ヒト単球走化活性化因子の高感度免疫学的測定法
【目的】本発明の目的は、微量のＭＣＡＦを測定することにあり、また血液中、尿中でも体液成分に妨害されずに測定が可能な方法を提供することにある。
【構成】抗ヒト単球走化活性化因子モノクローナル抗体を用いることを特徴とする、ヒト単球走化活性化因子の高感度免疫学的測定法および測定用キット。
【構成】抗ヒト単球走化活性化因子モノクローナル抗体を用いることを特徴とする、ヒト単球走化活性化因子の高感度免疫学的測定法および測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト単球走化活性化因子（monocyte chemotactic and activatingfactor 以下ＭＣＡＦと略す）を測定するための方法、さらに詳しくは、ＭＣＡＦに対する抗体を用いた免疫学的測定法および測定を行なうためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】炎症反応における局所への白血球の遊走、浸潤には、生体由来の各種サイトカインが重要な役割を担うことが知られている。その中で、単球走化活性化因子、ＭＣＡＦ（mono- cyte chemotactic and activating factor) は、１９８９年にMatsushimaらおよびYoshimura らによりそのｃＤＮＡがクロ−ニングされ、構造が明らかにされた単球特異的な遊走因子である（Oppenheim ら(1991) Annu. Rev. Immunol., 9, p617 など）。ＭＣＰ−１（monocyte chemoattractant protein1）とも呼ばれるこの物質は、互いにアミノ酸レベルで３０％程度のホモロジ−を有し、４個のシステイン残基の位置が一致する一群の低分子量タンパク（ＣＣファミリ−あるいはintercrineβファミリ−と総称される）の一員であり、このファミリ−に属する他のタンパクとしては、ＲＡＮＴＥＳ、ＬＤ７８、Ａｃｔ−２、Ｉ−３０９などが知られている。また、好中球遊走活性化因子であるＩＬ−８および一群のファミリ−タンパク（ＰＦ４、β−ＴＧ、ＧＲＯ、ＩＰ−１０など）とも若干のホモロジ−を有し、ＩＬ−８ス−パ−ファミリ−を形成している。
【０００３】ＭＣＡＦは、単球、リンパ球といった血球系の細胞のほかに、線維芽細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、各種腫瘍細胞など様々な細胞から、ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＦＮ−γ、ＬＰＳなどの刺激により産生されることが報告されている。また、特発性肺線維腫で局所の上皮細胞がｍＲＮＡおよびタンパクを発現すること、慢性関節リウマチ患者の滑膜細胞からの産生が見られること、動脈硬化症の病巣部で発現が見られることなどの報告があり、さらに、その生理活性も単球遊走活性化以外に好塩基球に対して強いヒスタミン遊離作用を有し、アレルギ−反応にも関与することが複数のグル−プで明らかにされるなど、多くの炎症性疾患で重要な働きを持つことが明らかになりつつある。
【０００４】これまで、in vivo でのＭＣＡＦの産生については、in situ ハイブリダイゼ−ション法によるｍＲＮＡの検出、あるいは免疫組織染色法でのタンパクの同定といった定性的な手法で検討されてきた。酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）系の報告も２つのグル−プから出されているが（Yoshimura ら(1991) J. Immunol., 147,p2229、Evanoff ら(1992) Immunol. Invest., 21, p39）、いずれも感度的に十分とは言えず、また単球遊走活性を指標にしたバイオアッセイ法も、生体サンプルに適用するためには感度、特異性ともに問題があり、これまで体液中の微量ＭＣＡＦを正確に定量することは困難であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記のように各種疾患との関連性が報告されているＭＣＡＦを血清、血漿または尿中で測定するための、高感度な免疫学的測定法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記本発明の課題を解決するために、本発明は以下の構成を有する。すなわち、本発明は、抗ヒト単球走化活性化因子モノクローナル抗体を用いることを特徴とする、ヒト単球走化活性化因子の高感度免疫学的測定法である。
