ヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞の成長および分化のための３Ｄ培養システム
本発明は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳ）からの肝細胞様細胞の誘導のための、３Ｄ培養システムの使用に関する。特に、本発明は、３Ｄ中空繊維キャピラリーバイオリアクターにおける、ヒト多能性幹細胞の、肝細胞様細胞への、方向性のある分化および成熟に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳ）からの肝細胞様細胞の誘導のための、３Ｄ培養システムの使用に関する。特に、本発明は、３Ｄ中空繊維キャピラリーバイオリアクターにおける、ヒト多能性幹細胞の、肝細胞様細胞への、方向性のある分化および成熟に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療および応用研究、例えば薬物スクリーニングまたは毒性学試験など、における、幹細胞ベースの用途の、開発および実施のためには、十分に定義された特徴を有する大量の細胞が必要である。したがって、高収率かつ高純度で、ｈＰＳの、成熟した肝細胞様細胞への、方向性のある再現性ある分化を可能にする培養システムが求められている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、肝細胞様細胞を得るための方法であって、
ｉ） バイオリアクター（Ｂｉｏｒａｃｔｏｒｓ）におけるｈＰＳ細胞または肝前駆細胞の播種
ｉｉ） 当該バイオリアクターを１種類以上の培養培地で１０日〜５０日の期間にわたり灌流して、肝細胞様細胞を得ること、
を含む方法に関する。
【０００４】
本発明の一局面、本発明は、肝細胞様細胞を得るための方法であって、
ｉ） バイオリアクターにおけるｈＰＳ細胞または肝前駆細胞の播種
ｉｉ） 当該バイオリアクターを１種類以上の培養培地で１０日〜５０日の期間にわたり灌流して、肝細胞様細胞を得ること、
を含む方法、により得られる肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造に関する。
【０００５】
本発明のさらなる一局面では、本発明は、肝細胞様細胞を得るための方法であって、
ｉ） バイオリアクターにおけるｈＰＳ細胞または肝前駆細胞の播種
ｉｉ） 当該バイオリアクターを１種類以上の培養培地で１０日〜５０日の期間にわたり灌流して、肝細胞様細胞を得ること、
を含む方法、により得られる細胞の、治療目的での、または、創薬、医薬製剤、毒性試験における、または、再生医療における、使用に関する。
【０００６】
さらなる一実施形態では、本発明は、ｈＰＳ細胞または肝前駆体を、肝細胞運命に向かって分化させるための、バイオリアクターの使用に関する。
【０００７】
序論
凝集体またはマイクロキャリアを用いる、分化に対する現在の３Ｄ浮遊培養モデルアプローチは、中央物質交換（ｃｅｎｔｒａｌ ｍａｓｓ ｅｘｃｈａｎｇｅ）が限られる。より大きな細胞量での、連続的な培地交換と、制御可能なガス圧での分散した酸素添加とを伴う、灌流を基本とした動的培養条件を提供することにより、３Ｄ灌流４区画キャピラリー膜バイオリアクター技術は、両方の培養の概念の利点を用いることを可能にする。加えて、医薬品の製造および品質管理に関する基準（ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅ；ＧＭＰ）の条件に適した、分化レジームの、閉鎖系への適用が可能である。この技術は、例えば酸素圧、ガス因子適用（ｇａｓ ｆａｃｔｏｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、培地因子勾配（ｍｅｄｉｕｍ ｆａｃｔｏｒ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ）、または、細胞に対する例えば流速および圧力などの物理的刺激の生成などの、変化するが制御可能な培地およびシステムのパラメータを可能にする。
【０００８】
バイオリアクターにおけるｈＰＳ細胞の培養
再生医療および応用研究、例えば薬物スクリーニングまたは毒性学試験など、における、幹細胞ベースの用途の、開発および実施のためには、十分に定義された特徴を有する大量の細胞が必要である。したがって、高収率かつ高純度で、未分化のヒト胚性幹細胞の、成熟した肝細胞への、方向性のある再現性ある分化を可能にする培養システムが求められている。
【０００９】
最も一般的に用いられる培養および分化の方法は、典型的には、非連続的な培地交換を伴う静的開放系を代表する、プラスチック・ディッシュの形の２Ｄ培養システムを利用するものであり、これは、培地交換と培地交換との間の、培養培地中の、代謝産物の蓄積や栄養素の減少といった形で、培養環境の周期的な変化を引き起こす。そのうえ、これらの２Ｄ培養は、広範な手作業による介入を要することから大きな労働力を要するものであるため、それ故、より大きな細胞数の取り扱いを実行不可能にする。
【００１０】
バイオリアクターにおけるｈＰＳ細胞の分化
Ｓｏｔｏ−ＧｕｔｉｅｒｒｅｚらによるｈＥＳＣ研究の肝分化が指し示しているのは、複雑なマトリックス構造を用いるかまたは非実質細胞との共培養を用いる、より複雑な環境が、ｈＥＳＣの肝分化を支援するとのことである（Ｓｏｔｏ−Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ ｅｔ ａｌ． ２００６）。Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇらは、ＥＳ細胞またはＥＢを播いた、ＰＬＧＡ―ポリ（乳酸‐コ‐グリコール酸）およびＰＬＬＡ―ポリ（Ｌ‐乳酸）の、生分解性の足場において、肝組織様構造の誘導は、アクチビンＡおよびＩＧＦでの処理により可能であったとのことを示した（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． ２００３）。Ｂａｈａｒｖａｎｄらは、３Ｄのコラーゲン製の足場における、ｈＥＳＣの、亢進された肝分化について報告した（Ｂａｈａｒｖａｎｄ ｅｔ ａｌ． ２００６）。したがって、３Ｄ培養環境を提供する灌流型バイオリアクターの使用により、胚性幹細胞分化のための、より効率的で、かつ、スケーラブルな方法がもたらされ得る。
【００１１】
新たなアプローチは、胚性幹細胞を広げるおよび分化させるための、中空繊維バイオリアクターの使用である。中空繊維キャピラリー膜バイオリアクター技術は、動的灌流培養条件を可能にし、また、自然のままの組織中に見られるような幹細胞の細胞密度を増加させることを可能にする。加えて、より大きな細胞量のためのスケールアップが可能である。しかしながら、周囲キャピラリーの束の周辺の細胞区画と、主に拡散による、栄養摂取と、外部酸素添加とを伴う、典型的な２区画バイオリアクター装置（例えばＦｉｂｅｒＣｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍｓ社のＦｉｂｅｒＣｅｌｌ Ｄｕｅｔ、ｗｗｗ．ｆｉｂｅｒｃｅｌｌｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）は、数デシメートルのキャピラリー長に沿った基質勾配の隔たり（ｄｉｓｔａｎｃｅ）を伴う、不均一な物質交換（ｍａｓｓ ｅｘｃｈａｎｇｅ）により制限される。
【００１２】
Ｇｅｒｌａｃｈらにより開発された３Ｄ多区画技術（Ｇｅｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ． １９９４）においては、この典型的な２区画装置に、もう１つの培地の、および、さらなる酸素添加膜区画が加えられた。４つの区画を織り合わせて、繰り返し単位を形成することにより、バイオリアクターのスケーラビリティ（ｓｃａｌａｂｉｌｉｔｙ）が可能となり、分散型の培地の灌流および置換が提供され、それと同時に、物質交換（ｍａｓｓ ｅｘｃｈａｎｇｅ）が亢進され、勾配の隔たりが減少する。当該概念は、閉じた、それ故、医薬品の製造および品質管理に関する基準（ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅ；ＧＭＰ）に適した、培養環境における、細胞の培養に基づいたものであり、これにより、結果の、可能な臨床転換（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）のみならず、生物工学的応用もまた容易となる。バイオリアクターにおいて培養された初代ブタまたはヒト肝臓細胞を用いた初期の臨床研究では、当該システムを備えた、臨床的な対外肝臓補助（ｅｘｔｒａｃｏｒｐｏｒｅａｌ ｌｉｖｅｒ ｓｕｐｐｏｒｔ）の実現可能性が実証された（Ｓａｕｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００３）。加えて、初代細胞は、胆管構造およびネオ・シヌソイド（ｎｅｏ−ｓｉｎｕｓｏｉｄｓ）を有する肝臓様組織の形成を含む、それら自身の典型的な微小環境を、そうしたｉｎ ｖｉｔｒｏ培養モデル中に作り出すことができる、とのことが示された。成体幹細胞は、非器官型（ａｎｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃａｌ）微小環境の創出のための、そうしたシステムにおける実質細胞／非実質細胞の共培養からの恩恵を受けられる可能性がある（Ｇｅｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ． ２００３）。
【００１３】
ｈＰＳ細胞は、その独特の特徴ゆえ、基礎科学、薬理学的な薬物スクリーニング、毒性試験、および、再生医療における細胞ベースの治療、への適用のための細胞源としての大きな可能性を保持している。特定の生育条件の下では、ｈＰＳ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、多種多様な体細胞組織および胚体外組織に分化することが可能である、とのことが実証されてきた（Ｐｅｒａ ｅｔ ａｌ． ２００４）。したがって、ｈＰＳ、および、特にｈＥＳ／ｈＢＳ細胞は、以前は研究用ヒト胚の利用困難性（ｉｎａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）ゆえに不可能であった、初期胚発生の際に細胞の運命を制御するような分子経路および制御機構の研究を可能にするものである。ｈＰＳ細胞の、可能な臨床適用は、肝機能不全、脊髄損傷または心筋欠損のような器官の欠陥を有する患者における細胞ベースの治療のための、幹細胞由来細胞調製物の提供に見られる。ｈＰＳ細胞由来の分化した細胞の、創薬における、可能な利用の分野は、標的の同定およびバリデーション、化合物の有効性のスクリーニングならびに安全性評価研究、のような前臨床活動に見られる（Ｓａｒｔｉｐｙ ｅｔ ａｌ． ２００７）。胚毒性試験に関しては、未分化のｈＰＳ細胞は、より良い試験システムの開発のための、新たなツールも提供する。
【００１４】
哺乳類の肝臓の発生
肝臓は、胚中で発生する最初の器官の１つであり、また、それは、たちまち胎児（胎仔）の体内で最も大きい器官の１つになる。肝臓は、胚前腸の胚体内胚葉上皮（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）から発生する。肝臓発生の誘導には、最初に、前腸におけるＷｎｔおよび繊維芽細胞成長因子シグナル伝達（ＦＧＦ４）の抑制が必要である。次いで、心臓中胚葉からのＦＧＦと、横中隔間充織からの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）とが、空間的に限定された細胞増殖を誘導し、それにより内胚葉層の肥厚化が引き起こされる。次いで、細胞が上皮から現れて、横中隔中へと移動しはじめる。この内胚葉から現れて横中隔中に集まる細胞の塊は肝芽（ｌｉｖｅｒ ｂｕｄ）と称される。器官形成のこのステージにおける内皮細胞との相互作用は、この初期出芽段階に極めて重要である。肝内胚葉（ｈｅｐａｔｉｃ ｅｎｄｏｄｅｒｍ）細胞は、この間、機能および形態に関してかなり未成熟であり、今度は肝芽細胞（ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔ）と称される。肝芽由来の肝芽細胞の索は、中胚葉に貫入し、卵黄静脈および臍静脈と混ざり合い、これらが肝芽付近で吻合して、毛細血管床を形成する。これらの変遷により肝臓の類洞構造が確立されるが、これは、器官機能に極めて重要なことであり、また、肝臓への土台作りをして胎児（胎仔）の造血を支援する。肝芽中へと移動する造血幹細胞は、グルココルチコイドと共に、さらなる肝成熟を誘導するオンコスタチンＭ（ＯｓＭ）を分泌する。この胚の肝臓塊に寄与する他の細胞型は、肝類洞、クッパー細胞および肝星細胞を取り巻く内皮細胞である。これらの細胞により産生される肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）は、完全な機能的肝成熟に重要である。肝臓分化の、これら、より後期のステージにおいては、Ｗｎｔシグナル伝達は、もはや成長および分化を阻害せず、促進する。原因肝臓療法がないこと、および、肝移植用のドナー臓器の入手可能性（ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）が不十分であることが、新しい細胞ベースの肝臓治療の開発に対する要求を生んでいる。損傷した組織と入れ換わるための、増殖および分化の能力を有する幹細胞の移植は、いくつかの臨床的徴候においては、全臓器移植（ｗｈｏｌｅ−ｏｒｇａｎ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）に取って代わることができ得るものである。
【００１５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｈＰＳ細胞の肝分化
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ＨＰＳ細胞、および、特にｈＥＳ／ｈＢＳ細胞の、肝分化の方向についての戦略に関する研究の結果、肝分化に対する効果を有する、いくつかのサイトカイン、成長因子および非タンパク質化合物の同定に至った（Ｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００５；Ｓｎｙｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ． ２００８において概説されている）。当該成長因子としては、アクチビンＡ、ＢＭＰ２および４、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＦＧＦ１、２および４、ＨＧＦ、インスリンならびにＯｓＭが挙げられる。当該非タンパク質因子としては、デキサメサゾン（ＤＥＸ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ニコチンアミドおよび酪酸ナトリウムが挙げられる。各分化因子の効果の鍵となるのは、タイミング、濃度および他の因子との組み合わせである。ｈＰＳ由来肝細胞様細胞の特徴決定をするために、種々のマーカーおよび機能試験が利用されてきた（Ｓｎｙｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ． ２００８により概説されている）。免疫細胞化学、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または酵素結合免疫吸着測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）により調べられたマーカーには、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）および尿素のような血漿タンパク質、サイトケラチン（ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ７、ＣＫ１９）、ならびに、アルファ‐１‐アンチトリプシン（α１ＡＴ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）およびシトクロムＰ４５０アイソエンザイムのような種々の肝細胞特異的酵素、の分泌物が含まれていた。肝細胞特異的機能の発現については、例えば、グリコーゲンの貯蔵の検出や、シトクロムＰ４５０アイソザイムに特異的な種々の試験基質の代謝などにより、調べられてきた。
【００１６】
ｈＰＳ細胞の肝分化が記述されている最初に公開されたプロトコルは、第一工程として、ＥＢの誘導を利用し、その後に、肝細胞を豊富にするための種々の成長因子を用いた接着培養が続くものであった（Ｌａｖｏｎ ｅｔ ａｌ． ２００４）。これらの研究では、非常に低い収率および純度の最終細胞集団しか報告されてこなかった。これまでに記述された、最も成功した分化プロトコルは、ｈＥＳＣの胚体内胚葉（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ；ＤＥ）分化の誘導から開始して、肝臓の器官発生をまねることを試みるものである（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ． ２００７）。基本的には、最大８０％ＤＥ細胞という収率のＤＥ分化にのためには、低下したインスリン／インスリン様成長因子（ＩＧＦ）シグナル伝達をもたらす低血清／インスリン条件での高濃度のアクチビンＡが適用される（Ｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ． ２００４）。この後に、ＦＧＦ、ＢＭＰ、ＨＧＦ、ＯｓＭ／ＤＥＸによる連続処理が続く。このアプローチでは、記述された肝細胞様細胞の収率は、約５０％であった。他のプロトコルとしては、ヒストン脱アセチル化酵素活性を阻害する酪酸ナトリウム（ＮａＢ）によるｈＥＳＣの処理が挙げられる（Ｄａｖｉｅ ２００３）。分化プロトコルの第一工程における、このエピジェネティックな分化剤の適用により、ｈＥＳＣから１０％肝細胞が得られ、また、最大７０％の純度の最終細胞集団が得られた（Ｒａｍｂｈａｔｌａ ｅｔ ａｌ． ２００３）。アクチビンＡによるＤＥ誘導とＮａＢ処理の組み合わせにより、最大７０％という肝細胞の収率が達成され、有望な結果が示された（Ｈａｙ ｅｔ ａｌ． ２００８）。
【００１７】
まとめると、こうした現在のアプローチにより導き出されるｈＥＳＣ由来肝細胞の収率、純度および成熟度は、未だに最適以下（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）のものであり、したがって、新たな方法が必要である。本発明は、例えばｈＢＳ細胞などのｈＰＳから、これら、または、分化が行われるバイオリアクターにおいてこれらから派生したＤＥ細胞、を播種することによって肝細胞を得るための方法を提供することにより、これらの課題に対処する。
【００１８】
ｈＰＳ由来肝細胞の用途
ｈＰＳ由来肝細胞の、将来の臨床上の用途は、例えば特定の遺伝的欠陥または急性もしくは慢性肝不全の場合などの肝機能不全を有する患者における、それらの、細胞移植への適用に見られる（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ． ２００９）。幹細胞由来肝細胞の移植は、いくつかの臨床的徴候においては、全臓器移植（ｗｈｏｌｅ−ｏｒｇａｎ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）に取って代わることができ得るものであり、また、―免疫適合性（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）細胞を用いる場合には―免疫抑制療法の必要性を不要にし得るものである。さらなる治療上の１つの選択肢は、移植まで、または、患者の器官の再生までの肝機能の橋渡しをするための、対外肝臓補助のための信頼性の高いヒト細胞源の提供に見られ、これは、対外肝臓装置のための細胞の入手可能性（ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）という既存の課題をも解決するであろう。さらに、対外システムは、また、細胞移植後、その適用した細胞が、十分な肝臓特異的な代謝パフォーマンスを示すまでの、肝機能の橋渡しをするための、興味深い治療上の１つの選択肢をも提供し得る。薬学研究における、可能性のある用途としては、創薬のために必要な新規肝臓アッセイの開発のための、ｈＰＳ細胞由来肝細胞の使用である。これにより、現存のｉｎ ｖｉｔｒｏツールによる乏しい予測力が克服される可能性があり、また、前臨床段階での、より信頼性が高く関連性のある試験を可能にし、かつ、弱いリード候補が臨床段階に入ってしまうのを妨げることとなるような、新たなヒト細胞ベースの試験システムがもたらされ得る（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ． ２００９）。
【００１９】
本発明は、調整培地の製造のための、バイオリアクターの使用にも関する。調整培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ；ＣＭ）の製造のための標準的な方法は、不活性ＭＥＦフィーダー細胞を高密度で播いた、標準的な培養容器内での、培養培地の、２４時間のインキュベーションである。単に、活性が緩まるまで、限られた時間の間、培地調整に用いることができるのみである、大量のフィーダー細胞を製造しなければならないため、この方法は、大きな労働力を要するものであり、かつ、スペースをとるものである。したがって、より大量のＣＭの製造は、この方法の、乏しいスケーラビリティ（ｓｃａｌａｂｉｌｉｔｙ）によって制限される。培養ｈＢＳ細胞のためのＣＭの使用に対する代替的アプローチは、明確になっている培養培地の使用である。ｈＥＳＣの、フィーダー非依存性培養に関し、いくつかの明確になっている培地調合物が記述されてきた（Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ２００５；Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ． ２００６）。明確になっている培地の使用には、ｈＢＳ細胞を、完全に動物由来物質がない条件下で培養することができる可能性、といったような、いくつかの利点がある一方で、これの主な欠点は、これらの培地調合物には、組換えサイトカインや成長因子といった、費用のかかるかなりの量の補助物質（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）が含まれる、ということである。
【００２０】
上記で概説されているように、本発明は、肝細胞様細胞を得るための方法であって、
ｉ） バイオリアクターにおけるｈＰＳ細胞または肝前駆細胞の播種
ｉｉ） 当該バイオリアクターを１種類以上の培養培地で１０日〜５０日の期間にわたり灌流して、肝細胞様細胞を得ること、
を含む方法に関する。
【００２１】
当該肝細胞様細胞は、肝細胞様細胞を含み、それ故、３Ｄ凝集体中に共にクラスター化したような、肝組織様３Ｄ構造の形をしていてもよい。当該ｈＰＳ細胞は、これらに限定されるものではないが、当該定義において記載されているような、ヒト胚性幹細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞であってもよい。当該肝細胞肝細胞前駆細胞は、胚体内胚葉（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ；ＤＥ）に似ているのではなくＤＥであってもよく、または、当該肝細胞前駆細胞は、胎児（胎仔）内胚葉または肝内胚葉（ｈｅｐａｔｉｃ ｅｎｄｏｄｅｒｍ）の特徴を有していてもよい。上記で言及したバイオリアクターは、中空繊維キャピラリーバイオリアクターであってもよく、所望により、膜区画を備えたものであってもよい。当該バイオリアクターは、２つ以上のキャピラリーシステムと１つ以上の中空繊維膜とを含んでいてもよい。さらに、当該バイオリアクターは、キャピラリーシステムを通っての培養培地の灌流のための手段と、当該キャピラリーシステム中のガス交換のための手段とを含んでいてもよく、所望により、増殖培地の灌流は、当該キャピラリーシステムを通って行なわれ、また、ガス交換は、中空繊維膜システム経由で行なわれる。当該キャピラリーシステムと１つ以上の中空繊維膜とは、１つのハウジング中へと組み込まれる独立した織り合わされた（ｉｎｔｅｒｗｏｗｅｎ）繊維キャピラリー膜システムを形成するよう構成されていてもよい。
【００２２】
当該ｈＰＳ細胞は工程ｉ）で播いてもよく、また、当該灌流は以下のスキームに従ったものであってもよいが、但し、工程２〜６のうちの少なくとも３つが含まれる：
【００２３】
【表１】
【００２４】
あるいは、これら工程１〜６のうちのすべてが含まれていてもよい。
【００２５】
本明細書において詳述されているように、当該培養培地ＤＭ‐Ａは、増殖培地を含んでいてもよく、かつ、次の成分うちの１つ以上を含んでいてもよい：アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、グルタマックス‐Ｉ。
【００２６】
本明細書において詳述されているように、培養培地ＤＭ‐Ｂは、例えばＲＰＭＩアドバンスト培地（ＲＰＭＩ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）等の増殖培地を含んでいてもよく、かつ、次の成分うちの１つ以上を含んでいてもよい：アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、グルタマックス‐Ｉ、ＦＣＳ。
【００２７】
本明細書において詳述されているように、培養培地ＤＭ‐Ｃは、例えばＲＰＭＩアドバンスト培地等の増殖培地を含んでいてもよく、かつ、次の成分うちの１つ以上を含んでいてもよい：ｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、グルタマックス‐Ｉ、ＦＣＳ。
【００２８】
本明細書において詳述されているように、培養培地ＤＭ‐Ｄは、例えばウィリアムズ培地Ｅ等などの肝培養培地を含み、かつ、次の成分うちの１つ以上を含む：ＢＳＡ、アスコルビン酸、グルタマックス‐Ｉ、Ｄ‐ガラクトース／Ｄ‐ソルビトール、ヒドロコルチゾン、インスリン、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ。
【００２９】
本明細書において詳述されているように、培養培地ＤＭ‐Ｅは、例えばウィリアムズ培地Ｅ等などの肝培養培地を含み、かつ、次の成分うちの１つ以上を含む：ＢＳＡ、アスコルビン酸、グルタマックス‐Ｉ、デキサメタゾン、Ｄ‐ガラクトース／Ｄ‐ソルビトール、ヒドロコルチゾン、インスリン、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、オンコスタチンＭ。
【００３０】
列記したこれらの培養培地はすべて、所望により、ｒｈｏキナーゼ阻害剤、例えばＢＩＯまたはＢＩＯのなんらかの変種など、を含んでいてもよい。
【００３１】
工程ｉ）の前に、バイオリアクターには、不活性化したフィーダー細胞を播種してもよい。かかるフィーダー細胞は、これらに限定されるものではないが、ｈＦＦまたはＭＥＦ細胞であってもよい。
【００３２】
さらに、バイオリアクターには、ｈＢＳ細胞およびフィーダー細胞またはＤＥ細胞およびフィーダー細胞、のいずれか関係する方を、工程ｉ）で共播種してもよい。
【００３３】
さらに、例えばＤＥ細胞などの肝前駆細胞は工程ｉ）で播いてもよく、また、以下表の工程１および２（太字で示した）は省略されてもよい。
【００３４】
【表２】
【００３５】
上記で概説されているように、本発明は、ｈＰＳ細胞、例えばｈＥＳＣ／ｈＢＳＣなど、の３Ｄ培養、および、特に、方向性のある肝分化に重点を置いた、ｈＰＳ細胞の成長および分化を支援する新規ｉｎ ｖｉｔｒｏシステムとしての多区画バイオリアクターシステムにおける前記細胞の培養に関する。結果が指し示しているのは、当該バイオリアクターの３Ｄ環境が、標準的な２Ｄ培養システムよりも、よりｉｎ ｖｉｖｏ様である環境を構成しており、それ故、これらのシステムに比べ、ｈＰＳ細胞の、改善された成長および分化を可能にする、ということである。
【００３６】
さらに、本発明は、細胞をバイオリアクターに播く前に、従来型の２Ｄ環境において細胞の最初の分化を行う方法に関する。興味深いことに、本発明の発明者らは、２Ｄ環境において、胚体内胚葉の方向に向かってｈＰＳの分化を開始させ、その後、それら最初に分化させた細胞をバイオリアクター中へと播くことにより、より純粋な培養がもたらされる、とのことを見出した。２Ｄ培養での胚体内胚葉への最初の分化後、それら細胞をバイオリアクターに播く。最初の２Ｄ分化ならびにその後のバイオリアクターにおける播種およびさらなる分化の例を、表２および表３〜５に提示する。
【００３７】
したがって、これら最初に分化させた細胞は、第３日目〜第２０日目、例えば第８日目〜第１２日目、例えば第１１日目または第１２日目、に当該バイオリアクターに播いてもよい。
【００３８】
上記の各局面に加え、肝細胞運命に向かうｈＰＳ細胞の分化は、アクチビンＡ、所望によりＲＨＯキナーゼ阻害剤および高成長因子レベルによりさらに刺激してもよい。細胞は、所定の時点で（表３に示されている実験については第１２日目、表４に示されている実験については第７日目または第１１日目に）バイオリアクター中へと播いて、さらなる分化および成熟が起こるようにしておいてもよい。
【００３９】
本明細書において述べられているように、本発明者らは、３Ｄバイオリアクターを適用することにより、ｈＰＳの肝分化が効率的に肝細胞運命の方向に向かう、とのことを見出した。ｈＰＳの、肝細胞運命に向かう、効率的な分化を促進するために適用可能な詳細なプロトコルを、以下に、および、特に、本明細書中の実施例において、詳細に記載する。本明細書において説明されているように、ｈＰＳ細胞の分化は、フィーダー細胞、例えばマウス胚性フィーダー細胞（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ；ＭＥＦ）またはヒト包皮繊維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｆｏｒｅｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＨＦＦ）など、を使用して、または、使用しないで、促進してもよい。さらに、増殖培地には、ｈＥＳＣ培養培地、ならびに、ＤＭ‐Ａ、ＤＭ‐Ｂ、ＤＭ‐Ｃ、ＤＭ‐ＤおよびＤＭ‐Ｅとして本明細書に記載の増殖培地のいずれかを含む、なんらかの適切な増殖培地が含まれていてもよい。したがって、本発明には、本明細書中に提示されている増殖培地および分化培地を変更または置き換えるために適用することが当業者によれば明確であるような、増殖培地組成に対するあらゆる変更（例えば増殖培地の成分の除去または追加）も包含される。同様に、例えば遅れた細胞成熟またはステージに特異的な成長因子の添加などに起因する、インキュベーション時間、流速または培養条件のあらゆる変更は、そうした微調整は本発明の自明な応用であると考えるべきものであるため、本発明の範囲内に含まれる。
【００４０】
最初の細胞播種の前に、所定の期間、例えば２４〜７２時間、にわたる、適切な増殖培地の再循環により、バイオリアクターを調整してもよい。分化の任意のステージにおいて、細胞を分化させるために使用されるあらゆる培地を含む、任意の適切な培地および流速を適用してもよい。あるいは、当該調整を最小限にすることにより、バイオリアクターに細胞をほぼ即時に播くことを可能にしてもよい。
【００４１】
バイオリアクターにおいて適用される流速は、例えば分化のステージ、播種規模、細胞の成熟、増殖培地の粘度等の、いくつかの要因に依存してもよい。ガス区画中の空気／ＣＯ２混合物の流速は、０．２ｍｌ／分〜１２０ｍｌ／分、例えば１０〜８０ｍｌ／分など、例えば３０ｍｌ／分など、であってもよい。
【００４２】
本発明によれば、細胞は、任意の適切な濃度または数でバイオリアクターに播いてもよい。非限定的な例として、１×１０６〜１０×１０８個の細胞、例えば２．５×１０７〜１０×１０７個の細胞など、をバイオリアクターに播いてもよい。
【００４３】
ｐＨ、酸素の分圧（ｐＯ２）および二酸化炭素の分圧（ｐＣＯ２）ならびに酸／塩基状態を定期的に測定してもよい。空気／ＣＯ２混合物は、特定のｐＨ値ならびにＯ２およびＣＯ２の分圧を維持するために変えてもよい。したがって、空気／ＣＯ２混合比は、５〜９の間の、例えば７．２または７．３などの安定したｐＨを維持するために調整してもよい。
【００４４】
当該バイオリアクターには、ｈＰＳをバイオリアクターに播く前に、フィーダー、例えばＭＥＦ細胞など、を播いてもよい。例えば、このフィーダー細胞は、例えばｈＰＳ細胞をバイオリアクターに播く５〜０日前、例えば１〜４日前など、例えばｈＰＳ細胞をバイオリアクターに播く２日前など、に播いてもよい。
【００４５】
ｈＰＳ細胞をバイオリアクターに播いた後、増殖培地は、決まった間隔を置いて変更してもよい。分化培地組成は、細胞分化スピードおよび細胞成熟に応じて、１〜１５日毎に変更してもよい。増殖培地組成、供給速度および増殖培地組成の変更間の間隔に関するインスピレーションについては、本明細書の表２を参照のこと。
【００４６】
バイオリアクターにおける分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｉｏｎ）の前、最中および後に、代謝パラメータをモニタリングしてもよい。これは、培地アウトフロー中および再循環培地中の可溶性因子を測定することにより行なわれてもよい。パラメータには、関連性がありかつ測定可能なあらゆるパラメータ、例えば以下を含む因子など、が包含されていてもよい：α‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、ベータ‐ヒト絨毛性ゴナドトロピン（β‐ｈＣＧ）、ｃ‐ペプチド、胎児性癌抗原（ＣＥＡ）、サイトケラチンフラグメント１９（Ｃｙｆｒａ２１‐１）、エリスロポエチン、エストラジオール、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、第ＩＩ‐Ｖ‐Ｘ‐ＸＩＩＩ因子、フィブリノーゲン、ガンマ‐グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、グルコース、乳酸塩、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、黄体形成ホルモン、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、重量オスモル濃度（ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ）、オステオカルシン、偽コリンエステラーゼ（ＰＣＨＥ）、プレアルブミンプロゲステロン、プロラクチン、Ｓ‐１００、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、トランスフェリン、グルタミン、グルタミン酸塩、グルコース、乳酸塩、アンモニウム、ｐＨ、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）、アクチビンＡ、インスリンおよびアルブミン、尿素、ガラクトースおよびソルビトール。これらの化合物を測定するための、任意の適用可能な方法を適用してもよい。各物質の産生または消費率は、その日の実際の廃棄体積に、供給培地中の物質濃度と廃棄培地中の物質濃度との間の差を掛けることにより、例えば１日毎に算出してもよい。
【００４７】
上記のパラメータまたは物質に加え、培養物の代謝活性を試験してもよい。例として、バイオリアクターの、フェナセチン、ジクロフェナクおよびミダゾラムを、第Ｉ相シトクロム（ＣＹＰ）Ｐ４５０酵素ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ３Ａ４経由で代謝する能力を試験してもよい。この試験は、例えば培養条件および増殖培地組成を分化の最中に調整するなどのために、分化の任意のステージで行なってもよい。しかしながら、細胞を、完全にまたは部分的に肝細胞運命の方向に向かわせるか、または、肝細胞または肝細胞様細胞に分化させる場合には、この、代謝活性の試験は、比較的後期の分化ステージで、最も関連性があってもよい。例として、当該試験は、分化の第３０日目〜第６０日目の間、例えば細胞の播種後の第４０日目および第４７日目など、に行なってもよい。
