バイオコンビケムによる化合物ライブラリーの効率的な生産方法
【課題】 多種多様な化合物を含むライブラリーを構築するための、バイオコンビナトリアル手法を用いた効率のよい方法を提供する。
【解決手段】 複数の酵素分子種を用いることを特徴とする化合物ライブラリーの構築方法。
【解決手段】 複数の酵素分子種を用いることを特徴とする化合物ライブラリーの構築方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオコンビケムによる化合物ライブラリーの作成方法、詳細には、複数の酵素分子種を用いることを特徴とする化合物ライブラリーの作成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の創薬においては、医薬品の標的となる受容体などの生体分子に、事前に合成しておいた、分子量約５００以下の低分子有機化合物を反応させて、その候補を絞り込むのが基本手法となっている。この手法を採る場合、できるだけ膨大な種類の化合物を持っていればいるほど創薬に成功する可能性が高くなる。そこで多くの製薬企業や研究機関では、多種類の化合物を効率的に作り出すコンビナトリアルケミストリー（コンビケム）の手法を用いて、化合物ライブラリーの充実に努めている。
【０００３】
しかし、従来の化学合成法では困難あるいは不可能な反応も多くあり、これらの困難な反応をあえて実行しようとすれば、収率が悪い、コストがかかる等の不利を被らなくてはならなかった。例えば、薬物のヒトなどへの投与が最終目的であることを考慮すると、薬物の薬効を失うことなく水溶性を高めることが重要となり、例えば、ベンゼン環の特定の位置に水酸基を導入することにより薬物の水溶性を高めることが必要である。しかしながら、このような反応は従来の有機化学的手法では容易なことではない。このため、コンビケムで得られる化合物は比較的合成しやすい化合物に偏りがちであった。
【０００４】
こうした化学合成法の欠点を克服するために、酵素によるバイオ変換法が用いられるようになってきた。しかしながら、酵素は本来的に基質特異性が高く、多種多様な反応生成物を作り出すという目的には不向きである。大腸菌などに目的とする酵素の遺伝子を導入して大量発現させ、これをバイオ変換反応に用いることも行われているが（特許文献１、非特許文献１および２参照）、基質特異性の問題のほかに、酵素反応産物を培地から分離・精製するには時間とコストが多くかかるという問題もある。酵素を改変して多様性を持たせようとする試みもなされており、例えばＤＮＡシャッフリング法を用いた研究なども行われているが（非特許文献３参照）、ＤＮＡシャッフリング法による新規酵素の発見にはコストと時間がかかる為、一般化していない。
【０００５】
近年、チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ（以下、「Ｐ４５０」ということがある）が多様な基質特異性を有することが明らかにされ、その代謝産物について研究されている。この酵素を発現する大腸菌をＭ９培地にて培養することによるバイオ変換の研究例もある（非特許文献４参照）。しかしながら、バイオ変換を創薬に応用すること、すなわち、本発明のように、複数の酵素分子種を組み合わせて使用して、化合物ライブラリーを構築することは、これまで全く行われていなかった。
【特許文献１】米国特許第６５６６１０８号明細書
【非特許文献１】Appl. Environ. Microbiol. (2003) 69, 6688-6697
【非特許文献２】Tetrahedron (2002) 58, 9605-9612
【非特許文献３】Reetz M. T., Proc. Natl. Acad. Sci. (2004) 101, 5716-5722
【非特許文献４】Eur. J. Biochem. (1999) 259, 731-738
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、従来の化学合成、バイオ変換およびＤＮＡシャッフリングなどの方法の欠点を克服し、より多種多様な化合物のライブラリーを効率的に構築するための方法を提供することが、本発明の課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意研究を行い、複数の酵素分子種を組み合わせて反応に用いることにより、上記欠点が克服され、多種多様な化合物を含むライブラリーが効率的に得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は下記の発明を提供するものである：
（１）複数の酵素分子種を用いることを特徴とする化合物ライブラリーの構築方法；
（２）酵素分子種が細胞により産生されるものである（１）に記載の方法；
（３）細胞が形質転換細胞である（２）に記載の方法；
（４）細胞が大腸菌である（２）または（３）に記載の方法；
（５）ＩＵ培地を用いることを特徴とする（２）〜（４）のいずれかに項記載の方法；
（６）固定化された酵素分子種または細胞を用いることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載の方法；
（７）酵素分子種がチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ分子種である（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、多種多様な化合物を含むライブラリーを構築するための、バイオコンビケム手法による効率のよい方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の化合物ライブラリーの構築方法の特徴は、複数の酵素分子種を用いるバイオコンビケム手法によるものである。なお、「酵素分子種」とは、ある酵素に着目した場合、個々の生物種により産生される個々の当該酵素、ならびに同じ生物種において産生される当該酵素の個々のアイソザイムをいう。例えば、Ｐ４５０分子種という場合には、植物のごとき他の生物種に存在するそれぞれのＰ４５０分子種を指してもよく、あるいはヒトにおける複数の分子種のそれぞれを指してもよい。また、「複数」の酵素分子種とは、２種またはそれ以上の酵素分子種をいう。後で説明するように、複数の酵素分子種は、同一、類似または異なる酵素の分子種であってよい。
【００１１】
バイオコンビケムを成功させるための条件は、（ｉ）使用する酵素が多様な反応を触媒するものであること；（ｉｉ）使用する酵素の基質特異性が低いこと；（ｉｉｉ）酵素反応産物の精製が容易であること；（ｉｖ）酵素反応を連続的に行うことができることであり、酵素自体に要求されるのは（ｉ）と（ｉｉ）である。単一の酵素分子種で上記（ｉ）および（ｉｉ）の条件をいずれも満たすものを見出すことは困難と思われるので、複数の酵素分子種を組み合わせて反応に使用する。複数の酵素分子種を用いることにより、反応に多くのバリエーションが生じ、得られる生成物も多種多様なものとなる。また、酵素反応を用いることにより、従来の化学合成では不利とされていた反応、例えば水溶性の低い分子に対する水酸基導入反応も比較的容易に行うことができる。