【０００７】本発明に用いる抗体は、哺乳動物をＭＣＡＦで免疫して得られる抗血清から精製されるポリクロ−ナル抗体およびＭＣＡＦで免疫された哺乳動物から取り出した抗体産生細胞をミエロ−マ細胞と融合して得られるハイブリド−マから産生されるモノクロ−ナル抗体のいずれもが使用できる。このようにして得られる各種の抗体の中から、抗原に対する親和性が高く、さらに他の血液、尿成分との反応が認められず特異性の高いものを選択することにより、３０ｐｇ／ｍｌより好ましくは５ｐｇ／ｍｌといった低濃度のＭＣＡＦを測定することができ、かつ血液、尿成分の妨害を受けない高感度な免疫学的測定法の確立に成功し、本発明を完成した。以下に本発明の具体的な方法を説明する。
【０００８】（ａ）モノクロ−ナル抗体ＭＣＡＦに対するモノクロ−ナル抗体は、常法に従って作製することができる。すなわち、マウスなど適当な動物をＭＣＡＦで免疫したのち、脾細胞をミエロ−マ細胞と融合し得られたハイブリド−マの中からＭＣＡＦと特異的に結合する抗体を産生するクロ−ンをＥＬＩＳＡなどの手法を用いて選択する。高感度な測定系を確立するためには、この段階でできるだけ抗原との親和性の高い抗体を選ぶことが重要である。次に、得られたハイブリド−マを培養し、その培養上清またはハイブリド−マを適当な動物に接腫して得られる腹水を材料として、モノクロ−ナル抗体を精製することができる。
【０００９】（ｂ）免疫学的測定法免疫学的測定法としては、サンドイッチ法、競合法など種々の測定原理を用いることができる。また、標識物質としては、酵素、ビオチンなどのハプテン、ラジオアイソト−プなどが用いられるが、高感度かつ測定の簡便な系とするためには、酵素標識抗体を用いたサンドイッチ法が望ましい。固相担体への抗体の固定および抗体の酵素標識は、常法に従って行なうことができる。固定化された抗体に検体中のＭＣＡＦを結合させ、さらに酵素標識抗体を反応させることにより、固相上に３者のサンドイッチ複合体を形成させる。最後に酵素基質を加え固相上の酵素活性を測定することにより、検体中のＭＣＡＦ濃度を定量することができる。
【００１０】また、９６穴マイクロプレ−トなど適当な担体に固相化した抗体、標識抗体および標準となる既知濃度のＭＣＡＦなどを組み合わせてキットを構成することが可能である。
【００１１】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
【００１２】１．モノクロ−ナル抗体の作製免疫原となるＭＣＡＦは、ヒト正常線維芽細胞培養上清より精製した天然型標品を用いた。免疫は、８週令の雌ｂａｌｂ／ｃマウス５匹を用い、腹腔内投与で４−５回行なった。初回免疫は、２０μｇのＭＣＡＦを、１×１０10個の百日咳死菌添加硫酸アルミニウムカリウムアジュバントと混合して投与し、２回目は硫酸アルミニウムカリウムアジュバントと混合、３回目以降はＰＢＳ溶液で、それぞれ２０μｇのＭＣＡＦを追加免疫した。最終免疫の３日後にマウスより脾臓を摘出し、脾細胞とマウスミエロ−マ細胞Ｐ３Ｕ１（P3- X63-Ag8U1 ）との細胞融合を行なった。融合後の細胞は、１５％牛胎児血清（Biocell 社）、２ ng/mlヒトＩＬ−６、およびＨＡＴ（ベ−リンガ−社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Flow社）に浮遊し、２〜５×１０5 個／２００μｌ／ウエルの細胞密度で９６穴マイクロプレ−ト（Corning 社）に分注し、７％ＣＯ2 存在下、３７℃で培養を行なった。
【００１３】抗体産生細胞のスクリ−ニングは、固相化ＭＣＡＦに対する抗体の結合を検出する下記のＥＬＩＳＡ法により行なった。９６穴マイクロプレ−ト（Nunc社）の各ウェルに０．５μｇ／ｍｌのＭＣＡＦ ＰＢＳ溶液を分注し、４℃で１晩固相化を行なった。０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ＰＢＳ溶液でブロッキングを行なった後、ハイブリド−マのＨＡＴ培地培養上清（細胞融合後９−１０日目）１００μｌを室温で１時間反応させ、さらにＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Cappel社）を室温で３０分間反応させた。各反応の間は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液にてウェルを３回洗浄し、未反応の試薬を除いた。最後に酵素基質（０．００６％過酸化水素および０．２ｍｇ／ｍｌ３、３´、５、５´−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む０．１Ｍ酢酸クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５）を加えて発色反応を行ない、その着色から陽性ウェルの判定を行なった。