プラスミドベクター
【課題】コクリア属細菌を産業上有効に利用するために、コクリア属細菌を遺伝子工学的に改変するための技術を提供する。
【解決手段】ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列と；レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列と；配列番号４５に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列とを含む複製領域を有する、細菌内で自律的に複製可能な環状のプラスミド。
【解決手段】ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列と；レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列と；配列番号４５に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列とを含む複製領域を有する、細菌内で自律的に複製可能な環状のプラスミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学的手法を用いた微生物の機能向上に寄与する技術に関する。詳しくは、コクリア（Kocuria）属細菌由来のプラスミドベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
ミクロコッカセア（Micrococcaceae）科細菌には、食品工業、医薬品製造業、化学工業、環境浄化などの分野において有用性が認められているものが多い。たとえば、チーズなどの乳製品の作製などにプロピオン酸菌（propionibacteria）が使用されている。また、Ｌ−グルタミンの生産菌としては、ブレビバクテリア（Brevibacteria）属細菌が知られている。
【０００３】
しかし、これらの細菌の野生株は、生産物の生成能が低い、培養が困難である、といった種々の問題を抱える。そこで、このような問題を解決するために、これらの細菌に遺伝子操作を施し、生産物の生成能や環境適合性などを高めた変異株を得る試みがなされている。その際に利用されるのが、これらの細菌において自律的に複製可能なプラスミドなどのベクターである。たとえば、プロピオン酸菌に利用可能なベクターには、特許文献１に記載されているものがある。
【０００４】
ミクロコッカセア科に属する細菌として、コクリア（Kocuria）属細菌が知られている。コクリア属細菌は高度な有機溶媒耐性、重金属耐性および増殖能力を示し、燃料や医薬化成品の製造、環境浄化などの分野での利用が期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−１１２７９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、コクリア属細菌に外来遺伝子を安定保持させる技術は知られていない。この細菌を用いて遺伝子工学的手法による微生物改変に成功したという例もない。結果として、新たな生物学的機能を付与することや本来の機能の最適化を図ることもできないことから、コクリア属細菌は産業界でほとんど利用されていない。
【０００７】
そこで、本発明は、コクリア属細菌を産業上有効に利用するために、コクリア属細菌を遺伝子工学的に改変するための技術を提供することを、発明が解決しようとする課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を進めた結果、比較的サイズの小さい取り扱いの容易な環状プラスミドを有する新規なコクリア属細菌であるコクリア エスピー ＭＢＥ１３１（Ｋｏｃｕｒｉａ ｓｐ． ＭＢＥ１３１）株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８８５；以下、ＭＢＥ１３１株とよぶ場合もある）を相模湾内の深度約２０００ｍの底泥から単離することに成功した。
【０００９】
本発明者らは、ＭＢＥ１３１株から取得したプラスミドをｐＫＲ１００と名付け、外来遺伝子および大腸菌内で自律的に複製可能なプラスミドを連結して、ＭＢＥ１３１株および大腸菌に対するシャトルベクターを構築した。このシャトルベクターをＭＢＥ１３１株および大腸菌に導入したところ、いずれの細菌内でも外来遺伝子が発現した。
【００１０】
さらに本発明者らは、プラスミドｐＫＲ１００についてさらに検討を進めたところ、プラスミドｐＫＲ１００におけるＤＮＡ複製を担うと推測される領域（複製領域）を解明した。次いでプラスミドｐＫＲ１００における複製領域と異なる領域に外来遺伝子を挿入した組換えプラスミドを用意し、これをＭＢＥ１３１株と異なるコクリア属細菌であるコクリア リゾフィラ ＤＣ２２０１（Ｋｏｃｕｒｉａ ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ ＤＣ２２０１）株（ＮＢＲＣ１０３２１７）に導入した。その結果、該組換えプラスミドは、コクリア リゾフィラ ＤＣ２２０１株においても外来遺伝子を発現し、かつ、自律的に複製可能であった。
【００１１】
本発明は以上の知見に基づいて完成されたものである。したがって、本発明によれば、ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列と；レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列と；配列番号４５に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列とを含む複製領域を有する、細菌内で自律的に複製可能な環状のプラスミドが提供される。
【００１２】
本発明の別の側面によれば、ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列と；レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列と；ＤＮＡ結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列とを含む複製領域を有する、細菌内で自律的に複製可能な環状のプラスミドが提供される。
【００１３】
本発明の別の側面によれば、ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列と；レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列と；ＤＮＡ結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列、酸化剤感受性配列ならびに逆方向反復配列を含む塩基配列とを含む複製領域を有する、細菌内で自律的に複製可能な環状のプラスミドが提供される。
【００１４】
好ましくは、本発明のプラスミドは、複製領域において、ＤＮＡ結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列のうち、ＤＮＡ結合タンパク質結合配列を１個以上かつ繰り返しモチーフ配列を２個以上含む。
【００１５】
好ましくは、ＤＮＡ結合タンパク質結合配列は、ＣＡＣＣＧＧＴＧ、ＡＣＣＧＧＴＧ、ＣＣＧＧＴＧ、ＡＣＣＧＧＴ、ＣＡＣＡＧＧＴ、ＣＡＣＣＧＧＴ、ＣＡＣＣＧＧ、ＧＴＧＣＧＣＡＣ、ＧＧＣＣＧＧＣＣ、ＴＣＧＧＡＧＣＴＣＣＧＡ（配列番号４６）、ＴＣＣＣＧＧＧＡ、ＴＧＣＣＧＧＣＡ、ＴＧＡＴＣＧＡＴＣＡ（配列番号４７）およびＧＣＡＣＧＴＧＣからなる群から選ばれる。
【００１６】
好ましくは、繰り返しモチーフ配列の反復単位は、ＴＧＧＣＧＴＧＧＴＣＧＴＴＧ（配列番号４８）、ＧＣＧＣＴＧＧＧＧＴＧ（配列番号４９）、ＴＧＧＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号５０）、ＧＣＧＧＴＧＧＴＧ、ＧＣＧＧＴＧＧＴＧＴＧ（配列番号５１）、ＧＧＧＣＣＧＧＧＧＴＴＧ（配列番号５２）、ＧＣＣＧＧＧＧＴＴＧＴ（配列番号５３）、ＴＧＧＴＣＧＴＧＴＴＧ（配列番号５４）、ＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＧＴＧ（配列番号５５）、ＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＴＧＧ（配列番号５６）およびＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＴＧＧ（配列番号５７）からなる群から選ばれる。
【００１７】
好ましくは、本発明のプラスミドは、複製領域において、酸化剤感受性配列を１個以上含む。
【００１８】
好ましくは、酸化剤感受性配列は、ＴＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＧＣＧＡＡＡＴＡ（配列番号５８）、ＧＧＣＣＴＣＴＣＡＧＣ（配列番号５９）、ＣＴＧＣＧＧＧＣＡＣＣＴＣＣＴＡＣ（配列番号６０）、ＴＴＣＧＡＴＧＡＧ、ＧＧＴＧＡＧＧＧＧＴＡＡＣＣＣ（配列番号６１）、ＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣ（配列番号６２）、ＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＴＴＣＣＴＡＴＣＧ（配列番号６３）、ＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣ（配列番号６４）、ＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＧＴＧＣＧＣＴＡＡ（配列番号６５）、ＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＣＣＧＡ（配列番号６６）およびＣＴＧＡＧＧＧＴＣＣＴＣ（配列番号６７）からなる群から選ばれる。
【００１９】
好ましくは、本発明のプラスミドは、複製領域において、逆方向反復配列を１個以上含む。
【００２０】
好ましくは、逆方向反復配列は、ＧＡＡＡＡＡＧＣＣＧＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＴＴＴＴＴＣ（配列番号６８）およびＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＧＣＣＧＧＧＴＧＧＴＡＧＡＧＣＣＣＧＧＣＴＴＴＴＴＣＣＧＴＧ（配列番号６９）からなる群から選ばれる。
【００２１】
好ましくは、レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列は、ＲｅｐＡタンパク質遺伝子の塩基配列である。
【００２２】
好ましくは、レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列は、配列番号２に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、レプリカーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。
【００２３】
好ましくは、ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列は、ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質遺伝子の塩基配列である。
【００２４】
好ましくは、ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質をコードする塩基配列である。
【００２５】
好ましくは、複製領域は、配列番号３に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である。
【００２６】
好ましくは、細菌は、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）属細菌である。
【００２７】
本発明の別の側面によれば、制限酵素認識部位およびその数（制限酵素認識部位：数）として、ＳｍａＩ：２、ＳｐｈＩ：１、ＳａｌＩ：１、ＸｈｏＩ：１およびＢａｍＨＩ：１を含む、コクリア属細菌内で自律的に複製可能な環状のプラスミドが提供される。
