ヒトシスタチンＣを評価するための比濁イムノアッセイ
【課題】比濁法によってヒトシスタチンＣの測定を可能とし、現在の技術の状態よりも強くそして速い比濁信号をもたらす比濁イムノアッセイおよび試薬を提供する。
【解決手段】増大したそしてより速い信号は、新しい試薬および組成物によって達成され、より短いアッセイ時間とより強い信号を有する動力学的読みを可能とし、全体のアッセイスピードと品質を改善する。脂質に対する改善された頑丈さおよび改良された直線性が得られる。
【解決手段】増大したそしてより速い信号は、新しい試薬および組成物によって達成され、より短いアッセイ時間とより強い信号を有する動力学的読みを可能とし、全体のアッセイスピードと品質を改善する。脂質に対する改善された頑丈さおよび改良された直線性が得られる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異性ナノ粒子抗体接合体の使用によるヒト体液サンプル中のヒトシスタチンＣを評価するための改良された比濁イムノアッセイ、前記アッセイの使用による患者の糸球体濾過速度の評価方法、対応する反応キット、改良されたナノ粒子抗体接合体、および上記の医学的目的のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
シスタチンＣは、１９８１年にＡ．ＧｒｕｂｂおよびＨ．Ｌｏｖｂｅｒｇにより発見され、キャラクタライズされた（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ
１９８２：７２）。シスタチンＣは、後にシスタチンタンパク質スーパーファミリーと命名されたものの中で発見された最初のタンパク質である。シスタチンタンパク質スーパーファミリーは、システインプロテアーゼ酵素を阻害するタンパク質グループである。シスタチンＣの他の生物学的機能は現在解明中である。シスタチンスーパーファミリーの他のメンバーと反対に、シスタチンＣはすべての体液中に存在するのに対し、異なるシスタチンの全体組成は体液から体液へ、そして異なるコンパートメントにおいて変動する（Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ
Ｍ．ｅｔ ａｌ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８６；２６１：１１２８２）。１９９０年にＡｂｒａｈａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．は、シスタチンＣはヒト体内のすべて（または殆どすべて）の有核細胞に存在し、“家庭内”タンパク質と呼ばれるものであることを証明した（Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ
Ｍ．ｅｔ ａｌ：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９０；２６８：２８７−９７）。
【０００３】
分子量１３ｋＤを持つシスタチンＣは、腎臓の糸球体膜を通って自由に濾過されるが、その後糸球体膜を通過するペプチドおよび小さいタンパク質の大部分を再吸収する腎臓のコンパートメントである、前腎小管において再吸収され、異化される。この態様において腎臓はこれらのタンパク質物質を体のために保存し、尿への損失を妨げる（Ｊａｃｏｂｓｏｎ
Ｂ ｅｔ ａｌ：Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ １９９５；２６：５５９−６４；Ｈｅｙｍｓ ＳＢ，ｅｔ ａｌ：Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．１９８３；３７：４７８）。
【０００４】
今まで糸球体濾過速度（ＧＦＲ）のためのマーカーとして最も多く使用されているクレアチニンは、筋肉細胞において生産される小分子量分子である。それ故クレアチニンの生成および排泄速度は体の筋肉質量に密接にリンクしている。集団中の個人の筋肉質量はかなり変動することが良く知られている。老人はしばしば体重に比較して低い筋肉質量を有し、また多数の患者は彼等の病気の進行につれて筋肉質量をそう失する。子供は大人に比較して一般に異なる相対的筋肉質量を有し、そして男性は女性よりも平均して高い相対的筋肉質量を有する。それ故、血清クレアチニン濃度が糸球体濾過速度のためのマーカーとして使用される時、糸球体濾過速度の５０％減少が起こっている時でさえ血清クレアチニン値は参照範囲内にあると判定され得る（Ｓｈｅｍｅｓｈ
Ｏ，ｅｔ ａｌ：Ｋｉｄｎ，Ｉｎｔ．１０８５；２８：８３０−８）。または食事も、特に高タンパク食事もクレアチニンの血清レベルに有意に影響する（Ｐｅｒｒｏｎｅ ＲＤ．ｅｔ
ａｌ；Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９２；３８：１９３３−５３）。
【０００５】
血清および血漿クレアチニン測定は、糸球体濾過速度のための標準的方法として信頼できない。Ｃｒ−５１−ＥＤＴＡまたはＴｃ−９９ｍのような放射性標識物質の静脈内注射、またはｉｏｈｅｘｏｌのようなヨウ素化剤の注射がそのためある程度の普及を獲得した。これらの方法の費用および時間がかかり、注射が必要であり、そしてしばしば採血がくり返される。Ｇｒｕｂｂ
ｅｔ ａｌ．によるＣｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５１：８，１４２０−１４３１中の発表“Ｓｉｍｐｌｅ Ｃｙｓｔａｔｉｎ
Ｃ−Ｂａｓｅｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｅｑｕａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｒａｔｅ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｄｉｅｔ ｉｎ Ｒｅｎａｌ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｅｑｕａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｄｕｌｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｃｈａｒｔｚ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｏｕｎａｈａｎ−Ｂａｒｒｅｔｔ
Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｅｑｕａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ”において、血液中の簡単なシスタチンＣ測定が糸球体濾過速度を測定するための複雑な方法に代り得ることが示された。
【０００６】
シスタチンＣ測定は、最初古典的生化学的方法を用いたが、しかしすぐ比ろう分析（ｎｅｐｈｒｏｍｅｔｒｙ）イムノアッセイへ移行した。Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ
Ｃｏｍｐａｎｙは比ろう測定方法を開拓した。Ｃｏｌｌ，Ｅ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０００：３６，２９３４を見よ。比ろう方法は非常に信頼できる。比ろう方法の欠点は、機器自体が光透過率に基づく自動分光計に比較してむしろ遅い処理スピードであることである。Ｄａｄｅ
Ｂｅｈｒｉｎｇ製造の比ろう計、典型的にはＢＮＩＩ比ろう計およびＰｒｏＳｐｅｃ比ろう計、およびＢｅｃｋｍａｎ機器は実質的なマーケット普及を獲得したが、しかし透過率測定に基づく機器よりも広く普及していない。比ろう計はまた、透過率測定に基づく大型自動機器よりもかなり低いサンプルスループットを有する。H．Ｓｔｏｍｅ ｅｔ ａｌ．は、Ｃｌｉｎｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ８，ｐｐ１４８２−８５，２００１中の論文“Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ａ ｐａｒｔｉｌｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ
ｆｏｒ ｓｅｒｕｍ ＣｙｓｔａｔｉｎＣ ｕｓｉｎｇ ｒａｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ”において速度比ろう分析法を提供した。しかしながら、多数のサンプルについて限られたキャパシティを有し、そして比ろう計機器の数も限られる。それ故、吸収分光光度均質機器への移行の需要が存在した。けだしそのような機器はもっと豊富であり、高いキャパシティを有するからである。
【０００７】
デンマークのＤａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎは比濁シスタチンイムノアッセイの分野を開拓した。この技術の状態は、２００５年７月のＤａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ
ＡＳのウエブサイトからダウンロードされたプレゼンテーションである以下の論文に記載されている。Ｃ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１０
Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００４，“ＣｙｓｔａｔｉｎＣ−Ｔｈｅ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｃｈｏｉｃｅ ｆｏｒ ｒｅｎａｌ
ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔｉｎｇ”，Ｃ．Ｓｃｈｍｉｄｔ ａｎｄ Ｋ．Ｇｒｏｎｋｊａｒ，“Ｎｅｗ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｒｂｉｍｅｔｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ
ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｃｙｓｔａｔｉｎ Ｃｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ”
【０００８】
しかしながら比濁測定は、Ｄａｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ２７，ｐ．５０９，１９９０中の論文“Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ ｉｍｍｕｎｏｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ”に記載されているように、サンプルの混濁度によって妨害される。２９ｔｈ
Ｎｏｒｄｉｃ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｌｍｏ，Ｓｗｅｄｅｎ，２４−２７ Ａｐｒｉｌ ２００４において、Ａ．ＧｒｕｂｂはシスタチンＣ測定結果において血清および血漿サンプル中のトリグリセライドからの妨害の結果を報告した。それ故ヒトシスタチンＣのための比濁イムノアッセイについて改良の必要性がなお存在する。
【０００９】
均質イムノアッセイ系の代替法は分離に基づく非均質イムノアッセイ系であろう。非均質イムノアッセイ系の利点は、アッセイの実施の間洗浄を伴う分離ステップによって特徴付けられる。これらのシステムの利益は、洗浄によっていかなる妨害物質をも除去することである。さらに、非結合抗体および非結合酵素または蛍光または着色または他の信号発生部分の洗い流しを許容する。以後検体と呼ぶ測定すべき物質は、抗体への結合に対し標識アナログと必ずしも競合しなければならないことはないので、これらの方法は一般に非競合的である。この面として洗浄ステップは、固定化抗体の大過剰の標識抗体の使用を可能とし、もし高品質抗体が使用されるならば、高い感度と通常高レベルの正確度にする。
【００１０】
固相および他の非均質イムノアッセイシステムには多数の教科書がある。大型の自動システムは商業的に入手し得る。Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｄｉｖｉｓｏｎ
ＵＳは、ＩｍＸ，ＡｘＳＹＭおよび他の自動非均質イムノアッセイ機器のための試薬を販売しており、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＧｅｒｍａｎｙはＥｌｅｃｓｙｓおよび他の非均質イムノアッセイシステムの試薬を販売しており、そして非均一イノムアッセイシステムおよび試薬の多数のサプライヤーが存在する。なお非常にポピュラーな非均質イムノアッセイシステムは、いわゆるマイクロタイターイムノアッセイシステムである。これらシステムは遅いが、しかし信頼できそして安価である。一般的なイムノアッセイ文献は、当業者に良く知られたこれらシステムに関する多数の情報を与える。
【００１１】
非均質イムノアッセイシステムの欠点は、単位時間、すなわち運転時間あたりの高いアッセイ数のためのキャパシティーの欠如である。これら方法は分離および洗浄ステップを含み、自動化されているが機器運転時間を占める。さらに固相が含まれるので、たとえ大量生産してもいくらかの生産コストを有する特別のデバイスまたは固相がしばしば使用される。結果発生の高いスループットおよびスピードは、絶えず増加している実施すべきテスト数のために近年増々重要になっている。アッセイを非均質、しばしば固相に基づくイムノアッセイ技術から均質イムノアッセイシステムへ移行させる需要が存在する。
【００１２】
均質イムノアッセイシステムは構成が簡単であり、そして高いスループット能力を有する。試薬が混合され、インキュベートされ、そしてインキュベーション中またはインキュベーション後測定される。エンドポイントまたは異なる時間ポイント間の信号の差または連続的動力学的測定が使用される。信号は蛍光、色または不透明度（混濁度）の測定であり得る。特に、色および／または不透明度／混濁度の測定のための大型自動機器が非常に成功的であった。日本の日立はＲｏｃｈｅと協力してこの大規模オートメーションを開拓したが、オリンパスおよびバイエルを含む多数の他のメーカーもそのような機器および試薬を供給している。これらの機器は、異なる波長においてそして異なる時間ポイントにおいてサンプルと試薬の混合物を通過する光の透過率を測定する自動マルチウエル分光光度計である。比濁シスタチンＣイムノアッセイはそのような均質高キャパシティ機器で行われるので、これは何故高品質比濁シスタチンＣアッセイが要望されるかの他の理由である。
【００１３】
大部分の均質イムノアッセイシステムは、サンプルと、標識した検体または検体アナログの良く制御された濃度を含む試薬溶液と、そして検体に対して特異性親和性を有する抗体を混合することに基づいている。サンプル中の検体分子は標識検体または検体アナログと競合し、信号を発生する。広範囲のイムノアッセイ文献は種々の標識およびアナログの使用を教える。ここでは、今のところ、色信号を発生する高分子量検体（分子量約４０００）のための均質イムノアッセイ法を使用した限られた成功例しか存在しないことに注目しなければならない。（蛍光技術、例えばプロキシミティアッセイを使用した成功例はあったが、しかし利用可能な高スループット自動蛍光計は多くなく、それ故これらの技術は本発明目的には役立たない。）両社ともカリフォルニア州に存在するＳｙｖａからのＥＭＩＴ技術およびＭｉｃｒｏｇｅｎｉｃｓからのＣＤＥＩＡ技術は、低分子量検体のための均質イムノアッセイにおいて色信号を使用して成功であった。高分子量検体のためには、粒子増強比濁測定がサンプルと試薬の混合物を通る光の透過度を測定する自動マルチウエル分光計のための最も成功的技術である。それ故比濁方法は高分子量検体に適している。比濁法の一般的記述は多数のイムノアッセイ教科書に見られる。
【００１４】
何故シスタチンＣの高精度測定が必要か？生物学の眺望から、シスタチンＣおよびクレアチニン、それに上で引用したメタ検体の生物学についての文献は減少した糸状体濾過速度をモニターし、診断するためクレアチニンの代りにシスタチンＣの使用の方向を目指している。しかしながら、生物学議論はシスタチンＣの使用に味方しているが、生物学的利益はシスタチンＣ分析の正確度および精度が良好である場合のみに重要である。クレアチニン測定の正確度および精度はすぐれており、そしてクレアチニンの代りにシスタチンＣの分析の医学的利益は、もしシスタチンＣイムノアッセイ方法の正確度および精度があまり低ければ容易に失われる。
【００１５】
本発明によって課決すべき課題は、対応する商業的に利用可能な比濁アッセイに比較して、改良された正確度および／または精度および／またはテストサンプル中の脂質およびヘモグロビンからの少ない妨害を有するイムノ比濁シスタチンＣイムノアッセイを提供することである。
【００１６】
シスタチンＣの比濁測定の先行技術の他の欠点は、長いアッセイ時間および／または非精密へ導く混濁度変化の遅い速度である。本発明によって解決すべきさらなる課題は、それ故シスタチンＣのもっと速い比濁測定を提供することである。
【発明の概要】
【００１７】
シスタチンＣの測定のための先行技術比濁イムノアッセイに関連する上記課題は、驚くべきことに、特許請求の範囲に規定され、そして明細書の以後の部分にもっと詳細に説明されている比濁方法によって解決できた。本発明の前記方法は改良されたナノ粒子免疫接合体を特に使用し、これは特に異なるシスタチン濃度、異なる測定波長、異なる反応時間、および異なる温度のような異なる実験条件のもとでもっと速い、および／またはもっと感受性の、および／またはもっと信頼できるシスタチンＣ測定を許容する。本発明のさらなる利益は実験結果から自明である。
【００１８】
免疫粒子および場合により試薬を注意深く調節することにより、驚くほど強いそして速い比濁信号を観察することができ、そしてそれによって妨害を減少させることができ、そして正確度を失うことなく直線性を改良することができた。アッセイ時間も減らすこともできた。
【００１９】
本発明の最良の実施形態は後で記載されるであろうが、しかし反応混合物を調製するため、そして測定を実施するために使用される他の試薬およびステップのシーケンスおよび時間もこの驚くべき結果を達成するために使用することができる。
【００２０】
ナノ粒子のいくつかの供給者、例えばＢａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．ＵＳＡおよびＭｅｒｃｋ Ｓ．Ａ．フランスがある。ナノ粒子へ抗体をカップリングするための接合体サービスの多数の供給者はインターネット上で見出すことができる。Ｄａｋｏ
Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ ＡＳ，デンマークは抗シスタチンＣ抗体へ接合したナノ粒子の供給者であり、そしてそれらは本発明の目的を達成するかどうかについて本発明者らによってテストされた。しかしながら前記先行技術製品は非成功的であった。
【００２１】
本発明者らは、中でも粒子サイズが注意深くバランスされていなければならないことを観察した。大粒子は良好な信号を発生するが、しかしバックグランドが高く、そして結合能力が低く、そのためより高いバックグランドを発生しても多量の粒子を添加しなければならない。Ｄａｋｏ
Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ ＡＳのような以前のアッセイ供給者からの製品、製品番号ＬＸ００２／ＥＦＧ／ＣＳ／２５．１０．０４，Ｓ２３６１／ＥＦＧ／ＫＧ／０９．０７．０３およびＸ０９７４／ＥＦＧ／ＳＵＭ／０９．０９．０４は良好な比濁信号を達成しなかった。
【００２２】
一般的用語の定義
本発明に従ったアッセイ方法に使用される「体液サンプル」は、哺乳動物、特にヒトから得られ、シスタチンＣを含有するサンプルである。いかなるシスタチンＣ含有液体サンプルも使用できる。本発明に従ってアッセイされる前記サンプルは、いかなるシスタチンＣ含有生物学的流体または組織抽出液でも良く、そしてアッセイ前に前処理されても良い。好適なサンプルの例は、血液、血清および血漿のような血液分画、そしてＥＤＴＡ−血液、ＥＤＴＡ−血漿、クエン酸−血漿、ヘパリン−血漿のような前処理血液、または尿サンプルである。始めに得られたサンプルまたはその分画はこの分野で知られた方法により、例えば分画または希釈によってさらに修飾することができる。分画はアッセイを妨害するかも知れない成分を除去するために実施することができる。希釈は元のサンプルまたはその分画を成分、例えば検体の濃度を調節するために緩衝液のような適切なサンプル液と混合することによって実施することができる。そのような修飾したサンプルは、哺乳類の体から採取または単離したオリジナルの体液サンプルから誘導されたサンプルを例示する。
【００２３】
本発明に従って分析される「検体」はシスタチンＣ、特に健康または病気の個人の体によって生成されたヒトシスタチンＣである。検体として、シスタチンＣの誘導体または天然シスタチンＣとシスタチンＣの混合物を使用することも可能である。シスタチンＣの誘導体の非限定例は、適当な検出可能なマーカー、例えば放射性、金属または発色団標識を担持しているシスタチンＣ化合物である。
【００２４】
「評価」は、定性的またはサンプル中に存在する検体、ここではシスタチンＣの量または濃度の絶対値を得る意味で、そしてサンプル中の検体のレベルを示す指数、比率、パーセントまたは可視的または他の値を得る意味で定量的決定の両方を含むことを意図する。評価は直接または間接でよく、そして実際に検出される化学種は勿論検体そのものである必要はなく、例えばその誘導体でも良い。
【００２５】
「均質イムノアッセイ」は、非均質イムノアッセイとは反対に、構成が簡単で、そしてより高いスループット能力を持っている。特に均質アッセイは、分離ステップの形のサンプルの前処理ステップ、例えばサンプルをクロマトグラフィーカラムのような固相マトリックスへ適用し、そしてオリジナルの複合サンプルのオリジナル成分の部分から検体を分離することによる分離ステップを含まない。均質アッセイのためには、サンプルと試薬が混合され、インキュベートされ、インキュベーション中またはその後に測定される。エンドポイント信号または異なる時間ポイント間の信号の差または連続的動力学的測定が使用される。
【００２６】
「粒子増強」比濁測定またはイムノアッセイは、本発明に従って使用されるナノ粒子またはナノ粒子免疫接合体に関連した「光散乱性質」に基づいている。そのようなナノ粒子は好ましくは狭いサイズ分布を持ったほぼ球形である。前記粒子のサイズは普通それらの平均直径によって表現される。良く知られる光散乱の法則によれば、前記光散乱性質は粒子サイズおよび／または媒質に対する粒子の屈折率の比によって影響される。弱い光散乱性質は小さい粒子サイズおよび／または媒質に対する粒子の屈折率の低い比から生じ得る。レイリーの散乱法則参照。
【００２７】
ナノ粒子のサイズおよび／または屈折率比は、凝集したナノ粒子免疫接合体の検出のために使用される波長において光散乱を発生することができなければならない。粒子サイズは一般に検出波長より小さいように選ばれる。
【００２８】
本発明に従ってサンプル混濁度の変化を測定するために使用される「検出波長」は通常３００ｎｍないし１２００ｎｍ、好ましくは４００ないし７００ｎｍ、特に５００ないし６００ｎｍである。
【００２９】
本発明の分析方法の「正確度」は、より信頼し得る参照方法によって決定された濃度と比較して、サンプル中のシスタチンＣの濃度を正確に決定することができる該方法の能力である。
【００３０】
本発明の分析方法の「精度」は、サンプル中のシスタチンＣの濃度がくり返して決定される時の結果の変動である。
【００３１】
本発明に従ったアッセイの「頑強性」は、妨害物質と、そしてシスタチンＣ濃度決定の得られる値に影響することなくアッセイ条件の変動に耐える方法の能力である。
【００３２】
本発明の文脈において使用される「不活性タンパク質」は、本発明のアッセイ方法を妨害しないいかなる起源（例えばヒトまたは非ヒト哺乳類、微生物）のタンパク質であり、特にそれは分析されるシスタチンＣに対して、および／または本発明のアッセイ方法に使用される抗体に対して検出可能な親和性を実質上持っていてはならない。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】直線回帰によって得た異なる患者の血清について希釈係数に対する本発明に従って測定した平均シスタチンＣ値のプロットを示す。
【図２】一次回帰によって得た、異なる患者の血清についての希釈係数に対する本発明に従って測定した平均シスタチン値のプロットを示す。
【図３】二次回帰によって得た、異なる患者の血清についての希釈係数に対する本発明に従って測定した平均シスタチン値のプロットを示す。
【図４】アッセイ実施例４の血清１のためのＤＬ（％）プロットを示す。
【図５】アッセイ実施例４の血清３のためのＤＬ（％）プロットを示す。
【図６】直線回帰によって得た、一患者の血清についての希釈係数に対する本発明に従って測定した平均シスタチンＣ値のプロットを示す。
【図７】二次回帰によって得た、一患者の血清についての希釈係数に対する本発明に従って測定した平均シスタチンＣ値のプロットを示す。
【図８】三次回帰によって得た、一患者の血清についての希釈係数に対する本発明に従って測定した平均シスタチンＣ値のプロットを示す。
【図９】アッセイ実施例５の血清ＡのＤＬ（％）プロットを示す。
【図１０】直線回帰によって得た、異なる患者血清についての希釈係数に対する本発明に従って測定した平均シスタチン値のプロットを示す。
【図１１】一次回帰によって得た、異なる患者血清についての希釈係数に対する本発明に従って測定した平均シスタチン値のプロットを示す。
【図１２】二次回帰によって得た、異なる患者血清についての希釈係数に対する本発明に従って測定した平均シスタチン値のプロットを示す。
【図１３】アッセイ実施例６（先行技術）の血清１のためのＤＬ（％）プロットである。
【図１４】アッセイ実施例６（先行技術）の血清２のためのＤＬ（％）プロットである。
【図１５】アッセイ実施例６（先行技術）の血清３のためのＤＬ（％）プロットである。
【図１６】本発明に従った比濁法による、および先行技術の比ろう法によるシスタチンＣのアッセイ方法の間の相関性の検討結果を示す。
【図１７】本発明に従った比濁法による、および先行技術の比ろう法によるシスタチンＣのアッセイ方法の間の相関性の検討結果を示す。
【図１８】本発明に従った比濁法による、および先行技術の比ろう法によるシスタチンＣのアッセイ方法の間の相関性の検討結果を示す。
【００３４】
本発明の詳細な記述
ａ）本発明の局面
本発明の最初の局面は、ヒト体液サンプルまたはそれから誘導されたサンプル中のヒトシスタチンＣを評価するための粒子増強比濁イムノアッセイに関し、該アッセイは、
（１）前記サンプルまたはその希釈液を、比濁測定に適したナノ粒子を含んでいるナノ粒子−抗体接合体（またはナノ粒子−免疫接合体）と接触させることによってアッセイ混合物を生成し、ここで前記ナノ粒子は前記シスタチンＣへ結合するように抗ヒトシスタチンＣ抗体またはその抗原結合性フラグメントで被覆されており、ここで前記被覆されたナノ粒子は少なくとも４０ｎｍの、例えば少なくとも４５，５０，５５または５８ｎｍの、好ましくは５８ｎｍより大きいメディアン直径を有し、そして
（２）前記混合物の混濁度の変化を測定することによってヒトシスタチンＣの含量を評価することを特徴とする。
【００３５】
好ましくは、前記抗体はヒトシスタチンＣに対するポリクローナル非ヒト、非ネズミ抗体を含み、特に前記ポリクローナル抗体はヒトシスタチンＣに対する鳥類抗体を含む。
【００３６】
さらなる好ましい具体例においては、前記ポリクローナル抗体またはそのフラグメントの少なくとも２５ｗｔ％はヒトシスタチンＣのアフィニティ精製によって得られたものである。アフィニティ精製によってヒトシスタチンＣへ結合する抗体の割合が増加する。加えて、アフィニティ精製により混合物から除去された抗体よりも高い親和性を有するヒトシスタチンＣ結合抗体を富化することができる。
【００３７】
例えば、本発明に従って使用される好適な抗体は、固相へ固定化したヒトシスタチンＣへの鳥類抗ヒトシスタチンＣ抗血清の結合を通じて鳥類抗体をアフィニティ精製し、そして好ましくはリン酸塩緩衝食塩水で洗浄後結合した抗体を０．０５Ｍないし０．２Ｍ、または０．０８ないし０．１２Ｍの範囲の、特に約０．１Ｍのモル濃度、および約３ないし３．５、または３．１ないし３．３の範囲の、特に約３．２のｐＨのクエン酸緩衝液（例えば後の実験の部でさらに詳しく説明するような）で溶出することによって得られる鳥類（例えばポリクローナル）抗体のアフィニティに相当する（または実質的に等しい）ヒトシスタチンＣに対するアフィニティを有することができる。
【００３８】
さらなる具体例において、前記抗体は、（ａ）ヒトシスタチンＣの単一エピトープへ結合するモノクローナル抗体か、または（ｂ）モノクローナル抗体の各スペーシスがヒトシスタチンＣの異なるエピトープへ結合するモノクローナル抗体の２以上のスペーシスか、または異なる結合強度（アフィニティ）で同じエピトープへ結合する２以上のスペーシスのセットを含む。
【００３９】
前記モノクローナル抗体はヒトまたは非ヒト起源（例えばネズミ、ヒツジ、ヤギ、鳥類またはウサギ起源）のどちらかである。
【００４０】
本発明に従って使用される被覆ナノ粒子は、好ましくは５８ｎｍより大きい平均直径、特に５９ないし１６０、６０ないし１４０、７０ないし１２０、７５ないし１１０，８０ないし９５ｎｍの範囲の平均直径を有する。好ましくは、それらは抗体の層で被覆される。特に前記層は約５ｎｍの大よその厚みを有する単一層と考えることができる。この層は完全（粒子は抗体で飽和）か、またはもっと好ましくは不飽和（すなわち粒子が提供する結合能力より少ない抗体が使用される）であることができる。
【００４１】
さらなる好ましい具体例においては、前記被覆ナノ粒子はナノ粒子−抗体接合体の全重量に対して、約５ないし３５％、特に１０ないし３０％または１５ないし２５％の抗体で不完全に被覆される。
【００４２】
さらなる好ましい具体例においては、ナノ粒子は抗体と、不活性な、好ましくは親水性のタンパク質との混合物で被覆される。例えば、ナノ粒子の表面へ結合した全タンパク質の２０ないし９０％、もっと好ましくは３５ないし８０％、さらに好ましくは４０ないし７０％が抗シスタチンＣ抗体によって構成される。そのような粒子は、好ましくは前記非被覆粒子の結合容量に応じて粒子へ理論上結合し得る抗体の量よりも少ない量において抗体を担持する。同時に、抗体分子によって被覆されない粒子表面積は不活性な、好ましくは親水性タンパク質によって飽和される。
【００４３】
好ましい具体例において、前記のオリジナルの非被覆ナノ粒子は本質的にラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、エポキシ樹脂、ポリ塩化ビニリデン、ポリα−ナフチルメタクリレート、ポリビニルナフタレン、およびそれらの対応する共重合でつくられる。他の好適な粒子材料はこの分野によって利用可能であり、そして本発明の教えに誘導されて当業者は適切な選択をなし得る立場にあるであろう。
【００４４】
クレームした方法のさらなる具体例によれば、混濁度変化は５００ないし６００ｎｍの範囲の波長において、好ましくは１０ないし５０℃の範囲の温度において、そして好ましくは反応時間３０ないし６００秒、例えば４０，１２０，２６０または６００秒後における前記アッセイ混合物の吸光度の変化によって測定される。
【００４５】
本発明は、シスタチンＣ含有流体サンプルまたはシスタチンＣ含有液から誘導されたサンプル、またはシスタチンＣ含有サンプルの希釈液を、前記シスタチンＣを結合するようにポリクローナルまたはモノクローナル抗シスタチンＣ抗体または抗体フラグメント結合ナノ粒子と接触させることによってアッセイ混合物を生成し、そして該混合物の混濁度の変化を測定することによってシスタチンＣの含量を評価することを特徴とする、体液サンプルまたは体液から誘導されたサンプル中のシスタチンＣを測定するための比濁イムノアッセイ方法を提供し、そして混濁度は以下の表Ａに述べた一定の最小サイズの被覆ナノ粒子との混合物の生成後、与えられた時間、与えられた温度において混合物が保たれた時の与えられた波長の光の前記混合物の吸光度の変化によってさらに特徴付けられる。
【００４６】
【００４７】
例として、吸光度変化の最高速度は、与えられたテスト条件の各自について観察された上記最高レベルよりも約４倍、好ましくは約２または４倍高い。
【００４８】
例として、以下の値を得ることができる。
３７℃、２６０秒、メディアン直径９２ｎｍ：
Ｃｙｓ．Ｃ濃度９．９μｇ／ｌ：６５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ
Ｃｙｓ．Ｃ濃度１９．８μｇ／ｌ：２０３ｍＡｂｓ単位／ｃｍ
Ｃｙｓ．Ｃ濃度２６．６μｇ／ｌ：２４４ｍＡｂｓ単位／ｃｍ
Ｃｙｓ．Ｃ濃度３４．１μｇ／ｌ：４２０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ
Ｃｙｓ．Ｃ濃度４４μｇ／ｌ：６２３ｍＡｂｓ単位／ｃｍ
３２℃、６００秒、メディアン直径９２ｎｍ：
Ｃｙｓ．Ｃ濃度９．９μｇ／ｌ：２９ｍＡｂｓ単位／ｃｍ
Ｃｙｓ．Ｃ濃度１９．８μｇ／ｌ：６２ｍＡｂｓ単位／ｃｍ
Ｃｙｓ．Ｃ濃度２６．６μｇ／ｌ：１２２ｍＡｂｓ単位／ｃｍ
Ｃｙｓ．Ｃ濃度３４．１μｇ／ｌ：１６７ｍＡｂｓ単位／ｃｍ
Ｃｙｓ．Ｃ濃度４４μｇ／ｌ：３８８ｍＡｂｓ単位／ｃｍ
【００４９】
本発明のさらなる好ましい方法は、比ろう方法に対する相関曲線が作成される時、０．１５ｍｇ／ｌ未満、好ましくは０．１およびもっと好ましくは０．０５ｍｇ／ｌ未満のシスタチンＣのインターセプト値が比ろう方法によって得られる０ｍｇ／ｌシスタチンＣの対応する値に対して比濁方法について得られることを特徴としている。
【００５０】
本発明によるさらなる好ましい方法は、非均質イムノアッセイ方法に対する相関曲線が作成される時、０．２５ｍｇ／ｌ未満、好ましくは０．１５ｍｇ／ｌ未満およびもっと好ましくは０．５ｍｇ／ｌ未満のシスタチンのインターセプト値がシスタチン０ｍｇ／ｌシスタチンの対応する値に対して得られることを特徴とする。
【００５１】
本発明によるさらなる好ましい方法は、テストサンプル中の１５ｍｍｏｌ／ｌトリグリセリドから１．２ｍｇシスタチンＣ／ｌのレベルにおけるシスタチンＣの測定値に対して６％未満、好ましくは４％未満、またはもっと好ましくは２％未満の干渉を有することを特徴とする。
【００５２】
