ヒトマッカード−ジョセフ病関連蛋白質、その蛋白質をコードするｃＤＮＡおよび遺伝子、そのＤＮＡまたは遺伝子を含むベクター、その発現ベクターで形質転換された宿主細胞、マッカード−ジョセフ病の診断方法および治療剤
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトマッカード−ジョセフ病関連蛋白質、その蛋白質をコードするｃＤＮＡおよび遺伝子、そのＤＮＡまたは遺伝子を含むベクター、その発現ベクターで形質転換された宿主細胞、マッカード−ジョセフ病の診断方法および治療剤に関する。
【０００２】
【発明の背景】原因不明の神経変性疾患のひとつにマッカード−ジョセフ病（Machado-JosephDisease、以下ＭＪＤと略記する。）がある。最初、いくつかの国の臨床医により別々の病名で呼ばれていたが、1976年、主に同一の遺伝子異常に基づく臨床亜型であることが証明された。後になって、この遺伝子異常は常染色体の優性遺伝の形式をとることが判明した。わが国でも1983年に初めてＭＪＤが報告され、それ以降、報告は年々増加している。
【０００３】ＭＪＤは、発病年齢が１０才前後から５０才前後と幅広く、初発症状としては運動失調による歩行障害を示すものが多く、次第に、平衡障害、協調運動障害、構音障害、眼振、眼球運動障害、筋萎縮などの症状が現われ、発病後約１０年を経過した晩期には、自律神経障害、神経知能障害などの症状が現われ、これが元で最終的には自殺などにより死に至る場合が多い。本症は世代が進むにつれて発病年齢が若くなる傾向がみられる。
【０００４】
【従来の技術】最近、ＭＪＤが一つの変異遺伝子に基づく疾患であると考えられるようになり、ＭＪＤの遺伝子座に関して盛んに研究されている。1993年、ツジらのグループは、連鎖の分析よりＭＪＤ遺伝子はヒト染色体１４ｑ24.3−32.1にマップされていることを突き止めた（Nature Genetics, 4, 300 (1993)参照のこと）。しかしながら、ＭＪＤ遺伝子の同定には至っていない。
【０００５】
【発明の目的】本発明者らは、ＭＪＤ遺伝子を同定するために鋭意検討を重ねた。すなわち、ＭＪＤと同様に常染色体優性遺伝の形式をとる神経変性疾患であるハンチントン舞踏病、ケネデイー病、ＳＣＡ１に着目した。最近、これらの関連遺伝子が相次いで同定され、患者の遺伝子では、塩基配列「ＣＡＧ」の繰り返し数が正常人に比べ異常に多いことが判明した。また、興味深いことに、患者間での比較において、「ＣＡＧ」の繰り返し数が多いほど発症年齢が下がり、臨床的重症度が増すということが明らかになった。ＭＪＤは、これらの遺伝性神経変性疾患と同様な遺伝形式および臨床経過をとることから、ＭＪＤでも関連遺伝子内での「ＣＡＧ」リピートの異常な増幅によって発病しているのではないかと想定し、独自の方法で検討を重ねた。
【０００６】本発明者らは、まず、ＣＡＧリピートに相補的であるＣＴＧリピートを有するプローブを用いて、正常人の脳皮質より調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした結果、明確なＣＡＧリピート構造を有し、３５９アミノ酸をコードするｃＤＮＡクローン（ＣＡＧ−２７）を得た。
【０００７】そこで、ＣＡＧ−２７の断片をプローブとして、ヒトジェノミックライブラリーのスクリーニングを行った結果、陽性クローンを得、さらにこれらのクローンはヒト染色体の１４ｑ.32.1 にマップされていることが判明した。これによってＣＡＧ−２７がまさしくＭＪＤ関連遺伝子である可能性が高まった。ＣＡＧ−２７の断片を用いて、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーを再度スクリーニングしたところ、新たに２種類のクローンが得られた。それらを比較したところ、ＣＡＧリピートの直前にスプライシングサイトが存在することが分かった。そこでＣＡＧリピートより３′側のＤＮＡ断片をプローブとしてヒトジェノミックライブラリーを再度スクリーニングした結果、陽性クローンよりＣＡＧリピートの直前のイントロンの構造が判明した。
【０００８】最後にイントロンの３′側とＣＡＧリピートの３′側をコードするプライマーを用いてＰＣＲ（ Polymerase chain reaction）を行ったところ成功し、ＰＣＲ生成物のアガロース電気泳動の結果より、正常人では１３から３６回のＣＡＧリピート部分を有していたのに対し、ＭＪＤ患者ではいずれも７０回前後のリピートが認められた。ここに、本発明者らはＭＪＤ関連蛋白質、およびその蛋白質をコードする遺伝子を見出して、本発明を完成するに至った。さらに、ＭＪＤ関連遺伝子の一部をＰＣＲプライマーとするＭＪＤの診断方法をも確立した。
【０００９】スイスプロット（Swiss Prot Release 2.0）に登録されている既知のポリペプチドのアミノ酸配列を調査したが、本発明のポリペプチドと同一の配列を有しているものはまったく無かった。さらに、ジーンバンク（GenBank Release 70.0）に登録されているヌクレオチド配列も調査したが、本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡと同一の配列は見つからなかった。従って、本発明のポリペプチドはまったく新規なものであることが確認された。
【００１０】
【発明の開示】本発明は、（１）ＭＪＤ関連蛋白質、（２）その蛋白質をコードするｃＤＮＡ、（３）その蛋白質をコードする遺伝子、（４）上記（２）で示されるｃＤＮＡまたは上記（３）で示される遺伝子を含む複製または発現ベクター、（５）上記（４）で示される発現ベクターで形質転換された宿主細胞、（６）上記（３）で示される遺伝子を用いることを特徴とするＭＪＤの診断方法、および（７）上記（４）で示されるベクターを有効成分として含有するＭＪＤ治療剤、に関する。
【００１１】以下、具体的に説明する。
（１）ＭＪＤ関連蛋白質には、実質的に純粋な形である、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＬｙｓ部が（Ｇｌｎ）ｎ（式中、ｎは１５０以下の整数を表わし、（Ｇｌｎ）ｎはその配列の途中に少なくともひとつのＬｙｓを含んでいてもよい。）を介して配列番号２で示されるアミノ酸配列のＡｒｇ部と結合したアミノ酸配列（以下、アミノ酸配列Ａという。）を含むポリペプチド、そのホモローグ、その配列のフラグメント、およびそのホモローグが含まれる。
【００１２】「実質的に純粋な形である」アミノ酸配列Ａを含むポリペプチドとは、一般に、生産時のポリペプチドの９０％以上、例えば、９５、９８または９９％がアミノ酸配列Ａで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを意味する。
【００１３】「アミノ酸配列Ａを含むポリペプチド」とは、アミノ酸配列Ａからなるポリペプチドだけでなく、そのポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に、アミノ酸配列Ａのアミノ酸数の２０％、より好ましくは５％以内の別個のポリペプチドを付加したポリペプチドを意味する。
【００１４】アミノ酸配列Ａを含むポリペプチドのホモローグとは、一般に少なくとも１００個、好ましくは少なくとも１５０個、例えば２００、２５０または３００個の連続したアミノ酸領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性のあるものであり、そのようなホモローグは、以下本発明のポリペプチドとして記載される。
【００１５】さらに、アミノ酸配列Ａを含むポリペプチドのフラグメント、またはそれらのホモローグのフラグメントとは、アミノ酸配列Ａを含むポリペプチドまたはそれらのホモローグのうち、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、例えば２０、２５、３０、４０、５０または６０アミノ酸部分を意味する。
【００１６】アミノ酸配列Ａを含むポリペプチドのホモローグ、その配列のフラグメント、およびそのホモローグを別の観点から説明すると、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＬｙｓ部が（Ｇｌｎ）ｎ（式中、ｎは１５０以下の整数を表わし、（Ｇｌｎ）ｎはその配列の途中に少なくともひとつのＬｙｓを含んでいてもよい。）を介して配列番号２で示されるアミノ酸配列のＡｒｇ部と結合しているアミノ酸配列Ａを有するもの以外に、そのアミノ酸配列の一部が欠損したもの（例えば、蛋白全長中、生物活性の発現に必須な部分だけからなるポリペプチド）、その一部が他のアミノ酸と置換したもの（例えば、物性の類似したアミノ酸に置換したもの）、およびその一部に他のアミノ酸が付加または挿入されたものも含まれる。
【００１７】ＣＡＧリピートには、「ＣＡＧ」そのもの、および「ＣＡＧ」の亜型である「ＣＡＡ」および「ＡＡＧ」も含めて数えることが合理的である。本発明によれば、ＣＡＧリピートは正常人で数回から３０回、ＭＪＤ患者で約７０回であることが判明している。また、疾患の重症度によっては１００を越えることも予測される。従って、アミノ酸配列Ａ中、Ｇｌｎリピート数、すなわちｎは１５０以下である。さらに（Ｇｌｎ）ｎは、その配列の途中に少なくともひとつ、例えば１から５個のＬｙｓ（すなわち、塩基配列「ＡＡＧ」に相当する）を含んでいてもよい。
【００１８】（２）ＭＪＤ関連蛋白質をコードするｃＤＮＡとは、（ｉ）前記アミノ酸配列Ａを含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、（ii）配列番号３で示される塩基配列のＡＡＡ部が（ＣＸＸ）ｍ（式中、ＣＸＸは、塩基配列「ＣＡＧ」、「ＣＡＡ」または「ＡＡＧ」を表わし、ｍは１５０以下の整数を表わす。ただし、「ＣＡＡ」および「ＡＡＧ」の数は各々０から５個である。）を介して配列番号４で示される塩基配列のＣＧＧ部と結合した塩基配列（以下、塩基配列Ｂという。）を有するｃＤＮＡ、(iii) 配列番号５で示される塩基配列のＡＡＡ部が（ＣＸＸ）ｍ（式中、ＣＸＸおよびｍは前記と同じ意味を表わす。）を介して配列番号６で示される塩基配列のＣＧＧ部と結合した塩基配列（以下、塩基配列Ｃという。）を有するｃＤＮＡ、および（iv）前記塩基配列ＢまたはＣで示される塩基配列に選択的にハイブリダイズする塩基配列を有するｃＤＮＡ、およびそれらのフラグメントが含まれる。
【００１９】塩基配列ＢまたはＣで示される塩基配列に選択的にハイブリダイズするｃＤＮＡとは、一般に、少なくとも３００個、好ましくは、少なくとも４５０個、例えば６００、７５０または９００個の連続した塩基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上の相同性のあるものであり、そのようなｃＤＮＡは、以後本発明のｃＤＮＡとして記載される。
【００２０】塩基配列ＢまたはＣで示される塩基配列を有するｃＤＮＡおよびその塩基配列に選択的にハイブリダイズする塩基配列を有するｃＤＮＡのフラグメントとは少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも４５塩基、例えば６０、７５、９０、１２０または１５０塩基部分を意味し、そのようなフラグメントも本発明のｃＤＮＡに含まれる。
【００２１】よく知られているように、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、メチオニン（Ｍｅｔ）は１種類、ロイシン（Ｌｅｕ）は６種類）知られている。従って、ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくｃＤＮＡの塩基配列を変えることができる。従って、（ｉ）で特定される本発明のｃＤＮＡには、それぞれ前記アミノ酸配列Ａで示されるポリペプチドをコードするすべての塩基配列群（但し、（Ｇｌｎ）ｎ部分は（ＣＸＸ）ｍによってコードされているものとする。）が含まれる。塩基配列を変えることによってポリペプチドの生産性が向上することがある。
（ii）で特定されるＤＮＡは、（ｉ）で示されるＤＮＡの一態様であり、(iii) に示されるＤＮＡは、（ii）で特定されるＤＮＡに天然の非翻訳部分を加えた配列を示す。
【００２２】ＣＡＧリピートは正常人で数回から３０回、ＭＪＤ患者で約７０回であることが判明している。従って、塩基配列ＢまたはＣで示される塩基配列中、ＣＡＧリピートの数、すなわち、ｍは１５０以下である。塩基配列Ｂ、Ｃおよび後記のＤで示される塩基配列中、「ＣＸＸ」は「ＣＡＧ」、「ＣＡＡ」または「ＡＡＧ」を表わすが、「ＣＡＡ」および「ＡＡＧ」の数は各々０から５個である。
【００２３】（３） ＭＪＤ関連遺伝子とは、ヒト遺伝子、１４ｑ24.3−32.1にマップされている少なくとも５つのエクソンからなる遺伝子のことである。本発明では、その全エクソンとイントロンの一部をシークエンスすることに成功した。より具体的には、配列番号７で示される塩基配列のＡＧＡ部が（ＣＸＸ）ｍ（式中、ＣＸＸおよびｍは前記と同じ意味を表わす。）を介して配列番号８で示される塩基配列（以下、塩基配列Ｄという。）を有する染色体ＤＮＡである。塩基配列Ｄには、ＣＡＧリピートを含むエクソン部分（本発明では第４エクソンと呼ぶことにする。）とその上流に位置するイントロン部分の塩基配列が明らかにされている。