【００１２】
本発明の方法に用いられる酵素はいずれのものであってもよいが、多種多様な分子種が存在するものが好ましい。本発明の方法に用いられる好ましい酵素分子種は、Ｐ４５０、メチル基転移酵素、糖転移酵素、リン酸化酵素（リン転移酵素）、脱リン酸化酵素（リン脱離酵素）、ＡＤＰリボシル基転移酵素、脱水素酵素、硫酸転移酵素、アミノ基転移酵素などである。なかでも、酸化的解毒酵素であるＰ４５０は多様な基質特異性を有し、その分子種も幅広い生物種に存在し、多種多様であるので、本発明の方法には特に好ましいものである。
【００１３】
複数の酵素分子種を本発明の方法に使用するにあたり、同一酵素の複数の分子種を使用してもよく、異なる酵素の分子種を複数使用してもよい。例えば、Ｐ４５０の３種の分子種を反応に用いてもよく、Ｐ４５０の２種の分子種およびメチル基転移酵素の１種の分子種を反応に用いてもよい。さらに、例えば、Ｐ４５０の４種の分子種、メチル基転移酵素の３種の分子種、および糖転移酵素の２種の分子種を反応に用いてもよい。酵素分子種の種類およびそれらの組み合わせ方は、目的とするライブラリーを構成する化合物の性質その他の条件に応じて変更することができる。
【００１４】
本発明の方法に用いられる酵素分子種は、遊離酵素として反応系に存在してもよいが、連続反応に適していることおよび酵素反応産物の単離・精製のし易さから、担体に固定化された状態で反応系に存在することが好ましい。酵素の固定化法や固定化担体は当業者によく知られている。酵素の固定化法としては、例えば、吸着法、共有結合法、包括法などがあり、固定化担体としては、例えば、種々のゲル、多孔性ビーズ、膜などがある。酵素分子種は均一に精製されていることが好ましいが、粗標品であってもよく、部分精製標品であってもよい。反応生成物の単離・精製の容易さからすると、精製段階の進んだものが好ましい。また、目的酵素を産生する細胞を酵素源として反応に用いてもよい。また、使用すべき酵素分子種の遺伝子をベクターに組み込み、これを細胞に導入して形質転換することにより、目的酵素分子種を発現するようになった細胞を反応に用いることも好ましい。酵素は細胞内、細胞外いずれに産生されるものであってもよいが、酵素反応産物の単離・精製のし易さから、一般的には細胞外酵素が好ましい。細胞を用いた場合、細胞は公知の遠心分離等の手段により反応系から除去することができるので、反応産物の単離・精製が容易になる。かかる細胞を担体に固定化して用いてもよく、そうすることにより、さらに酵素反応産物の単離・精製が容易となり、連続反応も容易となる。
【００１５】
細胞の形質転換は、１の酵素分子種をコードする遺伝子を含む１または複数のベクターを用いて行ってもよく、あるいは複数の酵素分子種をコードする遺伝子を含む１または複数のベクターを用いて行ってもよい（通常には、このようにして発現される酵素分子種は融合蛋白の形態である）。例えば、１のＰ４５０分子種のみをコードする遺伝子を含むベクターを用いて細胞を形質転換させてもよく、１のＰ４５０分子種をコードする遺伝子を含むベクターと別のＰ４５０分子種をコードする遺伝子を含むベクターを用いて細胞を同時形質転換させてもよい。また、例えば、Ｐ４５０分子種をコードする遺伝子とメチル基転移酵素分子種をコードする遺伝子とを連結したものを含むベクターを用いて細胞を形質転換させてもよい。これらの遺伝子は、生物からクローニングして得てもよく、あるいは既存の遺伝子ライブラリーから選択してもよい。
【００１６】
形質転換に用いられる細胞はいずれの種類のものであってもよく、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞のごとき真核細胞、細菌細胞のごとき原核細胞を、適宜選択して用いることができる。本発明の方法に用いられる好ましい細胞としては、動物細胞であればＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ ２９３等、植物細胞であればＢＹ２等、昆虫細胞であれはＳＦ９等、真菌細胞であれば酵母等、細菌細胞であれば大腸菌、枯草菌、放線菌、乳酸菌、好熱菌等が挙げられる。これらの細胞は、発現させるべき酵素分子種、所望の反応の種類、あるいは所望の化合物の性質等に応じて選択することができる。これらの細胞の形質転換に用いるベクターも当業者によく知られており、使用する細胞の種類その他の因子に応じて選択し、使用することができる。例えば、動物細胞用ベクターとしてはｐＣＭＶ等、植物細胞用ベクターとしてはｐＢＩ１２１等、昆虫細胞用ベクターとしてはｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ等、真菌細胞用ベクターとしてはｐＡＡＨ５、ｐＡＵＲ１２３等、細菌細胞用ベクターとしてはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、およびＭ１３バクテリオファージを基礎としたもの、λバクテリオファージを基礎としたもの等が挙げられる。さらに、これらの細胞の形質転換法も当業者によく知られており、カルシウムイオンを用いてコンピテントな細胞にベクターを導入する方法、エレクトロポレーション、遺伝子銃など、種々の方法を適宜選択して用いることができる。
【００１７】
酵素反応の基質は、目的とする生成物に応じて決定されるが、使用する酵素分子種の種類、反応の種類等の因子も考慮される。基質としては有機化合物が適当であり、その分子量については特に制限はないが、一般的には約１０００以下、好ましくは約５００以下である。例えば、基質としてエストロゲン、酵素分子種としてＰ４５０分子種を用いて反応を行ってもよい。また、例えば基質としてオリゴ糖などの糖類を用い、酵素分子種として糖転移酵素分子種を用いてもよい。また、基質としてアミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどを用いて、これらにメチル基転移酵素を作用させて修飾を行ってもよい。本発明の方法に使用する酵素分子種、基質、反応の種類については特に制限はなく、目的とする化合物ライブラリーの特性に応じて選択することができる。
【００１８】
反応は、複数の酵素分子種と基質とを接触させることにより行う。複数の酵素分子種を１の反応系にて反応させてもよく、いくつかの反応系に分けて反応を行ってもよい。上述のごとく、酵素分子種は遊離のものであってもよく、固定化されていてもよい。あるいは細胞を酵素源として用いてもよい。細胞は固定化されたものであってもよい。細胞を用いて反応を行う場合には、通常には、基質を添加した培地中で細胞を培養する。培地は使用細胞の種類や性質に適合したものを選択すべきである。細胞の選択と同様、培地の選択も当業者が適宜なし得ることである。動物細胞用培地としてはＥａｇｌｅ培地等、植物細胞用培地としてはＭＳ培地等、昆虫細胞用培地としてはＧｒａｃｅ培地、ＴＣ−１００培地等、真菌細胞用培地としてはＹＰＤ培地、ＳＤ培地等、細菌細胞用培地としてはＬＢ培地、ＹＭ培地等が挙げられる。例えば、形質転換された大腸菌を用いる場合には、一般的にはＬＢ培地、Ｍ９培地等が用いられるが、本発明者らは、ＩＵ培地を開発し、酵素反応産物の検出および単離・精製を飛躍的に容易化させた。ＩＵ培地については実施例にて詳述する。