本発明によるさらなる好ましい方法は、シスタチンＣ１．３２ないし７．５ｍｇ／ｌの測定範囲において５％以下、好ましくは４％以下、またはもっと好ましくは３％以下の直線性からの偏差、および／またはシスタチンＣ０．７５ないし１．３２ｍｇ／ｌの測定範囲において１５％以下、好ましくは１１％以下、またはもっと好ましくは７％以下の直線性からの偏差を有することによって特徴化される。
【００５３】
本発明によるさらなる好ましい方法は、吸光度の初期増加速度を、（ａ）混合時において直接記録することにより、（ｂ）初期吸光度増加への後方補外法と組合せて混合の少し後で記録することにより、または（ｃ）サンプルと試薬の混合後１分以内の２以上の時間ポイントの間の吸光差を測定することによって測定することによってサンプルのシスタチンＣ濃度を決定することを特徴とする。
【００５４】
本発明のさらなる局面は、哺乳動物の糸球体濾過速度を評価する方法を提供し、この方法は上で測定した方法に従ってヒトシスタチンＣの比濁評価を含む。前記方法は特に腎機能不全（腎不全のような）の診断または治療の間に適用することができる。
【００５５】
本発明のなお他の局面は、（ａ）乾燥または懸濁した形の上で規定した抗シスタチンＣ免疫粒子を含む粒子と、（ｂ）乾燥または溶解した形のアッセイ緩衝液、そして任意に（ｃ）各自乾燥または溶解または懸濁した形の較正混合物および対照混合物よりなる、上で規定した方法を実施するための試薬キットまたはパーツのキット、または試薬のセットのキットに関する。
【００５６】
好ましくは、粒子およびアッセイ緩衝液は組合せで乾燥または懸濁液形で提供される。
【００５７】
本発明の他の局面によれば、上の定義に従った、そして後のもっと詳細な説明に従ったナノ粒子−抗体接合体が提供される。
【００５８】
本発明は、そのようなナノ粒子−抗体接合体のヒトシスタチンＣの評価のためのイムノアッセイにおける、または哺乳動物の糸球体濾過速度の評価のための診断方法における使用に関する。
【００５９】
最後に本発明は、そのようなナノ粒子−抗体接合体のヒトシスタチンＣの評価のためのイムノアッセイにおける、または腎機能不全、例えば腎不全の評価のための診断方法における使用に関する。
【００６０】
ｂ）抗ヒトシスタチンＣ抗体の調製
ｂ１）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗ヒトシスタチンＣ抗体は、例えばＣｈａｓｅ，Ｍ．Ｗ．，１９６７，“Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，ｅｄ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｍ．Ｗ．，ｐｐ．１９７−２０９，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されているようなこの分野で良く知られた方法によって調製することができる。概略すると、適当な種の動物（例えばウサギ、ヤギ、ヒツジ、または好ましくは鳥類種、特にメンドリのようなニワトリ）が適当なアジュバンド、例えばフロインドの完全または不完全アジュバンド中の精製された抗原で繰り返して免疫される。免疫後動物はしゃ血され、そしてポリクローナル抗体が例えば硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウム沈澱、アニオン交換クロマトグラフィー、イムノアフィニティクロマトグラフィー、および／またはアフィニティクロマトグラフィーのような方法によって精製される。
【００６１】
十分な比濁測定信号を得るため、高い貧欲性を有する抗体が好ましい。ポリクローナル抗体は多数の異なる抗体分子を含んでいるので、親和定数を計算することができないが、しかしながら高い貧欲性および親和性は慣用のポリクローナル抗体技術によって得られた。慣用方法によって得られたウサギ抗体が使用されたが、しかしもっと良好な結果はヒツジ抗体で得られた。さらに良好な結果は鳥類抗体を使用する時に得られた。鳥類抗体は、Ｌａｒｓｏｎ
Ａ，Ｂａａｌｏｅｗ Ｒ−Ｍ，Ｌｉｎｄａｈｉ Ｔ，ａｎｄ Ｆｏｒｓｂｅｒｇ Ｐ−Ｏ，Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｌｎｃｅ ７２：１８０７−１８１２，１９９３に記載されている方法によることができる。一般にヒトから一層別個の鳥類はポリクローナル哺乳類抗体より高い貧欲性を有するヒトシスタチンＣに対する抗体を生産できることが企図される。
【００６２】
ポリクローナル鳥類抗体は卵黄から日常的に得られる（そしてそれ故ＩｇＹと呼ばれる）。しかしながら卵黄は多量の脂質を含有し、それらのさらなる使用を厄介にする。ＩｇＹは段階的な硫酸アンモニウム（例えば２５から４０％）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈澱を使用して卵黄から単離することができる。初期精製のため、Ｇａｌｌｕｓ
Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ，Ｃａｒｙ ＵＳＡから得ることができる商業的ＩｇＹ精製キット、またはＰｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡから得ることができるＥｇｇｃｅｌｌｅｎｔ
Ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＹ精製キットを製造者の指示書を考慮して使用することができる。
【００６３】
さらにポリクローナル抗体の貧欲性は、抗原アフィニティ精製方法、例えばｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ（Ａｐｒｉｌ ２００６）からダウンロードされる“Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”の教えに従って精製された抗体を使用することによってさらに増大し得る。アフィニティ精製は後でさらに詳しく記載される。
【００６４】
特に増大した貧欲性は、使用した抗体の２０％が抗原アフィニティ精製された時に観察され、さらなる増大は抗体の５０％が抗原アフィニティ精製された時に観察され、さらにより大きい増強は７５％以上、例えば抗体の７５ないし１００％を抗原アフィニティ精製方法によって得た時に観察された。
【００６５】
貧欲なポリクローナル抗ヒトシスタチンＣ抗体のアフィニティ精製のためには適切なヒトシスタチンＣアフィニティカラムを調製しなければならない。精製したヒトシスタチンＣが標準的プロトコールによって適当な固相支持体、例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＡｆｆｉ−ｇｅｌへ抗原を共有結合するように活性化して固定される（適当な活性固相支持体は例えばＰｉｅｒｃｅ
Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡから入手できる）。次にアフィニティカラムが前記抗原担持樹脂から調製される。
【００６６】
抗体の成功的アフィニティ精製は抗体の結合部位への抗原上の適切なエピトープの効果的なプレゼンテーションに依存する。もし抗原が小さくそして支持体表面へ多数の化学結合手によって直接固定化されたならば、重要なエピトープがブロックまたは立体障害を受け、効果的な抗体結合を阻害し得る。それ故、独特な官能基（例えばペプチド中の単一末端システインのスルフヒドリル）を使用し、そして数個の原子長のスペーサーアーム中にその反応性基がある活性化支持体を使用して抗体を固定化することが最善である。大きい抗原、特に固定化のための多数の部位を有する抗原については、抗原自体が支持体マトリックスとエピトープの間の効果的なスペーサーとして役立つので、スペーサーアームの長さはさほど重要でない。
【００６７】
各操作のコアはそれぞれの抗原に対する抗体のアフィニティであるので、通常抗体のアフィニティ精製のための典型的な結合および溶離条件の間には少しの変動しか存在しない。抗体は抗原を認識しそして生理学的条件下で抗原を強固に結合するように設計されているので、大部分のアフィニティ精製操作は生理的ｐＨおよびイオン強度を真似する結合条件を使用する。最も普通の結合緩衝液は、ｐＨ７．２および１．５Ｍ
ＮａＣｌのリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）およびトリス緩衝化食塩水（ＴＢＳ）である（あらかじめ混合した緩衝液パックは例えばＰｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡから入手可能）。一旦抗体が固定化抗原へ結合したならば、追加の結合緩衝液が未結合物質を支持体から洗浄するために使用される。非特異性結合を最小化するため、洗浄緩衝液は弱い相互作用を中断するための追加の塩または洗剤を含有することができる。
【００６８】
特異性の精製した抗体は、緩衝液のｐＨおよび／イオン強度を変更することにより（共通の溶離緩衝液は例えばＰｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡから入手可能）アフィニティ樹脂から溶離される。抗体は全般に最小の活性損失をもって２．５ないし１１．５のｐＨ範囲に耐えられる弾力性のタンパク質であり、これは断然最も普通の溶離戦略である。ある場合には、抗体−抗原相互作用はｐＨ変化によって効果的に中断されないか、またはｐＨによって損傷されず、代りに戦略の採用を必要とする。
【００６９】
アフィニティ精製プロトコールの一例を以下に与える。
ステップ１：各使用前残留タンパク質を除去するため、以下の緩衝液のシリーズの１０カラム容積を使用してカラム（〜１ｍｌ樹脂ベッド）を洗浄せよ。
０．２Ｍグリシン，ｐＨ２．８，１０ｍｌ
０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３，ｐＨ８．５．０．５Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍｌ
上の緩衝液でのサイクルを２回繰り返しせよ。次に０．５Ｍへ調節したＮａＣｌを含有するＴＴＢＳ緩衝液（０．３Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ，ｐＨ７．８，０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０，０．０１％
ＮａＮ３）中でカラムを平衡化せよ。
ステップ２：粗製抗体調製物の１０ｍｌ分量と、１０Ｘ ＴＴＢＳ １ｍｌと、４Ｍ ＮａＣｌ ０．５５ｍｌを加えよ。沈澱物を除去するため遠心せよ。
ステップ３：血清と共にアフィニティ樹脂をチューブ（１５ｍｌチューブ）へ移すことによって抗体をバッチ式に吸収せよ。冷室内でインキュベートせよ。代りにカラムへ血清を遅い流速を使用することによって適用することができる。人力的に収集した分画が得られる。カラムを通過した相を集め、遅い流速を使用してそれを２回目に再適用せよ。
ステップ４：Ａ２８０が０．０２以下になるまでカラムをＴＴＢＳ＋０．５ＮａＣｌでよく洗浄せよ。
ステップ５：０．０２ＮａＮ３を含有する０．２Ｍグリシン，ｐＨ２．８を使用して抗体を溶離せよ。緩衝液の１ｍｌ分量を用いて溶離せよ。分画を１Ｍ
Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．５の５０ｍｌを含んでいる１．５ｍｌマイクロ遠心チューブ中に採取せよ。これはタンパク質が溶離された直後酸性溶離緩衝液を中和する。少なくとも１０分画を採取せよ。これは抗体を除去するのに通常十分であに。適切なブランク（すなわち１ｍｌグリシン緩衝液プラス５０ｍｌ
１Ｍ Ｔｒｉｓ）を使用して各分画のＡ２８０を読取れ。
ステップ６：適切な分画をプールせよ。プールのＡ２８０を読取り、抗体を４℃で貯蔵するか、５０％グリセロールの存在下で部分量において凍結（−７０℃）をすることを考えよ。
ステップ７：０．２Ｍグリシン，ｐＨ２．８緩衝液および続いてＴＴＢＳで完全に洗浄することによりカラムを洗浄せよ。
【００７０】
ｂ２）モノクローナル抗体
粒子増強比濁アッセイにおいては、ポリクローナル抗体がしばしばモノクローナル抗体よりも好ましい。ポリクローナル抗体は本来抗原（または検体）上の多数の異なるエピトープと反応性であり（モノクローナルとは反対に）、それ故抗原分子自体間に、および抗原と抗体が固定化される粒子の間に交差結合およびネットワークを容易に創出する。対照的に、モノクローナル抗体は一般にエピトープの１タイプのみへ結合し、交差結合およびネットワークの形成をもっと困難にする。しかしながら診断産業は、モノクローナル抗体は、特に多年の製品寿命期間にわたってあらかじめ定めた標準化し、品質管理することが容易なため、しばしばモノクローナル抗体を好む。それ故、粒子増強比濁アッセイのための、特にモノクローナル抗体の使用を有利にする抗原特性が存在する時のモノクローナル抗体使用の良い例が存在する。Ｅｄａ
ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｐａｔｒｉｃｌｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｔｕｒｂｉｍｅｔｒｉｃ
Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔ４ｅｉｎ Ｗｉｔｈ Ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ
Ｄｙｎａｍｉｃ ｒａｎｇｅ”，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌｙｓｉｓ，１２：１３７−１４４（１９９８）は、２種類の異なるモノクローナル抗体および２種類の異なるマイクロ粒子の使用を記載する。ＣＲＰ分子は同じサブユニットのペンタマーであり、それ故すべてのエピトープの５複製を担持し（Ｐｅｐｙｓ
ＭＢ ｅｔ ａｌ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：１４１−２１２（１９８３））、それはモノクローナル抗体の使用を容易にするため、ＣＲＰはモノクローナル抗体の使用にとって特に有利である。しかしながら、シスタチンＣのようなモノマーで小さいタンパク質では、本発明の特別の具体例において異なるモノクローナル抗体のカクテルを使用することができる。異なるモノクローナル抗体のカクテル、特にそれらがシスタチンＣに対し、高いアフィニティを持った多数の異なるモノクローナル抗体よりなる時、本発明のシスタチンＣイムノアッセイの良い具体例をもたらす。
【００７１】
モノクローナル抗ヒトシスタチンＣ抗体はこの分野で良く知られた方法、例えばＧ．Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５；Ｇ．Ｇａｌｆｅｒ
ｅｔ ａｌ，１９８１，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３，３−３６；またはＲ．Ｋｅｎｎｅｔ，１９８０，“Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：ａ
ｎｅｗ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ”，ｅｄ．Ｒ．Ｋｅｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ，Ｐｌｅｎｕｍ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＆ Ｌｏｎｄｏｎに記載された方法によって調製することができる。免疫化したマウスまたはラットの脾臓細胞または末梢血液細胞がミエローマ細胞ラインと例えばポリエチレン融合方法を用いて融合される。融合は適当な条件、例えば培養プレート上で成育され、正しく融合された細胞の選別が例えばヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）選別方法を用いて実施される。抗体産生細胞ラインが例えばＥＩＡ，ＲＩＡまたは凝集アッセイのような方法によって同定される。抗体産生細胞ラインの同定後、細胞は新しい発育細胞ラインが１個の単一細胞から誘導されることを保証するため、例えば制限希釈法によってくり返してサブクローンされる。
【００７２】
ｂ３）キメラ抗体
キメラ抗ヒトシスタチン抗体は、Ｇ．Ｌ．Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２，６４３−６４５に記載されたようなこの分野でよく知られた方法によって得られる。概略して操作は以下のように記載することができる。１スペシスまたはその一部のモノクローナル抗体からの抗原結合部位のＤＮＡが異なるスペシスの他の抗体の抗体フレームワークのＤＮＡへ移される。この新しい構築物が発現ベクターへクローンされ、それが抗体を生産するための対応する発現システムへ移される。
【００７３】
ｂ４）組換え抗体
組換え抗ヒトシスタチンＣ抗体は、動物担体を使用することなく、Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３４９，２９３、またはＪ．Ｓ．Ｈｕｓｔｏｎ
ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５８７９に記載されているような、この分野において既知の方法を使用して得ることができる。これらの方法は、抗体またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）を宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ，カビ、イースト、植物または真核生物細胞へ導入し、望みの特異性および親和性を有する抗体を選定し、そして対応する発現システム内で抗体またはそのフラグメントを発現させるステップを含んでいる。
【００７４】
ｂ５）抗体フラグメント
ポリクローナル抗体、任意のスペシスのモノクローナル抗体（キメラ抗体および組換え抗体を含む）のＦａｂ−，Ｆａｂ’−およびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、例えばＡ．Ｎｉｓｓｏｎｏｆｆｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９６０，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ
Ｂｉｏｐｈｙｓ，８９，２３０、またはＲ．Ｐ．Ｐｏｒｔｅｒ，１９５９，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．７３，１１９，またはＥ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，６２６−６３１，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡに記載されているような、この分野で良く知られた方法によって製造することができる。
【００７５】
ｂ６）ヒトシスタチンＣに対し異なる反応性の抗ヒトシスタチンＣ抗体の選択
結合パートナーとしてモノクローナル抗体またはそのフラグメントを使用する時、特に高および低反応性の異なる抗体の選択は、慣用のコーティング技術によってモノクローナル抗体の各自を同じ材料およびサイズのナノ粒子上へ別々にコーティングし、そして検体との置換態様において与えられた比、例えば１／１ｖ／ｖにおいてナノ粒子試薬を混合することによって便利に実施することができる。同じ条件でナノ粒子の較正曲線を作成した後、検体の低濃度のための得られた較正曲線の険しさは免疫学的結合パートナーの反応性の第１の指示を与える。
【００７６】
結合パートナーとしてポリクローナル抗体を使用する時、高および低反応性ポリクローナル抗体の調製は、この分野で良く知られた方法に従って、ポリクローナル抗体をゲルマトリックスへ共有結合した抗原検体を担持するアフィニティクロマトグラフィーカラムへ導入することによって実施することができる。溶出バッファの勾配により、低反応性ポリクローナル分画が最初カラムから溶出し、続いて増大する高反応性を有する分画が溶出するであろう（Ｓ．Ｙａｍａｍｏｔｏ
ｅｔ ａｌ．，１９９３，“Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ”３６，２５７−２６４，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ＢＶ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍを見よ）。分画の反応はその後ＢＩＡｃｏｒｅ機器で、または同じサイズおよび材料のナノ粒子へそれらを独立にコーティングしそして対応する較正曲線を作成することによってチェックすることができる。
【００７７】
好適な抗ヒトシスタチンＣ抗体は異なる源から商業的に提供されている。例えば、フィンランドのＨｙＴｅｓｔは抗原の異なるエピトープを認識する高アフィニティ抗ヒトシスタチンＣ抗体のセットを提供している。これらの抗体は、慣用の態様において、ヒト尿から精製したシスタチンＣでＢａｌｂ／ｃマウスを免疫し、ハイブリドーマ細胞ラインＳｐ２／０との融合によって、ハイブリドーマを製造することによって調製される。選択されたクローンによって生産された抗体がタンパクＡアフィニティクロマトグラフィーによって精製された。下記ｍＡｂがＨｙＴｅｓｔから現在提供されている。Ｃｙｓｔ１０，Ｃｙｓｔ１３，Ｃｙｓｔ１６，Ｃｙｓｔｏ１８，Ｃｙｓｔｏ１９，Ｃｙｓｔｏ２３，Ｃｙｓｔｏ２４およびＣｙｓｔｏ２８。商業的に提供されているモノ−ポリクローナル抗ヒトシスタチンＣ抗体の他の供給者は、Ｆｕｓｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ
Ｉｒｅｌａｎｄ；ＢｉｏＶｅｎｄｏｒ，Ｃｚｅｃｈ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ；ＡＢ Ｌｏｃａｔｉｏｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ａｆｄｆｖａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｉｃｅｍｉｃａｌ，ＵＳＡ；Ａｂｃａｍ，ＵＫ；Ａｘｘｏｒａ，ＵＫ；Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，ＵＳＡ；Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ；ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｎｏｒｗａｙ；Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ＵＳＡである。前記源からのすべての抗ヒトシスタチンＣ抗体は、原則として、本発明を実施するため単独または併用して使用することができる。
【００７８】
ｃ）ナノ粒子およびそれらの抗体との接合体
本発明のナノ粒子を製造するための材料は、粒子増強光散乱アッセイを発生および実施するのに適した、任意の天然または合成、無機、有機、非ポリマーまたはポリマー材料であることができる。そのような材料は、例えば、セレニウム、炭素、金、窒化炭素、ケイ素またはゲルマニウム、例えばＳｉ３Ｎ４、鉄、チタンまたはケイ素の酸化物、例えばＴｉＯ２またはＳｉＯ２、そして例えばラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、エポキシ樹脂、ポリ塩化ビニリデン、ポリ（アルファナフチルメタクリレート）、ポリ（ビニルナフタレン）、またはそれらの共重合体、特にスチレンと共重合し得る不飽和化合物との共重合体、例えばスチレン−メタクリレート共重合体を含む。ポリマー材料製の粒子、それにスチレンから重合した内部コアと、スチレンと共重合し得るエチレン性不飽和化合物から共重合によって生成した外側シエルよりなるコア−シエル粒子、例えば米国特許第４，２１０，７２３号に記載された粒子も好適である。
【００７９】
接合に適したポリマー材料は、Ｂａｎｇｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｉｎｃ．またはＩｎｔｅｒｆａｃｉａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｍｅｒｃｋ ＳＡ，Ｆｒａｎｃｅ，または他の適当な源から購入することができる。粒子は抗体への結合のため多数の方法に従って活性化することができ、そのようなカップリング化学の完全な教えは、例えばＢａｎｇｓ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．のウエブサイトからダウンロード可能な、ＴｅｃｈＮｏｔｅ ２０５，Ｒｅｖ．００３，例えば２００２年３月の“Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ”中に見られる。例えば、カップリングは表面カルボキシル、アミノ、ヒドロキシ、ヒドラジドまたはクロロメチル基を持っている粒子によって達成し得る。連結される分子はそのような基と直接反応するか、または適当なリンカー、例えばカルボジイミド、グルタルアルデヒドまたは臭化シアンによって反応させることができる。
【００８０】
本発明に従った粒子のシエルは、好ましくは十分な比濁信号を発生する一定のサイズのナノ粒子コアと結合した、シスタチンＣに対して高い親和性を有する抗体を含まなければならない。典型的には、タンパク質性材料のシエルを含んでいるナノ粒子は、５８ないし２００ｎｍ，もっと好ましくは６５ないし１５０ｎｍ，そしてさらに好ましくは８０ないし１３５ｎｍである。
【００８１】
本発明の特定な具体例において、未被覆粒子の平均直径は約８０ｎｍである。これら粒子を使用し、コーティング後それらは直径が典型的は９０〜１００ｎｍになる。一般的に抗体の単一層は厚みが約５ｎｍであり、そのためそのような粒子は抗体の単層を支持していると考えられる。
【００８２】
これらの粒子は、接合した粒子の全乾燥重量の５ないし３５％が抗体で構成されている時に良好な成績を有し、抗体が接合した粒子の全乾燥重量の１０ないし３０％である時より良い成績が、１５ないし２５％である時最適の成績が得られる。
【００８３】
もし僅かに大きい粒子が使用されるならば、これらの最適なパーセント値は低くなる。例として、もし９５ｎｍ粒子が使用されるならば、それらは典型的には、もし被覆すれば１１０ｎｍであるメディアン直径へ上昇する。その時の対応するパーセントは４ないし３２％、８ないし２６％、そして最適成績のためには１２ないし２２％（接合した粒子の全乾燥重量を抗体が構成するパーセント）である。しかしながらこれらの僅かにより大きい粒子では、曲線を平坦化することなく較正曲線を発生させるためには（アッセイ較正曲線は８μｇシスタチンＣ／μｌサンプルまで良好なダイナミック範囲を持たなければならない。）十分な結合能力を持つように、アッセイにおいてもっと多くの粒子（粒子のもっと多い重量の意味において）がアッセイに使用されなければならない。これは一層高い吸収バックグラウンド（より大きい粒子をより多く）と、そして一層低い信号対ノズル比へ導く。
【００８４】
他方、より小さい粒子は被覆した粒子においてより高い最適抗体パーセントを持つであろう。例えば、もし７０ｎｍサイズの未被覆粒子が使用されるならば、被覆した粒子のメディアン直径は典型的には８０ｎｍであり、そして接合した粒子の全乾燥重量の４ないし４２％が最適パーセントになり、より最適でないのは１２ないし３６％、そしてもっと最適でない割合は抗体４ないし４２％となるであろう。しかしながらこれら少し小さい粒子では、低濃度において、すなわち１μｇシスタチンＣ／μｌサンプル以下において十分に険しい較正曲線を与えるためにはより少量の粒子（粒子のより少ない重量の意味で）をアッセイに使用しなければならず、そして信号は低くなり、そしてバックグランドノイズに対してもっと傷つけ易くなる。
【００８５】
上の説明を基にして、当業者は本発明の教えに指導されて異なるアッセイ条件のための最適な免疫粒子調製物を提供することができるであろう。
【００８６】
ナノ粒子への抗ヒトシスタチンＣ抗体のコーティングは、使用する材料の性質に適合したこの分野で良く知られた方法に従って、吸着的または共有結合的に実施することができる。
【００８７】
好ましい具体例によれば、抗シスタチンＣ抗体との１種以上の親水性不活性タンパクの混合物がナノ粒子への抗体の接合／結合の間存在しなければならない。本発明者らは驚くべきことに、抗体が接合ｐＨへ近いｐＩ値を有する親水性タンパクと一緒に粒子へ接合される時、高い結合能力を有する親水性粒子の最適の結果が得られることを観察した。最良の結果は、接合の間ウシトランスフエリンおよびアルブミンを存在させた時に得られる。しかしながら、接合の間抗体と他の不活性タンパク質を混合してもよい。そのような親水性不活性タンパク質の非限定例は、抗体またはシスタチンＣに対し親和性のない、リムペットへモシアニン、ハプトグロビンおよび他の水溶性タンパク質である。
【００８８】
カップリングプロセスの間、抗体が不活性タンパクとよりもナノ粒子コアと一層反応性で、それらがコアへ多かれ少なかれ定量的に結合するような条件でなければならず、もし必要ならば条件をそのように適合化しなければならない。ナノ粒子表面の残留反応性タンパクは不活性タンパクによってブロックされるであろう。
【００８９】
本発明者らは、一般原則として、最初のステップにおいて抗体の疎水性部分が粒子へ物理的に結合するように見え、このため粒子表面上の反応性基、例えばクロロメチル基へ近接し、これは次に対応するタンパク分子の基、例えばアミンと反応することを観察した。この物理的吸収のため、大きい抗体分子が驚くべきことに小さい不活性親水性タンパク、例えばアルブミンおよびトランスフェリンと競合する。しかしながら、粒子の結合能力より少ない抗体が使用されるため、アルブミンおよびトランスフェリンのような不活性タンパクは未反応の粒子表面と反応し、本発明の粒子に良好な親水性表面と良好な抗体結合能力を同時に付与し、そして良好な信号を発生することができるナノ粒子材料の適切な割合を付与する。
【００９０】
各コーティングプロセスの適切な条件への適応化は、当業者には日常的なここに提供された教示によって指導される。
【００９１】
例えば、カップリングのため、抗体のｐＩより半単位上のｐＨがモノクローナル抗体が使用される時に選ばれることができる。ポリクローナル抗体は全く広汎なｐＩを持ち、そのためポリクローナル抗体ではｐＨ８．８が好ましく選ばれる。
【００９２】
好ましい具体例においては、カップリング反応混合物の全タンパク含量を基にして、接合の間存在するタンパク質の約３ないし７０ｗｔ％、またはもっと好ましくは５ないし４０ｗｔ％が抗シスタチンＣ抗体によって占められなければならない。
【００９３】
上で説明したように、抗体は粒子に対し親水性不活性タンパクよりも高い結合速度を持っているので、粒子の表面へ結合した総タンパクに対する抗体タンパクの比はもっと高く、例えば粒子表面へ結合した総タンパクの２０ないし９０％、もっと好ましくは３５ないし８０％、さらに好ましくは４０ないし７０％が抗体によって占められる。
【００９４】
ｄ）特許請求した比濁方法の好ましい具体例
ｄ１）本発明の利益
本発明は、先行技術よりもはるかに強い信号対ノイズ比を有する比濁シスタチンＣイムノアッセイを提供する。抗原アフィニティ精製した抗体と組合せて、好ましくは一定の最小サイズの大きいコアおよびタンパクシエル粒子を選ぶことにより、驚くほど高い凝集信号が得られた。アッセイバッファーに比較した粒子の屈折率と、高度に精製した抗体の高い親和性（または貧欲性）の間の驚くべき相乗効果のため、強い比濁信号が得られる。強い比濁信号は、妨害物質、例えばトリグリセライドに対するより高い耐性と、そして先行技術よりも良好な比濁シスタチンＣイムノアッセイの直線性へ導いた。
【００９５】
均質イムノアッセイのための臨界的要因は、アッセイ混合物体積あたりの質量単位あたり発生する信号である。アッセイ混合物は、すべての試薬およびサンプルが添加された時に得られる混合物である。例えば、もし３μｌのサンプルを分析し、サンプルは１ｍ／ｌのシスタチンＣを含有し、そしてすべての試薬およびサンプルを混合した後の最終体積が３００μｌであるとすれば、最終アッセイ混合物中のシスタチンＣの濃度は１０μｇ／ｌである。もしサンプル中の検体濃度が低ければ、これはアッセイ混合物に比較して多量のサンプルを使用することにより、例えばアッセイ混合物３００μｌ中サンプルを８μｌに増量することによってしばしば補償することができる。サンプル体積の増量にはいくつかの妨害がある。第１に、サンプル中に存在するかも知れないすべての妨害物質の濃度がアッセイ混合物中で増大する。第２に、臨界的なフック効果（すなわち負の傾斜を持った用量応答曲線）を克服する抗体の必要性が増大し、これはアッセイの抗体コストを対応して増加させる。
【００９６】
それ故検体の低いアッセイ混合物濃度および対応して低いサンプル体積において良好な信号強度および頑強アッセイを得る必要が存在する。均質イムノアッセイにおいてサンプル体積を増大することはもっと大きな妨害およびもっと費用のかかるアッセイへ導く。
【００９７】
本発明は、比濁シスタチンＣイムノアッセイの信号強度、頑強さおよび直線性において驚くべき増大を提供する。本発明はまた、トリグリセライドのような脂質からの妨害がより少ない。これは検体単位質量あたりの比濁信号が低過ぎる信号強度に基づいている先行技術の欠点を理解した後に達成され、そして先行技術比濁方法よりも良い精度および直線性を有し、妨害の少ない方法を提供する。
【００９８】
ｄ２）異なるテスト条件下で観察された特異的改良
本発明によれば、体液サンプルまたは体液から誘導されたサンプル中のシスタチンＣを測定するための改良された比濁イムノアッセイ方法が提供される。該方法は、
前記シスタチン含有液サンプル、またはシスタチン含有液から誘導されたサンプル、またはシスタチンＣ含有サンプルの希釈液と、ポリクローナル抗シスタチン抗体または抗体フラグメント結合ナノ粒子とを前記シスタチンＣを結合するように接触させることによってアッセイ混合物を生成し、そして該混合物の混濁度の変化を測定することによってシスタチンＣ含量を評価することを特徴とし、
前記混濁度は、もし前記混合物が混合物生成後２６０秒間３７℃に保たれたならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において１５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において３０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において７５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５４６ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化され、そして前記方法は、
