ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体
【課題】ヒト化抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体、それらの選別基準、ならびにそれにより選別された、医薬として好適な生物学的活性を示すヒト化抗体の提供。
【解決手段】ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４３、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４４、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４５およびＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４６を有する細胞からなる群より選択される細胞を培養することにより得ることのできる、ヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性を有するヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体。
【解決手段】ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４３、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４４、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４５およびＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４６を有する細胞からなる群より選択される細胞を培養することにより得ることのできる、ヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性を有するヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ２０はヒトＢリンパ細胞表面に発現している糖鎖不含タンパク質で、末梢血、脾臓、扁桃、骨髄中の正常Ｂ細胞に加えて、多くの悪性腫瘍Ｂ細胞に発現している。ＣＤ２０のモノクローナル抗体が結合するエピトープは多様性が非常に高く、多様な生物学的応答が報告され、また、ＣＤ２０を認識するモノクローナル抗体が多数報告されている。とりわけ、リツキシマブ（rituximab）は、ヒトＢ細胞であるＳＢ細胞株を免疫して得られるマウス抗体２Ｂ８から由来するキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体（Ｃ２Ｂ８)であり（特許文献１および２参照）、登録商標リツキサン（Rituxan）の名称で低悪性度非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の治療薬として実用化されている。さらにその後、リツキサンはＢ細胞が関与する多くの免疫疾患に対して有効であること、例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）などの悪性腫瘍、自己免疫溶血性貧血症、特発性血小板減少症紫斑病（ＩＴＰ）などの病原性自己抗体が関与している自己免疫疾患、関節リウマチ（ＲＡ）や多発性硬化症（ＭＳ）のような炎症性疾患に対して有効であることが報告されている（非特許文献１〜４参照）。
リンパ系Ｂ細胞に結合したリツキシマブにヒト補体が結合し、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）によりリンパ系Ｂ細胞系を溶解することが報告されており（非特許文献５参照）、またリツキシマブは抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）のアッセイでは活性を示し、トリチウム化チミジン導入アッセイでは抗増殖効果と、アポトーシス誘発が報告されている（非特許文献６参照）。
一方、異種動物とのキメラ分子は抗原性を有するため治療薬として一般には好まれないが、リツキシマブを含め、抗ＣＤ２０抗体は正常細胞を含む全てのＢ細胞を標的し除去する性質を有するため抗原性はないと考えられた。しかし、数パーセントではあるが治療期間中に中和抗体を誘起する事例が報告されていること、投与する量や期間によってはさらにその可能性が高まることや、治療対象疾患がＢ細胞リンパ腫から、ＲＡ、ＩＴ、ＭＳに拡大していくなかで抗原性の問題がクローズアップされ、最近、よりヒトに近い配列を有するヒト化抗体またはヒト抗体が要望されるようになっている。
さらに、キメラ抗体は、血中半減期が比較的短い問題を有し、リツキシマブを含めマウス／ヒトのキメラ抗体のベータ半減期（β１／２）は３〜４日に過ぎず、リツキシマブの低悪性度ＮＨＬに対する臨床試験の奏効率は５０％弱であったことが報告されている（非特許文献７参照）。また、リツキシマブのＣＤ２０抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）は５．２ｎＭであり、結合親和性があまり高くなく、ＮＨＬ治療において投与量が多くなる問題もある（非特許文献８参照)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第９４／１１０２６号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５７３６１３７号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Coiffier B et al., Blood 1998; 92:1297-32
【非特許文献２】Edward JC et al., Rheumatology (Oxford) 2001; 40:205-11
【非特許文献３】Zaja F et al., Heamatologica 2002; 87:189-95
【非特許文献４】Perrotta S et al., Br J Haematol 2002; 116:465-7
【非特許文献５】Reff et al., Blood 1994; 83: 435-445
【非特許文献６】Maloney et al., Blood 1996; 88: 637a
【非特許文献７】IDEC Pharmaceuticals Corporation News Release, December 8, 1998
【非特許文献８】Mitchell ER et al., Blood 1994; 82:435-445
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のような事情に鑑み、本発明は、医薬としてさらに適した生物学的活性を示す抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記目的を達成するため、自然の状態のヒトＣＤ２０分子に対する結合親和性の高いモノクローナル抗体を作製し、優れた機能を有する抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を得るべく鋭意研究を重ねた。その結果、免疫原としてＣＤ２０抗原が高密度とされるＢ細胞株であるＳＢ細胞やRaji細胞と、遺伝子組換により細胞膜上にＣＤ２０を多量に発現させた非ヒト動物細胞を組み合わせて用いることにより、高親和性のモノクローナル抗体であって、優れた生物学活性を示すものが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
さらに本発明者らは、有効な抗ヒトＣＤ２０ヒト化抗体の新たな選抜方法を見出すことに成功した。この選抜方法を用いることにより、本発明のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体のなかから医薬品として有効に使用できるものを選抜することができた。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下のものを提供する：
（１）ヒトＣＤ２０抗原を発現しているヒトＢ細胞株と、ヒトＣＤ２０のＤＮＡで形質転換された非ヒトかつ被免疫動物とは異なる動物由来の細胞株とを免疫原とするヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性を有する、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であって、下記選抜基準：
（ｉ）ヒトＣＤ２０抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）が約９．５ｎＭ未満であって、Ｂ細胞に対するＣＤＣ活性が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体
を満たすヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、
（２）ヒトＣＤ２０抗原を発現しているヒトＢ細胞株と、ヒトＣＤ２０のＤＮＡで形質転換された非ヒトかつ被免疫動物とは異なる動物由来の細胞株とを免疫原とするヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性を有する、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であって、下記選抜基準：
（ａ）ヒトＣＤ２０抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）が約９．５ｎＭ未満であって、Ｒａｊｉ細胞（浮遊細胞）またはＳＵ−ＤＨＬ４細胞に対するＣＤＣ活性が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体
を満たすヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、
（３）ヒトＣＤ２０抗原を発現しているヒトＢ細胞株と、ヒトＣＤ２０のＤＮＡで形質転換された非ヒトかつ被免疫動物とは異なる動物由来の細胞株とを免疫原とするヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性を有する、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であって、下記選抜基準：
（ｉｉ）ヒトＣＤ２０抗原に対するＫｄ値が約９．５ｎＭから約１３ｎＭの範囲であって、Ｂ細胞に対するアポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体
を満たすヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、
（４）ヒトＣＤ２０抗原を発現しているヒトＢ細胞株と、ヒトＣＤ２０のＤＮＡで形質転換された非ヒトかつ被免疫動物とは異なる動物由来の細胞株とを免疫原とするヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性を有する、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であって、下記選抜基準：
（ｂ）ヒトＣＤ２０抗原に対するＫｄ値が約９．５ｎＭから約１３ｎＭの範囲であって、ＷｉＬ２細胞またはＲＣＫ８細胞に対するアポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体
を満たすヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、
（５）配列番号１８のＬ鎖と配列番号２２のＨ鎖を組み合わせた（１）または（２）記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、
（６）配列番号１８のＬ鎖と配列番号２４のＨ鎖を組み合わせた（１）または（２）記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、
（７）配列番号１９のＬ鎖と配列番号２２のＨ鎖を組み合わせた（３）または（４）記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、ならびに
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を有効成分として含むＢ細胞関連疾患治療剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、ＣＤ２０抗原の細胞外エピトープに対して強い結合親和性を示し、かつＣＤＣなどの細胞傷害活性が高いヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体が得られ、これらの抗体は、Ｂ細胞が関与する疾患の治療剤として極めて有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】組換抗体発現用ベクターpNOW-Abの構造を示す制限地図である。
【図２】タンパク発現用ベクターpNOWの構造を示す制限地図である。
【図３ａ】アポトーシス試験の結果を示すグラフである。
【図３ｂ】アポトーシス試験の結果を示すグラフである。
【図３ｃ】アポトーシス試験の結果を示すグラフである。
【図３ｄ】アポトーシス試験の結果を示すグラフである。
【図４ａ】抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。
【図４ｂ】抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。
【図４ｃ】抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。
【図４ｄ】抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。
【図５ａ】Ｅ：Ｔ比とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。
【図５ｂ】Ｅ：Ｔ比とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。
【図５ｃ】Ｅ：Ｔ比とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。
【図５ｄ】Ｅ：Ｔ比とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。
【図６ａ】ＣＤＣ試験の結果を示すグラフである。
【図６ｂ】ＣＤＣ試験の結果を示すグラフである。
【図６ｃ】ＣＤＣ試験の結果を示すグラフである。
【図６ｄ】ＣＤＣ試験の結果を示すグラフである。
【図７ａ】マウス抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
【図７ｂ】マウス抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
【図７ｃ】マウス抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
【図７ｄ】マウス抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
【図８ａ】ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
【図８ｂ】ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
【図８ｃ】ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
【図８ｄ】ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
【図９ａ】ヒト化抗体での早期アポトーシスに対する割合を示すグラフである。
【図９ｂ】ヒト化抗体での早期アポトーシスに対する割合を示すグラフである。
【図９ｃ】ヒト化抗体での早期アポトーシスに対する割合を示すグラフである。
【図９ｄ】ヒト化抗体での早期アポトーシスに対する割合を示すグラフである。
【図１０ａ】ヒト化抗体の解離定数および細胞障害活性（アポトーシス誘導活性およびＣＤＣ活性）の関係を示すグラフである。使用細胞はＲａｊｉ細胞である。白四角はＣＤＣ活性（％）、黒丸はアポトーシス活性（％）を示す。
【図１０ｂ】ヒト化抗体の解離定数および細胞障害活性（アポトーシス誘導活性およびＣＤＣ活性）の関係を示すグラフである。使用細胞はＳＵ−ＤＨＬ４細胞である。白四角はＣＤＣ活性（％）、黒丸はアポトーシス活性（％）を示す。
【図１０ｃ】ヒト化抗体の解離定数および細胞障害活性（アポトーシス誘導活性およびＣＤＣ活性）の関係を示すグラフである。使用細胞はＷｉＬ２細胞である。白四角はＣＤＣ活性（％）、黒丸はアポトーシス活性（％）を示す。
【図１０ｄ】ヒト化抗体の解離定数および細胞障害活性（アポトーシス誘導活性およびＣＤＣ活性）の関係を示すグラフである。使用細胞はＲＣ−Ｋ８である。白四角はＣＤＣ活性（％）、黒丸はアポトーシス活性（％）を示す。
【図１１ａ】ヒト化抗体およびキメラ抗体のＣＤＣ活性を示すグラフである。使用細胞はＲａｊｉ細胞である。
【図１１ｂ】ヒト化抗体およびキメラ抗体のＣＤＣ活性を示すグラフである。使用細胞はＳＵ−ＤＨＬ４細胞である。
【図１１ｃ】ヒト化抗体およびキメラ抗体のＣＤＣ活性を示すグラフである。使用細胞はＷｉＬ２細胞である。
【図１１ｄ】ヒト化抗体およびキメラ抗体のＣＤＣ活性を示すグラフである。使用細胞はＲＣ−Ｋ８である。
【図１２ａ】ヒト化抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。使用細胞はＲａｊｉ細胞である。
【図１２ｂ】ヒト化抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。使用細胞はＳＵ−ＤＨＬ４細胞である。
【図１２ｃ】ヒト化抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。使用細胞はＷｉＬ２細胞である。
【図１２ｄ】ヒト化抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。使用細胞はＲＣ−Ｋ８細胞である。
【図１３ａ】ヒト化抗体のＥ：Ｔ比とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。使用細胞はＲａｊｉ細胞である。
【図１３ｂ】ヒト化抗体のＥ：Ｔ比とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。使用細胞はＳＵ−ＤＨＬ４細胞である。
【図１３ｃ】ヒト化抗体のＥ：Ｔ比とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。使用細胞はＷｉＬ２細胞である。
【図１３ｄ】ヒト化抗体のＥ：Ｔ比とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。使用細胞はＲＣ−Ｋ８細胞である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書および図面において用いる略号を以下に示す。
Pcmv: サイトメガロウイルスプロモーター
PAbgh: ウシ成長ホルモン遺伝子ポリＡ付加シグナル
Psvd: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター
DHFR: マウスジヒドロ葉酸還元酵素ｃＤＮＡ
PAsv: シミアンウイルス４０ポリＡ付加シグナル
PBR322ori: 大腸菌中での複製起点
Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）
Neor: 哺乳動物細胞中での選択マーカー（Ｇ４１８耐性）
INrbg: ウサギβグロビンイントロン
SPl: 抗体軽鎖シグナルペプチド
VL: 抗体軽鎖可変領域ｃＤＮＡ
Cκ: 抗体κ軽鎖定常領域ｃＤＮＡ
SPh: 抗体軽鎖シグナルペプチド
Vh: 抗体軽鎖可変領域ｃＤＮＡ
Cγ1: 抗体γ1重鎖定常領域ｃＤＮＡ
【００１２】
本明細書において、「抗体」には、抗体全体のみならず、抗体全体と同等の、抗原に対する結合親和性を示すフラグメント、例えば、元の抗体全体の可変領域を含むフラグメント（例、Fab、F(ab’)2など）も包含する。
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＣＤ２０抗原に対し高い親和性を有し、かつ、優れた生物学的活性を示すモノクローナル抗体であり、マウス由来のモノクローナル抗体、そのキメラ化、ヒト化抗体を包含する。
その好ましい第１の態様は、ヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対して増殖阻害活性を有し、ヒトＣＤ２０抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）が、リツキシマブの由来するマウス抗体である２Ｂ８の１／２以下の、好ましくは１．７０〜３．３９ｎＭの、ヒトＣＤ２０抗原に対して高い親和性を有するモノクローナル抗体である。
解離定数（Ｋｄ値）の測定方法は、細胞上に発現する抗原に対するＫｄ値を測定できる方法であれば特に限定するものではないが、本明細書においては、後の実施例に記載する方法による解離定数とする。
【００１３】
ヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性は２Ｂ８よりも大きいことが好ましい。増殖阻害活性は、好ましくは、末梢血単核細胞非存在下でのヒトＣＤ２０抗原を有する細胞のin vitro培養に対する増殖阻害活性であり、さらに好ましくは、増殖阻害活性はアポトーシス誘導によるものである。抗ＣＤ２０抗体のうちいくつかの抗体では、ＣＤ２０への結合に伴いＢ細胞内のカルシウムイオン（Ｃａ２＋）濃度を上昇させＳｒｃキナーゼが関与するアポトーシスを誘導することが報告されている。
上記の増殖阻害活性の測定は、例えば、Miyamoto T, Min W, Lillehoj HS.Avian Dis. 2002 Jan-Mar;46(1):10-6に記載の方法により測定できる。
【００１４】
本発明の第１の態様のモノクローナル抗体の具体的な例としては、Ｌ鎖可変領域アミノ酸配列とＨ鎖可変領域アミノ酸配列がそれぞれ配列番号１及び９、配列番号２及び１０、又は、配列番号３及び１１であるマウスを由来とするモノクローナル抗体と、それらの抗体をキメラ化又はヒト化したものが挙げられる。
キメラ化は、例えば、Ishida T, Imai K, Nippon Rinsho Vol 60, No 3, 2002-3:439-444に記載されるような公知の方法に従って、マウス由来モノクローナル抗体の可変領域アミノ酸配列とヒトイムノグロブリン定常領域アミノ酸配列を融合させることにより行うことができる。
ヒト化は、例えば、上記Ishida T, Imai K, Nippon Rinsho Vol 60, No 3, 2002-3:439-444や、Eduardo A.Padlan, Molecular Immunology, Vol. 28-4/5, pp489-498, 1991； Eduardo A.Padlan et.al., The FASEB Journal,vol.9, pp133-139;およびTai te Wu, Elvin A. Kabat, Molecular Immunology, Vol.29-9, pp1141-1146, 1992に記載されるような公知の方法に従って、マウス由来モノクローナル抗体の可変領域ＣＤＲアミノ酸配列とヒトイムノグロブリンのアミノ酸配列を用いて行うことができる。
キメラ化又はヒト化を行う場合には、複数のマウスモノクローナル抗体のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列と、Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列を任意に組み合わせてもよい。例えば、配列番号１〜３のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域アミノ酸配列をキメラ化したＬ鎖と配列番号９〜１１のマウス由来モノクローナル抗体可変領域アミノ酸配列をキメラ化したＨ鎖を組み合わせたキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、配列番号１〜３のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域ＣＤＲのアミノ酸配列をヒト化したＬ鎖と配列番号９〜１１のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域ＣＤＲ配列をヒト化したＨ鎖を組み合わせたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体が挙げられる。
【００１５】
本発明の好ましい第２の態様の抗体は、ヒトＣＤ２０抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）が２Ｂ８の１／８以下であるマウス由来モノクローナル抗体をキメラ化またはヒト化したモノクローナル抗体である。
ヒトＣＤ２０抗原に対し高い親和性を有する抗体で、特にヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３、又はそれらを改変したヒトFc配列を有する抗体（マウス由来モノクローナル抗体をキメラ化又はヒト化したものを含む）は、細胞表面上のＣＤ２０に結合した場合、ＮＫ細胞上のFcγRIII（ＣＤ１６）を介したエフェクター細胞の活性化を誘発し、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を起こすことがよく知られている。また、ヒトＣＤ２０抗原に対し高い親和性を有する抗体で、特にヒトＩｇＧ又はＩｇＭ、又はそれらを改変したヒトFc配列を有する抗体（マウス由来モノクローナル抗体をキメラ化又はヒト化したものを含む）は、細胞表面上のＣＤ２０に結合した場合、補体の活性化を誘発し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を起こすこともよく知られている。
かくして、本発明の第２の態様の抗体は、ＡＤＣＣ又はＣＤＣを示すことが期待できる。
第２の態様の抗体の具体的な例としては、Ｌ鎖可変領域アミノ酸配列とＨ鎖可変領域アミノ酸配列がそれぞれ配列番号４及び１２、配列番号５及び１３、配列番号６及び１４、配列番号７及び１５、又は、配列番号８及び１６であるものが挙げられる。
キメラ化又はヒト化は、第１の態様の抗体と同様に行うことができ、その場合、複数のマウスモノクローナル抗体のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列と、Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列を任意に組み合わせてもよい。例えば、配列番号４〜８のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域アミノ酸配列をキメラ化したＬ鎖と配列番号１２〜１６のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域アミノ酸配列をキメラ化したＨ鎖を組み合わせたキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、配列番号４〜８のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域ＣＤＲのアミノ酸配列をヒト化したＬ鎖と配列番号１２〜１６のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域ＣＤＲ配列をヒト化したＨ鎖を組み合わせたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体が挙げられる。