【００１９】
温度、ｐＨ、通気等の反応条件は、使用する酵素分子種の最適温度、最適ｐＨ等、あるいは使用する細胞の最適生育条件等を考慮することにより決定することが望ましい。このような反応条件の決定も、当業者が容易になし得ることである。
【００２０】
酵素反応産物の単離・精製方法もまた当業者によく知られている。例えば、有機溶媒による抽出法、種々の沈殿法、ＨＰＬＣを包含する各種クロマトグラフィー（例えば、吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー）等を、単離・精製すべき化合物に応じて適宜選択して使用することができる。
【００２１】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００２２】
Ｐ４５０遺伝子組み込んだベクターの構築および形質転換体の取得
分子種としてＰ４５０ ＣＹＰ２ｃ２９（マウス由来）、ＣＹＰ２ｃ４３（サル由来）、ＣＹＰ２ａ４（マウス由来）を選択した（いずれも神戸大学遺伝子実験センター遺伝子ライブラリーから選択）。参考として、Ｐ４５０ ２ｃ２９の塩基配列を配列表の配列番号：１に示す。常法によりこれらのＰ４５０遺伝子をＰＣＲにて増幅した。ＮＡＤＰＨチトクロームＰ４５０レダクターゼ遺伝子（神戸大学遺伝子実験センター遺伝子ライブラリーに保存されている）も別途ＰＣＲにて増幅した。ベクター構築の際にＮＡＤＰＨチトクロームＰ４５０レダクターゼ遺伝子もベクター中に組み込んで、選択したＰ４５０分子種と同時発現させるようにした（そのスキームをＰ４５０ ２ｃ２９の場合を例にとって図１に示す）。ＮＡＤＰＨチトクロームＰ４５０レダクターゼ遺伝子を同時発現させることによりＰ４５０への電子供給を行うためである。
なお、Ｐ４５０ ２ｃ２９のＮ末端から２番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したものは、ネイティブな２ｃ２９よりもＰ４５０発現量が多くなることがわかった（データ示さず）。以下において、２ｃ２９という場合には、ネイティブな２ｃ２９のＮ末端から２番目のアスパラギン酸がアラニンに置き換わっている分子種をいう。
このようにして得られたベクターを、塩化カルシウム法により大腸菌ＤＨ５α株に導入し、形質転換を行った。得られた形質転換体の培養は表１に示すように行った。培地としてはＬＢ培地およびＩＵ培地を用いた。なおＩＵ培地の調製法は表２に示すとおりである。
表１
形質転換体の培養方法
（１）前培養
アンピシリン（１００μＭ）を添加した５０ｍｌのＩＵまたはＬＢ培地中、３７℃で２日間培養する。
（２）本培養
（ｉ）５００ｍｌのフラスコ中にアンピシリン（１００μＭ）およびグルコース（０．２％ ｗ／ｗ）を添加した１００ｍｌのＩＵまたはＬＢ培地を入れる。
（ｉｉ）前培養１ｍｌを上記１００ｍｌのＩＵまたはＬＢ培地に添加する。
（ｉｉｉ）Ｏ．Ｄ．６００＝０．２になるまで３７℃で培養する。
（ｉｖ）２５℃で１時間インキュベーションする。
（ｖ）１００μｌの０．１Ｍ ＩＰＴＧ（最終濃度１００μＭ）、１００μｌの０．１Ｍデルタアミノレブリン酸（最終濃度５００μＭ）および基質を添加する。
（ｖｉ）２５℃で２日間、１６０ｒｐｍで回転培養する
（ｖｉｉ）３０００ｇで１０分間遠心分離する。
表２
ＩＵ培地の調製方法
（１）調合物Ａ：
Ｎａ２ＨＰＯ４ ６ｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ３ｇ
ＮａＣｌ ０．５ｇ
Ｈ２Ｏを添加して９８０ｍｌとする。
（２）調合物Ｂ：
ＮＨ４Ｃｌ １ｇ
グルコース ２ｇ
チアミン １０ｍｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２４６ｍｇ
ＣａＣｌ２ １４．７ｍｇ
Ｈ２Ｏを添加して２０ｍｌとする。
（３）調合物Ａをオートクレーブしたものと、調合物Ｂを除菌濾過したものを混合する。
【実施例２】
【００２３】
ＬＢ培地とＩＵ培地の比較
実施例１で得られた、ＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体を用いて、ＬＢ培地およびＩＵ培地におけるＰ４５０濃度を比較した。Ｐ４５０濃度の測定は、Omura T, Sato R., THE CARBON MONOXIDE-BINDING PIGMENT OF LIVER MICROSOMES. I. EVIDENCE FOR ITS HEMOPROTEIN NATURE, J. Biol. Chem. (1964) 239, 2370-2378に記載の方法により行った。図２に示すように、培養３時間目でＬＢ培地においてＰ４５０濃度が若干高かったが、ＩＵ培地はＬＢ培地と同様に使用できることがわかった。
次に、基質としてエストロゲン（最終濃度１０μＭ）を含有するＬＢ培地およびＩＵ培地にてＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体を培養し、培養上清の酢酸エチル抽出物（有機相）をＨＰＬＣにより分析した。検出は２１０ｎｍにおける吸光度によった。ＬＢ培地では代謝産物が１種類（図３パネル（ａ）、矢印ｍで示す、保持時間約５分）検出された。ＩＵ培地ではバックグラウンドが低く（特に保持時間の短い部分）、ＬＢ培地で検出された代謝産物のほかに、さらにもう１つの代謝産物（図３パネル（ｂ）、左の矢印ｍで示す、保持時間約４．５分）が検出された。これらの結果は、ＩＵ培地を用いるとバイオコンビケムによる代謝物の検出および単離・精製がきわめて容易であることを示すものである。そこで、以下の実験ではＩＵ培地を用いることにした。
【実施例３】
【００２４】
複数の酵素分子種を用いたテストステロンの代謝実験
酵素分子種としてＰ４５０ ＣＹＰ２ａ４およびＣＹＰ２ｃ２９を選択し、実施例１記載の方法により形質転換体を得た。基質としてテストステロン（最終濃度１０μＭ）を用いて形質転換体を培養し、その培養上清を酢酸エチルで抽出してＨＰＬＣにて生成物を調べた。検出は２１０ｎｍにおける吸光度によった。ＣＹＰ２ａ４による形質転換体を用いた場合、３種の代謝産物（図４パネル（ａ）、矢印ｍで示す、保持時間それぞれ約１１分、約１２．５分および約１６分）が検出された。ＣＹＰ２ｃ２９による形質転換体を用いた場合にも、ＣＹＰ２ａ４による形質転換体を用いた場合と同じ保持時間のところに３種の代謝産物（図４パネル（ｂ）、矢印ｍで示す）が検出された。
ＣＹＰ２ａ４による形質転換体およびＣＹＰ２ｃ２９による形質転換体を同時培養した場合には、図４パネル（ｃ）に示すように、各形質転換体を用いた場合の３種の代謝産物のほかに、さらに３種の代謝産物（矢印ｄで示す、保持時間約１１．５分、約２０分および約２２分）が検出された。