【００２８】
好ましくは、本発明のプラスミドは、制限酵素認識部位ＳｍａＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩをこの順で含む。
【００２９】
好ましくは、本発明のプラスミドは、塩基対数が３．０×１０３〜３．４×１０３である。
【００３０】
好ましくは、本発明のプラスミドは、以下の制限酵素地図（Ｉ）
【化１】
で示される。
【００３１】
好ましくは、本発明のプラスミドは、配列番号３または４に記載の塩基配列を含む。
【００３２】
好ましくは、本発明のプラスミドは、コクリア エスピー ＭＢＥ１３１（Ｋｏｃｕｒｉａ ｓｐ． ＭＢＥ１３１）株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８８５）に由来する。
【００３３】
本発明の別の側面によれば、配列番号３に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む、ＤＮＡ断片が提供される。
【００３４】
本発明の別の側面によれば、本発明のＤＮＡ断片の塩基配列を含む、ベクターが提供される。
【００３５】
本発明の別の側面によれば、本発明のプラスミド、本発明のＤＮＡ断片、または本発明のベクターを含有してなる、形質転換体が提供される。
【発明の効果】
【００３６】
本発明のプラスミドによれば、コクリア属細菌において外来遺伝子を導入かつ発現させるためのベクターを構築できる。したがって、本発明のプラスミドを用いれば、コクリア属細菌などの宿主細胞に有用遺伝子を導入することができ、宿主細胞に新たな生物学的機能を付与することや宿主細胞の本来の機能を向上させることが可能である。
【００３７】
本発明のＤＮＡ断片およびベクターを用いれば、コクリア属細菌および他の細菌において自律的に複製可能なシャトルベクターを製造することができる。本発明の形質転換体には、宿主細胞に新たな生物学的機能を付与したものや宿主細胞の本来の機能を向上させたものなどがあり、用途に応じて種々の分野で利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ｐＫＲ１００の制限酵素地図に２つのオープンリーディングフレームを加入した図である。
【図２】ＯＲＦ１およびＯＲＦ２をそれぞれコードする塩基配列の領域を明示したｐＫＲ１００の塩基配列を示した図である。
【図３】ＯＲＦ１およびＯＲＦ２をそれぞれコードする塩基配列の領域を明示したｐＫＲ１００の塩基配列を示した図である（図２の続き）。
【図４】例６に示すｐＫＲ１００におけるＤＮＡ複製領域を調べた結果を示した図である。図４に示すＤＮＡ断片を含むプラスミドのうち、「＋」は複製が認められたプラスミド、「−」は複製が確認できなかったプラスミドを示す。
【図５】例３におけるコクリア エスピー ＭＢＥ１３１（Kocuria sp. ＭＢＥ１３１）株およびコクリア ロゼア（Kocuria rosea）標準株からのＤＮＡ抽出によるプラスミド検出結果を示した図である。レーン１は、ＭＢＥ１３１株から抽出したＤＮＡを示す。レーン２は、コクリア ロゼア標準株から抽出したＤＮＡを示す。レーン３は、ＤＮＡサイズマーカーを示す。
【図６】例３におけるＭＢＥ１３１株およびコクリア ロゼア標準株から抽出したＤＮＡを鋳型として、表１に記載のプライマーセットＡ〜Ｆを用いたＰＣＲを実施した場合のプラスミドの検出結果を示した図である。
【図７】例３におけるＭＢＥ１３１株およびコクリア ロゼア標準株の細胞溶解液に含まれるＤＮＡを鋳型として、表１に記載のプライマーセットＡ〜Ｆを用いたＰＣＲを実施した場合のプラスミドの検出結果を示した図である。
【図８】例５における、ＭＢＥ１３１形質転換株へ導入された組換えプラスミドｐＲ６６３２のＰＣＲによる検出結果を示した図である。レーン１は、ＤＮＡサイズマーカーを示す。
【図９】例５における、ＭＢＥ１３１形質転換株へ導入された組換えプラスミドｐＲ６６３２の制限酵素消化パターンによる確認結果を示した図である。レーン１は、ＤＮＡサイズマーカーを示す。
【図１０】例７におけるＤＣ２２０１株に導入されたプラスミドpＲ６６３２のＰＣＲによる検出結果を示した図である。レーン３は、ＤＮＡサイズマーカーを示す。
【図１１Ａ】配列番号３に記載の塩基配列とアクチノシンネマ ミラム ＤＳＭ４３８２７株の塩基配列とのアライメント結果を示す。
【図１１Ｂ】配列番号３に記載の塩基配列とアクチノシンネマ ミラム ＤＳＭ４３８２７株の塩基配列とのアライメント結果を示す（図１１Ａの続き）。
【図１１Ｃ】配列番号３に記載の塩基配列とアクチノシンネマ ミラム ＤＳＭ４３８２７株の塩基配列とのアライメント結果を示す（図１１Ｂの続き）。
【図１２】例８における各種合成プラスミドのコクリア属細菌内でのプラスミド保持率（％）を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、本発明の詳細について説明する。
［１］プラスミド（１）
まず、本発明のプラスミドの一実施態様である、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）属細菌内で自律的に複製可能な環状のプラスミドについて説明する。なお、本明細書における「自律的な複製」とは、プラスミドが宿主細菌の細胞質内に存在して、宿主の染色体ＤＮＡとは独立して複製および／または増殖することをいう。
【００４０】
コクリア属細菌は、マイクロコッカシニア（Micrococcineae）亜目におけるマイクロコッカシア（Micrococcaceae）科に属する、菌糸を作らないグラム陽性の球菌の一種である。コクリア属細菌は多種多様な分離源から分離されており、たとえば、ほ乳類の皮膚、土壌、根圏、発酵食品、臨床検体、淡水、海底堆積物などから単離されている。コクリア属細菌の同定方法は、これまでに知られている方法を制限なく使用できるが、たとえば、微生物ゲノムの１６Ｓ ｒＲＮＡ領域に基づく遺伝子工学的な系統解析や微生物の生理・生化学的な性質に基づく同定法を採用できる。
【００４１】
本発明のプラスミドは、たとえば、制限酵素認識部位およびその数によって表わすことができる。本発明のプラスミドの好ましい一実施態様は、制限酵素認識部位およびその数（制限酵素認識部位：数）として、ＳｍａＩ：２、ＳｐｈＩ：１、ＳａｌＩ：１、ＸｈｏＩ：１およびＢａｍＨＩ：１を含む。この態様において、制限酵素ＳｍａＩが認識する部位は２箇所、ＳｐｈＩが認識する部位は１箇所、ＳａｌＩが認識する部位は１箇所、ＸｈｏＩが認識する部位は１箇所、およびＢａｍＨＩが認識する部位は１箇所である。
【００４２】
本発明のプラスミドのより好ましい一実施態様は、制限酵素認識部位ＳｍａＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩをこの順で含む。
【００４３】
本発明のプラスミドにおける制限酵素認識部位の確認方法は特に制限されないが、たとえば、プラスミドの塩基配列を決定し、次いで制限酵素認識部位を照合して確認する方法や、プラスミドを制限酵素処理し、次いでアガロースゲル電気泳動にかけて生じるバンドのパターンから制限酵素認識部位を確認する方法を採用することができる。
【００４４】
本発明のプラスミドは、ＧＣ含量が６０〜７０％であることが好ましい。なお、後述する本発明の具体的態様の一つである、図１で示されるプラスミドｐＫＲ１００は、ＧＣ含量が約６３％である。ＧＣ含量を確認する方法は特に制限されないが、たとえば、プラスミドの全塩基配列を決定し、次いで塩基配列ＧおよびＣの数を算出する方法や、プラスミドを塩基単位にまで加水分解し、ＨＰＬＣなどのクロマトグラフィーを利用してＧとＣの数を算出する方法を採用することができる。
【００４５】
本発明のプラスミドは、コクリア属細菌内で自律的に複製可能であれば特に制限されず、種々の態様が想定され得るが、その全体の大きさは約３．２×１０３塩基対、好ましくは３．０×１０３〜３．４×１０３塩基対である。この「約３．２×１０３塩基対」はコクリア属細菌から単離した天然のプラスミドの塩基対数をいい、コクリア属細菌内で自律的に複製および／または増殖する機能を担うと推測される領域（以下、複製領域ともよぶ）以外の領域を切り出すことや、外来遺伝子を挿入することによって、その塩基対数は可変である。
【００４６】
本発明のプラスミドの好ましい一実施態様は、たとえば、以下の制限酵素地図（Ｉ）
【化１】
で示される制限酵素認識部位を含む。このようなプラスミドのより具体的な態様は、図１で示されるプラスミドｐＫＲ１００である。
【００４７】
図１において、ｏｒｆ１およびｏｒｆ２は、それぞれ異なるオープンリーディングフレームを示す。ｏｒｆ１によってコードされるタンパク質（ＯＲＦ１）は７０アミノ酸からなり、分子量は８．１ｋＤａおよび等電点は１０．４であると推定される。ＯＲＦ１は、２次構造予測により、ランダムコイル構造で隔てられた２つのヘリックス構造を有すると推定されることから、ヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）構造を形成するＤＮＡ結合タンパク質またはその類似体であると推測される。本明細書では、このようなヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）構造を形成すると推定されるＤＮＡ結合タンパク質およびその類似体を総称して、ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質とよぶ。さらに、ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質をコードする塩基配列を、ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子とよぶ。
【００４８】
ｏｒｆ２によってコードされるタンパク質（ＯＲＦ２）は３８５アミノ酸からなり、分子量は４１ｋＤａであり、等電点は１１．１であると推定される。ＯＲＦ２は、ロドコッカス ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）由来のｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ＲｅｐＡ（アクセッション番号ＹＰ_３４５１６４）と３１％の相同性（８０／２５７アミノ酸、Ｅ−ｖａｌｕｅ ６ｅ−６）がある。本明細書では、このようなＲｅｐＡと３０％以上の相同性を有し、かつ、ＲｅｐＡと類似の活性があるものと推測されるタンパク質を、レプリカーゼ様タンパク質とよぶ。また、レプリカーゼ様タンパク質をコードする塩基配列を、レプリカーゼ様タンパク質遺伝子とよぶ。
【００４９】
図１によって示されるプラスミドは、ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子であるｏｒｆ１と、レプリカーゼ様タンパク質遺伝子であるｏｒｆ２とを含有する。ｏｒｆ２のコードするタンパク質は、θ型の複製様式を持つプラスミドであるマイコバクテリウム フォーツイツム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）由来プラスミドｐＡＬ５０００にコードされるＲｅｐＡ（アクセッション番号ＡＡＡ９８１７１、７４／２６３アミノ酸配列の一致（同一性 ２８％））やｐＡＬ５０００に関連したプラスミドであるロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）由来のプラスミドｐＮＣ５００にコードされるＲｅｐＡ（アクセッション番号ＢＡＦ４５３８９、６０／２１０アミノ酸配列の一致（同一性 ２８％））に相同性を示すことから、本発明のプラスミドは複製が安定しているθ（シータ）型のプラスミドである可能性が高い。したがって、本発明のプラスミドは、好ましくは、複製様式がθ型のプラスミドである。
【００５０】
図１によって示されるプラスミドの塩基配列は、図１に示される制限酵素認識部位ならびにＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子およびレプリカーゼ様タンパク質遺伝子を含めば特に制限されないが、好ましくは図２および３によって示される塩基配列（配列番号４）を含む。
