-franosidase)(Y2)を作用させて、フラクトオリゴ糖と共にネオフラクトオリゴ糖を生成させることを特徴とするネオフラクトオリゴ糖の製造法。
【請求項２】ネオフラクトオリゴ糖が、ネオケストース(6G-β-fructofranosyl-Sucrose)、ネオニストース(6G-β-fructofranosyl-Kestose)およびネオフラクトシルニストース(6G-β-fructofranosyl-Nystose)の少なくとも１種である請求項１記載の製造法。
【請求項３】基質濃度が Brix ３０以上である請求項１記載の製造法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【特許番号】特許第３０５８６００号（Ｐ３０５８６００）
【登録日】平成１２年４月２１日（２０００．４．２１）
【発行日】平成１２年７月４日（２０００．７．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願平８−３３３７４９
【出願日】平成８年１２月１３日（１９９６．１２．１３）
【公開番号】特開平１０−１６５１９２
【公開日】平成１０年６月２３日（１９９８．６．２３）
【審査請求日】平成１０年１１月２４日（１９９８．１１．２４）
【微生物の受託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１５９４４
【出願人】（５９６１８０００９）
【出願人】（５９１０１４５８１）日本オリゴ株式会社 (4)
【登録日】平成１２年４月２１日（２０００．４．２１）
【発行日】平成１２年７月４日（２０００．７．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成８年１２月１３日（１９９６．１２．１３）
【公開番号】特開平１０−１６５１９２
【公開日】平成１０年６月２３日（１９９８．６．２３）
【審査請求日】平成１０年１１月２４日（１９９８．１１．２４）
【微生物の受託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１５９４４
【出願人】（５９６１８０００９）
【出願人】（５９１０１４５８１）日本オリゴ株式会社 (4)
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