前記ナノ粒子結合ポリクローナル抗シスタチンＣ抗体または抗体フラグメント接合体のメディアン直径が５８ｎｍ以上であることによってさらに特徴化される。
【００９９】
このことは、波長５４６ｎｍおよび３７℃は、日立、ＲｏｃｈｅからのＣｏｂａｓおよびＭｏｄｕｌａｒのような多数の大型自動臨床化学分析機のための典型的な作業モードであるため有利である。
【０１００】
本発明はさらに、もし前記アッセイ混合物が同じ理由で有利である、混合物生成後２６０秒間３７℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチン９．９μｇの濃度において２５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において５５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりのシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において１２５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５４６ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される改良された方法を提供する。
【０１０１】
本発明はさらに、もし前記アッセイ混合物が同じ理由で有利である、混合物生成後２６０秒間３７℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｍの濃度において３０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において８５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において１９０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５４６ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される方法を提供する。
【０１０２】
いくつかの分光分析機器は低い波長において作動する。それ故本発明は、もし前記アッセイ混合物が混合物生成後２６０秒間３７℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において２０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において５０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において９０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５０５ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される方法を提供する。
【０１０３】
特に本発明は、もし前記アッセイ混合物が混合物生成後２６０秒間３７℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において３０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において７５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において１５０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５０５ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される方法を提供する。
【０１０４】
さらに本発明は、もし前記アッセイ混合物が混合物生成後２６０秒間３７℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において４０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において１００ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において２５０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５０５ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される方法を提供する。
【０１０５】
他の分光分析機器は、高い波長で作動する。それ故本発明は、もし前記混合物が混合物生成後２６０秒間３７℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において１０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において３０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において８０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５７０ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される方法を提供する。
【０１０６】
特に本発明は、もし前記アッセイ混合物が混合物生成後２６０秒間３７℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において１５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において４５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において１００ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５７０ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される方法を提供する。
【０１０７】
加えて、本発明は、もし前記混合物が混合物生成後２６０秒間３７℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において２０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において５５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において１２５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５７０ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される方法を提供する。
【０１０８】
３７℃より低い温度で作動するいくつかの臨床化学機器がある、それ故本発明は、もし前記混合物が混合物生成後６００秒間３２℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において１２ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において２５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において７０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５４６ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される方法を提供する。
【０１０９】
臨床化学オートメーション機器の能力を増強するために、もっと速いそしてもっと効率的なアッセイ方法に対して大きな需要がある。もしアッセイがもっと速く進行するならば、単位時間あたりもっと多くのアッセイを実行することができる。特にもし機器が動力学的モードで作動するようにつくられているならば、アッセイのスタート後速いそして強い信号増大が有利である。それ故本発明は、もし前記混合物が混合物生成後１２０秒間３７℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において８ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において２０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において５０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５４６ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される方法を提供する。
【０１１０】
特に本発明は、もし前記混合物が混合物生成後１２０秒間３７℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において１５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において３０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において７５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５４６ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される方法を提供する。
【０１１１】
さらに本発明は、もし前記混合物が混合物生成後４０秒間３７℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において４ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において７ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において１５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５４６ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される方法を提供する。
【０１１２】
ｄ３）先行技術比濁システムで同じ条件で得られる結果
上で説明したように、このアッセイに使用するナノ粒子の粒子サイズは注意深くバランスしていなければならない。大粒子は良好な信号を発生するが、バックグランドが高く、結合能力が低いので、多量の粒子を加えなければならず、高いバックグラウンド混濁度を産生する。Ｄａｋｏ
Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ ＡＳのようなアッセイの以前のサプライヤーは、恐らくこの理由で良好な比濁号を達成しなかった。
【０１１３】
製品番号ＬＸ００２／ＥＦＧ／ＣＳ／２５．１０．０４，Ｓ２３６１／ＥＦＧ／ＫＧＲ／０９．０７．０３およびＸＯ９７４／ＥＦＧ／ＳＵＭ／０９．０９．１４のＤａｋｏ
Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ ＡＳの包装挿入物に、そして上で引用したＳｃｈｍｉｄｔ，Ｋｊｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｇｒｏｎｋｊａｒの論文に与えられた指令に従った時、これは波長５４６ｎｍ３７℃２６０秒以内において、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において９ｍＡｂｓ単位／ｃｍの、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において２４ｍＡｂｓ単位／ｃｍの、そして
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において５０ｍＡｂｓ単位／ｃｍの吸光度変化によって特徴化されるシスタチンＣのための比濁イムノアッセイ方法となった。
【０１１４】
これらの結果は本発明において観察された結果（上を見よ）より遥かに下であった。
【０１１５】
より短いアッセイ時間１２０秒の使用（動力学的読取りを目的として）を試みる時、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において６ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、そして
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において１５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、そして
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において２４ｍＡｂｓ単位／ｃｍの吸光度変化を生じ、これは本発明について得られた結果より遥かに下であった。
【０１１６】
さらに、より短いアッセイ時間４０秒の使用（動力学的読取りを目的として）を試みる時、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において３ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、そして
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において６ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、そして
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において９ｍＡｂｓ単位／ｃｍの吸光度変化を生じ、これは本発明について得られた結果より遥かに下であった。
【０１１７】
上のアッセイ時間は、アッセイ試薬およびサンプルの混合物へ免疫ナノ粒子の添加からの時間と定義される。すべての体積およびシーケンスは製造者の情報に従った。シスタチンＣの濃度は、デイドベーリングＵＳ，製品番号ＯＱＮＭ１３ＮラテックスシスタチンＣからのＰｒｏＳｐｅｃｔネフェロメトリー参照方法を使用して決定された。
【０１１８】
ｄ４）本発明のアッセイ方法の実施
本発明の好ましい具体例においては、アッセイバッファーがサンプルと免疫粒子サスペンジョンと混合され、そして混合物または生成したサスペンジョンの混濁度が光度計、好ましくは記録光度計、さらに好ましくは記録分光光度計でモニターされる。好ましいステップのシーケンスは、アッセイバッファー中にサンプルを混合し、混合物が完全に溶解し、安定化するのを許容し、次に免疫粒子混合物を添加する。本発明は、アッセイバッファーと免疫粒子サスペンジョンを最初に混合し、次にサンプルを添加し混合することによっても実施することができる。最適な混合方法（この分野で良く知られた方法から選ばれる）を適用すべきであり、これは限られた数の予備実験によって決定することができる。
【０１１９】
記録光度計が使用される時、混濁度の初期増加率は、吸光度の初期増加率を混合時に直接記録するか、または初期吸光度増加への補外と組合せて混合短時間後に記録することによって測定するか、またはサンプルと試薬の混合後１分より短い２以上の時点で吸光度差を測定することによってシスタチン濃度を決定することによって決定することができる。
【０１２０】
これらの測定または組合せた測定は、既知のシスタチンＣ濃度の較正液での対応する結果と相関または比較することができ、そして未知サンプルの濃度がこのようにして計算することができる。吸光度値を記録し、そして結果を算出するこれらの方法は、臨床化学の分野の当業者によって測定される数多くの他の物質について非常に良く知られている。勿論、本発明から得られる非常に良好な信号は、特に上記したようにサンプルと試薬の混合短時間後良好な信号が得られる時にそのような測定および計算を頑丈にそして正確にする。
【０１２１】
異なる種類の緩衝物質、異なる種類の洗剤、および／または異なる種類のポリマーおよび／またはバッファーへ添加される塩類を有する、使用することができるいくつかのアッセイバッファーがある。
【０１２２】
ＭＯＰＳ，ＰＩＰＥＳ，ＨＥＰＥＳのようなＴＲＩＳバッファー、リン酸塩バッファー、ホウ酸塩バッファーおよび他のバッファー物質が使用でき、そしてｐＨおよび添加されたサンプルの緩衝能力に関係なく最終アッセイ混合物の良く調節されたｐＨがアッセイが維持できる限り、本発明に対して臨界的ではない。典型的には、バッファーは最終モル濃度約５ｍＭないし０．２Ｍ、または１０ｍＭないし０．１Ｍに添加される。ｐＨは６ないし８、６．５ないし７．５の範囲に調節される。
【０１２３】
さらに、添加されるサンプルの脂質成分を溶解し、そしてサンプルと共に導入されるシスタチンＣとの抗体の反応をあまり強く妨害しない限り、いくつかの洗剤を使用することができる。トリグリセリド、コレステロールおよびある範囲のリポタンパクは、脂質が妨害信号を与えるミクロ液滴およびミセルを形成するので、比濁アッセイにおける妨害物質の例である。Ｔｗｅｅｎ２０，Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００およびデオキシコール酸塩が好適な洗剤の例である。脂質含有サンプル中のシスタチンＣの測定は大きな挑戦であり、そして脂質の良好な溶解性を必要とするが、もっと重要なことはいかなるマイナーな妨害を乗りこえる強い信号である。洗剤は、典型的には各自最終反応混合物の重量に対して、０．０１ないし０．５％、または０．１ないし０．３％の最終濃度に添加される。
【０１２４】
最も広く使用されるポリマーは、異なると分子サイズ（特に約６，０００ないし８，０００）のポリエチレングリコールであるが、デキストサンおよび他のポリマーも使用できる。ポリマーは、その濃度が高過ぎる時、テストサンプルがアッセイ混合物中の混合される時導入される他の物質の非特異的沈澱を生成するという不利益を有する。他方、前記ポリマーは同時に信号を増大する。しかしながらそれらは免疫粒子の全体の結合能力を減らす傾向がある。ポリマーは、典型的には最終反応混合物の重量の約０．０５ないし０．５％、または０．１ないし０．３％へ添加される。
【０１２５】
イオン強度を適応化する好適な塩類は、例えばアルカリ金属ハライド、特に１ないし１００ｍＭ、または５ないし５０ｍＭの濃度に添加される塩化ナトリウムである。
【０１２６】
アッセイ混合物中に存在することができるさらなる成分は、
最終濃度約１ないし５０ｍＭまたは５ないし２０ｍＭへ添加されるグリシンのようなアミノ酸；
最終濃度０．１ないし５ｇ／ｌまたは０．５ないし２ｇ／ｌへ添加されるアルブミンのようなタンパク；
最終濃度０．１ないし１０または１ないし５ｇ／ｌへ添加されるアジ化ナトリウムのような抗バクテリア剤；および較正または対照物質であり、これらは、任意にある種のタンパク質物質と共にバッファー、典型的にはリン酸塩バッファーまたはトリスバッファーに溶解した既知濃度のシスタチンＣを含み、任意に１００体積％までのヒトまたは動物血清（もし１００体積％が血清であれば、バッファー溶液の余地も必要性もない）を含んでいる。
【０１２７】
さらに、１種以上の試薬を乾燥形、任意に凍結乾燥形で使用することができる。ナノ粒子へ接合した抗体は乾燥形で、例えばペレットとして使用し、使用前溶解することができ、または緩衝試薬中または反応混合物へ溶解することができる。反応緩衝液中の１以上の成分はアッセイ実施の前または最中に乾燥形で添加することができ、較正剤もそうである。サンプルも乾燥または凍結乾燥した形で提供し、乾燥形で、または使用前溶解して反応混合物へ添加することができる。
【０１２８】
臨床化学分析においては、較正目的のための標準曲線の使用は標準的プラクティスである。このため本発明の実施方法においては、臨床サンプルの代りに既知のシスタチンＣ含有のサンプルを測定すべき応答／信号のための標準曲線を作成するために使用し、そして未知サンプルのシスタチンＣ含量を標準曲線から補内法によって計算することができる。
【０１２９】
混合物中のナノ粒子免疫接合体の総濃度は、粒子増光光散乱免疫アッセイの分野で良く知られた方法に従って選択され、前記ナノ粒子から誘導される吸光度値が正確なそして高精度の測定に影響しないが、しかしマイクロ粒子濃度が信号発生を得るには十分に高いように選ばれる。その量は、勿論体液サンプルまたはそれから誘導されたサンプルの体積、そしてシスタチンＣのような異なるパラメータによって影響される。
【０１３０】
非限定的なアッセイの典型的パラメータとして、以下を挙げることができる。
【０１３１】
典型的なサンプル体積は１ないし２０μｌ、例えば２ないし１０μｌ、特に３μｌである。
【０１３２】
典型的な免疫粒子体積は１０ないし１００μｌ、または２０ないし６０μｌ、特に４０μｌである。前記免疫粒子は、バッファー溶液ｍｌあたり、０．５ないし１０または１ないし５、典型的には約２ないし３、特に２．２６ｍｇのサスペンジョンとして提供することができる。前記バッファー溶液は、緩衝物質に加え、上で規定したように例えばアミノ酸、塩類、不活性タンパク、乳化剤または溶解剤のようなさらなる成分を含むことができる。そのような成分およびバッファーの典型的な混合物は、１０ｍＭホウ酸塩バッファー、１０ｍＭグリシン、１５ｍＭ
ＮａＣｌ、０．２５％Ｔｗｅｅｎ２０，およびアルブミン１ｇ／ｌを含む。
【０１３３】
典型的アッセイ総体積は、１００ないし１０００μｌ，または２００ないし５００μｌ、または２５０ないし３００μｌ、特に約２８０μｌである。
【０１３４】
異なる機器は異なる総体積で作動し、そのためこれら体積の３０％または６０％、またはこれら体積の１５０％または３００％が他の機器のためには典型的である。サンプル体積と免疫粒子体積の間の比は、１／１００ないし２／３、もっと好ましくは２／１００ないし１／３、そしてもっと好ましくは１／４０ないし１／５である。
【０１３５】
ｄ５）医学的使用
本発明のアッセイ方法は、体液または組織のシスタチンＣ含量に関係した、または顕示される病理学的または病理学的に可能性ある状態の診断またはモニターのために使用することができる。これら哺乳類の糸球体濾過速度（腎機能の測定としてＧＦＲ）、または前記濾過速度に影響する哺乳類または病理学的状態を特に含んでいる。
【０１３６】
本発明方法は、小児のＧＦＲまたは筋萎縮症を有する患者のＧＦＲの測定、腎機能における癌治療の影響の監視、腎移植および免疫抑制療法の監視、糖尿病における腎臓濾過の監視、子かんの検知および管理、および薬物投与が体内に蓄積した望ましくない薬物を招来し得るＧＦＲの減少に関係する場合における薬物の正しい投与量の決定のために使用することができる。
【０１３７】
このアッセイ方法は、前記濾過速度に対する医薬品の影響を評価するためにも使用することができる。
【０１３８】
本明細書の熟練した読者はさらなる可能な用途を思いつくことができる。
【０１３９】
本発明は、本発明に従ったイムノアッセイ方法を実施するための試薬のセットを提供する。試薬セットは、抗シスタチンＣ免疫粒子、好適なアッセイバッファー、および任意に較正溶液および対照溶液を含むことを特徴とする。任意に、粒子サスペンジョンおよびアッセイバッファーは混合した試薬として配送してもよい。
【０１４０】
他の面において、本発明はサンプル中のシスタチンＣのアッセイに使用するための任意にキットまたは部品キットフォーマットの分析製品を提供し、前記製品は、乾燥またはサスペンジョン形の上に記載した少なくとも１タイプのナノ粒子−免疫接合体と、そして任意に上に記載の１種以上のさらなる成分、例えば好適なアッセイバッファーおよび任意に較正液および対照液を含んでいる。
【０１４１】
本発明は、本発明に従ったイムノアッセイを実施するための試薬のセットを提供する。試薬セットは、抗シスタチンＣ免疫粒子、好適なバッファー、そして任意に較正液および対照液を含むことを特徴とする。任意に粒子サスペンジョンおよびアッセイバッファーは混合試薬として配達してもよい。
【０１４２】
任意に、観察したシスタチンＣ濃度をＣＦＲパラメータと直接相関させることを許容する計算スキームのような信号評価手段も存在することができる。
【０１４３】
以下の非限定的実施例は非限定態様において本発明方法を例証する。
【０１４４】
実験の部
合成実施例１：ポリクローナル鳥類血清の調製およびそのアフィニティ精製
ａ）鳥類血清の調製
ヒトシスタチンＣに対するポリクローナルＩｇＹ抗体の生産のために以下の免疫化プロトコールを使用することができる。
【０１４５】
各免疫化実験のため２ないし４羽のメンドリが使用される。免疫化開始前卵２個が採取される。これら卵から精製したＩｇＹが対照ＩｇＹとして役立つであろう。リン酸塩バッファー中の高度に精製したヒトシスタチンＣ（細管タンパク尿症を有する患者の尿から精製）をフロインド完全アジュバンドで乳化し、メンドリの胸筋肉に注射する。注射は４週毎にくり返された。注射スタート１０週後卵が集められた。卵から卵黄が分離され、そして先行技術卵抗体単離方法（例えば、Ｌａｒｓｏｎ
Ａ，Ｂａａｌｏｅｗ Ｒ−Ｍ，Ｌｉｎｄａｈ１ Ｔ，ａｎｄ Ｆｏｒｓｂｅｒｇ Ｐ−Ｏ，ｉｎ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７２：１８０７−１８１２，１９９３を見よ）に従った慣用の態様で、卵黄からＩｇＹ分画が塩化アンモニウム沈澱によって単離された。
【０１４６】
ｂ）ポリクローナル血清のアフィニティ精製
高度に精製したヒトシスタチンＣ１０ｍｇがＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏｔｅｃｈからのＨＩＴＲＡＰ ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖｅ ＨＰカラム上にカラムのパッケージインサートの処方に従って固定化された。
【０１４７】
単離されたＩｇＹ分画をリン酸塩緩衝化食塩水中に２ｍｇ／ｍｌへ希釈した。このＩｇＧ溶液２００ｍｌをカラムに通し、次にＩｇＹなしのリン酸塩緩衝化食塩水５０ｍｌを通した。固定化シスタチンＣに対して特異的親和性を有する抗体を６．１モル濃度クエン酸塩バッファー、ｐＨ３．２の３５ｍｌで溶出した。溶出した特異性抗シスタチンＣ抗体をリン酸塩緩衝化食塩水に対して透析し、分子量カットオフ３０，０００ダルトンを有するＡｍｉｃｏｎ
Ｃｅｎｔｉｖｃｏｎ遠心濾過装置を用いて３ｍｇ／ｍｌへ濃縮した。
【０１４８】
合成実施例２：モノクローナル抗ヒトシスタチンＣ抗体の調製
モノクローナル抗ヒトシスタチンＣ抗体は、例えばＨａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｅｃｔｉｏｎ ６ ｏｆ“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡに記載されたこの分野で良く知られた方法を用いて以下のように製造することができる。ヒトＰＳＡは、Ｓｅｎｓａｂａｕｇｈ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ １９９０，１４４，１５２３に記載されているように、ヒト精液血漿から単離された。
【０１４９】
ＲＡＳ（ＲＩＢＩアジュバントシステム）中のヒトシスタチンＣ５０μｇの規則的間隔の４回注射後マウスが免疫化された。最初の注射４日後免疫化したマウスの脾臓から単離されたリンパ球が、Ｇａｌｆｒｅ
ｅｔ ａｌ．，１９８１．Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｙ，７３，３−４６に記載されているポリエチレングリコール法を使用してミエローマ細胞ラインＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４と融合された。
【０１５０】
シスタチンＣに対する抗体を分泌するハイブリドーマは以下のスクリーニングＥＬＩＳＡによって同定された：マイクロタイタープレートがウサギ抗ヒトシスタチン免疫グロブリンでコートされ；この固体相へ結合したシスタチンＣがハイブリドーマ培養物の上清とインキュベートされた。シスタチンＣへ結合したモノクローナル抗体は、抗マウスイムノグロブリン−ペルオキシダーゼ結合体を用いて検出された。
【０１５１】
ヒトシスタチンＣの異なるエピトープに対する抗体を分泌する数百ものハイブリドーマを単離することができる。対応するモノクローナル抗体はその後アフィニティ精製され、もっと詳細にキャラクタライズされることができる。
【０１５２】
エピトープ結合が実施され、そして抗体の相対的反応性がＢ１Ａｃｏｒｅバイオセンサー技術（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてそれらの見掛け解離定数に関して決定された。後者は表面プラスモン共鳴技術（Ｊ．Ｌ．Ｄａｉｓｓ
ｅｔ ａｌ．，１９９４，ｉｎ“Ｍｅｔｈｏｄｓｗ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”６，１４３−１５６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＵＳＡを見よ）に基づいており、そしてバイオ分子反応の動力学およびストキオメトリーのモニターを許容する。
【０１５３】
細胞培養上清から出発し、モノクローナル抗体がホリクローナルウサギ抗マウス−Ｆｃ−抗体を介してバイオセンサー表面へ結合された。モノクローナル抗体への抗原シスタチンＣの会合および解離がモニターされた。データは簡単なＡ＋Ｂ＝ＡＢ平衡モデルに基づいた本来的ＢＩＡ評価ソフトウエア（Ｌ．Ｇ．Ｆａｇｅｒｓｔａｍ
ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，５９７，３９７−４１０）を使用して解析することができる。得られる抗体はその後それぞれの見掛け解離定数に関して比較されることができる。好適な抗体またはその組合せが本発明の免疫粒子の製造のために使用し得る。
【０１５４】
合成実施例３：抗シスタチンＣ免疫粒子の調製
ａ）カップリング操作−標準的操作
（１）緩衝液および試薬
【０１５５】
抗体ｍｇあたりのポリマー粒子からのより多い信号を持つため、カップリング緩衝液のｐＨは連結すべき抗体のｐＩへ特異的方法で適合化された。加えて、抗体はカップリング前にアルブミン／トランスフェリンで希釈された（後記を見よ）。カップリングのため抗体のｐＩ半単位上のｐＨがモノクローナル抗体が使用される時に選ばれた。ポリクローナル抗体は全く広汎なｐＩを持ち、そのためポリクローナル抗体では８．８のｐＨが使用された。選ばれたｐＨは上のＰＢＳバッファーとホウ酸塩バッファーを混合することによって得られた。
【０１５６】
以下の標準的操作は、クロロメチルへの抗体の物理的吸着による取付けのための単一ステップ方法の概要である。このプロトコールは１％固形分の１μｍクロロメチルラテックスのためである。この反応は個々のニーズに合わせるため容易にスケールアップまたはスケールダウンすることができる。例えばもし異なる粒子サイズが使用されるならば、その時抗体（Ａｂ）の量は、式
Ａｂの重量＝（１μｍ粒子のためのＡｂの重量／（μｍでの粒子直径）
から計算することができる。
【０１５７】
（２）ラテックス粒子サスペンジョンの調製
１．クロメチルラテックスマイクロスフェア２．５ｍｌ（４０ｍｇ／ｍｌ）をピペットし、ＭＥＳバッファー１０ｍｌで希釈せよ。
２．粒子沈降のため３，０００Ｇで２０分間遠心せよ。
３．上清を除去し、ペレットをＭＥＳバッファー１０ｍｌに再懸濁せよ。
４．再び遠心し、粒子から上清を除去せよ。
５．ペレットをＭＥＳ５ｍｌに再懸濁し、マイクロスフェア粒子が完全に懸濁していることを確実にせよ。
ラテックスサスペンジョンは今や固形分約２％（すなわち２０ｍｇ／ｍｌ）にある。
【０１５８】
（３）カップリング
１．適切なｐＨ（上を見よ）へ調節したＰＢＳ／ホウ酸塩バッファー中の抗体１．５ｍｇ，アルブミン３．７５ｍｇおよびウシトランスフェリン７ｍｇの５ｍｌ溶液へラテックス５ｍｌを加える。これは抗体モノレイヤーが必要とするよりも少ない。抗体はトランスフェリンおよびアルブミンよりもラテックスと一層反応性であり、そして多かれ少なかれ定量的にラテックスと結合し、ラテックス表面の残りはアルブミンおよび／またはトランスフェリンで飽和される。この混合物は粒子の凝集および良好な親水性に対しても確実にする。接合の間、抗体にもシスタチンＣにも親和性のない貝類ヘモシアニン、ハプトグロビンおよび他の水溶性タンパクのような他の不活性タンパクも抗体と混合することができる。
２．ラテックス／タンパク混合物をゆるやかな混合で室温において一夜インキュベートせよ。
３．タンパク標識したラテックス粒子を未結合タンパクから分離するため遠心せよ。
４．タンパク測定のため上清を除去し、保留せよ。
このステップにおいて、上清を保存し、タンパクを測定することができる。上清中の残存タンパクは添加した元の量から差引くことができる。残りは粒子上に被覆されている。ラテックスマイクロスフェアと両立し得る唯一のタンパク測定方法はＰｉｅｒｃｅからのＭｉｃｒｏ
ＢＣＡタンパク測定キットである。
５．ペレットをＰＢＳ１０ｍｌ中に再懸濁せよ。
６．粒子を沈降させるため再び遠心せよ。
７．合計３回洗浄のためステップ５および６をさらに２回反復せよ。
８．最終ラテックスを貯蔵バッファー１０ｍｌ中に再懸濁し、固形分１％の最終濃度とせよ。使用まで４℃で貯蔵し、冷凍するな。
タンパクがカバーされないマイクロスフェア表面上のいかなる反応部位をも充填するためグリシンが貯蔵バッファー中に使用される。これは非特異性結合を減少する。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはウシトランスフェリンのような不活性タンパクがもし望むならば同じ目的で使用できる。ＮａＮ３が保存剤として存在する。もしラテックスは無菌に保たれるならば、細胞または組織培養物と両立しないＮａＮ３は省くことができる。
【０１５９】
ｂ）被覆したナノ粒子の調製
上の標準的操作は、本発明のナノ粒子接合体の調製のため０．０８μｍの直径のラテックス粒子を被覆するために適用された。上の処方に従って、抗体２４ｍｇとアルブミン６５ｍｇが粒子１００ｍｇを被覆するために使用された。
【０１６０】