【００２４】ＣＡＧリピートは正常人で数回から３０回、ＭＪＤ患者では約７０回であることがわかった。従って、塩基配列Ｄにおいて、ｍは１５０以下と定義される。ＣＡＧリピートの数は、発症年齢や臨床的重症度と密接な関係があることが予測される。従って、ＣＡＧリピートの数を調べることは、ＭＪＤの診断法の一つとして利用することができる。本発明のｃＤＮＡおよび遺伝子は、遺伝子組み換え法、合成法あるいは当業者に公知の方法によって取得することができる。
【００２５】塩基配列ＢまたはＣで示される塩基配列を有するｃＤＮＡ、または塩基配列Ｄで示される塩基配列を有する遺伝子は、以下の方法に従って調製される。すなわち、（ｉ）ＣＡＧリピートまたはそれに相補的なＣＴＧリピートを有するプローブを調製し、（ii）（ｉ）で調製したプローブを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、(iii) （ii）で得られた陽性クローンをプローブとして、ヒトジェノミックライブラリーをスクリーニングし、（iv） 得られた陽性クローンを遺伝子マッピングし、（ｖ）１４ｑ24.3−32.1にマッピングされているものを検索することによって行なわれる。
【００２６】各ステップの詳細な方法は、後記の実施例に記載した方法に従って行なわれる。 塩基配列Ｂ、ＣまたはＤで示される塩基配列が一旦確定されると、その後は、化学合成によって、またはＰＣＲ法によって、あるいはその塩基配列の断片をプローブとしたハイブリダイズ法によって、本発明のＤＮＡを得ることができる。さらに、本ＤＮＡを含有するベクターＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増殖させることによって、目的とする本発明ＤＮＡを必要量得ることができる。
【００２７】本発明のポリペプチド（例えば、アミノ酸配列Ａを含むポリペプチド）を取得する方法としては、（ａ）生体または培養細胞から精製単離する方法、（ｂ）ペプチド合成する方法、または（ｃ）遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法、などが挙げられるが、工業的には（ｃ）に記載した方法が好ましい。
【００２８】遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。例えば、大腸菌で発現させる場合には、蛋白部分をコードするＤＮＡ（例えば、塩基配列Ｂで示される塩基配列をコードするＤＮＡ）を、適当なプロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発現ベクターを作製する。次に、この発現ベクターで形質転換した大腸菌（例えば、E. coli ＤＨ１、E.coli ＪＭ１０９、E. coli ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養して、その菌体より目的とするポリペプチドを得ることができる。また、バクテリアのシグナルペプチド（例えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリプラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することもできる。さらに、他のポリペプチドとのフュージョン・プロテイン(fusion protein)を生産することもできる。
【００２９】また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、例えば、塩基配列Ｃで示される塩基配列をコードするＤＮＡを適当なベクター（例えば、レトロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、その培養液中に目的とするポリペプチドが分泌される。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
【００３０】（４） 本発明には、本発明のｃＤＮＡまたは遺伝子を含む複製または発現ベクターが含まれる。ベクターとしては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ＤＮＡまたは遺伝子の発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子などからなるプラスミド、ウィルスまたはファージベクターが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を含んでいてもよい。
【００３１】（５） さらに、本発明には、上記（４）に示される複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞も含まれる。細胞としては、例えば細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。
【００３２】
【発明の効果】こうして得られた本発明のＭＪＤ関連蛋白質は、ＭＪＤ治療剤として用いることができる。すなわち、本発明の蛋白質（ＣＡＧリピートが正常範囲であるもの）をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを全身的あるいは局所的（好ましくは、公知のターゲティング法による局所投与により）に投与する。該ベクターは脳細胞内に侵入し、遺伝子に入り込んで正常範囲のＣＡＧリピートを有するＭＪＤ関連蛋白質を継続的に発現する。正常であるＭＪＤ蛋白質が異常であるＭＪＤ蛋白質に対して大過剰に発現されると、異常である蛋白質はもはや表現されなくなる。
【００３３】本発明のＭＪＤ関連蛋白質は、そのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて、生体におけるその蛋白質の定量を行なうことができる。これによってその蛋白質（遺伝子）と疾患の関係の研究あるいは疾患の診断等に利用することができる。本発明の蛋白質および遺伝子は現在のところＭＪＤとの関連でしか論じられていないが、ＭＪＤ以外の小脳変性疾患あるいはまったく別個の疾患に関連している可能性およびまったく新しい生理活性を有する蛋白質である可能性は否定できない。そのような理由から、重要な意味を持ってくると考えられる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、その蛋白質あるいはその断片を抗原として用いて常法により作製することができる。
【００３４】本発明のｃＤＮＡは、本発明の蛋白質を生産する際の重要かつ必須の鋳型となるだけでなく、ＭＪＤの治療に用いることができる。すなわち、アンチセンスＤＮＡを含む発現ベクターを投与することによって、異常であるＭＪＤ蛋白質の発現を停止させることができる。また、本発明のｃＤＮＡをプローブとしてジェノミックＤＮＡの分離に利用できる。さらに、ＭＪＤ関連遺伝子と相同性の高い遺伝子配列を有すると考えられる、ＭＪＤ以外の小脳変性疾患の遺伝子を分離することも可能である。
【００３５】本発明の遺伝子は、ＭＪＤの診断に利用することができる。ＣＡＧリピートの数は発症年齢や臨床的重症度と密接な関係があると考えられる。従って、ＣＡＧリピートの数を調べることによって、発症年齢を予測したり、発症した場合の症状をある程度予測したりすることができる。
【００３６】ＣＡＧリピートの数を調べるには、ＣＡＧリピート部分の両端の数塩基をプライマーとするＰＣＲ法が用いられる。より具体的には、ＣＡＧリピートの５′末端に位置するイントロン部分（配列番号９で示す。）のうち、任意の１０から３０塩基と、第４エクソン中のＣＡＧリピート部分の３′末端側に位置する部分（配列番号１０で示す。）のうち、任意の１０から３０塩基をプライマーとして、対象とするヒトの遺伝子またはｍＲＮＡをＰＣＲ法によって増幅した後、常法に従い、アガロース電気泳動に付すことにより行なわれる。より好適には、配列番号１１で示される塩基配列
【００３７】５′−CCAGTGACTACTTTGATTCG−３′および
【００３８】配列番号１２で示される塩基配列
【００３９】５′−TGGCCTTTCACATGGATGTGAA−３′、または配列番号１１で示される塩基配列
【００４０】５′−CCAGTGACTACTTTGATTCG−３′および配列番号１３で示される塩基配列
【００４１】５′−CTTACCTAGATCACTCCCAA−３′で示される塩基配列がプライマーとして用いられる。ＰＣＲの条件は常法によって設定できるが、例えば、サンプルＤＮＡ（遺伝子）２００ｎｇ、プライマーをそれぞれ２００ｎｇ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.8 ）、1.5 ｍＭ ＭｇＣｌ２、0.1 ％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）×１００、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、５ユニットＴａｑポリメラーゼ（和光純薬（株）製）を、総量２０μｌとする系、９５℃、５分間→（９５℃、１分間→５７℃、１分間→７２℃、１分間）×２５サイクル→７２℃、１０分間の条件で行われる。サンプルＤＮＡは健常人またはＭＪＤ患者の組織（例えば、血液）より調製されたＤＮＡまたはＲＮＡが用いられる。ＣＡＧリピートの数は電気泳動によりＰＣＲ産物の長さを判定し、計算することによって判定されるが、より好ましくは、ＰＣＲ産物をベクターＤＮＡ（pBluescript ＳＫ（−）等）にサブクローニングした後、シークエンスを行なうことにより、正確に判定することができる。
【００４２】
【実施例】以下に、本発明を実施例によって、より詳細に、かつより具体的に説明するが、もちろんこれによって本発明が制限されるものではない。
【００４３】実施例１：ＣＡＧに相補的であるＣＴＧが１２回連続した構造を持つプローブ（１）（配列番号１４）
【００４４】
５′−ＧＡＴＣＴ（ＣＴＧ）12Ｇ−３′ （１）
【００４５】を合成し、ヒト脳側頭葉皮質のｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡライブラリー（京都大学医学部、中西重忠教授より供与された（ J. Biol. Chem., 268, 3728 (1993))に記載されている。）をスクリーニングした。
【００４６】プローブ（１）をポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ１０３（商品名）、東洋紡績（株）製）を用いたエンドラベル法でラベルし、ライブラリーより得られた50,000 プラークをスクリーニングしたところ、３０個の陽性クローンが得られた（１Ｍ ＮａＣｌ、５００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.5 ）、１％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡ中で５５℃、１６時間ハイブリダイゼーションを行ない、２×ＳＳＣ、0.1 ％ＳＤＳ、５５℃、３０分で４回洗浄した後、オートラジオグラフィーを行った。）。
【００４７】制限酵素ＲｓａＩで切断し、サザンブロッティング分析をしたところ、そのうちの２１個に明確な陽性バンドが認められた。これらのバンドのうち、濃度の濃い（すなわち、ハイブリダイズの程度が高いと予想される）クローン８個を選択し、pBluescript ＳＫ（＋）（Stratagene社製）のＥｃｏＲＩサイトにリンカーをつけてサブクローンした後、シークエンスしたところ、明確なＣＡＧリピート構造を含むｃＤＮＡクローン（ＣＡＧ−２７、図１参照のこと）が得られた。ＣＡＧ−２７は全体で1807ｂｐを含み、その中に３５９アミノ酸からなるオープンリーディングフレームが認められた。ホモロジー検索の結果、Genbank. HUMSW×784. human×chromosome STSとのホモロジーを認めた。
【００４８】実施例２ＳＤ系雄性ラット（１４週令）の脳、脊髄、心臓、肺、胃、肝臓、小腸、大腸、膵臓、脾臓、腎臓、筋肉、精巣からＲＮＡを抽出しそれぞれポリＡ ＲＮＡを精製した。おのおの１０μｇのポリＡ ＲＮＡを、常法に従い、アガロース電気泳動で分離したのち、ナイロンメンブラン（Hybond Plus （商品名）、Amersham社製）に転写し、ＣＡＧ−２７のＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ断片をプローブとしてノザンブロッティング分析を行った。その結果、膵臓および精巣を除く全ての臓器に２８Ｓより高分子側に陽性バンドが認められた（精巣では１８Ｓ付近のバンド）。
【００４９】ＣＡＧリピートのサイズをＰＣＲにより検出するため、この部分を囲む形の２組のプライマー（下記プライマー（２）（配列番号１５）と（３）（配列番号１６）を組み合わせたものと、同（４）（配列番号１７）と（５）（配列番号１８）を組み合わせたもの）を作製した。
【００５０】
877−TCTTACTTCAGAAGAGCTTCGGAAG −901 （２）
1047−GCTGGCCTTTCACATGGATGTGAAC −1023 （３）
