ヒアルロン酸合成酵素及びその遺伝子
【課題】宿主における発現効率が高く、環境汚染の発生の低減したヒアルロン酸合成酵素及び該酵素をコードする遺伝子を提供する。
【解決手段】以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなるヒアルロン酸合成酵素遺伝子：（ａ）特定の塩基配列又はその相補鎖からなるＤＮＡ；（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；（ｃ）上記（ａ）のＤＮＡと９６．８％超のホモロジーを有し、且つ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；（ｄ）特定のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
【解決手段】以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなるヒアルロン酸合成酵素遺伝子：（ａ）特定の塩基配列又はその相補鎖からなるＤＮＡ；（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；（ｃ）上記（ａ）のＤＮＡと９６．８％超のホモロジーを有し、且つ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；（ｄ）特定のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸合成酵素及びヒアルロン酸合成酵素遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸 （以下、「ＨＡ」ともいう）は、高分子量のグルコサミノグリカンであり、グルクロン酸がβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンに結合した二糖単位（ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃ：ＧｌｃＡはグルクロン酸を、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを表す）のβ１，４結合による繰り返しからなる直鎖状の多糖である。ＨＡは、脊椎動物において、硝子体、皮膚、靭帯など様々な組織の細胞外マトリックス成分として幅広く存在することが知られている。ＨＡは、他の細胞外マトリックス成分とともに３次元構造の形成に働き、組織の水分保持や柔軟性の維持のような構造物として機能ばかりでなく、ＨＡ結合蛋白質とともに細胞表面受容体との相互作用により、細胞の接着、遊走、分化などの細胞の挙動を調節するとともに、形態形成、創傷治癒、癌の浸潤、転移などの現象にも関与している。
【０００３】
ヒアルロン酸 の生合成の研究は、1950〜1960年代に、連鎖球菌を用いた無細胞系実験により行われ、ヒアルロン酸鎖の伸長にUDP-グルクロン酸及びUDP-N-アセチルグルコサミンの２種類の糖ヌクレオチドを用いることにより、連鎖球菌細胞膜に局在するヒアルロン酸合成酵素（以下、「ＨＡＳ」ともいう）の活性が示された（非特許文献１参照）。本酵素を安定な活性型として、可溶化して高純度に精製することは長年の間、困難であったが、1993年に、Streptococcus pyogenesのヒアルロン酸合成酵素遺伝子(hasA)が単離されて（非特許文献２参照）以来、活性型の組換えＨＡＳが得られるようになり、ＨＡＳの諸性質に関する研究が進展した。
【０００４】
その後、真核生物である哺乳動物からもヒアルロン酸 合成酵素（以下、「ＨＡＳ」ともいう）遺伝子が単離された。最初、ＨＡＳ１（非特許文献３〜４、特許文献１〜３）が単離され、その後ＨＡＳ２（非特許文献５〜６、特許文献４）、ＨＡＳ３（非特許文献７、特許文献４）が次々に単離された。これらは相同性が高く、ファミリーを形成していると考えられている。また、これら以外にもＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ（非特許文献８、特許文献５）やＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ（非特許文献９、特許文献６）などからもＨＡＳ遺伝子がクローニングされた。さらに、既知の遺伝子の中にも上記ＨＡＳと相同性の高いものが存在し、アフリカツメガエルのＤＧ４２（非特許文献１０）あるいはクロレラ様の緑藻に感染するＰＢＣＶ−１ウィルスのＡ９８Ｒ（非特許文献１１）にＨＡＳ活性があることが報告されている。
【０００５】
Ａ９８Ｒに関しては、他の原核生物及び真核生物のＨＡＳとは異なる金属要求性を有し、HAS活性にマンガンイオンを必要とすることが報告されている。
【特許文献１】特開平９−２２４６７４号
【特許文献２】ＷＯ９７／３８１１３号
【特許文献３】ＷＯ９７／４０１７４号
【特許文献４】ＷＯ９８／００５５１号
【特許文献５】ＷＯ９９／２３２２７号
【特許文献６】ＷＯ９９／５１２６５号
【非特許文献１】Markovitz, M. et al., J. Biol. Chem. 234, 2343, (1959)
【非特許文献２】DeAngelis, P. L. et al., J. Biol. Chem., 268, 19181 (1993)
【非特許文献３】Itano, N. et al., J. Biol. Chem., 271, 9875 (1996)
【非特許文献４】Itano, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 222, 816 (1996)
【非特許文献５】Watanabe, K.et al., J. Biol. Chem., 271, 22945 (1996)
【非特許文献６】Spicer, A. P. et al., J. Biol. Chem., 271, 23400 (1996)
【非特許文献７】Spicer, A. P. et al., J. Biol. Chem., 272, 8957 (1997)
【非特許文献８】Kumari, K. et al., J. Biol. Chem., 272, 32539 (1997)
【非特許文献９】DeAngelis, P. L. et al., J. Biol. Chem., 273, 8454 (1998)
【非特許文献１０】DeAngelis, P. L. et al., J. Biol. Chem., 271, 23657 (1996)
【非特許文献１１】DeAngelis, P. L. et al., Science, 278, 1800 (1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、宿主における発現効率が高く、環境汚染の発生の低減した条件下でヒアルロン酸の生産が可能なヒアルロン酸合成酵素及び該酵素をコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下のヒアルロン酸合成酵素及び該酵素をコードする遺伝子を提供するものである。
１． 以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなるヒアルロン酸合成酵素遺伝子：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列又はその相補鎖からなるＤＮＡ；
（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）上記（ａ）のＤＮＡと９６．８％超のホモロジーを有し、且つ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