【００１６】
本発明の好ましい第３の態様の抗体は、リツキシマブが効果を示さない細胞に対しても有効なヒト化したモノクローナル抗体を包含する、２Ｂ８に対する特定の解離定数に限定されない一群のヒト化抗体である。
これらの抗体の例としては、配列番号１８のＬ鎖と配列番号２４のＨ鎖、配列番号１８のＬ鎖と配列番号２２のＨ鎖、配列番号１９のＬ鎖と配列番号２２のＨ鎖または配列番号１９のＬ鎖と配列番号２３のＨ鎖を組み合わせたヒト化ＣＤ２０モノクローナル抗体が挙げられる。
【００１７】
さらに本発明者らは、本発明により得られたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体について、抗体のヒトＣＤ２０抗原に対する親和性とＣＤＣ活性、アポトーシス誘導活性との相関に基づいて抗体のタイプを分類し、その分類に基づいて抗体医薬品として有用なモノクローナル抗体を選抜することができた（実施例４参照）。
【００１８】
すなわち、親和性が高い抗体は、それ自身でアポトーシスを誘導することができず、アポトーシスの誘導に二次抗体によるクロスリンクが必要であること、一方、親和性が低い抗体は、それ自身でアポトーシス誘導活性を発揮することがわかった。さらに、親和性が高い抗体ほどＣＤＣ活性も高いケースが多いこともわかった。それゆえ、親和性の低い抗体は、二次抗体が存在しなくてもアポトーシスを誘導できるが、ＣＤＣ活性が低い傾向を有する。したがって、これらの知見から、医薬品として有効な候補抗体を見出すことができる、２つの選抜基準を設定することができた：
−単独ではアポトーシスを誘導しないが、ヒトＣＤ２０抗原に対する親和性が極めて高く、ＣＤＣにより抗ガン効果を発揮しうる抗体；あるいは
−単独でアポトーシス誘導活性を持ち、アポトーシスとＣＤＣにより抗ガン効果を発揮しうる抗体のうち、ヒトＣＤ２０抗原に対する親和性が高いもの。
【００１９】
前者の選抜基準では、ヒトＣＤ２０抗原に対する親和性が高く、かつＣＤＣ活性も高いものを選抜することが好ましい（Ｋｄ値が低いほどＣＤＣ活性が高い傾向が見られる）。前者の選抜基準を満たすクローンの場合には、単独でアポトーシス誘導は引き起こさないが、親和性が高いという利点を有し、高いＣＤＣ活性により細胞枯渇を促すことができる。本発明者らは、前者の選抜基準を満たす抗体は、約９．５ｎＭ未満のヒトＣＤ２０抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）を有するものが多いことを見出した。
【００２０】
後者の選抜基準では、抗体によるアポトーシスとＣＤＣの総和が大きく、かつ、ヒトＣＤ２０抗原に対する親和性が高いものを選抜することが好ましい。したがって、後者の選抜基準を満たすクローンの場合には、親和性は高くないが、アポトーシス活性が高いという利点を有し、アポトーシス誘導とＣＤＣの相乗効果により細胞枯渇を促すことができる。本発明者らは、後者の選抜基準を満たす抗体は、約９．５ｎＭから約１３ｎＭの範囲のヒトＣＤ２０抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）を有するものが多いことを見出した。
【００２１】
上記選抜基準を数値的に表現することが好ましい。したがって、上記選抜基準は各々次のように表現することができる：
（ｉ）ヒトＣＤ２０抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）が約９．５ｎＭ未満であって、Ｂ細胞に対するＣＤＣ活性が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体；あるいは
（ｉｉ）ヒトＣＤ２０抗原に対するＫｄ値が約９．５ｎＭから約１３ｎＭの範囲であって、Ｂ細胞に対するアポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体。
ここに、同等とは、比較すべき値の±約１０％の範囲の値を意味する。
【００２２】
本発明者らはさらに実験を行って、Ｂ細胞の種類に応じて上記選抜基準を適用することが好ましいことを見出した。具体的には後記実施例４で得られた結果をふまえて、上記選抜基準（ｉ）を（ａ）のように、（ｉｉ）を（ｂ）のように、各々、さらに詳細に表現することができる：
（ａ）ヒトＣＤ２０抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）が約９．５ｎＭ未満であって、Ｒａｊｉ細胞（浮遊細胞）またはＳＵ−ＤＨＬ４細胞に対するＣＤＣ活性が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体；あるいは
（ｂ）ヒトＣＤ２０抗原に対するＫｄ値が約９．５ｎＭから約１３ｎＭの範囲であって、ＷｉＬ２細胞またはＲＣＫ８細胞に対するアポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体。
ここに、同等とは、比較すべき値の±約１０％の範囲の値を意味する。
【００２３】
上記（ｉ）または（ａ）の選抜基準に従う場合には、ヒトＣＤ２０抗原に対するＫｄ値が約９．５ｎＭ未満であって、できるだけＫｄ値が低く、かつ、ＣＤＣ活性の高い抗体を選抜することが好ましい。好ましくは、Ｒａｊｉ細胞（浮遊細胞）またはＤＨＬ４細胞に対するＣＤＣ活性が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体を選択する。通常は、Ｋｄ値の小さい抗体ほどＣＤＣ活性が高い傾向があるので、単にＫｄ値の小さい（ＣＤ２０抗原に対する親和性が高い）抗体を選抜すればよい。（ｉ）または（ａ）の選抜基準を満たす抗体は、ＣＤ２０抗原に対する親和性が極めて高く、ＣＤＣ活性も極めて高いので、優れた抗ガン効果を発揮することができる。ただし、（ｉ）または（ａ）の選抜基準を満たす抗体は、単独ではアポトーシスを誘導せず、アポトーシスの誘導には二次抗体を必要とする。
【００２４】
上記（ｉｉ）または（ｂ）の選抜基準に従う場合には、ヒトＣＤ２０抗原に対するＫｄ値が約９．５ｎＭから約１３ｎＭの範囲であって、できるだけアポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和が大きく、かつ、Ｋｄ値が小さい抗体を選抜することが好ましい。好ましくは、ＷｉＬ２細胞またはＲＣＫ８細胞に対するＣＤＣ活性とアポトーシス活性の総和が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上のものを選抜する。（ｉｉ）または（ｂ）の選抜基準を満たす抗体は、ＣＤ２０抗原に対する親和性がある程度高く、単独でアポトーシスを誘導でき、アポトーシスとＣＤＣの相乗効果により優れた抗ガン効果を発揮することができる。好ましくは、アポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上のものを選抜する。
【００２５】
換言すれば、（ｉ）または（ａ）の選抜基準は、抗体が極めて高いＣＤＣ活性を有することを期待する場合に適用することができ、（ｉｉ）または（ｂ）の選抜基準は、抗体がＣＤＣ活性とアポトーシス活性の両方を有することを期待する場合に適用することができる。
【００２６】
本発明により得られたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であって、上記選抜基準（ｉ）または（ａ）を満たす抗体としては、配列番号１８のＬ鎖と配列番号２２のＨ鎖を組み合わせたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、ならびに配列番号１８のＬ鎖と配列番号２４のＨ鎖を組み合わせたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体が例示される。
本発明により得られたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であって、上記選抜基準（ｉｉ）または（ｂ）を満たす抗体としては、配列番号１９のＬ鎖と配列番号２２のＨ鎖を組み合わせたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体が例示される。
【００２７】
また、本発明の抗体とは異なるエピトープを認識する抗体、例えば、本発明以外の方法により得られた抗体についても、本発明の選抜に関する考え方を適用し、選抜することが可能である。したがって、本発明は、さらなる態様において、下記選抜基準：
−単独ではアポトーシスを誘導しないが、抗原に対する親和性が極めて高く、ＣＤＣにより抗ガン効果を発揮しうる抗体；あるいは
−単独でアポトーシス誘導活性を持ち、アポトーシスとＣＤＣにより抗ガン効果を発揮しうる抗体のうち、抗原に対する親和性が高いもの
を用いることを特徴とする抗ガン抗体の選抜方法、ならびに該方法により選抜された抗体にも関する。
【００２８】
選抜基準（ｉ）または（ａ）、あるいは（ｉｉ）または（ｂ）を適用する際の、抗原に対する親和性、アポトーシス活性およびＣＤＣ活性の測定は、当該分野で知られているいずれの手法を用いて行ってもよい。抗原に対する親和性に関しては、抗原との解離定数を測定し、これを指標とするのが一般的である。ヒトＣＤ２０抗原に対するヒト化抗体の解離定数の測定は、ヒトＣＤ２０抗原を発現している細胞を標的として使用して行うのが一般的である。その際、ヒトＣＤ２０抗原を発現していない細胞をコントロールとして用いることが好ましい。細胞に結合したヒト化抗体の検出には、ヒト化抗体に検出可能な標識を付す、あるいはヒト化抗体に対する標識化特異的抗体を用いる等の手法を用いることができる。例えば、本明細書の実施例２に記載のごとくヒトＣＤ２０抗原に対する親和性（あるいは解離定数、Ｋｄ値）を測定してもよい。
【００２９】
以下に、本発明のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の取得および選抜について説明する。
本発明のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の作製に使用できるマウス由来モノクローナル抗体は、例えば、つぎのような方法によるスクリーニングで得られたハイブリドーマのクローンから目的の性質を有するモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することにより得ることができる。
感作抗原（免疫原）として、例えば、ＣＤ２０を発現している細胞であるＳＢ細胞又はRaji細胞と、例えば、遺伝子組換えにより商業的に入手可能なＣＤ２０のＤＮＡ（又は、同等の効果を有するそのフラグメント等）で形質転換して細胞表面上にＣＤ２０を発現させたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＣＤ２０）を用いる。そして、初回免疫、追加免疫、及び、最終免疫を行う際に、初回免疫及び追加免疫が、免疫の少なくとも１回は、感作抗原として、該抗原を発現する、被免疫動物とは他の目に属する動物に由来する細胞株を用いる免疫、及び、免疫の少なくとも１回は、感作抗原として、遺伝子組換により細胞膜表面上に該抗原を発現させた、被免疫動物と同目に属する動物に由来する細胞株を用いる免疫のいずれか一方であり、最終免疫が他方であるようにする。
この他の条件は、通常のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製法と同様でよい。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、公知の方法に従って、（１）被免疫動物の免疫、（２）免疫された動物からのリンパ球の調製、（３）親細胞の調製、（４）リンパ球と親細胞の細胞融合、（５）スクリーニング及びクローニングによって作製される（例えば、Ailsa M. Campbell (著)、大沢 利昭 (訳) 生化学実験法 モノクローナル抗体、東京化学同人、1989年参照）。
得られたクローンを用いてハイブリドーマを用いてモノクローナル抗体を作製する方法は、本発明のハイブリドーマ作製法で作製されたハイブリドーマを用いることの他は、通常の、モノクローナル抗体の作製の方法と同様でよい。大量作製の場合には、細胞培養による方法、マウスの腹水として作製する方法などが挙げられる。また、キメラ化又はヒト化抗体を作製する場合には、キメラ化又はヒト化抗体をコードする遺伝子を作製し、それを発現ベクターに組み込み、発現ベクターを適当な細胞で発現させることにより作製することができる。
【００３０】
例えば、Ｌ鎖およびＨ鎖の可変領域遺伝子を、ヒトイムノグロブリンＬ鎖およびＨ鎖（κ）定常域遺伝子とでキメラ化し、ＣＨＯ細胞用高発現ベクターに組み込む。組換抗体生産用のベクターシステムは市販されているものでよいが、哺乳動物細胞高発現ベクターpNOW（特許第３５８２９６５号公報）を基に、Ｌ鎖、Ｈ鎖両方のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を有するダイマー用高発現ベクターpNOW-abに構築したものを使用できる。各ベクターの構成を示す制限地図を図１および図２に示す。キメラ抗体遺伝子が組み込まれた発現ベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、それぞれ生産性の高いクローンを選別する。そのクローンから通常の方法で抗体を作製する。
【００３１】
本発明の第１の態様の抗体は、結合親和性がリツキシマブに比べて相対的に高くかつ増殖阻害活性、好ましくはアポトーシス誘導による活性が高いので、キメラ化又はヒト化した抗体はＢ細胞悪性腫瘍及びＢ細胞が関与する免疫疾患に対する治療剤の有効成分として使用できる。また、本発明の第２、第３の態様の抗体は、ヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対して抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示すと考えられるので、Ｂ細胞悪性腫瘍及びＢ細胞が関与する免疫疾患に対する治療剤の有効成分として使用できる。したがって、本発明は、これらキメラ化又はヒト化した抗体を有効成分とするＢ細胞関連疾患に対する治療剤も提供する。
また、本発明のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体は、上記（ｉ）または（ａ）、あるいは（ｉｉ）または（ｂ）の選抜基準を用いて選抜することができ、これらの選抜基準を満たすものはＢ細胞悪性腫瘍及びＢ細胞が関与する免疫疾患に対して有効性が高く、特に医薬用として好都合である。したがって、上記（ｉ）または（ａ）、あるいは（ｉｉ）または（ｂ）の選抜基準を満たすヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を有効成分として含有するＢ細胞関連疾患治療剤を提供する。
【００３２】
さらに、本発明においては、本発明の抗体を２種以上併用してもよい。
Ｂ細胞関連疾患としては、以下に限定するものではないが、例えば、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、関節リウマチ、自己免疫溶血性貧血症、特発性血小板減少症紫斑病、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、シェーグレン症候群、クローン病、強皮症、多発性硬化症などが挙げられる。
該治療剤は、公知の製剤技術に従って製造でき、他の配合成分は特に限定するものではなく、公知のリツキサンを参考にして、投与量等も決定することができる。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
（１）マウス感作用免疫原の準備
ＣＤ２０を発現しているＢ細胞株であるＳＢ細胞とRaji細胞をin vitroで培養した。
また、別途、Multiple Choice cDNA human spleen, Origene Technologies, Inc. 6 Taft Court, Suite 100, Rockville, MD 20850から入手したＣＤ２０の全分子をコードするＤＮＡを、特異的なプライマーhCD20-S-GK-Not aatgcggccgccaccatgacaacacccagaaattc（配列番号２５）、及びhCD20-E-Xba gctctagattaaggagagctgtcattttc（配列番号２６）を用いてクローニングし、それを哺乳動物細胞用高発現ベクターであるpNOW（図１)に組み込み、構築されたベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。ＦＡＣＳ分析により、細胞表面にＣＤ２０分子を高発現している組換ＣＨＯ細胞（ＣＤ２０／ＣＨＯ細胞）を樹立した。ここにおいて、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ２０モノクローナル抗体で染色した際に、ＳＢ細胞に比べて蛍光強度が５倍以上のものを高発現しているものとした。
【００３４】
（２）免疫原の調製
ＳＢ細胞またはRaji細胞は１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養を行った。ＣＤ２０／ＣＨＯ細胞は、Ｇ４１８を８００μｇ／ｍｌ添加したＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ培地（GIBCO、Cat. No. 12052-098）を用いて培養を行った。これらの培養液を１１００ｒｐｍで、５分遠心分離した後、細胞にDulbecco’s PBS(-)を加えて懸濁させ再度遠心分離した。この洗浄操作をもう一度繰り返し、細胞に生理食塩水を加えて調製した懸濁液（細胞数：１〜３×１０７／ｍｌ）を免疫に用いた。
【００３５】
（３）免疫
７〜１１週令のBalb/c系雌性マウスへ、免疫原の調製液をいずれも腹腔内投与した。ＳＢ細胞又はＣＤ２０／ＣＨＯ細胞のうち、いずれか同じ細胞をさまざまな日数間隔で２〜３回繰り返して投与した後、最終免疫には異なった細胞（ＣＤ２０／ＣＨＯ細胞又はRaji細胞）を投与した。投与した細胞数はいずれもマウス１匹当たり１〜３×１０７個であった。
使用した免疫原の組み合わせを表１に示す。
【００３６】
（４）細胞融合
最終免疫の３日後、２匹のマウスから脾臓細胞を調製し、Oi,V.T. and L.A. Herzenberg, 1980, in:Selected Methods in Cellular Immunology, eds. B. Mishell and S.M. Shiigi(Freeman and Co.San Francisco, CA) p.351に従って、マウスミエロ−マ（ＮＳ−１）との融合反応をＰＥＧ−１５００の存在下で行なった。
【００３７】
（５）１次、２次スクリーニング
ＣＤ２０／ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞（親株）を付着させた９６ウエルプレートを用いてCell ELISAを行い、ＣＤ２０に特異的に反応する抗体を産生しているウエルを選択した。さらに、同じＣＤ２０／ＣＨＯ細胞を付着させた９６ウエルプレートを用い、リツキシマブ（Ｃ２Ｂ８）との競合反応を行って、Ｃ２Ｂ８のエピトープと類似したところに反応する抗体（ウエル）を選択した。
表１にスクリーニング結果を示す。
【００３８】
（６）Cell ELISA
Poly-L-Lysineコート９６ウエルプレート（旭テクノグラス、Cat.No.11-023-018）に付着させたＣＤ２０／ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞（親株）をCell ELISAに用いた。その各ウエルにブロッキング液（０．２％−ゼラチン、０．５％ＢＳＡのＰＢＳ溶液）を１５０μｌ入れて３７℃で１時間静置した。１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、０．０５％−Tween２０水溶液を用いてプレートを５回洗浄した後、サンプル（培養上清の希釈液）を各ウエルに１００μｌ入れて１次反応を３７℃で１時間行なった。洗浄後、標識抗体の希釈液〔ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ウサギ抗体（Jackson Lab. Code No. 315-035-003）、またはＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Fcγ）ウサギ抗体（Jackson Lab. Code No. 315-035-008）〕を各ウエルに１００μｌ入れて２次反応を３７℃で１時間行なった。１次、２次の反応液の調製には、ブロッキング液と同じものを用いた。洗浄後、発色液（ＯＰＤ）を各ウエルに１００μｌ入れ３０分後に４Ｎ−Ｈ２ＳＯ４を５０μｌ加えて反応を停止し、４９２ｎｍの吸光度を測定した。
【００３９】
（７）Cell ELISAでの競合反応
サンプル（培養上清の希釈液）とキメラ抗体（１０〜４０ｎｇ／ｍｌ）の混合溶液を調製した。
上記のCell ELISAと同様にブロッキング反応をしたあと、この混合溶液を各ウエルに１００μｌ入れて１次反応を３７℃で１時間行なった。洗浄後、標識抗体の希釈液〔ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ウサギ抗体（Jackson Lab. Code No. 309-035-082）〕を各ウエルに１００ｕｌ入れて２次反応を３７℃で１時間行なった。洗浄後、発色液（ＯＰＤ）を各ウエルに１００μｌ入れ３０分後に４Ｎ−Ｈ２ＳＯ４を５０μｌ加えて反応を停止し、４９２ｎｍの吸光度を測定した。
標識抗体はキメラ抗体のみに反応するので、１次反応で添加したサンプル中の抗体がキメラ抗体と競合すれば、測定値の低下が認められた。
【００４０】
（８）クローニング
限界希釈法で行った。細胞を９６ウエルプレートに撒いて培養後、１コロニーのウエルの培養上清についてCell ELISAを行い、特異抗体の産生クローンを選択した。
【００４１】
（９）精製抗体の調製
特異抗体の産生クローンを１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、細胞密度が５×１０５／ｍｌ前後になった時点で無血清培地ＡＳＦ−１０４Ｎ（味の素）に培地を交換して培養を行った。その２〜４日後に培養液を遠心分離して培養上清を回収したあと、プロテインＧカラムを用いて精製を行い、溶出されたモノクローナル抗体溶液を１５０ｍＭ−ＮａＣｌに対して透析した。０．２μｍのフィルターでろ過滅菌を行ない、試験抗体（抗ヒトＣＤ２０マウスモノクローナル抗体）とした。
【００４２】
【表１】
代表的な８クローンの産生するモノクローナル抗体について、Ｌ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列（配列番号１〜８）及びＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列(配列番号９〜１６)は以下のとおりである。
【００４３】
1K0924のH鎖V領域配列（配列番号１１）
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNIHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTSDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARMSTMITGFDYWGQGTTLTVSS
1K1228のH鎖V領域配列（配列番号１６）
QVQLQQPGAELVKPGASVKVSCKASGFTFTSYNLHWVKQTPGQGLVWIGAIYPGNGDTSYNQKFRGKATLTADISSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYYGYDAMDYWGQGTSVTVSS
1k1422のH鎖V領域配列 (配列番号９)
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCRASGYTFTNYNMHWIKQTPGQGLEWIGAIYPGSGDTSYNRKFKGKATLTADTSSSTAYMQFSSLTSADSAVYYCARFTYYYGGTYGAMDYWGQGTSVTVSL
1k1791のH鎖V領域配列 (配列番号１０)
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNFGVNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYADDFKGRFAFSLEASANTAYLQINNLKNDDMSTYFCTRRTNYYGTSYYYAMDYWGQGTSVTVSS
1k1712のH鎖V領域配列 (配列番号１２)
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGFTFTSYNLHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGSGDTSYNQQFKGKATLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYCCARSAMISTGNWYFDYWGQGTTLTVSS
1k1402のH鎖V領域配列 (配列番号１３)
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGFTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGGIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARFYYYGSMGAMDYWGQGTSVTVSS
1k1736のH鎖V領域配列 (配列番号１４)
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYNLHWVKQTPGQGLEWIGGIYPGNGDTSYNQKFKVKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARWIYYGNYEGTLDYWGQGTSVTVSS
1k1782のH鎖V領域配列 (配列番号１５)
QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGYITPSTGYTDYNKKFKDKATLTADRSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCARSGPYFDVWGAGTTVTVSS
1K0924の Ｌ鎖V領域配列（配列番号３）
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQRPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYYFTISRVEAEDAATYYCQQWNSNPPTHGGGTKLEIK
1K1228の Ｌ鎖V領域配列（配列番号８）
EIILTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSYYLRWYQQKPGFSPKVLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGNTVPLTFGSGTKLEIK
1k1422の Ｌ鎖V領域配列 (配列番号１)