904−ACGAGAAGCCTACTTTGA−921 （４）
1025−AACTCTGTCCTGATAGGT−1008 （５）
【００５１】この２組のプライマーの組合せは、健常人白血球より得られたＤＮＡを用いて、種々の条件下に検討した結果、ＰＣＲによる増幅が不可能であり、ＣＡＧリピート構造内またはその前後にイントロンの存在する可能性が示唆された。
【００５２】一方、連鎖解析により、例えば、ＭＪＤ遺伝子はヒト染色体１４ｑ24.3−32.1にマップされていることが判明している（ツジ（ Tsuji）ら，Nature Genetics,4, 300 (1993)参照のこと）。そこで、得られたクローン、ＣＡＧ−２７がＭＪＤに関係するか否かを確認するため、フィッシュ（Fish）法によるクロモゾームマッピングを試みたが、非特異性像が多く、明確な結果が得られなかった。
【００５３】以上の結果より、次のステップとしてこのクローンの遺伝子クローニングを行った。ＣＡＧ−２７のＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ断片をプローブに用い、ヒトジェノミックライブラリー（ＨＬ １０６７ｊおよびＨＬ １１１１ｊ，いずれもClontech社製））より 500,000クローンをスクリーニングし（スクリーニングは、温度が６５℃であることを除いて、実施例１のハイブリダイゼーションの条件と同様にして行った。）、１２個の陽性クローンを得た。これらのクローンのそれぞれをＸｈｏＩ／ＰｓｔＩで切断しサザンブロッティング分析を行い、最強シグナルを与える２クローン（それぞれ、ＣＡＧ−２７−６およびＣＡＧ−２７−１１と命名した。）をフィッシュ法によるクロモゾームマッピングに供した。
【００５４】その結果、ＣＡＧ−２７−６およびＣＡＧ−２７−１１はともに１４ｑ24.3−32.1にマップされていることが判明した。ふたつのクローンをＰｓｔＩで切断し、pBluescript ＳＫ（＋）にサブクローニングし、ハイブリダイゼーションの陽性だったクローンをシークエンスしたところ、いずれもＣＡＧ−２７の２８７から３７２ｂｐに相当する部分を含んでいた。一方、さらに 790,000個のヒト脳ｃＤＮＡライブラリーを、ＣＡＧ−２７のＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ II をプローブとして検索したところ、ＣＡＧ−２７以外に異なる２種類のｃＤＮＡ（ｃＤＮＡ−３およびｃＤＮＡ−６）が得られた。
【００５５】シークエンスの結果、ｃＤＮＡ−６はＣＡＧ−２７の塩基、１〜２８７および３７３〜９２４の部分と一致し、ｃＤＮＡ−３はＣＡＧ−２７の塩基、１〜２８７の部分と一致した。従って、この三者はそれぞれ同一遺伝子からのスプライシングスにより生み出される、３つのｍＲＮＡアイソフォームと考えられた。特に、塩基９２４位のスプライシングはＣＡＧリピートの直前であり、ＰＣＲにはイントロンの３′−側を用いなければならないことが明確に示された。図２にクローン、ＣＡＧ−２７、ＣＡＧ−２７−６、ＣＡＧ−２７−１１、ｃＤＮＡ−３およびｃＤＮＡ−６の構造を示す。
【００５６】ＣＡＧ−２７のＤｒａＩＩ／ＳａｃＩ断片（ＣＡＧリピートの最終部分からコードされている蛋白質のカルボキシル末端に相当）をプローブとしてヒトジェノミックライブラリーをスクリーニングし、 800,000個から４個の陽性クローンを得た（それぞれをＣＡＧ−２７−２１、ＣＡＧ−２７−２２、ＣＡＧ−２７−２３、ＣＡＧ−２７−２４と命名した。スクリーニングは、温度が６５℃であることを除いて、実施例１のハイブリダイゼーションの条件と同様にして行った。）。このうち、ＣＡＧ−２７−２３をシークエンスすることにより、ＣＡＧ−２７の９２４位の塩基（ＣＡＧリピートの直前の塩基）のイントロン構造が判明した（配列番号９参照）。ここでヒトジェノミッククローン中に得られたＣＡＧリピートは２７回であり、ｃＤＮＡ（ＣＡＧ−２７）の２６回とは異なっていることがわかった。
【００５７】ここで新たなＰＣＲプライマー（６）（配列番号１１）、（７）（配列番号１２）および（８）（配列番号１３）を作製した。
【００５８】５′−CCAGTGACTACTTTGATTCG−３′ （６）（ＣＡＧリピートの５′側、イントロン部分に存在）
【００５９】
５′−TGGCCTTTCACATGGATGTGAA−３′ （７）（ＣＡＧリピートの３′側）
【００６０】
５′−CTTACCTAGATCACTCCCAA−３′ （８）（ＣＡＧリピートの３′側）
【００６１】プライマー（６）とプライマー（７）を組み合わせた場合にも、ＰＣＲされる検体とされない検体がでたが、プライマー（６）とプライマー（８）を組み合わせた場合には全例成功した。サンプルＤＮＡ（遺伝子）２００ｎｇ、プライマー（６）およびプライマー（８）をそれぞれ２００ｎｇ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.8 ）、1.5 ｍＭ ＭｇＣｌ２、0.1 ％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）×１００、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、５ユニットＴａｑポリメラーゼ（和光純薬（株）製）を、総量２０μｌの系でＰＣＲを行った（ＰＣＲは９５℃、５分間→（９５℃、１分間→５７℃、１分間→７２℃、１分間）×２５サイクル→７２℃、１０分間の条件で行った。）。反応後、常法に従い、アガロース電気泳動をしたところ、正常人では１３回から３６回のＣＡＧリピートに相当するバンドが検出されたのに対し、ＭＪＤの患者（１１例）においては、いずれも７０回前後（６８回から７９回）のＣＡＧリピートが認められた。従って、この条件はＭＪＤの遺伝子診断に十分使用できることがわかった。
【００６２】
【配列表】
配列番号：１配列の長さ：２９１配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列Met Glu Ser Ile Phe His Glu Lys Gln Glu Gly Ser Leu Cys Ala Gln 1 5 10 15 His Cys Leu Asn Asn Leu Leu Gln Gly Glu Tyr Phe Ser Pro Val Glu 20 25 30 Leu Ser Ser Ile Ala His Gln Leu Asp Glu Glu Glu Arg Met Arg Met 35 40 45 Ala Glu Gly Gly Val Thr Ser Glu Asp Tyr Arg Thr Phe Leu Gln Gln 50 55 60 Pro Ser Gly Asn Met Asp Asp Ser Gly Phe Phe Ser Ile Gln Val Ile 65 70 75 80 Ser Asn Ala Leu Lys Val Trp Gly Leu Glu Leu Ile Leu Phe Asn Ser 85 90 95 Pro Glu Tyr Gln Arg Leu Arg Ile Asp Pro Ile Asn Glu Arg Ser Phe 100 105 110 Ile Cys Asn Tyr Lys Glu His Trp Phe Thr Val Arg Lys Leu Gly Lys 115 120 125 Gln Trp Phe Asn Leu Asn Ser Leu Leu Thr Gly Pro Glu Leu Ile Ser 130 135 140 Asp Thr Tyr Leu Ala Leu Phe Leu Ala Gln Leu Gln Gln Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Ser Ile Phe Val Val Lys Gly Asp Leu Pro Asp Cys Glu Ala Asp Gln 165 170 175 Leu Leu Gln Met Ile Arg Val Gln Gln Met His Arg Pro Lys Leu Ile 180 185 190 Gly Glu Glu Leu Ala Gln Leu Lys Glu Gln Arg Val His Lys Thr Asp 195 200 205 Leu Glu Arg Met Leu Glu Ala Asn Asp Gly Ser Gly Met Leu Asp Glu 210 215 220 Asp Glu Glu Asp Leu Gln Arg Ala Leu Ala Leu Ser Arg Gln Glu Ile 225 230 235 240 Asp Met Glu Asp Glu Glu Ala Asp Leu Arg Arg Ala Ile Gln Leu Ser 245 250 255 Met Gln Gly Ser Ser Arg Asn Ile Ser Gln Asp Met Thr Gln Thr Ser 260 265 270 Gly Thr Asn Leu Thr Ser Glu Glu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Ala Tyr 275 280 285 Phe Glu Lys 290
【００６３】配列番号：２配列の長さ：４３配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列Arg Asp Leu Ser Gly Gln Ser Ser His Pro Cys Glu Arg Pro Ala Thr 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ala Leu Gly Ser Asp Leu Gly Lys Ala Cys Ser Pro Phe 20 25 30 Ile Met Phe Ala Thr Phe Thr Leu Tyr Leu Thr 35 40
【００６４】配列番号：３配列の長さ：８７３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA配列ATGGAGTCCA TCTTCCACGA GAAACAAGAA GGCTCACTTT GTGCTCAACA TTGCCTGAAT 60AACTTATTGC AAGGAGAATA TTTTAGCCCT GTGGAATTAT CCTCAATTGC ACATCAGCTG 120GATGAGGAGG AGAGGATGAG AATGGCAGAA GGAGGAGTTA CTAGTGAAGA TTATCGCACG 180TTTTTACAGC AGCCTTCTGG AAATATGGAT GACAGTGGTT TTTTCTCTAT TCAGGTTATA 240AGCAATGCCT TGAAAGTTTG GGGTTTAGAA CTAATCCTGT TCAACAGTCC AGAGTATCAG 300AGGCTCAGGA TCGATCCTAT AAATGAAAGA TCATTTATAT GCAATTATAA GGAACACTGG 360TTTACAGTTA GAAAATTAGG AAAACAGTGG TTTAACTTGA ATTCTCTCTT GACGGGTCCA 420GAATTAATAT CAGATACATA TCTTGCACTT TTCTTGGCTC AATTACAACA GGAAGGTTAT 480TCTATATTTG TTGTTAAGGG TGATCTGCCA GATTGCGAAG CTGACCAACT CCTGCAGATG 540ATTAGGGTCC AACAGATGCA TCGACCAAAA CTTATTGGAG AAGAATTAGC ACAACTAAAA 600GAGCAAAGAG TCCATAAAAC AGACCTGGAA CGAATGTTAG AAGCAAATGA TGGCTCAGGA 660ATGTTAGACG AAGATGAGGA GGATTTGCAG AGGGCTCTGG CACTAAGTCG CCAAGAAATT 720GACATGGAAG ATGAGGAAGC AGATCTCCGC AGGGCTATTC AGCTAAGTAT GCAAGGTAGT 780TCCAGAAACA TATCTCAAGA TATGACACAG ACATCAGGTA CAAATCTTAC TTCAGAAGAG 840CTTCGGAAGA GACGAGAAGC CTACTTTGAA AAA 873
【００６５】配列番号：４配列の長さ：１２９配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA配列CGGGACCTAT CAGGACAGAG TTCACATCCA TGTGAAAGGC CAGCCACCAG TTCAGGAGCA 60CTTGGGAGTG ATCTAGGTAA GGCCTGCTCA CCATTCATCA TGTTCGCTAC CTTCACACTT 120TATCTGACA 129