【００４８】
例として、以下のスキームに従って、ＣＹＰ Ｐ４５０活性試験を行ってもよい：
ＣＹＰ１Ａ２： フェナセチン −＞ アセトアミノフェン
ＣＹＰ２Ｃ９： ジクロフェナク −＞ ４’ＯＨ ジクロフェナク
ＣＹＰ３Ａ４： ミダゾラム −＞ １’ＯＨ ミダゾラム
【００４９】
試験物質を再循環培地中へと注入して、試験開始時に以下の濃度を得てもよい：０．５〜１０μＭ、例えば３μＭなど、のミダゾラム、１〜２５μＭ、例えば９μＭなど、のジクロフェナク、および、２〜６０μＭ、例えば２６μＭなど、のフェナセチン。次いで、バイオリアクターを再循環モードで２４時間作動させることができ得る。次いで、再循環からの試料を、実験開始前と、１、４、８および２４時間後とに採取し、試験物質の代謝産物について、例えば液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）などにより、分析することができ得る。
【００５０】
ＲＮＡの単離、ｃＤＮＡ合成、アレイハイブリダイゼーションおよびデータ解析は、当該分野において知られている任意の方法により行なうことができる。加えて、細胞および増殖培地の、組織化学的分析および免疫組織学的（ｉｍｍｕｎｉｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ）分析ならびに電子顕微鏡分析は、当業者の、入手可能なツールボックスの一部を形成する任意の機器および試薬を用いて行なってもよい。
【００５１】
上記で概説した詳細に従って、得られた細胞を、分化特異的マーカーに関して分析してもよい。一例を挙げれば、第０日目、播種日、およびバイオリアクターのシャットダウン日からなる測定時点で、４つの群のマーカーを測定してもよい（肝遺伝子、胎児（胎仔）／未成熟肝細胞に対するマーカー、未分化細胞に対するトランスポーターおよびマーカー）。比較目的のために、２Ｄ培養のみの後に得られた細胞を含む対照群が含まれて、適宜分析されてもよい。
【００５２】
本発明のさらなる一局面は、未分化ｈＰＳ細胞の培養のための調整培地の製造のための、バイオリアクターの使用に関する。
【００５３】
本発明の発明者らは、不活性ＨＦＦの存在は、それらＨＦＦがその活性を緩めるまで、ｈＥＳＣ分化の開始を遅らせる、とのことを観察した。この、ＨＦＦの、多能性を支援する活性は、そのアクチビンＡの産生と相互に関係している可能性がある。ＨＦＦフィーダー細胞の挙動をさらに調べるために、ＨＦＦのみを用いたいくつかの実験を、２Ｄ培養において、および、２つのバイオリアクターにおいて、行なった。
【００５４】
１つの実験においては、バイオリアクターには、活性ＨＦＦを播種するが、これは、ＨＦＦ増殖を刺激するべく血清およびｂＦＧＦを添加した培地で培養されることとなる。グルコース消費および乳酸塩産生のレベルにより、細胞数の増加をモニタリングする。十分な細胞数に達したときに、培養培地を、調整のためにｈＢＳ培地に変える。最適培地交換速度は、品質管理パラメータとして、例えば調整培地中のアクチビンＡおよびグルコースの濃度を測定して、決定されなければならない。低グルコースレベルは、培地供給速度を増加させることに対する要求を指し示している可能性があり、また、低アクチビンＡレベルは、ｈＥＳＣ多能性を促進するのに不適切な、不十分な調整に対するサインである可能性がある。
【００５５】
２Ｄおよび３Ｄ実験からの観察が示すのは、アクチビンＡ産生は、血清代替物（ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｒ）を含有する培地と組み合わせたｂＦＧＦにより刺激される、ということである。血清を添加した培地では、ｂＦＧＦは、アクチビンＡ産生を刺激しなかったが、活性ＨＦＦに対する強い分裂促進作用を呈した。この作用は、培地へのｂＦＧＦの添加に際してグルコースおよび乳酸塩の代謝のレベルを上昇させることを特徴とする、バイオリアクター実験ＨＦＦ‐１においても観察された。この分裂促進作用は、血清代替物（ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を添加した培地を使用した、バイオリアクター実験ＨＦＦ‐２においては観察されなかった。この実験では、グルコースおよび乳酸塩の代謝は、細胞が増殖していないことを示す、ある一定のレベルに留まった。
【００５６】
したがって、これらの所見は、当該バイオリアクター技術は、未分化ｈＰＳ細胞をフィーダーフリーで広げるために必要な、調整培地の製造に適用できる可能性がある、とのことを説明するものである。
【００５７】
ＣＭを製造するための、バイオリアクターにおけるＨＦＦの培養は、従来法に対する代替法となり得る。それにより、定められた速度の培地インおよびアウトフローならびに培養パラメータの自動制御を可能にするような、スケーラブルなシステムにおける、高い細胞密度のヒトフィーダー細胞が可能となるであろう。したがって、調整プロセスの標準化が可能となり、結果として、手動による方法に比べ、製造されたＣＭの、向上した品質がもたらされることとなる。活性フィーダー細胞が、多能性の維持も支援している、とのことが示されている（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ． ２００５）ことから、当該バイオリアクターを用いる場合の、１つのさらなる利点は、活性フィーダー細胞を用いることができる可能性であろう。これは、従来の２Ｄ培養では最初のバイオリアクター播種用に製造しなければならない、活性フィーダー細胞の数を減少させるであろう。
【００５８】
さらに、ｈＥＳＣ由来の分化した細胞を含有する当該バイオリアクターは、医学療法における対外装置として用いてもよく、また、例えば薬物代謝研究および奇形腫形成による多能性試験のような用途における動物試験に対する代替として用いてもよい。
【００５９】
あるいは、本発明は、基礎研究、薬理学的な薬物スクリーニングおよび細胞ベースの臨床適用に必要な、大量の、未分化の、または、分化したｈＢＳ細胞の製造のための、スケーラブルなシステムとして用いてもよい。しかしながら、これらの用途のためには、本明細書において開示されておりかつ特定の細胞型が非常に豊富な細胞調製物をもたらす方法のような方法が、重要な前提条件である。
【００６０】
したがって、本発明は、本明細書において開示されている方法により得られる肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造にも関する。
【００６１】
本発明の肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造は、上昇したレベルの１つ以上の肝マーカー遺伝子または肝トランスポーター遺伝子を発現していてもよい。
【００６２】
そのような（ｓｕｃｈｅ）肝マーカー遺伝子の例は、アルブミン、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ７Ａ１、ＴＡＴおよびＵＧＴ２Ｂ７を含むリストから選択されてもよく、また、１つ以上の肝マーカーの発現は、本明細書の図７中に、試料：バイオリアクター第２６日目、として列記されているような肝マーカー遺伝子の発現に典型的に似て（ｒｅｓｅｍｐｂｌｅ）いてもよい。図７は、本発明の、一般的発明概念の一部を形成する、とのことが本明細書により意図されている。
【００６３】
さらに、本発明の肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造は、上昇したレベルの肝トランスポーター遺伝子を発現していてもよい。これらの遺伝子は、ＡＢＣＣ２／ＭＲＰ２、ＦＡＢＰ１、ＯＡＴＰ２、ＯＣＴ‐１を含むリストから選択されてもよい。１つ以上の肝トランスポーター遺伝子の発現は、本明細書の図９中に、試料：バイオリアクター第２６日目、として列記されているような発現パターンに似ていてもよい。図９は、本発明の、一般的発明概念の一部を形成する、とのことが本明細書により意図されている。
【００６４】
本発明の一局面は、膜区画を備えたバイオリアクターにおける、ｉｎ ｖｉｔｒｏで導かれた（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｅｒｉｖｅｄ）肝細胞様細胞に関する。一局面では、これら細胞は、ｈＰＳ細胞または肝細胞前駆体から、肝細胞様細胞へ、当該バイオリアクター中で分化したものであってもよい。
【００６５】
上記で言及したバイオリアクターは、中空繊維キャピラリーバイオリアクターであってもよく、所望により、膜区画を備えたものであってもよい。当該バイオリアクターは、２つ以上のキャピラリーシステムと１つ以上の中空繊維膜とを含んでいてもよい。さらに、当該バイオリアクターは、キャピラリーシステムを通っての培養培地の灌流のための手段と、当該キャピラリーシステム中のガス交換のための手段とを含んでいてもよく、所望により、増殖培地の灌流は、当該キャピラリーシステムを通って行なわれ、また、ガス交換は、中空繊維膜システム経由で行なわれる。当該キャピラリーシステムと１つ以上の中空繊維膜とは、１つのハウジング中へと組み込まれる独立した織り合わされた（ｉｎｔｅｒｗｏｗｅｎ）繊維キャピラリー膜システムを形成するよう構成されていてもよい。
【００６６】
さらに、当該バイオリアクター肝細胞様細胞または当該バイオリアクターにおける肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造は、例えばＲＯＣＫ Ｒｈｏキナーゼの阻害剤などの細胞生存因子の存在下で成長していてもよい。
【００６７】
本発明は、調整培地を製造するための方法であって、
ａ） バイオリアクターにおけるフィーダー細胞の播種の工程
ｂ） 当該フィーダー細胞を成長させる工程
を含む方法にも関する。
【００６８】
上記で詳述されているように、上記で言及したバイオリアクターは、中空繊維キャピラリーバイオリアクターであってもよく、所望により、膜区画を備えたものであってもよい。当該バイオリアクターは、２つ以上のキャピラリーシステムと１つ以上の中空繊維膜とを含んでいてもよい。さらに、当該バイオリアクターは、キャピラリーシステムを通っての培養培地の灌流のための手段と、当該キャピラリーシステム中のガス交換のための手段とを含んでいてもよく、所望により、増殖培地の灌流は、当該キャピラリーシステムを通って行なわれ、また、ガス交換は、中空繊維膜システム経由で行なわれる。当該キャピラリーシステムと１つ以上の中空繊維膜とは、１つのハウジング中へと組み込まれる独立した織り合わされた（ｉｎｔｅｒｗｏｗｅｎ）繊維キャピラリー膜システムを形成するよう構成されていてもよい。
【００６９】
しかし、本発明のさらなる一局面は、本明細書における方法のいずれかにより得られる細胞の、治療目的での、または、創薬、医薬製剤、毒性試験における、または、再生医療における、使用に関する。
【００７０】
本明細書において開示されているように、本発明の発明者らは、当該３Ｄ灌流培養技術が、高度に制御された環境において高密度で幹細胞を広げるおよび分化させるための有望なツールに相当し、また、例えば特定の遺伝的欠陥または急性〜慢性肝不全の場合などの肝機能不全を有する患者における移植のための胚性または多能性幹細胞由来細胞調製物の製造におそらく使用することができるであろう、とのことを見出した。さらなる治療上の１つの選択肢は、ｈＥＳＣ由来肝臓細胞をヒト細胞源として用いることにより、移植まで、または、器官再生までの肝機能の橋渡しをすることを意図した、対外肝臓補助のための、当該バイオリアクター技術の適用に見られる。対外システムは、また、幹細胞移植後、その適用した細胞が、十分な機能的パフォーマンスを示すまでの、肝機能の橋渡しをするための、有用な治療上の１つの選択肢をも提供し得る。最終的には、当該バイオリアクターシステム中で広げ、維持した、幹細胞および幹細胞由来の分化した細胞は、内在性の再生プロセスをｉｎ ｖｉｖｏで刺激するような再生物質を製造するためにも使用することができる可能性がある。
【００７１】
したがって、本明細書に記載の方法により得られる当該細胞または３Ｄ細胞構造は、創薬、毒性試験、肝毒性試験に、または、薬物トランスポーター、薬物代謝酵素、肝形成、初期肝形成、肝細胞成熟もしくはヒト肝再生障害（ｈｅｐａｔｏｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の研究に、用いることができる。
【００７２】
さらに、当該バイオリアクターにおける成長の後に得られる、かつ、本明細書に記載の方法のいずれかに従った、細胞または細胞の３Ｄ構造は、医薬として適用してもよく、または、例えば肝臓組織の変性などの組織変性および／または原発性胆汁性肝硬変を含む自己免疫障害；脂質異常症を含む代謝障害；例えばアルコール乱用により引き起こされる肝臓障害；例えばＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、およびＡ型肝炎などの、ウィルスにより引き起こされる疾患；例えば医薬品に対する急性中毒反応により引き起こされる肝壊死；ならびに例えば肝細胞癌を患う患者における腫瘍除去、により引き起こされる病態および／または疾患の予防および／または治療のための組成物の製造のために適用してもよい。加えて、本明細書のこれら細胞または３Ｄ構造は、代謝病態および／もしくは疾患の治療および／もしくは予防のための組成物の製造のために、または、本明細書において開示されている方法のうちのいずれかに従ったバイオリアクターにおいて成長させた細胞を、化合物に暴露して、その化合物との接触により生じる、それらの細胞におけるなんらかの表現型の変化または代謝の変化を測定することを含む、肝細胞の機能を調節する能力に関して化合物をスクリーニングするための方法として、用いてもよい。
【００７３】
ｈＰＳ由来細胞の不十分な組織適合性の可能性、および、移植された細胞調製物中の未分化ｈＥＳＣの混入による内在する腫瘍形成の危険性に関する安全面、についても検討されている。したがって、これらの課題を解決し得る組織適合性多能性細胞を導き出すことを目的として、代替となる細胞源が調べられている。当該バイオリアクター技術は、現時点でゴールドスタンダードであるｈＥＳＣとの各候補細胞型の比較および特徴決定に適用できる可能性がある。
【００７４】
本発明の一部として、当該バイオリアクターにおける、ｈＰＳ細胞（ｈＰＳＣ）の、方向性のある肝分化、に関する２つのパイロット実験を最初に行ない、実現可能性を評価した。この２つのバイオリアクター実験（ＨｅｐＤｉｆｆ‐１およびＨｅｐＤｉｆｆ‐２）は、不活性化ＭＥＦの、当該バイオリアクターのうちの１つの中へのさらなる播種についてのみ異なるものであった。用いた分化プロトコルは、ＭＥＦ上で培養されるｈＰＳＣ用に開発されたものであった（表１および２、また、図３も参照のこと）。播種後、ｈＰＳＣを、これら実験の最初の４日間の間、血清代替物（ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を含有する標準培養培地（ＤＭ‐Ａ、表２参照）中で培養した。この最初の工程は、当該未分化細胞が、あらたな培養環境に適合し、ＨＦＦがその分化阻害活性を失うときであるものの自発的な分化の開始前に、分化を開始できるよう、選択した。この工程は、次の３つの所見に基づいて選択した：第一に、予備バイオリアクター実験において、ＬＤＨのピークにより示される細胞死の割合の増加が、細胞播種後に観察された。この増加した細胞死は、２Ｄ培養からの細胞採取のプロセス、播種プロセス自体、に起因するものであるか、および／または、それらの細胞が適合しなければならないバイオリアクターの変化した環境により誘導されたものである可能性がある。第二に、次の工程において適用された分化条件には、細胞に対する高い選択圧が含まれる。したがって、これらの条件を、細胞播種後すぐに適用することは、細胞にとってはもう１つのストレス要因であり、増加した細胞死をもたらし得るものである。第三に、方向性のある分化の開始前の４日という培養の長さは、先の実験のうちのいずれにおいても分化マーカーがこの期間内に検出されず、また、アクチビンＡ産生により測定されたＨＦＦ活性が一定に減少した、という所見に基づいて選択した。
【００７５】
追加の不活性ＭＥＦを播種したバイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐２は、フィーダーを含有しないＨｅｐＤｉｆｆ‐１に比べ、グルコースおよび乳酸塩の、よりずっと高い代謝を示した（図４）。これは、不活性化ＭＥＦの存在が、ｈＥＳＣにとって細胞保護的であり、播種後のよりよい細胞生存をもたらす、とのことを指し示している。これらバイオリアクターにおけるＡＦＰ産生およびＣＹＰ４５０活性を比較した場合に、フィーダーの非存在下における、より低い細胞生存も明らかになっている。これらのパラメータのレベルは、フィーダー細胞を含有するバイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐２に比べて、フィーダーを含有しないバイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐１では約８倍低かった（図５）。ＡＦＰの産生は、両バイオリアクターにおいて観察され、およそ実験第１７日目に開始された。これは、初期肝分化のサインであると解釈することができ、先行する細胞のＤＥ分化がうまくいったとのことが推定される。ＡＦＰは、胎児（胎仔）肝臓の主要な細胞型である肝芽細胞への、ＤＥ細胞の分化に対するマーカーであるが、原始内胚葉細胞への、未分化細胞の分化を指し示すこともある。ＣＹＰ１Ａ１／１Ａ２によるフェナセチンのかなりの代謝がこれらバイオリアクターにおいて検出された（図６ｂ）。ＣＹＰ１Ａ１は、胎児（胎仔）肝臓で妊娠第一期および第二期に発現し、肺および副腎組織のような他の胎児（胎仔）組織でも発現し、成体肝臓ではもう検出することはできなくなるが、一方、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ３Ａ４の発現は、胎児（胎仔）肝臓にはなく、成体肝臓では発現する（Ｈｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ． ２００２）。
【００７６】
上記で概説されているように、当該分化プロトコルの第一工程は、胚体内胚葉（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ；ＤＥ）の方向に向かうｈＰＳＣ分化の誘導である。このプロトコルでは、低血清条件における高アクチビンＡ濃度での処理により、ｈＰＳＣの、ＤＥ細胞への、高率の分化が達成される。適切な培養培地の例は、ＲＰＭＩアドバンスト培地に基づいたものであってもよい。当該培養培地には、０．５〜２％のグルタマックス‐Ｉ、１〜１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０〜２００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、または、１０〜２００μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、といった成分のうちの１つ以上が添加されていてもよい。あるいは、または、その後の使用のためには、もう１つの適切な培養培地は、ＲＰＭＩアドバンスト培地に基づいたものであって、かつ、０．５〜２％のグルタマックス‐Ｉ、０．１〜１％のＦＣＳ（熱非働化）、１〜１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０〜２００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、または、１０〜２００μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、といった成分のうちの１つ以上を含んでいてもよい。
【００７７】
肝臓細胞の方向に向かうさらなる細胞分化がうまくいくためには、この工程は極めて重要である。ＤＥ誘導後、次の２つの分化工程は、細胞の分化を、肝芽細胞表現型の方向に向かわせる。最終工程は、完全に分化した肝細胞への細胞成熟を支援するべきである。
【００７８】
適用した分化条件を評価するために、インスリンおよびアクチビンＡのレベルを分析した。この分析により、高レベルのインスリンの、高レベルのアクチビンＡとの、部分的重なりが明らかとなった（図６ａ）。この、観察された高レベルのインスリンは、培養培地（例えばＤＭ‐Ａ）に含まれる血清代替物（ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｒ）によってもたらされるものであり、ＥＲＢＢ２受容体シグナル伝達に加えインスリン様成長因子‐１受容体シグナル伝達の刺激によるｈＰＳＣ増殖および自己複製を支援し得る。ＤＥへの細胞運命決定（ｃｅｌｌ ｆａｔｅ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）には、低下したインスリン／インスリン様成長因子シグナル伝達と組み合わせたアクチビン／ｎｏｄａｌファミリーメンバーによるシグナル伝達が極めて重要である、とのことも示されてきた。これは、これらバイオリアクターにおける、同時発生の、高いインスリンレベルおよび高いアクチビンＡレベルという分化条件が、ＤＥの誘導には最適ではなかった、とのこと、ならびに、おそらく、これが、肝分化がないことに対する理由である可能性が高い、とのことを示している。したがって、同時に作動させた２つのバイオリアクター、ＢＲ２およびＢＲ３、を用いて、ｈＰＳＣ細胞の、ＤＥへの、および、ひいては、より成熟した肝表現型への、方向性のある分化を洗練されたものにするために、さらなる実験を行なった。このプロセスは、ｈＰＳＣを、ＤＥ運命の方向に向かって、まず、従来の２Ｄフラスコ中で、高レベルのアクチビンＡおよび他の成長因子を用いて、ある特定の時点でそれらをバイオリアクターの中に播種する前に、部分的に分化させることを含むものであった（実施例１９において詳述され、かつ、表４および５において概略的に示されているプロセス）。この、改良されたプロセスは、２Ｄ対照に比べ、第１２日目に当該バイオリアクター中へと播種し第２４日目に採取した細胞において、より高い発現レベルのいくつかの重要な肝マーカーを示し、；特に、５つのマーカー（アルブミン、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ７Ａ１およびＵＧＴ２Ｂ７）は、すべて、それらバイオリアクター培養試料において、有意に、より高い発現を示した（図７）。いくつかのトランスポーター遺伝子も、それらバイオリアクター培養細胞においてアップレギュレートされ（図９）、最も顕著であったのはＡＢＣＣ２／ＭＲＰ２およびＦＡＢＰ１であったが、これらの発現は肝細胞型に完全に限られたものではない、とのことには注目すべきである。重要なことに、未分化細胞に対する２つのマーカー、ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４、の発現は、当該最初の未分化の出発物質に比べ、バイオリアクター培養細胞において（および、２Ｄ対照において）検出不可能であった、とのことも分かった（図１０）。
【００７９】
これに続いて、１つよりも多いバイオリアクターにわたり結果に再現性があったとのことを確実にするべく、上述の実験を繰り返した。細胞は、上述のように培養し、２つのバイオリアクターのうちの１つ、ＢＲ１２１またはＢＲ１６８のいずれか、の中に、異なる２つの時点で（ＢＲ１２１については第７日目、または、ＢＲ１６８については第１２日目に）、播種した。細胞は、記載されている（実施例５）ように成熟させ、また、第２６日目に、実施例８〜１１に記載されているように処理する前に採取した。ＢＲ１６８からの結果が示しているのは、いくつかの肝マーカーは、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２およびＴＡＴを含め、２Ｄ対照に比べ、バイオリアクター成熟細胞において、有意にアップレギュレートされた、とのことである（図１１ＢおよびＤ）。重要なことに、ＢＲ１２１成長細胞も、ほぼ１００倍の増加が観察されたアルブミンおよびＣＹＰ３Ａ７を含め、２Ｄ対照に比べた場合に、肝マーカーのアップレギュレーションを示した（図１１ＡおよびＣ）。両バイオリアクターにおける細胞は、未分化細胞の２つのマーカー（Ｏｃｔ４およびＮＡＮＯＧ）の発現の、著しいダウンレギュレーションも示し（図１２）、細胞が分化していたこと、および、もはや多能性ではないこと、が確認された。
【００８０】
以下に含まれるのは、ｈＢＳ細胞の肝分化のための提案プロトコルである。出発物質および細胞アウトプットに応じて、工程を省略または反復してもよい。当業者は、当該個々の成分を、同じ機能を有する１つ以上と置き換えてもよいが、分化実験の基礎として部分的にまたは全体的に用いることもできる例えばＢＲ１２１およびＢＲ１６８においてなどの、後のバイオリアクターの作動において用いられる培地の詳細については表６も参照のこと。
【００８１】
当該分化プロトコルの際に使用される培養培地は、以下に列記されているような成分を含んでいてもよいが、当該増殖培地を種々のプロトコルに対して最適化するべく、成分を置き換えても、濃度を調整してもよい。
【００８２】
ｈＰＳ培養培地
ベース ノックアウトＤＭＥＭ
０．５〜２％ グルタマックス‐Ｉ
０．５〜２％ ＮＥＡＡ
１０〜５０％ ノックアウト血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｒ）
２０〜７５μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン
０．０５〜１ｍＭ β‐メルカプトエタノール
１〜２５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ
【００８３】
ＤＭ‐Ａ
ベース ＲＰＭＩアドバンスト培地
０．５〜２％ グルタマックス‐Ｉ
１〜１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ
１０〜２００ｎｇ／ｍｌ アクチビンＡ
１０〜２００μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン
【００８４】
ＤＭ‐Ｂ
ベース ＲＰＭＩアドバンスト培地
０．５〜２％ グルタマックス‐Ｉ
０．１〜１％ ＦＣＳ（熱非働化）
１〜１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ
１０〜２００ｎｇ／ｍｌ アクチビンＡ
１０〜２００μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン
【００８５】
ＤＭ‐Ｃ
ベース ＲＰＭＩアドバンスト培地
０．５〜２％ グルタマックス‐Ｉ
１０〜２５０ｎｇ／ｍｌ ａＦＧＦ
１〜５０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ
１０〜２００ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ２
５０〜５００ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４
０．０５〜１％ ＦＣＳ（熱非働化）
１０〜２００μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン
【００８６】
ＤＭ‐Ｄ
ベース ウィリアムズＥ（フェノールレッド不含）
１〜２×／５００ｍｌ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（登録商標）
０．５〜２％ グルタマックス
０．５〜５ｇ／ｌ Ｄ‐ガラクトース
０．５〜５ｇ／ｌ Ｄ‐ソルビトール
５〜５０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ
０．５〜５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ
１０〜２００μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン
【００８７】
ＤＭ‐Ｅ
ベース ウィリアムズＥ（フェノールレッド不含）
１〜２×／５００ｍｌ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（登録商標）
０．５〜２％ グルタマックス
０．５〜５ｇ／ｌ Ｄ‐ガラクトース
０．５〜５ｇ／ｌ Ｄ‐ソルビトール
１〜２５ｎｇ／ｍｌ オンコスタチンＭ
０．５〜１０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ
０．５〜１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ
０．０５〜２μＭ デキサメタゾン
１０〜２００μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン
０．１５〜５μＭ ｒｈｏキナーゼ阻害剤、例えばＢＩＯ
【００８８】
０．５〜１０日間、例えば２日間、にわたり細胞を培養してもよい、ＩＤＭ‐Ａ
ＲＰＭＩ １６４０（＋０．０１％〜５％ＰＥＳＴ、＋０．１〜１０％グルタマックス）
０．５〜２× Ｂ２７
１０〜２００ｎｇ／ｍｌ アクチビンＡ
０．１〜１０ｍＭ ＮａＢ
【００８９】
１〜１０日間、例えば５日間、にわたり細胞を培養してもよい、ＩＤＭ‐Ｂ
ＲＰＭＩ １６４０（＋０．０１％〜５％ＰＥＳＴ、＋０．１〜１０％グルタマックス）
０．５〜２× Ｂ２７
１０〜２００ｎｇ／ｍｌ アクチビンＡ
０．１〜８ｍＭ ＮａＢ
【００９０】
１〜１０日間、例えば３日間、にわたり細胞を培養してもよい、ＰＭ‐Ａ
ＲＰＭＩ Ａ（＋０．０１％〜５％ＰＥＳＴ、＋０．１〜１０％グルタマックス）
１０〜２００ｎｇ／ｍｌ ａＦＧＦ
０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ
５〜２５０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ２
２０〜５００ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４
０．０２〜５％ ＦＢＳ
【００９１】
１〜１０日間、例えば２日間、にわたり細胞を培養してもよい、ＶＨＭ‐Ａ
ＶｉｔｒｏＨＥＳ
０．１〜１０％ ＤＭＳＯ
【００９２】
１〜２０日間、例えば７日間、にわたり細胞を培養してもよい、ＶＨＭ‐Ｂ
ＶｉｔｒｏＨＥＳ
０．２〜２０％ ＤＭＳＯ
【００９３】
１〜３０日間、例えば２０日日間、にわたり細胞を培養してもよい、ＭＭ‐Ａ
ＷＭＥ＋ＳＱ（−ＧＡ１０００）（＋１％グルタマックス＋０．１％ＰＥＳＴ）
１〜１００ｎｇ／ｍｌ ＯｓＭ
０．０１〜１５μＭ ＤｅｘＭ
２〜５０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ
０．１〜３％ ＤＭＳＯ
０．１５〜５μＭ ｒｈｏキナーゼ阻害剤、例えばＢＩＯ
【００９４】
（ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（登録商標）は、独自（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）濃度の、ｈＥＧＦ、トランスフェリン、ヒドロコルチゾン、ＢＳＡ、アスコルビン酸、インスリンからなる）
【００９５】
略語
ＡＡ；アクチビンＡ
アルブミン（ＡＬＢ）
アルファ‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）
胚体内胚葉（Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ；ＤＥ）
ＦＢＳ；ウシ胎仔血清
ＦＧＦ２；繊維芽細胞成長因子２
繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）
フォークヘッドボックスＡ２（Ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ａ２；ＦＯＸＡ２）
肝細胞核因子４、アルファ（ＨＮＦ４Ａ）
ｈＰＳ；ヒト多能性幹細胞
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）
ＫＯ‐ＳＲ；ノックアウト血清代替物（ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）。
【００９６】
定義
本明細書で用いられているように、「ヒト多能性幹細胞」（ｈＰＳ）は、任意の源に由来していてもよい細胞であって、かつ、適切な条件下で、３胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）すべての派生物である種々の細胞型のヒト子孫を産生することができる細胞を指す。ｈＰＳ細胞は、８〜１２週齡のＳＣＩＤマウスにおいて奇形腫を形成する能力および／または組織培養において三胚葉すべての識別可能な細胞を形成する能力を有していてもよい。ヒト多能性幹細胞の定義には、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を含む様々な種類の胚細胞（例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｊ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９８）、Ｈｅｉｎｓ， Ｎ． ｅｔ．ａｌ． （２００４）を参照のこと）、ヒト胚盤胞由来幹（ｈｕｍａｎ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ；ｈＢＳ）細胞、ならびに、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）［例えば、Ｙｕ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， （２００７）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ． ｅｔ ａｌ． （２００７）を参照のこと］が包含される。本明細書に記載の種々の方法および他の実施形態は、種々の源に由来するｈＰＳ細胞を必要とするものであってもよく、または様々な源に由来するｈＰＳ細胞を利用するものであってもよい。例えば、使用に適したｈＰＳ細胞は、発生中の胚から得てもよい。加えて、または、あるいは、適したｈＰＳ細胞は、樹立細胞株および／またはヒト人工多能性幹（ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ；ｈｉＰＳ）細胞から得てもよい。
【００９７】
本明細書で用いられているように、「胚盤胞由来幹細胞」という語は、ＢＳ細胞と表され、ヒトでは「ｈＢＳ細胞」または「ｈＢＳＣ」と称される。文献中では、この細胞は、しばしば、胚性幹細胞、また、より具体的には、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ細胞またはｈＥＳＣ）と称される。よって、本発明において用いられる「多能性幹細胞」は、例えばＷＯ０３／０５５９９２およびＷＯ２００７／０４２２２５において記載されているような、胚盤胞から調製された胚性幹細胞であってもよく、または、市販のｈＢＳ細胞または細胞株であってもよい。
【００９８】
本明細書で用いられているように、「ｈｉＰＳ細胞」または「ｈｉＰＳＣ」は、ヒト人工多能性幹細胞を指す。
【００９９】