QIVLTQSPPIMSASLGEEITLTCSASSRVSYMLWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWTSNPCTFGGGTKLEIK
1k1791の Ｌ鎖V領域配列 (配列番号２)
STVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKVLIYFASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTINTVQAEDLAVYFCQQDYSSPLTFGAGTKLELK
1k1712の Ｌ鎖V領域配列 (配列番号４)
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMDWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDTATYYCQQWTFNPPTFGSGTKLEIK
1k1402の Ｌ鎖V領域配列 (配列番号５)
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWTFNPPTFGAGTKLELK
1k1736の Ｌ鎖V領域配列 (配列番号６)
QIVLSQSPAILSSSPGEKVTMTCRASSSVSYMLWYQQKPGSSPEPWIYATSNLASGVPARFSGGGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTFNPPTFGGGTKLEIK
1k1782の Ｌ鎖V領域配列 (配列番号７)
DILLTQSPAILFVSPGERVSLSCRASQNIGTSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESFSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPFTFGSGTKLEIK
【実施例２】
【００４４】
得られたクローンの一部に関し、モノクローナル抗体遺伝子の可変領域について塩基配列の決定を行うとともに、それらが産生するモノクローナルについて抗体結合親和性の測定及び生物学的特性試験を以下のとおり行った。
（１）結合親和性測定
目的とする抗原を細胞表面で発現しているヒトＢ細胞株由来の浮遊細胞Raji及び、ＣＤ２０抗原を発現していない細胞としてヒトT細胞株由来の浮遊細胞Jurkatを用いた。共にＲＰＭＩ１６４０（ナカライ、Cat.No.30264-85、Lot L4K2844）に１０％ウシ胎仔血清ＦＣＳ(BIOLOGICAL IND. Cat.No.04-001-1A、Lot 815242、補体成分を非働化するためあらかじめ５６℃３０分加温したもの）を添加した培地で３７℃ＣＯ２濃度５％のＣＯ２インキュベーター (SANYO MCO-175M)で培養、週２回の継代により維持した。
細胞数の測定は、Burker-Turk血球計算盤(ヱルマ販売(株)Cat.No.03-303-1)を用いて行った。
継代後３〜４日目のコンフルエントな細胞の培養液を多本架冷却遠心機ＬＸ−１２０ (TOMY)で室温、３０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を除き、細胞を回収した。ここで用いた回転数と時間は遠心分離と上清除去を繰り返し行っても細胞数が変化しない条件である。細胞の表面に残った培地及びFCSを除くため（洗浄）、回収した細胞をDulbecco’s Phosphate Buffered Saline(-) 〔Ca、Mgフリー、PBS(-) 、（NaCl：Wako、Cat.No.191-01665、Na2HPO4：Wako、Cat.No.197-02865、Lot ASF2635、KCl：Wako、Cat.No.163-0334T、Lot CEQ7122 、KH2PO4：Wako、Cat.No.169-0425、Lot ELG7616）〕で懸濁後、３０００ｒｐｍで３分間遠心して上清を除く操作を２回行った。洗浄を終えた細胞を１％ＢＳＡ (Wako Cat No.013-07492 Lot PKH3483)−ＰＢＳ溶液で懸濁し、細胞密度を５ｘ１０６個／ｍｌに調整した。
１次抗体として、試験抗体又は陽性コントロール抗体（２Ｂ８）１５、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００ｎｇ（１．５〜５μｌ）を各々、１．５ｍｌチューブ（ビーエム機器、BMリングロックチューブ Cat.No.BM-15）に分注し、同時に抗体を入れないチューブも４本用意した。また、各々の試験抗体あたり３点のサンプルを準備した。そこに、１％ＢＳＡ（Wako Cat No.013-07492 Lot PKH3483)−ＰＢＳ溶液で懸濁液を１００μｌ（細胞数５ｘ１０５個）ずつ加えて混和し、室温で１時間振とう反応させた。
反応後、微量高速冷却遠心機ＭＸ−１００（TOMY）で室温、３０００ｒｐｍ３分間遠心分離し、細胞を回収後、細胞の表面に残った未反応の一次抗体を除くため２００μｌのＰＢＳで懸濁し、３０００ｒｐｍで３分間遠心し上清を除く操作を２回行った。
【００４５】
次に、細胞と結合した１次抗体に対して過剰量（５００ｎｇ）のＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）２次抗体〔GOAT Anti-mouse IgG(H&L) Fluorescein conjugated, affinity purified Secondary antibody、Chemicon、Cat.No.AP124F、 Lot 24021014〕および１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液１００μｌ（５００ｎｇ／１００μｌ）を添加・懸濁し、遮光、室温のもと１時間振とう反応させて細胞に結合した１次抗体を検出した。反応後、３０００ｒｐｍで３分間遠心し、細胞を回収後、細胞の表面に残った未反応のＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体を除くため、２００μｌのＰＢＳで懸濁し、３０００ｒｐｍで３分間遠心し上清を除く操作を２回行った。
こうして得た細胞を１００μｌＰＢＳで懸濁し、９６ウエル平底プレート（住友ベークライトELISA PLATE Cat.No.8496F）へ移した。２次抗体の蛍光量をTyphoon9210イメージアナライザー(Amersham Bioscience)を用いて、Fluorescense mode, ６００Ｖ、526SP/green(532nm)、Focus：底面＋３ｍｍの検出条件で測定した。この際、ＦＩＴＣ標識２次抗体を０、１２．５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０ｎｇ添加したＰＢＳ溶液１００μｌを検量線作成用のコントロールとして用いた。
【００４６】
検出後、画像を画像解析ソフトImage Quant （Amersham Bioscience）を使用し、数値化を行った後、Excel (Microsoft)で解析を行った。この際、プレート、ＰＢＳ溶液、および細胞に非特異的に結合したＦＩＴＣ標識２次抗体に由来するバックグラウンド値として、細胞とＦＩＴＣ標識２次抗体のみを反応させたものの測定値を求め、その４点の平均値を各サンプルの蛍光強度の値から差し引いた。こうして、細胞に結合したＦＩＴＣ標識２次抗体の蛍光量を得た。更に、コントロールとして用いた各濃度のＦＩＴＣ標識二次抗体での蛍光量を測定することで検量線を作成し、細胞に結合している２次抗体の量（モル数または重量）を求めた。各１次抗体とＦＩＴＣ標識２次抗体が１：２の割合で反応していると仮定し、結合している１次抗体量を算出した。また遊離の１次抗体量は添加量から結合量を差し引いて求めた。抗体濃度をモル濃度に換算する際、モノクローナル抗体の分子量を１５００００とした。
【００４７】
添加する１次抗体の増加に伴い結合反応が飽和して蛍光強度が一定量に達することを確認するとともに、細胞表面の抗原数及び解離定数（Ｋｄ値）を算出するため、スキャッチャード解析（Scatchard,G.; Ann.N.Y.Acad.Sci.,51: 660-672,1949、分子生物学研究のための新培養細胞実験法；羊土社、実験医学別冊バイオマニュアルUPシリーズ改訂第２版、212-217参照）を行った。このとき、数値は各サンプルについて３点の値の平均値を用いた。
代表的な８クローンが産生するモノクローナル抗体と陽性コントロール抗体（２Ｂ８）の測定結果を後の表３に示す。
【００４８】
（２）生物学的特性試験
（ａ）アポトーシス誘導試験
フローサイトメトリー（Annexin V/ PI staining）を用いて試験抗体のアポトーシス誘導能を測定した。陽性コントロール（２Ｂ８）、陰性コントロール[Anti-CD3モノクローナル抗体(BD PharMingen社)]を用いた。試験はMEBCYTOApoptosis Kit (MBL, Cat.No.4700, Lot.20)を用いて行った。
Raji細胞を遠心後、１０％ＦＢＳ（非動化済）(ICN, Cat.No.2916754, Lot.8005C)を含む新鮮な培地ＲＰＭＩ１６４０(Sigma, Cat.No.R8758, Lot.44K2416)で懸濁し、１２ウエルプレートの各ウエルに５ｘ１０５細胞／ｍｌの密度で１ｍｌを入れた。各抗体あたり１２ウエルを用い、各抗体を終濃度２μｇ／ｍｌ又は４μｇ／ｍｌになるよう添加した（３ウエル×２種濃度×２時点、計１２ウエル）。培養開始１日後及び２日後に、２ｘ１０５個程度分の細胞を含む培養液を回収し、遠心後ＰＢＳで１回洗浄した。次に８５μｌ Binding bufferを加え懸濁した。さらに、Annexin V-FITC１０μｌとＰＩ５μｌを加えてよく混和した後、遮光、室温で１５分間反応させた。フローサイトメトリー(FACS Calibur、Becton Dickinson)を用いて測定し、CellQuest（Becton Dickinson）で解析を行った。
代表的な６クローンが産生するモノクローナル抗体と陽性コントロール（２Ｂ８）、陰性コントロール(Anti-CD3)の測定結果を図３ａ〜図３ｄに示した。一般に２Ｂ８のアポトーシスの誘導能は高いとされるが、１Ｋ１７シリーズ（ＣＤ２０／ＣＨＯとRaji細胞で免疫）の細胞融合から得られたクローン１ｋ１７９１、および１Ｋ１４シリーズ（ＳＢ細胞とＣＤ２０／ＣＨＯで免疫）の細胞融合から得られたクローン１ｋ１４２２の産生するモノクローナル抗体は２Ｂ８との比較において高いアポトーシス誘導がみられた。
【００４９】
（ｂ）細胞増殖阻害試験
５×１０４個／ｍｌのRaji細胞懸濁液を１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地で調製して９６ウエルプレートに１００μｌ／ウエルずつ入れて培養した。２４時間後、抗体濃度が１μｇ／ｍｌになるように各抗体溶液を５０μｌ／ウエル添加して培養を継続した。抗体添加７２時間後に発色色素Cell Counting Kit-8(同仁化学 Cat.No.343-07623，Lot. SG076)を１０μｌ／ウエル加え、さらに４時間培養した後で波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
上記６クローンのモノクローナル抗体と陽性コントロール（２Ｂ８）、および陰性コントロールの吸光度の測定結果を表２に、また、それらの特性を表３に示す。
【００５０】
細胞増殖阻害試験
【表２】
【００５１】
モノクローナル抗体の特性
【表３】
【００５２】
（ｃ）抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
この実験では抗ＣＤ２０キメラ抗体のＦｃ部位を介してエフェクター細胞が活性化し、それに伴ってリンパ腫細胞系を溶解する能力について測定を行った。
ヒトＢ細胞由来のRaji、ＷｉＬ２−ＮＳ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＲＣ−Ｋ８の４種類の細胞を非働化処理した１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０に培地（培養培地）で３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で培養、維持した。
実験に際しては、各々の細胞を１０％ＦＣＳ含ＲＰＭＩ１６４０で洗浄し、３７℃中で１５分間の反応によりカルセインを生細胞に取り込ませた後、細胞数を４×１０５個／ｍｌに調整した。カルセインは細胞膜が正常に保たれている細胞にのみ維持されるので生細胞のみを染色することができる。また抗ＣＤ２０キメラ抗体であるリツキシマブ（Ｃ２Ｂ８）と６種類のキメラ抗体（１ｋ０９２４、１ｋ１４０２、１ｋ１４２２、１ｋ１７１２、１ｋ１７３６、１ｋ１７９１）を１０％ＦＣＳ含ＲＰＭＩ１６４０で２０μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌに調整した。エフェクター細胞は健常者より採血し、直ちにFicollに重層して遠心しリンパ球画分を採取した後、５×１０６個／ｍｌ、１×１０６個／ｍｌ、０．２×１０６個／ｍｌに調整した。
濃度調整をした細胞２５μｌ、各抗ＣＤ２０キメラ抗体溶液２５μｌ（それぞれ終濃度が５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ）、各抗体濃度においてエフェクター細胞５０μｌ（それぞれＥ：Ｔ比が２５：１、５：１、１：１）、計１００μｌを９６穴プレート内で混合し、３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で４時間反応させた。また、自然な細胞の溶解を算出するために抗体溶液およびエフェクター細胞を１０％ＦＣＳ含ＲＰＭＩ１６４０で置き換えたサンプル、抗体に依存しないエフェクター細胞のみの活性を算出するサンプルとして抗体溶液を１０％ＦＣＳ含ＲＰＭＩ１６４０で置き換えたサンプル、最大溶解を算出するサンプルとして抗体溶液を２０％TritonＸ−１００で置き換えたサンプルを用意した。
反応後、溶解した細胞は細胞膜が壊れてカルセインが細胞外に出るため、Quencherを用いて反応溶液中に遊離したカルセインの蛍光を消失させた後、蛍光アナライザーにより蛍光量を測定した。
検出後、画像解析ソフト（Amersham Bioscience）を使用し、数値化を行った後、以下の式を用いて各サンプルの溶解率を算出した。
【数１】
【００５３】
ＮＫ細胞などのエフェクター細胞数とターゲットとなる細胞数の割合（Ｅ：Ｔ比）が２５：１のときの各細胞における抗体濃度と細胞傷害活性の関係を図４ａ〜図４ｄに示す。また、抗体濃度が５μｇ／ｍｌのときの各細胞におけるＥ：Ｔ比と細胞傷害活性の関係図５ａ〜図５ｄに示す。
図４ａ〜図４ｄに示すごとく、Ｅ：Ｔ比が２５：１の条件ではどの細胞でも抗体を加えることにより細胞傷害活性を示している。つまり抗体が細胞傷害に関与している。また、ＷｉＬ２−ＮＳ以外の細胞株では０．２μｇ／ｍｌの抗体濃度で既に１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌと同程度の活性を示し（０．２μｇ／ｍｌで飽和している）、活性は最大値まで達してフラットとなっており、補体依存性細胞傷害活性に必要とされる抗体量よりも少ない抗体量で作用することを示唆している。
図５ａ〜図５ｄに示すごとく、抗体濃度が５μｇ／ｍｌのときの細胞傷害活性のＥ：Ｔ比による影響を見ると、細胞傷害活性がＥ：Ｔ比濃度に依存して上昇しているのがわかる。このことからエフェクター細胞が作用して細胞傷害が起こっていると判断される。
【００５４】
（ｄ）補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）
この実験では抗ＣＤ２０キメラ抗体が補体を含む血清の存在下でリンパ腫細胞系を溶解する能力について測定を行った。
ヒトＢ細胞由来のRaji、ＷｉＬ２−ＮＳ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＲＣ−Ｋ８の４種類の細胞を非働化処理した１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０に培地（培養培地）で３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で培養、維持した。
実験に際しては各々の細胞を１０％ＦＣＳ含ＲＰＭＩ１６４０で洗浄し細胞数を２〜３×１０６個／ｍｌに調整した。また、抗ＣＤ２０キメラ抗体であるＣ２Ｂ８（リツキシマブ）と６種類のキメラ抗体（１ｋ０９２４、１ｋ１４０２、１ｋ１４２２、１ｋ１７１２、１ｋ１７３６、１ｋ１７９１）を１０％ＦＣＳ含ＲＰＭＩ１６４０で２０μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌに調整した。
濃度調整をした細胞５５μｌ、各抗ＣＤ２０キメラ抗体溶液２５μｌ（それぞれ終濃度が５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ）、５人の健常者より採取したプール血清又はそれを非働化したもの２０μｌ、計１００μｌをボルテックスミキサーにより混合し、３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で２時間反応させた。バックグラウンドの算出サンプルとしては抗体溶液２５μｌを１０％ＦＣＳ含ＲＰＭＩ１６４０培地２５μｌに置き換えたものを用意した。
反応後、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）溶液で死細胞を染色し、ＦＡＣＳ（Becton Dickinson）により解析を行った。数値は死細胞のポピュレーションをそのまま採用し、バックグラウンド及び非働化血清を加えたサンプルの値を差し引いてある。
各細胞においての抗体濃度と細胞傷害活性の関係を図６ａ〜図６ｄに示す。
図６ａ〜図６ｄに示すごとく、Raji、ＷｉＬ２−ＮＳ、ＳＵ−ＤＨＬ４では６種類全ての抗体が活性を示している。また、濃度依存性も確認できるが、５μｇ／ｍｌの濃度で比較すると１ｋ１７９１は他の抗体に比べて特に高い活性を示し、ついで、１ｋ１７３６、１ｋ１４２２、１ｋ１７１２が高い活性を示している。この濃度ではRaji、ＷｉＬ２−ＮＳにおいて１ｋ１７９１は他の抗体のおよそ２倍近い細胞傷害を誘導していることが確認できる。しかしながら、他の抗体もリツキシマブと同程度、もしくはそれ以上の活性を示している。
一方、リツキシマブが効かないとされるＲＣ−Ｋ８では、抗体ごとの差異が顕著に現れた。リツキシマブ、１ｋ１４０２および１ｋ１７１２ではほとんどもしくは全く活性がない。それに対し、１ｋ１７９１は非常に高い活性を示し、５μｇ／ｍｌの濃度では約５０％の傷害活性を示している。これに続き、１ｋ０９２４が２５％程度、１ｋ１４２２、１ｋ１７３６が１０％程度の傷害活性を示している。
以上から、今回試験対象とした６種類のキメラ抗体はリツキシマブと同程度あるいはより強いＣＤＣ活性を有していることが確認された。
【実施例３】
【００５５】
（１）結合親和性測定
ヒトＢ細胞株由来のRaji細胞を、ＲＰＭＩ１６４０に非働化処理した１０％ＦＣＳ添加培地で３７℃、ＣＯ２濃度５％のＣＯ２インキュベーター内で培養、週２回の継代により維持した。
継代後３〜４日目（約１ｘ１０６個／ｍｌ）の細胞培養液を室温、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収後、ＰＢＳ（−）で懸濁、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清を除く操作を２回行うことで洗浄した。
抗ＣＤ２０抗体（陽性コントロール抗体：マウス抗体２Ｂ８、キメラ抗体及びヒト化抗体Ｃ２Ｂ８）とRaji細胞を混和し、室温で１時間反応することで１次抗体反応を行った。ここで、抗ＣＤ２０抗体の各々の終濃度は１．３３、２．６７、４．００、５．３３、６．６７、８．００、９．３３、１０．６７、１２．００、１３．３３、１４．６７、１６．００ｎＭの１２点とし、細胞数５ｘ１０６個、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を反応溶液とし液量１００μｌになるよう１．５ｍｌチューブに分注した。同一試験抗体あたり３点のサンプルを準備し、バックグラウンド算出サンプルとして抗体を加えないチューブも４本用意した。
反応後、室温、３０００ｒｐｍにて３分間遠心分離し、未反応の１次抗体を除き、細胞を回収した。
【００５６】
細胞と結合した１次抗体に対して過剰量となるよう１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で５ｕｇ／ｍｌに調製したＦＩＴＣ標識二次抗体を１００μｌづつ添加し、懸濁後、遮光、室温のもと１時間反応させた。
ここでＦＩＴＣ標識２次抗体はマウス抗体ではGOAT Anti Mouse IgG (H&L)-FITCをキメラ抗体及びヒト化抗体ではGOAT F(ab’) 2F ragment Anti Human IgG (Fcγ)-FITCを用いた。
反応後、室温、３０００ｒｐｍにて３分間遠心分離し、未反応のＦＩＴＣ標識２次抗体を除き、細胞を回収し、２００μｌのＰＢＳで懸濁し再度遠心し洗浄を行った。
この細胞を１００μｌＰＢＳで懸濁し、９６ウエル平底プレートへ移した。２次抗体の蛍光量をTyphoon９２１０イメージアナライザー（Amersham Bioscience）を用いて測定した。
検出後、画像解析ソフトImage Quant (Amersham Bioscience）を使用し、数値化を行った後、Excel (Microsoft）で解析を行った。同一試験抗体の平均値を求め、バックグラウンド算出サンプル（細胞とＦＩＴＣ標識２次抗体のみを反応させたもの）の値を各試験抗体の値から差し引くことで、プレート、ＰＢＳ溶液および細胞に非特異的に結合したＦＩＴＣ標識２次抗体に由来するバックグラウンド値を除いた。同時に１００μｌ当り、０、１２．５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０ｎｇのＦＩＴＣ標識２次抗体単独の蛍光量を測定することで検量線を作成し、細胞に結合している２次抗体のモル数を求めた。各１次抗体とＦＩＴＣ標識２次抗体が１：５の割合で反応していると仮定し、結合している１次抗体量を算出した。遊離の１次抗体量は添加量から結合量を差し引いて求めた。これらの値を用いて、スキャッチャード解析を行い、解離定数Ｋｄ値を得た。
結果を以下の表４に示す。
【００５７】
（２）アポトーシス誘導試験
ヒトＢ細胞株由来細胞に対する抗ＣＤ２０抗体によるアポトーシス誘導を単独で見る条件（クロスリンク無）及びさらに抗ＣＤ２０抗体のＦｃ領域を認識する２次抗体を添加することによるアポトーシス誘導を見る条件（クロスリンク有）の２条件で反応し、Annexin V-FITC apoptosis kitを用いて初期アポトーシスの検出を行った。
ヒトＢ細胞株由来のRaji、ＷＩＬ２−ＮＳ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＲＣＫ８の４種類の細胞を、ＲＰＭＩ１６４０に非働化処理した１０％ＦＣＳ添加培地（培養培地）で３７℃、ＣＯ２濃度５％のＣＯ２インキュベーター内で培養、週２回の継代により維持した。
継代後３〜４日目（約１ｘ１０６個／ｍｌ）の細胞培養液を室温、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収した。
抗ＣＤ２０抗体（陽性コントロール抗体：マウス抗体２Ｂ８、キメラ抗体及びヒト化抗体Ｃ２Ｂ８；陰性コントロール：Ａｎｔｉ−ＣＤ３モノクローナル抗体）と新鮮な培養培地で懸濁した細胞を混和し、１．５時間３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で反応した。ここで、抗ＣＤ２０抗体各々の終濃度は０．２、１、５μｇ／ｍｌの３点、細胞密度１ｘ１０６細胞／ｍｌ、培養培地を反応溶液として液量２５０μｌになるよう１．５ｍｌチューブ内で反応を行った。同一試験抗体あたり３点のサンプルを準備した。
反応後、室温、１２００ｒｐｍにて３分間遠心分離し、未反応の抗体を除き、細胞を回収した。
クロスリンク無の条件では新鮮な培養培地、クロスリンク有条件では抗ＣＤ２０抗体の５倍量のＦｃ領域を認識する２次抗体を２５０μｌづつ添加し、混和後、さらに３時間、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で反応した。ここで２次抗体はマウス抗体ではGoat Anti mouse IgG, FcγFragmentを、キメラ抗体及びヒト化抗体ではGoat Anti human IgG, FcγFragment specificを用いた。
反応後、室温、１２００ｒｐｍにて３分間遠心分離し、未反応の２次抗体を除き、細胞を回収した。２５０μｌのＰＢＳで懸濁し再度遠心し洗浄を行った
検出試薬としてMEBCYTO apoptosis kit-AnnexinV-FITC ,PI- (MBL, Cat.No.4700, Lot. 21)を使用した。８５μｌのBinding bufferを加え懸濁した後、Annexin V-FITC 5μlとpropidium iodide (PI)５μｌ（終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）を加えてよく混和し、遮光、室温で１５分間反応させた。
フローサイトメトリー（EPICS ALTRA :BECKMAN COULTER）を用いてtotal count２０，０００の細胞を測定し、解析（Expo32: BECKMAN COULTER）を行った。
結果を図７ａ〜図９ｄに示す。
【００５８】
（３）ヒト化抗体産生株の調製
（ａ）ＤＮＡ合成
配列番号１７〜２４のアミノ酸配列を元にしてコドンをＣＨＯ細胞に最適化したＤＮＡを、定法によりデザインし、合成した。
（ｂ）コンストラクトの作成
pNOWを発現ベクターとして１６種類のヒト化1K1791発現コンストラクトを構築した。
ヒト化1K1791発現コンストラクトを作製した。
pNOW-aa1791kg1、pNOW-af1791kg1、pNOW-as1791kg1、pNOW-av1791kg1、pNOW-fa1791kg1、pNOW-ff1791kg1、pNOW-fs1791kg1、pNOW-fv1791kg1、pNOW-sa1791kg1、pNOW-sf1791kg1、pNOW-ss1791kg1、pNOW-sv1791kg1、pNOW-va1791kg1、pNOW-vf1791kg1、pNOW-vs1791kg1、pNOW-vv1791kg1
（ｃ）トランスフェクションと薬剤による選択
トランスフェクション試薬を用いてヒト化1K1791発現コンストラクトをＣＨＯ ＤＧ４４ｃｄＢ細胞に導入した。それぞれの遺伝子を導入したＣＨＯ ＤＧ４４ｃｄＢ細胞１×１０６個を１００ｍｌの選択培地に懸濁し、９６ウエルプレート５枚に撒いた（２００μｌ／ウエル）。５％炭酸ガス存在下に３７℃、３〜４週間培養した。
トランスフェクション試薬：Qiagen, Effectene Transfection Reagent, Cat. No 301427
選択培地：IS CHO-CD w/Hydrolysate/4mM GlutaMAX/0.8 mg/ml G418
（ｄ）高発現細胞株の選択
１）コロニーが出現しているウエルの上清をとり、ドット・プロット・アッセイ（Dot Blot assay）で抗体産生量を測定した。
２）抗体産生量の多いクローンを２４ウエルプレートに移し、約5日間培養後、上清をとり、サンドイッチELISAで抗体産生量を測定した。
３）発現量が多いクローンを２つ選択し、Ｔ７５フラスコに移した。
（ｅ）小規模培養