前記抗シスタチンＣ免疫粒子は、Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＡＳ，Ｎｏｒｗａｙからの抗シスタチンＣ抗体製品番号Ａ１６７Ｃｙｓ−Ｃ−ＡＦ（前記ポリクローナル抗ヒトシスタチンＣ抗体は、慢性腎糸球体タンパク尿症を有する患者からのシスタチンＣで免疫化したメンドリの卵から単離したイムノグロブリンのアフィニティー精製したイムノグロブリン分画に相当し、このアフィニティー精製プロセスは固定化ヒトシスタチＣで実施された）をクロロメチル活性化ラテックス粒子（０．０８μｍ，Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｃ．，ＵＳＡからの製品番号Ｃ３７４８７）へ連結することによって製造された。前記カップリングのためｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｄｃｌａｔｅｘ．ｃｏｍ／ｂｏｄｙ−ｂｇｒｏｕｎｄｅｒ−ｓｕｐｅｒａｃｔｉｖｅ−ｐｒｏｔｏｃｏｌ−１１．ａｓｐからダウンロードしたプロトコール“ＩＤＣ超クリーンクロロメチルラテックス”を使用することができる。
【０１６１】
代替的粒子およびカップリングプロトコールは、Ｉｎｔｅｒｆａｃｉｃｉａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ社のウエブサイド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のウエブサイド、およびＢａｎｇｅ
Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｉｎｃ．社のウエブサイドに見られる。
【０１６２】
得られた粒子は０．２５％Ｔｗｅｅｎ２０と１ｇ／ｌアルブミン添加１０ｍＭホウ酸バッファー、１０ｍＭグリシン、１５ｍＭ ＮａＣｌ中粒子２．２６ｍｇ／ｍｌのサスペンジョンとして使用される。
【０１６３】
アッセイ実施例１：異なるアッセイ条件下の本発明の免疫粒子に基づく比濁シスタチンＣアッセイ
合成実施例３において調製した免疫粒子懸濁液が以下の実験において使用された。
【０１６４】
これら実験において次の最適化されたアッセイバッファーｐＨ＝７．２が使用された。
ポリエチレングリコール（Ｓｉｇｍａ）２２ｇ／ｌ
Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）３ｇ／ｌ
ＭＯＰＳ（Ｓｉｇｍａ）９．４ｇ／ｌ
アジ化ナトリウム２．７ｇ／ｌ
【０１６５】
サンプル３μｌをアッセイバッファー２５０μｌと混合し、３０秒間静置し、粒子サスペンジョン４０μｌを加え混合した。混合後ｃｍあたりの吸光度を島津ＵＶ１６０１分光光度計で測定した。
【０１６６】
濃度、温度、免疫粒子添加混合後の時間、および分光光度計で使用した光の波長に応じて、以下の結果（ｍＡｂｓ単位／ｃｍ＝ミリ吸光度単位／光路長ｃｍ）が得られた。
【０１６７】
ａ）２６０秒アッセイ時間内で３７℃において波長５４６ｎｍ
吸光度変化：
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度９．９μｇ／ｌにおいて３３ｍＡｂｓ単位、
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度１９．８μｇ／ｌにおいて８８ｍＡｂｓ単位、および
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度３４．１μｇ／ｌにおいて１９４ｍＡｂｓ単位
ｂ）２６０秒アッセイ時間内で３７℃において波長５０５ｎｍ
吸光度変化：
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度９．９μｇ／ｌにおいて４３ｍＡｂｓ単位、
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度１９．８μｇ／ｌにおいて１２８ｍＡｂｓ単位、および
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度３４．１μｇ／ｌにおいて２８２ｍＡｂｓ単位
ｃ）２６０秒アッセイ時間内で３７℃において波長５７０ｎｍ
吸光度変化：
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度９．９μｇ／ｌにおいて２４ｍＡｂｓ単位、
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度１９．８μｇ／ｌにおいて６５ｍＡｂｓ単位、および
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度３４．１μｇ／ｌにおいて１４８ｍＡｂｓ単位
ｄ）アッセイ時間１２０秒内で３７℃において波長５４６ｎｍ
吸光度変化：
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度９．９μｇ／ｌにおいて１１ｍＡｂｓ単位、
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度１９．８μｇ／ｌにおいて３１ｍＡｂｓ単位、および
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度３４．１μｇ／ｌにおいて７２ｍＡｂｓ単位
ｅ）アッセイ時間４０秒で３７℃において波長５４６ｎｍ
吸光度変化：
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度９．９μｇ／ｌにおいて４ｍＡｂｓ単位、
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度１９．８μｇ／ｌにおいて１１ｍＡｂｓ単位、および
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度３４．１μｇ／ｌにおいて２３ｍＡｂｓ単位
【０１６８】
アッセイ時間は、免疫粒子をアッセイバッファーおよびサンプルと混合してから吸光度を読取るまでの時間（秒）として規定された。シスタチンＣの濃度はＤａｄｅ
Ｂｅｈｒｉｎｇ，ＵＳからのＰｒｏ Ｓｐｅｃ ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄｓ，製品番号ＯＱＮＭ１３Ｎ Ｌａｔｅｘ Ｃｙｓｔａｔｉｎ
Ｃを使用して決定された。
【０１６９】
より速いそしてより強力な信号を有するこれらの結果は、比濁イムノアッセイにおいては共通の妨害物質であるトリグリセライドからの妨害効果と、そして最良の先行技術方法と比較した本発明方法の直線性を検討するために使用された。これらの実験を以下に記載する。
【０１７０】
アッセイ実施例２：本発明方法の比濁測定に対するトリグリセライド妨害の検討
この研究の目的は、本発明方法がテストサンプル中のトリグリセライド（ＴＧ）によって妨害されるかどうかを決定することであった。妨害があらかじめ定めたＴＧ濃度以下において見られるかどうかによって、妨害と、潜在的妨害物質の間の関係を証明するために実施される。操作はＮＣＣＬＳガイド“Ｉｎｔｅｒｆｅｎｃｅ Ｆｅｓｔｉｎｇ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｔｙ，ａｐｐｒｏｖｅｄ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ”，ＮＣＣＬＳ ｓｅｃｔｉｏｎ ６．１．２に基づいている。
【０１７１】
ａ）設備
機器：Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから提供された標準アクセサリーを備えて日立９１７機器
日立９１７機器のセッティング：
アッセイバッファー体積 ３３０μｌ
サンプル体積 ３μｌ
免疫粒子体積 ４０μｌ
水体積 ２０μｌ
一次波長 ５４６ｎｍ
二次波長 ７００ｎｍ
較正液希釈度 ０．０５５，０．１２５，０．２５０，０．４３２，０．６６７，１．０００
Ｌｏｇｉｔ Ｌｏｇ（４Ｐ）
【０１７２】
ｂ）試薬
アッセイバッファー：ポリエチレングリコール（Ｓｉｇｍａ）２２ｇ／ｌ，Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）３ｇ／ｌ，ＭＯＰＳ（Ｓｉｇｍａ）９．４ｇ／ｌ，アジ化ナトリウム２．７ｇ／ｌ，塩化ナトリウム２７ｇ／ｌ，ｐH＝７．２
較正液:Ｄａｄｅ ＢｅｈｒｉｎｇのＰｒｏＳｐｅｃネフエロメーター上でネフエロメトリー法を使用して参照ラボラトリーによって決定された、ヒトシスタチンＣ７．７０ｍｇ／ｌを含んでいる血清
免疫粒子：上の合成実施例２に従って製造された抗シスタチンＣ免疫粒子。粒子は０．２５％Ｔｗｅｅｎ２０および１ｇ／ｌアルブミン添加１０ｍＭホウ酸塩バッファー、１０ｍＭグリシン、１５ｍＭ
ＮａＣｌ中のサスペンジョン（粒子２．２６ｍｇ／ｍｌ）として使用された。
【０１７３】
ｃ）サンプル
血清１：トリグリセライド濃度２０ｍｍｏｌ／ｌ以上のヒト血清プール
血清２：トリグリセライド濃度１０ｍｍｏｌ／ｌ以下のヒト血清プール
これら２種の血清サンプルが望むトリグリセライド濃度のサンプルを調製するために使用された。
【０１７４】
ｄ）使用される２種類の血清プール中のシスタチンＣ濃度の決定
使用される２種類の血清プールのシスタチンＣ濃度は１０反復数において測定された。
【０１７５】
前記血清プールのシスタチンＣ値に平均値が与えられた。
【０１７６】
１ｍｇ／ｌ以上の値における±５％妨害限界およびシスタチン１ｍｇ以下における±７．５％の妨害限界がトリグリセライドから許容される最大妨害のために選ばれた。
【０１７７】
ＮＣＣＬＳガイドラインに従って、９５％信頼性レベル（α＝０．０５）および９５％パワー（β＝０．０５）をもって２側面のこの実験を実施するのに必要な反復回数ｎ：
【数１】
ここでＳは血清プールの作業精度（ｍｇシスタチンＣ／ｌにおいて）内にある。
【０１７８】
ＮＣＣＬＳガイドラインに従った最小反復回数の計算：
【数２】
結果は反復回数３が充分であることを示した。
【０１７９】
ｅ）トリグリセライドをスパイクした血清の調製
約２０ｍｍｏｌ／ｌのトリグリセライドを有する血清を調節した（血清プールＡ）。独立のサービス研究所がトリグリセライド含量を決定した。血清のこの部分の半分が、Ｓｃｉｐａｃ
Ｌｔｄ．ＵＫからの精製シスタチンＣでスパイクされ、３ｍｇ／ｌ以上のシスタチン値を生じた（血清プールＢ）。
【０１８０】
血清プールＡおよびＢの半分がＢｅｃｋｍａｎ ＴＬ−１００ウルトラ遠心機中で５０，０００ｒｐｍにおいて３０分間超遠心処理された。サンプルの透明部分が対照プールとして使用され、そして体積が除去された脂質の体積について補正された（それぞれ血清プールＣおよびＤと命名）。
【０１８１】
ｆ）分析作業
基本プール混合物および対照プール混合物Ａ，Ｂ，ＣおよびＤ各自の３部分標本が調製された。
指示書に従った機器の較正および基本プール混合物と対照プール混合物と対照プール混合物の分析は交番する順序で実施された。
もし妨害が観察されたならば、０％および１００％プールの５０％中間プールが調製された。中間プールと０％プールから２５％プールが調製された。中間プールと１００％プールから７５％が各プールの等量を混合することによって調製された。
新しい較正を行ったランダム順序のすべてのｎ反復が測定された。
０％プールのための平均濃度が計算され、そしてすべての他の結果から差し引かれた。
【０１８２】
ｇ）データ解析の正味の結果
ｇ１）高シスタチンＣ値サンプル
結論：
０．１６ｍｇ／ｌの許容し得る偏差限界は信頼性インターバルより上であるので、我々は１８ｍｍｏｌ／ｌのＴＧ濃度は約３ｍｇ／ｌのシスタチンＣレベルにおいてシスタチンＣイムノアッセイを妨害しないと結論することができる。
【０１８３】
ｇ２）低シスタチンＣ値サンプル
結論：
０．０６５ｍｇ／ｌの許容し得る偏差限界は信頼性インターバルより上であるので、我々は１８ｍｍｏｌ／ｌのＴＧ濃度は約１ｍｇ／ｌのシスタチンＣレベルにおいてシスタチンＣイムノアッセイを妨害しないと結論することができる。
特定したテスト条件に従えば、１８ｍｍｏｌ／ｌ以下の濃度のＴＧは本発明のシスタチンＣイムノアッセイを妨害しないことが観察された。
それ故、本発明はシスタチンＣ３，２および０．８３ｍｇ／ｌのレベルにおいて測定したシスタチンＣの値に５％またはそれ以下のトリグリセライド１５ｍｍｏｌ／ｌからの妨害を持つことを特徴とするシスタチンＣの比濁イムノアッセイ方法を提供すると結論することができる。
【０１８４】
アッセイ実施例３：先行技術アッセイに対するＴＧによる妨害の決定
日立９１７機器および先行技術試薬（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いる対応する研究が実施された。
【０１８５】
ａ）試薬
免疫粒子： ＬＸ００２／ＥＦＧ／ＣＳ／２５．１０．０４
較正液： Ｘ０９７４／ＥＦＧ／ＳＵＭ／０９．０９，０４
対照セット： Ｘ０９７３／ＥＦＧ／ＳＵＭ／０９．０９，０４
反応バッファー９： Ｓ２３６１／ＥＦＧ／ＫＧＲ／０９．０７．０３
【０１８６】
ｂ）結果：
ｂ１）高シスタチンＣサンプル、先行技術試薬
結論：
０．１４ｍｇ／ｌの許容し得る偏差限界は信頼性インターバルより上であるので、１８ｍｍｏｌ／ｌのＴＧ濃度は約３ｍｇ／ｌのシスタチンＣレベルにおいてＤａｋｏシスタチンＣイムノアッセイを妨害すると結論できる。
【０１８７】
ｂ２）低シスタチンサンプルＣサンプル、先行技術試薬
結論：
０．０４７ｍｇ／ｌの許容し得る偏差限界は信頼性インターバルより上であるので、１８ｍｍｏｌ／ｌのＴＧ濃度は１ｍｇ／ｌ以下のシスタチンＣレベルにおいてＤａｋｏシスタチンＣイムノアッセイを妨害しないと結論できる。
【０１８８】
上の表から、本発明方法はトリグリセライドからの妨害に対して一層頑丈であると結論できる。
【０１８９】
アッセイ実施例４：本発明方法を用いて直線性の検討：
この検討はＮＣＣＬＳプロトコールＥＰ６−Ａ，ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１６に従って実施された。
この実験において、本発明のシスタチンＣイムノアッセイの直線性が検討された。これは３種の異なるスパイクした高血清サンプルを０から１００％まで低濃度血清サンプルで希釈することによってなされた。希釈シリーズの結果をプロットし、そしてプロットを一次、二次および三次回帰分析によって検討することにより、我々は本発明のシスタチンＣイムノアッセイ方法は与えられた基準に従って直線であると結論した。基準はプロットパラメータをスチューデントｔ−テストによって審査しそして比較し、測定ポイント（希釈係数に対してプロットした）が一次多項式よりも良く二次または三次多項式にフィットするかどうかを見ることであった。もしｔ−テストが失敗すれば、我々は一次多項式と高次多項式の間の６％の差を各レベルにおける測定平均値に関して（エンドポイントを除く。この区域におけるシスタチン濃度のサンプルは全くまたはまれにしか測定されないため）最小カイ２乗値をもって許容した。これらの基準に従って、本発明のシスタチンＣイムノアッセイ方法は日立９１１測定システムにおいて直線である。
【０１９０】
ａ）機器：
日立９１１機器が使用された。
【０１９１】
ｂ）試薬：
上に記載したアッセイバッファーとシスタチンＣ較正液と抗シスタチンＣ免疫粒子が使用された。
【０１９２】
ｃ）サンプル：
すべてのサンプルがシスタチンＣ値６ｍｇ／ｌ以上を持つ３人の異なる患者からのサンプルＡ，ＢおよびＣであった。
０．８ｍｇ／ｌ以下の低いシスタチンＣ濃度を有する患者血清サンプルＤは、高血清の希釈剤として使用された。
サンプルＡについて表に記載された血清サンプルＡ，ＢおよびCの希釈シリーズ：
もとの濃度１００％から０％まで低サンプルＤで各サンプルＡ，ＢおよびＣを１０回希釈せよ。ここで１００％は純粋な高濃度血清（Ａ１００，Ｂ１００およびＣ１００）であり、そして０％は純粋な低濃度血清（Ｄ１００）が調製された。
【０１９３】
【表１】
【０１９４】
サンプルＢおよびサンプルＣに対しても上の表と同じ希釈液が調製された。
標準曲線を確立するため日立９１１の較正が以下のアッセイパラメータを使用して実施された。
アッセイ体積： ２３０μｌ
サンプル体積： ３μｌ
免疫粒子体積： ４０μｌ
水体積： １０μｌ
【０１９５】
希釈したサンプルの各自は３回反復で測定され、各サンプルＡ，ＢおよびＣについての結果が記録された。
【０１９６】
ｄ）結果：
ｄ１）回帰分析
【表１−２】
【０１９７】
【表２】
【０１９８】
【表３】
【０１９９】
測定された平均値対希釈係数のプロットが図１，２および３に示されている。
【０２００】
ｄ２）スチューデントｔ−テスト
高次回帰パラメータがデータにフィットするかどうかをチェックするためスチューデントｔ−テストが実施された。結果は表４に示されている。
【０２０１】
【表４】
【０２０２】
血清１：
表４から、血清１からのデータセットは、計算したｔ−値が作表したｔ−値より小さいので二次多項式にフィットしないと結論することができる。
【０２０３】
表４から、このデータセットは高次多項式にフィットし得ると結論され、そして一次多項式と高次多項式の間の最低カイ２乗値を持つ差が８％以上かどうかをチェックする必要がある。三次多項式は最小のカイ２乗値を持っている。
【０２０４】
ＤＬ＝Ｐ（ｘ）−Ｌ（ｘ）
【０２０５】
ここでＰ（ｘ）は多項式であり、Ｌ（ｘ）は直線方程式である。
【０２０６】
【表５】
【０２０７】
血清１に対するＤＬ（％）プロットが図４に示されている。
【０２０８】
血清２：
表４から、血清２からデータセットは、計算したｔ値が作表したｔ値より小さいので二次多項式にフィットしないと結論できる。
【０２０９】
これから血清２からのデータベースは、計算したｔ値が作表したｔ値よりも小さくそして希釈シリーズは直線と考えられるので、三次多項式にフィットしないと結論できる。
【０２１０】
血清３：
表４から、血清３からデータセットは、計算したｔ値が作表したｔ値より小さいので二次多項式にフィットしないと結論できる。
【０２１１】
これから血清２からのデータベースは、計算したｔ値が作表したｔ値よりも小さいので二次多項式にフィットしないと結論できる。
【０２１２】
表４から、このデータセットは高次多項式にフィットし得ると結論され、そして一次多項式と高次多項式の間の最カイ２乗値を持った差が５％（ＤＬ）以上かどうかをチェックする必要がある。三次多項式は最低のカイ２乗値を持っている。
【０２１３】
ＤＬ＝Ｐ（ｘ）−Ｌ（ｘ）
【０２１４】
ここでＰ（ｘ）は多項式であり、Ｌ（ｘ）は直線式である。
【０２１５】
【表６】
【０２１６】
血清３に対するＤＬ（％）プロットが図５に示されている。
【０２１７】
上の計算および直線へセットされたスペックから、我々は本発明のシスタチンＣイムノアッセイは約０．６−８．５ｍｇ／ｌのテストした範囲において直線的であることを見出す。
【０２１８】
参照インターバルはこの範囲にカバーされ、そして８ｍｇ／ｌ以上のシスタチンＣ濃度はなお測定しなければならないので、この直線範囲が本発明のヒスタチンＣイムノアッセイのすべての臨床目的のために充分である。
【０２１９】
この研究から、本発明に従ったシスタチンＣの比濁イムノアッセイ方法は、シスタチンＣ １．３２ないし７．５ｍｇ／ｌの測定範囲において４％以下の直線性からの偏差を持ち、シスタチンＣ
０．７５ｍｇ／ｌの測定範囲において１５％以下の直線性からの偏差を持っていることを特徴としていると結論することができる。
【０２２０】
アッセイ実施例５：本発明に従った方法の直線性検討：
この検討はＮＣＣＬＳプロトコールＥＰ６−Ａ，ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１６に従って実施された。
【０２２１】
この実験において、本発明のシスタチンＣイムノアッセイの直線性が検討された。これはスパイクした高血清サンプルを低濃度血清サンプルで０から１００％まで希釈することによってなされた。希釈シリーズの結果をプロットし、そしてプロットを一次、二次および三次回帰分析によって検討することにより、我々は本発明のシスタチンＣイムノアッセイ方法は与えられた基準に従って直線であると結論した。基準はプロットパラメータをスチューデンドｔ−テストによって審査しそして比較し、測定ポイント（希釈係数に対してプロットした）が一次多項式と高次多項式の間の６％の差を各レベルにおける測定平均値に関して（エンドポイントを除く。この区域におけるシスタチンＣ濃度のサンプルは全くまたはまれにしか測定されないため）最小カイ２乗値をもって許容した。これらの基準に従って本発明のシスタチンＣイムノアッセイ方法はＡｒｃｈｉｔｅｃｔ測定システムにおいて直線である。
【０２２２】
ａ）機器：
Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ ｃｉ８２００機器が使用された。
【０２２３】
ｂ）試薬：
上に記載したアッセイバッファーとシスタチンＣ較正液と抗シスタチンＣ免疫粒子が使用された。
ｃ）サンプル：
８ｍｇ／ｌ以上のシスタチンＣ値を有する一人の患者の血清サンプルＡ。０．８ｍｇ／ｌ以下の低いシスタチン濃度を有する患者の血清サンプルＤは、高血清の希釈剤として使用された。
【０２２４】
表７に記載した血清サンプルの希釈シリーズ：
低サンプルＤで元の濃度を１００％から０％まで１０回希釈せよ。ここで１００％は純粋な高濃度血清（Ａ１００）であり、０％は純粋な低濃度血清（Ｄ１００）である。
【０２２５】
【表７】
【０２２６】
標準曲線を確立するため、日立９１１の較正が以下のアッセイパラメータを使用して実施された。
【０２２７】
アッセイ体積： ２２０ｍｌ
サンプル体積： ３ｍｌ
免疫粒子体積： ４５ｍｌ
【０２２８】
希釈したサンプルの各自は３回反復して測定され、サンプルＡについての結果が記録された。
【０２２９】
ｄ）結果
ｄ１）回帰分析
表８：生データ血清Ａ
【表８】
【０２３０】
回帰分析した血清Ａの測定平均値対希釈係数図６，７および８に示されている。
【０２３１】
ｄ２）スチューデントｔ−テスト
表９：スチューデントｔ−テスト
【表９】
【０２３２】
血清Ａ：
表９から、血清Ａからのデータセットは、計算したｔ−値が作表したｔ−値より小さいので二次多項式にフィットしたいと結論することができる。
【０２３３】
表９から、このデータセットは高次多項式にフッィトし得ると結論され、そして一次多項式と高次多項式の間の最低カイ２乗値を持つ差が６％以上かどうかをチェックする必要がある。三次多項式は最小のカイ２乗値を持っている。
【０２３４】
ＤＬ＝Ｐ（ｘ）−Ｌ（ｘ）
【０２３５】
ここでＰ（ｘ）は多項式であり、Ｌ（ｘ）は直線方程式である。
【０２３６】
表１０：ＤＬ（％）計算
【表１０】
【０２３７】
上の計算および直線性への明細書セットから、本発明のシスタチンＣイムノアッセイは約０．６−８．８ｍｇ／ｌの範囲において直線であることを見出した。
【０２３８】
参照間隔はこの範囲にカバーされ、そして８ｍｇ／ｌ以上のシスタチンＣ濃度はなお測定しなければならないので、記載した直線範囲は本発明のシスタチンＣイムノアッセイのすべての臨床目的に対して十分である。
【０２３９】
この研究から、本発明に従ったシスタチンＣのための比濁イムノアッセイ方法は、シスタチンＣの測定範囲１．３２ないし７．５ｍｇ／ｌにおいて４％以下の直線性からの偏差と、そしてシスタチンＣの測定範囲０．７５ないし７．５ｍｇ／ｌにおいて１５％以下の直線性からの偏差を有することによって特徴化されると結論することができる。
【０２４０】
アッセイ実施例６：先行技術比濁アッセイについての直線性検討
ａ）分析
アッセイ実施例４に相当する検討が、Ｊ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１０ Ｆｅｂ．２００４のＣａｍｉｌｌａ Ｓｃｈｍｉｄｔによる“Ｃｙｓｔａｔｉｎ Ｃ Ｔｈｅ ｍａｋｅｒ ｏｆ ｃｈｏｉｃｅ ｆｏｒ ｒｅｎａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔｉｎｇ”の論文、および前記論文で言及しているＤａｋｏ製品の包装挿入文書に従って実施され、以下の結果が得られた。
【０２４１】
ｂ）結果
ｂ１）回帰分析
回帰分析したすべての血清Ａ，ＢおよびＣについて測定した平均値対希釈係数のプロットが図１０，１１および１２に示されている。
【０２４２】
ｂ２）スチューデントｔ−テスト
高次回帰パラメータがデータにフィットするかをチェックするためスチューデントｔ−テストが実施された。対応する値が表１１に要約されている。
【０２４３】
表１１：スチューデントｔ−テスト値
【表１１】
【０２４４】
血清１：
データセットは高次多項式にフィットし得るので、一次多項式と高次多項式の間の最低カイ２乗値を持った差が６％（ＤＬ）以上であるかをチェックすることが必要である。三次多項式が最小カイ２乗値を有する。差（ＤＬ）は次表のとおりである。
【０２４５】
表１２：ＤＬ（％）計算
【表１２】
【０２４６】
血清１に対するプロットは表１３に示されている。
【０２４７】
血清２：
データセットは高次多項式にフィットし得るので、一次多項式と高多項式の間の最低カイ２乗値を持った差が６％（ＤＬ）以上であるかをチェックすることが必要である。三次多項式が最小カイ２乗値を有する。差（ＤＬ）は次表のとおりである。
【０２４８】
表１３：ＤＬ（％）計算
【表１３】
【０２４９】
血清２に対するＤＬ（％）は図１４に示されている。
【０２５０】
血清３：
これはデータセットが高次多項式にフィットすることができ、そして一次多項式と高次多項式の間の最低カイ２乗値を持った差が６％（ＤＬ）以上であるかをチェックする必要があることを意味する。
差は次の表のとおりである。
【０２５１】
表１４：ＤＬ（％）計算
【表１４】
【０２５２】
血清３に対するＤＬ（％）プロットが図１５に示されている。
【０２５３】
我々は、ＤａｋｏシスタチンＣイムノアッセイによって例示される先行技術比濁イムノアッセイは参照範囲の低い部分において満足に直線的でないと結論する。
【０２５４】
アッセイ実施例７：比ろう参照法に対する本発明の比濁アッセイの相関関係
Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎウエブサイト、２００５年春からダウンロードすることができ、Ｃ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｃ．ＫｊｏｌｌｅｒおよびＫ．Ｇｏｎｎｋｊａによる発表“Ｎｅｗ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｒｂｉｍｅｔｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ
ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｃｙｓｔａｔｉｎ Ｃ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ”を参照する。Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇからの比ろう参照法との相関性研究において、彼等は＋０．２１４のインターセプトおよび０．６９５４の相関曲線の増分／スロープを見出している。
【０２５５】
本発明により、前述した理由のため、参照方法に対してもっと良好な相関性を有する方法が提供される。
【０２５６】
ａ）アッセイ条件：
この実験において、上のようにセッティングした日立９１７機器によって本発明のシスタチンＣイムノアッセイがＵｐｐｓａｌａ，ＳｗｅｄｅｎのＡｋａｄｅｍｉｓｋａ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＨｏｓｐｉｔａｌにおけるＢＮ ＰｒｏＳｐｅｃ上のＤａｄｅ ＢｅｈｒｉｎｇシスタチンＣ方法と比較された。比較は同じ５１血清サンプルを両方法で２回反復（一つの較正液で１日）で測定し、それらをバイアス分析および回帰分析で比較することによって行われた。加えて、Ｄａｄｅ
Ｂｅｈｒｉｎｇの医学的決定ポイントとも称される上方信頼限界も決定された。実験デザインおよびデータ分析は、ＮＣＣＬＳプロトコールＥＰ−２，ｖｏｌ．２２．Ｎｏ．１９中の推奨に従った。
【０２５７】
ｂ）結果：
図１６，１７および１８が結果を示している。これらの図は、本発明方法は驚くほど比ろう参照法から有意差のない結果をもたらす非常に良好な正確度を持ったシスタチンＣ測定を提供することを示している。５０個のテストサンプルのこの研究において、二方法の間には有意なバイアスは存在しなかった。全部で、−０．０２３ないし＋０．０６５８の信頼幅を持った０．０２３のバイアスがあり、要するにゼロからの有意差のあるバイアスはなかった。
【０２５８】
Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇシスタチンイムノアッセイは０．９５ｍｇ／ｌの医学的決定ポイントを有する。直線回帰分析を用い、我々は、Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ方法でのサンプル測定０．９５ｍｇ／ｌは、本発明に従ったシスタチンイムノアッセイの０．８３〜０．８９ｍｇ／ｌを測定するであろうことを見出した。血漿法比較分析は、０．１０４ｍｇ／ｌのインターセプトをもって０．９６８の相関曲線のスロープを生じた。これは血漿分析のスロープおよびインターセプトは、血清分析スロープおよびインターセプトの信頼幅以内に入ることを意味する。
【０２５９】
このことは、本発明方法は、以前の最良先行技術方法と比較して、比ろう参照方法ともっと良い相関関係をもたらすことを証明する。
【０２６０】
上で述べた発表“Ｎｅｗ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ
ｔｕｒｂｉｍｅｔｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｃｙｓｔａｔｉｎ Ｃ ｉｎ ｓｅｒｕｍ
ａｎｄ ｐｌａｓｍａ”は、比濁シスタチンＣ測定は糸球体濾過速度の推定のため使用できることを証明する。このことは、Ｇｒｕｂｂ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５１：８，１４２０−１４３１中の“Ｓｉｍｐｌｅ Ｃｙｓｔａｔｉｎ
Ｃ−ｂａｓｅｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｅｑｕａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ Ｆｉｌｔｏａｔｉｏｎ Ｒｅｔｅ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｄｉｅｔ ｉｎ Ｒｅｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｅｄｉｃｉｔｏｎ Ｅｑｕａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｄｕｌｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ ｔｈｅ
Ｃｏｕｎａｎｈａｎ−Ｂａｒｒｅｔｔ Ｐｒｅｄｉｃｉｔｏｎ Ｅｑｕａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ”の発表でも示された。比ろう参照方法を使用する同様な発表は、“Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｍｌ／ｍｉｎ
ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍａ Ｃｙｓｔａｔｉｃ Ｃ ｖａｌｅｓ ｉｎ ｍｇ／ｌ”ｂｙ Ａ．Ｌａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ
Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００４：６４，２５−３０である。比ろう法とより良い相関性を有する本発明の方法は、勿論先行技術比濁測定法よりもこの目的のためによく研究されている。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異性ナノ粒子抗体接合体の使用によるヒト体液サンプル中のヒトシスタチンＣを評価するための改良された比濁イムノアッセイ、前記アッセイの使用による患者の糸球体濾過速度の評価方法、対応する反応キット、改良されたナノ粒子抗体接合体、および上記の医学的目的のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
シスタチンＣは、１９８１年にＡ．ＧｒｕｂｂおよびＨ．Ｌｏｖｂｅｒｇにより発見され、キャラクタライズされた（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ
１９８２：７２）。シスタチンＣは、後にシスタチンタンパク質スーパーファミリーと命名されたものの中で発見された最初のタンパク質である。シスタチンタンパク質スーパーファミリーは、システインプロテアーゼ酵素を阻害するタンパク質グループである。シスタチンＣの他の生物学的機能は現在解明中である。シスタチンスーパーファミリーの他のメンバーと反対に、シスタチンＣはすべての体液中に存在するのに対し、異なるシスタチンの全体組成は体液から体液へ、そして異なるコンパートメントにおいて変動する（Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ
Ｍ．ｅｔ ａｌ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８６；２６１：１１２８２）。１９９０年にＡｂｒａｈａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．は、シスタチンＣはヒト体内のすべて（または殆どすべて）の有核細胞に存在し、“家庭内”タンパク質と呼ばれるものであることを証明した（Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ
Ｍ．ｅｔ ａｌ：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９０；２６８：２８７−９７）。
【０００３】
分子量１３ｋＤを持つシスタチンＣは、腎臓の糸球体膜を通って自由に濾過されるが、その後糸球体膜を通過するペプチドおよび小さいタンパク質の大部分を再吸収する腎臓のコンパートメントである、前腎小管において再吸収され、異化される。この態様において腎臓はこれらのタンパク質物質を体のために保存し、尿への損失を妨げる（Ｊａｃｏｂｓｏｎ
Ｂ ｅｔ ａｌ：Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ １９９５；２６：５５９−６４；Ｈｅｙｍｓ ＳＢ，ｅｔ ａｌ：Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．１９８３；３７：４７８）。