さらに、ｈＰＳ細胞の例は、例として、精巣から単離される、ヒト成人生殖系細胞が挙げられる（Ｃｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ． ２００８；Ｋｏｓｓａｃｋ ｅｔ ａｌ． ２００８；Ｇａｌｌｉｃａｎｏ ｅｔ ａｌ． ２００９）。これらの細胞は、次のような、ｈＥＳＣに類似した特徴を呈する：それらは、多能性マーカーＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＳＳＥＡ‐４、ＴＲＡ１‐８１、およびＴＲＡ１‐６０を発現するものであり、また、高いテロメラーゼ活性を示したものであり、また、正常な核型を維持したまま４０回以上（ｍｏｒｅ ｔｈｅｎ ４０）にわたり継代培養することが可能であり得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、それらを、三胚葉すべての、様々な種類の体細胞へと分化させることが可能であり、また、それらは、免疫不全マウス中に移植された場合に奇形腫を形成し得る。最近では、肝細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）因子の導入により、体細胞を、多能性細胞、いわゆる人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｉＰＳＣ）、へとリプログラミングすることができる、とのことも実証されている。まず、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＣ‐ＭＹＣのレトロウィルス媒介性導入を用いたマウス尾端からの繊維芽細胞における多分化能の誘導が示された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． ２００６）。さらなる報告により、４つの転写因子、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８、または、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＣ‐ＭＹＣ、の組み合わせ発現が、ヒト胎児包皮または成人ヒト皮膚繊維芽細胞を多能性細胞へとリプログラミングするのに十分であることが実証された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． ２００７）。これらのヒトｉＰＳＣは、その形態学的性質および遺伝子発現の性質により、ヒト胚性幹細胞に似ている。ｉＰＳＣは、正常な核型を有し、テロメラーゼ活性を発現し、ヒトＥＳ細胞を特徴づける細胞表面メーカー（ｍａｋｅｒ）および遺伝子を発現し、ならびに、免疫不全マウス中へと移植された場合の奇形腫形成を含む３種類の一次胚葉すべての進行した派生物へと分化する発生上の潜在能力を維持する。
【０１００】
本明細書で用いられているように、「胚体内胚葉（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ；ＤＥ）」および胚体内胚葉細胞（ＤＥ細胞）は、これらに限定されるものではないが、例えば、胚体内胚葉の細胞に典型的な、タンパク質もしくは遺伝子の発現、およびもしくは／もしくは、形態など、を呈する細胞、または、胚体内胚葉の細胞に似たかなりの数の細胞を含む組成物、を指す。
【０１０１】
本明細書で用いられているように、「肝前駆体」または「肝前駆細胞」は、これらに限定されるものではないが、マーカー、例えば、胚体内胚葉の細胞に典型的な、タンパク質もしくは遺伝子の発現、および／もしくは、形態など、を呈する細胞、または、肝前駆体の細胞に似たかなりの数の細胞を含む組成物を指す。
【０１０２】
本明細書で用いられているように、「肝細胞様細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ；ＨＣＬＣ）」は、少なくともいくつかの成熟肝マーカー、例えばアルブミン、ＣＹＰ３Ａ４、ＵＧＴ２Ｂ７、ＯＡＴＰ‐２、ＡＤＨ１Ａ、ＵＧＴ１Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９およびＣＹＰ２Ｄ６など、を発現している細胞型を意味するよう意図されたものである。
【０１０３】
本明細書で用いられているように、「組織様３Ｄ構造」という語は、多能性出発物質由来の、ｉｎ ｖｉｔｒｏで導かれた３Ｄ（３次元）構造を意味するよう意図されたものである。
【０１０４】
本明細書で用いられているように、「肝組織様３Ｄ構造」という語は、肝臓器様組織に似た、ｉｎ ｖｉｔｒｏで導かれた組織を意味するよう意図されたものである。
【０１０５】
本明細書で用いられているように、フィーダー細胞は、単独でまたは組み合わせて用いられる支持細胞型を意味するよう意図されたものである。さらに、この細胞型は、ヒト由来のものであってもよく、または、他の種由来のものであってもよい。当該フィーダー細胞が由来し得る組織としては、胚組織、胎児（胎仔）組織、新生児（新生仔）組織、幼若組織または成人（成体）組織が挙げられ、また、さらには、包皮を含む皮膚、臍帯、筋肉、肺、上皮、胎盤、卵管、腺、間質（ｓｔｒｏｍａ）または胸に由来する組織が挙げられる。当該フィーダー細胞は、ヒト繊維芽細胞、線維細胞、筋細胞、ケラチノサイト、内皮細胞および上皮細胞からなる群に属する細胞型由来であってもよい。フィーダー細胞を導き出すために用いることができる具体的な細胞型の例としては、胚繊維芽細胞、胚体外内胚葉細胞、胚体外中胚葉細胞、胎児（胎仔）繊維芽細胞および／または線維細胞、胎児（胎仔）筋肉細胞、胎児（胎仔）皮膚細胞、胎児（胎仔）肺細胞、胎児（胎仔）内皮細胞、胎児（胎仔）上皮細胞、臍帯間葉系細胞、胎盤繊維芽細胞および／または線維細胞、胎盤内皮細胞が挙げられる。
【０１０６】
本明細書で用いられているように、「ｍＥＦ細胞」または「ＭＥＦ細胞」という語は、マウス胚繊維芽細胞を意味するよう意図されたものである。
【０１０７】
本明細書で用いられているように、「ＣＹＰ」は、シトクロムＰ、および、より具体的には、例えばＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６／２Ａ７／２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７およびＣＹＰ７Ａ１などの、多種多様なアイソエンザイムを構成する肝臓の主要な第Ｉ相代謝酵素であるシトクロムＰ４５０、を意味するよう意図されたものである。
【０１０８】
本明細書で用いられているように、「ＲＯＣＫ阻害剤」という語は、例えばＹ‐２７６３２またはファスジルなどの、Ｒｈｏ‐キナーゼの小分子阻害剤を意味するよう意図されたものである。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】表１には、行なった実験Ｈｅｐｄｉｆｆ１およびＨｅｐｄｉｆｆ２ならびにそれらの実験条件を記載する。
【図２】表２は、バイオリアクターにおいてｈＥＳＣの肝分化を誘導するために用いる培地の順序および組成の概要を示す。
【図３】表３は、バイオリアクターＢＲ１における、ｈＥＳＣの、肝細胞への成熟を示す；Ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ ２ｍｌバイオリアクター、流速 ２ｍｌ／時間＝５０ｍｌ／日／ＢＲ＝１日当たり１００ｍｌ。細胞：ＳＡ１２１ ＤＥＦ、前駆体ステージ１２における播種。ピンク色の段階：ＤＥ（胚体内胚葉）の誘導、緑色の段階：前駆体ステージ（小さい肝細胞様細胞）、青色の段階：成熟
【図４】表４は、バイオリアクターＢＲ２およびＢＲ３における、ｈＥＳＣの、肝細胞への成熟を示す；Ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ ２ｍｌバイオリアクター、流速 ２ｍｌ／時間＝５０ｍｌ／日／ＢＲ＝１日当たり１００ｍｌ。細胞：ＳＡ１２１ ＤＥＦ、第７日目（ＤＥステージ）および前駆体ステージ（第１２日目）における播種。ピンク色の段階：ＤＥ（胚体内胚葉）の誘導、緑色の段階：前駆体ステージ（小さい肝細胞様細胞）、青色の段階：成熟
【図５】表５は、バイオリアクターＢＲ１２１およびＢＲ１６８における、ｈＥＳＣの、肝細胞への成熟を示す；Ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ ２ｍｌバイオリアクター、流速 ２ｍｌ／時間＝５０ｍｌ／日／ＢＲ＝１日当たり１００ｍｌ。細胞：ＳＡ１２１ ＤＥＦ、前駆体ステージ１２における播種。ピンク色の段階：ＤＥ（胚体内胚葉）の誘導、緑色の段階：前駆体ステージ（小さい肝細胞様細胞）、青色の段階：成熟
【図６】表６は、実施例１９で用いた培養培地およびインキュベーション時間の概略図を示す。
【図７】図１はバイオリアクター設計を示す。Ａ）培地灌流（青色、ＩＩ；赤色、ＩＶ）、酸素添加（黄色、ＩＩＩ）および細胞収容（Ｉ）のための、独立した区画を有する、最小キャピラリー膜ユニット；Ｂ）これらの区画を構成するキャピラリー膜の束；Ｃ）細胞区画内の、それらキャピラリー／区画の３Ｄ配列；これら区画は、Ｂに示されているように、別々に灌流することができ、これにより、キャピラリーユニット間の物質勾配の隔たりの減少に対処し、かつ、物質交換（ｍａｓｓ ｅｘｃｈａｎｇｅ）を亢進する。すべての膜区画は細胞区画内で互いに織り合わされ、それにより、平均して５００μｍのキャピラリー間距離を有する緊密なキャピラリーネットワークが形成される（Ｃ）。各区画のキャピラリーは、インおよびアウトフローヘッドへと束ねられ、それぞれ、灌流のためのチューブシステムへと接続される（Ｂ）。細胞は、開口端（ｏｐｅｎ ｅｎｄｉｎｇ）チューブを介して細胞区画中へ播種され、これにより、その注入された細胞の細胞区画内での分布が可能となる（Ｂ、ｄ；灰色で示されている）。
【図８】図２は灌流システムを示す。Ａ）培地の再循環および置換のための交換可能なマルチチャンネルフローヘッドおよびギアを備えたモジュラーポンプに対する圧力および流速の制御を備えたプロセッサ制御式灌流装置ならびに外部自動ＣＯ２制御式ｐＨ制御システム（左）。Ｂ）圧力、温度、ポンプスピード、ｐＨおよびガスフローを継続的に記録し、グラフでモニタリングする、カスタムモニタリングソフトウェア。Ｃ）バイオリアクターを培地およびガスで灌流するために用いたチューブシステムの模式図
【図９】図３は、３つの別々の培養ディッシュにおいて示される、分化したｈＥＳＣの２Ｄ培養物中のβ‐ＨＧＣ濃度を示す。培養ディッシュ１は、培養第３０日目時点で最も低い曲線により表され、培養ディッシュ２は、培養第３０日目時点で真ん中にある曲線で表され、培養ディッシュ３は、培養第３０日目時点で最も高い曲線で表されている。
【図１０】図４は、バイオリアクターｈＥＳＣ‐１、‐２および‐３の培地アウトフローにおいて測定した代謝パラメータの経時変化を示す。バイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐２（ａ）およびＨｅｐＤｉｆｆ‐１（ｂ）中の細胞による、グルコース消費（緑色、測定開始時点での最も低い曲線）、乳酸塩産生（赤色、測定開始時点で真ん中の曲線）およびＬＨＤ放出（青色、測定開始時点での最も高い曲線）。
【図１１】図５は、バイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐１および‐２の培地アウトフローにおいて測定した分化マーカーの経時変化を示す。バイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐１（ａ）およびＨｅｐＤｉｆｆ‐２（ｂ）中の細胞による、ＡＦＰ産生（濃青色、第５０日目時点で真ん中）、アルブミン産生（濃緑色、第５０日目時点での最も高い曲線）および尿素産生（ピンク色、第５０日目時点での最も低い曲線）。
【図１２】図６は、培地において測定したアクチビンＡおよびインスリンの濃度の経時変化ならびにバイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐１および‐２におけるシトクロム活性測定を示す。（ａ）アクチビンＡ濃度（ピンク色、点線および実線、第２０日目時点での最も高い曲線）、インスリン濃度（青緑色、第２０日目時点での最も低いもの）
【図１３】図７は、分化の最中に発現し、いくつかの時点（第０日目、第１２日目、バイオリアクター第２６日目、２Ｄ対照第２６日目）においてモニタリングされた肝マーカー遺伝子（アルブミン、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ７Ａ１、ＴＡＴおよびＵＧＴ２Ｂ７）のヒストグラムを示す。
【図１４】図８は、分化の最中に発現し、いくつかの時点（第０日目、第１２日目、バイオリアクター第２６日目、２Ｄ対照第２６日目）においてモニタリングされた胎児／未成熟肝細胞に対するマーカー（ＡＦＰ、ＣＹＰ３Ａ７）のヒストグラムを示す。
【図１５】図９は、分化の最中に発現し、いくつかの時点（第０日目、第１２日目、バイオリアクター第２６日目、２Ｄ対照第２６日目）においてモニタリングされた肝トランスポーター遺伝子（ＡＢＣＣ２／ＭＲＰ２、ＦＡＢＰ１、ＯＡＴＰ２、ＯＣＴ‐１）のヒストグラムを示す。
【図１６】図１０は、分化の最中に発現し、いくつかの時点（第０日目、第１２日目、バイオリアクター第２６日目、２Ｄ対照第２６日目）においてモニタリングされた、未分化細胞に対するマーカー遺伝子（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４）のヒストグラムを示す。
【図１７−１】図１１は、異なる時点において２つの異なるバイオリアクター（１２１または１６８）へと播種された細胞の肝遺伝子発現プロファイルを示す４つのヒストグラム（Ａ〜Ｄ）を示す。１に等しい値を有する参照試料は、２Ｄ培養により得た細胞の遺伝子発現を表す。
【図１７−２】図１１は、異なる時点において２つの異なるバイオリアクター（１２１または１６８）へと播種された細胞の肝遺伝子発現プロファイルを示す４つのヒストグラム（Ａ〜Ｄ）を示す。１に等しい値を有する参照試料は、２Ｄ培養により得た細胞の遺伝子発現を表す。
【図１８】図１２は、バイオリアクターＢＲ１２１およびＢＲ１６８における細胞の分化および成熟の最中の、未分化細胞のマーカー（Ｏｃｔ４およびＮＡＮＯＧ）のダウンレギュレーションを示すヒストグラムを示す。１に等しい値を有する参照試料は、２Ｄ培養により得た細胞の遺伝子発現を表す。
【発明を実施するための形態】
【０１１０】
実施例１
ヒト包皮繊維芽細胞（ＨＦＦ）の培養
ＨＦＦは、Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入し（ＣＲＬ‐２４２９；米国バージニア州マナッサス）、４４回以下の集団倍加の間、グルタマックス‐１（インビトロジェン社）、１０％ 子ウシ胎仔血清および１０，０００Ｕ／１０，０００μｇ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシン（すべてＢｉｏｃｈｒｏｍ社、ドイツ ベルリン）を含有するイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中に広げた。その細胞を、３０００ラドのガンマ線照射により不活性化し、１０ｎｇ／ｍｌ ヒト組換え塩基性繊維芽細胞成長因子（ｈｒｂＦＧＦ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃ社）を添加したＶｉｔｒｏＨＥＳ培地（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ ＡＢ社、スウェーデン イェーテボリ）中、または、２０％ ノックアウト血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｒ）、２ｍＭ グルタマックス‐Ｉ（すべてインビトロジェン社）、０，１ｍＭ 非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、５０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン（すべてＢｉｏｃｈｒｏｍ社）、０．１ｍＭ β‐メルカプトエタノール（シグマ社）、１０ｎｇ／ｍｌ ｈｒｂＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃ社、英国ロンドン）を含有するノックアウトＤＭＥＭ中、１ｃｍ２当たり３０，０００〜７０，０００個ＨＦＦの密度で、０．１％ ゼラチン（シグマアルドリッチ社）でコートした培養ディッシュ上に蒔いた。すぐに使用しない照射細胞は、分注して、１０％ ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（シグマアルドリッチ社）を含有する子ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社）中に凍結し、後で使用するために−１５２℃に保存した。
【０１１１】
実施例２
マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）の培養
ＭＥＦを、２回〜最大４回までの継代の間、１０％ 子ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ‐グルタミン、０．１ｍＭ ＮＥＡＡおよび１０，０００Ｕ／１０，０００μｇ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシン（すべてＢｉｏｃｈｒｏｍ社）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に広げた。３０００ラドのガンマ線照射により不活性化し、ＶｉｔｒｏＨＥＳ培地（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ社）中、６５，０００細胞／ｃｍ２の密度で、０．１％ ゼラチン（シグマアルドリッチ社）でコートした「体外受精（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」（ＩＶＦ）ディッシュ（ファルコン、ベクトン・ディッキンソン社）に播くか、または、分注して、１０％ ＤＭＳＯ（シグマアルドリッチ社）を含有する子ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社）中に凍結し、後で使用するために−１５２℃に保存した。
【０１１２】
実施例３
バイオリアクター
本研究に用いた多区画バイオリアクターは、１つの二液型ポリウレタンハウジング（ＰＵＲ、Ｍｏｒｔｏｎ社、ドイツ ブレーメン）中へと組み込まれる、３つの、独立しているが織り合わされている中空繊維キャピラリー膜システムで構成されている。培地灌流用の２つの親水性キャピラリーシステムは、およそＭＷ５００，０００の分子量カットオフを有する微多孔性ポリエーテルスルホンキャピラリー膜（ｍＰＥＳ、Ｍｅｍｂｒａｎａ社、ドイツ ヴッパータール）でできている。３つ目のものは、ガス交換を可能にするために、疎水性マルチラミネート中空繊維膜キャピラリー（ＭＨＦ、三菱、日本国東京）でできている。よって、キャピラリー外スペース内に位置する細胞は高物質交換率の分散培地供給と拡散による直接膜酸素添加とに暴露される。細胞の注入には、フローヘッドおよび開口端（ｏｐｅｎ ｅｎｄｉｎｇ）シリコーンゴムキャピラリー（Ｓｉｌａｓｔｉｃ、ダウコーニング社、米国ニューヨーク州）を用いる（図１Ａ、ＢおよびＣ）。バイオリアクターは、培地の再循環および置換のための交換可能なマルチチャンネルフローヘッドおよびギアを備えたモジュラーポンプに対する圧力および流速の制御を備えた、１つのプロセッサ制御式灌流装置中へと組み込まれる（図２ＡおよびＣ）。加熱ユニットにより、灌流回路内の一定温度がもたらされる。空気およびＣＯ２の流速は、いずれも、組み込まれたロータメーターを用いて手動で制御するか、または、外部自動ＣＯ２制御式ｐＨ制御システムを用いることにより制御した（図２）。当該制御装置は、バイオリアクター灌流回路中に組み込まれた光学ｐＨセンサー経由で、培養培地のｐＨ値を連続的に測定し、また、空気／ＣＯ２混合物を調整して、予め設定したｐＨを維持する。バブルトラップを備えた灌流チューブ（図２Ｃに示されている）は、標準的な医療グレードの透析ＰＶＣ（ビー・ブラウン社、ドイツ メルズンゲン）から作製された。滅菌は、エチレンオキシドまたはホルムアルデヒドガスを用いて行ない、その後、少なくとも７日間の脱気期間を設けた。この実験の間、灌流装置は、組み込まれたＵＳＢポートを介してＰＣに接続し、また、ＬａｂＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ドイツ ミュンヘン）で作成されたスタンドアロンの測定プログラムを用いて、灌流パラメータ（圧力、温度、ポンプスピード）を、継続的に記録し、グラフでモニタリングした。このプログラムは、インターネット経由での遠隔モニタリングを可能にするウェブサーバーも提供する（図２Ｃ）。
【０１１３】
実施例４
バイオリアクター調整
最初の細胞播種の前に、バイオリアクターは、培地の再循環による２４〜７２時間の調整段階を経た。細胞播種後、培養物を、２２〜３０ｍｌ／分の流速で灌流した。このバイオリアクターを３７℃で保った。ガス区画中の空気／ＣＯ２混合物の流速を４０ｍｌ／分で維持した。ｐＨ、酸素の分圧（ｐＯ２）および二酸化炭素の分圧（ｐＣＯ２）ならびに酸／塩基状態を定期的に測定した（ＡＢＬ５、Ｒａｄｉｏ Ｍｅｔｅｒ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク コペンハーゲン）。手動ガス制御の場合には、空気／ＣＯ２混合比を、７．２〜７．３の間の安定したｐＨを維持するために調整した。これら実験の全体を通じて生じた代謝および灌流のデータの、オンラインでの保存、アクセスおよび分析を可能にするために、データベースを開発した。
【０１１４】
実施例５
バイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐１およびＨｅｐＤｉｆｆ‐２におけるｈＥＳＣの肝分化
方向性のある肝分化について調べるために、２つの最初のバイオリアクター作動を行なった。一方の実験においては、ｈＥＳＣ播種の２日前に、バイオリアクターに不活性化ＭＥＦを播いたが、もう一方は、フィーダー細胞の添加をせずに行なった（表１および表２参照）。ｈＥＳＣの肝分化を誘導するために、バイオリアクターを、５種類の異なる培地（ＤｉｆｆＭｅｄ１〜５、表２）で、出願人が開発した分化プロトコルに基づいて、連続的に灌流した。培地の順序、組成および灌流回路への新鮮培地添加速度についての概要を表２に示す。
【０１１５】
実施例６
灌流培地における代謝パラメータ
これらバイオリアクターの内側の細胞の代謝活性および分化は、培地アウトフロー中および再循環培地中の可溶性因子を測定することにより、毎日、特徴決定を行なった。自動臨床化学分析装置（ロシュ・ダイアグノスティックス社、ドイツ ハイデルベルク）を用いて、以下のパラメータを測定した：α‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、ベータ‐ヒト絨毛性ゴナドトロピン（β‐ｈＣＧ）、ｃ‐ペプチド、胎児性癌抗原（ＣＥＡ）、サイトケラチンフラグメント１９（Ｃｙｆｒａ２１‐１）、エリスロポエチン、エストラジオール、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、第ＩＩ‐Ｖ‐Ｘ‐ＸＩＩＩ因子、フィブリノーゲン、ガンマ‐グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、グルコース、乳酸塩、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、黄体形成ホルモン、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、重量オスモル濃度（ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ）、オステオカルシン、偽コリンエステラーゼ（ＰＣＨＥ）、プレアルブミンプロゲステロン、プロラクチン、Ｓ‐１００、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、トランスフェリン（測定方法の詳細な説明については、添付文書中の表８を参照のこと）。加えて、グルタミン、グルタミン酸塩、グルコース、乳酸塩、アンモニウム、ｐＨ、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）を、ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ １００ Ｐｌｕｓ装置（ノバ・バイオメディカル社、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて測定した。アクチビンＡ、インスリンおよびアルブミンは、酵素結合免疫吸着測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）を用いて、メーカーの推奨に従って（アクチビンＡは、ドイツ ヴィースバーデン‐ノルデンシュタットの、Ｒ＆Ｄシステムズ社からの製品ＤＹ３３８、ＤＹ９９９、ＤＹ９９４、ＤＹ９９５を用いて、；インスリンは、インビトロジェン社からのＥＬＩＳＡを用いて、；アルブミンは、米国ペンシルベニア州フィラデルフィアのエクソセル社、ＡｌｂｕｗｅｌｌからのＥＬＩＳＡを用いて）、測定した。尿素は、比色定量キット（ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ、バイオアッセイシステムス社、米国カリフォルニア州ヘイワード）を用いて測定した。ガラクトースおよびソルビトールの濃度は、酵素アッセイ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）により測定した。
【０１１６】
各物質の産生または消費率は、その日の実際の廃棄体積に、供給培地中の物質濃度と廃棄培地中の物質濃度との間の差を掛けることにより、バイオリアクター毎に１日毎に算出した。
【０１１７】
実施例７
代謝活性
当該肝分化プロトコルで処理したバイオリアクター培養物を試験するか、または、その、フェナセチン、ジクロフェナクおよびミダゾラムを、それぞれ、第Ｉ相シトクロム（ＣＹＰ）Ｐ４５０酵素ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ３Ａ４経由で代謝する能力を試験した。細胞の播種後の第４０日目および第４７日目に、以下のスキームに従って、ＣＹＰ Ｐ４５０活性試験を行なった：
ＣＹＰ１Ａ２： フェナセチン −＞ アセトアミノフェン
ＣＹＰ２Ｃ９： ジクロフェナク −＞ ４’ＯＨ ジクロフェナク
ＣＹＰ３Ａ４： ミダゾラム −＞ １’ＯＨ ミダゾラム
【０１１８】
この目的のために、新鮮培地インフローおよび培地アウトフローを閉じ、また、試験物質のカクテルを再循環培地中へと注入して、試験開始時に以下の濃度を得た：３μＭのミダゾラム、９μＭのジクロフェナクおよび２６μＭのフェナセチン。次の２４時間の間、バイオリアクターを再循環モード（新鮮培地は添加されず、培地再循環ポンプのみが培地を再循環させる）で作動させた。再循環からの試料を、実験開始前と、１、４、８および２４時間後とに採取し、試験物質の代謝産物について、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）により分析した。分析は、スウェーデン イェーテボリのアストラゼネカ社にて行なわれた。最後の試料を採取した後に、当該バイオリアクターは、新鮮培地を用いてシングル・パス・モードで、バイオリアクターおよびチューブシステムの体積の２倍を用いて洗い流し、その後、新鮮培地インフローを伴うノーマル灌流モード再循環へと切り替えた）。
【０１１９】
実施例８
バイオリアクターからの試料取得
予定された培養期間の終わりに、バイオリアクターをシャットダウンし、チューブを外した。低い方のバイオリアクターのフタを開け、キャピラリー層を含む細胞塊の試料を、滅菌したメスおよびピンセットを用いてさらなる分析用に切り出した。組織学的分析のために、試料は、すぐに、後述のように固定し、包埋した。奇形腫試験、ＦＡＣＳおよびＲＮＡ分析のために、細胞を、キャピラリーから分離し、ＣａＭｇを含有しないＰＢＳでの洗浄、および、０．０５％〜０．０２％のトリプシン‐ＥＤＴＡ溶液（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社）中での３分間のインキュベーションによりバラバラにした。トリプシン処理（ｔｒｙｐｓｉｎａｔｉｏｎ）は、１０％子ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社）を含有するＤＭＥＭの添加により停止させた。細胞溶液からのキャピラリーの分離は、１００μｍセルストレーナー（ファルコン、ベクトン・ディッキンソン社、ハイデルベルク）を用いてふるい分けることにより達成した。
【０１２０】
実施例９
ＲＮＡの単離
バイオリアクター中で培養した細胞／組織からＲＮＡを単離するために、切り出したキャピラリーは、ＣａＭｇを含有しないＰＢＳで洗浄し、０．０５％〜０．０２のトリプシン‐ＥＤＴＡ溶液（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社）中で３分間インキュベートした。ＲＮｅａｓｙキット（キアゲン社、ドイツ ヒルデン）を用いてメーカーのプロトコルに従い、全ＲＮＡを単離した。奇形腫は、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩを用い、その後、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒでホモジナイゼーションを行なうことにより、粉砕した（いずれもキアゲン社）。個々の細胞は、細胞ペレットへの溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）の直接の添加により溶解させた。この単離したＲＮＡの濃度および品質は、ナノドロップ分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、かつ、バイオアナライザ（アジレント２１００バイオアナライザ）で、または、未変性（ｎａｔｉｖｅ）アガロースゲル電気泳動により、決定した。
【０１２１】
実施例１０
アレイハイブリダイゼーション
ビオチン標識ｃＲＮＡは、投入（ｉｎｐｕｔ）として３００ｎｇの品質チェック済み全ＲＮＡを用い、イルミナ（登録商標）ＴｏｔａｌＰｒｅｐ ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社、米国テキサス州オースティン）を用いて作成した。チップハイブリダイゼーション、洗浄、Ｃｙ３‐ストレプトアビジン（アマシャム バイオサイエンス社）染色、およびスキャニングは、Ｂｅａｄ Ｓｔａｔｉｏｎ ５００（イルミナ社、サンディエゴ、米国）プラットホーム上で、メーカーにより供給されたプロトコルに従い、試薬を用いて行なった。ｃＲＮＡ試料は、およそ２４，０００種類のＲｅｆＳｅｑ転写産物を搭載したイルミナ ヒト‐８ｖ２ ＢｅａｄＣｈｉｐ上にハイブリダイズさせた（Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ． ２００４）。
【０１２２】
実施例１１
データ解析
すべての試料に対する、分位（ｑｕａｎｔｉｌ）正規化および非正規化ＲＡＷデータファイルは、ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏ Ｖ３ソフトウェア（イルミナ社）を用いて作成した。ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏソフトウェアで作成したデータを、マイクロアレイデータ解析ツールＭｕｌｔｉＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｖｉｅｗｅｒ（ＭｅＶ）、マイクロアレイ分析ツールのＴＭ４スイート（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｍ４．ｏｒｇ）の一コンポーネント（Ｓａｅｅｄ ｅｔ ａｌ． ２００３）、または、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． ２００４）をその分析バックエンド（ａｎａｌｙｓｉｓ ｂａｃｋｅｎｄ）として用いるグラフィカル・インターフェースであるＣｈｉｐｓｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｃｈｉｐｓｔｅｒ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）、へとインポートすることにより、さらなるデータ解析を行なった。機能エンリッチメント解析（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）は、ＤＡＶＩＤ（ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ）を用いて行なった（Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ． ２００３）。
【０１２３】
実施例１２
組織化学
パラフィン包埋試料を、４％緩衝ホルムアルデヒド溶液中で固定し、パラフィン中に包埋し、切って、５μｍの切片にした。切片を、キシレンで脱パラフィンし、段階的に減少するアルコール（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ａｌｃｏｈｏｌ ｓｅｒｉｅｓ）を用いて再水和させ、その後、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行なった。
【０１２４】
実施例１３
免疫組織学
パラフィン包埋試料を、４％緩衝ホルムアルデヒド溶液中で固定し、パラフィン中に包埋し、切って、５μｍの切片にした。切片を、キシレンで脱パラフィンし、段階的に減少するアルコール（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ａｌｃｏｈｏｌ ｓｅｒｉｅｓ）を用いて再水和させた。抗原は、切片を圧力釜にてクエン酸緩衝液（０．０１ クエン酸一水和物、ｐＨは６．０まで；メルク社、ドイツ ダルムシュタット）中で２５分間ボイルすることにより、賦活化（ｒｅｔｒｉｅｖｅ）し、その後、５％トリトン／ＰＢＳ中で２０分間のインキュベーションを行なった。切片を５％スキムミルクでブロッキングし、；それらを一次抗体と共に３０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、二次蛍光結合抗体と共にインキュベートした。以下の一次抗体を用いた：モノクローナルマウス抗ヒト平滑筋アクチンＩｇＧ２ａ（ＡＳＭＡ）、モノクローナルマウス抗ヒトデスミンＩｇＧ１（Ｄａｋｏ社、デンマーク グロストルプ）、モノクローナルマウス抗ニューロン特異的β‐ＩＩＩ‐チューブリンＩｇＧ２ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ社）、モノクローナルマウス抗ネスチンＩｇＧ１（ベクトン・ディッキンソン社）、ポリクローナルヤギ抗ＨＮＦ‐３βＩｇＧ、モノクローナルマウス抗ＯＣＴ‐４ ＩｇＧ２ｂおよびポリクローナルウサギ抗ビメンチンＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）。二次抗体としては、以下のポリクローナル抗体を用いた：ヤギ抗マウスＩｇＧ‐Ｃｙ２、ヤギ抗ウサギＩｇＧ‐Ｃｙ３（Ｄｉａｎｏｖａ社）、ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ‐ＴＲＩＣＴ、ヤギ抗マウスＩｇＧ‐ＦＩＴＣ、ヤギ抗マウスＩｇＧ‐ＦＩＴＣ、ヤギ抗マウスＩｇＧ‐Ｃｙ３、ヤギ抗マウスＩｇＧ‐ＦＩＴＣ（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社、ペンシルベニア州ウェストグローブ）およびロバ抗ヤギＩｇＧ‐Ｃｙ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）。核の非特異的染色のために、切片を、４’，６‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドール（ＤＡＰＩ、モレキュラープローブ社、ドイツ ライデン）と共にインキュベートした。
【０１２５】