【００５１】
図２によって示される塩基配列は、ｏｒｆ１の上流にＨ−ｓｉｔｅ−ｌｉｋｅ ｓｅｑを含む（図２における小文字で表わされた配列）。Ｈ−ｓｉｔｅ−ｌｉｋｅ ｓｅｑは、マイコバクテリウム フォーツイツム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）由来のプラスミドｐＡＬ５０００の複製開始領域に存在する複製タンパク質結合部位として知られているＨｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｉｔｅ（Ｈ−ｓｉｔｅ）に含まれるＧＣｂｏｘと呼ばれる配列に相同性を示す配列をいう（Stolt P, Stoker NG., Nucleic Acids Res. 1997, 25(19):3840-6.を参照）。また、ｐＡＬ５０００におけるＨ−ｓｉｔｅは、ＧＣｂｏｘと呼ばれる８塩基からなる１００％一致パリンドロームを含むことを構造特徴としている。このことより、本明細書では、８塩基以上からなる１００％一致パリンドローム構造を有する配列もまた、Ｈ−ｓｉｔｅ−ｌｉｋｅ ｓｅｑとよぶ。さらに、本明細書では、Ｈ−ｓｉｔｅ−ｌｉｋｅ ｓｅｑなどのように、複製タンパク質のようなＤＮＡ結合タンパク質に結合する配列をＤＮＡ結合タンパク質結合配列とよぶ。
【００５２】
図２によって示される塩基配列は、ｏｒｆ１の上流に酸化剤感受性配列を含む（図２における上部に点線がある斜体で表わされた配列）。一般的に、ＤＮＡ上のＨ−ｓｉｔｅにＤＮＡ結合タンパク質であるＲｅｐＢタンパク質が結合すると、該ＤＮＡにおいて折れ曲がりが起きることが知られている（Chatterjee S, Basu A, Basu A, Das Gupta SK., J Bacteriol. 2007, 189(23):8584-92.を参照）。このＤＮＡの折れ曲がり部分の周辺に、酸化剤に感受性を示す塩基配列の領域（酸化剤感受性配列とよぶ）が存在する。酸化剤感受性配列が酸化剤に感受性を示すということは、このような配列においてＤＮＡの解離が起きていると推測できる。したがって、酸化剤感受性配列から複製が開始されることが示唆される。酸化剤感受性配列およびその周辺の塩基配列として、ＴＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＧＣＧＡＡＡＴＡ（配列番号５８）とその相補鎖が知られている。図２によって示される塩基配列は、図示している通りに、配列番号５８およびその相補鎖に相同性のある配列を、酸化剤感受性配列として含む。
【００５３】
図２によって示される塩基配列は、ｏｒｆ１の上流に近似的な繰り返しモチーフ配列（順方向反復配列）を含む（図２における下部に実線がある太文字で表わされた配列）。また、図２によって示される塩基配列は、ｏｒｆ１の上流およびｏｒｆ１とｏｒｆ２との間に近似的な逆方向反復配列を含む（図２における下部に矢印がある配列）。一般的に、θ（シータ）型プラスミドファミリーの複製とコピー数制御には、繰り返しモチーフ配列であるイテロン（ｉｔｅｒｏｎ）がシスエレメント（ｃｉｓ−ｅｌｅｍｅｎｔ）として重要な働きを担うことが知られている（Chattoraj DK., Mol Microbiol. 2000, 37(3):467-76.およびCha KI, Lim K, Jang S, Lim W, Kim T, Chang H., J Microbiol Biotechnol. 2007, 17(11):1841-7.を参照）。シスエレメントとは、それ自体が保有している遺伝子制御を担う要素を指し、ゲノムや他のプラスミドなど外部から供給されることが可能な要素（トランスエレメント（ｔｒａｎｓ−ｅｌｅｍｅｎｔ））と区別される。たとえば、θ型プラスミドであるｐＣＤ３．４では、１個のイテロン削除によってコピー数が低下し、プラスミドの安定性が低下するという報告がある（van Belkum MJ, Stiles ME., Microbiology. 2006, 152:171-8.を参照）。また、θ型プラスミドであるｐ７０５／５では、ｒｅｐＡ遺伝子のプロモーター領域に存在する逆方向反復配列にＲｅｐＡタンパク質が結合することにより、ＲｅｐＡタンパク質の転写が抑制され、プラスミドのコピー数が調節されるとの報告がある（上記Cha KIらの文献を参照）。一方で、逆方向反復配列が見いだされないθ型プラスミドも存在するとの報告もある（上記van Belkum MJらの文献を参照）。
【００５４】
たとえば、ｐＡＬ５０００において、繰り返しモチーフ配列（イテロン）、ｒｅｐＡ遺伝子およびｒｅｐＢ遺伝子がｐＡＬ５０００の自律的な複製を担う配列と推測されている。ｐＡＬ５０００由来のｒｅｐＡ遺伝子およびｒｅｐＢ遺伝子を有さず、かつ、ｐＡＬ５０００由来の繰り返しモチーフ配列を有するプラスミドに、他のプラスミドに由来するＲｅｐＡタンパク質およびＲｅｐＢタンパク質をトランスに供給すれば、このｐＡＬ５０００由来の繰り返しモチーフ配列を有するプラスミドは複製可能となるとの報告がある（Stolt P, Stoker NG., Microbiology.1996, 142 (Pt 10):2795-802.を参照)。この文献の報告からもわかる通り、繰り返しモチーフ配列はプラスミドの不和合性やコピー数、安定性に関与するシスエレメントであると推測される。
【００５５】
本発明者らは、例８に示す通り、図２によって示される塩基配列のうち、複数の繰り返しモチーフ配列および１個の逆方向反復配列を１セット含む、第１０３１−３１７０位の塩基配列（配列番号３）の領域を含むプラスミドｐＫＲ１４１を作製し、このｐＫＲ１４１がコクリア属細菌内で自律的に複製可能であることを見出した。したがって、図２によって示される塩基配列の第１０３１−３１７０位の塩基配列を除く領域については、外来遺伝子を導入または置換することが可能である。
【００５６】
配列番号３に記載の塩基配列はユニークな塩基配列である。たとえば、配列番号３に記載の塩基配列について、ＤＤＢＪによるＦＡＳＴＡ検索によって相同性検索を実施すると、塩基配列の同一性が約５４％である、アクチノシンネマ ミラム ＤＳＭ４３８２７（Actinosynnema mirum DSM 43827）株が最上位に示される（http://fasta.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html；ＦＡＳＴＡ検索について、Pearson WR, Lipman DJ., (1988), Proc Natl Acad Sci U S A. 85(8):2444-8、 Lipman DJ, Pearson WR., (1985), Science. 227(4693):1435-41、および、Wilbur WJ, Lipman DJ., (1983), Proc Natl Acad Sci U S A. 80(3):726-30を参照）。配列番号３に記載の塩基配列とアクチノシンネマ ミラム ＤＳＭ４３８２７株の塩基配列とのアライメント結果を図１１に示す。
【００５７】
配列番号３に記載の塩基配列はユニークな塩基配列であることから、コクリア属細菌に由来するプラスミドであって、直線状に一本鎖化した形態で、配列番号３に記載の塩基配列のうち連続する５００塩基以上、好ましくは１０００塩基以上、より好ましくは１５００塩基以上、さらに好ましくは１７００塩基以上、なおさらに好ましくは１９００塩基以上の塩基配列に相補的な塩基配列を含むＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプラスミドは、コクリア属細菌内で自律的に増幅する可能性が高い。したがって、このようなプラスミドもまた、本発明のプラスミドに含まれる。
【００５８】
本明細書における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、たとえば、コロニーもしくはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．５〜２．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、４０〜７５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、好ましくは０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。プローブの調製やハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）などに記載されている方法に準じて実施することができる。なお、当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度などの条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブ長さ、反応時間などの諸条件を加味して、本発明のプラスミドにおいて複製領域を得るための条件を設定することができる。
【００５９】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ断片としては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性（同一性）を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡ断片が挙げられる。
【００６０】
配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、たとえば、配列番号３に記載の塩基配列において１から数個、好ましくは１から５０個、より好ましくは１から３０個、さらに好ましくは１から２０個、なおさらに好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の塩基の欠失、置換および／または付加された塩基配列を含む。
【００６１】
「塩基の欠失」とは配列中の塩基に欠落もしくは消失があること、「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていること、および、「塩基の付加」とは塩基が付け加えられていることをそれぞれ意味する。
【００６２】
配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むプラスミドがコクリア属細菌内で自律的に複製可能か否かは、実施例に記載の方法により確認することができる。この方法は、概略すると、配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列と薬剤耐性遺伝子とを連結させた組換えプラスミドを用意し、次いで該組換えプラスミドをコクリア属細菌に導入して形質転換体を製造し、次いで薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤の存在下で該形質転換体を培養し、次いで該形質転換体の増殖を確認することを含む。
【００６３】
図２および３（配列番号４）によって示される塩基配列を有するプラスミドは、コクリア エスピー ＭＢＥ１３１（Ｋｏｃｕｒｉａ ｓｐ． ＭＢＥ１３１）株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８８５）（以下、単にＭＢＥ１３１株とよぶ場合もある）から単離することができる。ただし、本発明のプラスミドは、ＭＢＥ１３１株から単離されるプラスミドであって、配列番号４に記載の塩基配列の全部を含まず、少なくとも配列番号３に記載の塩基配列を含むプラスミドであってもよい。
【００６４】
コクリア属細菌からプラスミドを抽出する方法は特に制限されないが、たとえば、コクリア属細菌をＹＴＮＭ培地などの適当な培地を用いて、コクリア属細菌の増殖に適した条件、たとえば、１５〜３０℃で、１〜３日間静置または振盪培養により増殖し、次いで遠心分離などの操作によって菌体を回収し、次いでリゾチーム処理などによって菌体の細胞壁を溶解し、次いでＨｉｇｈ ｐｕｒｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ロシュ社製）などのプラスミド抽出キットを用いてプラスミドを回収する方法を挙げることができる。