２． 以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなるヒアルロン酸合成酵素遺伝子：
（ａ）配列番号２で示される塩基配列又はその相補鎖からなるＤＮＡ；
（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）上記（ａ）のＤＮＡと９６．５％超のホモロジーを有し、且つ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
３． 以下の（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドからなるヒアルロン酸合成酵素：
（Ａ）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド；
（Ｃ）上記（Ａ）のアミノ酸配列と９７．８％超のホモロジーを有し、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド
４． 以下の（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドからなるヒアルロン酸合成酵素：
（Ａ）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド；
（Ｃ）上記（Ａ）のアミノ酸配列と９７．８％超のホモロジーを有し、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、酵母などの宿主で高発現可能であり、Ｍｎ２＋イオンなどの環境汚染の原因となる金属を必要としないヒアルロン酸合成酵素及び該酵素をコードする遺伝子を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
ヒアルロン酸合成酵素は、ＵＤＰ−グルクロン酸とＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを基質として、グルクロン酸とグルコサミンの繰り返し構造からなるポリマー構造のヒアルロン酸を合成する酵素である。
【００１０】
配列番号５又は６に記載される本発明のヒアルロン酸合成酵素は、クロレラウイルスCVHI1株およびCVKA1株由来のヒアルロン酸合成酵素である。なお、クロレラウイルスCVHI1株およびCVKA1株は、ゾウリムシから単離されたクロレラウイルスPBCV-1とは異なる系統のクロレラウイルスである。
【００１１】
本発明のヒアルロン酸合成酵素は、マグネシウムイオン要求性であり、マグネシウムイオンの存在下で高い活性を有する。一方、クロレラウイルスPBCV-1由来の公知のヒアルロン酸合成酵素(A98R)は、マンガンイオン要求性であることがDeAngelis et al, 1997, Science, 278, 1800-1803に記載されている。マンガンイオンは、マグネシウムイオンと異なり、環境に悪影響があり、廃液処理が必要とされている。
【００１２】
本発明のヒアルロン酸合成酵素は、環境に対する悪影響のないマグネシウムイオン要求性である点で、公知のヒアルロン酸合成酵素であるA98Rよりも優れている。なお、本発明のヒアルロン酸合成酵素は、マグネシウムイオンにより高活性を発現するが、マンガンイオンの存在下で、マグネシウム存在下よりも低い活性を有していてもよい。
【００１３】
ヒアルロン酸合成酵素の１若しくは数個（通常９個以下、好ましくは７個以下、より好ましくは５個以下、さらに好ましくは３個以下）のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチド、並びに、９７．８％超（好ましくは９８％超、より好ましくは９９％超）のホモロジーを有し且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドは、好ましくはマグネシウムイオン要求性を維持したポリペプチドであり、ヒアルロン酸合成酵素の一部且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドと、ヒアルロン酸合成酵素の欠失、付加、挿入又は置換体であって且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチド、９７．８％超のホモロジーを有し且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドを包含する。ヒアルロン酸合成酵素の一部であって、且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドとは、上記のようなヒアルロン酸合成酵素においてヒアルロン酸合成活性を奏するために必須となるアミノ酸部位を含み、必須でない部分の一部は欠失し、かつヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドである。
【００１４】
本発明におけるヒアルロン酸合成酵素をコードするDNA又はヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは数個（通常９個以下、好ましくは７個以下、より好ましくは５個以下、さらに好ましくは３個以下）のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするDNAとしては、上記ヒアルロン酸合成酵素又はポリペプチドをコードするものであれば特に限定されず、コドンの縮重により配列が異なるものも含まれる。
【００１５】
本発明の１つの実施形態において、本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子は、配列番号１の塩基配列と９６．８％超、好ましくは９７％超、より好ましくは９８％超、さらに好ましくは９９％超のホモロジーを有し、且つ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。
【００１６】
本発明の他の１つの実施形態において、本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子は、配列番号２の塩基配列と９６．５％超、好ましくは９７％超、より好ましくは９８％超、さらに好ましくは９９％超のホモロジーを有し、且つ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。
【００１７】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、特定のヒアルロン酸合成酵素と同等のヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列のみが該特定配列とハイブリット（いわゆる特異的ハイブリット）を形成し、同等の活性を有しないポリペプチドをコードする塩基配列は該特定配列とハイブリット（いわゆる非特異的ハイブリット）を形成しない条件を意味する。当業者は、ハイブリダイゼーション反応および洗浄時の温度や、ハイブリダイゼーション反応液および洗浄液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。具体的には、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ，０，２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．５×ＳＳＣにより洗浄する条件が、本発明のストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１８】