【００６６】配列番号：５配列の長さ：９２５配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA配列GAATTCCGTT GCTGTCGTCG GCGTGGGGGC CGTTGGCTCC AGACAAATAA ACATGGAGTC 60CATCTTCCAC GAGAAACAAG AAGGCTCACT TTGTGCTCAA CATTGCCTGA ATAACTTATT 120GCAAGGAGAA TATTTTAGCC CTGTGGAATT ATCCTCAATT GCACATCAGC TGGATGAGGA 180GGAGAGGATG AGAATGGCAG AAGGAGGAGT TACTAGTGAA GATTATCGCA CGTTTTTACA 240GCAGCCTTCT GGAAATATGG ATGACAGTGG TTTTTTCTCT ATTCAGGTTA TAAGCAATGC 300CTTGAAAGTT TGGGGTTTAG AACTAATCCT GTTCAACAGT CCAGAGTATC AGAGGCTCAG 360GATCGATCCT ATAAATGAAA GATCATTTAT ATGCAATTAT AAGGAACACT GGTTTACAGT 420TAGAAAATTA GGAAAACAGT GGTTTAACTT GAATTCTCTC TTGACGGGTC CAGAATTAAT 480ATCAGATACA TATCTTGCAC TTTTCTTGGC TCAATTACAA CAGGAAGGTT ATTCTATATT 540TGTTGTTAAG GGTGATCTGC CAGATTGCGA AGCTGACCAA CTCCTGCAGA TGATTAGGGT 600CCAACAGATG CATCGACCAA AACTTATTGG AGAAGAATTA GCACAACTAA AAGAGCAAAG 660AGTCCATAAA ACAGACCTGG AACGAATGTT AGAAGCAAAT GATGGCTCAG GAATGTTAGA 720CGAAGATGAG GAGGATTTGC AGAGGGCTCT GGCACTAAGT CGCCAAGAAA TTGACATGGA 780AGATGAGGAA GCAGATCTCC GCAGGGCTAT TCAGCTAAGT ATGCAAGGTA GTTCCAGAAA 840CATATCTCAA GATATGACAC AGACATCAGG TACAAATCTT ACTTCAGAAG AGCTTCGGAA 900GAGACGAGAA GCCTACTTTG AAAAA 925
【００６７】配列番号：６配列の長さ：８０７配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA配列CGGGACCTAT CAGGACAGAG TTCACATCCA TGTGAAAGGC CAGCCACCAG TTCAGGAGCA 60CTTGGGAGTG ATCTAGGTAA GGCCTGCTCA CCATTCATCA TGTTCGCTAC CTTCACACTT 120TATCTGACAT AAGAGCTCCA TGTGATTTTT GCTTTACATT ATTCTTCATT CCCTCTTTAA 180TCATATTAAG ACTCTTAAGT AAATTTGTAA TCTACTAAAT TTCCCTGGAT TAAGGAGCAA 240GGTTACCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAG CTAGATGTGG TGGCTCACAT CTGTAATCCC 300AGCACTTTGG GAAACCAAGG CAGGAGAGGA TTGCTAGAAC ATTTAATGAA TACTTTAACA 360TAATAATTTA AACTTCACAG TAATTTGTAC AGTCTCCAGA AATTCCTTAG ACATCATGAA 420TATTTTTCTT TTTTTGGGGT GACAGGGCAA AACTCTGTCT CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 480AAAGGGCTGG ACACGGTGGC TTACGCCTGT TATCCCGGCA CTTTGGGAGG CCAAGGCCGA 540TGGATCACCT GAGGTCAGGA GTTCAAGACC AGCCTGGCCA ACATGGTGAA ACCCCATCTC 600TACTAAAAAT ACAAAAATTT GCTGGGCATG GTGGTGGGCA CCTGTAATCC CAGGAGGCTG 660AGGCAGGAGA ATCACTTGAA CCTGGGAGCG GAGATTGCAG TGAGCCAAGA TTGTGCCATT 720GAACTCCAGC CTGGGTGACA AGACCAAAAC TCCATCTCAA AAAAAAAAAA AAAAAAAGCG 780ACAGCAACGG CGACAGCAAC GGAATTC 807
【００６８】配列番号：７配列の長さ：１２９配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA配列CTTTTAATAC CAGTGACTAC TTTGATTCGT GAAACAATGT ATTTTCCTTA TGAATAGTTT 60TTCTCCATGG TGTATTTATT CTTTTAAGTT TTGTTTTTTA AATATACTTC ACCTTTTGAA 120TGTTTCAGA 129
【００６９】配列番号：８配列の長さ：７６配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA配列CGGGACCTAT CAGGACAGAG TTCACATCCA TGTGAAAGGC CAGCCACCAG TTCAGGAGCA 60CTTGGGAGTG ATCTAG 76
【００７０】配列番号：９配列の長さ：１２８配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列CTTTTAATAC CAGTGACTAC TTTGATTCGT GAAACAATGT ATTTTCCTTA TGAATAGTTT 60TTCTCCATGG TGTATTTATT CTTTTAAGTT TTGTTTTTTA AATATACTTC ACCTTTTGAA 120TGTTTCAG 128
【００７１】配列番号：１０配列の長さ：１２９配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA配列CGGGACCTAT CAGGACAGAG TTCACATCCA TGTGAAAGGC CAGCCACCAG TTCAGGAGCA 60CTTGGGAGTG ATCTAGGTAA GGCCTGCTCA CCATTCATCA TGTTCGCTAC CTTCACACTT 120TATCTGACA 129
【００７２】配列番号：１１配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列CCAGTGACTA CTTTGATTCG
【００７３】配列番号：１２配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列TGGCCTTTCA CATGGATGTG AA
【００７４】配列番号：１３配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列CTTACCTAGA TCACTCCCAA
【００７５】配列番号：１４配列の長さ：４４配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列GATCTCTGCT GCTGCTGCTG CTGCTGCTG CTGCTGCTG CTGG
【００７６】配列番号：１５配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列TCTTACTTCA GAAGAGCTTC GGAAG
【００７７】配列番号：１６配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列GCTGGCCTTT CACATGGATG TGAAC
【００７８】配列番号：１７配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列ACGAGAAGCC TACTTTGA
【００７９】配列番号：１８配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列AACTCTGTCC TGATAGGT
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＣＡＧ２７のシークエンス解析図を表わす。
【図２】 クローン、ＣＡＧ−２７、ＣＡＧ−２７−６、ＣＡＧ−２７−１１、ｃＤＮＡ−３およびｃＤＮＡ−６の構造を比較したものである。
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトマッカード−ジョセフ病関連蛋白質、その蛋白質をコードするｃＤＮＡおよび遺伝子、そのＤＮＡまたは遺伝子を含むベクター、その発現ベクターで形質転換された宿主細胞、マッカード−ジョセフ病の診断方法および治療剤に関する。
【０００２】
【発明の背景】原因不明の神経変性疾患のひとつにマッカード−ジョセフ病（Machado-JosephDisease、以下ＭＪＤと略記する。）がある。最初、いくつかの国の臨床医により別々の病名で呼ばれていたが、1976年、主に同一の遺伝子異常に基づく臨床亜型であることが証明された。後になって、この遺伝子異常は常染色体の優性遺伝の形式をとることが判明した。わが国でも1983年に初めてＭＪＤが報告され、それ以降、報告は年々増加している。
【０００３】ＭＪＤは、発病年齢が１０才前後から５０才前後と幅広く、初発症状としては運動失調による歩行障害を示すものが多く、次第に、平衡障害、協調運動障害、構音障害、眼振、眼球運動障害、筋萎縮などの症状が現われ、発病後約１０年を経過した晩期には、自律神経障害、神経知能障害などの症状が現われ、これが元で最終的には自殺などにより死に至る場合が多い。本症は世代が進むにつれて発病年齢が若くなる傾向がみられる。
【０００４】
【従来の技術】最近、ＭＪＤが一つの変異遺伝子に基づく疾患であると考えられるようになり、ＭＪＤの遺伝子座に関して盛んに研究されている。1993年、ツジらのグループは、連鎖の分析よりＭＪＤ遺伝子はヒト染色体１４ｑ24.3−32.1にマップされていることを突き止めた（Nature Genetics, 4, 300 (1993)参照のこと）。しかしながら、ＭＪＤ遺伝子の同定には至っていない。
【０００５】
【発明の目的】本発明者らは、ＭＪＤ遺伝子を同定するために鋭意検討を重ねた。すなわち、ＭＪＤと同様に常染色体優性遺伝の形式をとる神経変性疾患であるハンチントン舞踏病、ケネデイー病、ＳＣＡ１に着目した。最近、これらの関連遺伝子が相次いで同定され、患者の遺伝子では、塩基配列「ＣＡＧ」の繰り返し数が正常人に比べ異常に多いことが判明した。また、興味深いことに、患者間での比較において、「ＣＡＧ」の繰り返し数が多いほど発症年齢が下がり、臨床的重症度が増すということが明らかになった。ＭＪＤは、これらの遺伝性神経変性疾患と同様な遺伝形式および臨床経過をとることから、ＭＪＤでも関連遺伝子内での「ＣＡＧ」リピートの異常な増幅によって発病しているのではないかと想定し、独自の方法で検討を重ねた。
【０００６】本発明者らは、まず、ＣＡＧリピートに相補的であるＣＴＧリピートを有するプローブを用いて、正常人の脳皮質より調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした結果、明確なＣＡＧリピート構造を有し、３５９アミノ酸をコードするｃＤＮＡクローン（ＣＡＧ−２７）を得た。
【０００７】そこで、ＣＡＧ−２７の断片をプローブとして、ヒトジェノミックライブラリーのスクリーニングを行った結果、陽性クローンを得、さらにこれらのクローンはヒト染色体の１４ｑ.32.1 にマップされていることが判明した。これによってＣＡＧ−２７がまさしくＭＪＤ関連遺伝子である可能性が高まった。ＣＡＧ−２７の断片を用いて、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーを再度スクリーニングしたところ、新たに２種類のクローンが得られた。それらを比較したところ、ＣＡＧリピートの直前にスプライシングサイトが存在することが分かった。そこでＣＡＧリピートより３′側のＤＮＡ断片をプローブとしてヒトジェノミックライブラリーを再度スクリーニングした結果、陽性クローンよりＣＡＧリピートの直前のイントロンの構造が判明した。
【０００８】最後にイントロンの３′側とＣＡＧリピートの３′側をコードするプライマーを用いてＰＣＲ（ Polymerase chain reaction）を行ったところ成功し、ＰＣＲ生成物のアガロース電気泳動の結果より、正常人では１３から３６回のＣＡＧリピート部分を有していたのに対し、ＭＪＤ患者ではいずれも７０回前後のリピートが認められた。ここに、本発明者らはＭＪＤ関連蛋白質、およびその蛋白質をコードする遺伝子を見出して、本発明を完成するに至った。さらに、ＭＪＤ関連遺伝子の一部をＰＣＲプライマーとするＭＪＤの診断方法をも確立した。