【００６５】
コクリア属細菌から抽出されたプラスミドが、配列番号３または４によって示される塩基配列を含むか否かを確認する方法は、特に制限されないが、たとえば、配列番号３または４によって示される塩基配列の情報を基に作製したＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーション法やｐＫＲ１００の制限酵素地図を基に制限酵素処理した後に、処理後に生じるＤＮＡサイズをアガロースゲル電気泳動によって確認する方法などが挙げられる。
【００６６】
本発明のプラスミドの別の入手方法として、たとえば、ＭＢＥ１３１株やその他のコクリア属細菌から抽出したプラスミドの中から、配列番号３または４に記載の塩基配列の情報を基に合成した、該塩基配列にハイブリダイズし得るプローブやＰＣＲ用のプライマーセットを用いて単離することができる。
【００６７】
本発明のプラスミドによれば、外来遺伝子と連結して、次いでエレクトロポレーション法、プロトプラスト法、カルシウムイオンを用いる方法などのこれまでに知られているＤＮＡ導入法によって、コクリア属細菌などの宿主細胞に導入することにより、外来遺伝子を発現する形質転換体を製造することができる。
【００６８】
本発明のプラスミドは、コクリア属細菌と異なる宿主細胞において自律的に複製可能なプラスミドのＤＮＡ複製領域と連結させることにより、コクリア属細菌とこれとは異なる宿主細胞において自律的に複製可能なシャトルベクターを構築することができる。本発明のプラスミドを用いたシャトルベクターの構築方法は特に制限されないが、たとえば、本発明のプラスミドの全部またはＤＮＡ複製を担う領域を含む一部を、ｐＨＹ３００ＰＬＫなどの大腸菌内で自律的に複製可能なプラスミドのマルチクローニングサイトに連結することにより、宿主細胞をコクリア属細菌および大腸菌とするシャトルベクターを構築することができる。
【００６９】
［２］プラスミド（２）
本発明の別の態様として、以下（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの、細菌内、好ましくはコクリア属細菌その他ミクロコッカセア科細菌内で自律的に複製する機能を担うと推測される複製領域を有する環状プラスミドが挙げられる：
（Ａ）ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列と；レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列と；配列番号４５に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列とを含む複製領域。
（Ｂ）ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列と；レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列と；ＤＮＡ結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列とを含む複製領域。
（Ｃ）ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列と；レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列と；ＤＮＡ結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列、酸化剤感受性配列ならびに逆方向反復配列を含む塩基配列とを含む複製領域。
【００７０】
ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡに結合し得る構造を持ったタンパク質であり、ホメオドメイン(homeodomain)、ジンクフィンガードメイン(Zinc finger domain)、ウイングドヘリックス(winged helix)、ロイシンジッパータンパク質(Leucine zipper protein)、ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質(helix-loop-helix : HLH protein)、ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質(helix-turn-helix : HTH protein)などに構造上分類されている。本発明のプラスミドの複製領域（Ａ）〜（Ｃ）におけるＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列としては、たとえば、上記のＤＮＡ結合タンパク質の遺伝子の塩基配列を制限なく挙げられるが、好ましくはヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質遺伝子の塩基配列であり、より好ましくは配列番号１に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質をコードする塩基配列である。
【００７１】
レプリカーゼ様タンパク質は、核酸のリン酸エステル骨格に沿って核酸の二重らせんや二次構造を解くレプリカーゼ活性を有するタンパク質であり、種々の構造を取りうる。レプリケーションタンパク質（またはレプリカーゼ）の機能についての記載としては、文献Hiraga S, Sugiyama T, Itoh T., J Bacteriol. 1994 Dec;176(23):7233-43の記載があり、たとえば「Ｒｅｐタンパク質は、特異的にオリジンに結合し、かつ、オリジンにてユニークなプライマーＲＮＡを合成する」との記載が挙げられる。
【００７２】
本発明のプラスミドの複製領域（Ａ）〜（Ｃ）におけるレプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列としては、たとえば、ＲｅｐＡタンパク質の遺伝子の塩基配列が挙げられるが、好ましくは配列番号２に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、レプリカーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。
【００７３】
本発明のプラスミドの複製領域（Ａ）は、ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子の塩基配列およびレプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列に加えて、配列番号４５に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む。配列番号４５に記載の塩基配列またはを該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列には、本発明のプラスミドのコクリア属細菌内での自律的な複製に関与すると推測される領域である、ＤＮＡ結合タンパク質結合配列、繰り返しモチーフ配列、酸化剤感受性配列、逆方向反復配列などを含む。配列番号４５に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列は、ＤＮＡ結合タンパク質結合配列としてＴＧＣＣＧＧＣＡ、ＴＧＡＴＣＧＡＴＣＡ（配列番号４７）、ＧＣＡＣＧＴＧＣおよびＣＡＣＣＧＧＴからなる群から選ばれる少なくとも１種の配列；繰り返しモチーフ配列としてＧＧＧＣＣＧＧＧＧＴＴＧ（配列番号５２）、ＴＧＧＴＣＧＴＧＴＴＧ（配列番号５４）、ＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＧＴＧ（配列番号５５）、ＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＴＧＧ（配列番号５６）、およびＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＴＧＧ（配列番号５７）からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列；酸化剤感受性配列としてＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＴＴＣＣＴＡＴＣＧ（配列番号６３）、ＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣ（配列番号６４）、ＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＧＴＧＣＧＣＴＡＡ（配列番号６５）、ＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＣＣＧＡ（配列番号６６）およびＣＴＧＡＧＧＧＴＣＣＴＣ（配列番号６７）からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列；ならびに、逆方向反復配列としてＧＡＡＡＡＡＧＣＣＧＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＴＴＴＴＴＣ（配列番号６８）またはＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＧＣＣＧＧＧＴＧＧＴＡＧＡＧＣＣＣＧＧＣＴＴＴＴＴＣＣＧＴＧ（配列番号６９）を含むことが好ましい。
【００７４】
本発明のプラスミドの複製領域（Ｂ）および（Ｃ）におけるＤＮＡ結合タンパク質結合配列の具体例は、ＣＡＣＣＧＧＴＧ、ＡＣＣＧＧＴＧ、ＣＣＧＧＴＧ、ＡＣＣＧＧＴ、ＣＡＣＡＧＧＴ、ＣＡＣＣＧＧＴ、ＣＡＣＣＧＧ、ＧＴＧＣＧＣＡＣ、ＧＧＣＣＧＧＣＣ、ＴＣＧＧＡＧＣＴＣＣＧＡ（配列番号４６）、ＴＣＣＣＧＧＧＡ、ＴＧＣＣＧＧＣＡ、ＴＧＡＴＣＧＡＴＣＡ（配列番号４７）およびＧＣＡＣＧＴＧＣが挙げられる。
【００７５】
本発明のプラスミドの複製領域（Ｂ）および（Ｃ）における繰り返しモチーフ配列の反復単位の具体例は、ＴＧＧＣＧＴＧＧＴＣＧＴＴＧ（配列番号４８）、ＧＣＧＣＴＧＧＧＧＴＧ（配列番号４９）、ＴＧＧＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号５０）、ＧＣＧＧＴＧＧＴＧ、ＧＣＧＧＴＧＧＴＧＴＧ（配列番号５１）、ＧＧＧＣＣＧＧＧＧＴＴＧ（配列番号５２）、ＧＣＣＧＧＧＧＴＴＧＴ（配列番号５３）、ＴＧＧＴＣＧＴＧＴＴＧ（配列番号５４）、ＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＧＴＧ（配列番号５５）、ＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＴＧＧ（配列番号５６）およびＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＴＧＧ（配列番号５７）が挙げられる。
【００７６】
本発明のプラスミドの複製領域（Ｃ）の酸化剤感受性配列の具体例は、ＴＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＧＣＧＡＡＡＴＡ（配列番号５８）、ＧＧＣＣＴＣＴＣＡＧＣ（配列番号５９）、ＣＴＧＣＧＧＧＣＡＣＣＴＣＣＴＡＣ（配列番号６０）、ＴＴＣＧＡＴＧＡＧ、ＧＧＴＧＡＧＧＧＧＴＡＡＣＣＣ（配列番号６１）、ＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣ（配列番号６２）、ＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＴＴＣＣＴＡＴＣＧ（配列番号６３）、ＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣ（配列番号６４）、ＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＧＴＧＣＧＣＴＡＡ（配列番号６５）、ＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＣＣＧＡ（配列番号６６）およびＣＴＧＡＧＧＧＴＣＣＴＣ（配列番号６７）が挙げられる。