該ストリンジェントな条件は、好ましくはハイストリンジェントな条件である。ハイストリンジェントな条件とは、Ａ９８Ｒをコードする遺伝子がハイブリダイズしない条件であれば特に限定されないが、例えば０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である。
本発明のヒアルロン酸合成酵素は、上記ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡが、上記性質を有する形で転写・翻訳されるように挿入された発現ベクターで、宿主を形質転換し、得られた形質転換体を適当な培地中で培養し、得られた培養物より採取することにより、得ることができる。
宿主細胞としては、大腸菌、酵母、細菌などの微生物細胞、昆虫細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＨＯ細胞などの動物細胞やアラビドプシス細胞などの植物細胞などが挙げられる。
【００１９】
ベクターとしては、形質転換する宿主に応じて、種々のものが利用できる。例えば、大腸菌では、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＵＣ１９など、酵母では、ｐＹＥＳ、ｐＹＣ、ｐＹＩ、ｐＹＬ、ｐＹＥＵｒａ３ＴＭなど、昆虫細胞では、ｐＢＬＵＥ Ｂａｃ４など、ＣＯＳ−１細胞ではｐＳＶＫ３、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＣＭＶ２など、アラビドプシス細胞ではｐＢＩなどが挙げられる。
【００２０】
プロモーターは、各宿主について公知のプロモーターが広く使用でき、例えば酵母においては、構成的発現プロモーターであるＰＭＡ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＡＤＨ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＧＡＬ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＰＧＫ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＰＨＯ５ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＧＡＰＤＨ ｐｒｏｍｏｔｅｒ等を用いることができる。
【００２１】
本発明のヒアルロン酸合成酵素をコードする遺伝子を、例えばｐＹＥＵｒａ３ＴＭ等の適切なベクターに挿入することにより、目的とするヒアルロン酸合成酵素の発現ベクターを得ることができる。
【００２２】
発現ベクターの宿主細胞への導入による形質転換体の調製は、遺伝子工学分野で通常用いられる方法で行うことができる。例えば、リポフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、塩化カルシウム法、プロトプラスト法、コンピテント法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００２３】
本発明のヒアルロン酸合成酵素は、上述の方法で得られた形質転換体を、適当な培地中で培養し、得られる培養物より採取することにより得ることができる。
【００２４】
本発明の１つの実施形態において、本発明のヒアルロン酸合成酵素は、得られた形質転換体の菌体（例えば酵母）を酵素処理、超音波破砕などの方法により破砕し、遠心分離することにより無細胞抽出液を得、さらに無細胞抽出液を超遠心分離することにより、膜画分として得ることができる。
【００２５】
また、得られた膜画分より、ジキトキニンやＣＨＡＰＳ（３−［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）などの界面活性剤を用いて、可溶化し、通常の精製方法により精製することもできる。精製方法としては、例えば硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムなどによる塩析、遠心分離、透析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法などが挙げられ、これらを適当に組み合わせることにより精製することができる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例を挙げて、本発明をより一層具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されることはない。
【００２７】
実施例１ クロレラウイルス由来ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の単離方法
クロレラウイルスヒアルロン酸合成酵素遺伝子（cvHAS）をPCRにより単離するためにPCRプライマーを作製した。プライマーは、既に明らかになっているクロレラウイルスゲノム配列情報（Kutish et al, 1996, Virology, 223, 303-317）（Li et al, 1995, Virology, 212, 134-150）（Li et al, 1997, Virology, 237, 360-377）（Lu et al, 1995, Virology, 206, 339-352）（Lu et al, 1996, Virology, 216, 102-123）およびクロレラウイルス由来ヒアルロン酸合成遺伝子の同定情報（Graves et al,1999, virology, 257, 15-23）（DeAngelis et al, 1997, Science, 278, 1800-1803）を基に設計し、かつ発現ベクターへの導入に必要な制限酵素部位を付加したものを作製した。制限酵素サイトは3’側プライマーにSacI部位を付加した。
5’側プライマー(配列番号３)
5’- ATG GGT AAA AAT ATA ATC ATA ATG GTT TCG - 3’
3’側プライマー（配列番号４）
5’ - AAT TGA GCT CTC ACA CAG ACT GAG CAT TGG TAG −3’
PCRの鋳型には、クロレラウイルスCVHI1株およびCVKA1株のゲノムDNAを用いた。PCR は、DNAポリメラーゼにKOD −plus- （東洋紡）を用い、94℃ ２分、（94℃ 15秒、55℃ 30秒、68℃ ２分）25サイクルの反応プログラムで行った。得られたPCR断片を、発現ベクターpLTex321sのマルチクローニングサイトのSmaI部位とSacI部位に挿入した。DNAシークエンサーにより、CVHI1株由来ヒアルロン酸合成酵素遺伝子cvHAS-HI（配列番号１）およびCVKA1株由来ヒアルロン酸合成酵素遺伝子cvHAS-KA（配列番号２）のDNA配列を確認した。
【００２８】
実施例２ cvHASの酵母での発現および抽出方法
cvHAS-HIまたはcvHAS-KAを含む酵母（BY4743）を30℃で一晩培養した。この前培養液1mlを100mLのSD培地（0.67% Yeast nitrogen base w/o AA、2% グルコース、0.02％ アデニン硫酸塩、0.02％ L-トリプトファン、0.02％ L-ヒスチジン、0.03％ リジン一塩酸塩、0.03％ L-メチオニン、-0.03％ L-ロイシンを含む）に接種し、30℃で18時間培養した。その後、組換えcvHASを発現誘導するため、低温(10℃)にて48時間培養した。培養終了後、培養液の遠心分離を行うことにより菌体を回収し、30mlのバッファー（50mM リン酸緩衝液（pH7.0）、５％ グリセロール、1mM EDTA、1mM ベンズアミジン、1mM ふっ化フェニルメチルスルホニル（PMSF）および1mM ジチオスレイトールを含む）で懸濁した後、フレンチプレスにより菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（12,000rpm、20分）し、さらにその上清を超遠心分離（x100,000g、１時間）することにより粗膜画分を抽出し、200μlのバッファー（上記と同様）で再懸濁し、cvHAS粗抽出液とした。