【０００９】スイスプロット（Swiss Prot Release 2.0）に登録されている既知のポリペプチドのアミノ酸配列を調査したが、本発明のポリペプチドと同一の配列を有しているものはまったく無かった。さらに、ジーンバンク（GenBank Release 70.0）に登録されているヌクレオチド配列も調査したが、本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡと同一の配列は見つからなかった。従って、本発明のポリペプチドはまったく新規なものであることが確認された。
【００１０】
【発明の開示】本発明は、（１）ＭＪＤ関連蛋白質、（２）その蛋白質をコードするｃＤＮＡ、（３）その蛋白質をコードする遺伝子、（４）上記（２）で示されるｃＤＮＡまたは上記（３）で示される遺伝子を含む複製または発現ベクター、（５）上記（４）で示される発現ベクターで形質転換された宿主細胞、（６）上記（３）で示される遺伝子を用いることを特徴とするＭＪＤの診断方法、および（７）上記（４）で示されるベクターを有効成分として含有するＭＪＤ治療剤、に関する。
【００１１】以下、具体的に説明する。
（１）ＭＪＤ関連蛋白質には、実質的に純粋な形である、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＬｙｓ部が（Ｇｌｎ）ｎ（式中、ｎは１５０以下の整数を表わし、（Ｇｌｎ）ｎはその配列の途中に少なくともひとつのＬｙｓを含んでいてもよい。）を介して配列番号２で示されるアミノ酸配列のＡｒｇ部と結合したアミノ酸配列（以下、アミノ酸配列Ａという。）を含むポリペプチド、そのホモローグ、その配列のフラグメント、およびそのホモローグが含まれる。
【００１２】「実質的に純粋な形である」アミノ酸配列Ａを含むポリペプチドとは、一般に、生産時のポリペプチドの９０％以上、例えば、９５、９８または９９％がアミノ酸配列Ａで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを意味する。
【００１３】「アミノ酸配列Ａを含むポリペプチド」とは、アミノ酸配列Ａからなるポリペプチドだけでなく、そのポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に、アミノ酸配列Ａのアミノ酸数の２０％、より好ましくは５％以内の別個のポリペプチドを付加したポリペプチドを意味する。
【００１４】アミノ酸配列Ａを含むポリペプチドのホモローグとは、一般に少なくとも１００個、好ましくは少なくとも１５０個、例えば２００、２５０または３００個の連続したアミノ酸領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性のあるものであり、そのようなホモローグは、以下本発明のポリペプチドとして記載される。
【００１５】さらに、アミノ酸配列Ａを含むポリペプチドのフラグメント、またはそれらのホモローグのフラグメントとは、アミノ酸配列Ａを含むポリペプチドまたはそれらのホモローグのうち、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、例えば２０、２５、３０、４０、５０または６０アミノ酸部分を意味する。
【００１６】アミノ酸配列Ａを含むポリペプチドのホモローグ、その配列のフラグメント、およびそのホモローグを別の観点から説明すると、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＬｙｓ部が（Ｇｌｎ）ｎ（式中、ｎは１５０以下の整数を表わし、（Ｇｌｎ）ｎはその配列の途中に少なくともひとつのＬｙｓを含んでいてもよい。）を介して配列番号２で示されるアミノ酸配列のＡｒｇ部と結合しているアミノ酸配列Ａを有するもの以外に、そのアミノ酸配列の一部が欠損したもの（例えば、蛋白全長中、生物活性の発現に必須な部分だけからなるポリペプチド）、その一部が他のアミノ酸と置換したもの（例えば、物性の類似したアミノ酸に置換したもの）、およびその一部に他のアミノ酸が付加または挿入されたものも含まれる。
【００１７】ＣＡＧリピートには、「ＣＡＧ」そのもの、および「ＣＡＧ」の亜型である「ＣＡＡ」および「ＡＡＧ」も含めて数えることが合理的である。本発明によれば、ＣＡＧリピートは正常人で数回から３０回、ＭＪＤ患者で約７０回であることが判明している。また、疾患の重症度によっては１００を越えることも予測される。従って、アミノ酸配列Ａ中、Ｇｌｎリピート数、すなわちｎは１５０以下である。さらに（Ｇｌｎ）ｎは、その配列の途中に少なくともひとつ、例えば１から５個のＬｙｓ（すなわち、塩基配列「ＡＡＧ」に相当する）を含んでいてもよい。
【００１８】（２）ＭＪＤ関連蛋白質をコードするｃＤＮＡとは、（ｉ）前記アミノ酸配列Ａを含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、（ii）配列番号３で示される塩基配列のＡＡＡ部が（ＣＸＸ）ｍ（式中、ＣＸＸは、塩基配列「ＣＡＧ」、「ＣＡＡ」または「ＡＡＧ」を表わし、ｍは１５０以下の整数を表わす。ただし、「ＣＡＡ」および「ＡＡＧ」の数は各々０から５個である。）を介して配列番号４で示される塩基配列のＣＧＧ部と結合した塩基配列（以下、塩基配列Ｂという。）を有するｃＤＮＡ、(iii) 配列番号５で示される塩基配列のＡＡＡ部が（ＣＸＸ）ｍ（式中、ＣＸＸおよびｍは前記と同じ意味を表わす。）を介して配列番号６で示される塩基配列のＣＧＧ部と結合した塩基配列（以下、塩基配列Ｃという。）を有するｃＤＮＡ、および（iv）前記塩基配列ＢまたはＣで示される塩基配列に選択的にハイブリダイズする塩基配列を有するｃＤＮＡ、およびそれらのフラグメントが含まれる。
【００１９】塩基配列ＢまたはＣで示される塩基配列に選択的にハイブリダイズするｃＤＮＡとは、一般に、少なくとも３００個、好ましくは、少なくとも４５０個、例えば６００、７５０または９００個の連続した塩基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上の相同性のあるものであり、そのようなｃＤＮＡは、以後本発明のｃＤＮＡとして記載される。
【００２０】塩基配列ＢまたはＣで示される塩基配列を有するｃＤＮＡおよびその塩基配列に選択的にハイブリダイズする塩基配列を有するｃＤＮＡのフラグメントとは少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも４５塩基、例えば６０、７５、９０、１２０または１５０塩基部分を意味し、そのようなフラグメントも本発明のｃＤＮＡに含まれる。
【００２１】よく知られているように、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、メチオニン（Ｍｅｔ）は１種類、ロイシン（Ｌｅｕ）は６種類）知られている。従って、ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくｃＤＮＡの塩基配列を変えることができる。従って、（ｉ）で特定される本発明のｃＤＮＡには、それぞれ前記アミノ酸配列Ａで示されるポリペプチドをコードするすべての塩基配列群（但し、（Ｇｌｎ）ｎ部分は（ＣＸＸ）ｍによってコードされているものとする。）が含まれる。塩基配列を変えることによってポリペプチドの生産性が向上することがある。
（ii）で特定されるＤＮＡは、（ｉ）で示されるＤＮＡの一態様であり、(iii) に示されるＤＮＡは、（ii）で特定されるＤＮＡに天然の非翻訳部分を加えた配列を示す。
【００２２】ＣＡＧリピートは正常人で数回から３０回、ＭＪＤ患者で約７０回であることが判明している。従って、塩基配列ＢまたはＣで示される塩基配列中、ＣＡＧリピートの数、すなわち、ｍは１５０以下である。塩基配列Ｂ、Ｃおよび後記のＤで示される塩基配列中、「ＣＸＸ」は「ＣＡＧ」、「ＣＡＡ」または「ＡＡＧ」を表わすが、「ＣＡＡ」および「ＡＡＧ」の数は各々０から５個である。
【００２３】（３） ＭＪＤ関連遺伝子とは、ヒト遺伝子、１４ｑ24.3−32.1にマップされている少なくとも５つのエクソンからなる遺伝子のことである。本発明では、その全エクソンとイントロンの一部をシークエンスすることに成功した。より具体的には、配列番号７で示される塩基配列のＡＧＡ部が（ＣＸＸ）ｍ（式中、ＣＸＸおよびｍは前記と同じ意味を表わす。）を介して配列番号８で示される塩基配列（以下、塩基配列Ｄという。）を有する染色体ＤＮＡである。塩基配列Ｄには、ＣＡＧリピートを含むエクソン部分（本発明では第４エクソンと呼ぶことにする。）とその上流に位置するイントロン部分の塩基配列が明らかにされている。
【００２４】ＣＡＧリピートは正常人で数回から３０回、ＭＪＤ患者では約７０回であることがわかった。従って、塩基配列Ｄにおいて、ｍは１５０以下と定義される。ＣＡＧリピートの数は、発症年齢や臨床的重症度と密接な関係があることが予測される。従って、ＣＡＧリピートの数を調べることは、ＭＪＤの診断法の一つとして利用することができる。本発明のｃＤＮＡおよび遺伝子は、遺伝子組み換え法、合成法あるいは当業者に公知の方法によって取得することができる。
【００２５】塩基配列ＢまたはＣで示される塩基配列を有するｃＤＮＡ、または塩基配列Ｄで示される塩基配列を有する遺伝子は、以下の方法に従って調製される。すなわち、（ｉ）ＣＡＧリピートまたはそれに相補的なＣＴＧリピートを有するプローブを調製し、（ii）（ｉ）で調製したプローブを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、(iii) （ii）で得られた陽性クローンをプローブとして、ヒトジェノミックライブラリーをスクリーニングし、（iv） 得られた陽性クローンを遺伝子マッピングし、（ｖ）１４ｑ24.3−32.1にマッピングされているものを検索することによって行なわれる。
【００２６】各ステップの詳細な方法は、後記の実施例に記載した方法に従って行なわれる。 塩基配列Ｂ、ＣまたはＤで示される塩基配列が一旦確定されると、その後は、化学合成によって、またはＰＣＲ法によって、あるいはその塩基配列の断片をプローブとしたハイブリダイズ法によって、本発明のＤＮＡを得ることができる。さらに、本ＤＮＡを含有するベクターＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増殖させることによって、目的とする本発明ＤＮＡを必要量得ることができる。
【００２７】本発明のポリペプチド（例えば、アミノ酸配列Ａを含むポリペプチド）を取得する方法としては、（ａ）生体または培養細胞から精製単離する方法、（ｂ）ペプチド合成する方法、または（ｃ）遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法、などが挙げられるが、工業的には（ｃ）に記載した方法が好ましい。
【００２８】遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。例えば、大腸菌で発現させる場合には、蛋白部分をコードするＤＮＡ（例えば、塩基配列Ｂで示される塩基配列をコードするＤＮＡ）を、適当なプロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発現ベクターを作製する。次に、この発現ベクターで形質転換した大腸菌（例えば、E. coli ＤＨ１、E.coli ＪＭ１０９、E. coli ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養して、その菌体より目的とするポリペプチドを得ることができる。また、バクテリアのシグナルペプチド（例えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリプラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することもできる。さらに、他のポリペプチドとのフュージョン・プロテイン(fusion protein)を生産することもできる。
【００２９】また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、例えば、塩基配列Ｃで示される塩基配列をコードするＤＮＡを適当なベクター（例えば、レトロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、その培養液中に目的とするポリペプチドが分泌される。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
【００３０】（４） 本発明には、本発明のｃＤＮＡまたは遺伝子を含む複製または発現ベクターが含まれる。ベクターとしては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ＤＮＡまたは遺伝子の発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子などからなるプラスミド、ウィルスまたはファージベクターが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を含んでいてもよい。
【００３１】（５） さらに、本発明には、上記（４）に示される複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞も含まれる。細胞としては、例えば細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。