続いて、それら切片を、Ａｑｕａ Ｐｏｌｙｍｏｕｎｔ溶液（ポリサイエンス社、米国ペンシルベニア州ウォリントン）を用いてマウントした。切片は、ＣＣＤカメラ（Ｒｅｔｉｇａ ２０００Ｒ、ＱＩｍａｇｉｎｇ社、カナダ バーナビー）を備えた倒立顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ、カールツァイス社、ドイツ ゲッティンゲン）を用いて分析した。写真を取得し、デジタルイメージングソフトウェア「Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ」（メディアサイバネティクス社、米国シルバースプリング）を用いて処理した。
【０１２６】
実施例１４
透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）
バイオリアクター細胞区画由来の物質を５％グルタルアルデヒド（Ｓｅｒｖａ社、ドイツ ハイデルベルク）で固定した。６０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液、ｐＨ７．３中での３０分間の浸漬後、細胞の凝集体を、２時間にわたり、２％ ＯｓＯ４（Ｐａｅｓｅｌ＋Ｌｏｒｅｉ社、ドイツ フランクフルト）中で後固定し、エタノール中で段階的に脱水し、次いで、アラルダイト（Ｓｅｒｖａ社、ドイツ ハイデルベルク）中に包埋した。超薄切片は、電子顕微鏡検査前に、酢酸ウラニルおよびレイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄ’ｓ）クエン酸鉛（Ｃｈｒｏｍａ社、ドイツ ミュンスター）を用いてコントラストをつけた。
【０１２７】
実施例１５
バイオリアクターにおけるｈＥＳＣの、改善された肝分化
実施例５に記載した最初の肝分化作動からの結果に基づき、さらなる作動を行なって、方向性のある肝分化についてさらに調べた。
【０１２８】
１つの実験においては、フィーダーフリーで培養したｈＥＳＣは、本明細書に記載の分化プロトコルに従って、バイオリアクターの外側で、２Ｄ培養で、ＤＥへと分化させた。この、肝細胞の方向に向かうＤＥへの第一分化工程により、大量の細胞死が誘導される。この工程をバイオリアクターの外側で行なうことにより、当該リアクター中の過半の細胞残屑は回避される。加えて、当該第一分化工程を２Ｄで行なうことにより、胚体内胚葉細胞の、より純粋な選択が可能となり、これは、当該培養物中にかなりの量の胚体内胚葉細胞を伴う、全体的な、より純粋な培養につながる。
【０１２９】
ＤＥへの分化後、細胞を、バイオリアクターに移すか、または、対照として２Ｄ中にとどめた。胚体内胚葉細胞のさらなる肝分化を誘導するために、バイオリアクターを、種々の培地で、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ社が開発した分化プロトコルに基づいて、連続的に灌流した。培地の順序、組成および灌流回路への新鮮培地添加速度の一例についての概要を表２に示す。
【０１３０】
実施例１６
未分化ｈＥＳＣの培養のための、当該バイオリアクターシステムを用いた、調整培地の製造
本明細書において検討したようなバイオリアクター実験は、不活性ＨＦＦの存在は、それらＨＦＦがその活性を緩めるまで、ｈＥＳＣ分化の開始を遅らせる、とのことも示す。この、ＨＦＦの、多能性を支援する活性は、そのアクチビンＡの産生と相互に関係している可能性がある。ＨＦＦフィーダー細胞の挙動をさらに調べるために、ＨＦＦのみを用いたいくつかの実験を、２Ｄ培養において、および、２つのバイオリアクターにおいて、行なった。
【０１３１】
１つの実験においては、バイオリアクターには、活性ＨＦＦを播種するが、これは、ＨＦＦ増殖を刺激するべく血清およびｂＦＧＦを添加した培地で培養されることとなる。グルコース消費および乳酸塩産生のレベルにより、細胞数の増加をモニタリングする。十分な細胞数に達したときに、培養培地を、調整のためにｈＢＳ培地に変える。最適培地交換速度は、品質管理パラメータとして、例えば調整培地中のアクチビンＡおよびグルコースの濃度を測定して、決定されなければならない。低グルコースレベルは、培地供給速度を増加させることに対する要求を指し示している可能性があり、また、低アクチビンＡレベルは、ｈＥＳＣ多能性を促進するのに不適切な、不十分な調整に対するサインである可能性がある。
【０１３２】
２Ｄおよび３Ｄ実験からの結果が示すのは、アクチビンＡ産生は、血清代替物（ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｒ）を含有する培地と組み合わせたｂＦＧＦにより刺激される、ということである。血清を添加した培地では、ｂＦＧＦは、アクチビンＡ産生を刺激しなかったが、活性ＨＦＦに対する強い分裂促進作用を呈した。この作用は、培地へのｂＦＧＦの添加に際してグルコースおよび乳酸塩の代謝のレベルを上昇させることを特徴とする、バイオリアクター実験ＨＦＦ‐１においても観察された。この分裂促進作用は、血清代替物（ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を添加した培地を使用した、バイオリアクター実験ＨＦＦ‐２においては観察されなかった。この実験では、グルコースおよび乳酸塩の代謝は、細胞が増殖していないことを示す、ある一定のレベルに留まった。これらの結果は、当該バイオリアクター技術の、可能性のある用途は、未分化ｈＥＳＣをフィーダーフリーで広げるために必要な、調整培地の製造である可能性がある、とのことを示している。
【０１３３】
調整培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ；ＣＭ）の製造のための標準的な方法は、不活性ＭＥＦフィーダー細胞を高密度で播いた、標準的な培養容器内での、培養培地の、２４時間のインキュベーションである。単に、活性が緩まるまで、限られた時間の間、培地調整に用いることができるのみである、大量のフィーダー細胞を製造しなければならないため、この方法は、大きな労働力を要するものであり、かつ、スペースをとるものである。したがって、より大量のＣＭの製造は、この方法の、乏しいスケーラビリティ（ｓｃａｌａｂｉｌｉｔｙ）によって制限される。培養ｈＢＳ細胞のためのＣＭの使用に対する代替的アプローチは、明確になっている培養培地の使用である。ｈＥＳＣの、フィーダー非依存性培養に関し、いくつかの明確になっている培地調合物が記述されてきた（Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ２００５；Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ． ２００６）。明確になっている培地の使用には、ｈＢＳ細胞を、完全に動物由来物質がない条件下で培養することができる可能性、といったような、いくつかの利点がある一方で、これの主な欠点は、これらの培地調合物には、組換えサイトカインや成長因子といった、費用のかかるかなりの量の補助物質（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）が含まれる、ということである。
【０１３４】
ＣＭを製造するための、バイオリアクターにおけるＨＦＦの培養は、背景の章において上記で概説した、現在利用可能な方法（ｍｅｔｏｄ）に対する代替法となり得る。それにより、定められた速度の培地インおよびアウトフロー並びに培養パラメータの自動制御を可能にするような、スケーラブルなシステムにおける、高い細胞密度のヒトフィーダー細胞が可能となるであろう。したがって、調整プロセスの標準化が可能となり、結果として、手動による方法に比べ、製造されたＣＭの、向上した品質がもたらされることとなる。活性フィーダー細胞が、多能性の維持も支援している、とのことが示されている（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ． ２００５）ことから、当該バイオリアクターを用いる場合の、１つのさらなる利点は、活性フィーダー細胞を用いることができる可能性であり得る。これは、従来の２Ｄ培養では最初のバイオリアクター播種用に製造しなければならない、活性フィーダー細胞の数を減少させるであろう。
【０１３５】
実施例１７ 肝成熟の評価
誘導された肝細胞の成熟度は、遺伝子発現、タンパク質発現、の測定、および、同様に、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）活性の活性測定、により、分析した。
【０１３６】
Ｑ‐ＰＣＲおよびＬＤＡカードによる肝細胞様細胞の遺伝子発現解析
これらバイオリアクターにおいて分化した肝細胞様細胞、および、適切な対照（２Ｄ分化肝細胞様細胞、または、成人ヒト肝臓由来の初代肝細胞のいずれか）、の試料を、肝臓関連遺伝子の発現について、ＱＰＣＲにより分析した。
【０１３７】
ＤＥ‐Ｈｅｐ細胞の遺伝子発現は、ＬＤＡマイクロ流体（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｔｙ）カード上で以下表に列記されているように特徴決定した。試料の全ＲＮＡに由来するｃＤＮＡはＬＤＡカードとハイブリダイズさせ、当該実験はＰＣＲセットアップにおいて行ない、適切なソフトウェアを用いてさらに分析した。すべての試料は、インストラクターのマニュアル（アプライドバイオシステムズ ７９００ＨＴ Ｍｉｃｒｏ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｃａｒｄ Ｇｅｔｔｉｎｇ Ｓｔａｒｔｅｄ Ｇｕｉｄｅ）と、以下の短くしたプロトコルとに従い、ＬＤＡカード上で、繰り返し実験において、適切な対照と同時に作動させた：
【０１３８】
ｃＤＮＡは、全ＲＮＡから調製し、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー水中に希釈して、適切な濃度（以下参照）を得た。以下の成分を混合した：ｃＤＮＡ（１〜１００ｎｇ）、５μｌ、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー水、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ、４５μｌ、マスターミックス（２×）、５０μｌ、合計：１００μｌ。その後、試料は、ＬＤＡカード上にロード（各試料混合物は１００ｕｌであり、１試料当たり１７０ｎｇのｃＤＮＡ）し、遠心し、その後、そのＬＤＡカードを密封した。最終的には、カードを、ＡＢＩ ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステム上でマニュアル中の指示に従って作動させ、結果は、ＳＤＳ２．２．１ソフトウェアおよび相対的定量方法を用いることにより分析した。
【０１３９】
実施例１８
肝分化
２Ｄ標準培養ディッシュ中で培養されるｈＥＳＣ用にＣｅｌｌａｒｔｉｓ社が確立した肝分化プロトコルに基づき、当該３Ｄバイオリアクターシステムにおける、ｈＥＳＣの、方向性のある肝分化に関する２つのパイロット実験を設計し、実施した。この２つのバイオリアクター実験は、不活性化ＭＥＦの、バイオリアクターのうちの１つの中へのさらなる播種についてのみ異なるものであった。
【０１４０】
灌流培地における代謝パラメータ
当該培地において測定された代謝パラメータに関する２つのバイオリアクターの比較が示すのは、追加のフィーダー細胞が播種されるバイオリアクター（ＨｅｐＤｉｆｆ‐２）は、グルコースおよび乳酸塩の代謝の観点から、および、分化マーカーの産生に関して、よりずっと高い細胞活性を最初に有していた、ということである。しかしながら、バイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐２では、当該実験中のグルコース消費および乳酸塩産生の、安定した減少が観察された（図４）。第２０日目にあるＬＤＨのピークは、おそらく、灌流システムの加熱ユニットの技術的な機能不良に起因するものであった。第４０日目以降のＬＤＨ放出ピークは、おそらく、当該バイオリアクター中の圧力上昇に関係するものであった。キャピラリー膜の凝固を引き起こし得る未同定培地成分の沈殿が観察されたため、これは、結果として、栄養素と共に、最適以下の（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）細胞供給をもたらしていたかもしれなかった。このバイオリアクター中のＡＦＰ産生は、第１７日目と第２４日目との間で指数関数的に増加し、その後、実験の終了まで減少した。ＡＦＰ産生のダウンレギュレーションの始まりは、別の分化培地へと変えることと相関する。肝分化マーカーである尿素は、その産生において、第１日目と第２０日目との間で小さなピークを示し、また、アルブミン産生は、実験の間中ずっと、約０．４μｇ／時間という比較的低いレベルにとどまった（図５）。
【０１４１】
追加のＭＥＦの播種がされないバイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐１では、非常に低いが、安定したグルコース消費および乳酸塩産生レベルが測定された。分化因子ＡＦＰのみが、第１７日目と第３５日目との間に、第２６日目に最大値を有する小さなピークを示したが、これは、バイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐２におけるＡＦＰの大きさには似ていないが、経時変化には似ている（図５）。
【０１４２】
上述の因子に加え、アクチビンＡおよびインスリンの濃度を、当該培養培地において測定して、その用いた灌流条件を、その結果として生じた分化培地の交換動態に関して評価した（図６）。両因子とも、未分化ｈＥＳＣにおける、胚体内胚葉の方向に向かう分化の誘導において重要な役割を果たすが、インスリンは、高アクチビンＡ濃度を通じての内胚葉誘導に拮抗する。両バイオリアクターにおいて、当該培地中のアクチビンＡ濃度は、第７日目と第８日目との間に、２６ｎｇ／ｍｌという最大値を有する。第０日目〜第２２日目にバイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐２においてのみ測定したインスリン濃度は、第３日目に１５０ｎｇ／ｍｌという最大値を示し、第９日目までに２ｎｇ／ｍｌへと急速に減少し、約３５ｎｇ／ｍｌという中間濃度は第７日目と第８日目との間であった。
【０１４３】
ＣＹＰ４５０活性
これらバイオリアクターにおける肝細胞特異的な細胞活性について試験するべく、フェナセチン、ジクロフェナクおよびミダゾラムを、それぞれ、第Ｉ相シトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ１Ａ２／１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ３Ａ４経由で代謝する能力を試験した。
【０１４４】
これらの試験は、ｈＥＳＣ播種後の第４０日目および第４７日目に行なった。両バイオリアクターにおいて、ジクロフェナクおよびミダゾラムの代謝を検出することはできなかった。フェナセチンの、パラセタモールへの代謝は、バイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐２では、リアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐１に比べて、より高く、また、第４７日目にほんのわずかだけ低下した。
【０１４５】
組織学
上記で述べられているように、両バイオリアクターとも、実験の終了時に、非常に低い代謝活性を呈した。この所見は、組織学的分析の際、バイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐２では、組織構造を含有する領域は非常にわずかしか見い出せず、また、バイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐１の試料においては構造は全く見いだせなかった、という事実と相関していた。バイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐２において観察された組織クラスターでは、はっきりした内胚葉分化を指し示す、様々な上皮形態を有するたくさんの構造を観察することができた。加えて、疎性結合組織を有する領域、および、核に対する細胞質の割合が低い細胞で構成される少数の細胞凝集体、が見い出された。
【０１４６】
実施例１９
ｈＥＳＣの肝細胞への分化およびバイオリアクターにおける成熟
同時に作動させたバイオリアクターの第一巡目：ＢＲ２およびＢＲ３
実施例１８において詳述したプロトコルに加え、いくつかのさらなる実験を作動させて、バイオリアクター環境における、ｈＥＳＣの、肝細胞への、方向性のある分化のための手順を、これらの細胞型の成熟の改善にも焦点を当てながら、洗練されたものにした。これらの実験は表３および４（バイオリアクターＢＲ２およびＢＲ３）において詳述されており、そこでは、アクチビンＡおよび高成長因子レベルを用いてｈＥＳＣの、ＤＥ細胞への分化を開始させ、所定の時点で（表３に示されている実験については第１２日目、表４に示されている実験については第７日目または第１１日目に）細胞をバイオリアクター中へと播種し、さらなる分化および成熟が起こるようにしておくための全体的な手順が記載されている。この手順は２Ｄ非バイオリアクター制御と同時に作動させ、また、両方の実験について、ＣＹＰ４５０のレベルを、第２５日目または第２６日目のバイオリアクターシャットダウンの前の複数の特定の時点において測定した。
【０１４７】
最初の実験の作動中に、バイオリアクター環境中で成長している細胞については、第０日目、播種日、およびバイオリアクターのシャットダウン日からなる測定時点で、また、２Ｄ対照群については、同時のシャットダウン日測定で、４つの群のマーカー（肝遺伝子、胎児／未成熟肝細胞に対するマーカー、未分化細胞に対するトランスポーターおよびマーカー）の発現を測定した（第１２日目に播種され、第２４日目に採取された細胞について図７〜１０に示す）。遺伝子発現レベルは、実施例９〜１１および１７に記載の通りに測定した。
【０１４８】
同時に作動させたバイオリアクターの第二巡目：ＢＲ１２１およびＢＲ１６８
続いて、一貫性および再現性を確実にするべく、２つの別々のバイオリアクターについて、結果を比較した。細胞を、バイオリアクター（Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｔ）ＢＲ１２１またはＢＲ１６８のいずれかの中に、異なる２つの時点で（第７日目および第１２日目に）、播種し、以下の通りに、第２６日目まで、成熟させておいた（図１１、Ａ〜Ｄ）：
【０１４９】
第０日目に、実験の開始時に、２００×１０６個の未分化ヒト胚性幹細胞ＤＥＦ ＳＡ１２１は、継代のためにトリプルセレクト（ｔｒｙｐｌｅ ｓｅｌｅｃｔ）し、マトリゲルコート培養フラスコ上に、１ｃｍ２当たり２０００００細胞で、１０ｕＭ Ｒｏｃｋ阻害剤を添加したＩＤ１中に播いた。上記スケジュールに従って第７日目まで毎日または１日おきの培地交換。内胚葉の誘導後、第７日目に、すべての細胞をトリプルセレクト（ｔｒｙｐｌｅ ｓｅｌｅｌｃｔ）し、数えたところ、全体で６千万個の細胞となった。ＢＲ１２１に３千万個の細胞を使用し、ＢＲ１６８に３千万個使用した。
【０１５０】
ＢＲ１２１：
第７日目に、２千５百万個の細胞を、ＢＲ１２１の中へ、１０ｕＭ Ｒｏｃｋ阻害剤を添加したＰ１中に播種し、上記スケジュールに従って実験第２６日目の終了まで培養した。５百万個の細胞は、２Ｄ対照用にマトリゲルコート４８ウェルに、１ｃｍ２当たり１５００００細胞で、１０ｕＭ Ｒｏｃｋ阻害剤を添加したＰ１中に播き、上記スケジュールに従って、実験の終了である第２６日目まで培養した。
【０１５１】
ＢＲ１６８：
第７日目に、３千万個の細胞を、２Ｄ培養フラスコ中に、１０ｕＭ Ｒｏｃｋ阻害剤を添加したＰ１中に播き、上記スケジュールに従って培養した。５日後、第１２日目に、細胞をトリプルセレクト（ｔｒｙｐｌｅ ｓｅｌｅｃｔ）し、数えたところ、全体で７千２百万個の細胞となった。
【０１５２】
６千２百万個の細胞を、ＢＲ１６８中に、１０ｕＭ Ｒｏｃｋ阻害剤を添加したＶＨ２中に播種し、上記スケジュールに従って実験の終了である第２６日目まで培養した。
【０１５３】
７百万個の細胞を、２Ｄ対照用にマトリゲルコート４８ウェル中に、１ｃｍ２当たり２０００００細胞で、１０ｕＭ Ｒｏｃｋ阻害剤を添加したＶＨ２中に播き、上記スケジュールに従って実験の終了である第２６日目まで培養した。
【０１５４】
分析したマーカーはすべて肝マーカーであり、レベルは２Ｄ対照と比較した。培養培地組成を表６に記載する。
【０１５５】
実施例２０
当該動的灌流技術のさらなる一局面は、細胞が区画化された状態のままでありながら、第一バイオリアクターの因子または可溶性メディエーターにより第二バイオリアクターが刺激され得る、１つの灌流回路における「ツインバイオリアクター」の組み合わせを、容易に行なうことが可能であるということである。これは、共培養物の未知の可溶性因子が用いられることとなる場合には興味深いものとなるであろうが、培養物間の細胞の移入は避けなければならない。
【０１５６】
参考文献：
【０１５７】
【表３】
【０１５８】
【表４】
【０１５９】
【表５】
【０１６０】
【表６】
【０１６１】
【表７】
【０１６２】
【表８】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳ）からの肝細胞様細胞の誘導のための、３Ｄ培養システムの使用に関する。特に、本発明は、３Ｄ中空繊維キャピラリーバイオリアクターにおける、ヒト多能性幹細胞の、肝細胞様細胞への、方向性のある分化および成熟に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療および応用研究、例えば薬物スクリーニングまたは毒性学試験など、における、幹細胞ベースの用途の、開発および実施のためには、十分に定義された特徴を有する大量の細胞が必要である。したがって、高収率かつ高純度で、ｈＰＳの、成熟した肝細胞様細胞への、方向性のある再現性ある分化を可能にする培養システムが求められている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、肝細胞様細胞を得るための方法であって、
ｉ） バイオリアクター（Ｂｉｏｒａｃｔｏｒｓ）におけるｈＰＳ細胞または肝前駆細胞の播種
ｉｉ） 当該バイオリアクターを１種類以上の培養培地で１０日〜５０日の期間にわたり灌流して、肝細胞様細胞を得ること、
を含む方法に関する。
【０００４】
本発明の一局面、本発明は、肝細胞様細胞を得るための方法であって、
ｉ） バイオリアクターにおけるｈＰＳ細胞または肝前駆細胞の播種
ｉｉ） 当該バイオリアクターを１種類以上の培養培地で１０日〜５０日の期間にわたり灌流して、肝細胞様細胞を得ること、
を含む方法、により得られる肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造に関する。
【０００５】
本発明のさらなる一局面では、本発明は、肝細胞様細胞を得るための方法であって、
ｉ） バイオリアクターにおけるｈＰＳ細胞または肝前駆細胞の播種
ｉｉ） 当該バイオリアクターを１種類以上の培養培地で１０日〜５０日の期間にわたり灌流して、肝細胞様細胞を得ること、
を含む方法、により得られる細胞の、治療目的での、または、創薬、医薬製剤、毒性試験における、または、再生医療における、使用に関する。
【０００６】
さらなる一実施形態では、本発明は、ｈＰＳ細胞または肝前駆体を、肝細胞運命に向かって分化させるための、バイオリアクターの使用に関する。
【０００７】
序論
凝集体またはマイクロキャリアを用いる、分化に対する現在の３Ｄ浮遊培養モデルアプローチは、中央物質交換（ｃｅｎｔｒａｌ ｍａｓｓ ｅｘｃｈａｎｇｅ）が限られる。より大きな細胞量での、連続的な培地交換と、制御可能なガス圧での分散した酸素添加とを伴う、灌流を基本とした動的培養条件を提供することにより、３Ｄ灌流４区画キャピラリー膜バイオリアクター技術は、両方の培養の概念の利点を用いることを可能にする。加えて、医薬品の製造および品質管理に関する基準（ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅ；ＧＭＰ）の条件に適した、分化レジームの、閉鎖系への適用が可能である。この技術は、例えば酸素圧、ガス因子適用（ｇａｓ ｆａｃｔｏｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、培地因子勾配（ｍｅｄｉｕｍ ｆａｃｔｏｒ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ）、または、細胞に対する例えば流速および圧力などの物理的刺激の生成などの、変化するが制御可能な培地およびシステムのパラメータを可能にする。
【０００８】
バイオリアクターにおけるｈＰＳ細胞の培養
再生医療および応用研究、例えば薬物スクリーニングまたは毒性学試験など、における、幹細胞ベースの用途の、開発および実施のためには、十分に定義された特徴を有する大量の細胞が必要である。したがって、高収率かつ高純度で、未分化のヒト胚性幹細胞の、成熟した肝細胞への、方向性のある再現性ある分化を可能にする培養システムが求められている。
【０００９】
最も一般的に用いられる培養および分化の方法は、典型的には、非連続的な培地交換を伴う静的開放系を代表する、プラスチック・ディッシュの形の２Ｄ培養システムを利用するものであり、これは、培地交換と培地交換との間の、培養培地中の、代謝産物の蓄積や栄養素の減少といった形で、培養環境の周期的な変化を引き起こす。そのうえ、これらの２Ｄ培養は、広範な手作業による介入を要することから大きな労働力を要するものであるため、それ故、より大きな細胞数の取り扱いを実行不可能にする。
【００１０】
バイオリアクターにおけるｈＰＳ細胞の分化
Ｓｏｔｏ−ＧｕｔｉｅｒｒｅｚらによるｈＥＳＣ研究の肝分化が指し示しているのは、複雑なマトリックス構造を用いるかまたは非実質細胞との共培養を用いる、より複雑な環境が、ｈＥＳＣの肝分化を支援するとのことである（Ｓｏｔｏ−Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ ｅｔ ａｌ． ２００６）。Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇらは、ＥＳ細胞またはＥＢを播いた、ＰＬＧＡ―ポリ（乳酸‐コ‐グリコール酸）およびＰＬＬＡ―ポリ（Ｌ‐乳酸）の、生分解性の足場において、肝組織様構造の誘導は、アクチビンＡおよびＩＧＦでの処理により可能であったとのことを示した（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． ２００３）。Ｂａｈａｒｖａｎｄらは、３Ｄのコラーゲン製の足場における、ｈＥＳＣの、亢進された肝分化について報告した（Ｂａｈａｒｖａｎｄ ｅｔ ａｌ． ２００６）。したがって、３Ｄ培養環境を提供する灌流型バイオリアクターの使用により、胚性幹細胞分化のための、より効率的で、かつ、スケーラブルな方法がもたらされ得る。
【００１１】
新たなアプローチは、胚性幹細胞を広げるおよび分化させるための、中空繊維バイオリアクターの使用である。中空繊維キャピラリー膜バイオリアクター技術は、動的灌流培養条件を可能にし、また、自然のままの組織中に見られるような幹細胞の細胞密度を増加させることを可能にする。加えて、より大きな細胞量のためのスケールアップが可能である。しかしながら、周囲キャピラリーの束の周辺の細胞区画と、主に拡散による、栄養摂取と、外部酸素添加とを伴う、典型的な２区画バイオリアクター装置（例えばＦｉｂｅｒＣｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍｓ社のＦｉｂｅｒＣｅｌｌ Ｄｕｅｔ、ｗｗｗ．ｆｉｂｅｒｃｅｌｌｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）は、数デシメートルのキャピラリー長に沿った基質勾配の隔たり（ｄｉｓｔａｎｃｅ）を伴う、不均一な物質交換（ｍａｓｓ ｅｘｃｈａｎｇｅ）により制限される。
【００１２】
Ｇｅｒｌａｃｈらにより開発された３Ｄ多区画技術（Ｇｅｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ． １９９４）においては、この典型的な２区画装置に、もう１つの培地の、および、さらなる酸素添加膜区画が加えられた。４つの区画を織り合わせて、繰り返し単位を形成することにより、バイオリアクターのスケーラビリティ（ｓｃａｌａｂｉｌｉｔｙ）が可能となり、分散型の培地の灌流および置換が提供され、それと同時に、物質交換（ｍａｓｓ ｅｘｃｈａｎｇｅ）が亢進され、勾配の隔たりが減少する。当該概念は、閉じた、それ故、医薬品の製造および品質管理に関する基準（ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅ；ＧＭＰ）に適した、培養環境における、細胞の培養に基づいたものであり、これにより、結果の、可能な臨床転換（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）のみならず、生物工学的応用もまた容易となる。バイオリアクターにおいて培養された初代ブタまたはヒト肝臓細胞を用いた初期の臨床研究では、当該システムを備えた、臨床的な対外肝臓補助（ｅｘｔｒａｃｏｒｐｏｒｅａｌ ｌｉｖｅｒ ｓｕｐｐｏｒｔ）の実現可能性が実証された（Ｓａｕｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００３）。加えて、初代細胞は、胆管構造およびネオ・シヌソイド（ｎｅｏ−ｓｉｎｕｓｏｉｄｓ）を有する肝臓様組織の形成を含む、それら自身の典型的な微小環境を、そうしたｉｎ ｖｉｔｒｏ培養モデル中に作り出すことができる、とのことが示された。成体幹細胞は、非器官型（ａｎｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃａｌ）微小環境の創出のための、そうしたシステムにおける実質細胞／非実質細胞の共培養からの恩恵を受けられる可能性がある（Ｇｅｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ． ２００３）。
【００１３】
ｈＰＳ細胞は、その独特の特徴ゆえ、基礎科学、薬理学的な薬物スクリーニング、毒性試験、および、再生医療における細胞ベースの治療、への適用のための細胞源としての大きな可能性を保持している。特定の生育条件の下では、ｈＰＳ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、多種多様な体細胞組織および胚体外組織に分化することが可能である、とのことが実証されてきた（Ｐｅｒａ ｅｔ ａｌ． ２００４）。したがって、ｈＰＳ、および、特にｈＥＳ／ｈＢＳ細胞は、以前は研究用ヒト胚の利用困難性（ｉｎａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）ゆえに不可能であった、初期胚発生の際に細胞の運命を制御するような分子経路および制御機構の研究を可能にするものである。ｈＰＳ細胞の、可能な臨床適用は、肝機能不全、脊髄損傷または心筋欠損のような器官の欠陥を有する患者における細胞ベースの治療のための、幹細胞由来細胞調製物の提供に見られる。ｈＰＳ細胞由来の分化した細胞の、創薬における、可能な利用の分野は、標的の同定およびバリデーション、化合物の有効性のスクリーニングならびに安全性評価研究、のような前臨床活動に見られる（Ｓａｒｔｉｐｙ ｅｔ ａｌ． ２００７）。胚毒性試験に関しては、未分化のｈＰＳ細胞は、より良い試験システムの開発のための、新たなツールも提供する。
【００１４】
哺乳類の肝臓の発生
肝臓は、胚中で発生する最初の器官の１つであり、また、それは、たちまち胎児（胎仔）の体内で最も大きい器官の１つになる。肝臓は、胚前腸の胚体内胚葉上皮（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）から発生する。肝臓発生の誘導には、最初に、前腸におけるＷｎｔおよび繊維芽細胞成長因子シグナル伝達（ＦＧＦ４）の抑制が必要である。次いで、心臓中胚葉からのＦＧＦと、横中隔間充織からの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）とが、空間的に限定された細胞増殖を誘導し、それにより内胚葉層の肥厚化が引き起こされる。次いで、細胞が上皮から現れて、横中隔中へと移動しはじめる。この内胚葉から現れて横中隔中に集まる細胞の塊は肝芽（ｌｉｖｅｒ ｂｕｄ）と称される。器官形成のこのステージにおける内皮細胞との相互作用は、この初期出芽段階に極めて重要である。肝内胚葉（ｈｅｐａｔｉｃ ｅｎｄｏｄｅｒｍ）細胞は、この間、機能および形態に関してかなり未成熟であり、今度は肝芽細胞（ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔ）と称される。肝芽由来の肝芽細胞の索は、中胚葉に貫入し、卵黄静脈および臍静脈と混ざり合い、これらが肝芽付近で吻合して、毛細血管床を形成する。これらの変遷により肝臓の類洞構造が確立されるが、これは、器官機能に極めて重要なことであり、また、肝臓への土台作りをして胎児（胎仔）の造血を支援する。肝芽中へと移動する造血幹細胞は、グルココルチコイドと共に、さらなる肝成熟を誘導するオンコスタチンＭ（ＯｓＭ）を分泌する。この胚の肝臓塊に寄与する他の細胞型は、肝類洞、クッパー細胞および肝星細胞を取り巻く内皮細胞である。これらの細胞により産生される肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）は、完全な機能的肝成熟に重要である。肝臓分化の、これら、より後期のステージにおいては、Ｗｎｔシグナル伝達は、もはや成長および分化を阻害せず、促進する。原因肝臓療法がないこと、および、肝移植用のドナー臓器の入手可能性（ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）が不十分であることが、新しい細胞ベースの肝臓治療の開発に対する要求を生んでいる。損傷した組織と入れ換わるための、増殖および分化の能力を有する幹細胞の移植は、いくつかの臨床的徴候においては、全臓器移植（ｗｈｏｌｅ−ｏｒｇａｎ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）に取って代わることができ得るものである。
【００１５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｈＰＳ細胞の肝分化
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ＨＰＳ細胞、および、特にｈＥＳ／ｈＢＳ細胞の、肝分化の方向についての戦略に関する研究の結果、肝分化に対する効果を有する、いくつかのサイトカイン、成長因子および非タンパク質化合物の同定に至った（Ｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００５；Ｓｎｙｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ． ２００８において概説されている）。当該成長因子としては、アクチビンＡ、ＢＭＰ２および４、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＦＧＦ１、２および４、ＨＧＦ、インスリンならびにＯｓＭが挙げられる。当該非タンパク質因子としては、デキサメサゾン（ＤＥＸ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ニコチンアミドおよび酪酸ナトリウムが挙げられる。各分化因子の効果の鍵となるのは、タイミング、濃度および他の因子との組み合わせである。ｈＰＳ由来肝細胞様細胞の特徴決定をするために、種々のマーカーおよび機能試験が利用されてきた（Ｓｎｙｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ． ２００８により概説されている）。免疫細胞化学、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または酵素結合免疫吸着測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）により調べられたマーカーには、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）および尿素のような血漿タンパク質、サイトケラチン（ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ７、ＣＫ１９）、ならびに、アルファ‐１‐アンチトリプシン（α１ＡＴ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）およびシトクロムＰ４５０アイソエンザイムのような種々の肝細胞特異的酵素、の分泌物が含まれていた。肝細胞特異的機能の発現については、例えば、グリコーゲンの貯蔵の検出や、シトクロムＰ４５０アイソザイムに特異的な種々の試験基質の代謝などにより、調べられてきた。