１６種類のコンストラクトそれぞれに対して選択した２種のクローンを３０ｍｌの選択培地を含むＴ７５フラスコ中で培養を行った。
【００５９】
（４）ヒト化抗体産生株の培養及び精製
抗体産生細胞株（遺伝子組み換えＣＨＯ−ＤＧ４４細胞）を、Hydrolysateを含むIS CHO-CD/with Hydrolysate (Irvine Scientific, Cat. No.91119）に、４ｍＭ GlutaMax(Invitrogen, Cat 35050-061）、２００μｇ／ｍｌG418 (Sigma,Cat.No.A1720-5G)を添加した培地で３７℃、ＣＯ２濃度５％のＣＯ２インキュベーター内で培養、週２回の継代により維持した。
継代後約２週間経過した細胞培養液を室温、３５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培養上清を回収し、０．４５μｍ syringe filterで濾過した。５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、ｐＨ７．０で平衡化した
Hi Trap Protein A HP(GE Healthcare, Cat No. 17-0402-01）カラムに、培養上清を添加後、５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、ｐＨ７．０で洗浄した。０．１Ｍクエン酸、ｐＨ４．０で溶出し、４００μｌづつ採取し、その１０／１量にあたる４０μｌ １Ｍ Tris−ＨＣｌ、ｐＨ９．０で中和した。１００倍量のＰＢＳに対して、Ｍ．Ｗ．３５００透析カップ（Bio-Tech Cat. No.212932）を用いて２．５時間を２回後、１５〜１８時間１回の透析を行った。
【００６０】
使用した抗体生産株は、ＣＨＯ細胞hz1791-fv10、hz1791-ff34、hz1791-sf43およびhz1791-ss32であり、これらは、ブタペスト条約の下、平成１８年（２００６年）３月１日より、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに、各々、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４３、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４４、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４５およびＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４６の受託番号で寄託してある。
これらの細胞株から得られたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列(配列番号１７〜２４)は以下のとおりである（アンダーライン部分が対応するマウス抗体と異なる）。
ヒト化1k1791の配列
Ｌ鎖V領域配列（配列番号２０）
Ven 1791 :STVMTQSPDSLAVSLGERVTINC KASQSVSNDVA WYQQKPGQSPKVLIY FASNRYT GVPDRFSGSGYGTDFTFTISSVQAEDVAVYFC QQDYSSPLT FGAGTKLELK
H鎖V領域配列（配列番号２４）
Ven 1791：QIQLVQSGPELKKPGASVKISCKASGYTFT NFGVN WVKQAPGKGLKWMG WINTYTGEPSYADDFKG RFAFSLDASVSTAY LQISSLKAEDTSTYFCTR RTNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS
Ｌ鎖V領域配列（配列番号１７）
abb 1791 :STVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVSNDVA WYQQKPGQSPKVLIY FASNRYS GVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQDYSSPLT FGAGTKLEIK
H鎖V領域配列（配列番号２１）
abb 1791：QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGVN WVRQAPGKGLEWMG WINTYTGEPSYAQGFTG RFVFSLDASVSTAY LQISSLKAEDTATYFCTR RTNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS
Ｌ鎖V領域配列（配列番号１９）
sdr 1791 : STVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSNSNDVA WYQQKPGQSPKVLIY FASNRYS GVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQDYSSPLT FGAGTKLEIK
H鎖V領域配列（配列番号２３）
sdr 1791：QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGVN WVRQAPGKGLKWMG WINTYTGEPSYAQGFTG RFAFSLDASVSTAY LQISSLKAEDTATYFCTR RTNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS
Ｌ鎖V領域配列（配列番号１８）
fra 1791 : STVMTQSPSFLSASVGDRVTITC KASQSVSNDVA WYQQKPGQSPKVLIY FASNRYT GVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQDYSSPLT FGAGTKLEIK
H鎖V領域配列（配列番号２２）
fra 1791：QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGVN WVKQAPGKGLKWMG WINTYTGEPSYADDFKG RFAFSLDASASTAY LQISSLKAEDMATYFCTR RTNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS
【００６１】
この実験では、AbbL、FraL、SdrL、VenLの４種類 × AbbH、FraH、SdrH、VenHの４種類を組み合わせた合計１６種類の配列組合せから各２クローンずつについて実験を行ない平均値を求めた。以上の結果より、Ｋｄ値を基に表４に示すように４グループに分類できる。それぞれのグループより１種類を選抜し以降の実験で使用した。
コントロール：c2B8
グループＩ： Kd = ２０ nM＜
グループＩＩ： Kd = １０−２０ nM
グループＩＩＩ： Kd = ８-１０ nM
グループＩＶ： Kd = ＜８ nM
【００６２】
表４ ヒト化抗体結合解離定数
【表４】
【００６３】
表５ ヒト化抗体結合解離定数
【表５】
【００６４】
さらに、マウス抗体８種類でのアポトーシス実験結果を図７ａ〜図７ｄに示す。４種類全ての細胞においてマウス抗体８種類および既知のＣＤ２０抗体２Ｂ８、２Ｈ７について２つのタイプに分けることができた（但し一部例外を除く）。
グループＡ：m0924 , m1422 , m1791 , m2B8
グループＢ：m1228 , m1402 , m1712 , m1736 , m1782 , m2H7
(但し、ｍ０９２４はＳＵ−ＤＨＬ４細胞ではグループＢに含まれる)
すなわち、抗ＣＤ２０抗体単独で十分なアポトーシス誘導能が示され、２次抗体によるクロスリンク条件下でもほぼ同程度であるグループＡと抗ＣＤ２０抗体単独でのアポトーシス誘導能は十分に示されないがクロスリンク条件下で大きく増加するグループＢである。またグループＡに含まれる抗体は親和性が２Ｂ８と同程度であり、グループＢに含まれる抗体は２Ｂ８より高い親和性であるものが含まれる。アポトーシス誘導に２次抗体の存在を必要とせず、単体でアポトーシス誘導が可能なグループＡの方が医薬としては都合よいといえる。
細胞別にみるとアポトーシスの割合がＲＡＪＩ、ＷＩＬ２−ＮＳ、ＲＣＫ８では高いものでも３０〜４０％であるのに対し、ＳＵ−ＤＨＬ４では高いもので８０％以上を示す結果となった。
【００６５】
ヒト化抗体４種類での結果を図８ａ〜図９ｄに示す。
マウス抗体同様、４種類全ての細胞においてヒト化1791抗体４種類について２つのタイプに分けることができた。
グループＡ：fv, ff
グループＢ：sf, ss, C2B8
Ｃ２Ｂ８と同等の親和性を示すグループＡのfv、ff抗体はクロスリンク無しではアポトーシス活性をほとんど発揮せず、クロスリンク条件下で明らかに活性を持つ。グループＢのsf、ss抗体はグループＡの抗体より、解離定数が大きく親和性は弱いが、これらの抗体単独でＣ２Ｂ８より高いアポトーシス活性を示した。
抗ＣＤ２０抗体によるＢ細胞に対するアポトーシス誘導能について、単独で十分なアポトーシス誘導能を示す場合、クロスリンク条件下でもその割合はほぼ同等であるが、抗体の種類、未飽和条件などで抗ＣＤ２０抗体単独では十分なアポトーシス誘導能が示されない場合、クロスリンク条件下でアポトーシス活性は増加すると考えられる。
なお、図９ａ〜図９ｄは、実験日の抗体を加えない条件での早期アポトーシス（％）を１とするグラフである。
【実施例４】
【００６６】
ヒト化抗体の結合解離定数（Ｋｄ値）と細胞増殖阻害活性との関連性
実施例３でヒト化抗体をグループＡとグループＢに分けた結果をふまえて、表５に示す各ｈｚ１７９１クローンについて、ヒトＣＤ２０抗原に対するＫｄ値（ｎＭ）とアポトーシス誘導活性（％）およびＣＤＣ活性（％）との関係を調べた。Ｋｄ値の測定は実施例２に記載のごとく行った。ＣＤＣ活性の測定は実施例２に記載のごとく行った（ただし、抗体量とＣＤＣ活性の関係を調べる実験においては後述のごとく抗体を生成したものを用いた）。ＡＤＣＣ活性の測定は実施例２に記載のごとく行った。アポトーシス活性の測定は実施例３に記載のごとく行った。使用したＢ細胞はＲａｊｉ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＷｉＬ−２、およびＲＣＫ８であった。それぞれの細胞につき、４種のクローンｆｖ、ｆｆ、ｓｆ、およびｓｓに関するデータを図１０ａ〜図１０ｄに示す。
【００６７】
アポトーシス活性に関しては、いずれの細胞を用いて試験した場合においても同様の傾向が見られた。すなわち、親和性が高い（Ｋｄ値が小さい）抗体ほどアポトーシス誘導活性が低く、親和性が低い（Ｋｄ値が大きい）抗体ほどアポトーシス誘導活性が高いことがわかった。また、Ｋｄ値が約１３ｎＭを超えると、アポトーシス活性は一定となる傾向を示した。親和性が高い抗体は、それ自体ではアポトーシス活性を発揮できず、アポトーシスの誘導には二次抗体によるクロスリンクが必要であった。そして、親和性が低い抗体は、それ自身でアポトーシス誘導活性を発揮することがわかった。
【００６８】
ＣＤＣ活性に関しては、Ｒａｊｉ細胞およびＳＵ−ＤＨＬ４細胞を用いた場合には、親和性が高い（Ｋｄ値が小さい）抗体ほどＣＤＣ活性が高い傾向がみられた。一方、ＷｉＬ−２細胞およびＲＣＫ８細胞を用いた場合には、Ｋｄ値が１３ｎＭ付近に極大値を有する傾向が見られた。
【００６９】
これらの知見から、医薬品として有効な候補抗体を見出すことができる、２つの選抜基準を設定した：
−単独ではアポトーシスを誘導しないが、ＣＤ２０抗原に対する親和性が極めて高く、ＣＤＣにより抗ガン効果を発揮しうる抗体；
−単独でアポトーシス誘導活性を持ち、アポトーシスとＣＤＣにより抗ガン効果を発揮しうる抗体のうち、ＣＤ２０抗原に対する親和性が高いもの。
【００７０】
前者の選抜基準では、ＣＤ２０抗原に対する親和性が高く、かつＣＤＣ活性も高いものを選抜することが好ましい（Ｋｄ値が低いほどＣＤＣ活性が高い傾向が見られる）。この場合、単独ではアポトーシスを誘導しない抗体の選抜なので、ＣＤＣ活性の値のみに注目してよい。前者の選抜基準を満たすクローンの場合には、単独でアポトーシス誘導は引き起こさないが、親和性およびＣＤＣ活性か極めて高いことから、細胞枯渇を促すことができる。
【００７１】
後者の選抜基準では、抗体のアポトーシスとＣＤＣの総和が大きく、かつ、ＣＤ２０抗原に対する親和性が高いものを選抜することが好ましい。したがって、後者の選抜基準を満たすクローンの場合には、親和性は高くないが、アポトーシス活性が高いという利点を有し、アポトーシス誘導とＣＤＣの相乗効果により細胞枯渇を促すことができる。
【００７２】
さらに、上の２つの選抜基準の境界点を決定するために、４種の細胞のアポトーシス活性の中点を与えるＫｄ値を作図により求めた（図１０ａ〜図１０ｄのグラフ中に点線で示す）。これら４つのグラフから、アポトーシス活性の中点を与えるＫｄ値に大きな相違はなく、Ｒａｊｉ細胞の場合には約９．５ｎＭ、ＳＵ−ＤＨＬ４細胞の場合には約８．５ｎＭ、ＷｉＬ２細胞の場合には約９．５ｎＭ、ＲＣＫ８細胞の場合には約１０ｎＭであった。これらの結果から、約９．５ｎＭのＫｄ値を上の２つの選抜基準の境界点とした。
また、後者の選別基準のＫｄ値の上限は、ＷｉＬ２細胞およびＲＣＫ８細胞の場合にＣＤＣ活性の極大値が見られることを考慮して（図１０ｃおよび図１０ｄ）、アポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和ができるだけ大きく、しかも親和性が高い（Ｋｄ値が小さい）範囲ということから、Ｋｄ値の上限を約１３ｎＭとした。
【００７３】
したがって、前者の選抜基準に従って、ヒトＣＤ２０抗原に対するＫｄ値が約９．５ｎＭ未満であって、できるだけＫｄ値が低く、かつ、ＣＤＣ活性の高い抗体を選抜すると、クローンｆｆとｆｖが該当する（図１０ａ、図１０ｂ）。また、後者の選抜基準に従って、ヒトＣＤ２０抗原に対するＫｄ値が約９．５ｎＭないし約１３ｎＭであって、できるだけアポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和が大きく、かつ、Ｋｄ値が小さい抗体を選抜すると、クローンｓｆが該当する（図１０ｃ、図１０ｄ）。
【００７４】
次に、上記４種のヒト化クローンからｆｖ、ｆｆ、ｓｆ、およびｓｓを選択し、Ｒａｊｉ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＷｉＬ−２、およびＲＣＫ８細胞を用いてＣＤＣ活性およびアポトーシス活性を測定した。結果を、それぞれ表６および表７に示す。リツキシマブ（ｃ２Ｂ８）およびクローン１７９１（ｃ１７９１）は、それぞれ対照である。
【００７５】
表６ 本発明のヒト化抗体のＣＤＣ活性
【表６】
【００７６】
表６の結果から、クローンｆｆおよびｆｖは、リツキシマブと同程度あるいはそれよりも強いＣＤＣ活性を発揮することがわかった。また、ｓｆはＷｉＬ２細胞およびＲＣＫ８細胞において極めて高いＣＤＣ活性を示した。
【００７７】
抗体濃度とＣＤＣ活性の関係を調べるための実験も行った。抗体は実施例２に記載のごとく調製したものよりも精製が進んだものを使用した。精製は下記の手順にて行った。
抗体産生細胞株（遺伝子組み換えＣＨＯ−ＤＧ４４細胞）はHydrolysateを含むIS CHO-CD/w（Irvine Scientific, Cat. No.91119）に、４ｍＭ GlutaMax（Invitrogen, Cat 35050-061）、２００μｇ／ｍｌ G418（Sigma,Cat.No.A1720-5G）を添加した培地で３７℃でＣＯ２濃度５％のＣＯ２インキュベーター内で培養、週２回の継代により維持した。継代後約２週間経過した細胞培養液を室温、３５００r.p.m.で５分間遠心分離し、培養上清を回収し、０．４５μｍシリンジフィルターで濾過した。５０ｍＭ Tris-HCl,pH7.0で平衡化した。Hi Trap Protein A HP（GE Healthcare, Cat No. 17-0402-01）カラムに、培養上清を添加後、５０ｍＭ Tris-HCl,pH7.0で洗浄した。０．１Ｍクエン酸，ｐＨ４．０で溶出し、４００μｌづつ採取し、その１０／１量にあたる４０μｌ １Ｍ Tris-HCl,pH9.0で中和した。１００倍量のＰＢＳに対して、Slyde-A-Lyzer 10K Dialysis Cassetes（PIERCE CatNo.66453）を用いて２．５時間を２回後、１５〜１８時間１回の透析を行った。
透析後のサンプルをVIVA SPIN 50,000MWCO PES（VIVASCIENCE CatNo.VS0231）を用いて濃縮した。このサンプルをＰＢＳで平衡化したHiLoad 16/60 superdex 200prep grade（GE Healthcare CatNo.17-1069-01）カラムに添加した。精製サンプルを０．２２μｍシリンジフィルターで濾過した後、VIVA SPIN 50,000MWCO PES（VIVASCIENCE CatNo. VS0231）を用いて濃縮を行った。抗体濃度はBECKMAN COULTER DU530を用いてＡ２８０の値より算出した。
【００７８】
Ｒａｊｉ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＷｉＬ−２、およびＲＣＫ８細胞に対するヒト化抗体ｆｖ、ｆｆ、ｓｆ、ｓｓ、およびキメラ抗体ｃ１ｋ１７９の、濃度とＣＤＣ活性の関係を図１１ａ〜図１１ｄに示す。いずれの実験系においても、濃度５μｇ／ｍｌ以上においてヒト化抗体ｆｖ、ｆｆ、ｓｆ、およびｓｓのＣＤＣ活性はリツキサン（Ｃ２Ｂ８）の活性と同程度であるかあるいはそれを上回っていた。
【００７９】
Ｒａｊｉ細胞（浮遊細胞）に対するＫｄ値が約９．５ｎＭ未満であって、しかもＣＤＣ活性の高い抗体として選別されたクローンｆｖおよびｆｆ（ＣＤＣ活性が期待されるクローン）は、濃度５μｇ／ｍｌ以上においていずれの細胞に対してもリツキシマブよりも高いＣＤＣ活性を示し、特にＳＵ−ＬＤＨＬ４細胞に対するＣＤＣ活性が高く、Ｒａｊｉ細胞およびＲＣＫ８細胞に対してもＣＤＣ活性が高いことがわかった。
【００８０】
Ｒａｊｉ細胞（浮遊細胞）に対するＫｄ値が約９．５ｎＭから約１３ｎＭの範囲であって、できるだけアポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和が大きく、かつ、Ｋｄ値が小さい抗体として選別されたクローンｓｆ（ＣＤＣ活性とアポトーシスの両方が期待される）は、濃度５μｇ／ｍｌ以上においていずれの細胞に対してもリツキシマブと同程度または高い細胞溶解活性を示し、特にＳＵ−ＬＤＨＬ４細胞に対する溶解活性が高く、Ｗｉｌ２細胞およびＲＣＫ８細胞に対する溶解活性が他の抗体よりも高いことがわかった。
【００８１】
Ｒａｊｉ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＷｉＬ−２、およびＲＣＫ８細胞に対するｆｖ、ｆｆ、ｓｆ、およびｓｓのアポトーシス活性についても調べた。表７に結果を示す。
【００８２】
表７ 本発明のヒト化抗体のアポトーシス活性
【表７】
【００８３】
表７の結果から、クローンｓｆは、リツキシマブと同程度あるいはそれよりも強いアポトーシス誘導活性を有すること、アポトーシス誘導に二次抗体を必要とせず、単独で十分なアポトーシス活性を発揮することがわかった。さらに、クローンｓｆのアポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和も、試験したすべての細胞においてリツキシマブを上回っており、特にＷｉＬ２細胞およびＳＵ−ＤＨＬ４細胞において大きな値であった（表６、図１１ａ〜図１１ｄ、および表７参照）。
【００８４】
Ｒａｊｉ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＷｉＬ−２、およびＲＣＫ８細胞に対するｆｖ、ｆｆ、ｓｆ、およびｓｓのＡＤＣＣ活性についても調べた。抗体濃度とＡＤＣＣとの関係を調べた結果を図１２ａ〜図１２ｄに示す（Ｅ：Ｔ比は２５）。Ｅ：Ｔ比とＡＤＣＣとの関係を調べた結果を図１３ａ〜図１３ｄに示す（抗体濃度は１μｇ／ｍｌ）。いずれの実験系においても、ｆｖ、ｆｆ、ｓｆ、およびｓｓのＡＤＣＣ活性はリツキサン（Ｃ２Ｂ８）の活性と同程度であるかあるいはそれを上回っていた。ＡＤＣＣ活性の結果からも、この実験で選抜されたｆｖ、ｆｆ、ｓｆ、およびｓｓの有効性が示された。
【００８５】
これらの結果から、上記のようにして選別された本発明のヒト化モノクローナル抗体はいずれもリツキサンの細胞溶解活性を上回る高い細胞溶解活性を示すことがわかった。したがって、本発明の選抜基準により選抜されたヒト化抗体は、医薬として十分に使用可能なＢ細胞関連疾患治療効果を有するものと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明によれば、自然の状態のヒトＣＤ２０分子に対する結合親和性の高い、医薬として好適な生物学的活性を示すヒト化抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体、ならびにその選抜方法が提供され、医薬として十分に使用可能なＢ細胞関連疾患治療効果を有するものを得ることができる。
【受託番号】
【００８７】
ＣＨＯ細胞hz1791-fv10、hz1791-ff34、hz1791-sf43およびhz1791-ss32は、ブタペスト条約の下、平成１８年（２００６年）３月１日より、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに、各々、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４３、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４４、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４５およびＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４６の受託番号で寄託してある。
【配列表フリーテキスト】
【００８８】
SEQ ID NO: 17: L chain V region sequence of humanized antibody abb 1791
SEQ ID NO: 18: L chain V region sequence of humanized antibody fra 1791
SEQ ID NO: 19: L chain V region sequence of humanized antibody sdr 1791
SEQ ID NO: 20: L chain V region sequence of humanized antibody Ven 1791
SEQ ID NO: 21: H chain V region sequence of humanized antibody abb 1791
SEQ ID NO: 22: H chain V region sequence of humanized antibody fra 1791
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SEQ ID NO: 24: H chain V region sequence of humanized antibody Ven 1791
SEQ ID NO: 25: primer
SEQ ID NO: 26: primer
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ２０はヒトＢリンパ細胞表面に発現している糖鎖不含タンパク質で、末梢血、脾臓、扁桃、骨髄中の正常Ｂ細胞に加えて、多くの悪性腫瘍Ｂ細胞に発現している。ＣＤ２０のモノクローナル抗体が結合するエピトープは多様性が非常に高く、多様な生物学的応答が報告され、また、ＣＤ２０を認識するモノクローナル抗体が多数報告されている。とりわけ、リツキシマブ（rituximab）は、ヒトＢ細胞であるＳＢ細胞株を免疫して得られるマウス抗体２Ｂ８から由来するキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体（Ｃ２Ｂ８)であり（特許文献１および２参照）、登録商標リツキサン（Rituxan）の名称で低悪性度非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の治療薬として実用化されている。さらにその後、リツキサンはＢ細胞が関与する多くの免疫疾患に対して有効であること、例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）などの悪性腫瘍、自己免疫溶血性貧血症、特発性血小板減少症紫斑病（ＩＴＰ）などの病原性自己抗体が関与している自己免疫疾患、関節リウマチ（ＲＡ）や多発性硬化症（ＭＳ）のような炎症性疾患に対して有効であることが報告されている（非特許文献１〜４参照）。
リンパ系Ｂ細胞に結合したリツキシマブにヒト補体が結合し、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）によりリンパ系Ｂ細胞系を溶解することが報告されており（非特許文献５参照）、またリツキシマブは抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）のアッセイでは活性を示し、トリチウム化チミジン導入アッセイでは抗増殖効果と、アポトーシス誘発が報告されている（非特許文献６参照）。
一方、異種動物とのキメラ分子は抗原性を有するため治療薬として一般には好まれないが、リツキシマブを含め、抗ＣＤ２０抗体は正常細胞を含む全てのＢ細胞を標的し除去する性質を有するため抗原性はないと考えられた。しかし、数パーセントではあるが治療期間中に中和抗体を誘起する事例が報告されていること、投与する量や期間によってはさらにその可能性が高まることや、治療対象疾患がＢ細胞リンパ腫から、ＲＡ、ＩＴ、ＭＳに拡大していくなかで抗原性の問題がクローズアップされ、最近、よりヒトに近い配列を有するヒト化抗体またはヒト抗体が要望されるようになっている。
さらに、キメラ抗体は、血中半減期が比較的短い問題を有し、リツキシマブを含めマウス／ヒトのキメラ抗体のベータ半減期（β１／２）は３〜４日に過ぎず、リツキシマブの低悪性度ＮＨＬに対する臨床試験の奏効率は５０％弱であったことが報告されている（非特許文献７参照）。また、リツキシマブのＣＤ２０抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）は５．２ｎＭであり、結合親和性があまり高くなく、ＮＨＬ治療において投与量が多くなる問題もある（非特許文献８参照)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第９４／１１０２６号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５７３６１３７号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Coiffier B et al., Blood 1998; 92:1297-32
【非特許文献２】Edward JC et al., Rheumatology (Oxford) 2001; 40:205-11
【非特許文献３】Zaja F et al., Heamatologica 2002; 87:189-95
【非特許文献４】Perrotta S et al., Br J Haematol 2002; 116:465-7
【非特許文献５】Reff et al., Blood 1994; 83: 435-445
【非特許文献６】Maloney et al., Blood 1996; 88: 637a
【非特許文献７】IDEC Pharmaceuticals Corporation News Release, December 8, 1998