【００２９】
実施例３ ヒアルロン酸合成酵素活性の測定
酵母で生産されたcvHAS粗抽出液を用いてヒアルロン酸をin vitroで合成し、その反応液中のヒアルロン酸濃度を測定することによりヒアルロン酸合成酵素活性を表した。In vitroヒアルロン酸合成は、50mM トリス緩衝液（pH7.0） 、20mM MgCl2、0.1mM EGTA、10mM 2-ME、0.05% BSA、1mM UDP-GlcA、1mM UDP-GlcNAc、および10μlの cvHAS粗抽出液を含み、全量100μlに調整した反応液を37℃で20時間反応させた。反応後、90℃にて3分間加熱し、反応を終了させた。反応液を遠心後、上清をヒアルロン酸の測定に用いた。
【００３０】
ヒアルロン酸の測定は、ヒアルロン酸結合タンパク質によるヒアルロン酸の測定試薬のヒアルロン酸プレート「中外」（富士レビオ）を用いた。ヒアルロン酸プレート「中外」は、ヒアルロン酸結合タンパク質を用いたサンドイッチ結合型ヒアルロン酸定量方法である。マイクロタイタープレート上に固定化したヒアルロン酸結合タンパク質に検体中のヒアルロン酸を結合させた後、酵素標識ヒアルロン酸結合タンパク質を結合させ、サンドイッチを形成させる。引き続き、テトラメチルベンチジン(TMB)および過酸化水素を加えると、標識酵素のペルオキシダーゼの作用でTMBが酸化されて呈色する。反応停止液を添加後、プレートリーダーで波長450nm、対照波長620nmで吸光度を測定（A450）することにより、サンプルのヒアルロン酸濃度が評価できる。本キットに付属している標準ヒアルロン酸溶液を用いて標準曲線を作製し、上記の反応前後の反応液の吸光度から、反応液中に合成されたヒアルロン酸濃度を算出した。
【００３１】
また、粗抽出液のタンパク質濃度はBSAを標準タンパク質として用い、Bio-Rad protein assay reagent（バイオラッド）により測定した。
【００３２】
また、ヒアルロン酸合成酵素活性は、ヒアルロン酸粗抽出液に含まれている1ｍｇあたりのタンパク質が１時間あたりに合成したヒアルロン酸量(ng-HA/h/mg-protein)を計算することにより表１でHAS活性として表示した。
【００３３】
表１において、ヒアルロン酸合成酵素を含まないベクターにより形質転換した酵母由来の粗抽出液をmockと表した。クロレラウイルスCVHI1株およびCVKA1株由来のヒアルロン酸合成酵素を含むベクターにより形質転換した酵母由来の粗抽出液をcvHAS-HIおよび cvHAS-KAとそれぞれ表した。
【００３４】
【表１】
【００３５】
表１の結果に表されるように、単離した遺伝子がヒアルロン酸合成酵素活性を有することが確認された。
実施例４ cvHASの至適温度
実施例３でヒアルロン酸合成酵素活性の確認されたcvHAS粗抽出液を用い、cvHASの至適温度を調べた。In vitroヒアルロン酸合成は、50mM トリス緩衝液（pH7.0） 、20mM MgCl2、0.1mM EGTA、10mM 2-ME、0.05% BSA、1mM UDP-GlcA、1mM UDP-GlcNAcおよび10μlの cvHAS粗抽出液を含み、全量100μlに調整した反応液を10〜42℃の温度範囲で１時間反応させた。実施例３に示した方法でcvHAS粗抽出液のヒアルロン酸合成酵素活性を測定し、各温度における相対活性を表した。その結果を図1に示す。図１の結果に表されるように、cvHAS-HIの至適温度は37℃付近であることが確認された。
実施例５ cvHASの至適ｐＨ
実施例３でヒアルロン酸合成酵素活性の確認されたcvHAS粗抽出液を用い、cvHASの至適ｐＨを調べた。In vitroヒアルロン酸合成は、20mM MgCl2、0.1mM EGTA、10mM 2-ME、0.05% BSA、1mM UDP-GlcA、1mM UDP-GlcNAc、10μlのcv HAS粗抽出液及び50mM リン酸緩衝液（pH5.5〜7.5）を含み、全量100μlに調整した反応液を37℃で１時間反応させた。実施例３に示した方法でcvHAS粗抽出液のヒアルロン酸合成酵素活性を測定し、各pHにおける相対活性を表した。その結果を図2に示す。図２の結果に表されるように、cvHAS-HIの至適pHは7.0付近であることが確認された。
実施例６ cvHASの金属イオン要求性
実施例３でヒアルロン酸合成酵素活性の確認されたcvHAS粗抽出液を用い、cvHASの金属イオン要求性を調べた。In vitroヒアルロン酸合成は、50mM トリス緩衝液（pH7.0） 、20mM MgCl2あるいはMnCl2、0.1mM EGTA、20mM 2-ME、0.05% BSA、1mM UDP-GlcA、1mM UDP-GlcNAc、および10μlのcv HAS粗抽出液を含み、全量100μlに調整した反応液を37℃で１時間および２時間反応させた。反応後、90℃にて3分間加熱し、反応を終了させた。実施例３に示した方法でcvHAS粗抽出液のヒアルロン酸合成酵素活性を測定し、各金属イオン存在下における活性を表した。その結果を図3に示した。図３の結果に表されるように、cvHASはMg2+イオンに対する金属要求性が高く、Mn2+イオン存在下ではMg2+イオン存在下と比較して、酵素活性が１０％以下であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ヒアルロン酸合成酵素の各温度における相対活性を示す。
【図２】ヒアルロン酸合成酵素の各ｐＨにおける相対活性を示す。
【図３】各金属イオン存在下におけるヒアルロン酸合成酵素活性を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸合成酵素及びヒアルロン酸合成酵素遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸 （以下、「ＨＡ」ともいう）は、高分子量のグルコサミノグリカンであり、グルクロン酸がβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンに結合した二糖単位（ＧｌｃＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃ：ＧｌｃＡはグルクロン酸を、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを表す）のβ１，４結合による繰り返しからなる直鎖状の多糖である。ＨＡは、脊椎動物において、硝子体、皮膚、靭帯など様々な組織の細胞外マトリックス成分として幅広く存在することが知られている。ＨＡは、他の細胞外マトリックス成分とともに３次元構造の形成に働き、組織の水分保持や柔軟性の維持のような構造物として機能ばかりでなく、ＨＡ結合蛋白質とともに細胞表面受容体との相互作用により、細胞の接着、遊走、分化などの細胞の挙動を調節するとともに、形態形成、創傷治癒、癌の浸潤、転移などの現象にも関与している。
【０００３】