【００１６】
ｈＰＳ細胞の肝分化が記述されている最初に公開されたプロトコルは、第一工程として、ＥＢの誘導を利用し、その後に、肝細胞を豊富にするための種々の成長因子を用いた接着培養が続くものであった（Ｌａｖｏｎ ｅｔ ａｌ． ２００４）。これらの研究では、非常に低い収率および純度の最終細胞集団しか報告されてこなかった。これまでに記述された、最も成功した分化プロトコルは、ｈＥＳＣの胚体内胚葉（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ；ＤＥ）分化の誘導から開始して、肝臓の器官発生をまねることを試みるものである（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ． ２００７）。基本的には、最大８０％ＤＥ細胞という収率のＤＥ分化にのためには、低下したインスリン／インスリン様成長因子（ＩＧＦ）シグナル伝達をもたらす低血清／インスリン条件での高濃度のアクチビンＡが適用される（Ｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ． ２００４）。この後に、ＦＧＦ、ＢＭＰ、ＨＧＦ、ＯｓＭ／ＤＥＸによる連続処理が続く。このアプローチでは、記述された肝細胞様細胞の収率は、約５０％であった。他のプロトコルとしては、ヒストン脱アセチル化酵素活性を阻害する酪酸ナトリウム（ＮａＢ）によるｈＥＳＣの処理が挙げられる（Ｄａｖｉｅ ２００３）。分化プロトコルの第一工程における、このエピジェネティックな分化剤の適用により、ｈＥＳＣから１０％肝細胞が得られ、また、最大７０％の純度の最終細胞集団が得られた（Ｒａｍｂｈａｔｌａ ｅｔ ａｌ． ２００３）。アクチビンＡによるＤＥ誘導とＮａＢ処理の組み合わせにより、最大７０％という肝細胞の収率が達成され、有望な結果が示された（Ｈａｙ ｅｔ ａｌ． ２００８）。
【００１７】
まとめると、こうした現在のアプローチにより導き出されるｈＥＳＣ由来肝細胞の収率、純度および成熟度は、未だに最適以下（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）のものであり、したがって、新たな方法が必要である。本発明は、例えばｈＢＳ細胞などのｈＰＳから、これら、または、分化が行われるバイオリアクターにおいてこれらから派生したＤＥ細胞、を播種することによって肝細胞を得るための方法を提供することにより、これらの課題に対処する。
【００１８】
ｈＰＳ由来肝細胞の用途
ｈＰＳ由来肝細胞の、将来の臨床上の用途は、例えば特定の遺伝的欠陥または急性もしくは慢性肝不全の場合などの肝機能不全を有する患者における、それらの、細胞移植への適用に見られる（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ． ２００９）。幹細胞由来肝細胞の移植は、いくつかの臨床的徴候においては、全臓器移植（ｗｈｏｌｅ−ｏｒｇａｎ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）に取って代わることができ得るものであり、また、―免疫適合性（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）細胞を用いる場合には―免疫抑制療法の必要性を不要にし得るものである。さらなる治療上の１つの選択肢は、移植まで、または、患者の器官の再生までの肝機能の橋渡しをするための、対外肝臓補助のための信頼性の高いヒト細胞源の提供に見られ、これは、対外肝臓装置のための細胞の入手可能性（ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）という既存の課題をも解決するであろう。さらに、対外システムは、また、細胞移植後、その適用した細胞が、十分な肝臓特異的な代謝パフォーマンスを示すまでの、肝機能の橋渡しをするための、興味深い治療上の１つの選択肢をも提供し得る。薬学研究における、可能性のある用途としては、創薬のために必要な新規肝臓アッセイの開発のための、ｈＰＳ細胞由来肝細胞の使用である。これにより、現存のｉｎ ｖｉｔｒｏツールによる乏しい予測力が克服される可能性があり、また、前臨床段階での、より信頼性が高く関連性のある試験を可能にし、かつ、弱いリード候補が臨床段階に入ってしまうのを妨げることとなるような、新たなヒト細胞ベースの試験システムがもたらされ得る（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ． ２００９）。
【００１９】
本発明は、調整培地の製造のための、バイオリアクターの使用にも関する。調整培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ；ＣＭ）の製造のための標準的な方法は、不活性ＭＥＦフィーダー細胞を高密度で播いた、標準的な培養容器内での、培養培地の、２４時間のインキュベーションである。単に、活性が緩まるまで、限られた時間の間、培地調整に用いることができるのみである、大量のフィーダー細胞を製造しなければならないため、この方法は、大きな労働力を要するものであり、かつ、スペースをとるものである。したがって、より大量のＣＭの製造は、この方法の、乏しいスケーラビリティ（ｓｃａｌａｂｉｌｉｔｙ）によって制限される。培養ｈＢＳ細胞のためのＣＭの使用に対する代替的アプローチは、明確になっている培養培地の使用である。ｈＥＳＣの、フィーダー非依存性培養に関し、いくつかの明確になっている培地調合物が記述されてきた（Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ２００５；Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ． ２００６）。明確になっている培地の使用には、ｈＢＳ細胞を、完全に動物由来物質がない条件下で培養することができる可能性、といったような、いくつかの利点がある一方で、これの主な欠点は、これらの培地調合物には、組換えサイトカインや成長因子といった、費用のかかるかなりの量の補助物質（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）が含まれる、ということである。
【００２０】
上記で概説されているように、本発明は、肝細胞様細胞を得るための方法であって、
ｉ） バイオリアクターにおけるｈＰＳ細胞または肝前駆細胞の播種
ｉｉ） 当該バイオリアクターを１種類以上の培養培地で１０日〜５０日の期間にわたり灌流して、肝細胞様細胞を得ること、
を含む方法に関する。
【００２１】
当該肝細胞様細胞は、肝細胞様細胞を含み、それ故、３Ｄ凝集体中に共にクラスター化したような、肝組織様３Ｄ構造の形をしていてもよい。当該ｈＰＳ細胞は、これらに限定されるものではないが、当該定義において記載されているような、ヒト胚性幹細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞であってもよい。当該肝細胞肝細胞前駆細胞は、胚体内胚葉（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ；ＤＥ）に似ているのではなくＤＥであってもよく、または、当該肝細胞前駆細胞は、胎児（胎仔）内胚葉または肝内胚葉（ｈｅｐａｔｉｃ ｅｎｄｏｄｅｒｍ）の特徴を有していてもよい。上記で言及したバイオリアクターは、中空繊維キャピラリーバイオリアクターであってもよく、所望により、膜区画を備えたものであってもよい。当該バイオリアクターは、２つ以上のキャピラリーシステムと１つ以上の中空繊維膜とを含んでいてもよい。さらに、当該バイオリアクターは、キャピラリーシステムを通っての培養培地の灌流のための手段と、当該キャピラリーシステム中のガス交換のための手段とを含んでいてもよく、所望により、増殖培地の灌流は、当該キャピラリーシステムを通って行なわれ、また、ガス交換は、中空繊維膜システム経由で行なわれる。当該キャピラリーシステムと１つ以上の中空繊維膜とは、１つのハウジング中へと組み込まれる独立した織り合わされた（ｉｎｔｅｒｗｏｗｅｎ）繊維キャピラリー膜システムを形成するよう構成されていてもよい。
【００２２】
当該ｈＰＳ細胞は工程ｉ）で播いてもよく、また、当該灌流は以下のスキームに従ったものであってもよいが、但し、工程２〜６のうちの少なくとも３つが含まれる：
【００２３】
【表１】
【００２４】
あるいは、これら工程１〜６のうちのすべてが含まれていてもよい。
【００２５】
本明細書において詳述されているように、当該培養培地ＤＭ‐Ａは、増殖培地を含んでいてもよく、かつ、次の成分うちの１つ以上を含んでいてもよい：アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、グルタマックス‐Ｉ。
【００２６】
本明細書において詳述されているように、培養培地ＤＭ‐Ｂは、例えばＲＰＭＩアドバンスト培地（ＲＰＭＩ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）等の増殖培地を含んでいてもよく、かつ、次の成分うちの１つ以上を含んでいてもよい：アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、グルタマックス‐Ｉ、ＦＣＳ。
【００２７】
本明細書において詳述されているように、培養培地ＤＭ‐Ｃは、例えばＲＰＭＩアドバンスト培地等の増殖培地を含んでいてもよく、かつ、次の成分うちの１つ以上を含んでいてもよい：ｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、グルタマックス‐Ｉ、ＦＣＳ。
【００２８】
本明細書において詳述されているように、培養培地ＤＭ‐Ｄは、例えばウィリアムズ培地Ｅ等などの肝培養培地を含み、かつ、次の成分うちの１つ以上を含む：ＢＳＡ、アスコルビン酸、グルタマックス‐Ｉ、Ｄ‐ガラクトース／Ｄ‐ソルビトール、ヒドロコルチゾン、インスリン、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ。
【００２９】
本明細書において詳述されているように、培養培地ＤＭ‐Ｅは、例えばウィリアムズ培地Ｅ等などの肝培養培地を含み、かつ、次の成分うちの１つ以上を含む：ＢＳＡ、アスコルビン酸、グルタマックス‐Ｉ、デキサメタゾン、Ｄ‐ガラクトース／Ｄ‐ソルビトール、ヒドロコルチゾン、インスリン、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、オンコスタチンＭ。
【００３０】
列記したこれらの培養培地はすべて、所望により、ｒｈｏキナーゼ阻害剤、例えばＢＩＯまたはＢＩＯのなんらかの変種など、を含んでいてもよい。
【００３１】
工程ｉ）の前に、バイオリアクターには、不活性化したフィーダー細胞を播種してもよい。かかるフィーダー細胞は、これらに限定されるものではないが、ｈＦＦまたはＭＥＦ細胞であってもよい。
【００３２】
さらに、バイオリアクターには、ｈＢＳ細胞およびフィーダー細胞またはＤＥ細胞およびフィーダー細胞、のいずれか関係する方を、工程ｉ）で共播種してもよい。
【００３３】
さらに、例えばＤＥ細胞などの肝前駆細胞は工程ｉ）で播いてもよく、また、以下表の工程１および２（太字で示した）は省略されてもよい。
【００３４】
【表２】
【００３５】
上記で概説されているように、本発明は、ｈＰＳ細胞、例えばｈＥＳＣ／ｈＢＳＣなど、の３Ｄ培養、および、特に、方向性のある肝分化に重点を置いた、ｈＰＳ細胞の成長および分化を支援する新規ｉｎ ｖｉｔｒｏシステムとしての多区画バイオリアクターシステムにおける前記細胞の培養に関する。結果が指し示しているのは、当該バイオリアクターの３Ｄ環境が、標準的な２Ｄ培養システムよりも、よりｉｎ ｖｉｖｏ様である環境を構成しており、それ故、これらのシステムに比べ、ｈＰＳ細胞の、改善された成長および分化を可能にする、ということである。
【００３６】
さらに、本発明は、細胞をバイオリアクターに播く前に、従来型の２Ｄ環境において細胞の最初の分化を行う方法に関する。興味深いことに、本発明の発明者らは、２Ｄ環境において、胚体内胚葉の方向に向かってｈＰＳの分化を開始させ、その後、それら最初に分化させた細胞をバイオリアクター中へと播くことにより、より純粋な培養がもたらされる、とのことを見出した。２Ｄ培養での胚体内胚葉への最初の分化後、それら細胞をバイオリアクターに播く。最初の２Ｄ分化ならびにその後のバイオリアクターにおける播種およびさらなる分化の例を、表２および表３〜５に提示する。
【００３７】
したがって、これら最初に分化させた細胞は、第３日目〜第２０日目、例えば第８日目〜第１２日目、例えば第１１日目または第１２日目、に当該バイオリアクターに播いてもよい。
【００３８】
上記の各局面に加え、肝細胞運命に向かうｈＰＳ細胞の分化は、アクチビンＡ、所望によりＲＨＯキナーゼ阻害剤および高成長因子レベルによりさらに刺激してもよい。細胞は、所定の時点で（表３に示されている実験については第１２日目、表４に示されている実験については第７日目または第１１日目に）バイオリアクター中へと播いて、さらなる分化および成熟が起こるようにしておいてもよい。
【００３９】
本明細書において述べられているように、本発明者らは、３Ｄバイオリアクターを適用することにより、ｈＰＳの肝分化が効率的に肝細胞運命の方向に向かう、とのことを見出した。ｈＰＳの、肝細胞運命に向かう、効率的な分化を促進するために適用可能な詳細なプロトコルを、以下に、および、特に、本明細書中の実施例において、詳細に記載する。本明細書において説明されているように、ｈＰＳ細胞の分化は、フィーダー細胞、例えばマウス胚性フィーダー細胞（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ；ＭＥＦ）またはヒト包皮繊維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｆｏｒｅｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＨＦＦ）など、を使用して、または、使用しないで、促進してもよい。さらに、増殖培地には、ｈＥＳＣ培養培地、ならびに、ＤＭ‐Ａ、ＤＭ‐Ｂ、ＤＭ‐Ｃ、ＤＭ‐ＤおよびＤＭ‐Ｅとして本明細書に記載の増殖培地のいずれかを含む、なんらかの適切な増殖培地が含まれていてもよい。したがって、本発明には、本明細書中に提示されている増殖培地および分化培地を変更または置き換えるために適用することが当業者によれば明確であるような、増殖培地組成に対するあらゆる変更（例えば増殖培地の成分の除去または追加）も包含される。同様に、例えば遅れた細胞成熟またはステージに特異的な成長因子の添加などに起因する、インキュベーション時間、流速または培養条件のあらゆる変更は、そうした微調整は本発明の自明な応用であると考えるべきものであるため、本発明の範囲内に含まれる。
【００４０】
最初の細胞播種の前に、所定の期間、例えば２４〜７２時間、にわたる、適切な増殖培地の再循環により、バイオリアクターを調整してもよい。分化の任意のステージにおいて、細胞を分化させるために使用されるあらゆる培地を含む、任意の適切な培地および流速を適用してもよい。あるいは、当該調整を最小限にすることにより、バイオリアクターに細胞をほぼ即時に播くことを可能にしてもよい。
【００４１】
バイオリアクターにおいて適用される流速は、例えば分化のステージ、播種規模、細胞の成熟、増殖培地の粘度等の、いくつかの要因に依存してもよい。ガス区画中の空気／ＣＯ２混合物の流速は、０．２ｍｌ／分〜１２０ｍｌ／分、例えば１０〜８０ｍｌ／分など、例えば３０ｍｌ／分など、であってもよい。
【００４２】
本発明によれば、細胞は、任意の適切な濃度または数でバイオリアクターに播いてもよい。非限定的な例として、１×１０６〜１０×１０８個の細胞、例えば２．５×１０７〜１０×１０７個の細胞など、をバイオリアクターに播いてもよい。
【００４３】
ｐＨ、酸素の分圧（ｐＯ２）および二酸化炭素の分圧（ｐＣＯ２）ならびに酸／塩基状態を定期的に測定してもよい。空気／ＣＯ２混合物は、特定のｐＨ値ならびにＯ２およびＣＯ２の分圧を維持するために変えてもよい。したがって、空気／ＣＯ２混合比は、５〜９の間の、例えば７．２または７．３などの安定したｐＨを維持するために調整してもよい。
【００４４】
当該バイオリアクターには、ｈＰＳをバイオリアクターに播く前に、フィーダー、例えばＭＥＦ細胞など、を播いてもよい。例えば、このフィーダー細胞は、例えばｈＰＳ細胞をバイオリアクターに播く５〜０日前、例えば１〜４日前など、例えばｈＰＳ細胞をバイオリアクターに播く２日前など、に播いてもよい。
【００４５】
ｈＰＳ細胞をバイオリアクターに播いた後、増殖培地は、決まった間隔を置いて変更してもよい。分化培地組成は、細胞分化スピードおよび細胞成熟に応じて、１〜１５日毎に変更してもよい。増殖培地組成、供給速度および増殖培地組成の変更間の間隔に関するインスピレーションについては、本明細書の表２を参照のこと。
【００４６】
バイオリアクターにおける分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｉｏｎ）の前、最中および後に、代謝パラメータをモニタリングしてもよい。これは、培地アウトフロー中および再循環培地中の可溶性因子を測定することにより行なわれてもよい。パラメータには、関連性がありかつ測定可能なあらゆるパラメータ、例えば以下を含む因子など、が包含されていてもよい：α‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、ベータ‐ヒト絨毛性ゴナドトロピン（β‐ｈＣＧ）、ｃ‐ペプチド、胎児性癌抗原（ＣＥＡ）、サイトケラチンフラグメント１９（Ｃｙｆｒａ２１‐１）、エリスロポエチン、エストラジオール、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、第ＩＩ‐Ｖ‐Ｘ‐ＸＩＩＩ因子、フィブリノーゲン、ガンマ‐グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、グルコース、乳酸塩、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、黄体形成ホルモン、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、重量オスモル濃度（ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ）、オステオカルシン、偽コリンエステラーゼ（ＰＣＨＥ）、プレアルブミンプロゲステロン、プロラクチン、Ｓ‐１００、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、トランスフェリン、グルタミン、グルタミン酸塩、グルコース、乳酸塩、アンモニウム、ｐＨ、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）、アクチビンＡ、インスリンおよびアルブミン、尿素、ガラクトースおよびソルビトール。これらの化合物を測定するための、任意の適用可能な方法を適用してもよい。各物質の産生または消費率は、その日の実際の廃棄体積に、供給培地中の物質濃度と廃棄培地中の物質濃度との間の差を掛けることにより、例えば１日毎に算出してもよい。
【００４７】
上記のパラメータまたは物質に加え、培養物の代謝活性を試験してもよい。例として、バイオリアクターの、フェナセチン、ジクロフェナクおよびミダゾラムを、第Ｉ相シトクロム（ＣＹＰ）Ｐ４５０酵素ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ３Ａ４経由で代謝する能力を試験してもよい。この試験は、例えば培養条件および増殖培地組成を分化の最中に調整するなどのために、分化の任意のステージで行なってもよい。しかしながら、細胞を、完全にまたは部分的に肝細胞運命の方向に向かわせるか、または、肝細胞または肝細胞様細胞に分化させる場合には、この、代謝活性の試験は、比較的後期の分化ステージで、最も関連性があってもよい。例として、当該試験は、分化の第３０日目〜第６０日目の間、例えば細胞の播種後の第４０日目および第４７日目など、に行なってもよい。
【００４８】
例として、以下のスキームに従って、ＣＹＰ Ｐ４５０活性試験を行ってもよい：
ＣＹＰ１Ａ２： フェナセチン −＞ アセトアミノフェン
ＣＹＰ２Ｃ９： ジクロフェナク −＞ ４’ＯＨ ジクロフェナク
ＣＹＰ３Ａ４： ミダゾラム −＞ １’ＯＨ ミダゾラム
【００４９】
試験物質を再循環培地中へと注入して、試験開始時に以下の濃度を得てもよい：０．５〜１０μＭ、例えば３μＭなど、のミダゾラム、１〜２５μＭ、例えば９μＭなど、のジクロフェナク、および、２〜６０μＭ、例えば２６μＭなど、のフェナセチン。次いで、バイオリアクターを再循環モードで２４時間作動させることができ得る。次いで、再循環からの試料を、実験開始前と、１、４、８および２４時間後とに採取し、試験物質の代謝産物について、例えば液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）などにより、分析することができ得る。
【００５０】
ＲＮＡの単離、ｃＤＮＡ合成、アレイハイブリダイゼーションおよびデータ解析は、当該分野において知られている任意の方法により行なうことができる。加えて、細胞および増殖培地の、組織化学的分析および免疫組織学的（ｉｍｍｕｎｉｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ）分析ならびに電子顕微鏡分析は、当業者の、入手可能なツールボックスの一部を形成する任意の機器および試薬を用いて行なってもよい。
【００５１】
上記で概説した詳細に従って、得られた細胞を、分化特異的マーカーに関して分析してもよい。一例を挙げれば、第０日目、播種日、およびバイオリアクターのシャットダウン日からなる測定時点で、４つの群のマーカーを測定してもよい（肝遺伝子、胎児（胎仔）／未成熟肝細胞に対するマーカー、未分化細胞に対するトランスポーターおよびマーカー）。比較目的のために、２Ｄ培養のみの後に得られた細胞を含む対照群が含まれて、適宜分析されてもよい。
【００５２】
本発明のさらなる一局面は、未分化ｈＰＳ細胞の培養のための調整培地の製造のための、バイオリアクターの使用に関する。
【００５３】
本発明の発明者らは、不活性ＨＦＦの存在は、それらＨＦＦがその活性を緩めるまで、ｈＥＳＣ分化の開始を遅らせる、とのことを観察した。この、ＨＦＦの、多能性を支援する活性は、そのアクチビンＡの産生と相互に関係している可能性がある。ＨＦＦフィーダー細胞の挙動をさらに調べるために、ＨＦＦのみを用いたいくつかの実験を、２Ｄ培養において、および、２つのバイオリアクターにおいて、行なった。
【００５４】
１つの実験においては、バイオリアクターには、活性ＨＦＦを播種するが、これは、ＨＦＦ増殖を刺激するべく血清およびｂＦＧＦを添加した培地で培養されることとなる。グルコース消費および乳酸塩産生のレベルにより、細胞数の増加をモニタリングする。十分な細胞数に達したときに、培養培地を、調整のためにｈＢＳ培地に変える。最適培地交換速度は、品質管理パラメータとして、例えば調整培地中のアクチビンＡおよびグルコースの濃度を測定して、決定されなければならない。低グルコースレベルは、培地供給速度を増加させることに対する要求を指し示している可能性があり、また、低アクチビンＡレベルは、ｈＥＳＣ多能性を促進するのに不適切な、不十分な調整に対するサインである可能性がある。
【００５５】
２Ｄおよび３Ｄ実験からの観察が示すのは、アクチビンＡ産生は、血清代替物（ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｒ）を含有する培地と組み合わせたｂＦＧＦにより刺激される、ということである。血清を添加した培地では、ｂＦＧＦは、アクチビンＡ産生を刺激しなかったが、活性ＨＦＦに対する強い分裂促進作用を呈した。この作用は、培地へのｂＦＧＦの添加に際してグルコースおよび乳酸塩の代謝のレベルを上昇させることを特徴とする、バイオリアクター実験ＨＦＦ‐１においても観察された。この分裂促進作用は、血清代替物（ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を添加した培地を使用した、バイオリアクター実験ＨＦＦ‐２においては観察されなかった。この実験では、グルコースおよび乳酸塩の代謝は、細胞が増殖していないことを示す、ある一定のレベルに留まった。
【００５６】
したがって、これらの所見は、当該バイオリアクター技術は、未分化ｈＰＳ細胞をフィーダーフリーで広げるために必要な、調整培地の製造に適用できる可能性がある、とのことを説明するものである。
【００５７】
ＣＭを製造するための、バイオリアクターにおけるＨＦＦの培養は、従来法に対する代替法となり得る。それにより、定められた速度の培地インおよびアウトフローならびに培養パラメータの自動制御を可能にするような、スケーラブルなシステムにおける、高い細胞密度のヒトフィーダー細胞が可能となるであろう。したがって、調整プロセスの標準化が可能となり、結果として、手動による方法に比べ、製造されたＣＭの、向上した品質がもたらされることとなる。活性フィーダー細胞が、多能性の維持も支援している、とのことが示されている（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ． ２００５）ことから、当該バイオリアクターを用いる場合の、１つのさらなる利点は、活性フィーダー細胞を用いることができる可能性であろう。これは、従来の２Ｄ培養では最初のバイオリアクター播種用に製造しなければならない、活性フィーダー細胞の数を減少させるであろう。
【００５８】
さらに、ｈＥＳＣ由来の分化した細胞を含有する当該バイオリアクターは、医学療法における対外装置として用いてもよく、また、例えば薬物代謝研究および奇形腫形成による多能性試験のような用途における動物試験に対する代替として用いてもよい。
【００５９】
あるいは、本発明は、基礎研究、薬理学的な薬物スクリーニングおよび細胞ベースの臨床適用に必要な、大量の、未分化の、または、分化したｈＢＳ細胞の製造のための、スケーラブルなシステムとして用いてもよい。しかしながら、これらの用途のためには、本明細書において開示されておりかつ特定の細胞型が非常に豊富な細胞調製物をもたらす方法のような方法が、重要な前提条件である。
【００６０】
したがって、本発明は、本明細書において開示されている方法により得られる肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造にも関する。
【００６１】
本発明の肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造は、上昇したレベルの１つ以上の肝マーカー遺伝子または肝トランスポーター遺伝子を発現していてもよい。
【００６２】
そのような（ｓｕｃｈｅ）肝マーカー遺伝子の例は、アルブミン、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ７Ａ１、ＴＡＴおよびＵＧＴ２Ｂ７を含むリストから選択されてもよく、また、１つ以上の肝マーカーの発現は、本明細書の図７中に、試料：バイオリアクター第２６日目、として列記されているような肝マーカー遺伝子の発現に典型的に似て（ｒｅｓｅｍｐｂｌｅ）いてもよい。図７は、本発明の、一般的発明概念の一部を形成する、とのことが本明細書により意図されている。
【００６３】
さらに、本発明の肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造は、上昇したレベルの肝トランスポーター遺伝子を発現していてもよい。これらの遺伝子は、ＡＢＣＣ２／ＭＲＰ２、ＦＡＢＰ１、ＯＡＴＰ２、ＯＣＴ‐１を含むリストから選択されてもよい。１つ以上の肝トランスポーター遺伝子の発現は、本明細書の図９中に、試料：バイオリアクター第２６日目、として列記されているような発現パターンに似ていてもよい。図９は、本発明の、一般的発明概念の一部を形成する、とのことが本明細書により意図されている。
【００６４】
本発明の一局面は、膜区画を備えたバイオリアクターにおける、ｉｎ ｖｉｔｒｏで導かれた（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｅｒｉｖｅｄ）肝細胞様細胞に関する。一局面では、これら細胞は、ｈＰＳ細胞または肝細胞前駆体から、肝細胞様細胞へ、当該バイオリアクター中で分化したものであってもよい。
【００６５】
上記で言及したバイオリアクターは、中空繊維キャピラリーバイオリアクターであってもよく、所望により、膜区画を備えたものであってもよい。当該バイオリアクターは、２つ以上のキャピラリーシステムと１つ以上の中空繊維膜とを含んでいてもよい。さらに、当該バイオリアクターは、キャピラリーシステムを通っての培養培地の灌流のための手段と、当該キャピラリーシステム中のガス交換のための手段とを含んでいてもよく、所望により、増殖培地の灌流は、当該キャピラリーシステムを通って行なわれ、また、ガス交換は、中空繊維膜システム経由で行なわれる。当該キャピラリーシステムと１つ以上の中空繊維膜とは、１つのハウジング中へと組み込まれる独立した織り合わされた（ｉｎｔｅｒｗｏｗｅｎ）繊維キャピラリー膜システムを形成するよう構成されていてもよい。
【００６６】
さらに、当該バイオリアクター肝細胞様細胞または当該バイオリアクターにおける肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造は、例えばＲＯＣＫ Ｒｈｏキナーゼの阻害剤などの細胞生存因子の存在下で成長していてもよい。
【００６７】
本発明は、調整培地を製造するための方法であって、
ａ） バイオリアクターにおけるフィーダー細胞の播種の工程
ｂ） 当該フィーダー細胞を成長させる工程
を含む方法にも関する。
【００６８】
上記で詳述されているように、上記で言及したバイオリアクターは、中空繊維キャピラリーバイオリアクターであってもよく、所望により、膜区画を備えたものであってもよい。当該バイオリアクターは、２つ以上のキャピラリーシステムと１つ以上の中空繊維膜とを含んでいてもよい。さらに、当該バイオリアクターは、キャピラリーシステムを通っての培養培地の灌流のための手段と、当該キャピラリーシステム中のガス交換のための手段とを含んでいてもよく、所望により、増殖培地の灌流は、当該キャピラリーシステムを通って行なわれ、また、ガス交換は、中空繊維膜システム経由で行なわれる。当該キャピラリーシステムと１つ以上の中空繊維膜とは、１つのハウジング中へと組み込まれる独立した織り合わされた（ｉｎｔｅｒｗｏｗｅｎ）繊維キャピラリー膜システムを形成するよう構成されていてもよい。
【００６９】
しかし、本発明のさらなる一局面は、本明細書における方法のいずれかにより得られる細胞の、治療目的での、または、創薬、医薬製剤、毒性試験における、または、再生医療における、使用に関する。
【００７０】
本明細書において開示されているように、本発明の発明者らは、当該３Ｄ灌流培養技術が、高度に制御された環境において高密度で幹細胞を広げるおよび分化させるための有望なツールに相当し、また、例えば特定の遺伝的欠陥または急性〜慢性肝不全の場合などの肝機能不全を有する患者における移植のための胚性または多能性幹細胞由来細胞調製物の製造におそらく使用することができるであろう、とのことを見出した。さらなる治療上の１つの選択肢は、ｈＥＳＣ由来肝臓細胞をヒト細胞源として用いることにより、移植まで、または、器官再生までの肝機能の橋渡しをすることを意図した、対外肝臓補助のための、当該バイオリアクター技術の適用に見られる。対外システムは、また、幹細胞移植後、その適用した細胞が、十分な機能的パフォーマンスを示すまでの、肝機能の橋渡しをするための、有用な治療上の１つの選択肢をも提供し得る。最終的には、当該バイオリアクターシステム中で広げ、維持した、幹細胞および幹細胞由来の分化した細胞は、内在性の再生プロセスをｉｎ ｖｉｖｏで刺激するような再生物質を製造するためにも使用することができる可能性がある。
【００７１】
したがって、本明細書に記載の方法により得られる当該細胞または３Ｄ細胞構造は、創薬、毒性試験、肝毒性試験に、または、薬物トランスポーター、薬物代謝酵素、肝形成、初期肝形成、肝細胞成熟もしくはヒト肝再生障害（ｈｅｐａｔｏｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の研究に、用いることができる。
【００７２】
さらに、当該バイオリアクターにおける成長の後に得られる、かつ、本明細書に記載の方法のいずれかに従った、細胞または細胞の３Ｄ構造は、医薬として適用してもよく、または、例えば肝臓組織の変性などの組織変性および／または原発性胆汁性肝硬変を含む自己免疫障害；脂質異常症を含む代謝障害；例えばアルコール乱用により引き起こされる肝臓障害；例えばＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、およびＡ型肝炎などの、ウィルスにより引き起こされる疾患；例えば医薬品に対する急性中毒反応により引き起こされる肝壊死；ならびに例えば肝細胞癌を患う患者における腫瘍除去、により引き起こされる病態および／または疾患の予防および／または治療のための組成物の製造のために適用してもよい。加えて、本明細書のこれら細胞または３Ｄ構造は、代謝病態および／もしくは疾患の治療および／もしくは予防のための組成物の製造のために、または、本明細書において開示されている方法のうちのいずれかに従ったバイオリアクターにおいて成長させた細胞を、化合物に暴露して、その化合物との接触により生じる、それらの細胞におけるなんらかの表現型の変化または代謝の変化を測定することを含む、肝細胞の機能を調節する能力に関して化合物をスクリーニングするための方法として、用いてもよい。
【００７３】
ｈＰＳ由来細胞の不十分な組織適合性の可能性、および、移植された細胞調製物中の未分化ｈＥＳＣの混入による内在する腫瘍形成の危険性に関する安全面、についても検討されている。したがって、これらの課題を解決し得る組織適合性多能性細胞を導き出すことを目的として、代替となる細胞源が調べられている。当該バイオリアクター技術は、現時点でゴールドスタンダードであるｈＥＳＣとの各候補細胞型の比較および特徴決定に適用できる可能性がある。
【００７４】
本発明の一部として、当該バイオリアクターにおける、ｈＰＳ細胞（ｈＰＳＣ）の、方向性のある肝分化、に関する２つのパイロット実験を最初に行ない、実現可能性を評価した。この２つのバイオリアクター実験（ＨｅｐＤｉｆｆ‐１およびＨｅｐＤｉｆｆ‐２）は、不活性化ＭＥＦの、当該バイオリアクターのうちの１つの中へのさらなる播種についてのみ異なるものであった。用いた分化プロトコルは、ＭＥＦ上で培養されるｈＰＳＣ用に開発されたものであった（表１および２、また、図３も参照のこと）。播種後、ｈＰＳＣを、これら実験の最初の４日間の間、血清代替物（ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を含有する標準培養培地（ＤＭ‐Ａ、表２参照）中で培養した。この最初の工程は、当該未分化細胞が、あらたな培養環境に適合し、ＨＦＦがその分化阻害活性を失うときであるものの自発的な分化の開始前に、分化を開始できるよう、選択した。この工程は、次の３つの所見に基づいて選択した：第一に、予備バイオリアクター実験において、ＬＤＨのピークにより示される細胞死の割合の増加が、細胞播種後に観察された。この増加した細胞死は、２Ｄ培養からの細胞採取のプロセス、播種プロセス自体、に起因するものであるか、および／または、それらの細胞が適合しなければならないバイオリアクターの変化した環境により誘導されたものである可能性がある。第二に、次の工程において適用された分化条件には、細胞に対する高い選択圧が含まれる。したがって、これらの条件を、細胞播種後すぐに適用することは、細胞にとってはもう１つのストレス要因であり、増加した細胞死をもたらし得るものである。第三に、方向性のある分化の開始前の４日という培養の長さは、先の実験のうちのいずれにおいても分化マーカーがこの期間内に検出されず、また、アクチビンＡ産生により測定されたＨＦＦ活性が一定に減少した、という所見に基づいて選択した。