陽性ウェルは、ＨＴ培地１００μｌを加えてさらに一晩培養を行ない、翌日培養上清を３倍段階希釈して再度ＥＬＩＳＡを行なった。低濃度抗体（高希釈倍率）まで発色が認められたクロ−ンを選択し、限界希釈法でクロ−ニングを行なった。上記スクリ−ニング、クロ−ニングの操作を２回繰り返して、単一クロ−ンとして７個のハイブリド−マとして確立した。得られた抗体の一覧を表１に示す。なお、ＭＥ１２０を産生するハイブリド−マは微工研菌寄第１３２９３号として、またＭＩ４４６を産生するハイブリド−マは微工研菌寄第１３２９４号として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。
【００１４】
【表１】
２．抗体組み合わせの選択およびＥＬＩＳＡ反応条件の最適化７種のモノクロ−ナル抗体をそれぞれ固相化（第１）抗体またはビオチン化（第２）抗体として用いる４９通りのサンドイッチＥＬＩＳＡ系を組み、緩衝液またはプ−ル正常ヒト血清で段階希釈した標準ＭＣＡＦを測定した結果、最も高感度かつ血液成分の影響を受けない系として、固相化ＭＥ１２０／ビオチン化ＭＩ４４６の系を選択した。次に、ＭＩ４４６抗体をＦab' 化後ＨＲＰで直接標識し、固相化ＭＥ１２０との組み合わせで反応条件（反応液ｐＨおよび抗体濃度）の最適化を行なった結果を図１、図２に示す。第１反応ｐＨは、５．０の酸性条件では発色レベルが著しく低下したが、ｐＨ６〜９の領域では、ほぼ同等の発色を与えた。第２反応についても、ｐＨ６−８の中性領域では安定した発色を示したため、反応液組成は第１反応には０．１Ｍトリス塩酸ｐＨ８．０を、第２反応にはＰＢＳ（それぞれ０．２５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む）を用いることにした。また、固相化抗体濃度は、０．５μg/mlが最も高い発色を与えたためこの濃度を選択し、第２反応については、０．５μg/ml以上でほぼ同等の発色レベルとなり、４μg/mlではバックグラウンドレベルが若干上昇することから、０．５μg/mlの条件を選択した。また、検体量については、はじめは５０μｌで検討を行なったが、後に示すように検体量を２０μｌに減らしても健常者血清中、尿中のＭＣＡＦは十分検出可能であり、検体量が多いと測定レンジが狭くなる点が逆に欠点となることから、２０μｌの条件を選択した。最終的に決定した測定プロトコ−ルを図３に示す。
【００１５】３．ＥＬＩＳＡ系の基本性能評価標準曲線および最低検出感度の算出結果を図４に示す。標準曲線は、０−３００ pg/mlの範囲で良好な直線性を示し、１２．５ pg/ml以上のポイントでのばらつき（ＣＶ値）はすべて３％以下と良好であった。低濃度標準液の測定結果より、最低検出感度は希釈法で２．５ pg/ml＝５０ fg/サンプル、（＋２ＳＤ法で０．８ pg/ml＝１６ fg/サンプル）と算出された。
【００１６】表２は、ＭＣＡＦと一次構造上ホモロジ−の見られる一群のＩＬ−８ファミリ−タンパクに対する交差反応性および反応阻害についての検討結果である。６種のタンパクそれぞれについて、５０ ng/mlで含む溶液を測定したが、測定値はいずれも感度（２．５ pg/ml以下であり、またこれら溶液に添加したＭＣＡＦの回収率は１０２〜１１１％と良好であったことから、本測定系は、これら物質の影響を受けないことが確認できた。
【００１７】
【表２】
４．体液サンプルの測定次に体液成分による測定妨害の有無について検討を行なうために、健常者血清、血漿、尿検体からの添加回収率を調べた（表３）。ＭＣＡＦ無添加の場合の測定値は血清、血漿尿検体いずれも３０ pg/ml以上と予想外に高い結果であったが、回収率は、血清、ＥＤＴＡ血漿、クエン酸血漿、尿および培地（１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０）の各サンプルについてはいずれも１００％に近い問題のない結果が得られた。一方、ヘパリン血漿４検体では、回収率が４２〜６７％（平均５０％）と低い結果になったが、これはＭＣＡＦがヘパリンと親和性を有することに起因する可能性が考えられる。
【００１８】
【表３】
健常者の血清、尿についてさらに例数を増やして測定値の分布を調べた結果を図５に示す。添加回収試験の結果からも予想された通り、血清、尿検体は、全例検出可能な濃度のＭＣＡＦを含有しており、測定値は、血清検体で７４．５〜２６４．５ pg/ml（ｎ＝６０、平均±ＳＤ： １３７．８±４０．０ pg/ml）、尿検体で３３．０〜５５５ pg/ml（ｎ＝２４，平均± ＳＤ：１５８．１±１２６．９ pg/ml）の範囲に分布した。血清検体については、性別で分けてプロットしたが、男女間で有意な差は見られなかった。また年齢との相関性も特に認められなかった。