【０００４】
今まで糸球体濾過速度（ＧＦＲ）のためのマーカーとして最も多く使用されているクレアチニンは、筋肉細胞において生産される小分子量分子である。それ故クレアチニンの生成および排泄速度は体の筋肉質量に密接にリンクしている。集団中の個人の筋肉質量はかなり変動することが良く知られている。老人はしばしば体重に比較して低い筋肉質量を有し、また多数の患者は彼等の病気の進行につれて筋肉質量をそう失する。子供は大人に比較して一般に異なる相対的筋肉質量を有し、そして男性は女性よりも平均して高い相対的筋肉質量を有する。それ故、血清クレアチニン濃度が糸球体濾過速度のためのマーカーとして使用される時、糸球体濾過速度の５０％減少が起こっている時でさえ血清クレアチニン値は参照範囲内にあると判定され得る（Ｓｈｅｍｅｓｈ
Ｏ，ｅｔ ａｌ：Ｋｉｄｎ，Ｉｎｔ．１０８５；２８：８３０−８）。または食事も、特に高タンパク食事もクレアチニンの血清レベルに有意に影響する（Ｐｅｒｒｏｎｅ ＲＤ．ｅｔ
ａｌ；Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９２；３８：１９３３−５３）。
【０００５】
血清および血漿クレアチニン測定は、糸球体濾過速度のための標準的方法として信頼できない。Ｃｒ−５１−ＥＤＴＡまたはＴｃ−９９ｍのような放射性標識物質の静脈内注射、またはｉｏｈｅｘｏｌのようなヨウ素化剤の注射がそのためある程度の普及を獲得した。これらの方法の費用および時間がかかり、注射が必要であり、そしてしばしば採血がくり返される。Ｇｒｕｂｂ
ｅｔ ａｌ．によるＣｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５１：８，１４２０−１４３１中の発表“Ｓｉｍｐｌｅ Ｃｙｓｔａｔｉｎ
Ｃ−Ｂａｓｅｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｅｑｕａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｒａｔｅ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｄｉｅｔ ｉｎ Ｒｅｎａｌ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｅｑｕａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｄｕｌｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｃｈａｒｔｚ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｏｕｎａｈａｎ−Ｂａｒｒｅｔｔ
Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｅｑｕａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ”において、血液中の簡単なシスタチンＣ測定が糸球体濾過速度を測定するための複雑な方法に代り得ることが示された。
【０００６】
シスタチンＣ測定は、最初古典的生化学的方法を用いたが、しかしすぐ比ろう分析（ｎｅｐｈｒｏｍｅｔｒｙ）イムノアッセイへ移行した。Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ
Ｃｏｍｐａｎｙは比ろう測定方法を開拓した。Ｃｏｌｌ，Ｅ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０００：３６，２９３４を見よ。比ろう方法は非常に信頼できる。比ろう方法の欠点は、機器自体が光透過率に基づく自動分光計に比較してむしろ遅い処理スピードであることである。Ｄａｄｅ
Ｂｅｈｒｉｎｇ製造の比ろう計、典型的にはＢＮＩＩ比ろう計およびＰｒｏＳｐｅｃ比ろう計、およびＢｅｃｋｍａｎ機器は実質的なマーケット普及を獲得したが、しかし透過率測定に基づく機器よりも広く普及していない。比ろう計はまた、透過率測定に基づく大型自動機器よりもかなり低いサンプルスループットを有する。H．Ｓｔｏｍｅ ｅｔ ａｌ．は、Ｃｌｉｎｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ８，ｐｐ１４８２−８５，２００１中の論文“Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ａ ｐａｒｔｉｌｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ
ｆｏｒ ｓｅｒｕｍ ＣｙｓｔａｔｉｎＣ ｕｓｉｎｇ ｒａｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ”において速度比ろう分析法を提供した。しかしながら、多数のサンプルについて限られたキャパシティを有し、そして比ろう計機器の数も限られる。それ故、吸収分光光度均質機器への移行の需要が存在した。けだしそのような機器はもっと豊富であり、高いキャパシティを有するからである。
【０００７】
デンマークのＤａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎは比濁シスタチンイムノアッセイの分野を開拓した。この技術の状態は、２００５年７月のＤａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ
ＡＳのウエブサイトからダウンロードされたプレゼンテーションである以下の論文に記載されている。Ｃ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１０
Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００４，“ＣｙｓｔａｔｉｎＣ−Ｔｈｅ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｃｈｏｉｃｅ ｆｏｒ ｒｅｎａｌ
ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔｉｎｇ”，Ｃ．Ｓｃｈｍｉｄｔ ａｎｄ Ｋ．Ｇｒｏｎｋｊａｒ，“Ｎｅｗ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｒｂｉｍｅｔｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ
ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｃｙｓｔａｔｉｎ Ｃｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ”
【０００８】
しかしながら比濁測定は、Ｄａｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ２７，ｐ．５０９，１９９０中の論文“Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ ｉｍｍｕｎｏｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ”に記載されているように、サンプルの混濁度によって妨害される。２９ｔｈ
Ｎｏｒｄｉｃ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｌｍｏ，Ｓｗｅｄｅｎ，２４−２７ Ａｐｒｉｌ ２００４において、Ａ．ＧｒｕｂｂはシスタチンＣ測定結果において血清および血漿サンプル中のトリグリセライドからの妨害の結果を報告した。それ故ヒトシスタチンＣのための比濁イムノアッセイについて改良の必要性がなお存在する。
【０００９】
均質イムノアッセイ系の代替法は分離に基づく非均質イムノアッセイ系であろう。非均質イムノアッセイ系の利点は、アッセイの実施の間洗浄を伴う分離ステップによって特徴付けられる。これらのシステムの利益は、洗浄によっていかなる妨害物質をも除去することである。さらに、非結合抗体および非結合酵素または蛍光または着色または他の信号発生部分の洗い流しを許容する。以後検体と呼ぶ測定すべき物質は、抗体への結合に対し標識アナログと必ずしも競合しなければならないことはないので、これらの方法は一般に非競合的である。この面として洗浄ステップは、固定化抗体の大過剰の標識抗体の使用を可能とし、もし高品質抗体が使用されるならば、高い感度と通常高レベルの正確度にする。
【００１０】
固相および他の非均質イムノアッセイシステムには多数の教科書がある。大型の自動システムは商業的に入手し得る。Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｄｉｖｉｓｏｎ
ＵＳは、ＩｍＸ，ＡｘＳＹＭおよび他の自動非均質イムノアッセイ機器のための試薬を販売しており、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＧｅｒｍａｎｙはＥｌｅｃｓｙｓおよび他の非均質イムノアッセイシステムの試薬を販売しており、そして非均一イノムアッセイシステムおよび試薬の多数のサプライヤーが存在する。なお非常にポピュラーな非均質イムノアッセイシステムは、いわゆるマイクロタイターイムノアッセイシステムである。これらシステムは遅いが、しかし信頼できそして安価である。一般的なイムノアッセイ文献は、当業者に良く知られたこれらシステムに関する多数の情報を与える。
【００１１】
非均質イムノアッセイシステムの欠点は、単位時間、すなわち運転時間あたりの高いアッセイ数のためのキャパシティーの欠如である。これら方法は分離および洗浄ステップを含み、自動化されているが機器運転時間を占める。さらに固相が含まれるので、たとえ大量生産してもいくらかの生産コストを有する特別のデバイスまたは固相がしばしば使用される。結果発生の高いスループットおよびスピードは、絶えず増加している実施すべきテスト数のために近年増々重要になっている。アッセイを非均質、しばしば固相に基づくイムノアッセイ技術から均質イムノアッセイシステムへ移行させる需要が存在する。
【００１２】
均質イムノアッセイシステムは構成が簡単であり、そして高いスループット能力を有する。試薬が混合され、インキュベートされ、そしてインキュベーション中またはインキュベーション後測定される。エンドポイントまたは異なる時間ポイント間の信号の差または連続的動力学的測定が使用される。信号は蛍光、色または不透明度（混濁度）の測定であり得る。特に、色および／または不透明度／混濁度の測定のための大型自動機器が非常に成功的であった。日本の日立はＲｏｃｈｅと協力してこの大規模オートメーションを開拓したが、オリンパスおよびバイエルを含む多数の他のメーカーもそのような機器および試薬を供給している。これらの機器は、異なる波長においてそして異なる時間ポイントにおいてサンプルと試薬の混合物を通過する光の透過率を測定する自動マルチウエル分光光度計である。比濁シスタチンＣイムノアッセイはそのような均質高キャパシティ機器で行われるので、これは何故高品質比濁シスタチンＣアッセイが要望されるかの他の理由である。
【００１３】
大部分の均質イムノアッセイシステムは、サンプルと、標識した検体または検体アナログの良く制御された濃度を含む試薬溶液と、そして検体に対して特異性親和性を有する抗体を混合することに基づいている。サンプル中の検体分子は標識検体または検体アナログと競合し、信号を発生する。広範囲のイムノアッセイ文献は種々の標識およびアナログの使用を教える。ここでは、今のところ、色信号を発生する高分子量検体（分子量約４０００）のための均質イムノアッセイ法を使用した限られた成功例しか存在しないことに注目しなければならない。（蛍光技術、例えばプロキシミティアッセイを使用した成功例はあったが、しかし利用可能な高スループット自動蛍光計は多くなく、それ故これらの技術は本発明目的には役立たない。）両社ともカリフォルニア州に存在するＳｙｖａからのＥＭＩＴ技術およびＭｉｃｒｏｇｅｎｉｃｓからのＣＤＥＩＡ技術は、低分子量検体のための均質イムノアッセイにおいて色信号を使用して成功であった。高分子量検体のためには、粒子増強比濁測定がサンプルと試薬の混合物を通る光の透過度を測定する自動マルチウエル分光計のための最も成功的技術である。それ故比濁方法は高分子量検体に適している。比濁法の一般的記述は多数のイムノアッセイ教科書に見られる。
【００１４】
何故シスタチンＣの高精度測定が必要か？生物学の眺望から、シスタチンＣおよびクレアチニン、それに上で引用したメタ検体の生物学についての文献は減少した糸状体濾過速度をモニターし、診断するためクレアチニンの代りにシスタチンＣの使用の方向を目指している。しかしながら、生物学議論はシスタチンＣの使用に味方しているが、生物学的利益はシスタチンＣ分析の正確度および精度が良好である場合のみに重要である。クレアチニン測定の正確度および精度はすぐれており、そしてクレアチニンの代りにシスタチンＣの分析の医学的利益は、もしシスタチンＣイムノアッセイ方法の正確度および精度があまり低ければ容易に失われる。
【００１５】
本発明によって課決すべき課題は、対応する商業的に利用可能な比濁アッセイに比較して、改良された正確度および／または精度および／またはテストサンプル中の脂質およびヘモグロビンからの少ない妨害を有するイムノ比濁シスタチンＣイムノアッセイを提供することである。
【００１６】
シスタチンＣの比濁測定の先行技術の他の欠点は、長いアッセイ時間および／または非精密へ導く混濁度変化の遅い速度である。本発明によって解決すべきさらなる課題は、それ故シスタチンＣのもっと速い比濁測定を提供することである。
【発明の概要】
【００１７】
シスタチンＣの測定のための先行技術比濁イムノアッセイに関連する上記課題は、驚くべきことに、特許請求の範囲に規定され、そして明細書の以後の部分にもっと詳細に説明されている比濁方法によって解決できた。本発明の前記方法は改良されたナノ粒子免疫接合体を特に使用し、これは特に異なるシスタチン濃度、異なる測定波長、異なる反応時間、および異なる温度のような異なる実験条件のもとでもっと速い、および／またはもっと感受性の、および／またはもっと信頼できるシスタチンＣ測定を許容する。本発明のさらなる利益は実験結果から自明である。
【００１８】
免疫粒子および場合により試薬を注意深く調節することにより、驚くほど強いそして速い比濁信号を観察することができ、そしてそれによって妨害を減少させることができ、そして正確度を失うことなく直線性を改良することができた。アッセイ時間も減らすこともできた。
【００１９】
本発明の最良の実施形態は後で記載されるであろうが、しかし反応混合物を調製するため、そして測定を実施するために使用される他の試薬およびステップのシーケンスおよび時間もこの驚くべき結果を達成するために使用することができる。
【００２０】
ナノ粒子のいくつかの供給者、例えばＢａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．ＵＳＡおよびＭｅｒｃｋ Ｓ．Ａ．フランスがある。ナノ粒子へ抗体をカップリングするための接合体サービスの多数の供給者はインターネット上で見出すことができる。Ｄａｋｏ
Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ ＡＳ，デンマークは抗シスタチンＣ抗体へ接合したナノ粒子の供給者であり、そしてそれらは本発明の目的を達成するかどうかについて本発明者らによってテストされた。しかしながら前記先行技術製品は非成功的であった。
【００２１】
本発明者らは、中でも粒子サイズが注意深くバランスされていなければならないことを観察した。大粒子は良好な信号を発生するが、しかしバックグランドが高く、そして結合能力が低く、そのためより高いバックグランドを発生しても多量の粒子を添加しなければならない。Ｄａｋｏ
Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ ＡＳのような以前のアッセイ供給者からの製品、製品番号ＬＸ００２／ＥＦＧ／ＣＳ／２５．１０．０４，Ｓ２３６１／ＥＦＧ／ＫＧ／０９．０７．０３およびＸ０９７４／ＥＦＧ／ＳＵＭ／０９．０９．０４は良好な比濁信号を達成しなかった。
【００２２】
一般的用語の定義
本発明に従ったアッセイ方法に使用される「体液サンプル」は、哺乳動物、特にヒトから得られ、シスタチンＣを含有するサンプルである。いかなるシスタチンＣ含有液体サンプルも使用できる。本発明に従ってアッセイされる前記サンプルは、いかなるシスタチンＣ含有生物学的流体または組織抽出液でも良く、そしてアッセイ前に前処理されても良い。好適なサンプルの例は、血液、血清および血漿のような血液分画、そしてＥＤＴＡ−血液、ＥＤＴＡ−血漿、クエン酸−血漿、ヘパリン−血漿のような前処理血液、または尿サンプルである。始めに得られたサンプルまたはその分画はこの分野で知られた方法により、例えば分画または希釈によってさらに修飾することができる。分画はアッセイを妨害するかも知れない成分を除去するために実施することができる。希釈は元のサンプルまたはその分画を成分、例えば検体の濃度を調節するために緩衝液のような適切なサンプル液と混合することによって実施することができる。そのような修飾したサンプルは、哺乳類の体から採取または単離したオリジナルの体液サンプルから誘導されたサンプルを例示する。
【００２３】
本発明に従って分析される「検体」はシスタチンＣ、特に健康または病気の個人の体によって生成されたヒトシスタチンＣである。検体として、シスタチンＣの誘導体または天然シスタチンＣとシスタチンＣの混合物を使用することも可能である。シスタチンＣの誘導体の非限定例は、適当な検出可能なマーカー、例えば放射性、金属または発色団標識を担持しているシスタチンＣ化合物である。
【００２４】
「評価」は、定性的またはサンプル中に存在する検体、ここではシスタチンＣの量または濃度の絶対値を得る意味で、そしてサンプル中の検体のレベルを示す指数、比率、パーセントまたは可視的または他の値を得る意味で定量的決定の両方を含むことを意図する。評価は直接または間接でよく、そして実際に検出される化学種は勿論検体そのものである必要はなく、例えばその誘導体でも良い。
【００２５】
「均質イムノアッセイ」は、非均質イムノアッセイとは反対に、構成が簡単で、そしてより高いスループット能力を持っている。特に均質アッセイは、分離ステップの形のサンプルの前処理ステップ、例えばサンプルをクロマトグラフィーカラムのような固相マトリックスへ適用し、そしてオリジナルの複合サンプルのオリジナル成分の部分から検体を分離することによる分離ステップを含まない。均質アッセイのためには、サンプルと試薬が混合され、インキュベートされ、インキュベーション中またはその後に測定される。エンドポイント信号または異なる時間ポイント間の信号の差または連続的動力学的測定が使用される。
【００２６】
「粒子増強」比濁測定またはイムノアッセイは、本発明に従って使用されるナノ粒子またはナノ粒子免疫接合体に関連した「光散乱性質」に基づいている。そのようなナノ粒子は好ましくは狭いサイズ分布を持ったほぼ球形である。前記粒子のサイズは普通それらの平均直径によって表現される。良く知られる光散乱の法則によれば、前記光散乱性質は粒子サイズおよび／または媒質に対する粒子の屈折率の比によって影響される。弱い光散乱性質は小さい粒子サイズおよび／または媒質に対する粒子の屈折率の低い比から生じ得る。レイリーの散乱法則参照。
【００２７】
ナノ粒子のサイズおよび／または屈折率比は、凝集したナノ粒子免疫接合体の検出のために使用される波長において光散乱を発生することができなければならない。粒子サイズは一般に検出波長より小さいように選ばれる。
【００２８】
本発明に従ってサンプル混濁度の変化を測定するために使用される「検出波長」は通常３００ｎｍないし１２００ｎｍ、好ましくは４００ないし７００ｎｍ、特に５００ないし６００ｎｍである。
【００２９】
本発明の分析方法の「正確度」は、より信頼し得る参照方法によって決定された濃度と比較して、サンプル中のシスタチンＣの濃度を正確に決定することができる該方法の能力である。
【００３０】
本発明の分析方法の「精度」は、サンプル中のシスタチンＣの濃度がくり返して決定される時の結果の変動である。
【００３１】
本発明に従ったアッセイの「頑強性」は、妨害物質と、そしてシスタチンＣ濃度決定の得られる値に影響することなくアッセイ条件の変動に耐える方法の能力である。
【００３２】
本発明の文脈において使用される「不活性タンパク質」は、本発明のアッセイ方法を妨害しないいかなる起源（例えばヒトまたは非ヒト哺乳類、微生物）のタンパク質であり、特にそれは分析されるシスタチンＣに対して、および／または本発明のアッセイ方法に使用される抗体に対して検出可能な親和性を実質上持っていてはならない。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】直線回帰によって得た異なる患者の血清について希釈係数に対する本発明に従って測定した平均シスタチンＣ値のプロットを示す。
【図２】一次回帰によって得た、異なる患者の血清についての希釈係数に対する本発明に従って測定した平均シスタチン値のプロットを示す。
【図３】二次回帰によって得た、異なる患者の血清についての希釈係数に対する本発明に従って測定した平均シスタチン値のプロットを示す。
【図４】アッセイ実施例４の血清１のためのＤＬ（％）プロットを示す。
【図５】アッセイ実施例４の血清３のためのＤＬ（％）プロットを示す。
【図６】直線回帰によって得た、一患者の血清についての希釈係数に対する本発明に従って測定した平均シスタチンＣ値のプロットを示す。
【図７】二次回帰によって得た、一患者の血清についての希釈係数に対する本発明に従って測定した平均シスタチンＣ値のプロットを示す。
【図８】三次回帰によって得た、一患者の血清についての希釈係数に対する本発明に従って測定した平均シスタチンＣ値のプロットを示す。
【図９】アッセイ実施例５の血清ＡのＤＬ（％）プロットを示す。
【図１０】直線回帰によって得た、異なる患者血清についての希釈係数に対する本発明に従って測定した平均シスタチン値のプロットを示す。
【図１１】一次回帰によって得た、異なる患者血清についての希釈係数に対する本発明に従って測定した平均シスタチン値のプロットを示す。
【図１２】二次回帰によって得た、異なる患者血清についての希釈係数に対する本発明に従って測定した平均シスタチン値のプロットを示す。
【図１３】アッセイ実施例６（先行技術）の血清１のためのＤＬ（％）プロットである。
【図１４】アッセイ実施例６（先行技術）の血清２のためのＤＬ（％）プロットである。
【図１５】アッセイ実施例６（先行技術）の血清３のためのＤＬ（％）プロットである。
【図１６】本発明に従った比濁法による、および先行技術の比ろう法によるシスタチンＣのアッセイ方法の間の相関性の検討結果を示す。
【図１７】本発明に従った比濁法による、および先行技術の比ろう法によるシスタチンＣのアッセイ方法の間の相関性の検討結果を示す。
【図１８】本発明に従った比濁法による、および先行技術の比ろう法によるシスタチンＣのアッセイ方法の間の相関性の検討結果を示す。
【００３４】
本発明の詳細な記述
ａ）本発明の局面
本発明の最初の局面は、ヒト体液サンプルまたはそれから誘導されたサンプル中のヒトシスタチンＣを評価するための粒子増強比濁イムノアッセイに関し、該アッセイは、
（１）前記サンプルまたはその希釈液を、比濁測定に適したナノ粒子を含んでいるナノ粒子−抗体接合体（またはナノ粒子−免疫接合体）と接触させることによってアッセイ混合物を生成し、ここで前記ナノ粒子は前記シスタチンＣへ結合するように抗ヒトシスタチンＣ抗体またはその抗原結合性フラグメントで被覆されており、ここで前記被覆されたナノ粒子は少なくとも４０ｎｍの、例えば少なくとも４５，５０，５５または５８ｎｍの、好ましくは５８ｎｍより大きいメディアン直径を有し、そして
（２）前記混合物の混濁度の変化を測定することによってヒトシスタチンＣの含量を評価することを特徴とする。
【００３５】
好ましくは、前記抗体はヒトシスタチンＣに対するポリクローナル非ヒト、非ネズミ抗体を含み、特に前記ポリクローナル抗体はヒトシスタチンＣに対する鳥類抗体を含む。
【００３６】
さらなる好ましい具体例においては、前記ポリクローナル抗体またはそのフラグメントの少なくとも２５ｗｔ％はヒトシスタチンＣのアフィニティ精製によって得られたものである。アフィニティ精製によってヒトシスタチンＣへ結合する抗体の割合が増加する。加えて、アフィニティ精製により混合物から除去された抗体よりも高い親和性を有するヒトシスタチンＣ結合抗体を富化することができる。
【００３７】
例えば、本発明に従って使用される好適な抗体は、固相へ固定化したヒトシスタチンＣへの鳥類抗ヒトシスタチンＣ抗血清の結合を通じて鳥類抗体をアフィニティ精製し、そして好ましくはリン酸塩緩衝食塩水で洗浄後結合した抗体を０．０５Ｍないし０．２Ｍ、または０．０８ないし０．１２Ｍの範囲の、特に約０．１Ｍのモル濃度、および約３ないし３．５、または３．１ないし３．３の範囲の、特に約３．２のｐＨのクエン酸緩衝液（例えば後の実験の部でさらに詳しく説明するような）で溶出することによって得られる鳥類（例えばポリクローナル）抗体のアフィニティに相当する（または実質的に等しい）ヒトシスタチンＣに対するアフィニティを有することができる。
【００３８】
さらなる具体例において、前記抗体は、（ａ）ヒトシスタチンＣの単一エピトープへ結合するモノクローナル抗体か、または（ｂ）モノクローナル抗体の各スペーシスがヒトシスタチンＣの異なるエピトープへ結合するモノクローナル抗体の２以上のスペーシスか、または異なる結合強度（アフィニティ）で同じエピトープへ結合する２以上のスペーシスのセットを含む。
【００３９】
前記モノクローナル抗体はヒトまたは非ヒト起源（例えばネズミ、ヒツジ、ヤギ、鳥類またはウサギ起源）のどちらかである。
【００４０】
本発明に従って使用される被覆ナノ粒子は、好ましくは５８ｎｍより大きい平均直径、特に５９ないし１６０、６０ないし１４０、７０ないし１２０、７５ないし１１０，８０ないし９５ｎｍの範囲の平均直径を有する。好ましくは、それらは抗体の層で被覆される。特に前記層は約５ｎｍの大よその厚みを有する単一層と考えることができる。この層は完全（粒子は抗体で飽和）か、またはもっと好ましくは不飽和（すなわち粒子が提供する結合能力より少ない抗体が使用される）であることができる。
【００４１】
さらなる好ましい具体例においては、前記被覆ナノ粒子はナノ粒子−抗体接合体の全重量に対して、約５ないし３５％、特に１０ないし３０％または１５ないし２５％の抗体で不完全に被覆される。
【００４２】
さらなる好ましい具体例においては、ナノ粒子は抗体と、不活性な、好ましくは親水性のタンパク質との混合物で被覆される。例えば、ナノ粒子の表面へ結合した全タンパク質の２０ないし９０％、もっと好ましくは３５ないし８０％、さらに好ましくは４０ないし７０％が抗シスタチンＣ抗体によって構成される。そのような粒子は、好ましくは前記非被覆粒子の結合容量に応じて粒子へ理論上結合し得る抗体の量よりも少ない量において抗体を担持する。同時に、抗体分子によって被覆されない粒子表面積は不活性な、好ましくは親水性タンパク質によって飽和される。
【００４３】
好ましい具体例において、前記のオリジナルの非被覆ナノ粒子は本質的にラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、エポキシ樹脂、ポリ塩化ビニリデン、ポリα−ナフチルメタクリレート、ポリビニルナフタレン、およびそれらの対応する共重合でつくられる。他の好適な粒子材料はこの分野によって利用可能であり、そして本発明の教えに誘導されて当業者は適切な選択をなし得る立場にあるであろう。
【００４４】
クレームした方法のさらなる具体例によれば、混濁度変化は５００ないし６００ｎｍの範囲の波長において、好ましくは１０ないし５０℃の範囲の温度において、そして好ましくは反応時間３０ないし６００秒、例えば４０，１２０，２６０または６００秒後における前記アッセイ混合物の吸光度の変化によって測定される。
【００４５】
本発明は、シスタチンＣ含有流体サンプルまたはシスタチンＣ含有液から誘導されたサンプル、またはシスタチンＣ含有サンプルの希釈液を、前記シスタチンＣを結合するようにポリクローナルまたはモノクローナル抗シスタチンＣ抗体または抗体フラグメント結合ナノ粒子と接触させることによってアッセイ混合物を生成し、そして該混合物の混濁度の変化を測定することによってシスタチンＣの含量を評価することを特徴とする、体液サンプルまたは体液から誘導されたサンプル中のシスタチンＣを測定するための比濁イムノアッセイ方法を提供し、そして混濁度は以下の表Ａに述べた一定の最小サイズの被覆ナノ粒子との混合物の生成後、与えられた時間、与えられた温度において混合物が保たれた時の与えられた波長の光の前記混合物の吸光度の変化によってさらに特徴付けられる。
【００４６】
【００４７】
例として、吸光度変化の最高速度は、与えられたテスト条件の各自について観察された上記最高レベルよりも約４倍、好ましくは約２または４倍高い。
【００４８】
例として、以下の値を得ることができる。
３７℃、２６０秒、メディアン直径９２ｎｍ：
Ｃｙｓ．Ｃ濃度９．９μｇ／ｌ：６５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ
Ｃｙｓ．Ｃ濃度１９．８μｇ／ｌ：２０３ｍＡｂｓ単位／ｃｍ
Ｃｙｓ．Ｃ濃度２６．６μｇ／ｌ：２４４ｍＡｂｓ単位／ｃｍ
Ｃｙｓ．Ｃ濃度３４．１μｇ／ｌ：４２０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ
Ｃｙｓ．Ｃ濃度４４μｇ／ｌ：６２３ｍＡｂｓ単位／ｃｍ
３２℃、６００秒、メディアン直径９２ｎｍ：
Ｃｙｓ．Ｃ濃度９．９μｇ／ｌ：２９ｍＡｂｓ単位／ｃｍ
Ｃｙｓ．Ｃ濃度１９．８μｇ／ｌ：６２ｍＡｂｓ単位／ｃｍ
Ｃｙｓ．Ｃ濃度２６．６μｇ／ｌ：１２２ｍＡｂｓ単位／ｃｍ
Ｃｙｓ．Ｃ濃度３４．１μｇ／ｌ：１６７ｍＡｂｓ単位／ｃｍ
Ｃｙｓ．Ｃ濃度４４μｇ／ｌ：３８８ｍＡｂｓ単位／ｃｍ
【００４９】
本発明のさらなる好ましい方法は、比ろう方法に対する相関曲線が作成される時、０．１５ｍｇ／ｌ未満、好ましくは０．１およびもっと好ましくは０．０５ｍｇ／ｌ未満のシスタチンＣのインターセプト値が比ろう方法によって得られる０ｍｇ／ｌシスタチンＣの対応する値に対して比濁方法について得られることを特徴としている。
【００５０】
本発明によるさらなる好ましい方法は、非均質イムノアッセイ方法に対する相関曲線が作成される時、０．２５ｍｇ／ｌ未満、好ましくは０．１５ｍｇ／ｌ未満およびもっと好ましくは０．５ｍｇ／ｌ未満のシスタチンのインターセプト値がシスタチン０ｍｇ／ｌシスタチンの対応する値に対して得られることを特徴とする。
【００５１】
本発明によるさらなる好ましい方法は、テストサンプル中の１５ｍｍｏｌ／ｌトリグリセリドから１．２ｍｇシスタチンＣ／ｌのレベルにおけるシスタチンＣの測定値に対して６％未満、好ましくは４％未満、またはもっと好ましくは２％未満の干渉を有することを特徴とする。
【００５２】
本発明によるさらなる好ましい方法は、シスタチンＣ１．３２ないし７．５ｍｇ／ｌの測定範囲において５％以下、好ましくは４％以下、またはもっと好ましくは３％以下の直線性からの偏差、および／またはシスタチンＣ０．７５ないし１．３２ｍｇ／ｌの測定範囲において１５％以下、好ましくは１１％以下、またはもっと好ましくは７％以下の直線性からの偏差を有することによって特徴化される。
【００５３】
本発明によるさらなる好ましい方法は、吸光度の初期増加速度を、（ａ）混合時において直接記録することにより、（ｂ）初期吸光度増加への後方補外法と組合せて混合の少し後で記録することにより、または（ｃ）サンプルと試薬の混合後１分以内の２以上の時間ポイントの間の吸光差を測定することによって測定することによってサンプルのシスタチンＣ濃度を決定することを特徴とする。
【００５４】
本発明のさらなる局面は、哺乳動物の糸球体濾過速度を評価する方法を提供し、この方法は上で測定した方法に従ってヒトシスタチンＣの比濁評価を含む。前記方法は特に腎機能不全（腎不全のような）の診断または治療の間に適用することができる。
【００５５】
本発明のなお他の局面は、（ａ）乾燥または懸濁した形の上で規定した抗シスタチンＣ免疫粒子を含む粒子と、（ｂ）乾燥または溶解した形のアッセイ緩衝液、そして任意に（ｃ）各自乾燥または溶解または懸濁した形の較正混合物および対照混合物よりなる、上で規定した方法を実施するための試薬キットまたはパーツのキット、または試薬のセットのキットに関する。
【００５６】
好ましくは、粒子およびアッセイ緩衝液は組合せで乾燥または懸濁液形で提供される。
【００５７】
本発明の他の局面によれば、上の定義に従った、そして後のもっと詳細な説明に従ったナノ粒子−抗体接合体が提供される。
【００５８】
本発明は、そのようなナノ粒子−抗体接合体のヒトシスタチンＣの評価のためのイムノアッセイにおける、または哺乳動物の糸球体濾過速度の評価のための診断方法における使用に関する。
【００５９】
最後に本発明は、そのようなナノ粒子−抗体接合体のヒトシスタチンＣの評価のためのイムノアッセイにおける、または腎機能不全、例えば腎不全の評価のための診断方法における使用に関する。
【００６０】
ｂ）抗ヒトシスタチンＣ抗体の調製
ｂ１）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗ヒトシスタチンＣ抗体は、例えばＣｈａｓｅ，Ｍ．Ｗ．，１９６７，“Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，ｅｄ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｍ．Ｗ．，ｐｐ．１９７−２０９，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されているようなこの分野で良く知られた方法によって調製することができる。概略すると、適当な種の動物（例えばウサギ、ヤギ、ヒツジ、または好ましくは鳥類種、特にメンドリのようなニワトリ）が適当なアジュバンド、例えばフロインドの完全または不完全アジュバンド中の精製された抗原で繰り返して免疫される。免疫後動物はしゃ血され、そしてポリクローナル抗体が例えば硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウム沈澱、アニオン交換クロマトグラフィー、イムノアフィニティクロマトグラフィー、および／またはアフィニティクロマトグラフィーのような方法によって精製される。
【００６１】