【００７５】
追加の不活性ＭＥＦを播種したバイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐２は、フィーダーを含有しないＨｅｐＤｉｆｆ‐１に比べ、グルコースおよび乳酸塩の、よりずっと高い代謝を示した（図４）。これは、不活性化ＭＥＦの存在が、ｈＥＳＣにとって細胞保護的であり、播種後のよりよい細胞生存をもたらす、とのことを指し示している。これらバイオリアクターにおけるＡＦＰ産生およびＣＹＰ４５０活性を比較した場合に、フィーダーの非存在下における、より低い細胞生存も明らかになっている。これらのパラメータのレベルは、フィーダー細胞を含有するバイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐２に比べて、フィーダーを含有しないバイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐１では約８倍低かった（図５）。ＡＦＰの産生は、両バイオリアクターにおいて観察され、およそ実験第１７日目に開始された。これは、初期肝分化のサインであると解釈することができ、先行する細胞のＤＥ分化がうまくいったとのことが推定される。ＡＦＰは、胎児（胎仔）肝臓の主要な細胞型である肝芽細胞への、ＤＥ細胞の分化に対するマーカーであるが、原始内胚葉細胞への、未分化細胞の分化を指し示すこともある。ＣＹＰ１Ａ１／１Ａ２によるフェナセチンのかなりの代謝がこれらバイオリアクターにおいて検出された（図６ｂ）。ＣＹＰ１Ａ１は、胎児（胎仔）肝臓で妊娠第一期および第二期に発現し、肺および副腎組織のような他の胎児（胎仔）組織でも発現し、成体肝臓ではもう検出することはできなくなるが、一方、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ３Ａ４の発現は、胎児（胎仔）肝臓にはなく、成体肝臓では発現する（Ｈｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ． ２００２）。
【００７６】
上記で概説されているように、当該分化プロトコルの第一工程は、胚体内胚葉（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ；ＤＥ）の方向に向かうｈＰＳＣ分化の誘導である。このプロトコルでは、低血清条件における高アクチビンＡ濃度での処理により、ｈＰＳＣの、ＤＥ細胞への、高率の分化が達成される。適切な培養培地の例は、ＲＰＭＩアドバンスト培地に基づいたものであってもよい。当該培養培地には、０．５〜２％のグルタマックス‐Ｉ、１〜１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０〜２００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、または、１０〜２００μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、といった成分のうちの１つ以上が添加されていてもよい。あるいは、または、その後の使用のためには、もう１つの適切な培養培地は、ＲＰＭＩアドバンスト培地に基づいたものであって、かつ、０．５〜２％のグルタマックス‐Ｉ、０．１〜１％のＦＣＳ（熱非働化）、１〜１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０〜２００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、または、１０〜２００μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、といった成分のうちの１つ以上を含んでいてもよい。
【００７７】
肝臓細胞の方向に向かうさらなる細胞分化がうまくいくためには、この工程は極めて重要である。ＤＥ誘導後、次の２つの分化工程は、細胞の分化を、肝芽細胞表現型の方向に向かわせる。最終工程は、完全に分化した肝細胞への細胞成熟を支援するべきである。
【００７８】
適用した分化条件を評価するために、インスリンおよびアクチビンＡのレベルを分析した。この分析により、高レベルのインスリンの、高レベルのアクチビンＡとの、部分的重なりが明らかとなった（図６ａ）。この、観察された高レベルのインスリンは、培養培地（例えばＤＭ‐Ａ）に含まれる血清代替物（ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｒ）によってもたらされるものであり、ＥＲＢＢ２受容体シグナル伝達に加えインスリン様成長因子‐１受容体シグナル伝達の刺激によるｈＰＳＣ増殖および自己複製を支援し得る。ＤＥへの細胞運命決定（ｃｅｌｌ ｆａｔｅ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）には、低下したインスリン／インスリン様成長因子シグナル伝達と組み合わせたアクチビン／ｎｏｄａｌファミリーメンバーによるシグナル伝達が極めて重要である、とのことも示されてきた。これは、これらバイオリアクターにおける、同時発生の、高いインスリンレベルおよび高いアクチビンＡレベルという分化条件が、ＤＥの誘導には最適ではなかった、とのこと、ならびに、おそらく、これが、肝分化がないことに対する理由である可能性が高い、とのことを示している。したがって、同時に作動させた２つのバイオリアクター、ＢＲ２およびＢＲ３、を用いて、ｈＰＳＣ細胞の、ＤＥへの、および、ひいては、より成熟した肝表現型への、方向性のある分化を洗練されたものにするために、さらなる実験を行なった。このプロセスは、ｈＰＳＣを、ＤＥ運命の方向に向かって、まず、従来の２Ｄフラスコ中で、高レベルのアクチビンＡおよび他の成長因子を用いて、ある特定の時点でそれらをバイオリアクターの中に播種する前に、部分的に分化させることを含むものであった（実施例１９において詳述され、かつ、表４および５において概略的に示されているプロセス）。この、改良されたプロセスは、２Ｄ対照に比べ、第１２日目に当該バイオリアクター中へと播種し第２４日目に採取した細胞において、より高い発現レベルのいくつかの重要な肝マーカーを示し、；特に、５つのマーカー（アルブミン、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ７Ａ１およびＵＧＴ２Ｂ７）は、すべて、それらバイオリアクター培養試料において、有意に、より高い発現を示した（図７）。いくつかのトランスポーター遺伝子も、それらバイオリアクター培養細胞においてアップレギュレートされ（図９）、最も顕著であったのはＡＢＣＣ２／ＭＲＰ２およびＦＡＢＰ１であったが、これらの発現は肝細胞型に完全に限られたものではない、とのことには注目すべきである。重要なことに、未分化細胞に対する２つのマーカー、ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４、の発現は、当該最初の未分化の出発物質に比べ、バイオリアクター培養細胞において（および、２Ｄ対照において）検出不可能であった、とのことも分かった（図１０）。
【００７９】
これに続いて、１つよりも多いバイオリアクターにわたり結果に再現性があったとのことを確実にするべく、上述の実験を繰り返した。細胞は、上述のように培養し、２つのバイオリアクターのうちの１つ、ＢＲ１２１またはＢＲ１６８のいずれか、の中に、異なる２つの時点で（ＢＲ１２１については第７日目、または、ＢＲ１６８については第１２日目に）、播種した。細胞は、記載されている（実施例５）ように成熟させ、また、第２６日目に、実施例８〜１１に記載されているように処理する前に採取した。ＢＲ１６８からの結果が示しているのは、いくつかの肝マーカーは、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２およびＴＡＴを含め、２Ｄ対照に比べ、バイオリアクター成熟細胞において、有意にアップレギュレートされた、とのことである（図１１ＢおよびＤ）。重要なことに、ＢＲ１２１成長細胞も、ほぼ１００倍の増加が観察されたアルブミンおよびＣＹＰ３Ａ７を含め、２Ｄ対照に比べた場合に、肝マーカーのアップレギュレーションを示した（図１１ＡおよびＣ）。両バイオリアクターにおける細胞は、未分化細胞の２つのマーカー（Ｏｃｔ４およびＮＡＮＯＧ）の発現の、著しいダウンレギュレーションも示し（図１２）、細胞が分化していたこと、および、もはや多能性ではないこと、が確認された。
【００８０】
以下に含まれるのは、ｈＢＳ細胞の肝分化のための提案プロトコルである。出発物質および細胞アウトプットに応じて、工程を省略または反復してもよい。当業者は、当該個々の成分を、同じ機能を有する１つ以上と置き換えてもよいが、分化実験の基礎として部分的にまたは全体的に用いることもできる例えばＢＲ１２１およびＢＲ１６８においてなどの、後のバイオリアクターの作動において用いられる培地の詳細については表６も参照のこと。
【００８１】
当該分化プロトコルの際に使用される培養培地は、以下に列記されているような成分を含んでいてもよいが、当該増殖培地を種々のプロトコルに対して最適化するべく、成分を置き換えても、濃度を調整してもよい。
【００８２】
ｈＰＳ培養培地
ベース ノックアウトＤＭＥＭ
０．５〜２％ グルタマックス‐Ｉ
０．５〜２％ ＮＥＡＡ
１０〜５０％ ノックアウト血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｒ）
２０〜７５μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン
０．０５〜１ｍＭ β‐メルカプトエタノール
１〜２５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ
【００８３】
ＤＭ‐Ａ
ベース ＲＰＭＩアドバンスト培地
０．５〜２％ グルタマックス‐Ｉ
１〜１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ
１０〜２００ｎｇ／ｍｌ アクチビンＡ
１０〜２００μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン
【００８４】
ＤＭ‐Ｂ
ベース ＲＰＭＩアドバンスト培地
０．５〜２％ グルタマックス‐Ｉ
０．１〜１％ ＦＣＳ（熱非働化）
１〜１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ
１０〜２００ｎｇ／ｍｌ アクチビンＡ
１０〜２００μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン
【００８５】
ＤＭ‐Ｃ
ベース ＲＰＭＩアドバンスト培地
０．５〜２％ グルタマックス‐Ｉ
１０〜２５０ｎｇ／ｍｌ ａＦＧＦ
１〜５０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ
１０〜２００ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ２
５０〜５００ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４
０．０５〜１％ ＦＣＳ（熱非働化）
１０〜２００μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン
【００８６】
ＤＭ‐Ｄ
ベース ウィリアムズＥ（フェノールレッド不含）
１〜２×／５００ｍｌ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（登録商標）
０．５〜２％ グルタマックス
０．５〜５ｇ／ｌ Ｄ‐ガラクトース
０．５〜５ｇ／ｌ Ｄ‐ソルビトール
５〜５０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ
０．５〜５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ
１０〜２００μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン
【００８７】
ＤＭ‐Ｅ
ベース ウィリアムズＥ（フェノールレッド不含）
１〜２×／５００ｍｌ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（登録商標）
０．５〜２％ グルタマックス
０．５〜５ｇ／ｌ Ｄ‐ガラクトース
０．５〜５ｇ／ｌ Ｄ‐ソルビトール
１〜２５ｎｇ／ｍｌ オンコスタチンＭ
０．５〜１０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ
０．５〜１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ
０．０５〜２μＭ デキサメタゾン
１０〜２００μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン
０．１５〜５μＭ ｒｈｏキナーゼ阻害剤、例えばＢＩＯ
【００８８】
０．５〜１０日間、例えば２日間、にわたり細胞を培養してもよい、ＩＤＭ‐Ａ
ＲＰＭＩ １６４０（＋０．０１％〜５％ＰＥＳＴ、＋０．１〜１０％グルタマックス）
０．５〜２× Ｂ２７
１０〜２００ｎｇ／ｍｌ アクチビンＡ
０．１〜１０ｍＭ ＮａＢ
【００８９】
１〜１０日間、例えば５日間、にわたり細胞を培養してもよい、ＩＤＭ‐Ｂ
ＲＰＭＩ １６４０（＋０．０１％〜５％ＰＥＳＴ、＋０．１〜１０％グルタマックス）
０．５〜２× Ｂ２７
１０〜２００ｎｇ／ｍｌ アクチビンＡ
０．１〜８ｍＭ ＮａＢ
【００９０】
１〜１０日間、例えば３日間、にわたり細胞を培養してもよい、ＰＭ‐Ａ
ＲＰＭＩ Ａ（＋０．０１％〜５％ＰＥＳＴ、＋０．１〜１０％グルタマックス）
１０〜２００ｎｇ／ｍｌ ａＦＧＦ
０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ
５〜２５０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ２
２０〜５００ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４
０．０２〜５％ ＦＢＳ
【００９１】
１〜１０日間、例えば２日間、にわたり細胞を培養してもよい、ＶＨＭ‐Ａ
ＶｉｔｒｏＨＥＳ
０．１〜１０％ ＤＭＳＯ
【００９２】
１〜２０日間、例えば７日間、にわたり細胞を培養してもよい、ＶＨＭ‐Ｂ
ＶｉｔｒｏＨＥＳ
０．２〜２０％ ＤＭＳＯ
【００９３】
１〜３０日間、例えば２０日日間、にわたり細胞を培養してもよい、ＭＭ‐Ａ
ＷＭＥ＋ＳＱ（−ＧＡ１０００）（＋１％グルタマックス＋０．１％ＰＥＳＴ）
１〜１００ｎｇ／ｍｌ ＯｓＭ
０．０１〜１５μＭ ＤｅｘＭ
２〜５０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ
０．１〜３％ ＤＭＳＯ
０．１５〜５μＭ ｒｈｏキナーゼ阻害剤、例えばＢＩＯ
【００９４】
（ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（登録商標）は、独自（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）濃度の、ｈＥＧＦ、トランスフェリン、ヒドロコルチゾン、ＢＳＡ、アスコルビン酸、インスリンからなる）
【００９５】
略語
ＡＡ；アクチビンＡ
アルブミン（ＡＬＢ）
アルファ‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）
胚体内胚葉（Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ；ＤＥ）
ＦＢＳ；ウシ胎仔血清
ＦＧＦ２；繊維芽細胞成長因子２
繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）
フォークヘッドボックスＡ２（Ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ａ２；ＦＯＸＡ２）
肝細胞核因子４、アルファ（ＨＮＦ４Ａ）
ｈＰＳ；ヒト多能性幹細胞
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）
ＫＯ‐ＳＲ；ノックアウト血清代替物（ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）。
【００９６】
定義
本明細書で用いられているように、「ヒト多能性幹細胞」（ｈＰＳ）は、任意の源に由来していてもよい細胞であって、かつ、適切な条件下で、３胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）すべての派生物である種々の細胞型のヒト子孫を産生することができる細胞を指す。ｈＰＳ細胞は、８〜１２週齡のＳＣＩＤマウスにおいて奇形腫を形成する能力および／または組織培養において三胚葉すべての識別可能な細胞を形成する能力を有していてもよい。ヒト多能性幹細胞の定義には、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を含む様々な種類の胚細胞（例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｊ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９８）、Ｈｅｉｎｓ， Ｎ． ｅｔ．ａｌ． （２００４）を参照のこと）、ヒト胚盤胞由来幹（ｈｕｍａｎ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ；ｈＢＳ）細胞、ならびに、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）［例えば、Ｙｕ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， （２００７）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ． ｅｔ ａｌ． （２００７）を参照のこと］が包含される。本明細書に記載の種々の方法および他の実施形態は、種々の源に由来するｈＰＳ細胞を必要とするものであってもよく、または様々な源に由来するｈＰＳ細胞を利用するものであってもよい。例えば、使用に適したｈＰＳ細胞は、発生中の胚から得てもよい。加えて、または、あるいは、適したｈＰＳ細胞は、樹立細胞株および／またはヒト人工多能性幹（ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ；ｈｉＰＳ）細胞から得てもよい。
【００９７】
本明細書で用いられているように、「胚盤胞由来幹細胞」という語は、ＢＳ細胞と表され、ヒトでは「ｈＢＳ細胞」または「ｈＢＳＣ」と称される。文献中では、この細胞は、しばしば、胚性幹細胞、また、より具体的には、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ細胞またはｈＥＳＣ）と称される。よって、本発明において用いられる「多能性幹細胞」は、例えばＷＯ０３／０５５９９２およびＷＯ２００７／０４２２２５において記載されているような、胚盤胞から調製された胚性幹細胞であってもよく、または、市販のｈＢＳ細胞または細胞株であってもよい。
【００９８】
本明細書で用いられているように、「ｈｉＰＳ細胞」または「ｈｉＰＳＣ」は、ヒト人工多能性幹細胞を指す。
【００９９】
さらに、ｈＰＳ細胞の例は、例として、精巣から単離される、ヒト成人生殖系細胞が挙げられる（Ｃｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ． ２００８；Ｋｏｓｓａｃｋ ｅｔ ａｌ． ２００８；Ｇａｌｌｉｃａｎｏ ｅｔ ａｌ． ２００９）。これらの細胞は、次のような、ｈＥＳＣに類似した特徴を呈する：それらは、多能性マーカーＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＳＳＥＡ‐４、ＴＲＡ１‐８１、およびＴＲＡ１‐６０を発現するものであり、また、高いテロメラーゼ活性を示したものであり、また、正常な核型を維持したまま４０回以上（ｍｏｒｅ ｔｈｅｎ ４０）にわたり継代培養することが可能であり得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、それらを、三胚葉すべての、様々な種類の体細胞へと分化させることが可能であり、また、それらは、免疫不全マウス中に移植された場合に奇形腫を形成し得る。最近では、肝細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）因子の導入により、体細胞を、多能性細胞、いわゆる人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｉＰＳＣ）、へとリプログラミングすることができる、とのことも実証されている。まず、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＣ‐ＭＹＣのレトロウィルス媒介性導入を用いたマウス尾端からの繊維芽細胞における多分化能の誘導が示された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． ２００６）。さらなる報告により、４つの転写因子、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８、または、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＣ‐ＭＹＣ、の組み合わせ発現が、ヒト胎児包皮または成人ヒト皮膚繊維芽細胞を多能性細胞へとリプログラミングするのに十分であることが実証された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． ２００７）。これらのヒトｉＰＳＣは、その形態学的性質および遺伝子発現の性質により、ヒト胚性幹細胞に似ている。ｉＰＳＣは、正常な核型を有し、テロメラーゼ活性を発現し、ヒトＥＳ細胞を特徴づける細胞表面メーカー（ｍａｋｅｒ）および遺伝子を発現し、ならびに、免疫不全マウス中へと移植された場合の奇形腫形成を含む３種類の一次胚葉すべての進行した派生物へと分化する発生上の潜在能力を維持する。
【０１００】
本明細書で用いられているように、「胚体内胚葉（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ；ＤＥ）」および胚体内胚葉細胞（ＤＥ細胞）は、これらに限定されるものではないが、例えば、胚体内胚葉の細胞に典型的な、タンパク質もしくは遺伝子の発現、およびもしくは／もしくは、形態など、を呈する細胞、または、胚体内胚葉の細胞に似たかなりの数の細胞を含む組成物、を指す。
【０１０１】
本明細書で用いられているように、「肝前駆体」または「肝前駆細胞」は、これらに限定されるものではないが、マーカー、例えば、胚体内胚葉の細胞に典型的な、タンパク質もしくは遺伝子の発現、および／もしくは、形態など、を呈する細胞、または、肝前駆体の細胞に似たかなりの数の細胞を含む組成物を指す。
【０１０２】
本明細書で用いられているように、「肝細胞様細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ；ＨＣＬＣ）」は、少なくともいくつかの成熟肝マーカー、例えばアルブミン、ＣＹＰ３Ａ４、ＵＧＴ２Ｂ７、ＯＡＴＰ‐２、ＡＤＨ１Ａ、ＵＧＴ１Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９およびＣＹＰ２Ｄ６など、を発現している細胞型を意味するよう意図されたものである。
【０１０３】
本明細書で用いられているように、「組織様３Ｄ構造」という語は、多能性出発物質由来の、ｉｎ ｖｉｔｒｏで導かれた３Ｄ（３次元）構造を意味するよう意図されたものである。
【０１０４】
本明細書で用いられているように、「肝組織様３Ｄ構造」という語は、肝臓器様組織に似た、ｉｎ ｖｉｔｒｏで導かれた組織を意味するよう意図されたものである。
【０１０５】
本明細書で用いられているように、フィーダー細胞は、単独でまたは組み合わせて用いられる支持細胞型を意味するよう意図されたものである。さらに、この細胞型は、ヒト由来のものであってもよく、または、他の種由来のものであってもよい。当該フィーダー細胞が由来し得る組織としては、胚組織、胎児（胎仔）組織、新生児（新生仔）組織、幼若組織または成人（成体）組織が挙げられ、また、さらには、包皮を含む皮膚、臍帯、筋肉、肺、上皮、胎盤、卵管、腺、間質（ｓｔｒｏｍａ）または胸に由来する組織が挙げられる。当該フィーダー細胞は、ヒト繊維芽細胞、線維細胞、筋細胞、ケラチノサイト、内皮細胞および上皮細胞からなる群に属する細胞型由来であってもよい。フィーダー細胞を導き出すために用いることができる具体的な細胞型の例としては、胚繊維芽細胞、胚体外内胚葉細胞、胚体外中胚葉細胞、胎児（胎仔）繊維芽細胞および／または線維細胞、胎児（胎仔）筋肉細胞、胎児（胎仔）皮膚細胞、胎児（胎仔）肺細胞、胎児（胎仔）内皮細胞、胎児（胎仔）上皮細胞、臍帯間葉系細胞、胎盤繊維芽細胞および／または線維細胞、胎盤内皮細胞が挙げられる。
【０１０６】
本明細書で用いられているように、「ｍＥＦ細胞」または「ＭＥＦ細胞」という語は、マウス胚繊維芽細胞を意味するよう意図されたものである。
【０１０７】
本明細書で用いられているように、「ＣＹＰ」は、シトクロムＰ、および、より具体的には、例えばＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６／２Ａ７／２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７およびＣＹＰ７Ａ１などの、多種多様なアイソエンザイムを構成する肝臓の主要な第Ｉ相代謝酵素であるシトクロムＰ４５０、を意味するよう意図されたものである。
【０１０８】
本明細書で用いられているように、「ＲＯＣＫ阻害剤」という語は、例えばＹ‐２７６３２またはファスジルなどの、Ｒｈｏ‐キナーゼの小分子阻害剤を意味するよう意図されたものである。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】表１には、行なった実験Ｈｅｐｄｉｆｆ１およびＨｅｐｄｉｆｆ２ならびにそれらの実験条件を記載する。
【図２】表２は、バイオリアクターにおいてｈＥＳＣの肝分化を誘導するために用いる培地の順序および組成の概要を示す。
【図３】表３は、バイオリアクターＢＲ１における、ｈＥＳＣの、肝細胞への成熟を示す；Ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ ２ｍｌバイオリアクター、流速 ２ｍｌ／時間＝５０ｍｌ／日／ＢＲ＝１日当たり１００ｍｌ。細胞：ＳＡ１２１ ＤＥＦ、前駆体ステージ１２における播種。ピンク色の段階：ＤＥ（胚体内胚葉）の誘導、緑色の段階：前駆体ステージ（小さい肝細胞様細胞）、青色の段階：成熟
【図４】表４は、バイオリアクターＢＲ２およびＢＲ３における、ｈＥＳＣの、肝細胞への成熟を示す；Ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ ２ｍｌバイオリアクター、流速 ２ｍｌ／時間＝５０ｍｌ／日／ＢＲ＝１日当たり１００ｍｌ。細胞：ＳＡ１２１ ＤＥＦ、第７日目（ＤＥステージ）および前駆体ステージ（第１２日目）における播種。ピンク色の段階：ＤＥ（胚体内胚葉）の誘導、緑色の段階：前駆体ステージ（小さい肝細胞様細胞）、青色の段階：成熟
【図５】表５は、バイオリアクターＢＲ１２１およびＢＲ１６８における、ｈＥＳＣの、肝細胞への成熟を示す；Ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ ２ｍｌバイオリアクター、流速 ２ｍｌ／時間＝５０ｍｌ／日／ＢＲ＝１日当たり１００ｍｌ。細胞：ＳＡ１２１ ＤＥＦ、前駆体ステージ１２における播種。ピンク色の段階：ＤＥ（胚体内胚葉）の誘導、緑色の段階：前駆体ステージ（小さい肝細胞様細胞）、青色の段階：成熟
【図６】表６は、実施例１９で用いた培養培地およびインキュベーション時間の概略図を示す。
【図７】図１はバイオリアクター設計を示す。Ａ）培地灌流（青色、ＩＩ；赤色、ＩＶ）、酸素添加（黄色、ＩＩＩ）および細胞収容（Ｉ）のための、独立した区画を有する、最小キャピラリー膜ユニット；Ｂ）これらの区画を構成するキャピラリー膜の束；Ｃ）細胞区画内の、それらキャピラリー／区画の３Ｄ配列；これら区画は、Ｂに示されているように、別々に灌流することができ、これにより、キャピラリーユニット間の物質勾配の隔たりの減少に対処し、かつ、物質交換（ｍａｓｓ ｅｘｃｈａｎｇｅ）を亢進する。すべての膜区画は細胞区画内で互いに織り合わされ、それにより、平均して５００μｍのキャピラリー間距離を有する緊密なキャピラリーネットワークが形成される（Ｃ）。各区画のキャピラリーは、インおよびアウトフローヘッドへと束ねられ、それぞれ、灌流のためのチューブシステムへと接続される（Ｂ）。細胞は、開口端（ｏｐｅｎ ｅｎｄｉｎｇ）チューブを介して細胞区画中へ播種され、これにより、その注入された細胞の細胞区画内での分布が可能となる（Ｂ、ｄ；灰色で示されている）。
【図８】図２は灌流システムを示す。Ａ）培地の再循環および置換のための交換可能なマルチチャンネルフローヘッドおよびギアを備えたモジュラーポンプに対する圧力および流速の制御を備えたプロセッサ制御式灌流装置ならびに外部自動ＣＯ２制御式ｐＨ制御システム（左）。Ｂ）圧力、温度、ポンプスピード、ｐＨおよびガスフローを継続的に記録し、グラフでモニタリングする、カスタムモニタリングソフトウェア。Ｃ）バイオリアクターを培地およびガスで灌流するために用いたチューブシステムの模式図
【図９】図３は、３つの別々の培養ディッシュにおいて示される、分化したｈＥＳＣの２Ｄ培養物中のβ‐ＨＧＣ濃度を示す。培養ディッシュ１は、培養第３０日目時点で最も低い曲線により表され、培養ディッシュ２は、培養第３０日目時点で真ん中にある曲線で表され、培養ディッシュ３は、培養第３０日目時点で最も高い曲線で表されている。
【図１０】図４は、バイオリアクターｈＥＳＣ‐１、‐２および‐３の培地アウトフローにおいて測定した代謝パラメータの経時変化を示す。バイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐２（ａ）およびＨｅｐＤｉｆｆ‐１（ｂ）中の細胞による、グルコース消費（緑色、測定開始時点での最も低い曲線）、乳酸塩産生（赤色、測定開始時点で真ん中の曲線）およびＬＨＤ放出（青色、測定開始時点での最も高い曲線）。
【図１１】図５は、バイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐１および‐２の培地アウトフローにおいて測定した分化マーカーの経時変化を示す。バイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐１（ａ）およびＨｅｐＤｉｆｆ‐２（ｂ）中の細胞による、ＡＦＰ産生（濃青色、第５０日目時点で真ん中）、アルブミン産生（濃緑色、第５０日目時点での最も高い曲線）および尿素産生（ピンク色、第５０日目時点での最も低い曲線）。
【図１２】図６は、培地において測定したアクチビンＡおよびインスリンの濃度の経時変化ならびにバイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐１および‐２におけるシトクロム活性測定を示す。（ａ）アクチビンＡ濃度（ピンク色、点線および実線、第２０日目時点での最も高い曲線）、インスリン濃度（青緑色、第２０日目時点での最も低いもの）
【図１３】図７は、分化の最中に発現し、いくつかの時点（第０日目、第１２日目、バイオリアクター第２６日目、２Ｄ対照第２６日目）においてモニタリングされた肝マーカー遺伝子（アルブミン、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ７Ａ１、ＴＡＴおよびＵＧＴ２Ｂ７）のヒストグラムを示す。
【図１４】図８は、分化の最中に発現し、いくつかの時点（第０日目、第１２日目、バイオリアクター第２６日目、２Ｄ対照第２６日目）においてモニタリングされた胎児／未成熟肝細胞に対するマーカー（ＡＦＰ、ＣＹＰ３Ａ７）のヒストグラムを示す。
【図１５】図９は、分化の最中に発現し、いくつかの時点（第０日目、第１２日目、バイオリアクター第２６日目、２Ｄ対照第２６日目）においてモニタリングされた肝トランスポーター遺伝子（ＡＢＣＣ２／ＭＲＰ２、ＦＡＢＰ１、ＯＡＴＰ２、ＯＣＴ‐１）のヒストグラムを示す。
【図１６】図１０は、分化の最中に発現し、いくつかの時点（第０日目、第１２日目、バイオリアクター第２６日目、２Ｄ対照第２６日目）においてモニタリングされた、未分化細胞に対するマーカー遺伝子（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４）のヒストグラムを示す。
【図１７−１】図１１は、異なる時点において２つの異なるバイオリアクター（１２１または１６８）へと播種された細胞の肝遺伝子発現プロファイルを示す４つのヒストグラム（Ａ〜Ｄ）を示す。１に等しい値を有する参照試料は、２Ｄ培養により得た細胞の遺伝子発現を表す。
【図１７−２】図１１は、異なる時点において２つの異なるバイオリアクター（１２１または１６８）へと播種された細胞の肝遺伝子発現プロファイルを示す４つのヒストグラム（Ａ〜Ｄ）を示す。１に等しい値を有する参照試料は、２Ｄ培養により得た細胞の遺伝子発現を表す。
【図１８】図１２は、バイオリアクターＢＲ１２１およびＢＲ１６８における細胞の分化および成熟の最中の、未分化細胞のマーカー（Ｏｃｔ４およびＮＡＮＯＧ）のダウンレギュレーションを示すヒストグラムを示す。１に等しい値を有する参照試料は、２Ｄ培養により得た細胞の遺伝子発現を表す。
【発明を実施するための形態】
【０１１０】
実施例１
ヒト包皮繊維芽細胞（ＨＦＦ）の培養
ＨＦＦは、Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入し（ＣＲＬ‐２４２９；米国バージニア州マナッサス）、４４回以下の集団倍加の間、グルタマックス‐１（インビトロジェン社）、１０％ 子ウシ胎仔血清および１０，０００Ｕ／１０，０００μｇ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシン（すべてＢｉｏｃｈｒｏｍ社、ドイツ ベルリン）を含有するイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中に広げた。その細胞を、３０００ラドのガンマ線照射により不活性化し、１０ｎｇ／ｍｌ ヒト組換え塩基性繊維芽細胞成長因子（ｈｒｂＦＧＦ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃ社）を添加したＶｉｔｒｏＨＥＳ培地（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ ＡＢ社、スウェーデン イェーテボリ）中、または、２０％ ノックアウト血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｒ）、２ｍＭ グルタマックス‐Ｉ（すべてインビトロジェン社）、０，１ｍＭ 非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、５０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン（すべてＢｉｏｃｈｒｏｍ社）、０．１ｍＭ β‐メルカプトエタノール（シグマ社）、１０ｎｇ／ｍｌ ｈｒｂＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃ社、英国ロンドン）を含有するノックアウトＤＭＥＭ中、１ｃｍ２当たり３０，０００〜７０，０００個ＨＦＦの密度で、０．１％ ゼラチン（シグマアルドリッチ社）でコートした培養ディッシュ上に蒔いた。すぐに使用しない照射細胞は、分注して、１０％ ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（シグマアルドリッチ社）を含有する子ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社）中に凍結し、後で使用するために−１５２℃に保存した。