【００１９】これら健常者血清、尿検体の反応が非特異的なものではないことを確認するために、抗ＭＣＡＦ抗体での吸収実験を行なった結果を図６に示す。検体をあらかじめ抗ＭＣＡＦウサギ抗血清とインキュベ−トした後に測定を行なった場合には測定値はすべて感度以下に低下した。一方、コントロ−ルとして、正常ウサギ血清とインキュベ−トしたサンプルの測定値は抗体無添加の場合とほとんど変化しなかった。
【００２０】５．採血条件の影響血中ＩＬ−８測定におけるわれわれの以前の検討では、採血刺激によって血球からＩＬ−８が産生され、採血から遠心分離までの時間が長いと測定値が高くなるという現象が見られている。健常者血液中に見い出されたＭＣＡＦが、このような採血後に産生されたア−ティファクトではないことを確認するために、採血後種々時間を変えて遠心分離を行なった血清、血漿検体を調製し、測定を行なってみた。血清、ヘパリン血漿、ＥＤＴＡ血漿、クエン酸血漿それぞれ２例について検討を行なったが、２サンプルは同様の傾向を示したので、ここでは代表的な１例についての結果を示す。また、同じ検体中のＩＬ−８を測定した結果も合わせて示した（図７）。ＩＬ−８測定値は採血後３時間以内に遠心分離したサンプルではすべて測定感度（2.5 pg/ml ）以下であったが、血清、クエン酸血漿、ヘパリン血漿では６時間後から顕著な上昇が認められた。ＥＤＴＡ血漿では測定値の上昇は見られなかったが、ＥＤＴＡは単核球からのＬＰＳ、ＩＬ−１α刺激によるＩＬ−８産生も抑制することから、血球からのＩＬ−８産生を抑制する効果があると考えられる。一方、ＭＣＡＦ測定値は、採血後すぐに遠心分離した場合でも１００ pg/ml前後の値を示し、血清では若干の経時的上昇、ヘパリン血漿およびクエン酸血漿では若干の経時的低下が見られるものの、ＩＬ−８のような大きな影響は受けないことが示された。なお、採血後の血液を４℃で保存した場合には、２４時間後に遠心分離を行なってもＭＣＡＦ、ＩＬ−８ともに測定値は採血直後に遠心分離したサンプルと全く変らなかった。
【００２１】
６．ゲル濾過カラム分画による体液中ＭＣＡＦの解析健常者血中、尿中に見出されたＭＣＡＦについてさらに解析を行なう目的で、プ−ル健常者血清およびプ−ル健常者尿それぞれ１ｍｌをセファクリルＳ−２００カラムで分画し各フラクションのＥＬＩＳＡ測定を行なった。図８に示すとおり、血清中および尿中のＭＣＡＦは、いずれも精製品と同じ分子量約１０ｋＤの位置に単一ピ−クとして溶出され、体液中でもキャリアタンパク等に結合せずフリ−の単量体として存在することが示唆された。
【００２２】
【発明の効果】本発明により、３０ pg/ml以下といった低濃度のＭＣＡＦを定量することが初めて可能となった。この方法は、各種疾患とＭＣＡＦとの関連性を解明するための有効な手段となる。また、特定の疾患との関連性が明らかになれば、その診断のために有効に活用され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＥＬＩＳＡ第１反応（Ａ）および第２反応（Ｂ）における反応溶液ｐＨの影響を示す。
【図２】ＥＬＩＳＡにおける固相化抗体濃度（Ａ）および標識抗体濃度（Ｂ）の影響を示す。
【図３】ＥＬＩＳＡの測定プロトコ−ルを示す。
【図４】標準曲線および最低検出感度の算出結果を示す。
【図５】健常者血清および尿中のＭＣＡＦ測定値の分布を示す。
【図６】抗ＭＣＡＦ抗血清による吸収試験の結果を示す。
【図７】採血条件（採血から遠心分離までの時間）の影響を示す。
【図８】ゲル濾過カラム分画による体液中ＭＣＡＦの解析結果を示す。
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト単球走化活性化因子（monocyte chemotactic and activatingfactor 以下ＭＣＡＦと略す）を測定するための方法、さらに詳しくは、ＭＣＡＦに対する抗体を用いた免疫学的測定法および測定を行なうためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】炎症反応における局所への白血球の遊走、浸潤には、生体由来の各種サイトカインが重要な役割を担うことが知られている。その中で、単球走化活性化因子、ＭＣＡＦ（mono- cyte chemotactic and activating factor) は、１９８９年にMatsushimaらおよびYoshimura らによりそのｃＤＮＡがクロ−ニングされ、構造が明らかにされた単球特異的な遊走因子である（Oppenheim ら(1991) Annu. Rev. Immunol., 9, p617 など）。ＭＣＰ−１（monocyte chemoattractant protein1）とも呼ばれるこの物質は、互いにアミノ酸レベルで３０％程度のホモロジ−を有し、４個のシステイン残基の位置が一致する一群の低分子量タンパク（ＣＣファミリ−あるいはintercrineβファミリ−と総称される）の一員であり、このファミリ−に属する他のタンパクとしては、ＲＡＮＴＥＳ、ＬＤ７８、Ａｃｔ−２、Ｉ−３０９などが知られている。また、好中球遊走活性化因子であるＩＬ−８および一群のファミリ−タンパク（ＰＦ４、β−ＴＧ、ＧＲＯ、ＩＰ−１０など）とも若干のホモロジ−を有し、ＩＬ−８ス−パ−ファミリ−を形成している。