【非特許文献８】Mitchell ER et al., Blood 1994; 82:435-445
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のような事情に鑑み、本発明は、医薬としてさらに適した生物学的活性を示す抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記目的を達成するため、自然の状態のヒトＣＤ２０分子に対する結合親和性の高いモノクローナル抗体を作製し、優れた機能を有する抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を得るべく鋭意研究を重ねた。その結果、免疫原としてＣＤ２０抗原が高密度とされるＢ細胞株であるＳＢ細胞やRaji細胞と、遺伝子組換により細胞膜上にＣＤ２０を多量に発現させた非ヒト動物細胞を組み合わせて用いることにより、高親和性のモノクローナル抗体であって、優れた生物学活性を示すものが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
さらに本発明者らは、有効な抗ヒトＣＤ２０ヒト化抗体の新たな選抜方法を見出すことに成功した。この選抜方法を用いることにより、本発明のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体のなかから医薬品として有効に使用できるものを選抜することができた。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下のものを提供する：
（１）ヒトＣＤ２０抗原を発現しているヒトＢ細胞株と、ヒトＣＤ２０のＤＮＡで形質転換された非ヒトかつ被免疫動物とは異なる動物由来の細胞株とを免疫原とするヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性を有する、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であって、下記選抜基準：
（ｉ）ヒトＣＤ２０抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）が約９．５ｎＭ未満であって、Ｂ細胞に対するＣＤＣ活性が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体
を満たすヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、
（２）ヒトＣＤ２０抗原を発現しているヒトＢ細胞株と、ヒトＣＤ２０のＤＮＡで形質転換された非ヒトかつ被免疫動物とは異なる動物由来の細胞株とを免疫原とするヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性を有する、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であって、下記選抜基準：
（ａ）ヒトＣＤ２０抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）が約９．５ｎＭ未満であって、Ｒａｊｉ細胞（浮遊細胞）またはＳＵ−ＤＨＬ４細胞に対するＣＤＣ活性が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体
を満たすヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、
（３）ヒトＣＤ２０抗原を発現しているヒトＢ細胞株と、ヒトＣＤ２０のＤＮＡで形質転換された非ヒトかつ被免疫動物とは異なる動物由来の細胞株とを免疫原とするヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性を有する、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であって、下記選抜基準：
（ｉｉ）ヒトＣＤ２０抗原に対するＫｄ値が約９．５ｎＭから約１３ｎＭの範囲であって、Ｂ細胞に対するアポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体
を満たすヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、
（４）ヒトＣＤ２０抗原を発現しているヒトＢ細胞株と、ヒトＣＤ２０のＤＮＡで形質転換された非ヒトかつ被免疫動物とは異なる動物由来の細胞株とを免疫原とするヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性を有する、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であって、下記選抜基準：
（ｂ）ヒトＣＤ２０抗原に対するＫｄ値が約９．５ｎＭから約１３ｎＭの範囲であって、ＷｉＬ２細胞またはＲＣＫ８細胞に対するアポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体
を満たすヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、
（５）配列番号１８のＬ鎖と配列番号２２のＨ鎖を組み合わせた（１）または（２）記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、
（６）配列番号１８のＬ鎖と配列番号２４のＨ鎖を組み合わせた（１）または（２）記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、
（７）配列番号１９のＬ鎖と配列番号２２のＨ鎖を組み合わせた（３）または（４）記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、ならびに
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を有効成分として含むＢ細胞関連疾患治療剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、ＣＤ２０抗原の細胞外エピトープに対して強い結合親和性を示し、かつＣＤＣなどの細胞傷害活性が高いヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体が得られ、これらの抗体は、Ｂ細胞が関与する疾患の治療剤として極めて有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】組換抗体発現用ベクターpNOW-Abの構造を示す制限地図である。
【図２】タンパク発現用ベクターpNOWの構造を示す制限地図である。
【図３ａ】アポトーシス試験の結果を示すグラフである。
【図３ｂ】アポトーシス試験の結果を示すグラフである。
【図３ｃ】アポトーシス試験の結果を示すグラフである。
【図３ｄ】アポトーシス試験の結果を示すグラフである。
【図４ａ】抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。
【図４ｂ】抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。
【図４ｃ】抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。
【図４ｄ】抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。
【図５ａ】Ｅ：Ｔ比とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。
【図５ｂ】Ｅ：Ｔ比とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。
【図５ｃ】Ｅ：Ｔ比とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。
【図５ｄ】Ｅ：Ｔ比とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。
【図６ａ】ＣＤＣ試験の結果を示すグラフである。
【図６ｂ】ＣＤＣ試験の結果を示すグラフである。
【図６ｃ】ＣＤＣ試験の結果を示すグラフである。
【図６ｄ】ＣＤＣ試験の結果を示すグラフである。
【図７ａ】マウス抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
【図７ｂ】マウス抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
【図７ｃ】マウス抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
【図７ｄ】マウス抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
【図８ａ】ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
【図８ｂ】ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
【図８ｃ】ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
【図８ｄ】ヒト化抗体でのアポトーシス実験結果を示すグラフである。
【図９ａ】ヒト化抗体での早期アポトーシスに対する割合を示すグラフである。
【図９ｂ】ヒト化抗体での早期アポトーシスに対する割合を示すグラフである。
【図９ｃ】ヒト化抗体での早期アポトーシスに対する割合を示すグラフである。
【図９ｄ】ヒト化抗体での早期アポトーシスに対する割合を示すグラフである。
【図１０ａ】ヒト化抗体の解離定数および細胞障害活性（アポトーシス誘導活性およびＣＤＣ活性）の関係を示すグラフである。使用細胞はＲａｊｉ細胞である。白四角はＣＤＣ活性（％）、黒丸はアポトーシス活性（％）を示す。
【図１０ｂ】ヒト化抗体の解離定数および細胞障害活性（アポトーシス誘導活性およびＣＤＣ活性）の関係を示すグラフである。使用細胞はＳＵ−ＤＨＬ４細胞である。白四角はＣＤＣ活性（％）、黒丸はアポトーシス活性（％）を示す。
【図１０ｃ】ヒト化抗体の解離定数および細胞障害活性（アポトーシス誘導活性およびＣＤＣ活性）の関係を示すグラフである。使用細胞はＷｉＬ２細胞である。白四角はＣＤＣ活性（％）、黒丸はアポトーシス活性（％）を示す。
【図１０ｄ】ヒト化抗体の解離定数および細胞障害活性（アポトーシス誘導活性およびＣＤＣ活性）の関係を示すグラフである。使用細胞はＲＣ−Ｋ８である。白四角はＣＤＣ活性（％）、黒丸はアポトーシス活性（％）を示す。
【図１１ａ】ヒト化抗体およびキメラ抗体のＣＤＣ活性を示すグラフである。使用細胞はＲａｊｉ細胞である。
【図１１ｂ】ヒト化抗体およびキメラ抗体のＣＤＣ活性を示すグラフである。使用細胞はＳＵ−ＤＨＬ４細胞である。
【図１１ｃ】ヒト化抗体およびキメラ抗体のＣＤＣ活性を示すグラフである。使用細胞はＷｉＬ２細胞である。
【図１１ｄ】ヒト化抗体およびキメラ抗体のＣＤＣ活性を示すグラフである。使用細胞はＲＣ−Ｋ８である。
【図１２ａ】ヒト化抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。使用細胞はＲａｊｉ細胞である。
【図１２ｂ】ヒト化抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。使用細胞はＳＵ−ＤＨＬ４細胞である。
【図１２ｃ】ヒト化抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。使用細胞はＷｉＬ２細胞である。
【図１２ｄ】ヒト化抗体濃度とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。使用細胞はＲＣ−Ｋ８細胞である。
【図１３ａ】ヒト化抗体のＥ：Ｔ比とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。使用細胞はＲａｊｉ細胞である。
【図１３ｂ】ヒト化抗体のＥ：Ｔ比とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。使用細胞はＳＵ−ＤＨＬ４細胞である。
【図１３ｃ】ヒト化抗体のＥ：Ｔ比とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。使用細胞はＷｉＬ２細胞である。
【図１３ｄ】ヒト化抗体のＥ：Ｔ比とＡＤＣＣの関係を示すグラフである。使用細胞はＲＣ−Ｋ８細胞である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書および図面において用いる略号を以下に示す。
Pcmv: サイトメガロウイルスプロモーター
PAbgh: ウシ成長ホルモン遺伝子ポリＡ付加シグナル
Psvd: エンハンサーを欠失させたシミアンウイルス４０プロモーター
DHFR: マウスジヒドロ葉酸還元酵素ｃＤＮＡ
PAsv: シミアンウイルス４０ポリＡ付加シグナル
PBR322ori: 大腸菌中での複製起点
Ampr: 大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）
Neor: 哺乳動物細胞中での選択マーカー（Ｇ４１８耐性）
INrbg: ウサギβグロビンイントロン
SPl: 抗体軽鎖シグナルペプチド
VL: 抗体軽鎖可変領域ｃＤＮＡ
Cκ: 抗体κ軽鎖定常領域ｃＤＮＡ
SPh: 抗体軽鎖シグナルペプチド
Vh: 抗体軽鎖可変領域ｃＤＮＡ
Cγ1: 抗体γ1重鎖定常領域ｃＤＮＡ
【００１２】
本明細書において、「抗体」には、抗体全体のみならず、抗体全体と同等の、抗原に対する結合親和性を示すフラグメント、例えば、元の抗体全体の可変領域を含むフラグメント（例、Fab、F(ab’)2など）も包含する。
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＣＤ２０抗原に対し高い親和性を有し、かつ、優れた生物学的活性を示すモノクローナル抗体であり、マウス由来のモノクローナル抗体、そのキメラ化、ヒト化抗体を包含する。
その好ましい第１の態様は、ヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対して増殖阻害活性を有し、ヒトＣＤ２０抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）が、リツキシマブの由来するマウス抗体である２Ｂ８の１／２以下の、好ましくは１．７０〜３．３９ｎＭの、ヒトＣＤ２０抗原に対して高い親和性を有するモノクローナル抗体である。
解離定数（Ｋｄ値）の測定方法は、細胞上に発現する抗原に対するＫｄ値を測定できる方法であれば特に限定するものではないが、本明細書においては、後の実施例に記載する方法による解離定数とする。
【００１３】
ヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性は２Ｂ８よりも大きいことが好ましい。増殖阻害活性は、好ましくは、末梢血単核細胞非存在下でのヒトＣＤ２０抗原を有する細胞のin vitro培養に対する増殖阻害活性であり、さらに好ましくは、増殖阻害活性はアポトーシス誘導によるものである。抗ＣＤ２０抗体のうちいくつかの抗体では、ＣＤ２０への結合に伴いＢ細胞内のカルシウムイオン（Ｃａ２＋）濃度を上昇させＳｒｃキナーゼが関与するアポトーシスを誘導することが報告されている。
上記の増殖阻害活性の測定は、例えば、Miyamoto T, Min W, Lillehoj HS.Avian Dis. 2002 Jan-Mar;46(1):10-6に記載の方法により測定できる。
【００１４】
本発明の第１の態様のモノクローナル抗体の具体的な例としては、Ｌ鎖可変領域アミノ酸配列とＨ鎖可変領域アミノ酸配列がそれぞれ配列番号１及び９、配列番号２及び１０、又は、配列番号３及び１１であるマウスを由来とするモノクローナル抗体と、それらの抗体をキメラ化又はヒト化したものが挙げられる。
キメラ化は、例えば、Ishida T, Imai K, Nippon Rinsho Vol 60, No 3, 2002-3:439-444に記載されるような公知の方法に従って、マウス由来モノクローナル抗体の可変領域アミノ酸配列とヒトイムノグロブリン定常領域アミノ酸配列を融合させることにより行うことができる。
ヒト化は、例えば、上記Ishida T, Imai K, Nippon Rinsho Vol 60, No 3, 2002-3:439-444や、Eduardo A.Padlan, Molecular Immunology, Vol. 28-4/5, pp489-498, 1991； Eduardo A.Padlan et.al., The FASEB Journal,vol.9, pp133-139;およびTai te Wu, Elvin A. Kabat, Molecular Immunology, Vol.29-9, pp1141-1146, 1992に記載されるような公知の方法に従って、マウス由来モノクローナル抗体の可変領域ＣＤＲアミノ酸配列とヒトイムノグロブリンのアミノ酸配列を用いて行うことができる。
キメラ化又はヒト化を行う場合には、複数のマウスモノクローナル抗体のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列と、Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列を任意に組み合わせてもよい。例えば、配列番号１〜３のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域アミノ酸配列をキメラ化したＬ鎖と配列番号９〜１１のマウス由来モノクローナル抗体可変領域アミノ酸配列をキメラ化したＨ鎖を組み合わせたキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、配列番号１〜３のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域ＣＤＲのアミノ酸配列をヒト化したＬ鎖と配列番号９〜１１のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域ＣＤＲ配列をヒト化したＨ鎖を組み合わせたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体が挙げられる。
【００１５】
本発明の好ましい第２の態様の抗体は、ヒトＣＤ２０抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）が２Ｂ８の１／８以下であるマウス由来モノクローナル抗体をキメラ化またはヒト化したモノクローナル抗体である。
ヒトＣＤ２０抗原に対し高い親和性を有する抗体で、特にヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３、又はそれらを改変したヒトFc配列を有する抗体（マウス由来モノクローナル抗体をキメラ化又はヒト化したものを含む）は、細胞表面上のＣＤ２０に結合した場合、ＮＫ細胞上のFcγRIII（ＣＤ１６）を介したエフェクター細胞の活性化を誘発し、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を起こすことがよく知られている。また、ヒトＣＤ２０抗原に対し高い親和性を有する抗体で、特にヒトＩｇＧ又はＩｇＭ、又はそれらを改変したヒトFc配列を有する抗体（マウス由来モノクローナル抗体をキメラ化又はヒト化したものを含む）は、細胞表面上のＣＤ２０に結合した場合、補体の活性化を誘発し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を起こすこともよく知られている。
かくして、本発明の第２の態様の抗体は、ＡＤＣＣ又はＣＤＣを示すことが期待できる。
第２の態様の抗体の具体的な例としては、Ｌ鎖可変領域アミノ酸配列とＨ鎖可変領域アミノ酸配列がそれぞれ配列番号４及び１２、配列番号５及び１３、配列番号６及び１４、配列番号７及び１５、又は、配列番号８及び１６であるものが挙げられる。
キメラ化又はヒト化は、第１の態様の抗体と同様に行うことができ、その場合、複数のマウスモノクローナル抗体のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列と、Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列を任意に組み合わせてもよい。例えば、配列番号４〜８のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域アミノ酸配列をキメラ化したＬ鎖と配列番号１２〜１６のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域アミノ酸配列をキメラ化したＨ鎖を組み合わせたキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、配列番号４〜８のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域ＣＤＲのアミノ酸配列をヒト化したＬ鎖と配列番号１２〜１６のいずれかのマウス由来モノクローナル抗体可変領域ＣＤＲ配列をヒト化したＨ鎖を組み合わせたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体が挙げられる。
【００１６】
本発明の好ましい第３の態様の抗体は、リツキシマブが効果を示さない細胞に対しても有効なヒト化したモノクローナル抗体を包含する、２Ｂ８に対する特定の解離定数に限定されない一群のヒト化抗体である。
これらの抗体の例としては、配列番号１８のＬ鎖と配列番号２４のＨ鎖、配列番号１８のＬ鎖と配列番号２２のＨ鎖、配列番号１９のＬ鎖と配列番号２２のＨ鎖または配列番号１９のＬ鎖と配列番号２３のＨ鎖を組み合わせたヒト化ＣＤ２０モノクローナル抗体が挙げられる。
【００１７】
さらに本発明者らは、本発明により得られたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体について、抗体のヒトＣＤ２０抗原に対する親和性とＣＤＣ活性、アポトーシス誘導活性との相関に基づいて抗体のタイプを分類し、その分類に基づいて抗体医薬品として有用なモノクローナル抗体を選抜することができた（実施例４参照）。
【００１８】
すなわち、親和性が高い抗体は、それ自身でアポトーシスを誘導することができず、アポトーシスの誘導に二次抗体によるクロスリンクが必要であること、一方、親和性が低い抗体は、それ自身でアポトーシス誘導活性を発揮することがわかった。さらに、親和性が高い抗体ほどＣＤＣ活性も高いケースが多いこともわかった。それゆえ、親和性の低い抗体は、二次抗体が存在しなくてもアポトーシスを誘導できるが、ＣＤＣ活性が低い傾向を有する。したがって、これらの知見から、医薬品として有効な候補抗体を見出すことができる、２つの選抜基準を設定することができた：
−単独ではアポトーシスを誘導しないが、ヒトＣＤ２０抗原に対する親和性が極めて高く、ＣＤＣにより抗ガン効果を発揮しうる抗体；あるいは
−単独でアポトーシス誘導活性を持ち、アポトーシスとＣＤＣにより抗ガン効果を発揮しうる抗体のうち、ヒトＣＤ２０抗原に対する親和性が高いもの。
【００１９】
前者の選抜基準では、ヒトＣＤ２０抗原に対する親和性が高く、かつＣＤＣ活性も高いものを選抜することが好ましい（Ｋｄ値が低いほどＣＤＣ活性が高い傾向が見られる）。前者の選抜基準を満たすクローンの場合には、単独でアポトーシス誘導は引き起こさないが、親和性が高いという利点を有し、高いＣＤＣ活性により細胞枯渇を促すことができる。本発明者らは、前者の選抜基準を満たす抗体は、約９．５ｎＭ未満のヒトＣＤ２０抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）を有するものが多いことを見出した。
【００２０】
後者の選抜基準では、抗体によるアポトーシスとＣＤＣの総和が大きく、かつ、ヒトＣＤ２０抗原に対する親和性が高いものを選抜することが好ましい。したがって、後者の選抜基準を満たすクローンの場合には、親和性は高くないが、アポトーシス活性が高いという利点を有し、アポトーシス誘導とＣＤＣの相乗効果により細胞枯渇を促すことができる。本発明者らは、後者の選抜基準を満たす抗体は、約９．５ｎＭから約１３ｎＭの範囲のヒトＣＤ２０抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）を有するものが多いことを見出した。
【００２１】
上記選抜基準を数値的に表現することが好ましい。したがって、上記選抜基準は各々次のように表現することができる：
（ｉ）ヒトＣＤ２０抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）が約９．５ｎＭ未満であって、Ｂ細胞に対するＣＤＣ活性が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体；あるいは
（ｉｉ）ヒトＣＤ２０抗原に対するＫｄ値が約９．５ｎＭから約１３ｎＭの範囲であって、Ｂ細胞に対するアポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体。
ここに、同等とは、比較すべき値の±約１０％の範囲の値を意味する。
【００２２】
本発明者らはさらに実験を行って、Ｂ細胞の種類に応じて上記選抜基準を適用することが好ましいことを見出した。具体的には後記実施例４で得られた結果をふまえて、上記選抜基準（ｉ）を（ａ）のように、（ｉｉ）を（ｂ）のように、各々、さらに詳細に表現することができる：
（ａ）ヒトＣＤ２０抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）が約９．５ｎＭ未満であって、Ｒａｊｉ細胞（浮遊細胞）またはＳＵ−ＤＨＬ４細胞に対するＣＤＣ活性が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体；あるいは
（ｂ）ヒトＣＤ２０抗原に対するＫｄ値が約９．５ｎＭから約１３ｎＭの範囲であって、ＷｉＬ２細胞またはＲＣＫ８細胞に対するアポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体。
ここに、同等とは、比較すべき値の±約１０％の範囲の値を意味する。
【００２３】
上記（ｉ）または（ａ）の選抜基準に従う場合には、ヒトＣＤ２０抗原に対するＫｄ値が約９．５ｎＭ未満であって、できるだけＫｄ値が低く、かつ、ＣＤＣ活性の高い抗体を選抜することが好ましい。好ましくは、Ｒａｊｉ細胞（浮遊細胞）またはＤＨＬ４細胞に対するＣＤＣ活性が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体を選択する。通常は、Ｋｄ値の小さい抗体ほどＣＤＣ活性が高い傾向があるので、単にＫｄ値の小さい（ＣＤ２０抗原に対する親和性が高い）抗体を選抜すればよい。（ｉ）または（ａ）の選抜基準を満たす抗体は、ＣＤ２０抗原に対する親和性が極めて高く、ＣＤＣ活性も極めて高いので、優れた抗ガン効果を発揮することができる。ただし、（ｉ）または（ａ）の選抜基準を満たす抗体は、単独ではアポトーシスを誘導せず、アポトーシスの誘導には二次抗体を必要とする。
【００２４】
上記（ｉｉ）または（ｂ）の選抜基準に従う場合には、ヒトＣＤ２０抗原に対するＫｄ値が約９．５ｎＭから約１３ｎＭの範囲であって、できるだけアポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和が大きく、かつ、Ｋｄ値が小さい抗体を選抜することが好ましい。好ましくは、ＷｉＬ２細胞またはＲＣＫ８細胞に対するＣＤＣ活性とアポトーシス活性の総和が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上のものを選抜する。（ｉｉ）または（ｂ）の選抜基準を満たす抗体は、ＣＤ２０抗原に対する親和性がある程度高く、単独でアポトーシスを誘導でき、アポトーシスとＣＤＣの相乗効果により優れた抗ガン効果を発揮することができる。好ましくは、アポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上のものを選抜する。