【実施例４】
【００２５】
複数の酵素分子種を用いたエストラジオールの代謝実験
酵素分子種としてＰ４５０ ＣＹＰ２ａ４およびＣＹＰ２ｃ４３を選択し、実施例１記載の方法により形質転換体を得た。基質としてエストラジオール（最終濃度１０μＭ）を用いて形質転換体を培養し、その培養上清を酢酸エチルで抽出してＨＰＬＣにて生成物を調べた。検出は２１０ｎｍにおける吸光度によった。ＣＹＰ２ａ４による形質転換体を用いた場合、２種の代謝産物（図５パネル（ａ）、矢印ｍで示す、保持時間約５分および約１７分）が検出された。ＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体を用いた場合には、２種の代謝産物が検出された（図５パネル（ｂ）、矢印ｍで示す、保持時間約５分および約７．５分）。
ＣＹＰ２ａ４による形質転換体およびＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体を同時培養した場合には、図５パネル（ｃ）に示すように、３種の代謝産物が検出された（図５パネル（ｂ）、矢印ｍで示す、保持時間約５分、約７．５分および約１７分）。
図５の四角で囲んだ保持時間の短い領域のＨＰＬＣパターンを詳細に調べたところ、ＣＹＰ２ａ４による形質転換体を用いた場合ならびにＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体を用いた場合には、いずれも保持時間約１．５分のところに代謝産物が１つ検出されたが（図６（ａ）および（ｂ）、矢印ｍで示す）、ＣＹＰ２ａ４による形質転換体とＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体を同時培養した場合には、保持時間約２．５分のところに、さらなる代謝産物が検出された（図６（ｃ）、矢印（ｄ）で示す）。
【００２６】
以上の結果から、複数の酵素分子種を使用することにより、基質が逐次変換されて、多種多様な代謝産物が得られることが証明された。そのモデルを図７に示す。したがって、本発明のバイオコンビケム手法により、多種多様な化合物を含むライブラリーを効率よく構築することができる。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明によるバイオコンビナトリアル手法は、化合物のライブラリーの作成に利用可能であり、特に、創薬分野において利用価値が高い。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、実施例で使用した形質転換体を得るためのベクターの構築手順を示すスキームである。
【図２】図２は、Ｐ４５０分子種ＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体を培養した場合の、ＬＢ培地とＩＵ培地におけるＰ４５０濃度を比較した図である。
【図３】図３は、ＬＢ培地（パネル（ａ））とＩＵ培地（パネル（ｂ））における、Ｐ４５０分子種ＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体によるエストロゲン代謝産物の検出につき比較したＨＰＬＣチャートである。対照系（基質のみの系、および基質無添加系）のチャートは省略した。
【図４】図４は、形質転換体によるテストステロン代謝産物の検出を示すＨＰＬＣチャートである。パネル（ａ）はＰ４５０分子種ＣＹＰ２ａ４による形質転換体を用いた場合、パネル（ｂ）はＰ４５０分子種ＣＹＰ２ｃ２９による形質転換体を用いた場合、パネル（ｃ）はＰ４５０分子種ＣＹＰ２ａ４による形質転換体およびＰ４５０分子種ＣＹＰ２ｃ２９による形質転換体を同時培養した場合のチャートである。図中、ｔはテストステロン、ｍは代謝産物、ｄは同時培養により得られたさらなる代謝産物のピークを示す。対照系（基質のみの系、および基質無添加系）のチャートは省略した。
【図５】図５は、形質転換体によるエストラジオール代謝産物の検出を示すＨＰＬＣチャートである。パネル（ａ）はＰ４５０分子種ＣＹＰ２ａ４による形質転換体を用いた場合、パネル（ｂ）はＰ４５０分子種ＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体を用いた場合、パネル（ｃ）はＰ４５０分子種ＣＹＰ２ａ４による形質転換体およびＰ４５０分子種ＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体を同時培養した場合のチャートである。図中、ｅはエストラジオール、ｍは代謝産物のピークを示す。図中、四角で囲んだ部分を拡大したものが図６である。対照系（基質のみの系、および基質無添加系）のチャートは省略した。
【図６】図６は、形質転換体によるエストラジオール代謝産物の検出を示す、保持時間の短い領域のＨＰＬＣチャートである。パネル（ａ）はＰ４５０分子種ＣＹＰ２ａ４による形質転換体を用いた場合、パネル（ｂ）はＰ４５０分子種ＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体を用いた場合、パネル（ｃ）はＰ４５０分子種ＣＹＰ２ａ４による形質転換体およびＰ４５０分子種ＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体を同時培養した場合のチャートである。図中、ｍは代謝産物、ｄは同時培養により得られたさらなる代謝産物のピークを示す。対照系（基質のみの系、および基質無添加系）のチャートは省略した。
【図７】図７は、本発明によるバイオコンビケム手法を用いた化合物ライブラリーの構築機構を示す模式図である。酵素（Ａ）〜（Ｃ）はそれぞれ別個の酵素分子種を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオコンビケムによる化合物ライブラリーの作成方法、詳細には、複数の酵素分子種を用いることを特徴とする化合物ライブラリーの作成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の創薬においては、医薬品の標的となる受容体などの生体分子に、事前に合成しておいた、分子量約５００以下の低分子有機化合物を反応させて、その候補を絞り込むのが基本手法となっている。この手法を採る場合、できるだけ膨大な種類の化合物を持っていればいるほど創薬に成功する可能性が高くなる。そこで多くの製薬企業や研究機関では、多種類の化合物を効率的に作り出すコンビナトリアルケミストリー（コンビケム）の手法を用いて、化合物ライブラリーの充実に努めている。
【０００３】
しかし、従来の化学合成法では困難あるいは不可能な反応も多くあり、これらの困難な反応をあえて実行しようとすれば、収率が悪い、コストがかかる等の不利を被らなくてはならなかった。例えば、薬物のヒトなどへの投与が最終目的であることを考慮すると、薬物の薬効を失うことなく水溶性を高めることが重要となり、例えば、ベンゼン環の特定の位置に水酸基を導入することにより薬物の水溶性を高めることが必要である。しかしながら、このような反応は従来の有機化学的手法では容易なことではない。このため、コンビケムで得られる化合物は比較的合成しやすい化合物に偏りがちであった。