ヒアルロン酸 の生合成の研究は、1950〜1960年代に、連鎖球菌を用いた無細胞系実験により行われ、ヒアルロン酸鎖の伸長にUDP-グルクロン酸及びUDP-N-アセチルグルコサミンの２種類の糖ヌクレオチドを用いることにより、連鎖球菌細胞膜に局在するヒアルロン酸合成酵素（以下、「ＨＡＳ」ともいう）の活性が示された（非特許文献１参照）。本酵素を安定な活性型として、可溶化して高純度に精製することは長年の間、困難であったが、1993年に、Streptococcus pyogenesのヒアルロン酸合成酵素遺伝子(hasA)が単離されて（非特許文献２参照）以来、活性型の組換えＨＡＳが得られるようになり、ＨＡＳの諸性質に関する研究が進展した。
【０００４】
その後、真核生物である哺乳動物からもヒアルロン酸 合成酵素（以下、「ＨＡＳ」ともいう）遺伝子が単離された。最初、ＨＡＳ１（非特許文献３〜４、特許文献１〜３）が単離され、その後ＨＡＳ２（非特許文献５〜６、特許文献４）、ＨＡＳ３（非特許文献７、特許文献４）が次々に単離された。これらは相同性が高く、ファミリーを形成していると考えられている。また、これら以外にもＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ（非特許文献８、特許文献５）やＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ（非特許文献９、特許文献６）などからもＨＡＳ遺伝子がクローニングされた。さらに、既知の遺伝子の中にも上記ＨＡＳと相同性の高いものが存在し、アフリカツメガエルのＤＧ４２（非特許文献１０）あるいはクロレラ様の緑藻に感染するＰＢＣＶ−１ウィルスのＡ９８Ｒ（非特許文献１１）にＨＡＳ活性があることが報告されている。
【０００５】
Ａ９８Ｒに関しては、他の原核生物及び真核生物のＨＡＳとは異なる金属要求性を有し、HAS活性にマンガンイオンを必要とすることが報告されている。
【特許文献１】特開平９−２２４６７４号
【特許文献２】ＷＯ９７／３８１１３号
【特許文献３】ＷＯ９７／４０１７４号
【特許文献４】ＷＯ９８／００５５１号
【特許文献５】ＷＯ９９／２３２２７号
【特許文献６】ＷＯ９９／５１２６５号
【非特許文献１】Markovitz, M. et al., J. Biol. Chem. 234, 2343, (1959)
【非特許文献２】DeAngelis, P. L. et al., J. Biol. Chem., 268, 19181 (1993)
【非特許文献３】Itano, N. et al., J. Biol. Chem., 271, 9875 (1996)
【非特許文献４】Itano, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 222, 816 (1996)
【非特許文献５】Watanabe, K.et al., J. Biol. Chem., 271, 22945 (1996)
【非特許文献６】Spicer, A. P. et al., J. Biol. Chem., 271, 23400 (1996)
【非特許文献７】Spicer, A. P. et al., J. Biol. Chem., 272, 8957 (1997)
【非特許文献８】Kumari, K. et al., J. Biol. Chem., 272, 32539 (1997)
【非特許文献９】DeAngelis, P. L. et al., J. Biol. Chem., 273, 8454 (1998)
【非特許文献１０】DeAngelis, P. L. et al., J. Biol. Chem., 271, 23657 (1996)
【非特許文献１１】DeAngelis, P. L. et al., Science, 278, 1800 (1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、宿主における発現効率が高く、環境汚染の発生の低減した条件下でヒアルロン酸の生産が可能なヒアルロン酸合成酵素及び該酵素をコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下のヒアルロン酸合成酵素及び該酵素をコードする遺伝子を提供するものである。
１． 以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなるヒアルロン酸合成酵素遺伝子：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列又はその相補鎖からなるＤＮＡ；
（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）上記（ａ）のＤＮＡと９６．８％超のホモロジーを有し、且つ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
２． 以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなるヒアルロン酸合成酵素遺伝子：
（ａ）配列番号２で示される塩基配列又はその相補鎖からなるＤＮＡ；
（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）上記（ａ）のＤＮＡと９６．５％超のホモロジーを有し、且つ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
３． 以下の（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドからなるヒアルロン酸合成酵素：
（Ａ）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド；
（Ｃ）上記（Ａ）のアミノ酸配列と９７．８％超のホモロジーを有し、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド
４． 以下の（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドからなるヒアルロン酸合成酵素：
（Ａ）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド；
（Ｃ）上記（Ａ）のアミノ酸配列と９７．８％超のホモロジーを有し、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、酵母などの宿主で高発現可能であり、Ｍｎ２＋イオンなどの環境汚染の原因となる金属を必要としないヒアルロン酸合成酵素及び該酵素をコードする遺伝子を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
ヒアルロン酸合成酵素は、ＵＤＰ−グルクロン酸とＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを基質として、グルクロン酸とグルコサミンの繰り返し構造からなるポリマー構造のヒアルロン酸を合成する酵素である。
【００１０】
配列番号５又は６に記載される本発明のヒアルロン酸合成酵素は、クロレラウイルスCVHI1株およびCVKA1株由来のヒアルロン酸合成酵素である。なお、クロレラウイルスCVHI1株およびCVKA1株は、ゾウリムシから単離されたクロレラウイルスPBCV-1とは異なる系統のクロレラウイルスである。
【００１１】
本発明のヒアルロン酸合成酵素は、マグネシウムイオン要求性であり、マグネシウムイオンの存在下で高い活性を有する。一方、クロレラウイルスPBCV-1由来の公知のヒアルロン酸合成酵素(A98R)は、マンガンイオン要求性であることがDeAngelis et al, 1997, Science, 278, 1800-1803に記載されている。マンガンイオンは、マグネシウムイオンと異なり、環境に悪影響があり、廃液処理が必要とされている。