【００３２】
【発明の効果】こうして得られた本発明のＭＪＤ関連蛋白質は、ＭＪＤ治療剤として用いることができる。すなわち、本発明の蛋白質（ＣＡＧリピートが正常範囲であるもの）をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを全身的あるいは局所的（好ましくは、公知のターゲティング法による局所投与により）に投与する。該ベクターは脳細胞内に侵入し、遺伝子に入り込んで正常範囲のＣＡＧリピートを有するＭＪＤ関連蛋白質を継続的に発現する。正常であるＭＪＤ蛋白質が異常であるＭＪＤ蛋白質に対して大過剰に発現されると、異常である蛋白質はもはや表現されなくなる。
【００３３】本発明のＭＪＤ関連蛋白質は、そのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて、生体におけるその蛋白質の定量を行なうことができる。これによってその蛋白質（遺伝子）と疾患の関係の研究あるいは疾患の診断等に利用することができる。本発明の蛋白質および遺伝子は現在のところＭＪＤとの関連でしか論じられていないが、ＭＪＤ以外の小脳変性疾患あるいはまったく別個の疾患に関連している可能性およびまったく新しい生理活性を有する蛋白質である可能性は否定できない。そのような理由から、重要な意味を持ってくると考えられる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、その蛋白質あるいはその断片を抗原として用いて常法により作製することができる。
【００３４】本発明のｃＤＮＡは、本発明の蛋白質を生産する際の重要かつ必須の鋳型となるだけでなく、ＭＪＤの治療に用いることができる。すなわち、アンチセンスＤＮＡを含む発現ベクターを投与することによって、異常であるＭＪＤ蛋白質の発現を停止させることができる。また、本発明のｃＤＮＡをプローブとしてジェノミックＤＮＡの分離に利用できる。さらに、ＭＪＤ関連遺伝子と相同性の高い遺伝子配列を有すると考えられる、ＭＪＤ以外の小脳変性疾患の遺伝子を分離することも可能である。
【００３５】本発明の遺伝子は、ＭＪＤの診断に利用することができる。ＣＡＧリピートの数は発症年齢や臨床的重症度と密接な関係があると考えられる。従って、ＣＡＧリピートの数を調べることによって、発症年齢を予測したり、発症した場合の症状をある程度予測したりすることができる。
【００３６】ＣＡＧリピートの数を調べるには、ＣＡＧリピート部分の両端の数塩基をプライマーとするＰＣＲ法が用いられる。より具体的には、ＣＡＧリピートの５′末端に位置するイントロン部分（配列番号９で示す。）のうち、任意の１０から３０塩基と、第４エクソン中のＣＡＧリピート部分の３′末端側に位置する部分（配列番号１０で示す。）のうち、任意の１０から３０塩基をプライマーとして、対象とするヒトの遺伝子またはｍＲＮＡをＰＣＲ法によって増幅した後、常法に従い、アガロース電気泳動に付すことにより行なわれる。より好適には、配列番号１１で示される塩基配列
【００３７】５′−CCAGTGACTACTTTGATTCG−３′および
【００３８】配列番号１２で示される塩基配列
【００３９】５′−TGGCCTTTCACATGGATGTGAA−３′、または配列番号１１で示される塩基配列
【００４０】５′−CCAGTGACTACTTTGATTCG−３′および配列番号１３で示される塩基配列
【００４１】５′−CTTACCTAGATCACTCCCAA−３′で示される塩基配列がプライマーとして用いられる。ＰＣＲの条件は常法によって設定できるが、例えば、サンプルＤＮＡ（遺伝子）２００ｎｇ、プライマーをそれぞれ２００ｎｇ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.8 ）、1.5 ｍＭ ＭｇＣｌ２、0.1 ％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）×１００、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、５ユニットＴａｑポリメラーゼ（和光純薬（株）製）を、総量２０μｌとする系、９５℃、５分間→（９５℃、１分間→５７℃、１分間→７２℃、１分間）×２５サイクル→７２℃、１０分間の条件で行われる。サンプルＤＮＡは健常人またはＭＪＤ患者の組織（例えば、血液）より調製されたＤＮＡまたはＲＮＡが用いられる。ＣＡＧリピートの数は電気泳動によりＰＣＲ産物の長さを判定し、計算することによって判定されるが、より好ましくは、ＰＣＲ産物をベクターＤＮＡ（pBluescript ＳＫ（−）等）にサブクローニングした後、シークエンスを行なうことにより、正確に判定することができる。
【００４２】
【実施例】以下に、本発明を実施例によって、より詳細に、かつより具体的に説明するが、もちろんこれによって本発明が制限されるものではない。
【００４３】実施例１：ＣＡＧに相補的であるＣＴＧが１２回連続した構造を持つプローブ（１）（配列番号１４）
【００４４】
５′−ＧＡＴＣＴ（ＣＴＧ）12Ｇ−３′ （１）
【００４５】を合成し、ヒト脳側頭葉皮質のｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡライブラリー（京都大学医学部、中西重忠教授より供与された（ J. Biol. Chem., 268, 3728 (1993))に記載されている。）をスクリーニングした。
【００４６】プローブ（１）をポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ１０３（商品名）、東洋紡績（株）製）を用いたエンドラベル法でラベルし、ライブラリーより得られた50,000 プラークをスクリーニングしたところ、３０個の陽性クローンが得られた（１Ｍ ＮａＣｌ、５００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.5 ）、１％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡ中で５５℃、１６時間ハイブリダイゼーションを行ない、２×ＳＳＣ、0.1 ％ＳＤＳ、５５℃、３０分で４回洗浄した後、オートラジオグラフィーを行った。）。
【００４７】制限酵素ＲｓａＩで切断し、サザンブロッティング分析をしたところ、そのうちの２１個に明確な陽性バンドが認められた。これらのバンドのうち、濃度の濃い（すなわち、ハイブリダイズの程度が高いと予想される）クローン８個を選択し、pBluescript ＳＫ（＋）（Stratagene社製）のＥｃｏＲＩサイトにリンカーをつけてサブクローンした後、シークエンスしたところ、明確なＣＡＧリピート構造を含むｃＤＮＡクローン（ＣＡＧ−２７、図１参照のこと）が得られた。ＣＡＧ−２７は全体で1807ｂｐを含み、その中に３５９アミノ酸からなるオープンリーディングフレームが認められた。ホモロジー検索の結果、Genbank. HUMSW×784. human×chromosome STSとのホモロジーを認めた。
【００４８】実施例２ＳＤ系雄性ラット（１４週令）の脳、脊髄、心臓、肺、胃、肝臓、小腸、大腸、膵臓、脾臓、腎臓、筋肉、精巣からＲＮＡを抽出しそれぞれポリＡ ＲＮＡを精製した。おのおの１０μｇのポリＡ ＲＮＡを、常法に従い、アガロース電気泳動で分離したのち、ナイロンメンブラン（Hybond Plus （商品名）、Amersham社製）に転写し、ＣＡＧ−２７のＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ断片をプローブとしてノザンブロッティング分析を行った。その結果、膵臓および精巣を除く全ての臓器に２８Ｓより高分子側に陽性バンドが認められた（精巣では１８Ｓ付近のバンド）。
【００４９】ＣＡＧリピートのサイズをＰＣＲにより検出するため、この部分を囲む形の２組のプライマー（下記プライマー（２）（配列番号１５）と（３）（配列番号１６）を組み合わせたものと、同（４）（配列番号１７）と（５）（配列番号１８）を組み合わせたもの）を作製した。
【００５０】
877−TCTTACTTCAGAAGAGCTTCGGAAG −901 （２）
1047−GCTGGCCTTTCACATGGATGTGAAC −1023 （３）
904−ACGAGAAGCCTACTTTGA−921 （４）
1025−AACTCTGTCCTGATAGGT−1008 （５）
【００５１】この２組のプライマーの組合せは、健常人白血球より得られたＤＮＡを用いて、種々の条件下に検討した結果、ＰＣＲによる増幅が不可能であり、ＣＡＧリピート構造内またはその前後にイントロンの存在する可能性が示唆された。
【００５２】一方、連鎖解析により、例えば、ＭＪＤ遺伝子はヒト染色体１４ｑ24.3−32.1にマップされていることが判明している（ツジ（ Tsuji）ら，Nature Genetics,4, 300 (1993)参照のこと）。そこで、得られたクローン、ＣＡＧ−２７がＭＪＤに関係するか否かを確認するため、フィッシュ（Fish）法によるクロモゾームマッピングを試みたが、非特異性像が多く、明確な結果が得られなかった。
【００５３】以上の結果より、次のステップとしてこのクローンの遺伝子クローニングを行った。ＣＡＧ−２７のＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ断片をプローブに用い、ヒトジェノミックライブラリー（ＨＬ １０６７ｊおよびＨＬ １１１１ｊ，いずれもClontech社製））より 500,000クローンをスクリーニングし（スクリーニングは、温度が６５℃であることを除いて、実施例１のハイブリダイゼーションの条件と同様にして行った。）、１２個の陽性クローンを得た。これらのクローンのそれぞれをＸｈｏＩ／ＰｓｔＩで切断しサザンブロッティング分析を行い、最強シグナルを与える２クローン（それぞれ、ＣＡＧ−２７−６およびＣＡＧ−２７−１１と命名した。）をフィッシュ法によるクロモゾームマッピングに供した。
【００５４】その結果、ＣＡＧ−２７−６およびＣＡＧ−２７−１１はともに１４ｑ24.3−32.1にマップされていることが判明した。ふたつのクローンをＰｓｔＩで切断し、pBluescript ＳＫ（＋）にサブクローニングし、ハイブリダイゼーションの陽性だったクローンをシークエンスしたところ、いずれもＣＡＧ−２７の２８７から３７２ｂｐに相当する部分を含んでいた。一方、さらに 790,000個のヒト脳ｃＤＮＡライブラリーを、ＣＡＧ−２７のＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ II をプローブとして検索したところ、ＣＡＧ−２７以外に異なる２種類のｃＤＮＡ（ｃＤＮＡ−３およびｃＤＮＡ−６）が得られた。
【００５５】シークエンスの結果、ｃＤＮＡ−６はＣＡＧ−２７の塩基、１〜２８７および３７３〜９２４の部分と一致し、ｃＤＮＡ−３はＣＡＧ−２７の塩基、１〜２８７の部分と一致した。従って、この三者はそれぞれ同一遺伝子からのスプライシングスにより生み出される、３つのｍＲＮＡアイソフォームと考えられた。特に、塩基９２４位のスプライシングはＣＡＧリピートの直前であり、ＰＣＲにはイントロンの３′−側を用いなければならないことが明確に示された。図２にクローン、ＣＡＧ−２７、ＣＡＧ−２７−６、ＣＡＧ−２７−１１、ｃＤＮＡ−３およびｃＤＮＡ−６の構造を示す。
【００５６】ＣＡＧ−２７のＤｒａＩＩ／ＳａｃＩ断片（ＣＡＧリピートの最終部分からコードされている蛋白質のカルボキシル末端に相当）をプローブとしてヒトジェノミックライブラリーをスクリーニングし、 800,000個から４個の陽性クローンを得た（それぞれをＣＡＧ−２７−２１、ＣＡＧ−２７−２２、ＣＡＧ−２７−２３、ＣＡＧ−２７−２４と命名した。スクリーニングは、温度が６５℃であることを除いて、実施例１のハイブリダイゼーションの条件と同様にして行った。）。このうち、ＣＡＧ−２７−２３をシークエンスすることにより、ＣＡＧ−２７の９２４位の塩基（ＣＡＧリピートの直前の塩基）のイントロン構造が判明した（配列番号９参照）。ここでヒトジェノミッククローン中に得られたＣＡＧリピートは２７回であり、ｃＤＮＡ（ＣＡＧ−２７）の２６回とは異なっていることがわかった。
【００５７】ここで新たなＰＣＲプライマー（６）（配列番号１１）、（７）（配列番号１２）および（８）（配列番号１３）を作製した。
【００５８】５′−CCAGTGACTACTTTGATTCG−３′ （６）（ＣＡＧリピートの５′側、イントロン部分に存在）
【００５９】
５′−TGGCCTTTCACATGGATGTGAA−３′ （７）（ＣＡＧリピートの３′側）
【００６０】
５′−CTTACCTAGATCACTCCCAA−３′ （８）（ＣＡＧリピートの３′側）