【０００４】
こうした化学合成法の欠点を克服するために、酵素によるバイオ変換法が用いられるようになってきた。しかしながら、酵素は本来的に基質特異性が高く、多種多様な反応生成物を作り出すという目的には不向きである。大腸菌などに目的とする酵素の遺伝子を導入して大量発現させ、これをバイオ変換反応に用いることも行われているが（特許文献１、非特許文献１および２参照）、基質特異性の問題のほかに、酵素反応産物を培地から分離・精製するには時間とコストが多くかかるという問題もある。酵素を改変して多様性を持たせようとする試みもなされており、例えばＤＮＡシャッフリング法を用いた研究なども行われているが（非特許文献３参照）、ＤＮＡシャッフリング法による新規酵素の発見にはコストと時間がかかる為、一般化していない。
【０００５】
近年、チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ（以下、「Ｐ４５０」ということがある）が多様な基質特異性を有することが明らかにされ、その代謝産物について研究されている。この酵素を発現する大腸菌をＭ９培地にて培養することによるバイオ変換の研究例もある（非特許文献４参照）。しかしながら、バイオ変換を創薬に応用すること、すなわち、本発明のように、複数の酵素分子種を組み合わせて使用して、化合物ライブラリーを構築することは、これまで全く行われていなかった。
【特許文献１】米国特許第６５６６１０８号明細書
【非特許文献１】Appl. Environ. Microbiol. (2003) 69, 6688-6697
【非特許文献２】Tetrahedron (2002) 58, 9605-9612
【非特許文献３】Reetz M. T., Proc. Natl. Acad. Sci. (2004) 101, 5716-5722
【非特許文献４】Eur. J. Biochem. (1999) 259, 731-738
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、従来の化学合成、バイオ変換およびＤＮＡシャッフリングなどの方法の欠点を克服し、より多種多様な化合物のライブラリーを効率的に構築するための方法を提供することが、本発明の課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意研究を行い、複数の酵素分子種を組み合わせて反応に用いることにより、上記欠点が克服され、多種多様な化合物を含むライブラリーが効率的に得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は下記の発明を提供するものである：
（１）複数の酵素分子種を用いることを特徴とする化合物ライブラリーの構築方法；
（２）酵素分子種が細胞により産生されるものである（１）に記載の方法；
（３）細胞が形質転換細胞である（２）に記載の方法；
（４）細胞が大腸菌である（２）または（３）に記載の方法；
（５）ＩＵ培地を用いることを特徴とする（２）〜（４）のいずれかに項記載の方法；
（６）固定化された酵素分子種または細胞を用いることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載の方法；
（７）酵素分子種がチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ分子種である（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、多種多様な化合物を含むライブラリーを構築するための、バイオコンビケム手法による効率のよい方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の化合物ライブラリーの構築方法の特徴は、複数の酵素分子種を用いるバイオコンビケム手法によるものである。なお、「酵素分子種」とは、ある酵素に着目した場合、個々の生物種により産生される個々の当該酵素、ならびに同じ生物種において産生される当該酵素の個々のアイソザイムをいう。例えば、Ｐ４５０分子種という場合には、植物のごとき他の生物種に存在するそれぞれのＰ４５０分子種を指してもよく、あるいはヒトにおける複数の分子種のそれぞれを指してもよい。また、「複数」の酵素分子種とは、２種またはそれ以上の酵素分子種をいう。後で説明するように、複数の酵素分子種は、同一、類似または異なる酵素の分子種であってよい。
【００１１】
バイオコンビケムを成功させるための条件は、（ｉ）使用する酵素が多様な反応を触媒するものであること；（ｉｉ）使用する酵素の基質特異性が低いこと；（ｉｉｉ）酵素反応産物の精製が容易であること；（ｉｖ）酵素反応を連続的に行うことができることであり、酵素自体に要求されるのは（ｉ）と（ｉｉ）である。単一の酵素分子種で上記（ｉ）および（ｉｉ）の条件をいずれも満たすものを見出すことは困難と思われるので、複数の酵素分子種を組み合わせて反応に使用する。複数の酵素分子種を用いることにより、反応に多くのバリエーションが生じ、得られる生成物も多種多様なものとなる。また、酵素反応を用いることにより、従来の化学合成では不利とされていた反応、例えば水溶性の低い分子に対する水酸基導入反応も比較的容易に行うことができる。
【００１２】
本発明の方法に用いられる酵素はいずれのものであってもよいが、多種多様な分子種が存在するものが好ましい。本発明の方法に用いられる好ましい酵素分子種は、Ｐ４５０、メチル基転移酵素、糖転移酵素、リン酸化酵素（リン転移酵素）、脱リン酸化酵素（リン脱離酵素）、ＡＤＰリボシル基転移酵素、脱水素酵素、硫酸転移酵素、アミノ基転移酵素などである。なかでも、酸化的解毒酵素であるＰ４５０は多様な基質特異性を有し、その分子種も幅広い生物種に存在し、多種多様であるので、本発明の方法には特に好ましいものである。
【００１３】
複数の酵素分子種を本発明の方法に使用するにあたり、同一酵素の複数の分子種を使用してもよく、異なる酵素の分子種を複数使用してもよい。例えば、Ｐ４５０の３種の分子種を反応に用いてもよく、Ｐ４５０の２種の分子種およびメチル基転移酵素の１種の分子種を反応に用いてもよい。さらに、例えば、Ｐ４５０の４種の分子種、メチル基転移酵素の３種の分子種、および糖転移酵素の２種の分子種を反応に用いてもよい。酵素分子種の種類およびそれらの組み合わせ方は、目的とするライブラリーを構成する化合物の性質その他の条件に応じて変更することができる。
【００１４】