【０００３】ＭＣＡＦは、単球、リンパ球といった血球系の細胞のほかに、線維芽細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、各種腫瘍細胞など様々な細胞から、ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＦＮ−γ、ＬＰＳなどの刺激により産生されることが報告されている。また、特発性肺線維腫で局所の上皮細胞がｍＲＮＡおよびタンパクを発現すること、慢性関節リウマチ患者の滑膜細胞からの産生が見られること、動脈硬化症の病巣部で発現が見られることなどの報告があり、さらに、その生理活性も単球遊走活性化以外に好塩基球に対して強いヒスタミン遊離作用を有し、アレルギ−反応にも関与することが複数のグル−プで明らかにされるなど、多くの炎症性疾患で重要な働きを持つことが明らかになりつつある。
【０００４】これまで、in vivo でのＭＣＡＦの産生については、in situ ハイブリダイゼ−ション法によるｍＲＮＡの検出、あるいは免疫組織染色法でのタンパクの同定といった定性的な手法で検討されてきた。酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）系の報告も２つのグル−プから出されているが（Yoshimura ら(1991) J. Immunol., 147,p2229、Evanoff ら(1992) Immunol. Invest., 21, p39）、いずれも感度的に十分とは言えず、また単球遊走活性を指標にしたバイオアッセイ法も、生体サンプルに適用するためには感度、特異性ともに問題があり、これまで体液中の微量ＭＣＡＦを正確に定量することは困難であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記のように各種疾患との関連性が報告されているＭＣＡＦを血清、血漿または尿中で測定するための、高感度な免疫学的測定法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記本発明の課題を解決するために、本発明は以下の構成を有する。すなわち、本発明は、抗ヒト単球走化活性化因子モノクローナル抗体を用いることを特徴とする、ヒト単球走化活性化因子の高感度免疫学的測定法である。
【０００７】本発明に用いる抗体は、哺乳動物をＭＣＡＦで免疫して得られる抗血清から精製されるポリクロ−ナル抗体およびＭＣＡＦで免疫された哺乳動物から取り出した抗体産生細胞をミエロ−マ細胞と融合して得られるハイブリド−マから産生されるモノクロ−ナル抗体のいずれもが使用できる。このようにして得られる各種の抗体の中から、抗原に対する親和性が高く、さらに他の血液、尿成分との反応が認められず特異性の高いものを選択することにより、３０ｐｇ／ｍｌより好ましくは５ｐｇ／ｍｌといった低濃度のＭＣＡＦを測定することができ、かつ血液、尿成分の妨害を受けない高感度な免疫学的測定法の確立に成功し、本発明を完成した。以下に本発明の具体的な方法を説明する。
【０００８】（ａ）モノクロ−ナル抗体ＭＣＡＦに対するモノクロ−ナル抗体は、常法に従って作製することができる。すなわち、マウスなど適当な動物をＭＣＡＦで免疫したのち、脾細胞をミエロ−マ細胞と融合し得られたハイブリド−マの中からＭＣＡＦと特異的に結合する抗体を産生するクロ−ンをＥＬＩＳＡなどの手法を用いて選択する。高感度な測定系を確立するためには、この段階でできるだけ抗原との親和性の高い抗体を選ぶことが重要である。次に、得られたハイブリド−マを培養し、その培養上清またはハイブリド−マを適当な動物に接腫して得られる腹水を材料として、モノクロ−ナル抗体を精製することができる。