十分な比濁測定信号を得るため、高い貧欲性を有する抗体が好ましい。ポリクローナル抗体は多数の異なる抗体分子を含んでいるので、親和定数を計算することができないが、しかしながら高い貧欲性および親和性は慣用のポリクローナル抗体技術によって得られた。慣用方法によって得られたウサギ抗体が使用されたが、しかしもっと良好な結果はヒツジ抗体で得られた。さらに良好な結果は鳥類抗体を使用する時に得られた。鳥類抗体は、Ｌａｒｓｏｎ
Ａ，Ｂａａｌｏｅｗ Ｒ−Ｍ，Ｌｉｎｄａｈｉ Ｔ，ａｎｄ Ｆｏｒｓｂｅｒｇ Ｐ−Ｏ，Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｌｎｃｅ ７２：１８０７−１８１２，１９９３に記載されている方法によることができる。一般にヒトから一層別個の鳥類はポリクローナル哺乳類抗体より高い貧欲性を有するヒトシスタチンＣに対する抗体を生産できることが企図される。
【００６２】
ポリクローナル鳥類抗体は卵黄から日常的に得られる（そしてそれ故ＩｇＹと呼ばれる）。しかしながら卵黄は多量の脂質を含有し、それらのさらなる使用を厄介にする。ＩｇＹは段階的な硫酸アンモニウム（例えば２５から４０％）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈澱を使用して卵黄から単離することができる。初期精製のため、Ｇａｌｌｕｓ
Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ，Ｃａｒｙ ＵＳＡから得ることができる商業的ＩｇＹ精製キット、またはＰｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡから得ることができるＥｇｇｃｅｌｌｅｎｔ
Ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＹ精製キットを製造者の指示書を考慮して使用することができる。
【００６３】
さらにポリクローナル抗体の貧欲性は、抗原アフィニティ精製方法、例えばｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ（Ａｐｒｉｌ ２００６）からダウンロードされる“Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”の教えに従って精製された抗体を使用することによってさらに増大し得る。アフィニティ精製は後でさらに詳しく記載される。
【００６４】
特に増大した貧欲性は、使用した抗体の２０％が抗原アフィニティ精製された時に観察され、さらなる増大は抗体の５０％が抗原アフィニティ精製された時に観察され、さらにより大きい増強は７５％以上、例えば抗体の７５ないし１００％を抗原アフィニティ精製方法によって得た時に観察された。
【００６５】
貧欲なポリクローナル抗ヒトシスタチンＣ抗体のアフィニティ精製のためには適切なヒトシスタチンＣアフィニティカラムを調製しなければならない。精製したヒトシスタチンＣが標準的プロトコールによって適当な固相支持体、例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＡｆｆｉ−ｇｅｌへ抗原を共有結合するように活性化して固定される（適当な活性固相支持体は例えばＰｉｅｒｃｅ
Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡから入手できる）。次にアフィニティカラムが前記抗原担持樹脂から調製される。
【００６６】
抗体の成功的アフィニティ精製は抗体の結合部位への抗原上の適切なエピトープの効果的なプレゼンテーションに依存する。もし抗原が小さくそして支持体表面へ多数の化学結合手によって直接固定化されたならば、重要なエピトープがブロックまたは立体障害を受け、効果的な抗体結合を阻害し得る。それ故、独特な官能基（例えばペプチド中の単一末端システインのスルフヒドリル）を使用し、そして数個の原子長のスペーサーアーム中にその反応性基がある活性化支持体を使用して抗体を固定化することが最善である。大きい抗原、特に固定化のための多数の部位を有する抗原については、抗原自体が支持体マトリックスとエピトープの間の効果的なスペーサーとして役立つので、スペーサーアームの長さはさほど重要でない。
【００６７】
各操作のコアはそれぞれの抗原に対する抗体のアフィニティであるので、通常抗体のアフィニティ精製のための典型的な結合および溶離条件の間には少しの変動しか存在しない。抗体は抗原を認識しそして生理学的条件下で抗原を強固に結合するように設計されているので、大部分のアフィニティ精製操作は生理的ｐＨおよびイオン強度を真似する結合条件を使用する。最も普通の結合緩衝液は、ｐＨ７．２および１．５Ｍ
ＮａＣｌのリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）およびトリス緩衝化食塩水（ＴＢＳ）である（あらかじめ混合した緩衝液パックは例えばＰｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡから入手可能）。一旦抗体が固定化抗原へ結合したならば、追加の結合緩衝液が未結合物質を支持体から洗浄するために使用される。非特異性結合を最小化するため、洗浄緩衝液は弱い相互作用を中断するための追加の塩または洗剤を含有することができる。
【００６８】
特異性の精製した抗体は、緩衝液のｐＨおよび／イオン強度を変更することにより（共通の溶離緩衝液は例えばＰｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡから入手可能）アフィニティ樹脂から溶離される。抗体は全般に最小の活性損失をもって２．５ないし１１．５のｐＨ範囲に耐えられる弾力性のタンパク質であり、これは断然最も普通の溶離戦略である。ある場合には、抗体−抗原相互作用はｐＨ変化によって効果的に中断されないか、またはｐＨによって損傷されず、代りに戦略の採用を必要とする。
【００６９】
アフィニティ精製プロトコールの一例を以下に与える。
ステップ１：各使用前残留タンパク質を除去するため、以下の緩衝液のシリーズの１０カラム容積を使用してカラム（〜１ｍｌ樹脂ベッド）を洗浄せよ。
０．２Ｍグリシン，ｐＨ２．８，１０ｍｌ
０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３，ｐＨ８．５．０．５Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍｌ
上の緩衝液でのサイクルを２回繰り返しせよ。次に０．５Ｍへ調節したＮａＣｌを含有するＴＴＢＳ緩衝液（０．３Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ，ｐＨ７．８，０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０，０．０１％
ＮａＮ３）中でカラムを平衡化せよ。
ステップ２：粗製抗体調製物の１０ｍｌ分量と、１０Ｘ ＴＴＢＳ １ｍｌと、４Ｍ ＮａＣｌ ０．５５ｍｌを加えよ。沈澱物を除去するため遠心せよ。
ステップ３：血清と共にアフィニティ樹脂をチューブ（１５ｍｌチューブ）へ移すことによって抗体をバッチ式に吸収せよ。冷室内でインキュベートせよ。代りにカラムへ血清を遅い流速を使用することによって適用することができる。人力的に収集した分画が得られる。カラムを通過した相を集め、遅い流速を使用してそれを２回目に再適用せよ。
ステップ４：Ａ２８０が０．０２以下になるまでカラムをＴＴＢＳ＋０．５ＮａＣｌでよく洗浄せよ。
ステップ５：０．０２ＮａＮ３を含有する０．２Ｍグリシン，ｐＨ２．８を使用して抗体を溶離せよ。緩衝液の１ｍｌ分量を用いて溶離せよ。分画を１Ｍ
Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．５の５０ｍｌを含んでいる１．５ｍｌマイクロ遠心チューブ中に採取せよ。これはタンパク質が溶離された直後酸性溶離緩衝液を中和する。少なくとも１０分画を採取せよ。これは抗体を除去するのに通常十分であに。適切なブランク（すなわち１ｍｌグリシン緩衝液プラス５０ｍｌ
１Ｍ Ｔｒｉｓ）を使用して各分画のＡ２８０を読取れ。
ステップ６：適切な分画をプールせよ。プールのＡ２８０を読取り、抗体を４℃で貯蔵するか、５０％グリセロールの存在下で部分量において凍結（−７０℃）をすることを考えよ。
ステップ７：０．２Ｍグリシン，ｐＨ２．８緩衝液および続いてＴＴＢＳで完全に洗浄することによりカラムを洗浄せよ。
【００７０】
ｂ２）モノクローナル抗体
粒子増強比濁アッセイにおいては、ポリクローナル抗体がしばしばモノクローナル抗体よりも好ましい。ポリクローナル抗体は本来抗原（または検体）上の多数の異なるエピトープと反応性であり（モノクローナルとは反対に）、それ故抗原分子自体間に、および抗原と抗体が固定化される粒子の間に交差結合およびネットワークを容易に創出する。対照的に、モノクローナル抗体は一般にエピトープの１タイプのみへ結合し、交差結合およびネットワークの形成をもっと困難にする。しかしながら診断産業は、モノクローナル抗体は、特に多年の製品寿命期間にわたってあらかじめ定めた標準化し、品質管理することが容易なため、しばしばモノクローナル抗体を好む。それ故、粒子増強比濁アッセイのための、特にモノクローナル抗体の使用を有利にする抗原特性が存在する時のモノクローナル抗体使用の良い例が存在する。Ｅｄａ
ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｐａｔｒｉｃｌｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｔｕｒｂｉｍｅｔｒｉｃ
Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔ４ｅｉｎ Ｗｉｔｈ Ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ
Ｄｙｎａｍｉｃ ｒａｎｇｅ”，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌｙｓｉｓ，１２：１３７−１４４（１９９８）は、２種類の異なるモノクローナル抗体および２種類の異なるマイクロ粒子の使用を記載する。ＣＲＰ分子は同じサブユニットのペンタマーであり、それ故すべてのエピトープの５複製を担持し（Ｐｅｐｙｓ
ＭＢ ｅｔ ａｌ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：１４１−２１２（１９８３））、それはモノクローナル抗体の使用を容易にするため、ＣＲＰはモノクローナル抗体の使用にとって特に有利である。しかしながら、シスタチンＣのようなモノマーで小さいタンパク質では、本発明の特別の具体例において異なるモノクローナル抗体のカクテルを使用することができる。異なるモノクローナル抗体のカクテル、特にそれらがシスタチンＣに対し、高いアフィニティを持った多数の異なるモノクローナル抗体よりなる時、本発明のシスタチンＣイムノアッセイの良い具体例をもたらす。
【００７１】
モノクローナル抗ヒトシスタチンＣ抗体はこの分野で良く知られた方法、例えばＧ．Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５；Ｇ．Ｇａｌｆｅｒ
ｅｔ ａｌ，１９８１，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３，３−３６；またはＲ．Ｋｅｎｎｅｔ，１９８０，“Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：ａ
ｎｅｗ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ”，ｅｄ．Ｒ．Ｋｅｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ，Ｐｌｅｎｕｍ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＆ Ｌｏｎｄｏｎに記載された方法によって調製することができる。免疫化したマウスまたはラットの脾臓細胞または末梢血液細胞がミエローマ細胞ラインと例えばポリエチレン融合方法を用いて融合される。融合は適当な条件、例えば培養プレート上で成育され、正しく融合された細胞の選別が例えばヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）選別方法を用いて実施される。抗体産生細胞ラインが例えばＥＩＡ，ＲＩＡまたは凝集アッセイのような方法によって同定される。抗体産生細胞ラインの同定後、細胞は新しい発育細胞ラインが１個の単一細胞から誘導されることを保証するため、例えば制限希釈法によってくり返してサブクローンされる。
【００７２】
ｂ３）キメラ抗体
キメラ抗ヒトシスタチン抗体は、Ｇ．Ｌ．Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２，６４３−６４５に記載されたようなこの分野でよく知られた方法によって得られる。概略して操作は以下のように記載することができる。１スペシスまたはその一部のモノクローナル抗体からの抗原結合部位のＤＮＡが異なるスペシスの他の抗体の抗体フレームワークのＤＮＡへ移される。この新しい構築物が発現ベクターへクローンされ、それが抗体を生産するための対応する発現システムへ移される。
【００７３】
ｂ４）組換え抗体
組換え抗ヒトシスタチンＣ抗体は、動物担体を使用することなく、Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３４９，２９３、またはＪ．Ｓ．Ｈｕｓｔｏｎ
ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５８７９に記載されているような、この分野において既知の方法を使用して得ることができる。これらの方法は、抗体またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）を宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ，カビ、イースト、植物または真核生物細胞へ導入し、望みの特異性および親和性を有する抗体を選定し、そして対応する発現システム内で抗体またはそのフラグメントを発現させるステップを含んでいる。
【００７４】
ｂ５）抗体フラグメント
ポリクローナル抗体、任意のスペシスのモノクローナル抗体（キメラ抗体および組換え抗体を含む）のＦａｂ−，Ｆａｂ’−およびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、例えばＡ．Ｎｉｓｓｏｎｏｆｆｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９６０，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ
Ｂｉｏｐｈｙｓ，８９，２３０、またはＲ．Ｐ．Ｐｏｒｔｅｒ，１９５９，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．７３，１１９，またはＥ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，６２６−６３１，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡに記載されているような、この分野で良く知られた方法によって製造することができる。
【００７５】
ｂ６）ヒトシスタチンＣに対し異なる反応性の抗ヒトシスタチンＣ抗体の選択
結合パートナーとしてモノクローナル抗体またはそのフラグメントを使用する時、特に高および低反応性の異なる抗体の選択は、慣用のコーティング技術によってモノクローナル抗体の各自を同じ材料およびサイズのナノ粒子上へ別々にコーティングし、そして検体との置換態様において与えられた比、例えば１／１ｖ／ｖにおいてナノ粒子試薬を混合することによって便利に実施することができる。同じ条件でナノ粒子の較正曲線を作成した後、検体の低濃度のための得られた較正曲線の険しさは免疫学的結合パートナーの反応性の第１の指示を与える。
【００７６】
結合パートナーとしてポリクローナル抗体を使用する時、高および低反応性ポリクローナル抗体の調製は、この分野で良く知られた方法に従って、ポリクローナル抗体をゲルマトリックスへ共有結合した抗原検体を担持するアフィニティクロマトグラフィーカラムへ導入することによって実施することができる。溶出バッファの勾配により、低反応性ポリクローナル分画が最初カラムから溶出し、続いて増大する高反応性を有する分画が溶出するであろう（Ｓ．Ｙａｍａｍｏｔｏ
ｅｔ ａｌ．，１９９３，“Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ”３６，２５７−２６４，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ＢＶ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍを見よ）。分画の反応はその後ＢＩＡｃｏｒｅ機器で、または同じサイズおよび材料のナノ粒子へそれらを独立にコーティングしそして対応する較正曲線を作成することによってチェックすることができる。
【００７７】
好適な抗ヒトシスタチンＣ抗体は異なる源から商業的に提供されている。例えば、フィンランドのＨｙＴｅｓｔは抗原の異なるエピトープを認識する高アフィニティ抗ヒトシスタチンＣ抗体のセットを提供している。これらの抗体は、慣用の態様において、ヒト尿から精製したシスタチンＣでＢａｌｂ／ｃマウスを免疫し、ハイブリドーマ細胞ラインＳｐ２／０との融合によって、ハイブリドーマを製造することによって調製される。選択されたクローンによって生産された抗体がタンパクＡアフィニティクロマトグラフィーによって精製された。下記ｍＡｂがＨｙＴｅｓｔから現在提供されている。Ｃｙｓｔ１０，Ｃｙｓｔ１３，Ｃｙｓｔ１６，Ｃｙｓｔｏ１８，Ｃｙｓｔｏ１９，Ｃｙｓｔｏ２３，Ｃｙｓｔｏ２４およびＣｙｓｔｏ２８。商業的に提供されているモノ−ポリクローナル抗ヒトシスタチンＣ抗体の他の供給者は、Ｆｕｓｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ
Ｉｒｅｌａｎｄ；ＢｉｏＶｅｎｄｏｒ，Ｃｚｅｃｈ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ；ＡＢ Ｌｏｃａｔｉｏｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ａｆｄｆｖａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｉｃｅｍｉｃａｌ，ＵＳＡ；Ａｂｃａｍ，ＵＫ；Ａｘｘｏｒａ，ＵＫ；Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，ＵＳＡ；Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ；ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｎｏｒｗａｙ；Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ＵＳＡである。前記源からのすべての抗ヒトシスタチンＣ抗体は、原則として、本発明を実施するため単独または併用して使用することができる。
【００７８】
ｃ）ナノ粒子およびそれらの抗体との接合体
本発明のナノ粒子を製造するための材料は、粒子増強光散乱アッセイを発生および実施するのに適した、任意の天然または合成、無機、有機、非ポリマーまたはポリマー材料であることができる。そのような材料は、例えば、セレニウム、炭素、金、窒化炭素、ケイ素またはゲルマニウム、例えばＳｉ３Ｎ４、鉄、チタンまたはケイ素の酸化物、例えばＴｉＯ２またはＳｉＯ２、そして例えばラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、エポキシ樹脂、ポリ塩化ビニリデン、ポリ（アルファナフチルメタクリレート）、ポリ（ビニルナフタレン）、またはそれらの共重合体、特にスチレンと共重合し得る不飽和化合物との共重合体、例えばスチレン−メタクリレート共重合体を含む。ポリマー材料製の粒子、それにスチレンから重合した内部コアと、スチレンと共重合し得るエチレン性不飽和化合物から共重合によって生成した外側シエルよりなるコア−シエル粒子、例えば米国特許第４，２１０，７２３号に記載された粒子も好適である。
【００７９】
接合に適したポリマー材料は、Ｂａｎｇｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｉｎｃ．またはＩｎｔｅｒｆａｃｉａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｍｅｒｃｋ ＳＡ，Ｆｒａｎｃｅ，または他の適当な源から購入することができる。粒子は抗体への結合のため多数の方法に従って活性化することができ、そのようなカップリング化学の完全な教えは、例えばＢａｎｇｓ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．のウエブサイトからダウンロード可能な、ＴｅｃｈＮｏｔｅ ２０５，Ｒｅｖ．００３，例えば２００２年３月の“Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ”中に見られる。例えば、カップリングは表面カルボキシル、アミノ、ヒドロキシ、ヒドラジドまたはクロロメチル基を持っている粒子によって達成し得る。連結される分子はそのような基と直接反応するか、または適当なリンカー、例えばカルボジイミド、グルタルアルデヒドまたは臭化シアンによって反応させることができる。
【００８０】
本発明に従った粒子のシエルは、好ましくは十分な比濁信号を発生する一定のサイズのナノ粒子コアと結合した、シスタチンＣに対して高い親和性を有する抗体を含まなければならない。典型的には、タンパク質性材料のシエルを含んでいるナノ粒子は、５８ないし２００ｎｍ，もっと好ましくは６５ないし１５０ｎｍ，そしてさらに好ましくは８０ないし１３５ｎｍである。
【００８１】
本発明の特定な具体例において、未被覆粒子の平均直径は約８０ｎｍである。これら粒子を使用し、コーティング後それらは直径が典型的は９０〜１００ｎｍになる。一般的に抗体の単一層は厚みが約５ｎｍであり、そのためそのような粒子は抗体の単層を支持していると考えられる。
【００８２】
これらの粒子は、接合した粒子の全乾燥重量の５ないし３５％が抗体で構成されている時に良好な成績を有し、抗体が接合した粒子の全乾燥重量の１０ないし３０％である時より良い成績が、１５ないし２５％である時最適の成績が得られる。
【００８３】
もし僅かに大きい粒子が使用されるならば、これらの最適なパーセント値は低くなる。例として、もし９５ｎｍ粒子が使用されるならば、それらは典型的には、もし被覆すれば１１０ｎｍであるメディアン直径へ上昇する。その時の対応するパーセントは４ないし３２％、８ないし２６％、そして最適成績のためには１２ないし２２％（接合した粒子の全乾燥重量を抗体が構成するパーセント）である。しかしながらこれらの僅かにより大きい粒子では、曲線を平坦化することなく較正曲線を発生させるためには（アッセイ較正曲線は８μｇシスタチンＣ／μｌサンプルまで良好なダイナミック範囲を持たなければならない。）十分な結合能力を持つように、アッセイにおいてもっと多くの粒子（粒子のもっと多い重量の意味において）がアッセイに使用されなければならない。これは一層高い吸収バックグラウンド（より大きい粒子をより多く）と、そして一層低い信号対ノズル比へ導く。
【００８４】
他方、より小さい粒子は被覆した粒子においてより高い最適抗体パーセントを持つであろう。例えば、もし７０ｎｍサイズの未被覆粒子が使用されるならば、被覆した粒子のメディアン直径は典型的には８０ｎｍであり、そして接合した粒子の全乾燥重量の４ないし４２％が最適パーセントになり、より最適でないのは１２ないし３６％、そしてもっと最適でない割合は抗体４ないし４２％となるであろう。しかしながらこれら少し小さい粒子では、低濃度において、すなわち１μｇシスタチンＣ／μｌサンプル以下において十分に険しい較正曲線を与えるためにはより少量の粒子（粒子のより少ない重量の意味で）をアッセイに使用しなければならず、そして信号は低くなり、そしてバックグランドノイズに対してもっと傷つけ易くなる。
【００８５】
上の説明を基にして、当業者は本発明の教えに指導されて異なるアッセイ条件のための最適な免疫粒子調製物を提供することができるであろう。
【００８６】
ナノ粒子への抗ヒトシスタチンＣ抗体のコーティングは、使用する材料の性質に適合したこの分野で良く知られた方法に従って、吸着的または共有結合的に実施することができる。
【００８７】
好ましい具体例によれば、抗シスタチンＣ抗体との１種以上の親水性不活性タンパクの混合物がナノ粒子への抗体の接合／結合の間存在しなければならない。本発明者らは驚くべきことに、抗体が接合ｐＨへ近いｐＩ値を有する親水性タンパクと一緒に粒子へ接合される時、高い結合能力を有する親水性粒子の最適の結果が得られることを観察した。最良の結果は、接合の間ウシトランスフエリンおよびアルブミンを存在させた時に得られる。しかしながら、接合の間抗体と他の不活性タンパク質を混合してもよい。そのような親水性不活性タンパク質の非限定例は、抗体またはシスタチンＣに対し親和性のない、リムペットへモシアニン、ハプトグロビンおよび他の水溶性タンパク質である。
【００８８】
カップリングプロセスの間、抗体が不活性タンパクとよりもナノ粒子コアと一層反応性で、それらがコアへ多かれ少なかれ定量的に結合するような条件でなければならず、もし必要ならば条件をそのように適合化しなければならない。ナノ粒子表面の残留反応性タンパクは不活性タンパクによってブロックされるであろう。
【００８９】
本発明者らは、一般原則として、最初のステップにおいて抗体の疎水性部分が粒子へ物理的に結合するように見え、このため粒子表面上の反応性基、例えばクロロメチル基へ近接し、これは次に対応するタンパク分子の基、例えばアミンと反応することを観察した。この物理的吸収のため、大きい抗体分子が驚くべきことに小さい不活性親水性タンパク、例えばアルブミンおよびトランスフェリンと競合する。しかしながら、粒子の結合能力より少ない抗体が使用されるため、アルブミンおよびトランスフェリンのような不活性タンパクは未反応の粒子表面と反応し、本発明の粒子に良好な親水性表面と良好な抗体結合能力を同時に付与し、そして良好な信号を発生することができるナノ粒子材料の適切な割合を付与する。
【００９０】
各コーティングプロセスの適切な条件への適応化は、当業者には日常的なここに提供された教示によって指導される。
【００９１】
例えば、カップリングのため、抗体のｐＩより半単位上のｐＨがモノクローナル抗体が使用される時に選ばれることができる。ポリクローナル抗体は全く広汎なｐＩを持ち、そのためポリクローナル抗体ではｐＨ８．８が好ましく選ばれる。
【００９２】
好ましい具体例においては、カップリング反応混合物の全タンパク含量を基にして、接合の間存在するタンパク質の約３ないし７０ｗｔ％、またはもっと好ましくは５ないし４０ｗｔ％が抗シスタチンＣ抗体によって占められなければならない。
【００９３】
上で説明したように、抗体は粒子に対し親水性不活性タンパクよりも高い結合速度を持っているので、粒子の表面へ結合した総タンパクに対する抗体タンパクの比はもっと高く、例えば粒子表面へ結合した総タンパクの２０ないし９０％、もっと好ましくは３５ないし８０％、さらに好ましくは４０ないし７０％が抗体によって占められる。
【００９４】
ｄ）特許請求した比濁方法の好ましい具体例
ｄ１）本発明の利益
本発明は、先行技術よりもはるかに強い信号対ノイズ比を有する比濁シスタチンＣイムノアッセイを提供する。抗原アフィニティ精製した抗体と組合せて、好ましくは一定の最小サイズの大きいコアおよびタンパクシエル粒子を選ぶことにより、驚くほど高い凝集信号が得られた。アッセイバッファーに比較した粒子の屈折率と、高度に精製した抗体の高い親和性（または貧欲性）の間の驚くべき相乗効果のため、強い比濁信号が得られる。強い比濁信号は、妨害物質、例えばトリグリセライドに対するより高い耐性と、そして先行技術よりも良好な比濁シスタチンＣイムノアッセイの直線性へ導いた。
【００９５】
均質イムノアッセイのための臨界的要因は、アッセイ混合物体積あたりの質量単位あたり発生する信号である。アッセイ混合物は、すべての試薬およびサンプルが添加された時に得られる混合物である。例えば、もし３μｌのサンプルを分析し、サンプルは１ｍ／ｌのシスタチンＣを含有し、そしてすべての試薬およびサンプルを混合した後の最終体積が３００μｌであるとすれば、最終アッセイ混合物中のシスタチンＣの濃度は１０μｇ／ｌである。もしサンプル中の検体濃度が低ければ、これはアッセイ混合物に比較して多量のサンプルを使用することにより、例えばアッセイ混合物３００μｌ中サンプルを８μｌに増量することによってしばしば補償することができる。サンプル体積の増量にはいくつかの妨害がある。第１に、サンプル中に存在するかも知れないすべての妨害物質の濃度がアッセイ混合物中で増大する。第２に、臨界的なフック効果（すなわち負の傾斜を持った用量応答曲線）を克服する抗体の必要性が増大し、これはアッセイの抗体コストを対応して増加させる。
【００９６】
それ故検体の低いアッセイ混合物濃度および対応して低いサンプル体積において良好な信号強度および頑強アッセイを得る必要が存在する。均質イムノアッセイにおいてサンプル体積を増大することはもっと大きな妨害およびもっと費用のかかるアッセイへ導く。
【００９７】
本発明は、比濁シスタチンＣイムノアッセイの信号強度、頑強さおよび直線性において驚くべき増大を提供する。本発明はまた、トリグリセライドのような脂質からの妨害がより少ない。これは検体単位質量あたりの比濁信号が低過ぎる信号強度に基づいている先行技術の欠点を理解した後に達成され、そして先行技術比濁方法よりも良い精度および直線性を有し、妨害の少ない方法を提供する。
【００９８】
ｄ２）異なるテスト条件下で観察された特異的改良
本発明によれば、体液サンプルまたは体液から誘導されたサンプル中のシスタチンＣを測定するための改良された比濁イムノアッセイ方法が提供される。該方法は、
前記シスタチン含有液サンプル、またはシスタチン含有液から誘導されたサンプル、またはシスタチンＣ含有サンプルの希釈液と、ポリクローナル抗シスタチン抗体または抗体フラグメント結合ナノ粒子とを前記シスタチンＣを結合するように接触させることによってアッセイ混合物を生成し、そして該混合物の混濁度の変化を測定することによってシスタチンＣ含量を評価することを特徴とし、
前記混濁度は、もし前記混合物が混合物生成後２６０秒間３７℃に保たれたならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において１５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において３０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において７５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５４６ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化され、そして前記方法は、
前記ナノ粒子結合ポリクローナル抗シスタチンＣ抗体または抗体フラグメント接合体のメディアン直径が５８ｎｍ以上であることによってさらに特徴化される。
【００９９】
このことは、波長５４６ｎｍおよび３７℃は、日立、ＲｏｃｈｅからのＣｏｂａｓおよびＭｏｄｕｌａｒのような多数の大型自動臨床化学分析機のための典型的な作業モードであるため有利である。
【０１００】
本発明はさらに、もし前記アッセイ混合物が同じ理由で有利である、混合物生成後２６０秒間３７℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチン９．９μｇの濃度において２５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において５５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりのシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において１２５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５４６ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される改良された方法を提供する。
【０１０１】
本発明はさらに、もし前記アッセイ混合物が同じ理由で有利である、混合物生成後２６０秒間３７℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｍの濃度において３０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において８５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において１９０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５４６ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される方法を提供する。
【０１０２】
いくつかの分光分析機器は低い波長において作動する。それ故本発明は、もし前記アッセイ混合物が混合物生成後２６０秒間３７℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において２０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において５０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において９０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５０５ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される方法を提供する。
【０１０３】