本発明の方法に用いられる酵素分子種は、遊離酵素として反応系に存在してもよいが、連続反応に適していることおよび酵素反応産物の単離・精製のし易さから、担体に固定化された状態で反応系に存在することが好ましい。酵素の固定化法や固定化担体は当業者によく知られている。酵素の固定化法としては、例えば、吸着法、共有結合法、包括法などがあり、固定化担体としては、例えば、種々のゲル、多孔性ビーズ、膜などがある。酵素分子種は均一に精製されていることが好ましいが、粗標品であってもよく、部分精製標品であってもよい。反応生成物の単離・精製の容易さからすると、精製段階の進んだものが好ましい。また、目的酵素を産生する細胞を酵素源として反応に用いてもよい。また、使用すべき酵素分子種の遺伝子をベクターに組み込み、これを細胞に導入して形質転換することにより、目的酵素分子種を発現するようになった細胞を反応に用いることも好ましい。酵素は細胞内、細胞外いずれに産生されるものであってもよいが、酵素反応産物の単離・精製のし易さから、一般的には細胞外酵素が好ましい。細胞を用いた場合、細胞は公知の遠心分離等の手段により反応系から除去することができるので、反応産物の単離・精製が容易になる。かかる細胞を担体に固定化して用いてもよく、そうすることにより、さらに酵素反応産物の単離・精製が容易となり、連続反応も容易となる。
【００１５】
細胞の形質転換は、１の酵素分子種をコードする遺伝子を含む１または複数のベクターを用いて行ってもよく、あるいは複数の酵素分子種をコードする遺伝子を含む１または複数のベクターを用いて行ってもよい（通常には、このようにして発現される酵素分子種は融合蛋白の形態である）。例えば、１のＰ４５０分子種のみをコードする遺伝子を含むベクターを用いて細胞を形質転換させてもよく、１のＰ４５０分子種をコードする遺伝子を含むベクターと別のＰ４５０分子種をコードする遺伝子を含むベクターを用いて細胞を同時形質転換させてもよい。また、例えば、Ｐ４５０分子種をコードする遺伝子とメチル基転移酵素分子種をコードする遺伝子とを連結したものを含むベクターを用いて細胞を形質転換させてもよい。これらの遺伝子は、生物からクローニングして得てもよく、あるいは既存の遺伝子ライブラリーから選択してもよい。
【００１６】
形質転換に用いられる細胞はいずれの種類のものであってもよく、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞のごとき真核細胞、細菌細胞のごとき原核細胞を、適宜選択して用いることができる。本発明の方法に用いられる好ましい細胞としては、動物細胞であればＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ ２９３等、植物細胞であればＢＹ２等、昆虫細胞であれはＳＦ９等、真菌細胞であれば酵母等、細菌細胞であれば大腸菌、枯草菌、放線菌、乳酸菌、好熱菌等が挙げられる。これらの細胞は、発現させるべき酵素分子種、所望の反応の種類、あるいは所望の化合物の性質等に応じて選択することができる。これらの細胞の形質転換に用いるベクターも当業者によく知られており、使用する細胞の種類その他の因子に応じて選択し、使用することができる。例えば、動物細胞用ベクターとしてはｐＣＭＶ等、植物細胞用ベクターとしてはｐＢＩ１２１等、昆虫細胞用ベクターとしてはｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ等、真菌細胞用ベクターとしてはｐＡＡＨ５、ｐＡＵＲ１２３等、細菌細胞用ベクターとしてはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、およびＭ１３バクテリオファージを基礎としたもの、λバクテリオファージを基礎としたもの等が挙げられる。さらに、これらの細胞の形質転換法も当業者によく知られており、カルシウムイオンを用いてコンピテントな細胞にベクターを導入する方法、エレクトロポレーション、遺伝子銃など、種々の方法を適宜選択して用いることができる。
【００１７】
酵素反応の基質は、目的とする生成物に応じて決定されるが、使用する酵素分子種の種類、反応の種類等の因子も考慮される。基質としては有機化合物が適当であり、その分子量については特に制限はないが、一般的には約１０００以下、好ましくは約５００以下である。例えば、基質としてエストロゲン、酵素分子種としてＰ４５０分子種を用いて反応を行ってもよい。また、例えば基質としてオリゴ糖などの糖類を用い、酵素分子種として糖転移酵素分子種を用いてもよい。また、基質としてアミノ酸、ペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどを用いて、これらにメチル基転移酵素を作用させて修飾を行ってもよい。本発明の方法に使用する酵素分子種、基質、反応の種類については特に制限はなく、目的とする化合物ライブラリーの特性に応じて選択することができる。
【００１８】
反応は、複数の酵素分子種と基質とを接触させることにより行う。複数の酵素分子種を１の反応系にて反応させてもよく、いくつかの反応系に分けて反応を行ってもよい。上述のごとく、酵素分子種は遊離のものであってもよく、固定化されていてもよい。あるいは細胞を酵素源として用いてもよい。細胞は固定化されたものであってもよい。細胞を用いて反応を行う場合には、通常には、基質を添加した培地中で細胞を培養する。培地は使用細胞の種類や性質に適合したものを選択すべきである。細胞の選択と同様、培地の選択も当業者が適宜なし得ることである。動物細胞用培地としてはＥａｇｌｅ培地等、植物細胞用培地としてはＭＳ培地等、昆虫細胞用培地としてはＧｒａｃｅ培地、ＴＣ−１００培地等、真菌細胞用培地としてはＹＰＤ培地、ＳＤ培地等、細菌細胞用培地としてはＬＢ培地、ＹＭ培地等が挙げられる。例えば、形質転換された大腸菌を用いる場合には、一般的にはＬＢ培地、Ｍ９培地等が用いられるが、本発明者らは、ＩＵ培地を開発し、酵素反応産物の検出および単離・精製を飛躍的に容易化させた。ＩＵ培地については実施例にて詳述する。
【００１９】
温度、ｐＨ、通気等の反応条件は、使用する酵素分子種の最適温度、最適ｐＨ等、あるいは使用する細胞の最適生育条件等を考慮することにより決定することが望ましい。このような反応条件の決定も、当業者が容易になし得ることである。
【００２０】
酵素反応産物の単離・精製方法もまた当業者によく知られている。例えば、有機溶媒による抽出法、種々の沈殿法、ＨＰＬＣを包含する各種クロマトグラフィー（例えば、吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー）等を、単離・精製すべき化合物に応じて適宜選択して使用することができる。
【００２１】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００２２】
Ｐ４５０遺伝子組み込んだベクターの構築および形質転換体の取得