【００２５】
換言すれば、（ｉ）または（ａ）の選抜基準は、抗体が極めて高いＣＤＣ活性を有することを期待する場合に適用することができ、（ｉｉ）または（ｂ）の選抜基準は、抗体がＣＤＣ活性とアポトーシス活性の両方を有することを期待する場合に適用することができる。
【００２６】
本発明により得られたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であって、上記選抜基準（ｉ）または（ａ）を満たす抗体としては、配列番号１８のＬ鎖と配列番号２２のＨ鎖を組み合わせたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、ならびに配列番号１８のＬ鎖と配列番号２４のＨ鎖を組み合わせたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体が例示される。
本発明により得られたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であって、上記選抜基準（ｉｉ）または（ｂ）を満たす抗体としては、配列番号１９のＬ鎖と配列番号２２のＨ鎖を組み合わせたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体が例示される。
【００２７】
また、本発明の抗体とは異なるエピトープを認識する抗体、例えば、本発明以外の方法により得られた抗体についても、本発明の選抜に関する考え方を適用し、選抜することが可能である。したがって、本発明は、さらなる態様において、下記選抜基準：
−単独ではアポトーシスを誘導しないが、抗原に対する親和性が極めて高く、ＣＤＣにより抗ガン効果を発揮しうる抗体；あるいは
−単独でアポトーシス誘導活性を持ち、アポトーシスとＣＤＣにより抗ガン効果を発揮しうる抗体のうち、抗原に対する親和性が高いもの
を用いることを特徴とする抗ガン抗体の選抜方法、ならびに該方法により選抜された抗体にも関する。
【００２８】
選抜基準（ｉ）または（ａ）、あるいは（ｉｉ）または（ｂ）を適用する際の、抗原に対する親和性、アポトーシス活性およびＣＤＣ活性の測定は、当該分野で知られているいずれの手法を用いて行ってもよい。抗原に対する親和性に関しては、抗原との解離定数を測定し、これを指標とするのが一般的である。ヒトＣＤ２０抗原に対するヒト化抗体の解離定数の測定は、ヒトＣＤ２０抗原を発現している細胞を標的として使用して行うのが一般的である。その際、ヒトＣＤ２０抗原を発現していない細胞をコントロールとして用いることが好ましい。細胞に結合したヒト化抗体の検出には、ヒト化抗体に検出可能な標識を付す、あるいはヒト化抗体に対する標識化特異的抗体を用いる等の手法を用いることができる。例えば、本明細書の実施例２に記載のごとくヒトＣＤ２０抗原に対する親和性（あるいは解離定数、Ｋｄ値）を測定してもよい。
【００２９】
以下に、本発明のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の取得および選抜について説明する。
本発明のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の作製に使用できるマウス由来モノクローナル抗体は、例えば、つぎのような方法によるスクリーニングで得られたハイブリドーマのクローンから目的の性質を有するモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することにより得ることができる。
感作抗原（免疫原）として、例えば、ＣＤ２０を発現している細胞であるＳＢ細胞又はRaji細胞と、例えば、遺伝子組換えにより商業的に入手可能なＣＤ２０のＤＮＡ（又は、同等の効果を有するそのフラグメント等）で形質転換して細胞表面上にＣＤ２０を発現させたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＣＤ２０）を用いる。そして、初回免疫、追加免疫、及び、最終免疫を行う際に、初回免疫及び追加免疫が、免疫の少なくとも１回は、感作抗原として、該抗原を発現する、被免疫動物とは他の目に属する動物に由来する細胞株を用いる免疫、及び、免疫の少なくとも１回は、感作抗原として、遺伝子組換により細胞膜表面上に該抗原を発現させた、被免疫動物と同目に属する動物に由来する細胞株を用いる免疫のいずれか一方であり、最終免疫が他方であるようにする。
この他の条件は、通常のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製法と同様でよい。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、公知の方法に従って、（１）被免疫動物の免疫、（２）免疫された動物からのリンパ球の調製、（３）親細胞の調製、（４）リンパ球と親細胞の細胞融合、（５）スクリーニング及びクローニングによって作製される（例えば、Ailsa M. Campbell (著)、大沢 利昭 (訳) 生化学実験法 モノクローナル抗体、東京化学同人、1989年参照）。
得られたクローンを用いてハイブリドーマを用いてモノクローナル抗体を作製する方法は、本発明のハイブリドーマ作製法で作製されたハイブリドーマを用いることの他は、通常の、モノクローナル抗体の作製の方法と同様でよい。大量作製の場合には、細胞培養による方法、マウスの腹水として作製する方法などが挙げられる。また、キメラ化又はヒト化抗体を作製する場合には、キメラ化又はヒト化抗体をコードする遺伝子を作製し、それを発現ベクターに組み込み、発現ベクターを適当な細胞で発現させることにより作製することができる。
【００３０】
例えば、Ｌ鎖およびＨ鎖の可変領域遺伝子を、ヒトイムノグロブリンＬ鎖およびＨ鎖（κ）定常域遺伝子とでキメラ化し、ＣＨＯ細胞用高発現ベクターに組み込む。組換抗体生産用のベクターシステムは市販されているものでよいが、哺乳動物細胞高発現ベクターpNOW（特許第３５８２９６５号公報）を基に、Ｌ鎖、Ｈ鎖両方のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を有するダイマー用高発現ベクターpNOW-abに構築したものを使用できる。各ベクターの構成を示す制限地図を図１および図２に示す。キメラ抗体遺伝子が組み込まれた発現ベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、それぞれ生産性の高いクローンを選別する。そのクローンから通常の方法で抗体を作製する。
【００３１】
本発明の第１の態様の抗体は、結合親和性がリツキシマブに比べて相対的に高くかつ増殖阻害活性、好ましくはアポトーシス誘導による活性が高いので、キメラ化又はヒト化した抗体はＢ細胞悪性腫瘍及びＢ細胞が関与する免疫疾患に対する治療剤の有効成分として使用できる。また、本発明の第２、第３の態様の抗体は、ヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対して抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示すと考えられるので、Ｂ細胞悪性腫瘍及びＢ細胞が関与する免疫疾患に対する治療剤の有効成分として使用できる。したがって、本発明は、これらキメラ化又はヒト化した抗体を有効成分とするＢ細胞関連疾患に対する治療剤も提供する。
また、本発明のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体は、上記（ｉ）または（ａ）、あるいは（ｉｉ）または（ｂ）の選抜基準を用いて選抜することができ、これらの選抜基準を満たすものはＢ細胞悪性腫瘍及びＢ細胞が関与する免疫疾患に対して有効性が高く、特に医薬用として好都合である。したがって、上記（ｉ）または（ａ）、あるいは（ｉｉ）または（ｂ）の選抜基準を満たすヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を有効成分として含有するＢ細胞関連疾患治療剤を提供する。
【００３２】
さらに、本発明においては、本発明の抗体を２種以上併用してもよい。
Ｂ細胞関連疾患としては、以下に限定するものではないが、例えば、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、関節リウマチ、自己免疫溶血性貧血症、特発性血小板減少症紫斑病、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、シェーグレン症候群、クローン病、強皮症、多発性硬化症などが挙げられる。
該治療剤は、公知の製剤技術に従って製造でき、他の配合成分は特に限定するものではなく、公知のリツキサンを参考にして、投与量等も決定することができる。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
（１）マウス感作用免疫原の準備
ＣＤ２０を発現しているＢ細胞株であるＳＢ細胞とRaji細胞をin vitroで培養した。
また、別途、Multiple Choice cDNA human spleen, Origene Technologies, Inc. 6 Taft Court, Suite 100, Rockville, MD 20850から入手したＣＤ２０の全分子をコードするＤＮＡを、特異的なプライマーhCD20-S-GK-Not aatgcggccgccaccatgacaacacccagaaattc（配列番号２５）、及びhCD20-E-Xba gctctagattaaggagagctgtcattttc（配列番号２６）を用いてクローニングし、それを哺乳動物細胞用高発現ベクターであるpNOW（図１)に組み込み、構築されたベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。ＦＡＣＳ分析により、細胞表面にＣＤ２０分子を高発現している組換ＣＨＯ細胞（ＣＤ２０／ＣＨＯ細胞）を樹立した。ここにおいて、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ２０モノクローナル抗体で染色した際に、ＳＢ細胞に比べて蛍光強度が５倍以上のものを高発現しているものとした。
【００３４】
（２）免疫原の調製
ＳＢ細胞またはRaji細胞は１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養を行った。ＣＤ２０／ＣＨＯ細胞は、Ｇ４１８を８００μｇ／ｍｌ添加したＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ培地（GIBCO、Cat. No. 12052-098）を用いて培養を行った。これらの培養液を１１００ｒｐｍで、５分遠心分離した後、細胞にDulbecco’s PBS(-)を加えて懸濁させ再度遠心分離した。この洗浄操作をもう一度繰り返し、細胞に生理食塩水を加えて調製した懸濁液（細胞数：１〜３×１０７／ｍｌ）を免疫に用いた。
【００３５】
（３）免疫
７〜１１週令のBalb/c系雌性マウスへ、免疫原の調製液をいずれも腹腔内投与した。ＳＢ細胞又はＣＤ２０／ＣＨＯ細胞のうち、いずれか同じ細胞をさまざまな日数間隔で２〜３回繰り返して投与した後、最終免疫には異なった細胞（ＣＤ２０／ＣＨＯ細胞又はRaji細胞）を投与した。投与した細胞数はいずれもマウス１匹当たり１〜３×１０７個であった。
使用した免疫原の組み合わせを表１に示す。
【００３６】
（４）細胞融合
最終免疫の３日後、２匹のマウスから脾臓細胞を調製し、Oi,V.T. and L.A. Herzenberg, 1980, in:Selected Methods in Cellular Immunology, eds. B. Mishell and S.M. Shiigi(Freeman and Co.San Francisco, CA) p.351に従って、マウスミエロ−マ（ＮＳ−１）との融合反応をＰＥＧ−１５００の存在下で行なった。
【００３７】
（５）１次、２次スクリーニング
ＣＤ２０／ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞（親株）を付着させた９６ウエルプレートを用いてCell ELISAを行い、ＣＤ２０に特異的に反応する抗体を産生しているウエルを選択した。さらに、同じＣＤ２０／ＣＨＯ細胞を付着させた９６ウエルプレートを用い、リツキシマブ（Ｃ２Ｂ８）との競合反応を行って、Ｃ２Ｂ８のエピトープと類似したところに反応する抗体（ウエル）を選択した。
表１にスクリーニング結果を示す。
【００３８】
（６）Cell ELISA
Poly-L-Lysineコート９６ウエルプレート（旭テクノグラス、Cat.No.11-023-018）に付着させたＣＤ２０／ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞（親株）をCell ELISAに用いた。その各ウエルにブロッキング液（０．２％−ゼラチン、０．５％ＢＳＡのＰＢＳ溶液）を１５０μｌ入れて３７℃で１時間静置した。１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、０．０５％−Tween２０水溶液を用いてプレートを５回洗浄した後、サンプル（培養上清の希釈液）を各ウエルに１００μｌ入れて１次反応を３７℃で１時間行なった。洗浄後、標識抗体の希釈液〔ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ウサギ抗体（Jackson Lab. Code No. 315-035-003）、またはＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Fcγ）ウサギ抗体（Jackson Lab. Code No. 315-035-008）〕を各ウエルに１００μｌ入れて２次反応を３７℃で１時間行なった。１次、２次の反応液の調製には、ブロッキング液と同じものを用いた。洗浄後、発色液（ＯＰＤ）を各ウエルに１００μｌ入れ３０分後に４Ｎ−Ｈ２ＳＯ４を５０μｌ加えて反応を停止し、４９２ｎｍの吸光度を測定した。
【００３９】
（７）Cell ELISAでの競合反応
サンプル（培養上清の希釈液）とキメラ抗体（１０〜４０ｎｇ／ｍｌ）の混合溶液を調製した。
上記のCell ELISAと同様にブロッキング反応をしたあと、この混合溶液を各ウエルに１００μｌ入れて１次反応を３７℃で１時間行なった。洗浄後、標識抗体の希釈液〔ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ウサギ抗体（Jackson Lab. Code No. 309-035-082）〕を各ウエルに１００ｕｌ入れて２次反応を３７℃で１時間行なった。洗浄後、発色液（ＯＰＤ）を各ウエルに１００μｌ入れ３０分後に４Ｎ−Ｈ２ＳＯ４を５０μｌ加えて反応を停止し、４９２ｎｍの吸光度を測定した。
標識抗体はキメラ抗体のみに反応するので、１次反応で添加したサンプル中の抗体がキメラ抗体と競合すれば、測定値の低下が認められた。
【００４０】
（８）クローニング
限界希釈法で行った。細胞を９６ウエルプレートに撒いて培養後、１コロニーのウエルの培養上清についてCell ELISAを行い、特異抗体の産生クローンを選択した。
【００４１】
（９）精製抗体の調製
特異抗体の産生クローンを１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、細胞密度が５×１０５／ｍｌ前後になった時点で無血清培地ＡＳＦ−１０４Ｎ（味の素）に培地を交換して培養を行った。その２〜４日後に培養液を遠心分離して培養上清を回収したあと、プロテインＧカラムを用いて精製を行い、溶出されたモノクローナル抗体溶液を１５０ｍＭ−ＮａＣｌに対して透析した。０．２μｍのフィルターでろ過滅菌を行ない、試験抗体（抗ヒトＣＤ２０マウスモノクローナル抗体）とした。
【００４２】
【表１】
代表的な８クローンの産生するモノクローナル抗体について、Ｌ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列（配列番号１〜８）及びＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列(配列番号９〜１６)は以下のとおりである。
【００４３】
1K0924のH鎖V領域配列（配列番号１１）
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNIHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTSDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARMSTMITGFDYWGQGTTLTVSS
1K1228のH鎖V領域配列（配列番号１６）
QVQLQQPGAELVKPGASVKVSCKASGFTFTSYNLHWVKQTPGQGLVWIGAIYPGNGDTSYNQKFRGKATLTADISSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYYGYDAMDYWGQGTSVTVSS
1k1422のH鎖V領域配列 (配列番号９)
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCRASGYTFTNYNMHWIKQTPGQGLEWIGAIYPGSGDTSYNRKFKGKATLTADTSSSTAYMQFSSLTSADSAVYYCARFTYYYGGTYGAMDYWGQGTSVTVSL
1k1791のH鎖V領域配列 (配列番号１０)
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNFGVNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYADDFKGRFAFSLEASANTAYLQINNLKNDDMSTYFCTRRTNYYGTSYYYAMDYWGQGTSVTVSS
1k1712のH鎖V領域配列 (配列番号１２)
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGFTFTSYNLHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGSGDTSYNQQFKGKATLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYCCARSAMISTGNWYFDYWGQGTTLTVSS
1k1402のH鎖V領域配列 (配列番号１３)
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGFTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGGIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARFYYYGSMGAMDYWGQGTSVTVSS
1k1736のH鎖V領域配列 (配列番号１４)
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYNLHWVKQTPGQGLEWIGGIYPGNGDTSYNQKFKVKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARWIYYGNYEGTLDYWGQGTSVTVSS
1k1782のH鎖V領域配列 (配列番号１５)
QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGYITPSTGYTDYNKKFKDKATLTADRSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCARSGPYFDVWGAGTTVTVSS
1K0924の Ｌ鎖V領域配列（配列番号３）
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQRPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYYFTISRVEAEDAATYYCQQWNSNPPTHGGGTKLEIK
1K1228の Ｌ鎖V領域配列（配列番号８）
EIILTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSYYLRWYQQKPGFSPKVLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGNTVPLTFGSGTKLEIK
1k1422の Ｌ鎖V領域配列 (配列番号１)
QIVLTQSPPIMSASLGEEITLTCSASSRVSYMLWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWTSNPCTFGGGTKLEIK
1k1791の Ｌ鎖V領域配列 (配列番号２)
STVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKVLIYFASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTINTVQAEDLAVYFCQQDYSSPLTFGAGTKLELK
1k1712の Ｌ鎖V領域配列 (配列番号４)
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMDWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDTATYYCQQWTFNPPTFGSGTKLEIK
1k1402の Ｌ鎖V領域配列 (配列番号５)
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWTFNPPTFGAGTKLELK
1k1736の Ｌ鎖V領域配列 (配列番号６)
QIVLSQSPAILSSSPGEKVTMTCRASSSVSYMLWYQQKPGSSPEPWIYATSNLASGVPARFSGGGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTFNPPTFGGGTKLEIK
1k1782の Ｌ鎖V領域配列 (配列番号７)
DILLTQSPAILFVSPGERVSLSCRASQNIGTSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESFSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPFTFGSGTKLEIK
【実施例２】
【００４４】
得られたクローンの一部に関し、モノクローナル抗体遺伝子の可変領域について塩基配列の決定を行うとともに、それらが産生するモノクローナルについて抗体結合親和性の測定及び生物学的特性試験を以下のとおり行った。
（１）結合親和性測定
目的とする抗原を細胞表面で発現しているヒトＢ細胞株由来の浮遊細胞Raji及び、ＣＤ２０抗原を発現していない細胞としてヒトT細胞株由来の浮遊細胞Jurkatを用いた。共にＲＰＭＩ１６４０（ナカライ、Cat.No.30264-85、Lot L4K2844）に１０％ウシ胎仔血清ＦＣＳ(BIOLOGICAL IND. Cat.No.04-001-1A、Lot 815242、補体成分を非働化するためあらかじめ５６℃３０分加温したもの）を添加した培地で３７℃ＣＯ２濃度５％のＣＯ２インキュベーター (SANYO MCO-175M)で培養、週２回の継代により維持した。
細胞数の測定は、Burker-Turk血球計算盤(ヱルマ販売(株)Cat.No.03-303-1)を用いて行った。
継代後３〜４日目のコンフルエントな細胞の培養液を多本架冷却遠心機ＬＸ−１２０ (TOMY)で室温、３０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を除き、細胞を回収した。ここで用いた回転数と時間は遠心分離と上清除去を繰り返し行っても細胞数が変化しない条件である。細胞の表面に残った培地及びFCSを除くため（洗浄）、回収した細胞をDulbecco’s Phosphate Buffered Saline(-) 〔Ca、Mgフリー、PBS(-) 、（NaCl：Wako、Cat.No.191-01665、Na2HPO4：Wako、Cat.No.197-02865、Lot ASF2635、KCl：Wako、Cat.No.163-0334T、Lot CEQ7122 、KH2PO4：Wako、Cat.No.169-0425、Lot ELG7616）〕で懸濁後、３０００ｒｐｍで３分間遠心して上清を除く操作を２回行った。洗浄を終えた細胞を１％ＢＳＡ (Wako Cat No.013-07492 Lot PKH3483)−ＰＢＳ溶液で懸濁し、細胞密度を５ｘ１０６個／ｍｌに調整した。
１次抗体として、試験抗体又は陽性コントロール抗体（２Ｂ８）１５、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００ｎｇ（１．５〜５μｌ）を各々、１．５ｍｌチューブ（ビーエム機器、BMリングロックチューブ Cat.No.BM-15）に分注し、同時に抗体を入れないチューブも４本用意した。また、各々の試験抗体あたり３点のサンプルを準備した。そこに、１％ＢＳＡ（Wako Cat No.013-07492 Lot PKH3483)−ＰＢＳ溶液で懸濁液を１００μｌ（細胞数５ｘ１０５個）ずつ加えて混和し、室温で１時間振とう反応させた。
反応後、微量高速冷却遠心機ＭＸ−１００（TOMY）で室温、３０００ｒｐｍ３分間遠心分離し、細胞を回収後、細胞の表面に残った未反応の一次抗体を除くため２００μｌのＰＢＳで懸濁し、３０００ｒｐｍで３分間遠心し上清を除く操作を２回行った。
【００４５】
次に、細胞と結合した１次抗体に対して過剰量（５００ｎｇ）のＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）２次抗体〔GOAT Anti-mouse IgG(H&L) Fluorescein conjugated, affinity purified Secondary antibody、Chemicon、Cat.No.AP124F、 Lot 24021014〕および１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液１００μｌ（５００ｎｇ／１００μｌ）を添加・懸濁し、遮光、室温のもと１時間振とう反応させて細胞に結合した１次抗体を検出した。反応後、３０００ｒｐｍで３分間遠心し、細胞を回収後、細胞の表面に残った未反応のＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体を除くため、２００μｌのＰＢＳで懸濁し、３０００ｒｐｍで３分間遠心し上清を除く操作を２回行った。
こうして得た細胞を１００μｌＰＢＳで懸濁し、９６ウエル平底プレート（住友ベークライトELISA PLATE Cat.No.8496F）へ移した。２次抗体の蛍光量をTyphoon9210イメージアナライザー(Amersham Bioscience)を用いて、Fluorescense mode, ６００Ｖ、526SP/green(532nm)、Focus：底面＋３ｍｍの検出条件で測定した。この際、ＦＩＴＣ標識２次抗体を０、１２．５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０ｎｇ添加したＰＢＳ溶液１００μｌを検量線作成用のコントロールとして用いた。