特に本発明は、もし前記アッセイ混合物が混合物生成後２６０秒間３７℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において３０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において７５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において１５０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５０５ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される方法を提供する。
【０１０４】
さらに本発明は、もし前記アッセイ混合物が混合物生成後２６０秒間３７℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において４０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において１００ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において２５０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５０５ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される方法を提供する。
【０１０５】
他の分光分析機器は、高い波長で作動する。それ故本発明は、もし前記混合物が混合物生成後２６０秒間３７℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において１０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において３０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において８０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５７０ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される方法を提供する。
【０１０６】
特に本発明は、もし前記アッセイ混合物が混合物生成後２６０秒間３７℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において１５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において４５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において１００ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５７０ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される方法を提供する。
【０１０７】
加えて、本発明は、もし前記混合物が混合物生成後２６０秒間３７℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において２０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において５５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において１２５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５７０ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される方法を提供する。
【０１０８】
３７℃より低い温度で作動するいくつかの臨床化学機器がある、それ故本発明は、もし前記混合物が混合物生成後６００秒間３２℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において１２ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において２５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において７０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５４６ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される方法を提供する。
【０１０９】
臨床化学オートメーション機器の能力を増強するために、もっと速いそしてもっと効率的なアッセイ方法に対して大きな需要がある。もしアッセイがもっと速く進行するならば、単位時間あたりもっと多くのアッセイを実行することができる。特にもし機器が動力学的モードで作動するようにつくられているならば、アッセイのスタート後速いそして強い信号増大が有利である。それ故本発明は、もし前記混合物が混合物生成後１２０秒間３７℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において８ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において２０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において５０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５４６ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される方法を提供する。
【０１１０】
特に本発明は、もし前記混合物が混合物生成後１２０秒間３７℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において１５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において３０ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において７５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５４６ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される方法を提供する。
【０１１１】
さらに本発明は、もし前記混合物が混合物生成後４０秒間３７℃に保たれるならば、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において４ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において７ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、または
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において１５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の前記混合物の波長５４６ｎｍの光の吸光度の変化によって特徴化される方法を提供する。
【０１１２】
ｄ３）先行技術比濁システムで同じ条件で得られる結果
上で説明したように、このアッセイに使用するナノ粒子の粒子サイズは注意深くバランスしていなければならない。大粒子は良好な信号を発生するが、バックグランドが高く、結合能力が低いので、多量の粒子を加えなければならず、高いバックグラウンド混濁度を産生する。Ｄａｋｏ
Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ ＡＳのようなアッセイの以前のサプライヤーは、恐らくこの理由で良好な比濁号を達成しなかった。
【０１１３】
製品番号ＬＸ００２／ＥＦＧ／ＣＳ／２５．１０．０４，Ｓ２３６１／ＥＦＧ／ＫＧＲ／０９．０７．０３およびＸＯ９７４／ＥＦＧ／ＳＵＭ／０９．０９．１４のＤａｋｏ
Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ ＡＳの包装挿入物に、そして上で引用したＳｃｈｍｉｄｔ，Ｋｊｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｇｒｏｎｋｊａｒの論文に与えられた指令に従った時、これは波長５４６ｎｍ３７℃２６０秒以内において、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において９ｍＡｂｓ単位／ｃｍの、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において２４ｍＡｂｓ単位／ｃｍの、そして
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において５０ｍＡｂｓ単位／ｃｍの吸光度変化によって特徴化されるシスタチンＣのための比濁イムノアッセイ方法となった。
【０１１４】
これらの結果は本発明において観察された結果（上を見よ）より遥かに下であった。
【０１１５】
より短いアッセイ時間１２０秒の使用（動力学的読取りを目的として）を試みる時、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において６ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、そして
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において１５ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、そして
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において２４ｍＡｂｓ単位／ｃｍの吸光度変化を生じ、これは本発明について得られた結果より遥かに下であった。
【０１１６】
さらに、より短いアッセイ時間４０秒の使用（動力学的読取りを目的として）を試みる時、
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ９．９μｇの濃度において３ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、そして
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ１９．８μｇの濃度において６ｍＡｂｓ単位／ｃｍ以上の、そして
アッセイ混合物１あたりシスタチンＣ３４．１μｇの濃度において９ｍＡｂｓ単位／ｃｍの吸光度変化を生じ、これは本発明について得られた結果より遥かに下であった。
【０１１７】
上のアッセイ時間は、アッセイ試薬およびサンプルの混合物へ免疫ナノ粒子の添加からの時間と定義される。すべての体積およびシーケンスは製造者の情報に従った。シスタチンＣの濃度は、デイドベーリングＵＳ，製品番号ＯＱＮＭ１３ＮラテックスシスタチンＣからのＰｒｏＳｐｅｃｔネフェロメトリー参照方法を使用して決定された。
【０１１８】
ｄ４）本発明のアッセイ方法の実施
本発明の好ましい具体例においては、アッセイバッファーがサンプルと免疫粒子サスペンジョンと混合され、そして混合物または生成したサスペンジョンの混濁度が光度計、好ましくは記録光度計、さらに好ましくは記録分光光度計でモニターされる。好ましいステップのシーケンスは、アッセイバッファー中にサンプルを混合し、混合物が完全に溶解し、安定化するのを許容し、次に免疫粒子混合物を添加する。本発明は、アッセイバッファーと免疫粒子サスペンジョンを最初に混合し、次にサンプルを添加し混合することによっても実施することができる。最適な混合方法（この分野で良く知られた方法から選ばれる）を適用すべきであり、これは限られた数の予備実験によって決定することができる。
【０１１９】
記録光度計が使用される時、混濁度の初期増加率は、吸光度の初期増加率を混合時に直接記録するか、または初期吸光度増加への補外と組合せて混合短時間後に記録することによって測定するか、またはサンプルと試薬の混合後１分より短い２以上の時点で吸光度差を測定することによってシスタチン濃度を決定することによって決定することができる。
【０１２０】
これらの測定または組合せた測定は、既知のシスタチンＣ濃度の較正液での対応する結果と相関または比較することができ、そして未知サンプルの濃度がこのようにして計算することができる。吸光度値を記録し、そして結果を算出するこれらの方法は、臨床化学の分野の当業者によって測定される数多くの他の物質について非常に良く知られている。勿論、本発明から得られる非常に良好な信号は、特に上記したようにサンプルと試薬の混合短時間後良好な信号が得られる時にそのような測定および計算を頑丈にそして正確にする。
【０１２１】
異なる種類の緩衝物質、異なる種類の洗剤、および／または異なる種類のポリマーおよび／またはバッファーへ添加される塩類を有する、使用することができるいくつかのアッセイバッファーがある。
【０１２２】
ＭＯＰＳ，ＰＩＰＥＳ，ＨＥＰＥＳのようなＴＲＩＳバッファー、リン酸塩バッファー、ホウ酸塩バッファーおよび他のバッファー物質が使用でき、そしてｐＨおよび添加されたサンプルの緩衝能力に関係なく最終アッセイ混合物の良く調節されたｐＨがアッセイが維持できる限り、本発明に対して臨界的ではない。典型的には、バッファーは最終モル濃度約５ｍＭないし０．２Ｍ、または１０ｍＭないし０．１Ｍに添加される。ｐＨは６ないし８、６．５ないし７．５の範囲に調節される。
【０１２３】
さらに、添加されるサンプルの脂質成分を溶解し、そしてサンプルと共に導入されるシスタチンＣとの抗体の反応をあまり強く妨害しない限り、いくつかの洗剤を使用することができる。トリグリセリド、コレステロールおよびある範囲のリポタンパクは、脂質が妨害信号を与えるミクロ液滴およびミセルを形成するので、比濁アッセイにおける妨害物質の例である。Ｔｗｅｅｎ２０，Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００およびデオキシコール酸塩が好適な洗剤の例である。脂質含有サンプル中のシスタチンＣの測定は大きな挑戦であり、そして脂質の良好な溶解性を必要とするが、もっと重要なことはいかなるマイナーな妨害を乗りこえる強い信号である。洗剤は、典型的には各自最終反応混合物の重量に対して、０．０１ないし０．５％、または０．１ないし０．３％の最終濃度に添加される。
【０１２４】
最も広く使用されるポリマーは、異なると分子サイズ（特に約６，０００ないし８，０００）のポリエチレングリコールであるが、デキストサンおよび他のポリマーも使用できる。ポリマーは、その濃度が高過ぎる時、テストサンプルがアッセイ混合物中の混合される時導入される他の物質の非特異的沈澱を生成するという不利益を有する。他方、前記ポリマーは同時に信号を増大する。しかしながらそれらは免疫粒子の全体の結合能力を減らす傾向がある。ポリマーは、典型的には最終反応混合物の重量の約０．０５ないし０．５％、または０．１ないし０．３％へ添加される。
【０１２５】
イオン強度を適応化する好適な塩類は、例えばアルカリ金属ハライド、特に１ないし１００ｍＭ、または５ないし５０ｍＭの濃度に添加される塩化ナトリウムである。
【０１２６】
アッセイ混合物中に存在することができるさらなる成分は、
最終濃度約１ないし５０ｍＭまたは５ないし２０ｍＭへ添加されるグリシンのようなアミノ酸；
最終濃度０．１ないし５ｇ／ｌまたは０．５ないし２ｇ／ｌへ添加されるアルブミンのようなタンパク；
最終濃度０．１ないし１０または１ないし５ｇ／ｌへ添加されるアジ化ナトリウムのような抗バクテリア剤；および較正または対照物質であり、これらは、任意にある種のタンパク質物質と共にバッファー、典型的にはリン酸塩バッファーまたはトリスバッファーに溶解した既知濃度のシスタチンＣを含み、任意に１００体積％までのヒトまたは動物血清（もし１００体積％が血清であれば、バッファー溶液の余地も必要性もない）を含んでいる。
【０１２７】
さらに、１種以上の試薬を乾燥形、任意に凍結乾燥形で使用することができる。ナノ粒子へ接合した抗体は乾燥形で、例えばペレットとして使用し、使用前溶解することができ、または緩衝試薬中または反応混合物へ溶解することができる。反応緩衝液中の１以上の成分はアッセイ実施の前または最中に乾燥形で添加することができ、較正剤もそうである。サンプルも乾燥または凍結乾燥した形で提供し、乾燥形で、または使用前溶解して反応混合物へ添加することができる。
【０１２８】
臨床化学分析においては、較正目的のための標準曲線の使用は標準的プラクティスである。このため本発明の実施方法においては、臨床サンプルの代りに既知のシスタチンＣ含有のサンプルを測定すべき応答／信号のための標準曲線を作成するために使用し、そして未知サンプルのシスタチンＣ含量を標準曲線から補内法によって計算することができる。
【０１２９】
混合物中のナノ粒子免疫接合体の総濃度は、粒子増光光散乱免疫アッセイの分野で良く知られた方法に従って選択され、前記ナノ粒子から誘導される吸光度値が正確なそして高精度の測定に影響しないが、しかしマイクロ粒子濃度が信号発生を得るには十分に高いように選ばれる。その量は、勿論体液サンプルまたはそれから誘導されたサンプルの体積、そしてシスタチンＣのような異なるパラメータによって影響される。
【０１３０】
非限定的なアッセイの典型的パラメータとして、以下を挙げることができる。
【０１３１】
典型的なサンプル体積は１ないし２０μｌ、例えば２ないし１０μｌ、特に３μｌである。
【０１３２】
典型的な免疫粒子体積は１０ないし１００μｌ、または２０ないし６０μｌ、特に４０μｌである。前記免疫粒子は、バッファー溶液ｍｌあたり、０．５ないし１０または１ないし５、典型的には約２ないし３、特に２．２６ｍｇのサスペンジョンとして提供することができる。前記バッファー溶液は、緩衝物質に加え、上で規定したように例えばアミノ酸、塩類、不活性タンパク、乳化剤または溶解剤のようなさらなる成分を含むことができる。そのような成分およびバッファーの典型的な混合物は、１０ｍＭホウ酸塩バッファー、１０ｍＭグリシン、１５ｍＭ
ＮａＣｌ、０．２５％Ｔｗｅｅｎ２０，およびアルブミン１ｇ／ｌを含む。
【０１３３】
典型的アッセイ総体積は、１００ないし１０００μｌ，または２００ないし５００μｌ、または２５０ないし３００μｌ、特に約２８０μｌである。
【０１３４】
異なる機器は異なる総体積で作動し、そのためこれら体積の３０％または６０％、またはこれら体積の１５０％または３００％が他の機器のためには典型的である。サンプル体積と免疫粒子体積の間の比は、１／１００ないし２／３、もっと好ましくは２／１００ないし１／３、そしてもっと好ましくは１／４０ないし１／５である。
【０１３５】
ｄ５）医学的使用
本発明のアッセイ方法は、体液または組織のシスタチンＣ含量に関係した、または顕示される病理学的または病理学的に可能性ある状態の診断またはモニターのために使用することができる。これら哺乳類の糸球体濾過速度（腎機能の測定としてＧＦＲ）、または前記濾過速度に影響する哺乳類または病理学的状態を特に含んでいる。
【０１３６】
本発明方法は、小児のＧＦＲまたは筋萎縮症を有する患者のＧＦＲの測定、腎機能における癌治療の影響の監視、腎移植および免疫抑制療法の監視、糖尿病における腎臓濾過の監視、子かんの検知および管理、および薬物投与が体内に蓄積した望ましくない薬物を招来し得るＧＦＲの減少に関係する場合における薬物の正しい投与量の決定のために使用することができる。
【０１３７】
このアッセイ方法は、前記濾過速度に対する医薬品の影響を評価するためにも使用することができる。
【０１３８】
本明細書の熟練した読者はさらなる可能な用途を思いつくことができる。
【０１３９】
本発明は、本発明に従ったイムノアッセイ方法を実施するための試薬のセットを提供する。試薬セットは、抗シスタチンＣ免疫粒子、好適なアッセイバッファー、および任意に較正溶液および対照溶液を含むことを特徴とする。任意に、粒子サスペンジョンおよびアッセイバッファーは混合した試薬として配送してもよい。
【０１４０】
他の面において、本発明はサンプル中のシスタチンＣのアッセイに使用するための任意にキットまたは部品キットフォーマットの分析製品を提供し、前記製品は、乾燥またはサスペンジョン形の上に記載した少なくとも１タイプのナノ粒子−免疫接合体と、そして任意に上に記載の１種以上のさらなる成分、例えば好適なアッセイバッファーおよび任意に較正液および対照液を含んでいる。
【０１４１】
本発明は、本発明に従ったイムノアッセイを実施するための試薬のセットを提供する。試薬セットは、抗シスタチンＣ免疫粒子、好適なバッファー、そして任意に較正液および対照液を含むことを特徴とする。任意に粒子サスペンジョンおよびアッセイバッファーは混合試薬として配達してもよい。
【０１４２】
任意に、観察したシスタチンＣ濃度をＣＦＲパラメータと直接相関させることを許容する計算スキームのような信号評価手段も存在することができる。
【０１４３】
以下の非限定的実施例は非限定態様において本発明方法を例証する。
【０１４４】
実験の部
合成実施例１：ポリクローナル鳥類血清の調製およびそのアフィニティ精製
ａ）鳥類血清の調製
ヒトシスタチンＣに対するポリクローナルＩｇＹ抗体の生産のために以下の免疫化プロトコールを使用することができる。
【０１４５】
各免疫化実験のため２ないし４羽のメンドリが使用される。免疫化開始前卵２個が採取される。これら卵から精製したＩｇＹが対照ＩｇＹとして役立つであろう。リン酸塩バッファー中の高度に精製したヒトシスタチンＣ（細管タンパク尿症を有する患者の尿から精製）をフロインド完全アジュバンドで乳化し、メンドリの胸筋肉に注射する。注射は４週毎にくり返された。注射スタート１０週後卵が集められた。卵から卵黄が分離され、そして先行技術卵抗体単離方法（例えば、Ｌａｒｓｏｎ
Ａ，Ｂａａｌｏｅｗ Ｒ−Ｍ，Ｌｉｎｄａｈ１ Ｔ，ａｎｄ Ｆｏｒｓｂｅｒｇ Ｐ−Ｏ，ｉｎ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７２：１８０７−１８１２，１９９３を見よ）に従った慣用の態様で、卵黄からＩｇＹ分画が塩化アンモニウム沈澱によって単離された。
【０１４６】
ｂ）ポリクローナル血清のアフィニティ精製
高度に精製したヒトシスタチンＣ１０ｍｇがＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏｔｅｃｈからのＨＩＴＲＡＰ ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖｅ ＨＰカラム上にカラムのパッケージインサートの処方に従って固定化された。
【０１４７】
単離されたＩｇＹ分画をリン酸塩緩衝化食塩水中に２ｍｇ／ｍｌへ希釈した。このＩｇＧ溶液２００ｍｌをカラムに通し、次にＩｇＹなしのリン酸塩緩衝化食塩水５０ｍｌを通した。固定化シスタチンＣに対して特異的親和性を有する抗体を６．１モル濃度クエン酸塩バッファー、ｐＨ３．２の３５ｍｌで溶出した。溶出した特異性抗シスタチンＣ抗体をリン酸塩緩衝化食塩水に対して透析し、分子量カットオフ３０，０００ダルトンを有するＡｍｉｃｏｎ
Ｃｅｎｔｉｖｃｏｎ遠心濾過装置を用いて３ｍｇ／ｍｌへ濃縮した。
【０１４８】
合成実施例２：モノクローナル抗ヒトシスタチンＣ抗体の調製
モノクローナル抗ヒトシスタチンＣ抗体は、例えばＨａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｅｃｔｉｏｎ ６ ｏｆ“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡに記載されたこの分野で良く知られた方法を用いて以下のように製造することができる。ヒトＰＳＡは、Ｓｅｎｓａｂａｕｇｈ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ １９９０，１４４，１５２３に記載されているように、ヒト精液血漿から単離された。
【０１４９】
ＲＡＳ（ＲＩＢＩアジュバントシステム）中のヒトシスタチンＣ５０μｇの規則的間隔の４回注射後マウスが免疫化された。最初の注射４日後免疫化したマウスの脾臓から単離されたリンパ球が、Ｇａｌｆｒｅ
ｅｔ ａｌ．，１９８１．Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｙ，７３，３−４６に記載されているポリエチレングリコール法を使用してミエローマ細胞ラインＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４と融合された。
【０１５０】
シスタチンＣに対する抗体を分泌するハイブリドーマは以下のスクリーニングＥＬＩＳＡによって同定された：マイクロタイタープレートがウサギ抗ヒトシスタチン免疫グロブリンでコートされ；この固体相へ結合したシスタチンＣがハイブリドーマ培養物の上清とインキュベートされた。シスタチンＣへ結合したモノクローナル抗体は、抗マウスイムノグロブリン−ペルオキシダーゼ結合体を用いて検出された。
【０１５１】
ヒトシスタチンＣの異なるエピトープに対する抗体を分泌する数百ものハイブリドーマを単離することができる。対応するモノクローナル抗体はその後アフィニティ精製され、もっと詳細にキャラクタライズされることができる。
【０１５２】
エピトープ結合が実施され、そして抗体の相対的反応性がＢ１Ａｃｏｒｅバイオセンサー技術（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてそれらの見掛け解離定数に関して決定された。後者は表面プラスモン共鳴技術（Ｊ．Ｌ．Ｄａｉｓｓ
ｅｔ ａｌ．，１９９４，ｉｎ“Ｍｅｔｈｏｄｓｗ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”６，１４３−１５６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＵＳＡを見よ）に基づいており、そしてバイオ分子反応の動力学およびストキオメトリーのモニターを許容する。
【０１５３】
細胞培養上清から出発し、モノクローナル抗体がホリクローナルウサギ抗マウス−Ｆｃ−抗体を介してバイオセンサー表面へ結合された。モノクローナル抗体への抗原シスタチンＣの会合および解離がモニターされた。データは簡単なＡ＋Ｂ＝ＡＢ平衡モデルに基づいた本来的ＢＩＡ評価ソフトウエア（Ｌ．Ｇ．Ｆａｇｅｒｓｔａｍ
ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，５９７，３９７−４１０）を使用して解析することができる。得られる抗体はその後それぞれの見掛け解離定数に関して比較されることができる。好適な抗体またはその組合せが本発明の免疫粒子の製造のために使用し得る。
【０１５４】
合成実施例３：抗シスタチンＣ免疫粒子の調製
ａ）カップリング操作−標準的操作
（１）緩衝液および試薬
【０１５５】
抗体ｍｇあたりのポリマー粒子からのより多い信号を持つため、カップリング緩衝液のｐＨは連結すべき抗体のｐＩへ特異的方法で適合化された。加えて、抗体はカップリング前にアルブミン／トランスフェリンで希釈された（後記を見よ）。カップリングのため抗体のｐＩ半単位上のｐＨがモノクローナル抗体が使用される時に選ばれた。ポリクローナル抗体は全く広汎なｐＩを持ち、そのためポリクローナル抗体では８．８のｐＨが使用された。選ばれたｐＨは上のＰＢＳバッファーとホウ酸塩バッファーを混合することによって得られた。
【０１５６】
以下の標準的操作は、クロロメチルへの抗体の物理的吸着による取付けのための単一ステップ方法の概要である。このプロトコールは１％固形分の１μｍクロロメチルラテックスのためである。この反応は個々のニーズに合わせるため容易にスケールアップまたはスケールダウンすることができる。例えばもし異なる粒子サイズが使用されるならば、その時抗体（Ａｂ）の量は、式
Ａｂの重量＝（１μｍ粒子のためのＡｂの重量／（μｍでの粒子直径）
から計算することができる。
【０１５７】
（２）ラテックス粒子サスペンジョンの調製
１．クロメチルラテックスマイクロスフェア２．５ｍｌ（４０ｍｇ／ｍｌ）をピペットし、ＭＥＳバッファー１０ｍｌで希釈せよ。
２．粒子沈降のため３，０００Ｇで２０分間遠心せよ。
３．上清を除去し、ペレットをＭＥＳバッファー１０ｍｌに再懸濁せよ。
４．再び遠心し、粒子から上清を除去せよ。
５．ペレットをＭＥＳ５ｍｌに再懸濁し、マイクロスフェア粒子が完全に懸濁していることを確実にせよ。
ラテックスサスペンジョンは今や固形分約２％（すなわち２０ｍｇ／ｍｌ）にある。
【０１５８】
（３）カップリング
１．適切なｐＨ（上を見よ）へ調節したＰＢＳ／ホウ酸塩バッファー中の抗体１．５ｍｇ，アルブミン３．７５ｍｇおよびウシトランスフェリン７ｍｇの５ｍｌ溶液へラテックス５ｍｌを加える。これは抗体モノレイヤーが必要とするよりも少ない。抗体はトランスフェリンおよびアルブミンよりもラテックスと一層反応性であり、そして多かれ少なかれ定量的にラテックスと結合し、ラテックス表面の残りはアルブミンおよび／またはトランスフェリンで飽和される。この混合物は粒子の凝集および良好な親水性に対しても確実にする。接合の間、抗体にもシスタチンＣにも親和性のない貝類ヘモシアニン、ハプトグロビンおよび他の水溶性タンパクのような他の不活性タンパクも抗体と混合することができる。
２．ラテックス／タンパク混合物をゆるやかな混合で室温において一夜インキュベートせよ。
３．タンパク標識したラテックス粒子を未結合タンパクから分離するため遠心せよ。
４．タンパク測定のため上清を除去し、保留せよ。
このステップにおいて、上清を保存し、タンパクを測定することができる。上清中の残存タンパクは添加した元の量から差引くことができる。残りは粒子上に被覆されている。ラテックスマイクロスフェアと両立し得る唯一のタンパク測定方法はＰｉｅｒｃｅからのＭｉｃｒｏ
ＢＣＡタンパク測定キットである。
５．ペレットをＰＢＳ１０ｍｌ中に再懸濁せよ。
６．粒子を沈降させるため再び遠心せよ。
７．合計３回洗浄のためステップ５および６をさらに２回反復せよ。
８．最終ラテックスを貯蔵バッファー１０ｍｌ中に再懸濁し、固形分１％の最終濃度とせよ。使用まで４℃で貯蔵し、冷凍するな。
タンパクがカバーされないマイクロスフェア表面上のいかなる反応部位をも充填するためグリシンが貯蔵バッファー中に使用される。これは非特異性結合を減少する。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはウシトランスフェリンのような不活性タンパクがもし望むならば同じ目的で使用できる。ＮａＮ３が保存剤として存在する。もしラテックスは無菌に保たれるならば、細胞または組織培養物と両立しないＮａＮ３は省くことができる。
【０１５９】
ｂ）被覆したナノ粒子の調製
上の標準的操作は、本発明のナノ粒子接合体の調製のため０．０８μｍの直径のラテックス粒子を被覆するために適用された。上の処方に従って、抗体２４ｍｇとアルブミン６５ｍｇが粒子１００ｍｇを被覆するために使用された。
【０１６０】
前記抗シスタチンＣ免疫粒子は、Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＡＳ，Ｎｏｒｗａｙからの抗シスタチンＣ抗体製品番号Ａ１６７Ｃｙｓ−Ｃ−ＡＦ（前記ポリクローナル抗ヒトシスタチンＣ抗体は、慢性腎糸球体タンパク尿症を有する患者からのシスタチンＣで免疫化したメンドリの卵から単離したイムノグロブリンのアフィニティー精製したイムノグロブリン分画に相当し、このアフィニティー精製プロセスは固定化ヒトシスタチＣで実施された）をクロロメチル活性化ラテックス粒子（０．０８μｍ，Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｃ．，ＵＳＡからの製品番号Ｃ３７４８７）へ連結することによって製造された。前記カップリングのためｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｄｃｌａｔｅｘ．ｃｏｍ／ｂｏｄｙ−ｂｇｒｏｕｎｄｅｒ−ｓｕｐｅｒａｃｔｉｖｅ−ｐｒｏｔｏｃｏｌ−１１．ａｓｐからダウンロードしたプロトコール“ＩＤＣ超クリーンクロロメチルラテックス”を使用することができる。
【０１６１】
代替的粒子およびカップリングプロトコールは、Ｉｎｔｅｒｆａｃｉｃｉａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ社のウエブサイド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のウエブサイド、およびＢａｎｇｅ
Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｉｎｃ．社のウエブサイドに見られる。
【０１６２】
得られた粒子は０．２５％Ｔｗｅｅｎ２０と１ｇ／ｌアルブミン添加１０ｍＭホウ酸バッファー、１０ｍＭグリシン、１５ｍＭ ＮａＣｌ中粒子２．２６ｍｇ／ｍｌのサスペンジョンとして使用される。
【０１６３】
アッセイ実施例１：異なるアッセイ条件下の本発明の免疫粒子に基づく比濁シスタチンＣアッセイ
合成実施例３において調製した免疫粒子懸濁液が以下の実験において使用された。
【０１６４】
これら実験において次の最適化されたアッセイバッファーｐＨ＝７．２が使用された。
ポリエチレングリコール（Ｓｉｇｍａ）２２ｇ／ｌ
Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）３ｇ／ｌ
ＭＯＰＳ（Ｓｉｇｍａ）９．４ｇ／ｌ
アジ化ナトリウム２．７ｇ／ｌ
【０１６５】
サンプル３μｌをアッセイバッファー２５０μｌと混合し、３０秒間静置し、粒子サスペンジョン４０μｌを加え混合した。混合後ｃｍあたりの吸光度を島津ＵＶ１６０１分光光度計で測定した。
【０１６６】
濃度、温度、免疫粒子添加混合後の時間、および分光光度計で使用した光の波長に応じて、以下の結果（ｍＡｂｓ単位／ｃｍ＝ミリ吸光度単位／光路長ｃｍ）が得られた。
【０１６７】
ａ）２６０秒アッセイ時間内で３７℃において波長５４６ｎｍ
吸光度変化：
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度９．９μｇ／ｌにおいて３３ｍＡｂｓ単位、
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度１９．８μｇ／ｌにおいて８８ｍＡｂｓ単位、および
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度３４．１μｇ／ｌにおいて１９４ｍＡｂｓ単位
ｂ）２６０秒アッセイ時間内で３７℃において波長５０５ｎｍ
吸光度変化：
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度９．９μｇ／ｌにおいて４３ｍＡｂｓ単位、