【０００９】（ｂ）免疫学的測定法免疫学的測定法としては、サンドイッチ法、競合法など種々の測定原理を用いることができる。また、標識物質としては、酵素、ビオチンなどのハプテン、ラジオアイソト−プなどが用いられるが、高感度かつ測定の簡便な系とするためには、酵素標識抗体を用いたサンドイッチ法が望ましい。固相担体への抗体の固定および抗体の酵素標識は、常法に従って行なうことができる。固定化された抗体に検体中のＭＣＡＦを結合させ、さらに酵素標識抗体を反応させることにより、固相上に３者のサンドイッチ複合体を形成させる。最後に酵素基質を加え固相上の酵素活性を測定することにより、検体中のＭＣＡＦ濃度を定量することができる。
【００１０】また、９６穴マイクロプレ−トなど適当な担体に固相化した抗体、標識抗体および標準となる既知濃度のＭＣＡＦなどを組み合わせてキットを構成することが可能である。
【００１１】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
【００１２】１．モノクロ−ナル抗体の作製免疫原となるＭＣＡＦは、ヒト正常線維芽細胞培養上清より精製した天然型標品を用いた。免疫は、８週令の雌ｂａｌｂ／ｃマウス５匹を用い、腹腔内投与で４−５回行なった。初回免疫は、２０μｇのＭＣＡＦを、１×１０10個の百日咳死菌添加硫酸アルミニウムカリウムアジュバントと混合して投与し、２回目は硫酸アルミニウムカリウムアジュバントと混合、３回目以降はＰＢＳ溶液で、それぞれ２０μｇのＭＣＡＦを追加免疫した。最終免疫の３日後にマウスより脾臓を摘出し、脾細胞とマウスミエロ−マ細胞Ｐ３Ｕ１（P3- X63-Ag8U1 ）との細胞融合を行なった。融合後の細胞は、１５％牛胎児血清（Biocell 社）、２ ng/mlヒトＩＬ−６、およびＨＡＴ（ベ−リンガ−社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Flow社）に浮遊し、２〜５×１０5 個／２００μｌ／ウエルの細胞密度で９６穴マイクロプレ−ト（Corning 社）に分注し、７％ＣＯ2 存在下、３７℃で培養を行なった。
【００１３】抗体産生細胞のスクリ−ニングは、固相化ＭＣＡＦに対する抗体の結合を検出する下記のＥＬＩＳＡ法により行なった。９６穴マイクロプレ−ト（Nunc社）の各ウェルに０．５μｇ／ｍｌのＭＣＡＦ ＰＢＳ溶液を分注し、４℃で１晩固相化を行なった。０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ＰＢＳ溶液でブロッキングを行なった後、ハイブリド−マのＨＡＴ培地培養上清（細胞融合後９−１０日目）１００μｌを室温で１時間反応させ、さらにＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Cappel社）を室温で３０分間反応させた。各反応の間は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液にてウェルを３回洗浄し、未反応の試薬を除いた。最後に酵素基質（０．００６％過酸化水素および０．２ｍｇ／ｍｌ３、３´、５、５´−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む０．１Ｍ酢酸クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５）を加えて発色反応を行ない、その着色から陽性ウェルの判定を行なった。陽性ウェルは、ＨＴ培地１００μｌを加えてさらに一晩培養を行ない、翌日培養上清を３倍段階希釈して再度ＥＬＩＳＡを行なった。低濃度抗体（高希釈倍率）まで発色が認められたクロ−ンを選択し、限界希釈法でクロ−ニングを行なった。上記スクリ−ニング、クロ−ニングの操作を２回繰り返して、単一クロ−ンとして７個のハイブリド−マとして確立した。得られた抗体の一覧を表１に示す。なお、ＭＥ１２０を産生するハイブリド−マは微工研菌寄第１３２９３号として、またＭＩ４４６を産生するハイブリド−マは微工研菌寄第１３２９４号として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。
【００１４】
【表１】
２．抗体組み合わせの選択およびＥＬＩＳＡ反応条件の最適化７種のモノクロ−ナル抗体をそれぞれ固相化（第１）抗体またはビオチン化（第２）抗体として用いる４９通りのサンドイッチＥＬＩＳＡ系を組み、緩衝液またはプ−ル正常ヒト血清で段階希釈した標準ＭＣＡＦを測定した結果、最も高感度かつ血液成分の影響を受けない系として、固相化ＭＥ１２０／ビオチン化ＭＩ４４６の系を選択した。次に、ＭＩ４４６抗体をＦab' 化後ＨＲＰで直接標識し、固相化ＭＥ１２０との組み合わせで反応条件（反応液ｐＨおよび抗体濃度）の最適化を行なった結果を図１、図２に示す。第１反応ｐＨは、５．０の酸性条件では発色レベルが著しく低下したが、ｐＨ６〜９の領域では、ほぼ同等の発色を与えた。第２反応についても、ｐＨ６−８の中性領域では安定した発色を示したため、反応液組成は第１反応には０．１Ｍトリス塩酸ｐＨ８．