【００１２】
本発明のヒアルロン酸合成酵素は、環境に対する悪影響のないマグネシウムイオン要求性である点で、公知のヒアルロン酸合成酵素であるA98Rよりも優れている。なお、本発明のヒアルロン酸合成酵素は、マグネシウムイオンにより高活性を発現するが、マンガンイオンの存在下で、マグネシウム存在下よりも低い活性を有していてもよい。
【００１３】
ヒアルロン酸合成酵素の１若しくは数個（通常９個以下、好ましくは７個以下、より好ましくは５個以下、さらに好ましくは３個以下）のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチド、並びに、９７．８％超（好ましくは９８％超、より好ましくは９９％超）のホモロジーを有し且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドは、好ましくはマグネシウムイオン要求性を維持したポリペプチドであり、ヒアルロン酸合成酵素の一部且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドと、ヒアルロン酸合成酵素の欠失、付加、挿入又は置換体であって且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチド、９７．８％超のホモロジーを有し且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドを包含する。ヒアルロン酸合成酵素の一部であって、且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドとは、上記のようなヒアルロン酸合成酵素においてヒアルロン酸合成活性を奏するために必須となるアミノ酸部位を含み、必須でない部分の一部は欠失し、かつヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドである。
【００１４】
本発明におけるヒアルロン酸合成酵素をコードするDNA又はヒアルロン酸合成酵素のアミノ酸配列において、１若しくは数個（通常９個以下、好ましくは７個以下、より好ましくは５個以下、さらに好ましくは３個以下）のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするDNAとしては、上記ヒアルロン酸合成酵素又はポリペプチドをコードするものであれば特に限定されず、コドンの縮重により配列が異なるものも含まれる。
【００１５】
本発明の１つの実施形態において、本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子は、配列番号１の塩基配列と９６．８％超、好ましくは９７％超、より好ましくは９８％超、さらに好ましくは９９％超のホモロジーを有し、且つ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。
【００１６】
本発明の他の１つの実施形態において、本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子は、配列番号２の塩基配列と９６．５％超、好ましくは９７％超、より好ましくは９８％超、さらに好ましくは９９％超のホモロジーを有し、且つ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。
【００１７】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、特定のヒアルロン酸合成酵素と同等のヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列のみが該特定配列とハイブリット（いわゆる特異的ハイブリット）を形成し、同等の活性を有しないポリペプチドをコードする塩基配列は該特定配列とハイブリット（いわゆる非特異的ハイブリット）を形成しない条件を意味する。当業者は、ハイブリダイゼーション反応および洗浄時の温度や、ハイブリダイゼーション反応液および洗浄液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。具体的には、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ，０，２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．５×ＳＳＣにより洗浄する条件が、本発明のストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１８】
該ストリンジェントな条件は、好ましくはハイストリンジェントな条件である。ハイストリンジェントな条件とは、Ａ９８Ｒをコードする遺伝子がハイブリダイズしない条件であれば特に限定されないが、例えば０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である。
本発明のヒアルロン酸合成酵素は、上記ヒアルロン酸合成酵素をコードするＤＮＡが、上記性質を有する形で転写・翻訳されるように挿入された発現ベクターで、宿主を形質転換し、得られた形質転換体を適当な培地中で培養し、得られた培養物より採取することにより、得ることができる。
宿主細胞としては、大腸菌、酵母、細菌などの微生物細胞、昆虫細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＨＯ細胞などの動物細胞やアラビドプシス細胞などの植物細胞などが挙げられる。
【００１９】
ベクターとしては、形質転換する宿主に応じて、種々のものが利用できる。例えば、大腸菌では、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＵＣ１９など、酵母では、ｐＹＥＳ、ｐＹＣ、ｐＹＩ、ｐＹＬ、ｐＹＥＵｒａ３ＴＭなど、昆虫細胞では、ｐＢＬＵＥ Ｂａｃ４など、ＣＯＳ−１細胞ではｐＳＶＫ３、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＣＭＶ２など、アラビドプシス細胞ではｐＢＩなどが挙げられる。
【００２０】
プロモーターは、各宿主について公知のプロモーターが広く使用でき、例えば酵母においては、構成的発現プロモーターであるＰＭＡ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＡＤＨ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＧＡＬ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＰＧＫ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＰＨＯ５ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＧＡＰＤＨ ｐｒｏｍｏｔｅｒ等を用いることができる。
【００２１】
本発明のヒアルロン酸合成酵素をコードする遺伝子を、例えばｐＹＥＵｒａ３ＴＭ等の適切なベクターに挿入することにより、目的とするヒアルロン酸合成酵素の発現ベクターを得ることができる。
【００２２】
発現ベクターの宿主細胞への導入による形質転換体の調製は、遺伝子工学分野で通常用いられる方法で行うことができる。例えば、リポフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、塩化カルシウム法、プロトプラスト法、コンピテント法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００２３】