分子種としてＰ４５０ ＣＹＰ２ｃ２９（マウス由来）、ＣＹＰ２ｃ４３（サル由来）、ＣＹＰ２ａ４（マウス由来）を選択した（いずれも神戸大学遺伝子実験センター遺伝子ライブラリーから選択）。参考として、Ｐ４５０ ２ｃ２９の塩基配列を配列表の配列番号：１に示す。常法によりこれらのＰ４５０遺伝子をＰＣＲにて増幅した。ＮＡＤＰＨチトクロームＰ４５０レダクターゼ遺伝子（神戸大学遺伝子実験センター遺伝子ライブラリーに保存されている）も別途ＰＣＲにて増幅した。ベクター構築の際にＮＡＤＰＨチトクロームＰ４５０レダクターゼ遺伝子もベクター中に組み込んで、選択したＰ４５０分子種と同時発現させるようにした（そのスキームをＰ４５０ ２ｃ２９の場合を例にとって図１に示す）。ＮＡＤＰＨチトクロームＰ４５０レダクターゼ遺伝子を同時発現させることによりＰ４５０への電子供給を行うためである。
なお、Ｐ４５０ ２ｃ２９のＮ末端から２番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したものは、ネイティブな２ｃ２９よりもＰ４５０発現量が多くなることがわかった（データ示さず）。以下において、２ｃ２９という場合には、ネイティブな２ｃ２９のＮ末端から２番目のアスパラギン酸がアラニンに置き換わっている分子種をいう。
このようにして得られたベクターを、塩化カルシウム法により大腸菌ＤＨ５α株に導入し、形質転換を行った。得られた形質転換体の培養は表１に示すように行った。培地としてはＬＢ培地およびＩＵ培地を用いた。なおＩＵ培地の調製法は表２に示すとおりである。
表１
形質転換体の培養方法
（１）前培養
アンピシリン（１００μＭ）を添加した５０ｍｌのＩＵまたはＬＢ培地中、３７℃で２日間培養する。
（２）本培養
（ｉ）５００ｍｌのフラスコ中にアンピシリン（１００μＭ）およびグルコース（０．２％ ｗ／ｗ）を添加した１００ｍｌのＩＵまたはＬＢ培地を入れる。
（ｉｉ）前培養１ｍｌを上記１００ｍｌのＩＵまたはＬＢ培地に添加する。
（ｉｉｉ）Ｏ．Ｄ．６００＝０．２になるまで３７℃で培養する。
（ｉｖ）２５℃で１時間インキュベーションする。
（ｖ）１００μｌの０．１Ｍ ＩＰＴＧ（最終濃度１００μＭ）、１００μｌの０．１Ｍデルタアミノレブリン酸（最終濃度５００μＭ）および基質を添加する。
（ｖｉ）２５℃で２日間、１６０ｒｐｍで回転培養する
（ｖｉｉ）３０００ｇで１０分間遠心分離する。
表２
ＩＵ培地の調製方法
（１）調合物Ａ：
Ｎａ２ＨＰＯ４ ６ｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ３ｇ
ＮａＣｌ ０．５ｇ
Ｈ２Ｏを添加して９８０ｍｌとする。
（２）調合物Ｂ：
ＮＨ４Ｃｌ １ｇ
グルコース ２ｇ
チアミン １０ｍｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２４６ｍｇ
ＣａＣｌ２ １４．７ｍｇ
Ｈ２Ｏを添加して２０ｍｌとする。
（３）調合物Ａをオートクレーブしたものと、調合物Ｂを除菌濾過したものを混合する。
【実施例２】
【００２３】
ＬＢ培地とＩＵ培地の比較
実施例１で得られた、ＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体を用いて、ＬＢ培地およびＩＵ培地におけるＰ４５０濃度を比較した。Ｐ４５０濃度の測定は、Omura T, Sato R., THE CARBON MONOXIDE-BINDING PIGMENT OF LIVER MICROSOMES. I. EVIDENCE FOR ITS HEMOPROTEIN NATURE, J. Biol. Chem. (1964) 239, 2370-2378に記載の方法により行った。図２に示すように、培養３時間目でＬＢ培地においてＰ４５０濃度が若干高かったが、ＩＵ培地はＬＢ培地と同様に使用できることがわかった。
次に、基質としてエストロゲン（最終濃度１０μＭ）を含有するＬＢ培地およびＩＵ培地にてＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体を培養し、培養上清の酢酸エチル抽出物（有機相）をＨＰＬＣにより分析した。検出は２１０ｎｍにおける吸光度によった。ＬＢ培地では代謝産物が１種類（図３パネル（ａ）、矢印ｍで示す、保持時間約５分）検出された。ＩＵ培地ではバックグラウンドが低く（特に保持時間の短い部分）、ＬＢ培地で検出された代謝産物のほかに、さらにもう１つの代謝産物（図３パネル（ｂ）、左の矢印ｍで示す、保持時間約４．５分）が検出された。これらの結果は、ＩＵ培地を用いるとバイオコンビケムによる代謝物の検出および単離・精製がきわめて容易であることを示すものである。そこで、以下の実験ではＩＵ培地を用いることにした。
【実施例３】
【００２４】
複数の酵素分子種を用いたテストステロンの代謝実験
酵素分子種としてＰ４５０ ＣＹＰ２ａ４およびＣＹＰ２ｃ２９を選択し、実施例１記載の方法により形質転換体を得た。基質としてテストステロン（最終濃度１０μＭ）を用いて形質転換体を培養し、その培養上清を酢酸エチルで抽出してＨＰＬＣにて生成物を調べた。検出は２１０ｎｍにおける吸光度によった。ＣＹＰ２ａ４による形質転換体を用いた場合、３種の代謝産物（図４パネル（ａ）、矢印ｍで示す、保持時間それぞれ約１１分、約１２．５分および約１６分）が検出された。ＣＹＰ２ｃ２９による形質転換体を用いた場合にも、ＣＹＰ２ａ４による形質転換体を用いた場合と同じ保持時間のところに３種の代謝産物（図４パネル（ｂ）、矢印ｍで示す）が検出された。
ＣＹＰ２ａ４による形質転換体およびＣＹＰ２ｃ２９による形質転換体を同時培養した場合には、図４パネル（ｃ）に示すように、各形質転換体を用いた場合の３種の代謝産物のほかに、さらに３種の代謝産物（矢印ｄで示す、保持時間約１１．５分、約２０分および約２２分）が検出された。
【実施例４】
【００２５】
複数の酵素分子種を用いたエストラジオールの代謝実験
酵素分子種としてＰ４５０ ＣＹＰ２ａ４およびＣＹＰ２ｃ４３を選択し、実施例１記載の方法により形質転換体を得た。基質としてエストラジオール（最終濃度１０μＭ）を用いて形質転換体を培養し、その培養上清を酢酸エチルで抽出してＨＰＬＣにて生成物を調べた。検出は２１０ｎｍにおける吸光度によった。ＣＹＰ２ａ４による形質転換体を用いた場合、２種の代謝産物（図５パネル（ａ）、矢印ｍで示す、保持時間約５分および約１７分）が検出された。ＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体を用いた場合には、２種の代謝産物が検出された（図５パネル（ｂ）、矢印ｍで示す、保持時間約５分および約７．５分）。
ＣＹＰ２ａ４による形質転換体およびＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体を同時培養した場合には、図５パネル（ｃ）に示すように、３種の代謝産物が検出された（図５パネル（ｂ）、矢印ｍで示す、保持時間約５分、約７．５分および約１７分）。