０を、第２反応にはＰＢＳ（それぞれ０．２５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む）を用いることにした。また、固相化抗体濃度は、０．５μg/mlが最も高い発色を与えたためこの濃度を選択し、第２反応については、０．５μg/ml以上でほぼ同等の発色レベルとなり、４μg/mlではバックグラウンドレベルが若干上昇することから、０．５μg/mlの条件を選択した。また、検体量については、はじめは５０μｌで検討を行なったが、後に示すように検体量を２０μｌに減らしても健常者血清中、尿中のＭＣＡＦは十分検出可能であり、検体量が多いと測定レンジが狭くなる点が逆に欠点となることから、２０μｌの条件を選択した。最終的に決定した測定プロトコ−ルを図３に示す。
【００１５】３．ＥＬＩＳＡ系の基本性能評価標準曲線および最低検出感度の算出結果を図４に示す。標準曲線は、０−３００ pg/mlの範囲で良好な直線性を示し、１２．５ pg/ml以上のポイントでのばらつき（ＣＶ値）はすべて３％以下と良好であった。低濃度標準液の測定結果より、最低検出感度は希釈法で２．５ pg/ml＝５０ fg/サンプル、（＋２ＳＤ法で０．８ pg/ml＝１６ fg/サンプル）と算出された。
【００１６】表２は、ＭＣＡＦと一次構造上ホモロジ−の見られる一群のＩＬ−８ファミリ−タンパクに対する交差反応性および反応阻害についての検討結果である。６種のタンパクそれぞれについて、５０ ng/mlで含む溶液を測定したが、測定値はいずれも感度（２．５ pg/ml以下であり、またこれら溶液に添加したＭＣＡＦの回収率は１０２〜１１１％と良好であったことから、本測定系は、これら物質の影響を受けないことが確認できた。
【００１７】
【表２】
４．体液サンプルの測定次に体液成分による測定妨害の有無について検討を行なうために、健常者血清、血漿、尿検体からの添加回収率を調べた（表３）。ＭＣＡＦ無添加の場合の測定値は血清、血漿尿検体いずれも３０ pg/ml以上と予想外に高い結果であったが、回収率は、血清、ＥＤＴＡ血漿、クエン酸血漿、尿および培地（１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０）の各サンプルについてはいずれも１００％に近い問題のない結果が得られた。一方、ヘパリン血漿４検体では、回収率が４２〜６７％（平均５０％）と低い結果になったが、これはＭＣＡＦがヘパリンと親和性を有することに起因する可能性が考えられる。
【００１８】
【表３】
健常者の血清、尿についてさらに例数を増やして測定値の分布を調べた結果を図５に示す。添加回収試験の結果からも予想された通り、血清、尿検体は、全例検出可能な濃度のＭＣＡＦを含有しており、測定値は、血清検体で７４．５〜２６４．５ pg/ml（ｎ＝６０、平均±ＳＤ： １３７．８±４０．０ pg/ml）、尿検体で３３．０〜５５５ pg/ml（ｎ＝２４，平均± ＳＤ：１５８．１±１２６．９ pg/ml）の範囲に分布した。血清検体については、性別で分けてプロットしたが、男女間で有意な差は見られなかった。また年齢との相関性も特に認められなかった。
【００１９】これら健常者血清、尿検体の反応が非特異的なものではないことを確認するために、抗ＭＣＡＦ抗体での吸収実験を行なった結果を図６に示す。検体をあらかじめ抗ＭＣＡＦウサギ抗血清とインキュベ−トした後に測定を行なった場合には測定値はすべて感度以下に低下した。一方、コントロ−ルとして、正常ウサギ血清とインキュベ−トしたサンプルの測定値は抗体無添加の場合とほとんど変化しなかった。
【００２０】５．採血条件の影響血中ＩＬ−８測定におけるわれわれの以前の検討では、採血刺激によって血球からＩＬ−８が産生され、採血から遠心分離までの時間が長いと測定値が高くなるという現象が見られている。健常者血液中に見い出されたＭＣＡＦが、このような採血後に産生されたア−ティファクトではないことを確認するために、採血後種々時間を変えて遠心分離を行なった血清、血漿検体を調製し、測定を行なってみた。血清、ヘパリン血漿、ＥＤＴＡ血漿、クエン酸血漿それぞれ２例について検討を行なったが、２サンプルは同様の傾向を示したので、ここでは代表的な１例についての結果を示す。また、同じ検体中のＩＬ−８を測定した結果も合わせて示した（図７）。ＩＬ−８測定値は採血後３時間以内に遠心分離したサンプルではすべて測定感度（2.5 pg/ml ）以下であったが、血清、クエン酸血漿、ヘパリン血漿では６時間後から顕著な上昇が認められた。ＥＤＴＡ血漿では測定値の上昇は見られなかったが、ＥＤＴＡは単核球からのＬＰＳ、ＩＬ−１α刺激によるＩＬ−８産生も抑制することから、血球からのＩＬ−８産生を抑制する効果があると考えられる。一方、ＭＣＡＦ測定値は、採血後すぐに遠心分離した場合でも１００ pg/ml前後の値を示し、血清では若干の経時的上昇、ヘパリン血漿およびクエン酸血漿では若干の経時的低下が見られるものの、ＩＬ−８のような大きな影響は受けないことが示された。なお、採血後の血液を４℃で保存した場合には、２４時間後に遠心分離を行なってもＭＣＡＦ、ＩＬ−８ともに測定値は採血直後に遠心分離したサンプルと全く変らなかった。