【００７７】
本発明のプラスミドの複製領域（Ｃ）の逆方向反復配列の具体例は、ＧＡＡＡＡＡＧＣＣＧＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＴＴＴＴＴＣ（配列番号６８）およびＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＧＣＣＧＧＧＴＧＧＴＡＧＡＧＣＣＣＧＧＣＴＴＴＴＴＣＣＧＴＧ（配列番号６９）が挙げられる。
【００７８】
後述する例２で述べている通り、ＤＮＡ結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列のいずれかまたはその両方を含む領域が、複製領域においてプラスミドの複製と安定保持に関与していると推測される。そこで、本発明のプラスミドの複製領域（Ｂ）および（Ｃ）は、ＤＮＡ結合タンパク質結合配列、繰り返しモチーフ配列またはＤＮＡ結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列を含む。また、本発明のプラスミドの複製領域（Ｂ）および（Ｃ）は、ＤＮＡ結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列のいずれかまたは両方を２個以上含み得る。
【００７９】
本発明のプラスミドの複製領域（Ｃ）は、酸化剤感受性配列および逆方向反復配列を含む。上記の通り、酸化剤感受性配列は複製の開始に関与すると推測される配列であり、かつ、逆方向反復配列はレプリカーゼ様タンパク質が結合し、結果的にプラスミドのコピー数を調節し得る配列である。本発明のプラスミドの複製領域（Ｃ）は、これらの配列を含有することにより、プラスミドの自律的な複製を制御し得る。なお、本発明のプラスミドの複製領域（Ａ）および（Ｂ）においても、逆方向反復配列を含むことが好ましい。
【００８０】
本発明のプラスミドの複製領域（Ａ）〜（Ｃ）における各配列の数や配置順序は、本発明のプラスミドが細菌内で自律的に複製可能であれば特に制限されず、種々の態様をとることができる。
【００８１】
本発明のプラスミドにおける複製領域（Ａ）〜（Ｃ）の具体例の一つは、配列番号３に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である。
【００８２】
［３］ＤＮＡ断片、ベクターおよび形質転換体
本発明の別の側面によれば、配列番号３に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ断片が提供される。本発明のＤＮＡ断片と外来遺伝子を連結させたものを、コクリア属細菌などの宿主細胞の染色体に、または環状化したプラスミドとして宿主細胞の細胞質内に導入することにより、外来遺伝子を発現する形質転換体が得られる。
【００８３】
本発明のＤＮＡ断片は、上記したＰＣＲ以外にも、これまでに知られているＤＮＡ合成方法を制限なく利用して合成できる。ＤＮＡ合成の具体例としては、配列番号３に記載の塩基配列の情報を基に、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などによって化学合成する方法〔J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967)；同 91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981)；同 24, 245 (1983)〕および配列番号３に記載の塩基配列に対して部位特異的突然変異を導入する方法〔Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987)；同 100, 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」、日本生化学会編, p105 (1986)〕などの遺伝子工学的な方法、ならびにこれらを組合せた方法などがあげられる。たとえば、ＤＮＡの合成は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置も使用できる。
【００８４】
本発明のＤＮＡ断片は、これまでに知られているベクター中に挿入した上で、該ベクターに対応する標的細胞に導入してもよい。このようなベクターは、例えば、自律的に複製することが可能なものでもよいし、標的細胞に導入された際に標的細胞の染色体に組み込まれ、染色体と共に複製されるものであってもよい。ベクターの好ましい例は、発現ベクターである。発現ベクターの具体例としては、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクターなどを挙げることができる。本発明のＤＮＡ断片は、発現ベクターにおいて転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）とともに機能的に連結される。プロモーターは標的細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、標的細胞の種類に応じて適宜選択することができる。
【００８５】
本発明のＤＮＡ断片を含むベクターもまた本発明の別の態様として含まれる。本発明のベクターの好ましい態様は、本発明のプラスミドである。さらに、本発明のプラスミドやベクターを含有してなる形質転換体もまた、本発明の別の態様として含まれる。
【００８６】
本明細書における、プライマーおよびプローブの調製、プラスミドＤＮＡの抽出、ライゲーション、ＤＮＡ導入、クローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーなどに記載の方法に準じて実施することができる。
【００８７】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００８８】
例１ コクリア属細菌由来プラスミドの単離
相模湾内の深度約２０００ｍの底泥から、アクチノマイセス亜目細菌の約２５０株を分離した。そのうち、コクリア属細菌であるコクリア エスピー ＭＢＥ１３１（Kocuria sp. ＭＢＥ１３１）株がプラスミドＤＮＡを含有することを次のように確認した。ＭＢＥ１３１株をＹＴＮＭ培地（１.６％ バクトトリプトン、０．５％ イーストイクストラクト、１％ 塩化ナトリウム、０．１％ 硫酸マグネシウム）中で２５℃２日間振盪培養した。この培養物から遠心操作により菌体を得た。リゾチーム（２ｍｇ／ｍＬ）を含有する２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液において３７℃で１時間保温し、菌体の細胞壁を溶解したのち、Ｈｉｇｈ ｐｕｒｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ロシュ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
【００８９】
例２ プラスミドｐＫＲ１００の塩基配列解析
例１で調製したプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩまたはＳａｌＩで消化して得られたフラグメントをプラスミドベクターｐＵＣ１８にそれぞれクローン化し、各全塩基配列を決定した。その結果、それぞれのクローンは全く同一の塩基配列からなる挿入断片を有している、環状プラスミドであることが分かった。本プラスミドをｐＫＲ１００と命名し、その塩基配列を配列番号４および図１に示した。また、本プラスミドの制限酵素マップに、ＯＲＦを記載したものを図１に示した。プラスミドｐＫＲ１００の塩基配列をＧＥＮＥＴＹＸ ＭＡＣプログラム第１２．１．１版(ＧＥＮＥＴＹＸ社製)を使用して解析した。プラスミドｐＫＲ１００は、３１８７塩基長であり、そのＧ＋Ｃ含量は６３％であった。
【００９０】
塩基番号１の１−１７５１番に示す領域には、近似的な繰り返しモチーフ配列からなるダイレクトリピート構造（図２において、塩基配列下に実線を付して太字で示した）、インバーテッドリピート（ヘアピン構造）（図２において、塩基配列下の矢印で示した）が多数検出された（図１を参照）。これにより本領域は、プラスミド複製やコピー数調節に関与する領域であることが示唆された。また、ｐＫＲ１００全長に対し、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣによるダイレクトリピート（繰り返しモチーフ配列）の検索を実施した。その結果、７４２−７５５と７５６−７６９番塩基に１４塩基対（ＴＧＧＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号５０））からなる１００％一致繰り返し配列が検出された。次に、１４塩基対からなる繰り返しモチーフ配列（ＴＧＧＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号５０））を用いてこれに相同性を示す領域の検索を実施した。１２７８−１２９１番塩基にはＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＴＧＧ（配列番号５６）が見出され７４２−７５５番塩基と１１／１４塩基が一致した。また、４１０−４２０、８７６−８８４、１０００−１０１１、１１７０−１１８２、１７２３−１７３５番塩基にも相同性を示す部分が存在した。繰り返しモチーフ配列（ＴＧＧＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号５０）、７４２−７５５および７５６−７６９番塩基）に相同性を示した１２７８−１２９１番塩基（ＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＴＧＧ（配列番号５６））に対しても同様にこれに相同性を示す領域の検索を行なった。その結果、７４２−７５５、３７６−３８９、８７６−８８６、１００２−１０１２、１１６４−１１７４番塩基が相同性を示した。よって、ｐＫＲ１００のこれらの近似的な繰り返し配列のいずれかがｐＫＲ１００の複製とコピー数制御に関与していることが示唆された。
【００９１】
ｐＫＲ１００全長に対し、ＧＥＮＥＴＹＸによるインバーテッドリピート＆コンプリメンタリー配列の検索を実施した。その結果、インバーテッドリピート配列が８０６−８３５、１３２２−１３６１番塩基に検出された。
【００９２】
ｐＫＲ１００において、１−１７５１番に示す領域には、マイコバクテリウム フォーツイツム（Mycobacteriu fortuitum）由来のプラスミドｐＡＬ５０００の複製開始領域に存在する複製タンパク質結合部位として知られているＨｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｉｔｅ（Ｈ−ｓｉｔｅ）中のＧＣｂｏｘと呼ばれる配列に相同性を示す配列が検出された（図１において、小文字で示した）。また、ｐＫＲ１００全長に対し、Ｈ−ｓｉｔｅ（ＤＮＡ結合タンパク質結合配列）の中で、最も重要な８塩基対からなるＧＣｂｏｘと呼ばれる配列ＣＡＣＣＧＧＴＧを用いて遺伝子解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ ｖｅｒ．１２．１．０（ＧＥＮＥＴＹＸ社製）による相同性検索を実施した。その結果、連続する７塩基が完全一致する箇所が、ｐＫＲ１００の４４２−４４８番の塩基配列、１３９９−１４０５番の塩基配列に検出された。これらのＨ−ｓｉｔｅ−ｌｉｋｅ ｓｅｑがＲｅｐＢタンパク質とプラスミドの結合の際に重要な役割を担う塩基配列であると予測できる。したがって、これらのＨ−ｓｉｔｅ−ｌｉｋｅ ｓｅｑは、単独または両方とも、ｐＫＲ１００の複製に関与すると予想される。
【００９３】