【０１１１】
実施例２
マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）の培養
ＭＥＦを、２回〜最大４回までの継代の間、１０％ 子ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ‐グルタミン、０．１ｍＭ ＮＥＡＡおよび１０，０００Ｕ／１０，０００μｇ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシン（すべてＢｉｏｃｈｒｏｍ社）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に広げた。３０００ラドのガンマ線照射により不活性化し、ＶｉｔｒｏＨＥＳ培地（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ社）中、６５，０００細胞／ｃｍ２の密度で、０．１％ ゼラチン（シグマアルドリッチ社）でコートした「体外受精（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」（ＩＶＦ）ディッシュ（ファルコン、ベクトン・ディッキンソン社）に播くか、または、分注して、１０％ ＤＭＳＯ（シグマアルドリッチ社）を含有する子ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社）中に凍結し、後で使用するために−１５２℃に保存した。
【０１１２】
実施例３
バイオリアクター
本研究に用いた多区画バイオリアクターは、１つの二液型ポリウレタンハウジング（ＰＵＲ、Ｍｏｒｔｏｎ社、ドイツ ブレーメン）中へと組み込まれる、３つの、独立しているが織り合わされている中空繊維キャピラリー膜システムで構成されている。培地灌流用の２つの親水性キャピラリーシステムは、およそＭＷ５００，０００の分子量カットオフを有する微多孔性ポリエーテルスルホンキャピラリー膜（ｍＰＥＳ、Ｍｅｍｂｒａｎａ社、ドイツ ヴッパータール）でできている。３つ目のものは、ガス交換を可能にするために、疎水性マルチラミネート中空繊維膜キャピラリー（ＭＨＦ、三菱、日本国東京）でできている。よって、キャピラリー外スペース内に位置する細胞は高物質交換率の分散培地供給と拡散による直接膜酸素添加とに暴露される。細胞の注入には、フローヘッドおよび開口端（ｏｐｅｎ ｅｎｄｉｎｇ）シリコーンゴムキャピラリー（Ｓｉｌａｓｔｉｃ、ダウコーニング社、米国ニューヨーク州）を用いる（図１Ａ、ＢおよびＣ）。バイオリアクターは、培地の再循環および置換のための交換可能なマルチチャンネルフローヘッドおよびギアを備えたモジュラーポンプに対する圧力および流速の制御を備えた、１つのプロセッサ制御式灌流装置中へと組み込まれる（図２ＡおよびＣ）。加熱ユニットにより、灌流回路内の一定温度がもたらされる。空気およびＣＯ２の流速は、いずれも、組み込まれたロータメーターを用いて手動で制御するか、または、外部自動ＣＯ２制御式ｐＨ制御システムを用いることにより制御した（図２）。当該制御装置は、バイオリアクター灌流回路中に組み込まれた光学ｐＨセンサー経由で、培養培地のｐＨ値を連続的に測定し、また、空気／ＣＯ２混合物を調整して、予め設定したｐＨを維持する。バブルトラップを備えた灌流チューブ（図２Ｃに示されている）は、標準的な医療グレードの透析ＰＶＣ（ビー・ブラウン社、ドイツ メルズンゲン）から作製された。滅菌は、エチレンオキシドまたはホルムアルデヒドガスを用いて行ない、その後、少なくとも７日間の脱気期間を設けた。この実験の間、灌流装置は、組み込まれたＵＳＢポートを介してＰＣに接続し、また、ＬａｂＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ドイツ ミュンヘン）で作成されたスタンドアロンの測定プログラムを用いて、灌流パラメータ（圧力、温度、ポンプスピード）を、継続的に記録し、グラフでモニタリングした。このプログラムは、インターネット経由での遠隔モニタリングを可能にするウェブサーバーも提供する（図２Ｃ）。
【０１１３】
実施例４
バイオリアクター調整
最初の細胞播種の前に、バイオリアクターは、培地の再循環による２４〜７２時間の調整段階を経た。細胞播種後、培養物を、２２〜３０ｍｌ／分の流速で灌流した。このバイオリアクターを３７℃で保った。ガス区画中の空気／ＣＯ２混合物の流速を４０ｍｌ／分で維持した。ｐＨ、酸素の分圧（ｐＯ２）および二酸化炭素の分圧（ｐＣＯ２）ならびに酸／塩基状態を定期的に測定した（ＡＢＬ５、Ｒａｄｉｏ Ｍｅｔｅｒ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク コペンハーゲン）。手動ガス制御の場合には、空気／ＣＯ２混合比を、７．２〜７．３の間の安定したｐＨを維持するために調整した。これら実験の全体を通じて生じた代謝および灌流のデータの、オンラインでの保存、アクセスおよび分析を可能にするために、データベースを開発した。
【０１１４】
実施例５
バイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐１およびＨｅｐＤｉｆｆ‐２におけるｈＥＳＣの肝分化
方向性のある肝分化について調べるために、２つの最初のバイオリアクター作動を行なった。一方の実験においては、ｈＥＳＣ播種の２日前に、バイオリアクターに不活性化ＭＥＦを播いたが、もう一方は、フィーダー細胞の添加をせずに行なった（表１および表２参照）。ｈＥＳＣの肝分化を誘導するために、バイオリアクターを、５種類の異なる培地（ＤｉｆｆＭｅｄ１〜５、表２）で、出願人が開発した分化プロトコルに基づいて、連続的に灌流した。培地の順序、組成および灌流回路への新鮮培地添加速度についての概要を表２に示す。
【０１１５】
実施例６
灌流培地における代謝パラメータ
これらバイオリアクターの内側の細胞の代謝活性および分化は、培地アウトフロー中および再循環培地中の可溶性因子を測定することにより、毎日、特徴決定を行なった。自動臨床化学分析装置（ロシュ・ダイアグノスティックス社、ドイツ ハイデルベルク）を用いて、以下のパラメータを測定した：α‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、ベータ‐ヒト絨毛性ゴナドトロピン（β‐ｈＣＧ）、ｃ‐ペプチド、胎児性癌抗原（ＣＥＡ）、サイトケラチンフラグメント１９（Ｃｙｆｒａ２１‐１）、エリスロポエチン、エストラジオール、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、第ＩＩ‐Ｖ‐Ｘ‐ＸＩＩＩ因子、フィブリノーゲン、ガンマ‐グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、グルコース、乳酸塩、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、黄体形成ホルモン、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、重量オスモル濃度（ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ）、オステオカルシン、偽コリンエステラーゼ（ＰＣＨＥ）、プレアルブミンプロゲステロン、プロラクチン、Ｓ‐１００、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、トランスフェリン（測定方法の詳細な説明については、添付文書中の表８を参照のこと）。加えて、グルタミン、グルタミン酸塩、グルコース、乳酸塩、アンモニウム、ｐＨ、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）を、ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ １００ Ｐｌｕｓ装置（ノバ・バイオメディカル社、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて測定した。アクチビンＡ、インスリンおよびアルブミンは、酵素結合免疫吸着測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）を用いて、メーカーの推奨に従って（アクチビンＡは、ドイツ ヴィースバーデン‐ノルデンシュタットの、Ｒ＆Ｄシステムズ社からの製品ＤＹ３３８、ＤＹ９９９、ＤＹ９９４、ＤＹ９９５を用いて、；インスリンは、インビトロジェン社からのＥＬＩＳＡを用いて、；アルブミンは、米国ペンシルベニア州フィラデルフィアのエクソセル社、ＡｌｂｕｗｅｌｌからのＥＬＩＳＡを用いて）、測定した。尿素は、比色定量キット（ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ、バイオアッセイシステムス社、米国カリフォルニア州ヘイワード）を用いて測定した。ガラクトースおよびソルビトールの濃度は、酵素アッセイ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）により測定した。
【０１１６】
各物質の産生または消費率は、その日の実際の廃棄体積に、供給培地中の物質濃度と廃棄培地中の物質濃度との間の差を掛けることにより、バイオリアクター毎に１日毎に算出した。
【０１１７】
実施例７
代謝活性
当該肝分化プロトコルで処理したバイオリアクター培養物を試験するか、または、その、フェナセチン、ジクロフェナクおよびミダゾラムを、それぞれ、第Ｉ相シトクロム（ＣＹＰ）Ｐ４５０酵素ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ３Ａ４経由で代謝する能力を試験した。細胞の播種後の第４０日目および第４７日目に、以下のスキームに従って、ＣＹＰ Ｐ４５０活性試験を行なった：
ＣＹＰ１Ａ２： フェナセチン −＞ アセトアミノフェン
ＣＹＰ２Ｃ９： ジクロフェナク −＞ ４’ＯＨ ジクロフェナク
ＣＹＰ３Ａ４： ミダゾラム −＞ １’ＯＨ ミダゾラム
【０１１８】
この目的のために、新鮮培地インフローおよび培地アウトフローを閉じ、また、試験物質のカクテルを再循環培地中へと注入して、試験開始時に以下の濃度を得た：３μＭのミダゾラム、９μＭのジクロフェナクおよび２６μＭのフェナセチン。次の２４時間の間、バイオリアクターを再循環モード（新鮮培地は添加されず、培地再循環ポンプのみが培地を再循環させる）で作動させた。再循環からの試料を、実験開始前と、１、４、８および２４時間後とに採取し、試験物質の代謝産物について、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）により分析した。分析は、スウェーデン イェーテボリのアストラゼネカ社にて行なわれた。最後の試料を採取した後に、当該バイオリアクターは、新鮮培地を用いてシングル・パス・モードで、バイオリアクターおよびチューブシステムの体積の２倍を用いて洗い流し、その後、新鮮培地インフローを伴うノーマル灌流モード再循環へと切り替えた）。
【０１１９】
実施例８
バイオリアクターからの試料取得
予定された培養期間の終わりに、バイオリアクターをシャットダウンし、チューブを外した。低い方のバイオリアクターのフタを開け、キャピラリー層を含む細胞塊の試料を、滅菌したメスおよびピンセットを用いてさらなる分析用に切り出した。組織学的分析のために、試料は、すぐに、後述のように固定し、包埋した。奇形腫試験、ＦＡＣＳおよびＲＮＡ分析のために、細胞を、キャピラリーから分離し、ＣａＭｇを含有しないＰＢＳでの洗浄、および、０．０５％〜０．０２％のトリプシン‐ＥＤＴＡ溶液（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社）中での３分間のインキュベーションによりバラバラにした。トリプシン処理（ｔｒｙｐｓｉｎａｔｉｏｎ）は、１０％子ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社）を含有するＤＭＥＭの添加により停止させた。細胞溶液からのキャピラリーの分離は、１００μｍセルストレーナー（ファルコン、ベクトン・ディッキンソン社、ハイデルベルク）を用いてふるい分けることにより達成した。
【０１２０】
実施例９
ＲＮＡの単離
バイオリアクター中で培養した細胞／組織からＲＮＡを単離するために、切り出したキャピラリーは、ＣａＭｇを含有しないＰＢＳで洗浄し、０．０５％〜０．０２のトリプシン‐ＥＤＴＡ溶液（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社）中で３分間インキュベートした。ＲＮｅａｓｙキット（キアゲン社、ドイツ ヒルデン）を用いてメーカーのプロトコルに従い、全ＲＮＡを単離した。奇形腫は、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩを用い、その後、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒでホモジナイゼーションを行なうことにより、粉砕した（いずれもキアゲン社）。個々の細胞は、細胞ペレットへの溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）の直接の添加により溶解させた。この単離したＲＮＡの濃度および品質は、ナノドロップ分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、かつ、バイオアナライザ（アジレント２１００バイオアナライザ）で、または、未変性（ｎａｔｉｖｅ）アガロースゲル電気泳動により、決定した。
【０１２１】
実施例１０
アレイハイブリダイゼーション
ビオチン標識ｃＲＮＡは、投入（ｉｎｐｕｔ）として３００ｎｇの品質チェック済み全ＲＮＡを用い、イルミナ（登録商標）ＴｏｔａｌＰｒｅｐ ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社、米国テキサス州オースティン）を用いて作成した。チップハイブリダイゼーション、洗浄、Ｃｙ３‐ストレプトアビジン（アマシャム バイオサイエンス社）染色、およびスキャニングは、Ｂｅａｄ Ｓｔａｔｉｏｎ ５００（イルミナ社、サンディエゴ、米国）プラットホーム上で、メーカーにより供給されたプロトコルに従い、試薬を用いて行なった。ｃＲＮＡ試料は、およそ２４，０００種類のＲｅｆＳｅｑ転写産物を搭載したイルミナ ヒト‐８ｖ２ ＢｅａｄＣｈｉｐ上にハイブリダイズさせた（Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ． ２００４）。
【０１２２】
実施例１１
データ解析
すべての試料に対する、分位（ｑｕａｎｔｉｌ）正規化および非正規化ＲＡＷデータファイルは、ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏ Ｖ３ソフトウェア（イルミナ社）を用いて作成した。ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏソフトウェアで作成したデータを、マイクロアレイデータ解析ツールＭｕｌｔｉＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｖｉｅｗｅｒ（ＭｅＶ）、マイクロアレイ分析ツールのＴＭ４スイート（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｍ４．ｏｒｇ）の一コンポーネント（Ｓａｅｅｄ ｅｔ ａｌ． ２００３）、または、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． ２００４）をその分析バックエンド（ａｎａｌｙｓｉｓ ｂａｃｋｅｎｄ）として用いるグラフィカル・インターフェースであるＣｈｉｐｓｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｃｈｉｐｓｔｅｒ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）、へとインポートすることにより、さらなるデータ解析を行なった。機能エンリッチメント解析（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）は、ＤＡＶＩＤ（ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ）を用いて行なった（Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ． ２００３）。
【０１２３】
実施例１２
組織化学
パラフィン包埋試料を、４％緩衝ホルムアルデヒド溶液中で固定し、パラフィン中に包埋し、切って、５μｍの切片にした。切片を、キシレンで脱パラフィンし、段階的に減少するアルコール（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ａｌｃｏｈｏｌ ｓｅｒｉｅｓ）を用いて再水和させ、その後、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行なった。
【０１２４】
実施例１３
免疫組織学
パラフィン包埋試料を、４％緩衝ホルムアルデヒド溶液中で固定し、パラフィン中に包埋し、切って、５μｍの切片にした。切片を、キシレンで脱パラフィンし、段階的に減少するアルコール（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ａｌｃｏｈｏｌ ｓｅｒｉｅｓ）を用いて再水和させた。抗原は、切片を圧力釜にてクエン酸緩衝液（０．０１ クエン酸一水和物、ｐＨは６．０まで；メルク社、ドイツ ダルムシュタット）中で２５分間ボイルすることにより、賦活化（ｒｅｔｒｉｅｖｅ）し、その後、５％トリトン／ＰＢＳ中で２０分間のインキュベーションを行なった。切片を５％スキムミルクでブロッキングし、；それらを一次抗体と共に３０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、二次蛍光結合抗体と共にインキュベートした。以下の一次抗体を用いた：モノクローナルマウス抗ヒト平滑筋アクチンＩｇＧ２ａ（ＡＳＭＡ）、モノクローナルマウス抗ヒトデスミンＩｇＧ１（Ｄａｋｏ社、デンマーク グロストルプ）、モノクローナルマウス抗ニューロン特異的β‐ＩＩＩ‐チューブリンＩｇＧ２ａ（Ｒ＆Ｄシステムズ社）、モノクローナルマウス抗ネスチンＩｇＧ１（ベクトン・ディッキンソン社）、ポリクローナルヤギ抗ＨＮＦ‐３βＩｇＧ、モノクローナルマウス抗ＯＣＴ‐４ ＩｇＧ２ｂおよびポリクローナルウサギ抗ビメンチンＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）。二次抗体としては、以下のポリクローナル抗体を用いた：ヤギ抗マウスＩｇＧ‐Ｃｙ２、ヤギ抗ウサギＩｇＧ‐Ｃｙ３（Ｄｉａｎｏｖａ社）、ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ‐ＴＲＩＣＴ、ヤギ抗マウスＩｇＧ‐ＦＩＴＣ、ヤギ抗マウスＩｇＧ‐ＦＩＴＣ、ヤギ抗マウスＩｇＧ‐Ｃｙ３、ヤギ抗マウスＩｇＧ‐ＦＩＴＣ（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社、ペンシルベニア州ウェストグローブ）およびロバ抗ヤギＩｇＧ‐Ｃｙ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）。核の非特異的染色のために、切片を、４’，６‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドール（ＤＡＰＩ、モレキュラープローブ社、ドイツ ライデン）と共にインキュベートした。
【０１２５】
続いて、それら切片を、Ａｑｕａ Ｐｏｌｙｍｏｕｎｔ溶液（ポリサイエンス社、米国ペンシルベニア州ウォリントン）を用いてマウントした。切片は、ＣＣＤカメラ（Ｒｅｔｉｇａ ２０００Ｒ、ＱＩｍａｇｉｎｇ社、カナダ バーナビー）を備えた倒立顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ、カールツァイス社、ドイツ ゲッティンゲン）を用いて分析した。写真を取得し、デジタルイメージングソフトウェア「Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ」（メディアサイバネティクス社、米国シルバースプリング）を用いて処理した。
【０１２６】
実施例１４
透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）
バイオリアクター細胞区画由来の物質を５％グルタルアルデヒド（Ｓｅｒｖａ社、ドイツ ハイデルベルク）で固定した。６０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液、ｐＨ７．３中での３０分間の浸漬後、細胞の凝集体を、２時間にわたり、２％ ＯｓＯ４（Ｐａｅｓｅｌ＋Ｌｏｒｅｉ社、ドイツ フランクフルト）中で後固定し、エタノール中で段階的に脱水し、次いで、アラルダイト（Ｓｅｒｖａ社、ドイツ ハイデルベルク）中に包埋した。超薄切片は、電子顕微鏡検査前に、酢酸ウラニルおよびレイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄ’ｓ）クエン酸鉛（Ｃｈｒｏｍａ社、ドイツ ミュンスター）を用いてコントラストをつけた。
【０１２７】
実施例１５
バイオリアクターにおけるｈＥＳＣの、改善された肝分化
実施例５に記載した最初の肝分化作動からの結果に基づき、さらなる作動を行なって、方向性のある肝分化についてさらに調べた。
【０１２８】
１つの実験においては、フィーダーフリーで培養したｈＥＳＣは、本明細書に記載の分化プロトコルに従って、バイオリアクターの外側で、２Ｄ培養で、ＤＥへと分化させた。この、肝細胞の方向に向かうＤＥへの第一分化工程により、大量の細胞死が誘導される。この工程をバイオリアクターの外側で行なうことにより、当該リアクター中の過半の細胞残屑は回避される。加えて、当該第一分化工程を２Ｄで行なうことにより、胚体内胚葉細胞の、より純粋な選択が可能となり、これは、当該培養物中にかなりの量の胚体内胚葉細胞を伴う、全体的な、より純粋な培養につながる。
【０１２９】
ＤＥへの分化後、細胞を、バイオリアクターに移すか、または、対照として２Ｄ中にとどめた。胚体内胚葉細胞のさらなる肝分化を誘導するために、バイオリアクターを、種々の培地で、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ社が開発した分化プロトコルに基づいて、連続的に灌流した。培地の順序、組成および灌流回路への新鮮培地添加速度の一例についての概要を表２に示す。
【０１３０】
実施例１６
未分化ｈＥＳＣの培養のための、当該バイオリアクターシステムを用いた、調整培地の製造
本明細書において検討したようなバイオリアクター実験は、不活性ＨＦＦの存在は、それらＨＦＦがその活性を緩めるまで、ｈＥＳＣ分化の開始を遅らせる、とのことも示す。この、ＨＦＦの、多能性を支援する活性は、そのアクチビンＡの産生と相互に関係している可能性がある。ＨＦＦフィーダー細胞の挙動をさらに調べるために、ＨＦＦのみを用いたいくつかの実験を、２Ｄ培養において、および、２つのバイオリアクターにおいて、行なった。
【０１３１】
１つの実験においては、バイオリアクターには、活性ＨＦＦを播種するが、これは、ＨＦＦ増殖を刺激するべく血清およびｂＦＧＦを添加した培地で培養されることとなる。グルコース消費および乳酸塩産生のレベルにより、細胞数の増加をモニタリングする。十分な細胞数に達したときに、培養培地を、調整のためにｈＢＳ培地に変える。最適培地交換速度は、品質管理パラメータとして、例えば調整培地中のアクチビンＡおよびグルコースの濃度を測定して、決定されなければならない。低グルコースレベルは、培地供給速度を増加させることに対する要求を指し示している可能性があり、また、低アクチビンＡレベルは、ｈＥＳＣ多能性を促進するのに不適切な、不十分な調整に対するサインである可能性がある。
【０１３２】
２Ｄおよび３Ｄ実験からの結果が示すのは、アクチビンＡ産生は、血清代替物（ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｒ）を含有する培地と組み合わせたｂＦＧＦにより刺激される、ということである。血清を添加した培地では、ｂＦＧＦは、アクチビンＡ産生を刺激しなかったが、活性ＨＦＦに対する強い分裂促進作用を呈した。この作用は、培地へのｂＦＧＦの添加に際してグルコースおよび乳酸塩の代謝のレベルを上昇させることを特徴とする、バイオリアクター実験ＨＦＦ‐１においても観察された。この分裂促進作用は、血清代替物（ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を添加した培地を使用した、バイオリアクター実験ＨＦＦ‐２においては観察されなかった。この実験では、グルコースおよび乳酸塩の代謝は、細胞が増殖していないことを示す、ある一定のレベルに留まった。これらの結果は、当該バイオリアクター技術の、可能性のある用途は、未分化ｈＥＳＣをフィーダーフリーで広げるために必要な、調整培地の製造である可能性がある、とのことを示している。
【０１３３】
調整培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ；ＣＭ）の製造のための標準的な方法は、不活性ＭＥＦフィーダー細胞を高密度で播いた、標準的な培養容器内での、培養培地の、２４時間のインキュベーションである。単に、活性が緩まるまで、限られた時間の間、培地調整に用いることができるのみである、大量のフィーダー細胞を製造しなければならないため、この方法は、大きな労働力を要するものであり、かつ、スペースをとるものである。したがって、より大量のＣＭの製造は、この方法の、乏しいスケーラビリティ（ｓｃａｌａｂｉｌｉｔｙ）によって制限される。培養ｈＢＳ細胞のためのＣＭの使用に対する代替的アプローチは、明確になっている培養培地の使用である。ｈＥＳＣの、フィーダー非依存性培養に関し、いくつかの明確になっている培地調合物が記述されてきた（Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ２００５；Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ． ２００６）。明確になっている培地の使用には、ｈＢＳ細胞を、完全に動物由来物質がない条件下で培養することができる可能性、といったような、いくつかの利点がある一方で、これの主な欠点は、これらの培地調合物には、組換えサイトカインや成長因子といった、費用のかかるかなりの量の補助物質（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）が含まれる、ということである。
【０１３４】
ＣＭを製造するための、バイオリアクターにおけるＨＦＦの培養は、背景の章において上記で概説した、現在利用可能な方法（ｍｅｔｏｄ）に対する代替法となり得る。それにより、定められた速度の培地インおよびアウトフロー並びに培養パラメータの自動制御を可能にするような、スケーラブルなシステムにおける、高い細胞密度のヒトフィーダー細胞が可能となるであろう。したがって、調整プロセスの標準化が可能となり、結果として、手動による方法に比べ、製造されたＣＭの、向上した品質がもたらされることとなる。活性フィーダー細胞が、多能性の維持も支援している、とのことが示されている（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ． ２００５）ことから、当該バイオリアクターを用いる場合の、１つのさらなる利点は、活性フィーダー細胞を用いることができる可能性であり得る。これは、従来の２Ｄ培養では最初のバイオリアクター播種用に製造しなければならない、活性フィーダー細胞の数を減少させるであろう。
【０１３５】
実施例１７ 肝成熟の評価
誘導された肝細胞の成熟度は、遺伝子発現、タンパク質発現、の測定、および、同様に、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）活性の活性測定、により、分析した。
【０１３６】
Ｑ‐ＰＣＲおよびＬＤＡカードによる肝細胞様細胞の遺伝子発現解析
これらバイオリアクターにおいて分化した肝細胞様細胞、および、適切な対照（２Ｄ分化肝細胞様細胞、または、成人ヒト肝臓由来の初代肝細胞のいずれか）、の試料を、肝臓関連遺伝子の発現について、ＱＰＣＲにより分析した。
【０１３７】
ＤＥ‐Ｈｅｐ細胞の遺伝子発現は、ＬＤＡマイクロ流体（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｔｙ）カード上で以下表に列記されているように特徴決定した。試料の全ＲＮＡに由来するｃＤＮＡはＬＤＡカードとハイブリダイズさせ、当該実験はＰＣＲセットアップにおいて行ない、適切なソフトウェアを用いてさらに分析した。すべての試料は、インストラクターのマニュアル（アプライドバイオシステムズ ７９００ＨＴ Ｍｉｃｒｏ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｃａｒｄ Ｇｅｔｔｉｎｇ Ｓｔａｒｔｅｄ Ｇｕｉｄｅ）と、以下の短くしたプロトコルとに従い、ＬＤＡカード上で、繰り返し実験において、適切な対照と同時に作動させた：
【０１３８】
ｃＤＮＡは、全ＲＮＡから調製し、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー水中に希釈して、適切な濃度（以下参照）を得た。以下の成分を混合した：ｃＤＮＡ（１〜１００ｎｇ）、５μｌ、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリー水、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ、４５μｌ、マスターミックス（２×）、５０μｌ、合計：１００μｌ。その後、試料は、ＬＤＡカード上にロード（各試料混合物は１００ｕｌであり、１試料当たり１７０ｎｇのｃＤＮＡ）し、遠心し、その後、そのＬＤＡカードを密封した。最終的には、カードを、ＡＢＩ ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステム上でマニュアル中の指示に従って作動させ、結果は、ＳＤＳ２．２．１ソフトウェアおよび相対的定量方法を用いることにより分析した。
【０１３９】
実施例１８
肝分化
２Ｄ標準培養ディッシュ中で培養されるｈＥＳＣ用にＣｅｌｌａｒｔｉｓ社が確立した肝分化プロトコルに基づき、当該３Ｄバイオリアクターシステムにおける、ｈＥＳＣの、方向性のある肝分化に関する２つのパイロット実験を設計し、実施した。この２つのバイオリアクター実験は、不活性化ＭＥＦの、バイオリアクターのうちの１つの中へのさらなる播種についてのみ異なるものであった。
【０１４０】
灌流培地における代謝パラメータ
当該培地において測定された代謝パラメータに関する２つのバイオリアクターの比較が示すのは、追加のフィーダー細胞が播種されるバイオリアクター（ＨｅｐＤｉｆｆ‐２）は、グルコースおよび乳酸塩の代謝の観点から、および、分化マーカーの産生に関して、よりずっと高い細胞活性を最初に有していた、ということである。しかしながら、バイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐２では、当該実験中のグルコース消費および乳酸塩産生の、安定した減少が観察された（図４）。第２０日目にあるＬＤＨのピークは、おそらく、灌流システムの加熱ユニットの技術的な機能不良に起因するものであった。第４０日目以降のＬＤＨ放出ピークは、おそらく、当該バイオリアクター中の圧力上昇に関係するものであった。キャピラリー膜の凝固を引き起こし得る未同定培地成分の沈殿が観察されたため、これは、結果として、栄養素と共に、最適以下の（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）細胞供給をもたらしていたかもしれなかった。このバイオリアクター中のＡＦＰ産生は、第１７日目と第２４日目との間で指数関数的に増加し、その後、実験の終了まで減少した。ＡＦＰ産生のダウンレギュレーションの始まりは、別の分化培地へと変えることと相関する。肝分化マーカーである尿素は、その産生において、第１日目と第２０日目との間で小さなピークを示し、また、アルブミン産生は、実験の間中ずっと、約０．４μｇ／時間という比較的低いレベルにとどまった（図５）。
【０１４１】
追加のＭＥＦの播種がされないバイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐１では、非常に低いが、安定したグルコース消費および乳酸塩産生レベルが測定された。分化因子ＡＦＰのみが、第１７日目と第３５日目との間に、第２６日目に最大値を有する小さなピークを示したが、これは、バイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐２におけるＡＦＰの大きさには似ていないが、経時変化には似ている（図５）。
【０１４２】
上述の因子に加え、アクチビンＡおよびインスリンの濃度を、当該培養培地において測定して、その用いた灌流条件を、その結果として生じた分化培地の交換動態に関して評価した（図６）。両因子とも、未分化ｈＥＳＣにおける、胚体内胚葉の方向に向かう分化の誘導において重要な役割を果たすが、インスリンは、高アクチビンＡ濃度を通じての内胚葉誘導に拮抗する。両バイオリアクターにおいて、当該培地中のアクチビンＡ濃度は、第７日目と第８日目との間に、２６ｎｇ／ｍｌという最大値を有する。第０日目〜第２２日目にバイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐２においてのみ測定したインスリン濃度は、第３日目に１５０ｎｇ／ｍｌという最大値を示し、第９日目までに２ｎｇ／ｍｌへと急速に減少し、約３５ｎｇ／ｍｌという中間濃度は第７日目と第８日目との間であった。
【０１４３】
ＣＹＰ４５０活性
これらバイオリアクターにおける肝細胞特異的な細胞活性について試験するべく、フェナセチン、ジクロフェナクおよびミダゾラムを、それぞれ、第Ｉ相シトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ１Ａ２／１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ３Ａ４経由で代謝する能力を試験した。
【０１４４】
これらの試験は、ｈＥＳＣ播種後の第４０日目および第４７日目に行なった。両バイオリアクターにおいて、ジクロフェナクおよびミダゾラムの代謝を検出することはできなかった。フェナセチンの、パラセタモールへの代謝は、バイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐２では、リアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐１に比べて、より高く、また、第４７日目にほんのわずかだけ低下した。
【０１４５】
組織学