本発明のヒアルロン酸合成酵素は、上述の方法で得られた形質転換体を、適当な培地中で培養し、得られる培養物より採取することにより得ることができる。
【００２４】
本発明の１つの実施形態において、本発明のヒアルロン酸合成酵素は、得られた形質転換体の菌体（例えば酵母）を酵素処理、超音波破砕などの方法により破砕し、遠心分離することにより無細胞抽出液を得、さらに無細胞抽出液を超遠心分離することにより、膜画分として得ることができる。
【００２５】
また、得られた膜画分より、ジキトキニンやＣＨＡＰＳ（３−［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）などの界面活性剤を用いて、可溶化し、通常の精製方法により精製することもできる。精製方法としては、例えば硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムなどによる塩析、遠心分離、透析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法などが挙げられ、これらを適当に組み合わせることにより精製することができる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例を挙げて、本発明をより一層具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されることはない。
【００２７】
実施例１ クロレラウイルス由来ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の単離方法
クロレラウイルスヒアルロン酸合成酵素遺伝子（cvHAS）をPCRにより単離するためにPCRプライマーを作製した。プライマーは、既に明らかになっているクロレラウイルスゲノム配列情報（Kutish et al, 1996, Virology, 223, 303-317）（Li et al, 1995, Virology, 212, 134-150）（Li et al, 1997, Virology, 237, 360-377）（Lu et al, 1995, Virology, 206, 339-352）（Lu et al, 1996, Virology, 216, 102-123）およびクロレラウイルス由来ヒアルロン酸合成遺伝子の同定情報（Graves et al,1999, virology, 257, 15-23）（DeAngelis et al, 1997, Science, 278, 1800-1803）を基に設計し、かつ発現ベクターへの導入に必要な制限酵素部位を付加したものを作製した。制限酵素サイトは3’側プライマーにSacI部位を付加した。
5’側プライマー(配列番号３)
5’- ATG GGT AAA AAT ATA ATC ATA ATG GTT TCG - 3’
3’側プライマー（配列番号４）
5’ - AAT TGA GCT CTC ACA CAG ACT GAG CAT TGG TAG −3’
PCRの鋳型には、クロレラウイルスCVHI1株およびCVKA1株のゲノムDNAを用いた。PCR は、DNAポリメラーゼにKOD −plus- （東洋紡）を用い、94℃ ２分、（94℃ 15秒、55℃ 30秒、68℃ ２分）25サイクルの反応プログラムで行った。得られたPCR断片を、発現ベクターpLTex321sのマルチクローニングサイトのSmaI部位とSacI部位に挿入した。DNAシークエンサーにより、CVHI1株由来ヒアルロン酸合成酵素遺伝子cvHAS-HI（配列番号１）およびCVKA1株由来ヒアルロン酸合成酵素遺伝子cvHAS-KA（配列番号２）のDNA配列を確認した。
【００２８】
実施例２ cvHASの酵母での発現および抽出方法
cvHAS-HIまたはcvHAS-KAを含む酵母（BY4743）を30℃で一晩培養した。この前培養液1mlを100mLのSD培地（0.67% Yeast nitrogen base w/o AA、2% グルコース、0.02％ アデニン硫酸塩、0.02％ L-トリプトファン、0.02％ L-ヒスチジン、0.03％ リジン一塩酸塩、0.03％ L-メチオニン、-0.03％ L-ロイシンを含む）に接種し、30℃で18時間培養した。その後、組換えcvHASを発現誘導するため、低温(10℃)にて48時間培養した。培養終了後、培養液の遠心分離を行うことにより菌体を回収し、30mlのバッファー（50mM リン酸緩衝液（pH7.0）、５％ グリセロール、1mM EDTA、1mM ベンズアミジン、1mM ふっ化フェニルメチルスルホニル（PMSF）および1mM ジチオスレイトールを含む）で懸濁した後、フレンチプレスにより菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（12,000rpm、20分）し、さらにその上清を超遠心分離（x100,000g、１時間）することにより粗膜画分を抽出し、200μlのバッファー（上記と同様）で再懸濁し、cvHAS粗抽出液とした。
【００２９】
実施例３ ヒアルロン酸合成酵素活性の測定
酵母で生産されたcvHAS粗抽出液を用いてヒアルロン酸をin vitroで合成し、その反応液中のヒアルロン酸濃度を測定することによりヒアルロン酸合成酵素活性を表した。In vitroヒアルロン酸合成は、50mM トリス緩衝液（pH7.0） 、20mM MgCl2、0.1mM EGTA、10mM 2-ME、0.05% BSA、1mM UDP-GlcA、1mM UDP-GlcNAc、および10μlの cvHAS粗抽出液を含み、全量100μlに調整した反応液を37℃で20時間反応させた。反応後、90℃にて3分間加熱し、反応を終了させた。反応液を遠心後、上清をヒアルロン酸の測定に用いた。
【００３０】
ヒアルロン酸の測定は、ヒアルロン酸結合タンパク質によるヒアルロン酸の測定試薬のヒアルロン酸プレート「中外」（富士レビオ）を用いた。ヒアルロン酸プレート「中外」は、ヒアルロン酸結合タンパク質を用いたサンドイッチ結合型ヒアルロン酸定量方法である。マイクロタイタープレート上に固定化したヒアルロン酸結合タンパク質に検体中のヒアルロン酸を結合させた後、酵素標識ヒアルロン酸結合タンパク質を結合させ、サンドイッチを形成させる。引き続き、テトラメチルベンチジン(TMB)および過酸化水素を加えると、標識酵素のペルオキシダーゼの作用でTMBが酸化されて呈色する。反応停止液を添加後、プレートリーダーで波長450nm、対照波長620nmで吸光度を測定（A450）することにより、サンプルのヒアルロン酸濃度が評価できる。本キットに付属している標準ヒアルロン酸溶液を用いて標準曲線を作製し、上記の反応前後の反応液の吸光度から、反応液中に合成されたヒアルロン酸濃度を算出した。
【００３１】
また、粗抽出液のタンパク質濃度はBSAを標準タンパク質として用い、Bio-Rad protein assay reagent（バイオラッド）により測定した。
【００３２】
また、ヒアルロン酸合成酵素活性は、ヒアルロン酸粗抽出液に含まれている1ｍｇあたりのタンパク質が１時間あたりに合成したヒアルロン酸量(ng-HA/h/mg-protein)を計算することにより表１でHAS活性として表示した。
【００３３】
表１において、ヒアルロン酸合成酵素を含まないベクターにより形質転換した酵母由来の粗抽出液をmockと表した。クロレラウイルスCVHI1株およびCVKA1株由来のヒアルロン酸合成酵素を含むベクターにより形質転換した酵母由来の粗抽出液をcvHAS-HIおよび cvHAS-KAとそれぞれ表した。