複製開始に関与すると推測される酸化剤感受性配列について、ｐＫＲ１００全長を対象に、ＴＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＧＣＧＡＡＡＴＡ（配列番号５８）を用いてＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣによる相同性検索を行った。その結果、上記配列に相同性を示す箇所が、ｐＫＲ１００の非ｏｒｆ領域に検出された。ＴＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＧＣＧＡＡＡＴＡ（配列番号５８）に相同性を示す配列部分の内の一つがｐＫＲ１００の複製開始点となる可能性が高いと思われる。特に、ＴＧＴＧＧＧＧは１２００−１２１１番塩基（ＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣ（配列番号６４））、３７０−３７９番塩基（ＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣ（配列番号６２））には高い相同性が見いだされた。また、その他にも相同性を示す配列が複数箇所検出された。これらの配列のうちいずれか１つまたは複数が、ＤＮＡの解離点として複製開始に関与する可能性は高いと推測される。
【００９４】
以上の通り、ｐＫＲ１００の非ｏｒｆ領域のうち、近似的な繰り返しモチーフ配列からなるダイレクトリピートまたはＨ−ｓｉｔｅ様配列のいずれかまたはその両方を含む領域が、プラスミドの複製と安定保持に関する機能を有する領域と推測される。
【００９５】
続いて、オープンリーディングフレーム解析を行なったところ、２つのオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ１とｏｒｆ２）が存在すること示唆された（図１を参照）。ｏｒｆ１のコードするタンパク質（ＯＲＦ１）は７０アミノ酸からなり、推定分子量は８．１ｋＤａ、等電点は１０．４と算出された。ｏｒｆ１がコードするアミノ酸配列の相同性検索を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）の ＢＬＡＳＴプログラムを使用して行った。しかし、ＯＲＦ１に一致するアミノ酸配列はデータベース上に見出されなかった。
【００９６】
ＯＲＦ１のアミノ酸配列を用いてAPSSP2: Advanced Protein Secondary Structure Prediction Server（http://www.imtech.res.in/raghava/apssp2/）（Raghava, G. P. S. (2002) APSSP2 : A combination method for protein secondary structure prediction based on neural network and example based learning. CASP5. A-132.を参照）により２次構造予測を行なったところ、ランダムコイル構造で隔てられた２つのヘリックス構造を有することが推定され、ＤＮＡ結合タンパク質において典型的に見出される特徴的なヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）構造を形成するＤＮＡ結合タンパク質であることが示唆された。ｏｒｆ２のコードするタンパク質（ＯＲＦ２）は３８５アミノ酸からなり、推定分子量は４１ｋＤａ、等電点は１１．１と算出された。ＯＲＦ２と一致するタンパク質をＮＣＢＩのＢＬＡＳＴプログラムにより検索したところ、 レプリカーゼスーパーファミリータンパク質に相同性を示した。しかし、最も相同性が高いものとして、わずか３１％（８０／２５７アミノ酸、Ｅ−ｖａｌｕｅ ６ｅ−６）の一致性を示すロドコッカス ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）由来のｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ（アクセッション番号ＹＰ_３４５１６４）がヒットしたにすぎなかった。ＯＲＦ２はプラスミドｐＫＲ１００の複製に関与するタンパク質であることが示唆された。
【００９７】
例３ ＭＢＥ１３１株の系統解析
例１で得たＭＢＥ１３１株の総ＤＮＡより、配列番号７および８に記載の塩基配列からなるプライマーセットを用いて１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅した。増幅断片をＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ （ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製し、その塩基配列を決定した。ＭＢＥ１３１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は、データベースに登録されているコクリア ロゼア（Kocuria rosea）標準株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列（アクセッション番号 Ｘ８７７５６）に対して、９９％の塩基配列の同一性を示した。これによりＭＢＥ１３１株は、系統分類学的にコクリア ロゼアに最も近縁の種であると想定される。
【００９８】
例４ コクリア エスピー ＭＢＥ１３１株とコクリア ロゼア標準株との比較
ＭＢＥ１３１株を、ＹＴＭＮ培地で２５℃、２日間培養し、得られた菌体から例１と同様の手順で、プラスミド精製キットを用いたプラスミド抽出操作を行った。一方、菌株保存機関に保存されているコクリア属細菌であるコクリア ロゼア 標準株（ＮＢＲＣ１５５８８）を同条件で培養し、培養物から得られた菌体を同様の操作に供した。続いて、前述の２株より抽出した各ＤＮＡ溶液をアガロース電気泳動に供した（図５を参照）。その結果、ＭＢＥ１３１株の場合には、プラスミドＤＮＡのバンドが検出されたが、コクリア ロゼア標準株では検出されなかった。
【００９９】
また、抽出した各ＤＮＡ溶液を鋳型として、ｐＫＲ１００の塩基配列に相補的な配列を有するフォワードプライマーおよびリバースプライマーのプライマーセットＡ−Ｆ（表１）を用いてＰＣＲを実施した。
【表１】
【０１００】
ＰＣＲでは、ＬＡ ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、熱変性条件：９８℃にて３０秒間、アニーリング条件：６２℃にて、６０秒間、伸長条件：７２℃にて２分間の反応を１サイクルとして、これを合計３０サイクル繰り返した。得られたＰＣＲ反応物をアガロース電気泳動に供したところ、ＭＢＥ１３１株から得られたＤＮＡ溶液を鋳型として用いた場合は、配列番号１に基づいて算出される大きさと一致する増幅断片が検出されたが、コクリア ロゼア標準株から得られたＤＮＡ溶液を鋳型として用いた場合は、増幅断片は検出されなかった（図６を参照）。なお、図６のレーン、プライマーセットおよび鋳型に用いたＤＮＡの関係を表２に示す。
【表２】
【０１０１】
さらに、ＭＢＥ１３１株またはコクリア ロゼア標準株を０．１ｍｇ／ｍＬ プロテアーゼＫを含む０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ溶液にけん濁し、６５℃にて２０分間保温した後、１００℃にて１０分間加熱し、細胞溶解液を調整した。各菌株より得られた細胞溶解液を鋳型ＤＮＡ溶液として、前述のプライマーセットＡ−Ｆ(表１)を用いたＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応では、ＬＡ ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、熱変性条件：９８℃にて３０秒間、アニーリング条件：６２℃にて、６０秒間、伸長条件：７２℃にて２分間の反応を１サイクルとして、これを合計３０サイクル繰り返した。得られたＰＣＲ反応物をアガロース電気泳動に供したところ、ＭＢＥ１３１株から得られた細胞溶解液を鋳型ＤＮＡ溶液として用いた場合は、配列番号１に基づいて算出される大きさと一致する増幅断片が検出されたが、コクリア ロゼア標準株から得られた細胞溶解液を鋳型ＤＮＡ溶液として用いた場合は、増幅断片は検出されなかった（図７を参照）。以上の結果より、プラスミドｐＫＲ１００は、コクリア ロゼア 標準株には存在しないことが分かった。なお、図７のレーン、プライマーセットおよび鋳型に用いたＤＮＡの関係を表３に示す。
【表３】
【０１０２】
例５ シャトルベクターの構築
プラスミドｐＫＲ１００の配列番号４の７−３１７０番に示す塩基配列を含むＤＮＡ断片とスタフィロコッカス オーレウス（Staphyrococcus aureus）由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子を、ｐＨＹ３００ＰＬＫのマルチクローニングサイトに連結し、大腸菌とのシャトルベクターｐＲ６６３２を構築した。コクリア属細菌ＭＢＥ１３１株の形質転換は、ｐＲ６６３２を有する大腸菌ＨＢ１０１の形質転換体から調製したプラスミドを用いて、以下の諸条件からなるエレクトロポレーションによって実施した。プラスミドＤＮＡ ０．１〜１０μg；電場強度６〜２５ｋＶ／ｃｍ；抵抗５０〜９００Ω。細胞のパルス処理後のインキュベーション時間は３０℃で３時間とした。
【０１０３】
２μg／ｍＬのクロラムフェニコールまたは４μg／ｍＬのテトラサイクリン含有のＹＴＮＭ寒天培地上で、３０℃で５〜７日間培養した。増殖したコロニーを、０．１ｍｇ／ｍＬ プロテアーゼＫを含む０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ溶液にけん濁し、６５℃にて２０分間保温した後、１００℃にて１０分間加熱し、細胞溶解液を調整した。得られた細胞溶解液を鋳型ＤＮＡ溶液として、ｐＲ６６３２の有するクロラムフェニコール耐性遺伝子塩基配列に相補的なプライマーセット（配列番号２１および２２に記載の塩基配列からなるプライマーセット）を用いたＰＣＲを行った。本ＰＣＲではクロラムフェニコール耐性遺伝子はＭＢＥ１３１野生株およびプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫには存在しないため、導入されたｐＲ６６３２の選択的検出が可能である。ＰＣＲでは、ＬＡ ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、熱変性条件：９８℃にて３０秒間、アニーリング条件：６０℃にて、６０秒間、伸長条件：７２℃にて１分間の反応を１サイクルとして、これを合計３０サイクル繰り返した。得られたＰＣＲ反応物をアガロース電気泳動に供したところ、ＭＢＥ１３１株形質転換株から得られた細胞溶解液を鋳型ＤＮＡ溶液として用いた場合は、ｐＲ６６３２の塩基配列から算出される増幅断片が検出された（図８のレーン２を参照）。比較として、野生型のＭＢＥ１３１株を用いて同試験を行ったが、増幅断片は検出されなかった（図８のレーン３を参照）。
【０１０４】
一方、ＭＢＥ１３１形質転換体をＹＴＮＭ培地で３０℃にて１日培養し、例１と同様にプラスミド精製キットを用いてプラスミド抽出操作を行った。得られたＤＮＡ溶液を用いて、大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。大腸菌形質転換体から同プラスミド精製キットを用いてプラスミドを調製し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動に供した（図９を参照）。比較対象として、同制限酵素で消化したｐＨＹ３００ＰＬＫも同時に泳動した（図９のレーン２）。その結果、制限酵素消化パターンより、得られたＭＢＥ１３１形質転換株が有するプラスミドは、ｐＲ６６３２であることが分かった（図９のレーン３）。
【０１０５】
その結果、プラスミドｐＲ６６３２は、ＭＢＥ１３１株中で複製・保持されることが分かった。ｐＫＲ１００を有するＭＢＥ１３１株が持つＹＴＮＭ固体培地上でのクロラムフェニコール耐性が１μg／ｍＬ未満であるのに対し、ｐＲ６６３２で形質転換されたＭＢＥ１３１株は５０μg／ｍＬのクロラムフェニコールに耐性を示した。また、ｐＲ６６３２はエンテロコッカス ファエカリス（Enterococcus faecalis）由来のテトラサイクリン遺伝子も有しており、ｐＫＲ１００を有するＭＢＥ１３１株が持つテトラサイクリン耐性が３μg／ｍＬ未満であるのに対し、ｐＲ６６３２で形質転換されたＭＢＥ１３１株は１００μg／ｍＬのテトラサイクリンに耐性を示した。従って、ｐＫＲ１００を含むプラスミドはＭＢＥ１３１株において、異種外来遺伝子を保持、発現させるためのベクターとして機能すると考えられる。