【００４６】
検出後、画像を画像解析ソフトImage Quant （Amersham Bioscience）を使用し、数値化を行った後、Excel (Microsoft)で解析を行った。この際、プレート、ＰＢＳ溶液、および細胞に非特異的に結合したＦＩＴＣ標識２次抗体に由来するバックグラウンド値として、細胞とＦＩＴＣ標識２次抗体のみを反応させたものの測定値を求め、その４点の平均値を各サンプルの蛍光強度の値から差し引いた。こうして、細胞に結合したＦＩＴＣ標識２次抗体の蛍光量を得た。更に、コントロールとして用いた各濃度のＦＩＴＣ標識二次抗体での蛍光量を測定することで検量線を作成し、細胞に結合している２次抗体の量（モル数または重量）を求めた。各１次抗体とＦＩＴＣ標識２次抗体が１：２の割合で反応していると仮定し、結合している１次抗体量を算出した。また遊離の１次抗体量は添加量から結合量を差し引いて求めた。抗体濃度をモル濃度に換算する際、モノクローナル抗体の分子量を１５００００とした。
【００４７】
添加する１次抗体の増加に伴い結合反応が飽和して蛍光強度が一定量に達することを確認するとともに、細胞表面の抗原数及び解離定数（Ｋｄ値）を算出するため、スキャッチャード解析（Scatchard,G.; Ann.N.Y.Acad.Sci.,51: 660-672,1949、分子生物学研究のための新培養細胞実験法；羊土社、実験医学別冊バイオマニュアルUPシリーズ改訂第２版、212-217参照）を行った。このとき、数値は各サンプルについて３点の値の平均値を用いた。
代表的な８クローンが産生するモノクローナル抗体と陽性コントロール抗体（２Ｂ８）の測定結果を後の表３に示す。
【００４８】
（２）生物学的特性試験
（ａ）アポトーシス誘導試験
フローサイトメトリー（Annexin V/ PI staining）を用いて試験抗体のアポトーシス誘導能を測定した。陽性コントロール（２Ｂ８）、陰性コントロール[Anti-CD3モノクローナル抗体(BD PharMingen社)]を用いた。試験はMEBCYTOApoptosis Kit (MBL, Cat.No.4700, Lot.20)を用いて行った。
Raji細胞を遠心後、１０％ＦＢＳ（非動化済）(ICN, Cat.No.2916754, Lot.8005C)を含む新鮮な培地ＲＰＭＩ１６４０(Sigma, Cat.No.R8758, Lot.44K2416)で懸濁し、１２ウエルプレートの各ウエルに５ｘ１０５細胞／ｍｌの密度で１ｍｌを入れた。各抗体あたり１２ウエルを用い、各抗体を終濃度２μｇ／ｍｌ又は４μｇ／ｍｌになるよう添加した（３ウエル×２種濃度×２時点、計１２ウエル）。培養開始１日後及び２日後に、２ｘ１０５個程度分の細胞を含む培養液を回収し、遠心後ＰＢＳで１回洗浄した。次に８５μｌ Binding bufferを加え懸濁した。さらに、Annexin V-FITC１０μｌとＰＩ５μｌを加えてよく混和した後、遮光、室温で１５分間反応させた。フローサイトメトリー(FACS Calibur、Becton Dickinson)を用いて測定し、CellQuest（Becton Dickinson）で解析を行った。
代表的な６クローンが産生するモノクローナル抗体と陽性コントロール（２Ｂ８）、陰性コントロール(Anti-CD3)の測定結果を図３ａ〜図３ｄに示した。一般に２Ｂ８のアポトーシスの誘導能は高いとされるが、１Ｋ１７シリーズ（ＣＤ２０／ＣＨＯとRaji細胞で免疫）の細胞融合から得られたクローン１ｋ１７９１、および１Ｋ１４シリーズ（ＳＢ細胞とＣＤ２０／ＣＨＯで免疫）の細胞融合から得られたクローン１ｋ１４２２の産生するモノクローナル抗体は２Ｂ８との比較において高いアポトーシス誘導がみられた。
【００４９】
（ｂ）細胞増殖阻害試験
５×１０４個／ｍｌのRaji細胞懸濁液を１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地で調製して９６ウエルプレートに１００μｌ／ウエルずつ入れて培養した。２４時間後、抗体濃度が１μｇ／ｍｌになるように各抗体溶液を５０μｌ／ウエル添加して培養を継続した。抗体添加７２時間後に発色色素Cell Counting Kit-8(同仁化学 Cat.No.343-07623，Lot. SG076)を１０μｌ／ウエル加え、さらに４時間培養した後で波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
上記６クローンのモノクローナル抗体と陽性コントロール（２Ｂ８）、および陰性コントロールの吸光度の測定結果を表２に、また、それらの特性を表３に示す。
【００５０】
細胞増殖阻害試験
【表２】
【００５１】
モノクローナル抗体の特性
【表３】
【００５２】
（ｃ）抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
この実験では抗ＣＤ２０キメラ抗体のＦｃ部位を介してエフェクター細胞が活性化し、それに伴ってリンパ腫細胞系を溶解する能力について測定を行った。
ヒトＢ細胞由来のRaji、ＷｉＬ２−ＮＳ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＲＣ−Ｋ８の４種類の細胞を非働化処理した１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０に培地（培養培地）で３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で培養、維持した。
実験に際しては、各々の細胞を１０％ＦＣＳ含ＲＰＭＩ１６４０で洗浄し、３７℃中で１５分間の反応によりカルセインを生細胞に取り込ませた後、細胞数を４×１０５個／ｍｌに調整した。カルセインは細胞膜が正常に保たれている細胞にのみ維持されるので生細胞のみを染色することができる。また抗ＣＤ２０キメラ抗体であるリツキシマブ（Ｃ２Ｂ８）と６種類のキメラ抗体（１ｋ０９２４、１ｋ１４０２、１ｋ１４２２、１ｋ１７１２、１ｋ１７３６、１ｋ１７９１）を１０％ＦＣＳ含ＲＰＭＩ１６４０で２０μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌに調整した。エフェクター細胞は健常者より採血し、直ちにFicollに重層して遠心しリンパ球画分を採取した後、５×１０６個／ｍｌ、１×１０６個／ｍｌ、０．２×１０６個／ｍｌに調整した。
濃度調整をした細胞２５μｌ、各抗ＣＤ２０キメラ抗体溶液２５μｌ（それぞれ終濃度が５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ）、各抗体濃度においてエフェクター細胞５０μｌ（それぞれＥ：Ｔ比が２５：１、５：１、１：１）、計１００μｌを９６穴プレート内で混合し、３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で４時間反応させた。また、自然な細胞の溶解を算出するために抗体溶液およびエフェクター細胞を１０％ＦＣＳ含ＲＰＭＩ１６４０で置き換えたサンプル、抗体に依存しないエフェクター細胞のみの活性を算出するサンプルとして抗体溶液を１０％ＦＣＳ含ＲＰＭＩ１６４０で置き換えたサンプル、最大溶解を算出するサンプルとして抗体溶液を２０％TritonＸ−１００で置き換えたサンプルを用意した。
反応後、溶解した細胞は細胞膜が壊れてカルセインが細胞外に出るため、Quencherを用いて反応溶液中に遊離したカルセインの蛍光を消失させた後、蛍光アナライザーにより蛍光量を測定した。
検出後、画像解析ソフト（Amersham Bioscience）を使用し、数値化を行った後、以下の式を用いて各サンプルの溶解率を算出した。
【数１】
【００５３】
ＮＫ細胞などのエフェクター細胞数とターゲットとなる細胞数の割合（Ｅ：Ｔ比）が２５：１のときの各細胞における抗体濃度と細胞傷害活性の関係を図４ａ〜図４ｄに示す。また、抗体濃度が５μｇ／ｍｌのときの各細胞におけるＥ：Ｔ比と細胞傷害活性の関係図５ａ〜図５ｄに示す。
図４ａ〜図４ｄに示すごとく、Ｅ：Ｔ比が２５：１の条件ではどの細胞でも抗体を加えることにより細胞傷害活性を示している。つまり抗体が細胞傷害に関与している。また、ＷｉＬ２−ＮＳ以外の細胞株では０．２μｇ／ｍｌの抗体濃度で既に１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌと同程度の活性を示し（０．２μｇ／ｍｌで飽和している）、活性は最大値まで達してフラットとなっており、補体依存性細胞傷害活性に必要とされる抗体量よりも少ない抗体量で作用することを示唆している。
図５ａ〜図５ｄに示すごとく、抗体濃度が５μｇ／ｍｌのときの細胞傷害活性のＥ：Ｔ比による影響を見ると、細胞傷害活性がＥ：Ｔ比濃度に依存して上昇しているのがわかる。このことからエフェクター細胞が作用して細胞傷害が起こっていると判断される。
【００５４】
（ｄ）補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）
この実験では抗ＣＤ２０キメラ抗体が補体を含む血清の存在下でリンパ腫細胞系を溶解する能力について測定を行った。
ヒトＢ細胞由来のRaji、ＷｉＬ２−ＮＳ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＲＣ−Ｋ８の４種類の細胞を非働化処理した１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０に培地（培養培地）で３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で培養、維持した。
実験に際しては各々の細胞を１０％ＦＣＳ含ＲＰＭＩ１６４０で洗浄し細胞数を２〜３×１０６個／ｍｌに調整した。また、抗ＣＤ２０キメラ抗体であるＣ２Ｂ８（リツキシマブ）と６種類のキメラ抗体（１ｋ０９２４、１ｋ１４０２、１ｋ１４２２、１ｋ１７１２、１ｋ１７３６、１ｋ１７９１）を１０％ＦＣＳ含ＲＰＭＩ１６４０で２０μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌに調整した。
濃度調整をした細胞５５μｌ、各抗ＣＤ２０キメラ抗体溶液２５μｌ（それぞれ終濃度が５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ）、５人の健常者より採取したプール血清又はそれを非働化したもの２０μｌ、計１００μｌをボルテックスミキサーにより混合し、３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で２時間反応させた。バックグラウンドの算出サンプルとしては抗体溶液２５μｌを１０％ＦＣＳ含ＲＰＭＩ１６４０培地２５μｌに置き換えたものを用意した。
反応後、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）溶液で死細胞を染色し、ＦＡＣＳ（Becton Dickinson）により解析を行った。数値は死細胞のポピュレーションをそのまま採用し、バックグラウンド及び非働化血清を加えたサンプルの値を差し引いてある。
各細胞においての抗体濃度と細胞傷害活性の関係を図６ａ〜図６ｄに示す。
図６ａ〜図６ｄに示すごとく、Raji、ＷｉＬ２−ＮＳ、ＳＵ−ＤＨＬ４では６種類全ての抗体が活性を示している。また、濃度依存性も確認できるが、５μｇ／ｍｌの濃度で比較すると１ｋ１７９１は他の抗体に比べて特に高い活性を示し、ついで、１ｋ１７３６、１ｋ１４２２、１ｋ１７１２が高い活性を示している。この濃度ではRaji、ＷｉＬ２−ＮＳにおいて１ｋ１７９１は他の抗体のおよそ２倍近い細胞傷害を誘導していることが確認できる。しかしながら、他の抗体もリツキシマブと同程度、もしくはそれ以上の活性を示している。
一方、リツキシマブが効かないとされるＲＣ−Ｋ８では、抗体ごとの差異が顕著に現れた。リツキシマブ、１ｋ１４０２および１ｋ１７１２ではほとんどもしくは全く活性がない。それに対し、１ｋ１７９１は非常に高い活性を示し、５μｇ／ｍｌの濃度では約５０％の傷害活性を示している。これに続き、１ｋ０９２４が２５％程度、１ｋ１４２２、１ｋ１７３６が１０％程度の傷害活性を示している。
以上から、今回試験対象とした６種類のキメラ抗体はリツキシマブと同程度あるいはより強いＣＤＣ活性を有していることが確認された。
【実施例３】
【００５５】
（１）結合親和性測定
ヒトＢ細胞株由来のRaji細胞を、ＲＰＭＩ１６４０に非働化処理した１０％ＦＣＳ添加培地で３７℃、ＣＯ２濃度５％のＣＯ２インキュベーター内で培養、週２回の継代により維持した。
継代後３〜４日目（約１ｘ１０６個／ｍｌ）の細胞培養液を室温、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収後、ＰＢＳ（−）で懸濁、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清を除く操作を２回行うことで洗浄した。
抗ＣＤ２０抗体（陽性コントロール抗体：マウス抗体２Ｂ８、キメラ抗体及びヒト化抗体Ｃ２Ｂ８）とRaji細胞を混和し、室温で１時間反応することで１次抗体反応を行った。ここで、抗ＣＤ２０抗体の各々の終濃度は１．３３、２．６７、４．００、５．３３、６．６７、８．００、９．３３、１０．６７、１２．００、１３．３３、１４．６７、１６．００ｎＭの１２点とし、細胞数５ｘ１０６個、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を反応溶液とし液量１００μｌになるよう１．５ｍｌチューブに分注した。同一試験抗体あたり３点のサンプルを準備し、バックグラウンド算出サンプルとして抗体を加えないチューブも４本用意した。
反応後、室温、３０００ｒｐｍにて３分間遠心分離し、未反応の１次抗体を除き、細胞を回収した。
【００５６】
細胞と結合した１次抗体に対して過剰量となるよう１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で５ｕｇ／ｍｌに調製したＦＩＴＣ標識二次抗体を１００μｌづつ添加し、懸濁後、遮光、室温のもと１時間反応させた。
ここでＦＩＴＣ標識２次抗体はマウス抗体ではGOAT Anti Mouse IgG (H&L)-FITCをキメラ抗体及びヒト化抗体ではGOAT F(ab’) 2F ragment Anti Human IgG (Fcγ)-FITCを用いた。
反応後、室温、３０００ｒｐｍにて３分間遠心分離し、未反応のＦＩＴＣ標識２次抗体を除き、細胞を回収し、２００μｌのＰＢＳで懸濁し再度遠心し洗浄を行った。
この細胞を１００μｌＰＢＳで懸濁し、９６ウエル平底プレートへ移した。２次抗体の蛍光量をTyphoon９２１０イメージアナライザー（Amersham Bioscience）を用いて測定した。
検出後、画像解析ソフトImage Quant (Amersham Bioscience）を使用し、数値化を行った後、Excel (Microsoft）で解析を行った。同一試験抗体の平均値を求め、バックグラウンド算出サンプル（細胞とＦＩＴＣ標識２次抗体のみを反応させたもの）の値を各試験抗体の値から差し引くことで、プレート、ＰＢＳ溶液および細胞に非特異的に結合したＦＩＴＣ標識２次抗体に由来するバックグラウンド値を除いた。同時に１００μｌ当り、０、１２．５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０ｎｇのＦＩＴＣ標識２次抗体単独の蛍光量を測定することで検量線を作成し、細胞に結合している２次抗体のモル数を求めた。各１次抗体とＦＩＴＣ標識２次抗体が１：５の割合で反応していると仮定し、結合している１次抗体量を算出した。遊離の１次抗体量は添加量から結合量を差し引いて求めた。これらの値を用いて、スキャッチャード解析を行い、解離定数Ｋｄ値を得た。
結果を以下の表４に示す。
【００５７】
（２）アポトーシス誘導試験
ヒトＢ細胞株由来細胞に対する抗ＣＤ２０抗体によるアポトーシス誘導を単独で見る条件（クロスリンク無）及びさらに抗ＣＤ２０抗体のＦｃ領域を認識する２次抗体を添加することによるアポトーシス誘導を見る条件（クロスリンク有）の２条件で反応し、Annexin V-FITC apoptosis kitを用いて初期アポトーシスの検出を行った。
ヒトＢ細胞株由来のRaji、ＷＩＬ２−ＮＳ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＲＣＫ８の４種類の細胞を、ＲＰＭＩ１６４０に非働化処理した１０％ＦＣＳ添加培地（培養培地）で３７℃、ＣＯ２濃度５％のＣＯ２インキュベーター内で培養、週２回の継代により維持した。
継代後３〜４日目（約１ｘ１０６個／ｍｌ）の細胞培養液を室温、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収した。
抗ＣＤ２０抗体（陽性コントロール抗体：マウス抗体２Ｂ８、キメラ抗体及びヒト化抗体Ｃ２Ｂ８；陰性コントロール：Ａｎｔｉ−ＣＤ３モノクローナル抗体）と新鮮な培養培地で懸濁した細胞を混和し、１．５時間３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で反応した。ここで、抗ＣＤ２０抗体各々の終濃度は０．２、１、５μｇ／ｍｌの３点、細胞密度１ｘ１０６細胞／ｍｌ、培養培地を反応溶液として液量２５０μｌになるよう１．５ｍｌチューブ内で反応を行った。同一試験抗体あたり３点のサンプルを準備した。
反応後、室温、１２００ｒｐｍにて３分間遠心分離し、未反応の抗体を除き、細胞を回収した。
クロスリンク無の条件では新鮮な培養培地、クロスリンク有条件では抗ＣＤ２０抗体の５倍量のＦｃ領域を認識する２次抗体を２５０μｌづつ添加し、混和後、さらに３時間、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で反応した。ここで２次抗体はマウス抗体ではGoat Anti mouse IgG, FcγFragmentを、キメラ抗体及びヒト化抗体ではGoat Anti human IgG, FcγFragment specificを用いた。
反応後、室温、１２００ｒｐｍにて３分間遠心分離し、未反応の２次抗体を除き、細胞を回収した。２５０μｌのＰＢＳで懸濁し再度遠心し洗浄を行った
検出試薬としてMEBCYTO apoptosis kit-AnnexinV-FITC ,PI- (MBL, Cat.No.4700, Lot. 21)を使用した。８５μｌのBinding bufferを加え懸濁した後、Annexin V-FITC 5μlとpropidium iodide (PI)５μｌ（終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）を加えてよく混和し、遮光、室温で１５分間反応させた。
フローサイトメトリー（EPICS ALTRA :BECKMAN COULTER）を用いてtotal count２０，０００の細胞を測定し、解析（Expo32: BECKMAN COULTER）を行った。
結果を図７ａ〜図９ｄに示す。
【００５８】
（３）ヒト化抗体産生株の調製
（ａ）ＤＮＡ合成
配列番号１７〜２４のアミノ酸配列を元にしてコドンをＣＨＯ細胞に最適化したＤＮＡを、定法によりデザインし、合成した。
（ｂ）コンストラクトの作成
pNOWを発現ベクターとして１６種類のヒト化1K1791発現コンストラクトを構築した。
ヒト化1K1791発現コンストラクトを作製した。
pNOW-aa1791kg1、pNOW-af1791kg1、pNOW-as1791kg1、pNOW-av1791kg1、pNOW-fa1791kg1、pNOW-ff1791kg1、pNOW-fs1791kg1、pNOW-fv1791kg1、pNOW-sa1791kg1、pNOW-sf1791kg1、pNOW-ss1791kg1、pNOW-sv1791kg1、pNOW-va1791kg1、pNOW-vf1791kg1、pNOW-vs1791kg1、pNOW-vv1791kg1
（ｃ）トランスフェクションと薬剤による選択
トランスフェクション試薬を用いてヒト化1K1791発現コンストラクトをＣＨＯ ＤＧ４４ｃｄＢ細胞に導入した。それぞれの遺伝子を導入したＣＨＯ ＤＧ４４ｃｄＢ細胞１×１０６個を１００ｍｌの選択培地に懸濁し、９６ウエルプレート５枚に撒いた（２００μｌ／ウエル）。５％炭酸ガス存在下に３７℃、３〜４週間培養した。
トランスフェクション試薬：Qiagen, Effectene Transfection Reagent, Cat. No 301427
選択培地：IS CHO-CD w/Hydrolysate/4mM GlutaMAX/0.8 mg/ml G418
（ｄ）高発現細胞株の選択
１）コロニーが出現しているウエルの上清をとり、ドット・プロット・アッセイ（Dot Blot assay）で抗体産生量を測定した。
２）抗体産生量の多いクローンを２４ウエルプレートに移し、約5日間培養後、上清をとり、サンドイッチELISAで抗体産生量を測定した。
３）発現量が多いクローンを２つ選択し、Ｔ７５フラスコに移した。
（ｅ）小規模培養
１６種類のコンストラクトそれぞれに対して選択した２種のクローンを３０ｍｌの選択培地を含むＴ７５フラスコ中で培養を行った。
【００５９】
（４）ヒト化抗体産生株の培養及び精製
抗体産生細胞株（遺伝子組み換えＣＨＯ−ＤＧ４４細胞）を、Hydrolysateを含むIS CHO-CD/with Hydrolysate (Irvine Scientific, Cat. No.91119）に、４ｍＭ GlutaMax(Invitrogen, Cat 35050-061）、２００μｇ／ｍｌG418 (Sigma,Cat.No.A1720-5G)を添加した培地で３７℃、ＣＯ２濃度５％のＣＯ２インキュベーター内で培養、週２回の継代により維持した。
継代後約２週間経過した細胞培養液を室温、３５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培養上清を回収し、０．４５μｍ syringe filterで濾過した。５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、ｐＨ７．０で平衡化した
Hi Trap Protein A HP(GE Healthcare, Cat No. 17-0402-01）カラムに、培養上清を添加後、５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、ｐＨ７．０で洗浄した。０．１Ｍクエン酸、ｐＨ４．０で溶出し、４００μｌづつ採取し、その１０／１量にあたる４０μｌ １Ｍ Tris−ＨＣｌ、ｐＨ９．０で中和した。１００倍量のＰＢＳに対して、Ｍ．Ｗ．３５００透析カップ（Bio-Tech Cat. No.212932）を用いて２．５時間を２回後、１５〜１８時間１回の透析を行った。
【００６０】
使用した抗体生産株は、ＣＨＯ細胞hz1791-fv10、hz1791-ff34、hz1791-sf43およびhz1791-ss32であり、これらは、ブタペスト条約の下、平成１８年（２００６年）３月１日より、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに、各々、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４３、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４４、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４５およびＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４６の受託番号で寄託してある。
これらの細胞株から得られたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列(配列番号１７〜２４)は以下のとおりである（アンダーライン部分が対応するマウス抗体と異なる）。
ヒト化1k1791の配列
Ｌ鎖V領域配列（配列番号２０）
Ven 1791 :STVMTQSPDSLAVSLGERVTINC KASQSVSNDVA WYQQKPGQSPKVLIY FASNRYT GVPDRFSGSGYGTDFTFTISSVQAEDVAVYFC QQDYSSPLT FGAGTKLELK
H鎖V領域配列（配列番号２４）
Ven 1791：QIQLVQSGPELKKPGASVKISCKASGYTFT NFGVN WVKQAPGKGLKWMG WINTYTGEPSYADDFKG RFAFSLDASVSTAY LQISSLKAEDTSTYFCTR RTNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS
Ｌ鎖V領域配列（配列番号１７）
abb 1791 :STVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVSNDVA WYQQKPGQSPKVLIY FASNRYS GVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQDYSSPLT FGAGTKLEIK
H鎖V領域配列（配列番号２１）
abb 1791：QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGVN WVRQAPGKGLEWMG WINTYTGEPSYAQGFTG RFVFSLDASVSTAY LQISSLKAEDTATYFCTR RTNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS
Ｌ鎖V領域配列（配列番号１９）
sdr 1791 : STVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSNSNDVA WYQQKPGQSPKVLIY FASNRYS GVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQDYSSPLT FGAGTKLEIK
H鎖V領域配列（配列番号２３）
sdr 1791：QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGVN WVRQAPGKGLKWMG WINTYTGEPSYAQGFTG RFAFSLDASVSTAY LQISSLKAEDTATYFCTR RTNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS
Ｌ鎖V領域配列（配列番号１８）
fra 1791 : STVMTQSPSFLSASVGDRVTITC KASQSVSNDVA WYQQKPGQSPKVLIY FASNRYT GVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQDYSSPLT FGAGTKLEIK
H鎖V領域配列（配列番号２２）
fra 1791：QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGVN WVKQAPGKGLKWMG WINTYTGEPSYADDFKG RFAFSLDASASTAY LQISSLKAEDMATYFCTR RTNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS
【００６１】
この実験では、AbbL、FraL、SdrL、VenLの４種類 × AbbH、FraH、SdrH、VenHの４種類を組み合わせた合計１６種類の配列組合せから各２クローンずつについて実験を行ない平均値を求めた。以上の結果より、Ｋｄ値を基に表４に示すように４グループに分類できる。それぞれのグループより１種類を選抜し以降の実験で使用した。
コントロール：c2B8
グループＩ： Kd = ２０ nM＜