上記で述べられているように、両バイオリアクターとも、実験の終了時に、非常に低い代謝活性を呈した。この所見は、組織学的分析の際、バイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐２では、組織構造を含有する領域は非常にわずかしか見い出せず、また、バイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐１の試料においては構造は全く見いだせなかった、という事実と相関していた。バイオリアクターＨｅｐＤｉｆｆ‐２において観察された組織クラスターでは、はっきりした内胚葉分化を指し示す、様々な上皮形態を有するたくさんの構造を観察することができた。加えて、疎性結合組織を有する領域、および、核に対する細胞質の割合が低い細胞で構成される少数の細胞凝集体、が見い出された。
【０１４６】
実施例１９
ｈＥＳＣの肝細胞への分化およびバイオリアクターにおける成熟
同時に作動させたバイオリアクターの第一巡目：ＢＲ２およびＢＲ３
実施例１８において詳述したプロトコルに加え、いくつかのさらなる実験を作動させて、バイオリアクター環境における、ｈＥＳＣの、肝細胞への、方向性のある分化のための手順を、これらの細胞型の成熟の改善にも焦点を当てながら、洗練されたものにした。これらの実験は表３および４（バイオリアクターＢＲ２およびＢＲ３）において詳述されており、そこでは、アクチビンＡおよび高成長因子レベルを用いてｈＥＳＣの、ＤＥ細胞への分化を開始させ、所定の時点で（表３に示されている実験については第１２日目、表４に示されている実験については第７日目または第１１日目に）細胞をバイオリアクター中へと播種し、さらなる分化および成熟が起こるようにしておくための全体的な手順が記載されている。この手順は２Ｄ非バイオリアクター制御と同時に作動させ、また、両方の実験について、ＣＹＰ４５０のレベルを、第２５日目または第２６日目のバイオリアクターシャットダウンの前の複数の特定の時点において測定した。
【０１４７】
最初の実験の作動中に、バイオリアクター環境中で成長している細胞については、第０日目、播種日、およびバイオリアクターのシャットダウン日からなる測定時点で、また、２Ｄ対照群については、同時のシャットダウン日測定で、４つの群のマーカー（肝遺伝子、胎児／未成熟肝細胞に対するマーカー、未分化細胞に対するトランスポーターおよびマーカー）の発現を測定した（第１２日目に播種され、第２４日目に採取された細胞について図７〜１０に示す）。遺伝子発現レベルは、実施例９〜１１および１７に記載の通りに測定した。
【０１４８】
同時に作動させたバイオリアクターの第二巡目：ＢＲ１２１およびＢＲ１６８
続いて、一貫性および再現性を確実にするべく、２つの別々のバイオリアクターについて、結果を比較した。細胞を、バイオリアクター（Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｔ）ＢＲ１２１またはＢＲ１６８のいずれかの中に、異なる２つの時点で（第７日目および第１２日目に）、播種し、以下の通りに、第２６日目まで、成熟させておいた（図１１、Ａ〜Ｄ）：
【０１４９】
第０日目に、実験の開始時に、２００×１０６個の未分化ヒト胚性幹細胞ＤＥＦ ＳＡ１２１は、継代のためにトリプルセレクト（ｔｒｙｐｌｅ ｓｅｌｅｃｔ）し、マトリゲルコート培養フラスコ上に、１ｃｍ２当たり２０００００細胞で、１０ｕＭ Ｒｏｃｋ阻害剤を添加したＩＤ１中に播いた。上記スケジュールに従って第７日目まで毎日または１日おきの培地交換。内胚葉の誘導後、第７日目に、すべての細胞をトリプルセレクト（ｔｒｙｐｌｅ ｓｅｌｅｌｃｔ）し、数えたところ、全体で６千万個の細胞となった。ＢＲ１２１に３千万個の細胞を使用し、ＢＲ１６８に３千万個使用した。
【０１５０】
ＢＲ１２１：
第７日目に、２千５百万個の細胞を、ＢＲ１２１の中へ、１０ｕＭ Ｒｏｃｋ阻害剤を添加したＰ１中に播種し、上記スケジュールに従って実験第２６日目の終了まで培養した。５百万個の細胞は、２Ｄ対照用にマトリゲルコート４８ウェルに、１ｃｍ２当たり１５００００細胞で、１０ｕＭ Ｒｏｃｋ阻害剤を添加したＰ１中に播き、上記スケジュールに従って、実験の終了である第２６日目まで培養した。
【０１５１】
ＢＲ１６８：
第７日目に、３千万個の細胞を、２Ｄ培養フラスコ中に、１０ｕＭ Ｒｏｃｋ阻害剤を添加したＰ１中に播き、上記スケジュールに従って培養した。５日後、第１２日目に、細胞をトリプルセレクト（ｔｒｙｐｌｅ ｓｅｌｅｃｔ）し、数えたところ、全体で７千２百万個の細胞となった。
【０１５２】
６千２百万個の細胞を、ＢＲ１６８中に、１０ｕＭ Ｒｏｃｋ阻害剤を添加したＶＨ２中に播種し、上記スケジュールに従って実験の終了である第２６日目まで培養した。
【０１５３】
７百万個の細胞を、２Ｄ対照用にマトリゲルコート４８ウェル中に、１ｃｍ２当たり２０００００細胞で、１０ｕＭ Ｒｏｃｋ阻害剤を添加したＶＨ２中に播き、上記スケジュールに従って実験の終了である第２６日目まで培養した。
【０１５４】
分析したマーカーはすべて肝マーカーであり、レベルは２Ｄ対照と比較した。培養培地組成を表６に記載する。
【０１５５】
実施例２０
当該動的灌流技術のさらなる一局面は、細胞が区画化された状態のままでありながら、第一バイオリアクターの因子または可溶性メディエーターにより第二バイオリアクターが刺激され得る、１つの灌流回路における「ツインバイオリアクター」の組み合わせを、容易に行なうことが可能であるということである。これは、共培養物の未知の可溶性因子が用いられることとなる場合には興味深いものとなるであろうが、培養物間の細胞の移入は避けなければならない。
【０１５６】
参考文献：
【０１５７】
【表３】
【０１５８】
【表４】
【０１５９】
【表５】
【０１６０】
【表６】
【０１６１】
【表７】
【０１６２】
【表８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞様細胞を得るための方法であって、
ｉ） バイオリアクターにおけるｈＰＳ細胞または肝前駆細胞の播種
ｉｉ） 前記バイオリアクターを１種類以上の培養培地で１０日〜５０日の期間にわたり灌流して、肝細胞様細胞を得ること、
を含む方法。
【請求項２】
前記肝細胞様細胞が、肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造の形をしている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｈＰＳ細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｈＰＳ細胞が人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記肝細胞前駆細胞が胚体内胚葉（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ；ＤＥ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記肝細胞前駆細胞が胚体内胚葉（ＤＥ）ではない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記肝細胞前駆細胞が、胎児（胎仔）内胚葉の特徴を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記肝細胞前駆細胞が、肝内胚葉（ｈｅｐａｔｉｃ ｅｎｄｏｄｅｒｍ）の特徴を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオリアクターが中空繊維キャピラリーバイオリアクターである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記バイオリアクターが、膜区画を備えている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記膜区画が、２つ以上のキャピラリーシステムと１つ以上の中空繊維膜とを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記バイオリアクターが、キャピラリーシステムを通っての培養培地の灌流のための手段と、前記キャピラリーシステム中のガス交換のための手段とを含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
増殖培地の灌流が、前記キャピラリーシステムを通って行なわれ、また、ガス交換が、中空繊維膜システム経由で行なわれる、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記キャピラリーシステムと１つ以上の中空繊維膜とが、１つのハウジング中へと組み込まれる独立した織り合わされた（ｉｎｔｅｒｗｏｗｅｎ）繊維キャピラリー膜システムを形成するよう構成されている、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ｈＰＳ細胞は工程ｉ）で播き、また、前記灌流は以下のスキーム：
【表１】
に従ったものであるが、但し、工程２〜６のうちの少なくとも３つが含まれる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
すべての工程が含まれる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
培地ＤＭ‐Ａが、増殖培地を含み、かつ、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、グルタマックス‐Ｉといった成分のうちの１つ以上を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記培地ＤＭ‐Ａが、アクチビン‐ＡおよびｂＦＧＦを含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
培地ＤＭ‐Ｂが、例えばＲＰＭＩアドバンスト培地等の増殖培地を含み、かつ、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、グルタマックス‐Ｉ、ＦＣＳといった成分のうちの１つ以上を含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記培地ＤＭ‐Ｂが、アクチビン‐ＡおよびｂＦＧＦを含む、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
培地ＤＭ‐Ｃが、例えばＲＰＭＩアドバンスト培地等の増殖培地を含み、かつ、ｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、グルタマックス‐Ｉ、ＦＣＳといった成分のうちの１つ以上を含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記培地ＤＭ‐Ｃが、ｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
培地ＤＭ‐Ｄが、例えばウィリアムズ培地Ｅ等などの肝培養培地を含み、かつ、ＢＳＡ、アスコルビン酸、グルタマックス‐Ｉ、Ｄ‐ガラクトース／Ｄ‐ソルビトール、ヒドロコルチゾン、インスリン、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦといった成分のうちの１つ以上を含む、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記培地ＤＭ‐Ｄが、ＢＳＡ、アスコルビン酸、Ｄ‐ガラクトース（Ｇａｌｃｔｏｓｅ）／Ｄソルビトール、ヒドロコルチゾン、インスリン、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
培地ＤＭ‐Ｅが、例えばウィリアムズ培地Ｅ等などの肝培養培地を含み、かつ、ＢＳＡ、アスコルビン酸、グルタマックス‐Ｉ、デキサメタゾン、Ｄ‐ガラクトース／Ｄ‐ソルビトール、ヒドロコルチゾン、インスリン、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、オンコスタチンＭといった成分のうちの１つ以上を含む、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記培地ＤＭ‐Ｅが、ＢＳＡ、アスコルビン酸、デキサメタゾン、Ｄ‐ガラクトース／Ｄ‐ソルビトール、ヒドロコルチゾン、インスリン、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、オンコスタチンＭを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
工程ｉ）の前に、前記バイオリアクターに、不活性化したフィーダー細胞を播種する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記フィーダー細胞が、ｈＦＦ細胞またはＭＥＦ細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記バイオリアクターに、ｈＢＳ細胞およびフィーダー細胞またはＤＥ細胞およびフィーダー細胞、のいずれか関係する方を、共播種する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
例えばＤＥ細胞などの肝前駆細胞は工程ｉ）で播き、また、請求項１５の工程１および２は省略される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記培養培地のうちの１つ以上が、例えばＲＯＣＫ Ｒｈｏキナーゼの阻害剤などの細胞生存因子を含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか一項において定義されている方法により得られる肝細胞様細胞。
【請求項３３】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法により得られる肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項３４】
前記細胞が、上昇したレベルの１つ以上の肝マーカー遺伝子または肝トランスポーター遺伝子を発現する、請求項３２または３３に記載の肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項３５】
前記１つ以上の肝マーカー遺伝子が、アルブミン、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ７Ａ１、ＴＡＴおよびＵＧＴ２Ｂ７を含むリストから選択される、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項３６】
前記１つ以上の肝マーカー遺伝子の発現が、本明細書の図７中に、試料：バイオリアクター第２６日目、として列記されているような肝マーカー遺伝子の発現に似ている、請求項３２〜３４に記載の肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項３７】
前記１つ以上の肝トランスポーター遺伝子が、ＡＢＣＣ２／ＭＲＰ２、ＦＡＢＰ１、ＯＡＴＰ２、ＯＣＴ‐１を含むリストから選択される、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項３８】
前記１つ以上の肝トランスポーター遺伝子の発現が、本明細書の図９中に、試料：バイオリアクター第２６日目、として列記されているような発現に似ている、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項３９】
膜区画を備えたバイオリアクターにおける、ｉｎ ｖｉｔｒｏで導かれた（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｅｒｉｖｅｄ）肝細胞様細胞。
【請求項４０】
前記細胞が、ｈＰＳ細胞または肝細胞前駆体から、肝細胞様細胞へ、前記バイオリアクター中で分化したものである、請求項３２〜３９のいずれか一項に記載の、ｉｎ ｖｉｔｒｏで導かれた肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項４１】
前記バイオリアクターが中空繊維キャピラリーバイオリアクターである、請求項３２〜４０のいずれか一項に記載の、ｉｎ ｖｉｔｒｏで導かれた肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項４２】
前記バイオリアクターが、前記キャピラリーシステムを通っての培養培地の灌流のための手段と、前記キャピラリーシステム中のガス交換のための手段とを含む、請求項３２〜４１のいずれか一項に記載の、ｉｎ ｖｉｔｒｏで導かれた肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項４３】
前記膜区画が、２つ以上のキャピラリーシステムと１つ以上の中空繊維膜とを含む、請求項３２〜４２のいずれか一項に記載の、ｉｎ ｖｉｔｒｏで導かれた肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項４４】
増殖培地の灌流が、前記キャピラリーシステムを通って行なわれ、また、ガス交換が、前記中空繊維膜システム経由で行なわれる、請求項３２〜４３のいずれか一項に記載の、ｉｎ ｖｉｔｒｏで導かれた肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項４５】
前記キャピラリーシステムと前記中空繊維膜とが、１つのハウジング中へと組み込まれる独立した織り合わされた（ｉｎｔｅｒｗｏｗｅｎ）繊維キャピラリー膜システムを形成するよう構成されている、請求項３２〜４４のいずれか一項に記載の、ｉｎ ｖｉｔｒｏで導かれた肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項４６】
前記肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造が、例えばＲＯＣＫ Ｒｈｏキナーゼの阻害剤などの細胞生存因子の存在下で成長している、請求項３２〜４５のいずれか一項に記載の、ｉｎ ｖｉｔｒｏで導かれた肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項４７】
ｈＰＳ細胞または肝前駆体を、肝細胞運命に向かって分化させるための、バイオリアクターの使用。
【請求項４８】
調整培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）を製造するための方法であって、
ａ） バイオリアクターにおけるフィーダー細胞の播種の工程
ｂ） 前記フィーダー細胞を成長させる工程
を含む方法。
【請求項４９】
前記バイオリアクターが中空繊維キャピラリーバイオリアクターである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記バイオリアクターが、膜区画を備えている、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記膜区画が、２つ以上のキャピラリーシステムと１つ以上の中空繊維膜とを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記バイオリアクターが、キャピラリーシステムを通っての培養培地の灌流のための手段と、前記キャピラリーシステム中のガス交換のための手段とを含む、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記バイオリアクターにおける増殖培地の灌流が、前記キャピラリーシステムを通って行なわれ、また、ガス交換が、中空繊維膜システム経由で行なわれる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
１つのキャピラリーシステムと１つ以上の中空繊維膜とが、１つのハウジング中へと組み込まれる独立した織り合わされた（ｉｎｔｅｒｗｏｗｅｎ）繊維キャピラリー膜システムを形成するよう構成されている、請求項４８〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
請求項１〜４６のいずれか一項において得られる細胞の、治療目的での、または、創薬、医薬製剤、毒性試験における、または、再生医療における、使用。
【請求項１】
肝細胞様細胞を得るための方法であって、
ｉ） バイオリアクターにおけるｈＰＳ細胞または肝前駆細胞の播種
ｉｉ） 前記バイオリアクターを１種類以上の培養培地で１０日〜５０日の期間にわたり灌流して、肝細胞様細胞を得ること、
を含む方法。
【請求項２】
前記肝細胞様細胞が、肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造の形をしている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｈＰＳ細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｈＰＳ細胞が人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記肝細胞前駆細胞が胚体内胚葉（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ；ＤＥ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記肝細胞前駆細胞が胚体内胚葉（ＤＥ）ではない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記肝細胞前駆細胞が、胎児（胎仔）内胚葉の特徴を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記肝細胞前駆細胞が、肝内胚葉（ｈｅｐａｔｉｃ ｅｎｄｏｄｅｒｍ）の特徴を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオリアクターが中空繊維キャピラリーバイオリアクターである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記バイオリアクターが、膜区画を備えている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記膜区画が、２つ以上のキャピラリーシステムと１つ以上の中空繊維膜とを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記バイオリアクターが、キャピラリーシステムを通っての培養培地の灌流のための手段と、前記キャピラリーシステム中のガス交換のための手段とを含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
増殖培地の灌流が、前記キャピラリーシステムを通って行なわれ、また、ガス交換が、中空繊維膜システム経由で行なわれる、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記キャピラリーシステムと１つ以上の中空繊維膜とが、１つのハウジング中へと組み込まれる独立した織り合わされた（ｉｎｔｅｒｗｏｗｅｎ）繊維キャピラリー膜システムを形成するよう構成されている、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ｈＰＳ細胞は工程ｉ）で播き、また、前記灌流は以下のスキーム：
【表１】
に従ったものであるが、但し、工程２〜６のうちの少なくとも３つが含まれる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
すべての工程が含まれる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
培地ＤＭ‐Ａが、増殖培地を含み、かつ、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、グルタマックス‐Ｉといった成分のうちの１つ以上を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記培地ＤＭ‐Ａが、アクチビン‐ＡおよびｂＦＧＦを含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
培地ＤＭ‐Ｂが、例えばＲＰＭＩアドバンスト培地等の増殖培地を含み、かつ、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、グルタマックス‐Ｉ、ＦＣＳといった成分のうちの１つ以上を含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記培地ＤＭ‐Ｂが、アクチビン‐ＡおよびｂＦＧＦを含む、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
培地ＤＭ‐Ｃが、例えばＲＰＭＩアドバンスト培地等の増殖培地を含み、かつ、ｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、グルタマックス‐Ｉ、ＦＣＳといった成分のうちの１つ以上を含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記培地ＤＭ‐Ｃが、ｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
培地ＤＭ‐Ｄが、例えばウィリアムズ培地Ｅ等などの肝培養培地を含み、かつ、ＢＳＡ、アスコルビン酸、グルタマックス‐Ｉ、Ｄ‐ガラクトース／Ｄ‐ソルビトール、ヒドロコルチゾン、インスリン、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦといった成分のうちの１つ以上を含む、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記培地ＤＭ‐Ｄが、ＢＳＡ、アスコルビン酸、Ｄ‐ガラクトース（Ｇａｌｃｔｏｓｅ）／Ｄソルビトール、ヒドロコルチゾン、インスリン、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
培地ＤＭ‐Ｅが、例えばウィリアムズ培地Ｅ等などの肝培養培地を含み、かつ、ＢＳＡ、アスコルビン酸、グルタマックス‐Ｉ、デキサメタゾン、Ｄ‐ガラクトース／Ｄ‐ソルビトール、ヒドロコルチゾン、インスリン、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、オンコスタチンＭといった成分のうちの１つ以上を含む、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記培地ＤＭ‐Ｅが、ＢＳＡ、アスコルビン酸、デキサメタゾン、Ｄ‐ガラクトース／Ｄ‐ソルビトール、ヒドロコルチゾン、インスリン、トランスフェリン、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、オンコスタチンＭを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
工程ｉ）の前に、前記バイオリアクターに、不活性化したフィーダー細胞を播種する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記フィーダー細胞が、ｈＦＦ細胞またはＭＥＦ細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記バイオリアクターに、ｈＢＳ細胞およびフィーダー細胞またはＤＥ細胞およびフィーダー細胞、のいずれか関係する方を、共播種する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
例えばＤＥ細胞などの肝前駆細胞は工程ｉ）で播き、また、請求項１５の工程１および２は省略される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記培養培地のうちの１つ以上が、例えばＲＯＣＫ Ｒｈｏキナーゼの阻害剤などの細胞生存因子を含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか一項において定義されている方法により得られる肝細胞様細胞。
【請求項３３】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法により得られる肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項３４】
前記細胞が、上昇したレベルの１つ以上の肝マーカー遺伝子または肝トランスポーター遺伝子を発現する、請求項３２または３３に記載の肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項３５】
前記１つ以上の肝マーカー遺伝子が、アルブミン、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ７Ａ１、ＴＡＴおよびＵＧＴ２Ｂ７を含むリストから選択される、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項３６】
前記１つ以上の肝マーカー遺伝子の発現が、本明細書の図７中に、試料：バイオリアクター第２６日目、として列記されているような肝マーカー遺伝子の発現に似ている、請求項３２〜３４に記載の肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項３７】
前記１つ以上の肝トランスポーター遺伝子が、ＡＢＣＣ２／ＭＲＰ２、ＦＡＢＰ１、ＯＡＴＰ２、ＯＣＴ‐１を含むリストから選択される、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項３８】
前記１つ以上の肝トランスポーター遺伝子の発現が、本明細書の図９中に、試料：バイオリアクター第２６日目、として列記されているような発現に似ている、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項３９】
膜区画を備えたバイオリアクターにおける、ｉｎ ｖｉｔｒｏで導かれた（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｅｒｉｖｅｄ）肝細胞様細胞。
【請求項４０】
前記細胞が、ｈＰＳ細胞または肝細胞前駆体から、肝細胞様細胞へ、前記バイオリアクター中で分化したものである、請求項３２〜３９のいずれか一項に記載の、ｉｎ ｖｉｔｒｏで導かれた肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項４１】
前記バイオリアクターが中空繊維キャピラリーバイオリアクターである、請求項３２〜４０のいずれか一項に記載の、ｉｎ ｖｉｔｒｏで導かれた肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項４２】
前記バイオリアクターが、前記キャピラリーシステムを通っての培養培地の灌流のための手段と、前記キャピラリーシステム中のガス交換のための手段とを含む、請求項３２〜４１のいずれか一項に記載の、ｉｎ ｖｉｔｒｏで導かれた肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項４３】
前記膜区画が、２つ以上のキャピラリーシステムと１つ以上の中空繊維膜とを含む、請求項３２〜４２のいずれか一項に記載の、ｉｎ ｖｉｔｒｏで導かれた肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項４４】
増殖培地の灌流が、前記キャピラリーシステムを通って行なわれ、また、ガス交換が、前記中空繊維膜システム経由で行なわれる、請求項３２〜４３のいずれか一項に記載の、ｉｎ ｖｉｔｒｏで導かれた肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項４５】
前記キャピラリーシステムと前記中空繊維膜とが、１つのハウジング中へと組み込まれる独立した織り合わされた（ｉｎｔｅｒｗｏｗｅｎ）繊維キャピラリー膜システムを形成するよう構成されている、請求項３２〜４４のいずれか一項に記載の、ｉｎ ｖｉｔｒｏで導かれた肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項４６】
前記肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造が、例えばＲＯＣＫ Ｒｈｏキナーゼの阻害剤などの細胞生存因子の存在下で成長している、請求項３２〜４５のいずれか一項に記載の、ｉｎ ｖｉｔｒｏで導かれた肝細胞様細胞または肝細胞様細胞を含む肝組織様３Ｄ構造。
【請求項４７】
ｈＰＳ細胞または肝前駆体を、肝細胞運命に向かって分化させるための、バイオリアクターの使用。
【請求項４８】
調整培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）を製造するための方法であって、
ａ） バイオリアクターにおけるフィーダー細胞の播種の工程
ｂ） 前記フィーダー細胞を成長させる工程
を含む方法。
【請求項４９】
前記バイオリアクターが中空繊維キャピラリーバイオリアクターである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記バイオリアクターが、膜区画を備えている、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記膜区画が、２つ以上のキャピラリーシステムと１つ以上の中空繊維膜とを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記バイオリアクターが、キャピラリーシステムを通っての培養培地の灌流のための手段と、前記キャピラリーシステム中のガス交換のための手段とを含む、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記バイオリアクターにおける増殖培地の灌流が、前記キャピラリーシステムを通って行なわれ、また、ガス交換が、中空繊維膜システム経由で行なわれる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
１つのキャピラリーシステムと１つ以上の中空繊維膜とが、１つのハウジング中へと組み込まれる独立した織り合わされた（ｉｎｔｅｒｗｏｗｅｎ）繊維キャピラリー膜システムを形成するよう構成されている、請求項４８〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
請求項１〜４６のいずれか一項において得られる細胞の、治療目的での、または、創薬、医薬製剤、毒性試験における、または、再生医療における、使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７−１】
【図１７−２】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７−１】
【図１７−２】
【図１８】
【公表番号】特表２０１２−５２９９０１（Ｐ２０１２−５２９９０１Ａ）
【公表日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１５５１８（Ｐ２０１２−５１５５１８）
【出願日】平成２２年６月１８日（２０１０．６．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５８６７９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４９５９７
【国際公開日】平成２２年１２月２９日（２０１０．１２．２９）
【出願人】（５１００７５１０３）セルアーティス アーベー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１８日（２０１０．６．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５８６７９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４９５９７
【国際公開日】平成２２年１２月２９日（２０１０．１２．２９）
【出願人】（５１００７５１０３）セルアーティス アーベー (2)
【Ｆターム（参考）】
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