【０１０６】
例６ 複製を担う領域の特定
プラスミドｐＫＲ１００の一部を含む種々のＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。ｐＨＹ３００ＰＬＫのマルチクローニングサイトに上述のクロラムフェニコール耐性遺伝子を連結し、さらに図４に示した各断片を連結した。構築した各プラスミドで大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、大腸菌ＨＢ１０１形質転換体からプラスミドを調製した。調製したプラスミドを用いて、上述の方法でＭＢＥ１３１株を形質転換した。その結果、配列番号１の１０３１−３１７０番の塩基配列を含む断片を有するプラスミドを用いた場合にＭＢＥ１３１株を形質転換することができた（図４を参照）。従って、配列番号１に示す１０３１−３１７０番の塩基配列で示す領域はＭＢＥ１３１株中でプラスミドの複製・保持を担う領域であるといえる。なお、配列番号１の１０３１−３１７０番の塩基配列を含む断片は、次のようにして得た。プラスミドｐＫＲ１００を鋳型として、表４に示すＧからＱのフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマーセットから選ばれる一組のプライマーセットを用いて、ＰＣＲ反応を行なった。
【表４】
【０１０７】
ＰＣＲ反応では、ＬＡ ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、熱変性条件：９４から９８℃にて１５から３０秒間、アニーリング条件：５５から６８℃にて、１５から６０秒間、伸長条件：７２℃にて２から５分間の反応を１サイクルとして、これを合計３０サイクル繰り返した。
【０１０８】
例７ 異種を宿主細胞とした形質転換体の作製
プラスミドｐＲ６６３２を用いて、種の異なるコクリア属細菌Kocuria rhizophila ＤＣ２２０１（ＮＢＲＣ１０３２１７）を形質転換した。形質転換体を２μg／ｍＬのクロラムフェニコールまたは４μg／ｍＬのテトラサイクリン含有のＹＴＮＭ寒天培地上で、３０℃で５〜７日間培養した。増殖したコロニーを、０．１ｍｇ／ｍＬ プロテアーゼＫを含む０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ溶液にけん濁し、６５℃にて２０分間保温した後、１００℃にて１０分間加熱し、細胞溶解液を調整した。得られた細胞溶解液を鋳型ＤＮＡ溶液として、ｐＲ６６３２の有するクロラムフェニコール耐性遺伝子塩基配列に相補的なプライマーセット（配列番号２１および２２の塩基配列からなるフォワードプライマーおよびリバースプライマー）、テトラサイクリン耐性遺伝子塩基配列に相補的なプライマーセット（配列番号４３および４４の塩基配列からなるフォワードプライマーおよびリバースプライマー）、を用いたＰＣＲを行った。
【０１０９】
クロラムフェニコール耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子はＤＣ２２０１株ゲノム上には存在していないため、ｐＲ６６３２の選択的検出が可能である。ＰＣＲでは、ＬＡ ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、熱変性条件：９８℃にて３０秒間、アニーリング条件：６０℃にて、６０秒間、伸長条件：７２℃にて１分間の反応を１サイクルとして、これを合計３０サイクル繰り返した。得られたＰＣＲ反応物をアガロース電気泳動に供したところ、ＤＣ２２０１形質転換株から得られた細胞溶解液を鋳型ＤＮＡ溶液として用いた場合、ｐＲ６６３２の塩基配列から算出される増幅断片が検出された（図１０のレーン１および２を参照）。また、ＭＢＥ１３１株形質転換体を用いた場合に得られたＰＣＲ増幅断片の大きさとも良く一致した（図１０のレーン４および５を参照）。比較として、ＤＣ２２０１野生株を用いて同試験を行ったが、増幅断片は検出されなかった（図１０のレーン６および７を参照）ことから、検出された増幅断片は、導入されたプラスミドｐＲ６６３２に由来することが分かった。以上の結果より、プラスミドｐＲ６６３２はＤＣ２２０１株においても、複製および保持されることが分かった。
【０１１０】
このことから、プラスミドｐＲ６６３２は、さらに他の種の異なるコクリア属細菌中でも複製・保持されることが可能であると考えられる。プラスミドを有していないＤＣ２２０１株が持つＹＴＮＭ固体培地上でのクロラムフェニコール耐性が１μg／ｍＬ未満であるのに対し、ｐＲ６６３２で形質転換されたＤＣ２２０１株は１０μg／ｍＬのクロラムフェニコールに耐性を示した。従って、ｐＫＲ１００の複製を担う領域を含むプラスミドは、種の異なるコクリア属細菌においても、異種外来遺伝子を保持、発現させるためのベクターとして機能すると考えられる。
【０１１１】
例８ ｐＫＲ１００における非タンパク質コード領域の機能解析
ｐＫＲ１００の有するタンパクをコードしないＤＮＡ塩基配列の機能を確かめるために、以下の実験を行った。ｐＫＲ１００の一部が欠如したＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＫＲ１１１、ｐＫＲ１２１、ｐＫＲ１４１を作成した。これらのプラスミドはｐＲ６６３２と同様に、クロラムフェニコール耐性遺伝子を選択マーカーとして有している。ｐＫＲ１１１はｐＫＲ１００の３１２−３１７０番に由来するＤＮＡ断片を有し、ｐＫＲ１２１はｐＫＲ１００の５５９−３１７０番に由来するＤＮＡ断片を有し、ｐＫＲ１４１はｐＫＲ１００の１０３１−３１７０番に由来するＤＮＡ断片を有している。ｐＫＲ１１１およびｐＫＲ１２１はｐＲ６６３２と同様に、近似的な繰り返しモチーフ配列からなるダイレクトリピートとインバーテッドリピートからなる特徴的な配列を２セット有しているが、ｐＫＲ１４１では１セットのみである。各プラスミドを有する形質転換体ＭＢＥ１３１（ｐＲ６６３２）ＭＢＥ１３１（ｐＫＲ１１１）、ＭＢＥ１３１（ｐＫＲ１２１）、ＭＢＥ１３１（ｐＫＲ１４１）を２５℃にて、抗生物質を含有しないＹＴＮＭ培地中２０世代培養した。培養後の培養液を、抗生物質を含有しないＹＴＮＭ寒天培地に塗布し、２５℃にて３日間、単一コロニーを形成させた。固体寒天培地上に増殖した各コロニーを、抗生物質を含有していないＹＴＮＭ寒天培地とクロラムフェニコールを含有する個体寒天培地に同時にピックアップした。抗生物質を含有しない固体寒天培地に増殖したコロニー数に対する、クロラムフェニコール含有固体寒天培地に増殖したコロニー数を算出し、プラスミド保持率（％）とした（図１２を参照）。この結果、近似的な繰り返しモチーフ配列からなるダイレクトリピートとインバーテッドリピートからなる特徴的な配列を１セットしか有していないｐＫＲ１４１は他の被験プラスミドに比べて、プラスミド安定性が低いことが分かった。すなわち、ｐＫＲ１００の５５９−１０３１番塩基配列は、プラスミドの安定保持に関与する機能を持つことが分かった。また、さらにｐＫＲ１４１に存在するダイレクトリピートをした削除プラスミドはＭＢＥ１３１株中で複製不可能である（すでに記載の実施例、例６より）ことからダイレクトリピートとインバーテッドリピートからなる特徴的な配列は、ｐＫＲ１００の複製や安定保持に重要な役割を担っていると判断される。また、ｐＫＲ１００の５５９−３１７０番塩基は、プラスミドの複製、安定性に重要な役割を持つと判断される。
【０１１２】
以下に、本明細書に記載のある塩基配列を列記する。
［配列番号１］ｐＫＲ１００におけるｏｒｆ１領域
ATGGGCGACCCTCAGCTTGTAATGGGCTTTTTCCAGGTCTTCCTTCGTGCCTTTCTCGTACAGAGCGTCTGCTTCGAGAAGGGCCCATTCCGCTTCGACAAACTGCCGGGCAAGAAGTTTTTTGCTGGATGGCTTAGTCATGGCAAGGAACGTAGCTGCCGAAGTAGTGAAGGCTGTACAGATCCGACGCGGTTCGCGCGGGTCCGTCAGTAG
［配列番号２］ｐＫＲ１００におけるｏｒｆ２領域
GTGACCAGTGTAGGCACGCACCTTCCCTCGTCCACCAGCCCCGCCGCAACACGGCAGGCGGCTGTTCGGCAGGCATTTGTTAACCATTTAGGCGTGCGCCACGTGCGTGTGGCGGCCACCAAGAACGGTGCGCCGCGCACCGTTCCCATTGAGGCGTTAGGCGAGTTCGCCTTTTGGACGCCACCGGCCTGGCCCAACCTCGGATTGCTGACTATTGACGTCGACCGGGATGCGGCCGTGCTCGAGCTCTTCGCCGCCCCTGCCCTGCCGCATGTGGTCGTGGAGACCCCCCGCGGGGCCCAAGCGGTGTGGCTGATCGACCGAGTACACACCGGCCCGAACGCCCGCCCGCACCCGATCGCCTATGCCGAAACCGTAGGAAGCGCTTTGCGTGCCTCCCTGGATGGAGACTCGGCCGTGGATCCATTGCGCCCGGTACGTACCCGTAACCCCTGCTACAGACCTGCACAGCGCGATGTGTTCACCACTGCCCGCCCGCTAACGGCGCCCTACCGTCTCGGAGAGCTCCAGAAATCCCTGGATGCTGCTGGAGCATGGCCAACACGTCCTGAGCGCTCTCAGGCCCGTGGAAGGGCGCAGAAGGCCGTTGACGGAGTGTTCGTGGGCCGTAACGACGCCGTCAACCGCTCCACCTGGCTGACCGTGCGCTACGGACTCGAAAATGGTTCCGTGACTCACTGGACCGATGCCGACGTGCTGGAGCTGGCCCATGGCATTAACGAGGCCGTCGCTGCTGAGCAAGGCGTGCCGCCCTTACCCGAGGATCAAGTGCGCGACTTGGCTGTCTCGATCTGCCGGCATCAACACCGACCTGGCCGCCGAGCCATCTCCGGACAAGGCTCGGCCACCGCCCGCGCCCTCGGCGCTAAAGGCGGCGCAGCCCGTTCCGAGGCCAAAACCATTAGCGGGCGGCGCAACGTGGGCAAGGCGACCGCTGTGCGTTCCGCATCCGCGGCCTTGCGTTCTGAGAGCATCCGAATCCTGGCCGAGCAAGGGCACACCTACGAGGCCATTGCCGCCGCTGTCGGATGCTCCACTAAGACCGTTCAGCGTGCTCTTCGCGACCTCTGA
［配列番号３］ｐＫＲ１００における複製領域