【００６１】プライマー（６）とプライマー（７）を組み合わせた場合にも、ＰＣＲされる検体とされない検体がでたが、プライマー（６）とプライマー（８）を組み合わせた場合には全例成功した。サンプルＤＮＡ（遺伝子）２００ｎｇ、プライマー（６）およびプライマー（８）をそれぞれ２００ｎｇ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.8 ）、1.5 ｍＭ ＭｇＣｌ２、0.1 ％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）×１００、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、５ユニットＴａｑポリメラーゼ（和光純薬（株）製）を、総量２０μｌの系でＰＣＲを行った（ＰＣＲは９５℃、５分間→（９５℃、１分間→５７℃、１分間→７２℃、１分間）×２５サイクル→７２℃、１０分間の条件で行った。）。反応後、常法に従い、アガロース電気泳動をしたところ、正常人では１３回から３６回のＣＡＧリピートに相当するバンドが検出されたのに対し、ＭＪＤの患者（１１例）においては、いずれも７０回前後（６８回から７９回）のＣＡＧリピートが認められた。従って、この条件はＭＪＤの遺伝子診断に十分使用できることがわかった。
【００６２】
【配列表】
配列番号：１配列の長さ：２９１配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列Met Glu Ser Ile Phe His Glu Lys Gln Glu Gly Ser Leu Cys Ala Gln 1 5 10 15 His Cys Leu Asn Asn Leu Leu Gln Gly Glu Tyr Phe Ser Pro Val Glu 20 25 30 Leu Ser Ser Ile Ala His Gln Leu Asp Glu Glu Glu Arg Met Arg Met 35 40 45 Ala Glu Gly Gly Val Thr Ser Glu Asp Tyr Arg Thr Phe Leu Gln Gln 50 55 60 Pro Ser Gly Asn Met Asp Asp Ser Gly Phe Phe Ser Ile Gln Val Ile 65 70 75 80 Ser Asn Ala Leu Lys Val Trp Gly Leu Glu Leu Ile Leu Phe Asn Ser 85 90 95 Pro Glu Tyr Gln Arg Leu Arg Ile Asp Pro Ile Asn Glu Arg Ser Phe 100 105 110 Ile Cys Asn Tyr Lys Glu His Trp Phe Thr Val Arg Lys Leu Gly Lys 115 120 125 Gln Trp Phe Asn Leu Asn Ser Leu Leu Thr Gly Pro Glu Leu Ile Ser 130 135 140 Asp Thr Tyr Leu Ala Leu Phe Leu Ala Gln Leu Gln Gln Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Ser Ile Phe Val Val Lys Gly Asp Leu Pro Asp Cys Glu Ala Asp Gln 165 170 175 Leu Leu Gln Met Ile Arg Val Gln Gln Met His Arg Pro Lys Leu Ile 180 185 190 Gly Glu Glu Leu Ala Gln Leu Lys Glu Gln Arg Val His Lys Thr Asp 195 200 205 Leu Glu Arg Met Leu Glu Ala Asn Asp Gly Ser Gly Met Leu Asp Glu 210 215 220 Asp Glu Glu Asp Leu Gln Arg Ala Leu Ala Leu Ser Arg Gln Glu Ile 225 230 235 240 Asp Met Glu Asp Glu Glu Ala Asp Leu Arg Arg Ala Ile Gln Leu Ser 245 250 255 Met Gln Gly Ser Ser Arg Asn Ile Ser Gln Asp Met Thr Gln Thr Ser 260 265 270 Gly Thr Asn Leu Thr Ser Glu Glu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Ala Tyr 275 280 285 Phe Glu Lys 290
【００６３】配列番号：２配列の長さ：４３配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列Arg Asp Leu Ser Gly Gln Ser Ser His Pro Cys Glu Arg Pro Ala Thr 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ala Leu Gly Ser Asp Leu Gly Lys Ala Cys Ser Pro Phe 20 25 30 Ile Met Phe Ala Thr Phe Thr Leu Tyr Leu Thr 35 40
【００６４】配列番号：３配列の長さ：８７３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA配列ATGGAGTCCA TCTTCCACGA GAAACAAGAA GGCTCACTTT GTGCTCAACA TTGCCTGAAT 60AACTTATTGC AAGGAGAATA TTTTAGCCCT GTGGAATTAT CCTCAATTGC ACATCAGCTG 120GATGAGGAGG AGAGGATGAG AATGGCAGAA GGAGGAGTTA CTAGTGAAGA TTATCGCACG 180TTTTTACAGC AGCCTTCTGG AAATATGGAT GACAGTGGTT TTTTCTCTAT TCAGGTTATA 240AGCAATGCCT TGAAAGTTTG GGGTTTAGAA CTAATCCTGT TCAACAGTCC AGAGTATCAG 300AGGCTCAGGA TCGATCCTAT AAATGAAAGA TCATTTATAT GCAATTATAA GGAACACTGG 360TTTACAGTTA GAAAATTAGG AAAACAGTGG TTTAACTTGA ATTCTCTCTT GACGGGTCCA 420GAATTAATAT CAGATACATA TCTTGCACTT TTCTTGGCTC AATTACAACA GGAAGGTTAT 480TCTATATTTG TTGTTAAGGG TGATCTGCCA GATTGCGAAG CTGACCAACT CCTGCAGATG 540ATTAGGGTCC AACAGATGCA TCGACCAAAA CTTATTGGAG AAGAATTAGC ACAACTAAAA 600GAGCAAAGAG TCCATAAAAC AGACCTGGAA CGAATGTTAG AAGCAAATGA TGGCTCAGGA 660ATGTTAGACG AAGATGAGGA GGATTTGCAG AGGGCTCTGG CACTAAGTCG CCAAGAAATT 720GACATGGAAG ATGAGGAAGC AGATCTCCGC AGGGCTATTC AGCTAAGTAT GCAAGGTAGT 780TCCAGAAACA TATCTCAAGA TATGACACAG ACATCAGGTA CAAATCTTAC TTCAGAAGAG 840CTTCGGAAGA GACGAGAAGC CTACTTTGAA AAA 873
【００６５】配列番号：４配列の長さ：１２９配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA配列CGGGACCTAT CAGGACAGAG TTCACATCCA TGTGAAAGGC CAGCCACCAG TTCAGGAGCA 60CTTGGGAGTG ATCTAGGTAA GGCCTGCTCA CCATTCATCA TGTTCGCTAC CTTCACACTT 120TATCTGACA 129
【００６６】配列番号：５配列の長さ：９２５配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA配列GAATTCCGTT GCTGTCGTCG GCGTGGGGGC CGTTGGCTCC AGACAAATAA ACATGGAGTC 60CATCTTCCAC GAGAAACAAG AAGGCTCACT TTGTGCTCAA CATTGCCTGA ATAACTTATT 120GCAAGGAGAA TATTTTAGCC CTGTGGAATT ATCCTCAATT GCACATCAGC TGGATGAGGA 180GGAGAGGATG AGAATGGCAG AAGGAGGAGT TACTAGTGAA GATTATCGCA CGTTTTTACA 240GCAGCCTTCT GGAAATATGG ATGACAGTGG TTTTTTCTCT ATTCAGGTTA TAAGCAATGC 300CTTGAAAGTT TGGGGTTTAG AACTAATCCT GTTCAACAGT CCAGAGTATC AGAGGCTCAG 360GATCGATCCT ATAAATGAAA GATCATTTAT ATGCAATTAT AAGGAACACT GGTTTACAGT 420TAGAAAATTA GGAAAACAGT GGTTTAACTT GAATTCTCTC TTGACGGGTC CAGAATTAAT 480ATCAGATACA TATCTTGCAC TTTTCTTGGC TCAATTACAA CAGGAAGGTT ATTCTATATT 540TGTTGTTAAG GGTGATCTGC CAGATTGCGA AGCTGACCAA CTCCTGCAGA TGATTAGGGT 600CCAACAGATG CATCGACCAA AACTTATTGG AGAAGAATTA GCACAACTAA AAGAGCAAAG 660AGTCCATAAA ACAGACCTGG AACGAATGTT AGAAGCAAAT GATGGCTCAG GAATGTTAGA 720CGAAGATGAG GAGGATTTGC AGAGGGCTCT GGCACTAAGT CGCCAAGAAA TTGACATGGA 780AGATGAGGAA GCAGATCTCC GCAGGGCTAT TCAGCTAAGT ATGCAAGGTA GTTCCAGAAA 840CATATCTCAA GATATGACAC AGACATCAGG TACAAATCTT ACTTCAGAAG AGCTTCGGAA 900GAGACGAGAA GCCTACTTTG AAAAA 925
【００６７】配列番号：６配列の長さ：８０７配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA配列CGGGACCTAT CAGGACAGAG TTCACATCCA TGTGAAAGGC CAGCCACCAG TTCAGGAGCA 60CTTGGGAGTG ATCTAGGTAA GGCCTGCTCA CCATTCATCA TGTTCGCTAC CTTCACACTT 120TATCTGACAT AAGAGCTCCA TGTGATTTTT GCTTTACATT ATTCTTCATT CCCTCTTTAA 180TCATATTAAG ACTCTTAAGT AAATTTGTAA TCTACTAAAT TTCCCTGGAT TAAGGAGCAA 240GGTTACCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAG CTAGATGTGG TGGCTCACAT CTGTAATCCC 300AGCACTTTGG GAAACCAAGG CAGGAGAGGA TTGCTAGAAC ATTTAATGAA TACTTTAACA 360TAATAATTTA AACTTCACAG TAATTTGTAC AGTCTCCAGA AATTCCTTAG ACATCATGAA 420TATTTTTCTT TTTTTGGGGT GACAGGGCAA AACTCTGTCT CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 480AAAGGGCTGG ACACGGTGGC TTACGCCTGT TATCCCGGCA CTTTGGGAGG CCAAGGCCGA 540TGGATCACCT GAGGTCAGGA GTTCAAGACC AGCCTGGCCA ACATGGTGAA ACCCCATCTC 600TACTAAAAAT ACAAAAATTT GCTGGGCATG GTGGTGGGCA CCTGTAATCC CAGGAGGCTG 660AGGCAGGAGA ATCACTTGAA CCTGGGAGCG GAGATTGCAG TGAGCCAAGA TTGTGCCATT 720GAACTCCAGC CTGGGTGACA AGACCAAAAC TCCATCTCAA AAAAAAAAAA AAAAAAAGCG 780ACAGCAACGG CGACAGCAAC GGAATTC 807