グループＩＩ： Kd = １０−２０ nM
グループＩＩＩ： Kd = ８-１０ nM
グループＩＶ： Kd = ＜８ nM
【００６２】
表４ ヒト化抗体結合解離定数
【表４】
【００６３】
表５ ヒト化抗体結合解離定数
【表５】
【００６４】
さらに、マウス抗体８種類でのアポトーシス実験結果を図７ａ〜図７ｄに示す。４種類全ての細胞においてマウス抗体８種類および既知のＣＤ２０抗体２Ｂ８、２Ｈ７について２つのタイプに分けることができた（但し一部例外を除く）。
グループＡ：m0924 , m1422 , m1791 , m2B8
グループＢ：m1228 , m1402 , m1712 , m1736 , m1782 , m2H7
(但し、ｍ０９２４はＳＵ−ＤＨＬ４細胞ではグループＢに含まれる)
すなわち、抗ＣＤ２０抗体単独で十分なアポトーシス誘導能が示され、２次抗体によるクロスリンク条件下でもほぼ同程度であるグループＡと抗ＣＤ２０抗体単独でのアポトーシス誘導能は十分に示されないがクロスリンク条件下で大きく増加するグループＢである。またグループＡに含まれる抗体は親和性が２Ｂ８と同程度であり、グループＢに含まれる抗体は２Ｂ８より高い親和性であるものが含まれる。アポトーシス誘導に２次抗体の存在を必要とせず、単体でアポトーシス誘導が可能なグループＡの方が医薬としては都合よいといえる。
細胞別にみるとアポトーシスの割合がＲＡＪＩ、ＷＩＬ２−ＮＳ、ＲＣＫ８では高いものでも３０〜４０％であるのに対し、ＳＵ−ＤＨＬ４では高いもので８０％以上を示す結果となった。
【００６５】
ヒト化抗体４種類での結果を図８ａ〜図９ｄに示す。
マウス抗体同様、４種類全ての細胞においてヒト化1791抗体４種類について２つのタイプに分けることができた。
グループＡ：fv, ff
グループＢ：sf, ss, C2B8
Ｃ２Ｂ８と同等の親和性を示すグループＡのfv、ff抗体はクロスリンク無しではアポトーシス活性をほとんど発揮せず、クロスリンク条件下で明らかに活性を持つ。グループＢのsf、ss抗体はグループＡの抗体より、解離定数が大きく親和性は弱いが、これらの抗体単独でＣ２Ｂ８より高いアポトーシス活性を示した。
抗ＣＤ２０抗体によるＢ細胞に対するアポトーシス誘導能について、単独で十分なアポトーシス誘導能を示す場合、クロスリンク条件下でもその割合はほぼ同等であるが、抗体の種類、未飽和条件などで抗ＣＤ２０抗体単独では十分なアポトーシス誘導能が示されない場合、クロスリンク条件下でアポトーシス活性は増加すると考えられる。
なお、図９ａ〜図９ｄは、実験日の抗体を加えない条件での早期アポトーシス（％）を１とするグラフである。
【実施例４】
【００６６】
ヒト化抗体の結合解離定数（Ｋｄ値）と細胞増殖阻害活性との関連性
実施例３でヒト化抗体をグループＡとグループＢに分けた結果をふまえて、表５に示す各ｈｚ１７９１クローンについて、ヒトＣＤ２０抗原に対するＫｄ値（ｎＭ）とアポトーシス誘導活性（％）およびＣＤＣ活性（％）との関係を調べた。Ｋｄ値の測定は実施例２に記載のごとく行った。ＣＤＣ活性の測定は実施例２に記載のごとく行った（ただし、抗体量とＣＤＣ活性の関係を調べる実験においては後述のごとく抗体を生成したものを用いた）。ＡＤＣＣ活性の測定は実施例２に記載のごとく行った。アポトーシス活性の測定は実施例３に記載のごとく行った。使用したＢ細胞はＲａｊｉ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＷｉＬ−２、およびＲＣＫ８であった。それぞれの細胞につき、４種のクローンｆｖ、ｆｆ、ｓｆ、およびｓｓに関するデータを図１０ａ〜図１０ｄに示す。
【００６７】
アポトーシス活性に関しては、いずれの細胞を用いて試験した場合においても同様の傾向が見られた。すなわち、親和性が高い（Ｋｄ値が小さい）抗体ほどアポトーシス誘導活性が低く、親和性が低い（Ｋｄ値が大きい）抗体ほどアポトーシス誘導活性が高いことがわかった。また、Ｋｄ値が約１３ｎＭを超えると、アポトーシス活性は一定となる傾向を示した。親和性が高い抗体は、それ自体ではアポトーシス活性を発揮できず、アポトーシスの誘導には二次抗体によるクロスリンクが必要であった。そして、親和性が低い抗体は、それ自身でアポトーシス誘導活性を発揮することがわかった。
【００６８】
ＣＤＣ活性に関しては、Ｒａｊｉ細胞およびＳＵ−ＤＨＬ４細胞を用いた場合には、親和性が高い（Ｋｄ値が小さい）抗体ほどＣＤＣ活性が高い傾向がみられた。一方、ＷｉＬ−２細胞およびＲＣＫ８細胞を用いた場合には、Ｋｄ値が１３ｎＭ付近に極大値を有する傾向が見られた。
【００６９】
これらの知見から、医薬品として有効な候補抗体を見出すことができる、２つの選抜基準を設定した：
−単独ではアポトーシスを誘導しないが、ＣＤ２０抗原に対する親和性が極めて高く、ＣＤＣにより抗ガン効果を発揮しうる抗体；
−単独でアポトーシス誘導活性を持ち、アポトーシスとＣＤＣにより抗ガン効果を発揮しうる抗体のうち、ＣＤ２０抗原に対する親和性が高いもの。
【００７０】
前者の選抜基準では、ＣＤ２０抗原に対する親和性が高く、かつＣＤＣ活性も高いものを選抜することが好ましい（Ｋｄ値が低いほどＣＤＣ活性が高い傾向が見られる）。この場合、単独ではアポトーシスを誘導しない抗体の選抜なので、ＣＤＣ活性の値のみに注目してよい。前者の選抜基準を満たすクローンの場合には、単独でアポトーシス誘導は引き起こさないが、親和性およびＣＤＣ活性か極めて高いことから、細胞枯渇を促すことができる。
【００７１】
後者の選抜基準では、抗体のアポトーシスとＣＤＣの総和が大きく、かつ、ＣＤ２０抗原に対する親和性が高いものを選抜することが好ましい。したがって、後者の選抜基準を満たすクローンの場合には、親和性は高くないが、アポトーシス活性が高いという利点を有し、アポトーシス誘導とＣＤＣの相乗効果により細胞枯渇を促すことができる。
【００７２】
さらに、上の２つの選抜基準の境界点を決定するために、４種の細胞のアポトーシス活性の中点を与えるＫｄ値を作図により求めた（図１０ａ〜図１０ｄのグラフ中に点線で示す）。これら４つのグラフから、アポトーシス活性の中点を与えるＫｄ値に大きな相違はなく、Ｒａｊｉ細胞の場合には約９．５ｎＭ、ＳＵ−ＤＨＬ４細胞の場合には約８．５ｎＭ、ＷｉＬ２細胞の場合には約９．５ｎＭ、ＲＣＫ８細胞の場合には約１０ｎＭであった。これらの結果から、約９．５ｎＭのＫｄ値を上の２つの選抜基準の境界点とした。
また、後者の選別基準のＫｄ値の上限は、ＷｉＬ２細胞およびＲＣＫ８細胞の場合にＣＤＣ活性の極大値が見られることを考慮して（図１０ｃおよび図１０ｄ）、アポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和ができるだけ大きく、しかも親和性が高い（Ｋｄ値が小さい）範囲ということから、Ｋｄ値の上限を約１３ｎＭとした。
【００７３】
したがって、前者の選抜基準に従って、ヒトＣＤ２０抗原に対するＫｄ値が約９．５ｎＭ未満であって、できるだけＫｄ値が低く、かつ、ＣＤＣ活性の高い抗体を選抜すると、クローンｆｆとｆｖが該当する（図１０ａ、図１０ｂ）。また、後者の選抜基準に従って、ヒトＣＤ２０抗原に対するＫｄ値が約９．５ｎＭないし約１３ｎＭであって、できるだけアポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和が大きく、かつ、Ｋｄ値が小さい抗体を選抜すると、クローンｓｆが該当する（図１０ｃ、図１０ｄ）。
【００７４】
次に、上記４種のヒト化クローンからｆｖ、ｆｆ、ｓｆ、およびｓｓを選択し、Ｒａｊｉ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＷｉＬ−２、およびＲＣＫ８細胞を用いてＣＤＣ活性およびアポトーシス活性を測定した。結果を、それぞれ表６および表７に示す。リツキシマブ（ｃ２Ｂ８）およびクローン１７９１（ｃ１７９１）は、それぞれ対照である。
【００７５】
表６ 本発明のヒト化抗体のＣＤＣ活性
【表６】
【００７６】
表６の結果から、クローンｆｆおよびｆｖは、リツキシマブと同程度あるいはそれよりも強いＣＤＣ活性を発揮することがわかった。また、ｓｆはＷｉＬ２細胞およびＲＣＫ８細胞において極めて高いＣＤＣ活性を示した。
【００７７】
抗体濃度とＣＤＣ活性の関係を調べるための実験も行った。抗体は実施例２に記載のごとく調製したものよりも精製が進んだものを使用した。精製は下記の手順にて行った。
抗体産生細胞株（遺伝子組み換えＣＨＯ−ＤＧ４４細胞）はHydrolysateを含むIS CHO-CD/w（Irvine Scientific, Cat. No.91119）に、４ｍＭ GlutaMax（Invitrogen, Cat 35050-061）、２００μｇ／ｍｌ G418（Sigma,Cat.No.A1720-5G）を添加した培地で３７℃でＣＯ２濃度５％のＣＯ２インキュベーター内で培養、週２回の継代により維持した。継代後約２週間経過した細胞培養液を室温、３５００r.p.m.で５分間遠心分離し、培養上清を回収し、０．４５μｍシリンジフィルターで濾過した。５０ｍＭ Tris-HCl,pH7.0で平衡化した。Hi Trap Protein A HP（GE Healthcare, Cat No. 17-0402-01）カラムに、培養上清を添加後、５０ｍＭ Tris-HCl,pH7.0で洗浄した。０．１Ｍクエン酸，ｐＨ４．０で溶出し、４００μｌづつ採取し、その１０／１量にあたる４０μｌ １Ｍ Tris-HCl,pH9.0で中和した。１００倍量のＰＢＳに対して、Slyde-A-Lyzer 10K Dialysis Cassetes（PIERCE CatNo.66453）を用いて２．５時間を２回後、１５〜１８時間１回の透析を行った。
透析後のサンプルをVIVA SPIN 50,000MWCO PES（VIVASCIENCE CatNo.VS0231）を用いて濃縮した。このサンプルをＰＢＳで平衡化したHiLoad 16/60 superdex 200prep grade（GE Healthcare CatNo.17-1069-01）カラムに添加した。精製サンプルを０．２２μｍシリンジフィルターで濾過した後、VIVA SPIN 50,000MWCO PES（VIVASCIENCE CatNo. VS0231）を用いて濃縮を行った。抗体濃度はBECKMAN COULTER DU530を用いてＡ２８０の値より算出した。
【００７８】
Ｒａｊｉ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＷｉＬ−２、およびＲＣＫ８細胞に対するヒト化抗体ｆｖ、ｆｆ、ｓｆ、ｓｓ、およびキメラ抗体ｃ１ｋ１７９の、濃度とＣＤＣ活性の関係を図１１ａ〜図１１ｄに示す。いずれの実験系においても、濃度５μｇ／ｍｌ以上においてヒト化抗体ｆｖ、ｆｆ、ｓｆ、およびｓｓのＣＤＣ活性はリツキサン（Ｃ２Ｂ８）の活性と同程度であるかあるいはそれを上回っていた。
【００７９】
Ｒａｊｉ細胞（浮遊細胞）に対するＫｄ値が約９．５ｎＭ未満であって、しかもＣＤＣ活性の高い抗体として選別されたクローンｆｖおよびｆｆ（ＣＤＣ活性が期待されるクローン）は、濃度５μｇ／ｍｌ以上においていずれの細胞に対してもリツキシマブよりも高いＣＤＣ活性を示し、特にＳＵ−ＬＤＨＬ４細胞に対するＣＤＣ活性が高く、Ｒａｊｉ細胞およびＲＣＫ８細胞に対してもＣＤＣ活性が高いことがわかった。
【００８０】
Ｒａｊｉ細胞（浮遊細胞）に対するＫｄ値が約９．５ｎＭから約１３ｎＭの範囲であって、できるだけアポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和が大きく、かつ、Ｋｄ値が小さい抗体として選別されたクローンｓｆ（ＣＤＣ活性とアポトーシスの両方が期待される）は、濃度５μｇ／ｍｌ以上においていずれの細胞に対してもリツキシマブと同程度または高い細胞溶解活性を示し、特にＳＵ−ＬＤＨＬ４細胞に対する溶解活性が高く、Ｗｉｌ２細胞およびＲＣＫ８細胞に対する溶解活性が他の抗体よりも高いことがわかった。
【００８１】
Ｒａｊｉ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＷｉＬ−２、およびＲＣＫ８細胞に対するｆｖ、ｆｆ、ｓｆ、およびｓｓのアポトーシス活性についても調べた。表７に結果を示す。
【００８２】
表７ 本発明のヒト化抗体のアポトーシス活性
【表７】
【００８３】
表７の結果から、クローンｓｆは、リツキシマブと同程度あるいはそれよりも強いアポトーシス誘導活性を有すること、アポトーシス誘導に二次抗体を必要とせず、単独で十分なアポトーシス活性を発揮することがわかった。さらに、クローンｓｆのアポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和も、試験したすべての細胞においてリツキシマブを上回っており、特にＷｉＬ２細胞およびＳＵ−ＤＨＬ４細胞において大きな値であった（表６、図１１ａ〜図１１ｄ、および表７参照）。
【００８４】
Ｒａｊｉ、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＷｉＬ−２、およびＲＣＫ８細胞に対するｆｖ、ｆｆ、ｓｆ、およびｓｓのＡＤＣＣ活性についても調べた。抗体濃度とＡＤＣＣとの関係を調べた結果を図１２ａ〜図１２ｄに示す（Ｅ：Ｔ比は２５）。Ｅ：Ｔ比とＡＤＣＣとの関係を調べた結果を図１３ａ〜図１３ｄに示す（抗体濃度は１μｇ／ｍｌ）。いずれの実験系においても、ｆｖ、ｆｆ、ｓｆ、およびｓｓのＡＤＣＣ活性はリツキサン（Ｃ２Ｂ８）の活性と同程度であるかあるいはそれを上回っていた。ＡＤＣＣ活性の結果からも、この実験で選抜されたｆｖ、ｆｆ、ｓｆ、およびｓｓの有効性が示された。
【００８５】
これらの結果から、上記のようにして選別された本発明のヒト化モノクローナル抗体はいずれもリツキサンの細胞溶解活性を上回る高い細胞溶解活性を示すことがわかった。したがって、本発明の選抜基準により選抜されたヒト化抗体は、医薬として十分に使用可能なＢ細胞関連疾患治療効果を有するものと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明によれば、自然の状態のヒトＣＤ２０分子に対する結合親和性の高い、医薬として好適な生物学的活性を示すヒト化抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体、ならびにその選抜方法が提供され、医薬として十分に使用可能なＢ細胞関連疾患治療効果を有するものを得ることができる。
【受託番号】
【００８７】
ＣＨＯ細胞hz1791-fv10、hz1791-ff34、hz1791-sf43およびhz1791-ss32は、ブタペスト条約の下、平成１８年（２００６年）３月１日より、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに、各々、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４３、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４４、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４５およびＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４６の受託番号で寄託してある。
【配列表フリーテキスト】
【００８８】
SEQ ID NO: 17: L chain V region sequence of humanized antibody abb 1791
SEQ ID NO: 18: L chain V region sequence of humanized antibody fra 1791
SEQ ID NO: 19: L chain V region sequence of humanized antibody sdr 1791
SEQ ID NO: 20: L chain V region sequence of humanized antibody Ven 1791
SEQ ID NO: 21: H chain V region sequence of humanized antibody abb 1791
SEQ ID NO: 22: H chain V region sequence of humanized antibody fra 1791
SEQ ID NO: 23: H chain V region sequence of humanized antibody sdr 1791
SEQ ID NO: 24: H chain V region sequence of humanized antibody Ven 1791
SEQ ID NO: 25: primer
SEQ ID NO: 26: primer
【特許請求の範囲】
【請求項１】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４３、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４４、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４５およびＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４６を有する細胞からなる群より選択される細胞を培養することにより得ることのできる、ヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性を有するヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体。
【請求項２】
配列番号：１７〜２０のいずれかのＬ鎖と配列番号：２１〜２４のいずれかのＨ鎖を組み合わせたモノクローナル抗体であって、ヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性を有するヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１または２記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であって、ヒトＣＤ２０抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）が９．５ｎＭ未満であって、Ｂ細胞に対するＣＤＣ活性が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上である抗体。
【請求項４】
請求項１または２記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であって、ヒトＣＤ２０抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）が９．５ｎＭ未満であって、Ｒａｊｉ細胞（浮遊細胞）またはＳＵ−ＤＨＬ４細胞に対するＣＤＣ活性が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体。
【請求項５】
請求項１または２記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であって、ヒトＣＤ２０抗原に対するＫｄ値が９．５ｎＭから１３ｎＭの範囲であって、Ｂ細胞に対するアポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体。
【請求項６】
請求項１または２記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であって、ヒトＣＤ２０抗原に対するＫｄ値が９．５ｎＭから１３ｎＭの範囲であって、ＷｉＬ２細胞またはＲＣＫ８細胞に対するアポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体。
【請求項７】
ＲＣＫ８細胞に対するＣＤＣ活性がリツキサン（登録商標）（Ｃ２Ｂ８）の活性よりも高い、請求項１または２記載の抗体。
【請求項８】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４３、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４４、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４５およびＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４６を有する細胞からなる群より選択される細胞を培養することを特徴とする、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４３、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４４、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４５およびＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４６を有する細胞からなる群より選択される細胞を培養することにより得ることのできる、ヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性を有するヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体。
【請求項２】
配列番号：１７〜２０のいずれかのＬ鎖と配列番号：２１〜２４のいずれかのＨ鎖を組み合わせたモノクローナル抗体であって、ヒトＣＤ２０抗原を有する細胞に対する増殖阻害活性を有するヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１または２記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であって、ヒトＣＤ２０抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）が９．５ｎＭ未満であって、Ｂ細胞に対するＣＤＣ活性が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上である抗体。
【請求項４】
請求項１または２記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であって、ヒトＣＤ２０抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）が９．５ｎＭ未満であって、Ｒａｊｉ細胞（浮遊細胞）またはＳＵ−ＤＨＬ４細胞に対するＣＤＣ活性が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体。
【請求項５】
請求項１または２記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であって、ヒトＣＤ２０抗原に対するＫｄ値が９．５ｎＭから１３ｎＭの範囲であって、Ｂ細胞に対するアポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体。
【請求項６】
請求項１または２記載のヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であって、ヒトＣＤ２０抗原に対するＫｄ値が９．５ｎＭから１３ｎＭの範囲であって、ＷｉＬ２細胞またはＲＣＫ８細胞に対するアポトーシス活性とＣＤＣ活性の総和が２Ｂ８抗体と同等またはそれ以上の抗体。
【請求項７】
ＲＣＫ８細胞に対するＣＤＣ活性がリツキサン（登録商標）（Ｃ２Ｂ８）の活性よりも高い、請求項１または２記載の抗体。
【請求項８】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４３、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４４、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４５およびＦＥＲＭ ＢＰ−１０５４６を有する細胞からなる群より選択される細胞を培養することを特徴とする、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図４ｄ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図５ｄ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図６ｄ】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図７ｃ】
【図７ｄ】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図８ｃ】
【図８ｄ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図９ｃ】
【図９ｄ】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１０ｃ】
【図１０ｄ】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１１ｃ】
【図１１ｄ】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１２ｃ】
【図１２ｄ】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１３ｃ】
【図１３ｄ】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図４ｄ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図５ｄ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図６ｄ】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図７ｃ】
【図７ｄ】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図８ｃ】
【図８ｄ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図９ｃ】
【図９ｄ】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１０ｃ】
【図１０ｄ】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１１ｃ】
【図１１ｄ】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１２ｃ】
【図１２ｄ】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１３ｃ】
【図１３ｄ】
【公開番号】特開２０１０−１８９４０２（Ｐ２０１０−１８９４０２Ａ）
【公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−７５６６８（Ｐ２０１０−７５６６８）
【出願日】平成２２年３月２９日（２０１０．３．２９）
【分割の表示】特願２００７−５２５１０９（Ｐ２００７−５２５１０９）の分割
【原出願日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２９日（２０１０．３．２９）
【分割の表示】特願２００７−５２５１０９（Ｐ２００７−５２５１０９）の分割
【原出願日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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