図５の四角で囲んだ保持時間の短い領域のＨＰＬＣパターンを詳細に調べたところ、ＣＹＰ２ａ４による形質転換体を用いた場合ならびにＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体を用いた場合には、いずれも保持時間約１．５分のところに代謝産物が１つ検出されたが（図６（ａ）および（ｂ）、矢印ｍで示す）、ＣＹＰ２ａ４による形質転換体とＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体を同時培養した場合には、保持時間約２．５分のところに、さらなる代謝産物が検出された（図６（ｃ）、矢印（ｄ）で示す）。
【００２６】
以上の結果から、複数の酵素分子種を使用することにより、基質が逐次変換されて、多種多様な代謝産物が得られることが証明された。そのモデルを図７に示す。したがって、本発明のバイオコンビケム手法により、多種多様な化合物を含むライブラリーを効率よく構築することができる。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明によるバイオコンビナトリアル手法は、化合物のライブラリーの作成に利用可能であり、特に、創薬分野において利用価値が高い。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、実施例で使用した形質転換体を得るためのベクターの構築手順を示すスキームである。
【図２】図２は、Ｐ４５０分子種ＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体を培養した場合の、ＬＢ培地とＩＵ培地におけるＰ４５０濃度を比較した図である。
【図３】図３は、ＬＢ培地（パネル（ａ））とＩＵ培地（パネル（ｂ））における、Ｐ４５０分子種ＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体によるエストロゲン代謝産物の検出につき比較したＨＰＬＣチャートである。対照系（基質のみの系、および基質無添加系）のチャートは省略した。
【図４】図４は、形質転換体によるテストステロン代謝産物の検出を示すＨＰＬＣチャートである。パネル（ａ）はＰ４５０分子種ＣＹＰ２ａ４による形質転換体を用いた場合、パネル（ｂ）はＰ４５０分子種ＣＹＰ２ｃ２９による形質転換体を用いた場合、パネル（ｃ）はＰ４５０分子種ＣＹＰ２ａ４による形質転換体およびＰ４５０分子種ＣＹＰ２ｃ２９による形質転換体を同時培養した場合のチャートである。図中、ｔはテストステロン、ｍは代謝産物、ｄは同時培養により得られたさらなる代謝産物のピークを示す。対照系（基質のみの系、および基質無添加系）のチャートは省略した。
【図５】図５は、形質転換体によるエストラジオール代謝産物の検出を示すＨＰＬＣチャートである。パネル（ａ）はＰ４５０分子種ＣＹＰ２ａ４による形質転換体を用いた場合、パネル（ｂ）はＰ４５０分子種ＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体を用いた場合、パネル（ｃ）はＰ４５０分子種ＣＹＰ２ａ４による形質転換体およびＰ４５０分子種ＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体を同時培養した場合のチャートである。図中、ｅはエストラジオール、ｍは代謝産物のピークを示す。図中、四角で囲んだ部分を拡大したものが図６である。対照系（基質のみの系、および基質無添加系）のチャートは省略した。
【図６】図６は、形質転換体によるエストラジオール代謝産物の検出を示す、保持時間の短い領域のＨＰＬＣチャートである。パネル（ａ）はＰ４５０分子種ＣＹＰ２ａ４による形質転換体を用いた場合、パネル（ｂ）はＰ４５０分子種ＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体を用いた場合、パネル（ｃ）はＰ４５０分子種ＣＹＰ２ａ４による形質転換体およびＰ４５０分子種ＣＹＰ２ｃ４３による形質転換体を同時培養した場合のチャートである。図中、ｍは代謝産物、ｄは同時培養により得られたさらなる代謝産物のピークを示す。対照系（基質のみの系、および基質無添加系）のチャートは省略した。
【図７】図７は、本発明によるバイオコンビケム手法を用いた化合物ライブラリーの構築機構を示す模式図である。酵素（Ａ）〜（Ｃ）はそれぞれ別個の酵素分子種を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の酵素分子種を用いることを特徴とする化合物ライブラリーの構築方法。
【請求項２】
酵素分子種が細胞により産生されるものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞が形質転換細胞である請求項２記載の方法。
【請求項４】
細胞が大腸菌である請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
ＩＵ培地を用いることを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
固定化された酵素分子種または細胞を用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
酵素分子種がチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ分子種である請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１】
複数の酵素分子種を用いることを特徴とする化合物ライブラリーの構築方法。
【請求項２】
酵素分子種が細胞により産生されるものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞が形質転換細胞である請求項２記載の方法。
【請求項４】
細胞が大腸菌である請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
ＩＵ培地を用いることを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
固定化された酵素分子種または細胞を用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
酵素分子種がチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ分子種である請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００６−１２９８３６（Ｐ２００６−１２９８３６Ａ）
【公開日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３２５３５３（Ｐ２００４−３２５３５３）
【出願日】平成１６年１１月９日（２００４．１１．９）
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月９日（２００４．１１．９）
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
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