【００６８】配列番号：７配列の長さ：１２９配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA配列CTTTTAATAC CAGTGACTAC TTTGATTCGT GAAACAATGT ATTTTCCTTA TGAATAGTTT 60TTCTCCATGG TGTATTTATT CTTTTAAGTT TTGTTTTTTA AATATACTTC ACCTTTTGAA 120TGTTTCAGA 129
【００６９】配列番号：８配列の長さ：７６配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA配列CGGGACCTAT CAGGACAGAG TTCACATCCA TGTGAAAGGC CAGCCACCAG TTCAGGAGCA 60CTTGGGAGTG ATCTAG 76
【００７０】配列番号：９配列の長さ：１２８配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列CTTTTAATAC CAGTGACTAC TTTGATTCGT GAAACAATGT ATTTTCCTTA TGAATAGTTT 60TTCTCCATGG TGTATTTATT CTTTTAAGTT TTGTTTTTTA AATATACTTC ACCTTTTGAA 120TGTTTCAG 128
【００７１】配列番号：１０配列の長さ：１２９配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA配列CGGGACCTAT CAGGACAGAG TTCACATCCA TGTGAAAGGC CAGCCACCAG TTCAGGAGCA 60CTTGGGAGTG ATCTAGGTAA GGCCTGCTCA CCATTCATCA TGTTCGCTAC CTTCACACTT 120TATCTGACA 129
【００７２】配列番号：１１配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列CCAGTGACTA CTTTGATTCG
【００７３】配列番号：１２配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列TGGCCTTTCA CATGGATGTG AA
【００７４】配列番号：１３配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列CTTACCTAGA TCACTCCCAA
【００７５】配列番号：１４配列の長さ：４４配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列GATCTCTGCT GCTGCTGCTG CTGCTGCTG CTGCTGCTG CTGG
【００７６】配列番号：１５配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列TCTTACTTCA GAAGAGCTTC GGAAG
【００７７】配列番号：１６配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列GCTGGCCTTT CACATGGATG TGAAC
【００７８】配列番号：１７配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列ACGAGAAGCC TACTTTGA
【００７９】配列番号：１８配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列AACTCTGTCC TGATAGGT
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＣＡＧ２７のシークエンス解析図を表わす。
【図２】 クローン、ＣＡＧ−２７、ＣＡＧ−２７−６、ＣＡＧ−２７−１１、ｃＤＮＡ−３およびｃＤＮＡ−６の構造を比較したものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 配列番号１で示されるアミノ酸配列のＣ末端のＬｙｓが（Ｇｌｎ）ｎ（式中、ｎは１３〜３６の整数を表わし、（Ｇｌｎ）ｎはその配列の途中に少なくとも一つのＬｙｓを含んでいてもよい。）を介して配列番号２で示されるアミノ酸配列のＮ末端のＡｒｇと結合したアミノ酸配列であるポリペプチド。
【請求項２】 配列番号１で示されるアミノ酸配列のＣ末端のＬｙｓが（Ｇｌｎ）ｎ（式中、ｎは１３〜３６の整数を表わし、（Ｇｌｎ）ｎはその配列の途中に少なくとも一つのＬｙｓを含んでいてもよい。）を介して配列番号２で示されるアミノ酸配列のＮ末端のＡｒｇと結合したアミノ酸配列であるポリペプチドをコードするｃＤＮＡ。
【請求項３】 配列番号３で示される塩基配列の３’末端が（ＣＸＸ）ｍ（式中、ＣＸＸは、塩基配列「ＣＡＧ」、「ＣＡＡ」または「ＡＡＧ」を表わし、ｍは１３〜３６の整数を表わす。ただし、「ＣＡＡ」および「ＡＡＧ」の数は各々０から５個である。）を介して配列番号４で示される塩基配列の５’末端と結合した塩基配列を有するｃＤＮＡ。
【請求項４】 配列番号５で示される塩基配列の３’末端が（ＣＸＸ）ｍ（式中、ＣＸＸおよびｍは請求項３の記載と同じ意味を表わす。）を介して配列番号６で示される塩基配列の５’末端と結合した塩基配列を有するｃＤＮＡ。
【請求項５】 配列番号７で示される塩基配列の３’末端が（ＣＸＸ）ｍ（式中、ＣＸＸおよびｍは請求項３の記載と同じ意味を表わす。）を介して配列番号８で示される塩基配列の５’末端と結合した塩基配列を有する遺伝子。
【請求項６】 請求項２乃至５のいずれかの項に記載のｃＤＮＡまたは遺伝子を含む複製または発現ベクター。
【請求項７】 請求項６に記載された複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項８】 配列番号１１および配列番号１３で示される塩基配列の組み合わせであるプライマーセット。
【請求項９】 請求項８記載のプライマーセットをＰＣＲのプライマーとして用いることを特徴とするマッカードジョセフ病特有蛋白中のグルタミンの繰り返し回数を測定する方法。
【請求項１０】 配列番号１で示されるアミノ酸配列のＣ末端のＬｙｓが（Ｇｌｎ）ｎ（式中、ｎは６８〜７９の整数を表わし、（Ｇｌｎ）ｎはその配列の途中に少なくとも一つのＬｙｓを含んでいてもよい。）を介して配列番号２で示されるアミノ酸配列のＮ末端のＡｒｇと結合したアミノ酸配列であるポリペプチド。
【請求項１１】 配列番号１で示されるアミノ酸配列のＣ末端のＬｙｓが（Ｇｌｎ）ｎ（式中、ｎは６８〜７９の整数を表わし、（Ｇｌｎ）ｎはその配列の途中に少なくとも一つのＬｙｓを含んでいてもよい。）を介して配列番号２で示されるアミノ酸配列のＮ末端のＡｒｇと結合したアミノ酸配列であるポリペプチドをコードするｃＤＮＡ。
【請求項１２】 配列番号３で示される塩基配列の３’末端が（ＣＸＸ）ｍ（式中、ＣＸＸは、塩基配列「ＣＡＧ」、「ＣＡＡ」または「ＡＡＧ」を表わし、ｍは６８〜７９の整数を表わす。ただし、「ＣＡＡ」および「ＡＡＧ」の数は各々０から５個である。）を介して配列番号４で示される塩基配列の５’末端と結合した塩基配列を有するｃＤＮＡ。
【請求項１３】 配列番号５で示される塩基配列の３’末端が（ＣＸＸ）ｍ（式中、ＣＸＸおよびｍは請求項１２の記載と同じ意味を表わす。）を介して配列番号６で示される塩基配列の５’末端と結合した塩基配列を有するｃＤＮＡ。
【請求項１４】 配列番号７で示される塩基配列の３’末端が（ＣＸＸ）ｍ（式中、ＣＸＸおよびｍは請求項１２の記載と同じ意味を表わす。）を介して配列番号８で示される塩基配列の５’末端と結合した塩基配列を有する遺伝子。
【請求項１５】 マッカード−ジョセフ病関連蛋白のＮ末端部の２９１個のアミノ酸である配列番号１で示される配列であるアミノ酸配列。
【請求項１６】 請求項１５で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項１７】 請求項１６で示されるｃＤＮＡが、配列番号３で示される配列であるｃＤＮＡ。
【請求項１】 配列番号１で示されるアミノ酸配列のＣ末端のＬｙｓが（Ｇｌｎ）ｎ（式中、ｎは１３〜３６の整数を表わし、（Ｇｌｎ）ｎはその配列の途中に少なくとも一つのＬｙｓを含んでいてもよい。）を介して配列番号２で示されるアミノ酸配列のＮ末端のＡｒｇと結合したアミノ酸配列であるポリペプチド。
【請求項２】 配列番号１で示されるアミノ酸配列のＣ末端のＬｙｓが（Ｇｌｎ）ｎ（式中、ｎは１３〜３６の整数を表わし、（Ｇｌｎ）ｎはその配列の途中に少なくとも一つのＬｙｓを含んでいてもよい。）を介して配列番号２で示されるアミノ酸配列のＮ末端のＡｒｇと結合したアミノ酸配列であるポリペプチドをコードするｃＤＮＡ。
【請求項３】 配列番号３で示される塩基配列の３’末端が（ＣＸＸ）ｍ（式中、ＣＸＸは、塩基配列「ＣＡＧ」、「ＣＡＡ」または「ＡＡＧ」を表わし、ｍは１３〜３６の整数を表わす。ただし、「ＣＡＡ」および「ＡＡＧ」の数は各々０から５個である。）を介して配列番号４で示される塩基配列の５’末端と結合した塩基配列を有するｃＤＮＡ。
【請求項４】 配列番号５で示される塩基配列の３’末端が（ＣＸＸ）ｍ（式中、ＣＸＸおよびｍは請求項３の記載と同じ意味を表わす。）を介して配列番号６で示される塩基配列の５’末端と結合した塩基配列を有するｃＤＮＡ。
【請求項５】 配列番号７で示される塩基配列の３’末端が（ＣＸＸ）ｍ（式中、ＣＸＸおよびｍは請求項３の記載と同じ意味を表わす。）を介して配列番号８で示される塩基配列の５’末端と結合した塩基配列を有する遺伝子。
【請求項６】 請求項２乃至５のいずれかの項に記載のｃＤＮＡまたは遺伝子を含む複製または発現ベクター。
【請求項７】 請求項６に記載された複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項８】 配列番号１１および配列番号１３で示される塩基配列の組み合わせであるプライマーセット。
【請求項９】 請求項８記載のプライマーセットをＰＣＲのプライマーとして用いることを特徴とするマッカードジョセフ病特有蛋白中のグルタミンの繰り返し回数を測定する方法。
【請求項１０】 配列番号１で示されるアミノ酸配列のＣ末端のＬｙｓが（Ｇｌｎ）ｎ（式中、ｎは６８〜７９の整数を表わし、（Ｇｌｎ）ｎはその配列の途中に少なくとも一つのＬｙｓを含んでいてもよい。）を介して配列番号２で示されるアミノ酸配列のＮ末端のＡｒｇと結合したアミノ酸配列であるポリペプチド。
【請求項１１】 配列番号１で示されるアミノ酸配列のＣ末端のＬｙｓが（Ｇｌｎ）ｎ（式中、ｎは６８〜７９の整数を表わし、（Ｇｌｎ）ｎはその配列の途中に少なくとも一つのＬｙｓを含んでいてもよい。）を介して配列番号２で示されるアミノ酸配列のＮ末端のＡｒｇと結合したアミノ酸配列であるポリペプチドをコードするｃＤＮＡ。
【請求項１２】 配列番号３で示される塩基配列の３’末端が（ＣＸＸ）ｍ（式中、ＣＸＸは、塩基配列「ＣＡＧ」、「ＣＡＡ」または「ＡＡＧ」を表わし、ｍは６８〜７９の整数を表わす。ただし、「ＣＡＡ」および「ＡＡＧ」の数は各々０から５個である。）を介して配列番号４で示される塩基配列の５’末端と結合した塩基配列を有するｃＤＮＡ。
【請求項１３】 配列番号５で示される塩基配列の３’末端が（ＣＸＸ）ｍ（式中、ＣＸＸおよびｍは請求項１２の記載と同じ意味を表わす。）を介して配列番号６で示される塩基配列の５’末端と結合した塩基配列を有するｃＤＮＡ。
【請求項１４】 配列番号７で示される塩基配列の３’末端が（ＣＸＸ）ｍ（式中、ＣＸＸおよびｍは請求項１２の記載と同じ意味を表わす。）を介して配列番号８で示される塩基配列の５’末端と結合した塩基配列を有する遺伝子。
【請求項１５】 マッカード−ジョセフ病関連蛋白のＮ末端部の２９１個のアミノ酸である配列番号１で示される配列であるアミノ酸配列。
【請求項１６】 請求項１５で示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項１７】 請求項１６で示されるｃＤＮＡが、配列番号３で示される配列であるｃＤＮＡ。
【図１】
【図２】
【図２】
【特許番号】特許第３５１７９８８号（Ｐ３５１７９８８）
【登録日】平成１６年２月６日（２００４．２．６）
【発行日】平成１６年４月１２日（２００４．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願平６−２５１６００
【出願日】平成６年９月２１日（１９９４．９．２１）
【公開番号】特開平８−９２２８９
【公開日】平成８年４月９日（１９９６．４．９）
【審査請求日】平成１２年３月２２日（２０００．３．２２）
【出願人】（０００１８５９８３）小野薬品工業株式会社 (180)
【登録日】平成１６年２月６日（２００４．２．６）
【発行日】平成１６年４月１２日（２００４．４．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成６年９月２１日（１９９４．９．２１）
【公開番号】特開平８−９２２８９
【公開日】平成８年４月９日（１９９６．４．９）
【審査請求日】平成１２年３月２２日（２０００．３．２２）
【出願人】（０００１８５９８３）小野薬品工業株式会社 (180)
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