【００３４】
【表１】
【００３５】
表１の結果に表されるように、単離した遺伝子がヒアルロン酸合成酵素活性を有することが確認された。
実施例４ cvHASの至適温度
実施例３でヒアルロン酸合成酵素活性の確認されたcvHAS粗抽出液を用い、cvHASの至適温度を調べた。In vitroヒアルロン酸合成は、50mM トリス緩衝液（pH7.0） 、20mM MgCl2、0.1mM EGTA、10mM 2-ME、0.05% BSA、1mM UDP-GlcA、1mM UDP-GlcNAcおよび10μlの cvHAS粗抽出液を含み、全量100μlに調整した反応液を10〜42℃の温度範囲で１時間反応させた。実施例３に示した方法でcvHAS粗抽出液のヒアルロン酸合成酵素活性を測定し、各温度における相対活性を表した。その結果を図1に示す。図１の結果に表されるように、cvHAS-HIの至適温度は37℃付近であることが確認された。
実施例５ cvHASの至適ｐＨ
実施例３でヒアルロン酸合成酵素活性の確認されたcvHAS粗抽出液を用い、cvHASの至適ｐＨを調べた。In vitroヒアルロン酸合成は、20mM MgCl2、0.1mM EGTA、10mM 2-ME、0.05% BSA、1mM UDP-GlcA、1mM UDP-GlcNAc、10μlのcv HAS粗抽出液及び50mM リン酸緩衝液（pH5.5〜7.5）を含み、全量100μlに調整した反応液を37℃で１時間反応させた。実施例３に示した方法でcvHAS粗抽出液のヒアルロン酸合成酵素活性を測定し、各pHにおける相対活性を表した。その結果を図2に示す。図２の結果に表されるように、cvHAS-HIの至適pHは7.0付近であることが確認された。
実施例６ cvHASの金属イオン要求性
実施例３でヒアルロン酸合成酵素活性の確認されたcvHAS粗抽出液を用い、cvHASの金属イオン要求性を調べた。In vitroヒアルロン酸合成は、50mM トリス緩衝液（pH7.0） 、20mM MgCl2あるいはMnCl2、0.1mM EGTA、20mM 2-ME、0.05% BSA、1mM UDP-GlcA、1mM UDP-GlcNAc、および10μlのcv HAS粗抽出液を含み、全量100μlに調整した反応液を37℃で１時間および２時間反応させた。反応後、90℃にて3分間加熱し、反応を終了させた。実施例３に示した方法でcvHAS粗抽出液のヒアルロン酸合成酵素活性を測定し、各金属イオン存在下における活性を表した。その結果を図3に示した。図３の結果に表されるように、cvHASはMg2+イオンに対する金属要求性が高く、Mn2+イオン存在下ではMg2+イオン存在下と比較して、酵素活性が１０％以下であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ヒアルロン酸合成酵素の各温度における相対活性を示す。
【図２】ヒアルロン酸合成酵素の各ｐＨにおける相対活性を示す。
【図３】各金属イオン存在下におけるヒアルロン酸合成酵素活性を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなるヒアルロン酸合成酵素遺伝子：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列又はその相補鎖からなるＤＮＡ；
（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）上記（ａ）のＤＮＡと９６．８％超のホモロジーを有し、且つ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなるヒアルロン酸合成酵素遺伝子：
（ａ）配列番号２で示される塩基配列又はその相補鎖からなるＤＮＡ；
（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）上記（ａ）のＤＮＡと９６．５％超のホモロジーを有し、且つ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
【請求項３】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドからなるヒアルロン酸合成酵素：
（Ａ）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド；
（Ｃ）上記（Ａ）のアミノ酸配列と９７．８％超のホモロジーを有し、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドからなるヒアルロン酸合成酵素：
（Ａ）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド；
（Ｃ）上記（Ａ）のアミノ酸配列と９７．８％超のホモロジーを有し、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなるヒアルロン酸合成酵素遺伝子：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列又はその相補鎖からなるＤＮＡ；
（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）上記（ａ）のＤＮＡと９６．８％超のホモロジーを有し、且つ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなるヒアルロン酸合成酵素遺伝子：
（ａ）配列番号２で示される塩基配列又はその相補鎖からなるＤＮＡ；
（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）上記（ａ）のＤＮＡと９６．５％超のホモロジーを有し、且つ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入され且つヒアルロン酸合成活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
【請求項３】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドからなるヒアルロン酸合成酵素：
（Ａ）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド；
（Ｃ）上記（Ａ）のアミノ酸配列と９７．８％超のホモロジーを有し、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドからなるヒアルロン酸合成酵素：
（Ａ）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド；
（Ｃ）上記（Ａ）のアミノ酸配列と９７．８％超のホモロジーを有し、かつ、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するポリペプチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−２０４２６０（Ｐ２００６−２０４２６０Ａ）
【公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２３９９２（Ｐ２００５−２３９９２）
【出願日】平成１７年１月３１日（２００５．１．３１）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月３１日（２００５．１．３１）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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