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度１９．８μｇ／ｌにおいて１２８ｍＡｂｓ単位、および
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度３４．１μｇ／ｌにおいて２８２ｍＡｂｓ単位
ｃ）２６０秒アッセイ時間内で３７℃において波長５７０ｎｍ
吸光度変化：
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度９．９μｇ／ｌにおいて２４ｍＡｂｓ単位、
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度１９．８μｇ／ｌにおいて６５ｍＡｂｓ単位、および
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度３４．１μｇ／ｌにおいて１４８ｍＡｂｓ単位
ｄ）アッセイ時間１２０秒内で３７℃において波長５４６ｎｍ
吸光度変化：
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度９．９μｇ／ｌにおいて１１ｍＡｂｓ単位、
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度１９．８μｇ／ｌにおいて３１ｍＡｂｓ単位、および
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度３４．１μｇ／ｌにおいて７２ｍＡｂｓ単位
ｅ）アッセイ時間４０秒で３７℃において波長５４６ｎｍ
吸光度変化：
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度９．９μｇ／ｌにおいて４ｍＡｂｓ単位、
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度１９．８μｇ／ｌにおいて１１ｍＡｂｓ単位、および
アッセイ混合物中シスタチンＣ濃度３４．１μｇ／ｌにおいて２３ｍＡｂｓ単位
【０１６８】
アッセイ時間は、免疫粒子をアッセイバッファーおよびサンプルと混合してから吸光度を読取るまでの時間（秒）として規定された。シスタチンＣの濃度はＤａｄｅ
Ｂｅｈｒｉｎｇ，ＵＳからのＰｒｏ Ｓｐｅｃ ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄｓ，製品番号ＯＱＮＭ１３Ｎ Ｌａｔｅｘ Ｃｙｓｔａｔｉｎ
Ｃを使用して決定された。
【０１６９】
より速いそしてより強力な信号を有するこれらの結果は、比濁イムノアッセイにおいては共通の妨害物質であるトリグリセライドからの妨害効果と、そして最良の先行技術方法と比較した本発明方法の直線性を検討するために使用された。これらの実験を以下に記載する。
【０１７０】
アッセイ実施例２：本発明方法の比濁測定に対するトリグリセライド妨害の検討
この研究の目的は、本発明方法がテストサンプル中のトリグリセライド（ＴＧ）によって妨害されるかどうかを決定することであった。妨害があらかじめ定めたＴＧ濃度以下において見られるかどうかによって、妨害と、潜在的妨害物質の間の関係を証明するために実施される。操作はＮＣＣＬＳガイド“Ｉｎｔｅｒｆｅｎｃｅ Ｆｅｓｔｉｎｇ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｔｙ，ａｐｐｒｏｖｅｄ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ”，ＮＣＣＬＳ ｓｅｃｔｉｏｎ ６．１．２に基づいている。
【０１７１】
ａ）設備
機器：Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから提供された標準アクセサリーを備えて日立９１７機器
日立９１７機器のセッティング：
アッセイバッファー体積 ３３０μｌ
サンプル体積 ３μｌ
免疫粒子体積 ４０μｌ
水体積 ２０μｌ
一次波長 ５４６ｎｍ
二次波長 ７００ｎｍ
較正液希釈度 ０．０５５，０．１２５，０．２５０，０．４３２，０．６６７，１．０００
Ｌｏｇｉｔ Ｌｏｇ（４Ｐ）
【０１７２】
ｂ）試薬
アッセイバッファー：ポリエチレングリコール（Ｓｉｇｍａ）２２ｇ／ｌ，Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）３ｇ／ｌ，ＭＯＰＳ（Ｓｉｇｍａ）９．４ｇ／ｌ，アジ化ナトリウム２．７ｇ／ｌ，塩化ナトリウム２７ｇ／ｌ，ｐH＝７．２
較正液:Ｄａｄｅ ＢｅｈｒｉｎｇのＰｒｏＳｐｅｃネフエロメーター上でネフエロメトリー法を使用して参照ラボラトリーによって決定された、ヒトシスタチンＣ７．７０ｍｇ／ｌを含んでいる血清
免疫粒子：上の合成実施例２に従って製造された抗シスタチンＣ免疫粒子。粒子は０．２５％Ｔｗｅｅｎ２０および１ｇ／ｌアルブミン添加１０ｍＭホウ酸塩バッファー、１０ｍＭグリシン、１５ｍＭ
ＮａＣｌ中のサスペンジョン（粒子２．２６ｍｇ／ｍｌ）として使用された。
【０１７３】
ｃ）サンプル
血清１：トリグリセライド濃度２０ｍｍｏｌ／ｌ以上のヒト血清プール
血清２：トリグリセライド濃度１０ｍｍｏｌ／ｌ以下のヒト血清プール
これら２種の血清サンプルが望むトリグリセライド濃度のサンプルを調製するために使用された。
【０１７４】
ｄ）使用される２種類の血清プール中のシスタチンＣ濃度の決定
使用される２種類の血清プールのシスタチンＣ濃度は１０反復数において測定された。
【０１７５】
前記血清プールのシスタチンＣ値に平均値が与えられた。
【０１７６】
１ｍｇ／ｌ以上の値における±５％妨害限界およびシスタチン１ｍｇ以下における±７．５％の妨害限界がトリグリセライドから許容される最大妨害のために選ばれた。
【０１７７】
ＮＣＣＬＳガイドラインに従って、９５％信頼性レベル（α＝０．０５）および９５％パワー（β＝０．０５）をもって２側面のこの実験を実施するのに必要な反復回数ｎ：
【数１】
ここでＳは血清プールの作業精度（ｍｇシスタチンＣ／ｌにおいて）内にある。
【０１７８】
ＮＣＣＬＳガイドラインに従った最小反復回数の計算：
【数２】
結果は反復回数３が充分であることを示した。
【０１７９】
ｅ）トリグリセライドをスパイクした血清の調製
約２０ｍｍｏｌ／ｌのトリグリセライドを有する血清を調節した（血清プールＡ）。独立のサービス研究所がトリグリセライド含量を決定した。血清のこの部分の半分が、Ｓｃｉｐａｃ
Ｌｔｄ．ＵＫからの精製シスタチンＣでスパイクされ、３ｍｇ／ｌ以上のシスタチン値を生じた（血清プールＢ）。
【０１８０】
血清プールＡおよびＢの半分がＢｅｃｋｍａｎ ＴＬ−１００ウルトラ遠心機中で５０，０００ｒｐｍにおいて３０分間超遠心処理された。サンプルの透明部分が対照プールとして使用され、そして体積が除去された脂質の体積について補正された（それぞれ血清プールＣおよびＤと命名）。
【０１８１】
ｆ）分析作業
基本プール混合物および対照プール混合物Ａ，Ｂ，ＣおよびＤ各自の３部分標本が調製された。
指示書に従った機器の較正および基本プール混合物と対照プール混合物と対照プール混合物の分析は交番する順序で実施された。
もし妨害が観察されたならば、０％および１００％プールの５０％中間プールが調製された。中間プールと０％プールから２５％プールが調製された。中間プールと１００％プールから７５％が各プールの等量を混合することによって調製された。
新しい較正を行ったランダム順序のすべてのｎ反復が測定された。
０％プールのための平均濃度が計算され、そしてすべての他の結果から差し引かれた。
【０１８２】
ｇ）データ解析の正味の結果
ｇ１）高シスタチンＣ値サンプル
結論：
０．１６ｍｇ／ｌの許容し得る偏差限界は信頼性インターバルより上であるので、我々は１８ｍｍｏｌ／ｌのＴＧ濃度は約３ｍｇ／ｌのシスタチンＣレベルにおいてシスタチンＣイムノアッセイを妨害しないと結論することができる。
【０１８３】
ｇ２）低シスタチンＣ値サンプル
結論：
０．０６５ｍｇ／ｌの許容し得る偏差限界は信頼性インターバルより上であるので、我々は１８ｍｍｏｌ／ｌのＴＧ濃度は約１ｍｇ／ｌのシスタチンＣレベルにおいてシスタチンＣイムノアッセイを妨害しないと結論することができる。
特定したテスト条件に従えば、１８ｍｍｏｌ／ｌ以下の濃度のＴＧは本発明のシスタチンＣイムノアッセイを妨害しないことが観察された。
それ故、本発明はシスタチンＣ３，２および０．８３ｍｇ／ｌのレベルにおいて測定したシスタチンＣの値に５％またはそれ以下のトリグリセライド１５ｍｍｏｌ／ｌからの妨害を持つことを特徴とするシスタチンＣの比濁イムノアッセイ方法を提供すると結論することができる。
【０１８４】
アッセイ実施例３：先行技術アッセイに対するＴＧによる妨害の決定
日立９１７機器および先行技術試薬（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いる対応する研究が実施された。
【０１８５】
ａ）試薬
免疫粒子： ＬＸ００２／ＥＦＧ／ＣＳ／２５．１０．０４
較正液： Ｘ０９７４／ＥＦＧ／ＳＵＭ／０９．０９，０４
対照セット： Ｘ０９７３／ＥＦＧ／ＳＵＭ／０９．０９，０４
反応バッファー９： Ｓ２３６１／ＥＦＧ／ＫＧＲ／０９．０７．０３
【０１８６】
ｂ）結果：
ｂ１）高シスタチンＣサンプル、先行技術試薬
結論：
０．１４ｍｇ／ｌの許容し得る偏差限界は信頼性インターバルより上であるので、１８ｍｍｏｌ／ｌのＴＧ濃度は約３ｍｇ／ｌのシスタチンＣレベルにおいてＤａｋｏシスタチンＣイムノアッセイを妨害すると結論できる。
【０１８７】
ｂ２）低シスタチンサンプルＣサンプル、先行技術試薬
結論：
０．０４７ｍｇ／ｌの許容し得る偏差限界は信頼性インターバルより上であるので、１８ｍｍｏｌ／ｌのＴＧ濃度は１ｍｇ／ｌ以下のシスタチンＣレベルにおいてＤａｋｏシスタチンＣイムノアッセイを妨害しないと結論できる。
【０１８８】
上の表から、本発明方法はトリグリセライドからの妨害に対して一層頑丈であると結論できる。
【０１８９】
アッセイ実施例４：本発明方法を用いて直線性の検討：
この検討はＮＣＣＬＳプロトコールＥＰ６−Ａ，ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１６に従って実施された。
この実験において、本発明のシスタチンＣイムノアッセイの直線性が検討された。これは３種の異なるスパイクした高血清サンプルを０から１００％まで低濃度血清サンプルで希釈することによってなされた。希釈シリーズの結果をプロットし、そしてプロットを一次、二次および三次回帰分析によって検討することにより、我々は本発明のシスタチンＣイムノアッセイ方法は与えられた基準に従って直線であると結論した。基準はプロットパラメータをスチューデントｔ−テストによって審査しそして比較し、測定ポイント（希釈係数に対してプロットした）が一次多項式よりも良く二次または三次多項式にフィットするかどうかを見ることであった。もしｔ−テストが失敗すれば、我々は一次多項式と高次多項式の間の６％の差を各レベルにおける測定平均値に関して（エンドポイントを除く。この区域におけるシスタチン濃度のサンプルは全くまたはまれにしか測定されないため）最小カイ２乗値をもって許容した。これらの基準に従って、本発明のシスタチンＣイムノアッセイ方法は日立９１１測定システムにおいて直線である。
【０１９０】
ａ）機器：
日立９１１機器が使用された。
【０１９１】
ｂ）試薬：
上に記載したアッセイバッファーとシスタチンＣ較正液と抗シスタチンＣ免疫粒子が使用された。
【０１９２】
ｃ）サンプル：
すべてのサンプルがシスタチンＣ値６ｍｇ／ｌ以上を持つ３人の異なる患者からのサンプルＡ，ＢおよびＣであった。
０．８ｍｇ／ｌ以下の低いシスタチンＣ濃度を有する患者血清サンプルＤは、高血清の希釈剤として使用された。
サンプルＡについて表に記載された血清サンプルＡ，ＢおよびCの希釈シリーズ：
もとの濃度１００％から０％まで低サンプルＤで各サンプルＡ，ＢおよびＣを１０回希釈せよ。ここで１００％は純粋な高濃度血清（Ａ１００，Ｂ１００およびＣ１００）であり、そして０％は純粋な低濃度血清（Ｄ１００）が調製された。
【０１９３】
【表１】
【０１９４】
サンプルＢおよびサンプルＣに対しても上の表と同じ希釈液が調製された。
標準曲線を確立するため日立９１１の較正が以下のアッセイパラメータを使用して実施された。
アッセイ体積： ２３０μｌ
サンプル体積： ３μｌ
免疫粒子体積： ４０μｌ
水体積： １０μｌ
【０１９５】
希釈したサンプルの各自は３回反復で測定され、各サンプルＡ，ＢおよびＣについての結果が記録された。
【０１９６】
ｄ）結果：
ｄ１）回帰分析
【表１−２】
【０１９７】
【表２】
【０１９８】
【表３】
【０１９９】
測定された平均値対希釈係数のプロットが図１，２および３に示されている。
【０２００】
ｄ２）スチューデントｔ−テスト
高次回帰パラメータがデータにフィットするかどうかをチェックするためスチューデントｔ−テストが実施された。結果は表４に示されている。
【０２０１】
【表４】
【０２０２】
血清１：
表４から、血清１からのデータセットは、計算したｔ−値が作表したｔ−値より小さいので二次多項式にフィットしないと結論することができる。
【０２０３】
表４から、このデータセットは高次多項式にフィットし得ると結論され、そして一次多項式と高次多項式の間の最低カイ２乗値を持つ差が８％以上かどうかをチェックする必要がある。三次多項式は最小のカイ２乗値を持っている。
【０２０４】
ＤＬ＝Ｐ（ｘ）−Ｌ（ｘ）
【０２０５】
ここでＰ（ｘ）は多項式であり、Ｌ（ｘ）は直線方程式である。
【０２０６】
【表５】
【０２０７】
血清１に対するＤＬ（％）プロットが図４に示されている。
【０２０８】
血清２：
表４から、血清２からデータセットは、計算したｔ値が作表したｔ値より小さいので二次多項式にフィットしないと結論できる。
【０２０９】
これから血清２からのデータベースは、計算したｔ値が作表したｔ値よりも小さくそして希釈シリーズは直線と考えられるので、三次多項式にフィットしないと結論できる。
【０２１０】
血清３：
表４から、血清３からデータセットは、計算したｔ値が作表したｔ値より小さいので二次多項式にフィットしないと結論できる。
【０２１１】
これから血清２からのデータベースは、計算したｔ値が作表したｔ値よりも小さいので二次多項式にフィットしないと結論できる。
【０２１２】
表４から、このデータセットは高次多項式にフィットし得ると結論され、そして一次多項式と高次多項式の間の最カイ２乗値を持った差が５％（ＤＬ）以上かどうかをチェックする必要がある。三次多項式は最低のカイ２乗値を持っている。
【０２１３】
ＤＬ＝Ｐ（ｘ）−Ｌ（ｘ）
【０２１４】
ここでＰ（ｘ）は多項式であり、Ｌ（ｘ）は直線式である。
【０２１５】
【表６】
【０２１６】
血清３に対するＤＬ（％）プロットが図５に示されている。
【０２１７】
上の計算および直線へセットされたスペックから、我々は本発明のシスタチンＣイムノアッセイは約０．６−８．５ｍｇ／ｌのテストした範囲において直線的であることを見出す。
【０２１８】
参照インターバルはこの範囲にカバーされ、そして８ｍｇ／ｌ以上のシスタチンＣ濃度はなお測定しなければならないので、この直線範囲が本発明のヒスタチンＣイムノアッセイのすべての臨床目的のために充分である。
【０２１９】
この研究から、本発明に従ったシスタチンＣの比濁イムノアッセイ方法は、シスタチンＣ １．３２ないし７．５ｍｇ／ｌの測定範囲において４％以下の直線性からの偏差を持ち、シスタチンＣ
０．７５ｍｇ／ｌの測定範囲において１５％以下の直線性からの偏差を持っていることを特徴としていると結論することができる。
【０２２０】
アッセイ実施例５：本発明に従った方法の直線性検討：
この検討はＮＣＣＬＳプロトコールＥＰ６−Ａ，ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１６に従って実施された。
【０２２１】
この実験において、本発明のシスタチンＣイムノアッセイの直線性が検討された。これはスパイクした高血清サンプルを低濃度血清サンプルで０から１００％まで希釈することによってなされた。希釈シリーズの結果をプロットし、そしてプロットを一次、二次および三次回帰分析によって検討することにより、我々は本発明のシスタチンＣイムノアッセイ方法は与えられた基準に従って直線であると結論した。基準はプロットパラメータをスチューデンドｔ−テストによって審査しそして比較し、測定ポイント（希釈係数に対してプロットした）が一次多項式と高次多項式の間の６％の差を各レベルにおける測定平均値に関して（エンドポイントを除く。この区域におけるシスタチンＣ濃度のサンプルは全くまたはまれにしか測定されないため）最小カイ２乗値をもって許容した。これらの基準に従って本発明のシスタチンＣイムノアッセイ方法はＡｒｃｈｉｔｅｃｔ測定システムにおいて直線である。
【０２２２】
ａ）機器：
Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ ｃｉ８２００機器が使用された。
【０２２３】
ｂ）試薬：
上に記載したアッセイバッファーとシスタチンＣ較正液と抗シスタチンＣ免疫粒子が使用された。
ｃ）サンプル：
８ｍｇ／ｌ以上のシスタチンＣ値を有する一人の患者の血清サンプルＡ。０．８ｍｇ／ｌ以下の低いシスタチン濃度を有する患者の血清サンプルＤは、高血清の希釈剤として使用された。
【０２２４】
表７に記載した血清サンプルの希釈シリーズ：
低サンプルＤで元の濃度を１００％から０％まで１０回希釈せよ。ここで１００％は純粋な高濃度血清（Ａ１００）であり、０％は純粋な低濃度血清（Ｄ１００）である。
【０２２５】
【表７】
【０２２６】
標準曲線を確立するため、日立９１１の較正が以下のアッセイパラメータを使用して実施された。
【０２２７】
アッセイ体積： ２２０ｍｌ
サンプル体積： ３ｍｌ
免疫粒子体積： ４５ｍｌ
【０２２８】
希釈したサンプルの各自は３回反復して測定され、サンプルＡについての結果が記録された。
【０２２９】
ｄ）結果
ｄ１）回帰分析
表８：生データ血清Ａ
【表８】
【０２３０】
回帰分析した血清Ａの測定平均値対希釈係数図６，７および８に示されている。
【０２３１】
ｄ２）スチューデントｔ−テスト
表９：スチューデントｔ−テスト
【表９】
【０２３２】
血清Ａ：
表９から、血清Ａからのデータセットは、計算したｔ−値が作表したｔ−値より小さいので二次多項式にフィットしたいと結論することができる。
【０２３３】
表９から、このデータセットは高次多項式にフッィトし得ると結論され、そして一次多項式と高次多項式の間の最低カイ２乗値を持つ差が６％以上かどうかをチェックする必要がある。三次多項式は最小のカイ２乗値を持っている。
【０２３４】
ＤＬ＝Ｐ（ｘ）−Ｌ（ｘ）
【０２３５】
ここでＰ（ｘ）は多項式であり、Ｌ（ｘ）は直線方程式である。
【０２３６】
表１０：ＤＬ（％）計算
【表１０】
【０２３７】
上の計算および直線性への明細書セットから、本発明のシスタチンＣイムノアッセイは約０．６−８．８ｍｇ／ｌの範囲において直線であることを見出した。
【０２３８】
参照間隔はこの範囲にカバーされ、そして８ｍｇ／ｌ以上のシスタチンＣ濃度はなお測定しなければならないので、記載した直線範囲は本発明のシスタチンＣイムノアッセイのすべての臨床目的に対して十分である。
【０２３９】
この研究から、本発明に従ったシスタチンＣのための比濁イムノアッセイ方法は、シスタチンＣの測定範囲１．３２ないし７．５ｍｇ／ｌにおいて４％以下の直線性からの偏差と、そしてシスタチンＣの測定範囲０．７５ないし７．５ｍｇ／ｌにおいて１５％以下の直線性からの偏差を有することによって特徴化されると結論することができる。
【０２４０】
アッセイ実施例６：先行技術比濁アッセイについての直線性検討
ａ）分析
アッセイ実施例４に相当する検討が、Ｊ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１０ Ｆｅｂ．２００４のＣａｍｉｌｌａ Ｓｃｈｍｉｄｔによる“Ｃｙｓｔａｔｉｎ Ｃ Ｔｈｅ ｍａｋｅｒ ｏｆ ｃｈｏｉｃｅ ｆｏｒ ｒｅｎａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔｉｎｇ”の論文、および前記論文で言及しているＤａｋｏ製品の包装挿入文書に従って実施され、以下の結果が得られた。
【０２４１】
ｂ）結果
ｂ１）回帰分析
回帰分析したすべての血清Ａ，ＢおよびＣについて測定した平均値対希釈係数のプロットが図１０，１１および１２に示されている。
【０２４２】
ｂ２）スチューデントｔ−テスト
高次回帰パラメータがデータにフィットするかをチェックするためスチューデントｔ−テストが実施された。対応する値が表１１に要約されている。
【０２４３】
表１１：スチューデントｔ−テスト値
【表１１】
【０２４４】
血清１：
データセットは高次多項式にフィットし得るので、一次多項式と高次多項式の間の最低カイ２乗値を持った差が６％（ＤＬ）以上であるかをチェックすることが必要である。三次多項式が最小カイ２乗値を有する。差（ＤＬ）は次表のとおりである。
【０２４５】
表１２：ＤＬ（％）計算
【表１２】
【０２４６】
血清１に対するプロットは表１３に示されている。
【０２４７】
血清２：
データセットは高次多項式にフィットし得るので、一次多項式と高多項式の間の最低カイ２乗値を持った差が６％（ＤＬ）以上であるかをチェックすることが必要である。三次多項式が最小カイ２乗値を有する。差（ＤＬ）は次表のとおりである。
【０２４８】
表１３：ＤＬ（％）計算
【表１３】
【０２４９】
血清２に対するＤＬ（％）は図１４に示されている。
【０２５０】
血清３：
これはデータセットが高次多項式にフィットすることができ、そして一次多項式と高次多項式の間の最低カイ２乗値を持った差が６％（ＤＬ）以上であるかをチェックする必要があることを意味する。
差は次の表のとおりである。
【０２５１】
表１４：ＤＬ（％）計算
【表１４】
【０２５２】
血清３に対するＤＬ（％）プロットが図１５に示されている。
【０２５３】
我々は、ＤａｋｏシスタチンＣイムノアッセイによって例示される先行技術比濁イムノアッセイは参照範囲の低い部分において満足に直線的でないと結論する。
【０２５４】
アッセイ実施例７：比ろう参照法に対する本発明の比濁アッセイの相関関係
Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎウエブサイト、２００５年春からダウンロードすることができ、Ｃ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｃ．ＫｊｏｌｌｅｒおよびＫ．Ｇｏｎｎｋｊａによる発表“Ｎｅｗ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｒｂｉｍｅｔｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ
ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｃｙｓｔａｔｉｎ Ｃ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ”を参照する。Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇからの比ろう参照法との相関性研究において、彼等は＋０．２１４のインターセプトおよび０．６９５４の相関曲線の増分／スロープを見出している。
【０２５５】
本発明により、前述した理由のため、参照方法に対してもっと良好な相関性を有する方法が提供される。
【０２５６】
ａ）アッセイ条件：
この実験において、上のようにセッティングした日立９１７機器によって本発明のシスタチンＣイムノアッセイがＵｐｐｓａｌａ，ＳｗｅｄｅｎのＡｋａｄｅｍｉｓｋａ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＨｏｓｐｉｔａｌにおけるＢＮ ＰｒｏＳｐｅｃ上のＤａｄｅ ＢｅｈｒｉｎｇシスタチンＣ方法と比較された。比較は同じ５１血清サンプルを両方法で２回反復（一つの較正液で１日）で測定し、それらをバイアス分析および回帰分析で比較することによって行われた。加えて、Ｄａｄｅ
Ｂｅｈｒｉｎｇの医学的決定ポイントとも称される上方信頼限界も決定された。実験デザインおよびデータ分析は、ＮＣＣＬＳプロトコールＥＰ−２，ｖｏｌ．２２．Ｎｏ．１９中の推奨に従った。
【０２５７】
ｂ）結果：
図１６，１７および１８が結果を示している。これらの図は、本発明方法は驚くほど比ろう参照法から有意差のない結果をもたらす非常に良好な正確度を持ったシスタチンＣ測定を提供することを示している。５０個のテストサンプルのこの研究において、二方法の間には有意なバイアスは存在しなかった。全部で、−０．０２３ないし＋０．０６５８の信頼幅を持った０．０２３のバイアスがあり、要するにゼロからの有意差のあるバイアスはなかった。
【０２５８】
Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇシスタチンイムノアッセイは０．９５ｍｇ／ｌの医学的決定ポイントを有する。直線回帰分析を用い、我々は、Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ方法でのサンプル測定０．９５ｍｇ／ｌは、本発明に従ったシスタチンイムノアッセイの０．８３〜０．８９ｍｇ／ｌを測定するであろうことを見出した。血漿法比較分析は、０．１０４ｍｇ／ｌのインターセプトをもって０．９６８の相関曲線のスロープを生じた。これは血漿分析のスロープおよびインターセプトは、血清分析スロープおよびインターセプトの信頼幅以内に入ることを意味する。
【０２５９】
このことは、本発明方法は、以前の最良先行技術方法と比較して、比ろう参照方法ともっと良い相関関係をもたらすことを証明する。
【０２６０】
上で述べた発表“Ｎｅｗ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ
ｔｕｒｂｉｍｅｔｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｃｙｓｔａｔｉｎ Ｃ ｉｎ ｓｅｒｕｍ
ａｎｄ ｐｌａｓｍａ”は、比濁シスタチンＣ測定は糸球体濾過速度の推定のため使用できることを証明する。このことは、Ｇｒｕｂｂ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５１：８，１４２０−１４３１中の“Ｓｉｍｐｌｅ Ｃｙｓｔａｔｉｎ
Ｃ−ｂａｓｅｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｅｑｕａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ Ｆｉｌｔｏａｔｉｏｎ Ｒｅｔｅ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｄｉｅｔ ｉｎ Ｒｅｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｅｄｉｃｉｔｏｎ Ｅｑｕａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｄｕｌｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ ｔｈｅ
Ｃｏｕｎａｎｈａｎ−Ｂａｒｒｅｔｔ Ｐｒｅｄｉｃｉｔｏｎ Ｅｑｕａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ”の発表でも示された。比ろう参照方法を使用する同様な発表は、“Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｍｌ／ｍｉｎ
ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍａ Ｃｙｓｔａｔｉｃ Ｃ ｖａｌｅｓ ｉｎ ｍｇ／ｌ”ｂｙ Ａ．Ｌａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ
Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００４：６４，２５−３０である。比ろう法とより良い相関性を有する本発明の方法は、勿論先行技術比濁測定法よりもこの目的のためによく研究されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト体液サンプル中のヒトシスタチンＣを評価するための比濁イムノアッセイ方法であって、
ａ）前記サンプルをナノ粒子抗体接合体と接触させることによってアッセイ混合物を調製し、そして
ｂ）前記混合物の混濁度の変化を測定することによってサンプル中のヒトシスタチンＣ含量を評価することを含み；
ここで、前記ナノ粒子抗体接合体は、有機ポリマー材料からつくられた混濁度測定に適したナノ粒子のコアを、特異的にヒトシスタチンＣを結合する抗ヒトシスタチンＣ抗体またはその抗原結合性フラグメントを含むタンパク性材料のシェルで被覆してなり；
前記被覆したナノ粒子は５８ｎｍから２００ｎｍまでの範囲のメディアン直径を有し；そして
前記ナノ粒子抗体接合体は、その全重量の５ないし３５％のヒトシスタチンＣへ特異的に結合する抗体によって被覆されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記抗体は、ヒトシスタチンＣに対するポリクローナル非ヒト、非げつ歯類抗体である請求項１の方法。
【請求項３】
前記ポリクローナル抗体は、ヒトシスタチンＣに対する鳥類抗体である請求項２の方法。
【請求項４】
前記ポリクローナル抗体またはそのフラグメントの少なくとも２５ｗｔ％はヒトシスタチンＣによるアフィニティ精製によって得られる請求項２または３の方法。
【請求項５】
前記抗体は、（ａ）ヒトシスタチンＣの単一エピトープへ結合するモノクローナル抗体か、または（ｂ）モノクローナル抗体の２以上の種を含み、モノクローナル抗体の各種はヒトシスタチンＣの異なるエピトープへ結合するか、または２以上の種が異なる強度で同じエピトープへ結合する請求項１の方法。
【請求項６】
モノクローナル抗体は非ヒト起源である請求項５の方法。
【請求項７】
被覆されたナノ粒子は、５８ｎｍ以上の平均直径を持っている請求項１ないし６のいずれかの方法。
【請求項８】
被覆されたナノ粒子は、８０ないし１０５ｎｍの範囲の平均直径を持っている請求項７の方法。
【請求項９】
被覆されたナノ粒子は、抗ヒトシスタチンＣ抗体と少なくとも１種の不活性タンパクとの混合物で被覆されている請求項１ないし８のいずれかの方法。
【請求項１０】
ナノ粒子は、本質的にポリスチレン、ポリ塩化ビニル、エポキシ樹脂、ポリ塩化ビニリデン、ポリα−ナフチルメタクリレート、ポリビニルナフタレン、および対応するそれらの共重合体でできている請求項１ないし９のいずれかの方法。
【請求項１１】
混濁度変化は、５００ないし６００ｎｍの範囲の波長および１０ないし５０℃の範囲の温度において前記アッセイ混合物の吸光度変化を通じて測定される請求項１ないし１０のいずれかの方法。
【請求項１】
ヒト体液サンプル中のヒトシスタチンＣを評価するための比濁イムノアッセイ方法であって、
ａ）前記サンプルをナノ粒子抗体接合体と接触させることによってアッセイ混合物を調製し、そして
ｂ）前記混合物の混濁度の変化を測定することによってサンプル中のヒトシスタチンＣ含量を評価することを含み；
ここで、前記ナノ粒子抗体接合体は、有機ポリマー材料からつくられた混濁度測定に適したナノ粒子のコアを、特異的にヒトシスタチンＣを結合する抗ヒトシスタチンＣ抗体またはその抗原結合性フラグメントを含むタンパク性材料のシェルで被覆してなり；
前記被覆したナノ粒子は５８ｎｍから２００ｎｍまでの範囲のメディアン直径を有し；そして
前記ナノ粒子抗体接合体は、その全重量の５ないし３５％のヒトシスタチンＣへ特異的に結合する抗体によって被覆されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記抗体は、ヒトシスタチンＣに対するポリクローナル非ヒト、非げつ歯類抗体である請求項１の方法。
【請求項３】
前記ポリクローナル抗体は、ヒトシスタチンＣに対する鳥類抗体である請求項２の方法。
【請求項４】
前記ポリクローナル抗体またはそのフラグメントの少なくとも２５ｗｔ％はヒトシスタチンＣによるアフィニティ精製によって得られる請求項２または３の方法。
【請求項５】
前記抗体は、（ａ）ヒトシスタチンＣの単一エピトープへ結合するモノクローナル抗体か、または（ｂ）モノクローナル抗体の２以上の種を含み、モノクローナル抗体の各種はヒトシスタチンＣの異なるエピトープへ結合するか、または２以上の種が異なる強度で同じエピトープへ結合する請求項１の方法。
【請求項６】
モノクローナル抗体は非ヒト起源である請求項５の方法。
【請求項７】
被覆されたナノ粒子は、５８ｎｍ以上の平均直径を持っている請求項１ないし６のいずれかの方法。
【請求項８】
被覆されたナノ粒子は、８０ないし１０５ｎｍの範囲の平均直径を持っている請求項７の方法。
【請求項９】
被覆されたナノ粒子は、抗ヒトシスタチンＣ抗体と少なくとも１種の不活性タンパクとの混合物で被覆されている請求項１ないし８のいずれかの方法。
【請求項１０】
ナノ粒子は、本質的にポリスチレン、ポリ塩化ビニル、エポキシ樹脂、ポリ塩化ビニリデン、ポリα−ナフチルメタクリレート、ポリビニルナフタレン、および対応するそれらの共重合体でできている請求項１ないし９のいずれかの方法。
【請求項１１】
混濁度変化は、５００ないし６００ｎｍの範囲の波長および１０ないし５０℃の範囲の温度において前記アッセイ混合物の吸光度変化を通じて測定される請求項１ないし１０のいずれかの方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２０１３−７７５７（Ｐ２０１３−７７５７Ａ）
【公開日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１９５３６２（Ｐ２０１２−１９５３６２）
【出願日】平成２４年９月５日（２０１２．９．５）
【分割の表示】特願２００８−５４１８４９（Ｐ２００８−５４１８４９）の分割
【原出願日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【出願人】（５０８１５４８５２）
【公開日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年９月５日（２０１２．９．５）
【分割の表示】特願２００８−５４１８４９（Ｐ２００８−５４１８４９）の分割
【原出願日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【出願人】（５０８１５４８５２）
[ Back to top ]