【００２１】
６．ゲル濾過カラム分画による体液中ＭＣＡＦの解析健常者血中、尿中に見出されたＭＣＡＦについてさらに解析を行なう目的で、プ−ル健常者血清およびプ−ル健常者尿それぞれ１ｍｌをセファクリルＳ−２００カラムで分画し各フラクションのＥＬＩＳＡ測定を行なった。図８に示すとおり、血清中および尿中のＭＣＡＦは、いずれも精製品と同じ分子量約１０ｋＤの位置に単一ピ−クとして溶出され、体液中でもキャリアタンパク等に結合せずフリ−の単量体として存在することが示唆された。
【００２２】
【発明の効果】本発明により、３０ pg/ml以下といった低濃度のＭＣＡＦを定量することが初めて可能となった。この方法は、各種疾患とＭＣＡＦとの関連性を解明するための有効な手段となる。また、特定の疾患との関連性が明らかになれば、その診断のために有効に活用され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＥＬＩＳＡ第１反応（Ａ）および第２反応（Ｂ）における反応溶液ｐＨの影響を示す。
【図２】ＥＬＩＳＡにおける固相化抗体濃度（Ａ）および標識抗体濃度（Ｂ）の影響を示す。
【図３】ＥＬＩＳＡの測定プロトコ−ルを示す。
【図４】標準曲線および最低検出感度の算出結果を示す。
【図５】健常者血清および尿中のＭＣＡＦ測定値の分布を示す。
【図６】抗ＭＣＡＦ抗血清による吸収試験の結果を示す。
【図７】採血条件（採血から遠心分離までの時間）の影響を示す。
【図８】ゲル濾過カラム分画による体液中ＭＣＡＦの解析結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】抗ヒト単球走化活性化因子モノクローナル抗体を用いることを特徴とする、ヒト単球走化活性化因子の高感度免疫学的測定法。
【請求項２】抗ヒト単球走化活性化因子モノクローナル抗体を固相化抗体および酵素標識抗体として用いることを特徴とする請求項１記載の高感度免疫学的測定法。
【請求項３】固相化抗体、酵素標識抗体としてクロ−ンＭＥ１２０およびクロ−ンＭＩ４４６を用いることを特徴とする請求項２記載の高感度免疫学的測定法。
【請求項４】抗ヒト単球走化活性化因子モノクローナル抗体クロ−ンＭＥ１２０。
【請求項５】抗ヒト単球走化活性化因子モノクローナル抗体クロ−ンＭＩ４４６。
【請求項６】抗ヒト単球走化活性化因子モノクローナル抗体を用いることを特徴とする高感度免疫学的ヒト単球走化活性化因子測定キット。
【請求項１】抗ヒト単球走化活性化因子モノクローナル抗体を用いることを特徴とする、ヒト単球走化活性化因子の高感度免疫学的測定法。
【請求項２】抗ヒト単球走化活性化因子モノクローナル抗体を固相化抗体および酵素標識抗体として用いることを特徴とする請求項１記載の高感度免疫学的測定法。
【請求項３】固相化抗体、酵素標識抗体としてクロ−ンＭＥ１２０およびクロ−ンＭＩ４４６を用いることを特徴とする請求項２記載の高感度免疫学的測定法。
【請求項４】抗ヒト単球走化活性化因子モノクローナル抗体クロ−ンＭＥ１２０。
【請求項５】抗ヒト単球走化活性化因子モノクローナル抗体クロ−ンＭＩ４４６。
【請求項６】抗ヒト単球走化活性化因子モノクローナル抗体を用いることを特徴とする高感度免疫学的ヒト単球走化活性化因子測定キット。
【図１】
【図４】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図４】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開平６−２０５６９０
【公開日】平成６年（１９９４）７月２６日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平４−３３２９４３
【出願日】平成４年（１９９２）１２月１４日
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【公開日】平成６年（１９９４）７月２６日
【国際特許分類】
【出願日】平成４年（１９９２）１２月１４日
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
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