CGGTCAGGCTGGACGGTGCGTGGTCATAAACCGTGGGTCGGTTCGGAGAGCCGGGGGGTGGCTTCCTATCGTCGTGAGATGAGCAGAGAACGCTATGAGCCGATGAGTGAGGCCCGGTTGGAAGTCGCTTGGATGGTCGTGTTGCTGGGGTGTGCGCTGGTTCTTATGGGTGGGGTGGCCCTGGATGTGTTGATCGATCATCTCGCTGTCAGCTTCGCCTTGGCGGGGGTGCCGAGTGTGTTGGTGGTGGCGGTGTTGTGGCGGCGGCACGTGCGCTAAGCCGTGTACGGGCACAGAAAAAGCCGGGTGGTAGAGCCCGGCTTTTTCCGTGGGGGAGAGTCTCGTACCCCGCGTCTCAGTGTCCTGCACACCGGTCGTGATGCCTACTGCCGCTACACGGAGCAAAGCTATGCGTTATGTGCCATAAACGCGGATCGCCCTTCGTCCAGCTCGTGGAGCTGGCTGAGTGCCTATGTGCCATAGGCGGGCGGGGGCACCCGAGCGGGCTCGTGTGAGCGCTGCGCTGGGCATAGGGAAGGCCGGGCGCTAGCCCAGCCCTCCATGGGGGCAGAGGGCCCCGTGGTGTTGAGAGTGGCGAGCCCTACTGAGGGTCCTCGAAGGCGTCGGGGGCGCTTCGTGTCCTCTTCAGTTTTTGATCCCTGGCGTCCTGAACTTCGTTCGCGACTGCCTCCGGGGTGCCGGTGGCAAGGAGAGCATGCACATGGGCGACCCTCAGCTTGTAATGGGCTTTTTCCAGGTCTTCCTTCGTGCCTTTCTCGTACAGAGCGTCTGCTTCGAGAAGGGCCCATTCCGCTTCGACAAACTGCCGGGCAAGAAGTTTTTTGCTGGATGGCTTAGTCATGGCAAGGAACGTAGCTGCCGAAGTAGTGAAGGCTGTACAGATCCGACGCGGTTCGCGCGGGTCCGTCAGTAGGCCAGTGATGGGCCATAGGGTGACCAGGAAAGAGTTGAGCCCCGGAGATTCCACCCTCCGGGGCTCGACTTCCCCGATTGATAGCGGCAATCAGGAGAAGCCTTGTGACCAGTGTAGGCACGCACCTTCCCTCGTCCACCAGCCCCGCCGCAACACGGCAGGCGGCTGTTCGGCAGGCATTTGTTAACCATTTAGGCGTGCGCCACGTGCGTGTGGCGGCCACCAAGAACGGTGCGCCGCGCACCGTTCCCATTGAGGCGTTAGGCGAGTTCGCCTTTTGGACGCCACCGGCCTGGCCCAACCTCGGATTGCTGACTATTGACGTCGACCGGGATGCGGCCGTGCTCGAGCTCTTCGCCGCCCCTGCCCTGCCGCATGTGGTCGTGGAGACCCCCCGCGGGGCCCAAGCGGTGTGGCTGATCGACCGAGTACACACCGGCCCGAACGCCCGCCCGCACCCGATCGCCTATGCCGAAACCGTAGGAAGCGCTTTGCGTGCCTCCCTGGATGGAGACTCGGCCGTGGATCCATTGCGCCCGGTACGTACCCGTAACCCCTGCTACAGACCTGCACAGCGCGATGTGTTCACCACTGCCCGCCCGCTAACGGCGCCCTACCGTCTCGGAGAGCTCCAGAAATCCCTGGATGCTGCTGGAGCATGGCCAACACGTCCTGAGCGCTCTCAGGCCCGTGGAAGGGCGCAGAAGGCCGTTGACGGAGTGTTCGTGGGCCGTAACGACGCCGTCAACCGCTCCACCTGGCTGACCGTGCGCTACGGACTCGAAAATGGTTCCGTGACTCACTGGACCGATGCCGACGTGCTGGAGCTGGCCCATGGCATTAACGAGGCCGTCGCTGCTGAGCAAGGCGTGCCGCCCTTACCCGAGGATCAAGTGCGCGACTTGGCTGTCTCGATCTGCCGGCATCAACACCGACCTGGCCGCCGAGCCATCTCCGGACAAGGCTCGGCCACCGCCCGCGCCCTCGGCGCTAAAGGCGGCGCAGCCCGTTCCGAGGCCAAAACCATTAGCGGGCGGCGCAACGTGGGCAAGGCGACCGCTGTGCGTTCCGCATCCGCGGCCTTGCGTTCTGAGAGCATCCGAATCCTGGCCGAGCAAGGGCACACCTACGAGGCCATTGCCGCCGCTGTCGGATGCTCCACTAAGACCGTTCAGCGTGCTCTTCGCGACCTCTGAAACAGTCTCC
［配列番号４］ｐＫＲ１００
ATAAGCCCAAGGTGAGGGGACGCTCCCCGGGCCTCTCAGCCCCCCCTCTGAGGGCTCCTGCGGGCACCTCCTACGATCCTCCGAACAGCCCTGATCGTCACACCTCATGCATCATTCGATGAGCCAGGTCTAGGTGACCAAACGCAGGCGGCCACAGACTCAGCTGCACTCTCATCGTGAGGTGCCCAGAGCGTCGCAACAAGGCACCGACCCAGCCTCAATTTTCATCCGCCGGCCTTAACGGCGACCGTCACTGTTGATGACTTTTGCTGTCCTCGAATCACCCTTCGCGGGTGAGGGGTAACCCGCTTCGGGTGAGGCAACCAGAACGGGTCCCTGTGCTCGGCTATGTGGTCGAGCAGGTGCCTGGTGGGGTGGCGTGGTCGTTGTCGGCGGGCCGGTTTCGGGCGCGCTGGGGTGACCTAGCTGTGCGCACCGAGGACCGGTGCGAAGGACAAGATGAGCGTCTTTCCCGAGGGCCGGCCAAAGAATGCAAGAGGTGTGACGACTTGGATCAGAGTTCGGAGCTCCGACGCATTGGGAGGTGATTGGGTGCAGCGTGAGACCAGTCCGTAGCGTTTGACGAATGCAAATGCGACGCGGGGACCAGGAGGCTAGACATCGTCGAGATATGGCTTGGATTCTGGTGCTGCTGGCTGGAGTGCAGGTGGGTTTGCTGGCGACGGTGATCGGTGTCTTGGTCGAGGACCTCGTGGTGGGCACTGTCGTTGCTTTGGTTCCTGGGGCTGTGGTGGTGGGGCTGTGGTGGCGGCGGTTTTTGGACTAGCCGGCGTTGCTGGGCATGGAAAAAGCCGGGCTGCTGCCCGGCTTTTTCTTCTGGGAGGCGGGGCCTGGTCAACCGGGCCTCCCGGGAAGCGGTGGTGTGAGCACGTCAGTTCCCGCCTCCAGTGTTGGCCGTTCTTCGGTTTGTTCCCAAAAGTGACGGCGATGGGTGGGTGGAAGGTCCCGTCCAGGTCTGATTTGCCGGCACAGGTTGCTGGGCCGGGGTTGTCCCCGTAGGGGTCTGTCCCGGTCAGGCTGGACGGTGCGTGGTCATAAACCGTGGGTCGGTTCGGAGAGCCGGGGGGTGGCTTCCTATCGTCGTGAGATGAGCAGAGAACGCTATGAGCCGATGAGTGAGGCCCGGTTGGAAGTCGCTTGGATGGTCGTGTTGCTGGGGTGTGCGCTGGTTCTTATGGGTGGGGTGGCCCTGGATGTGTTGATCGATCATCTCGCTGTCAGCTTCGCCTTGGCGGGGGTGCCGAGTGTGTTGGTGGTGGCGGTGTTGTGGCGGCGGCACGTGCGCTAAGCCGTGTACGGGCACAGAAAAAGCCGGGTGGTAGAGCCCGGCTTTTTCCGTGGGGGAGAGTCTCGTACCCCGCGTCTCAGTGTCCTGCACACCGGTCGTGATGCCTACTGCCGCTACACGGAGCAAAGCTATGCGTTATGTGCCATAAACGCGGATCGCCCTTCGTCCAGCTCGTGGAGCTGGCTGAGTGCCTATGTGCCATAGGCGGGCGGGGGCACCCGAGCGGGCTCGTGTGAGCGCTGCGCTGGGCATAGGGAAGGCCGGGCGCTAGCCCAGCCCTCCATGGGGGCAGAGGGCCCCGTGGTGTTGAGAGTGGCGAGCCCTACTGAGGGTCCTCGAAGGCGTCGGGGGCGCTTCGTGTCCTCTTCAGTTTTTGATCCCTGGCGTCCTGAACTTCGTTCGCGACTGCCTCCGGGGTGCCGGTGGCAAGGAGAGCATGCACATGGGCGACCCTCAGCTTGTAATGGGCTTTTTCCAGGTCTTCCTTCGTGCCTTTCTCGTACAGAGCGTCTGCTTCGAGAAGGGCCCATTCCGCTTCGACAAACTGCCGGGCAAGAAGTTTTTTGCTGGATGGCTTAGTCATGGCAAGGAACGTAGCTGCCGAAGTAGTGAAGGCTGTACAGATCCGACGCGGTTCGCGCGGGTCCGTCAGTAGGCCAGTGATGGGCCATAGGGTGACCAGGAAAGAGTTGAGCCCCGGAGATTCCACCCTCCGGGGCTCGACTTCCCCGATTGATAGCGGCAATCAGGAGAAGCCTTGTGACCAGTGTAGGCACGCACCTTCCCTCGTCCACCAGCCCCGCCGCAACACGGCAGGCGGCTGTTCGGCAGGCATTTGTTAACCATTTAGGCGTGCGCCACGTGCGTGTGGCGGCCACCAAGAACGGTGCGCCGCGCACCGTTCCCATTGAGGCGTTAGGCGAGTTCGCCTTTTGGACGCCACCGGCCTGGCCCAACCTCGGATTGCTGACTATTGACGTCGACCGGGATGCGGCCGTGCTCGAGCTCTTCGCCGCCCCTGCCCTGCCGCATGTGGTCGTGGAGACCCCCCGCGGGGCCCAAGCGGTGTGGCTGATCGACCGAGTACACACCGGCCCGAACGCCCGCCCGCACCCGATCGCCTATGCCGAAACCGTAGGAAGCGCTTTGCGTGCCTCCCTGGATGGAGACTCGGCCGTGGATCCATTGCGCCCGGTACGTACCCGTAACCCCTGCTACAGACCTGCACAGCGCGATGTGTTCACCACTGCCCGCCCGCTAACGGCGCCCTACCGTCTCGGAGAGCTCCAGAAATCCCTGGATGCTGCTGGAGCATGGCCAACACGTCCTGAGCGCTCTCAGGCCCGTGGAAGGGCGCAGAAGGCCGTTGACGGAGTGTTCGTGGGCCGTAACGACGCCGTCAACCGCTCCACCTGGCTGACCGTGCGCTACGGACTCGAAAATGGTTCCGTGACTCACTGGACCGATGCCGACGTGCTGGAGCTGGCCCATGGCATTAACGAGGCCGTCGCTGCTGAGCAAGGCGTGCCGCCCTTACCCGAGGATCAAGTGCGCGACTTGGCTGTCTCGATCTGCCGGCATCAACACCGACCTGGCCGCCGAGCCATCTCCGGACAAGGCTCGGCCACCGCCCGCGCCCTCGGCGCTAAAGGCGGCGCAGCCCGTTCCGAGGCCAAAACCATTAGCGGGCGGCGCAACGTGGGCAAGGCGACCGCTGTGCGTTCCGCATCCGCGGCCTTGCGTTCTGAGAGCATCCGAATCCTGGCCGAGCAAGGGCACACCTACGAGGCCATTGCCGCCGCTGTCGGATGCTCCACTAAGACCGTTCAGCGTGCTCTTCGCGACCTCTGAAACAGTCTCCGTCGAGGTGGACATTTC
［配列番号５］ｐＫＲ１００におけるｏｒｆ１によってコードされるＯＲＦ１
MTSVGTHLPSSTSPAATRQAAVRQAFVNHLGVRHVRVAATKNGAPRTVPIEALGEFAFWTPPAWPNLGLLTIDVDRDAAVLELFAAPALPHVVVETPRGAQAVWLIDRVHTGPNARPHPIAYAETVGSALRASLDGDSAVDPLRPVRTRNPCYRPAQRDVFTTARPLTAPYRLGELQKSLDAAGAWPTRPERSQARGRAQKAVDGVFVGRNDAVNRSTWLTVRYGLENGSVTHWTDADVLELAHGINEAVAAEQGVPPLPEDQVRDLAVSICRHQHRPGRRAISGQGSATARALGAKGGAARSEAKTISGRRNVGKATAVRSASAALRSESIRILAEQGHTYEAIAAAVGCSTKTVQRALRDL
［配列番号６］ｐＫＲ１００におけるｏｒｆ２によってコードされるＯＲＦ２
MGDPQLVMGFFQVFLRAFLVQSVCFEKGPFRFDKLPGKKFFAGWLSHGKERSCRSSEGCTDPTRFARVRQ
［配列番号７］ＭＢＥ１３１株の系統分類解析用のフォワードプライマー
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
［配列番号８］ＭＢＥ１３１株の系統分類解析用のリバースプライマー
AAAGGAGGTGATCCAGCC
［配列番号９］表１のセットＡのフォワードプライマー
TGGTGGCGGTGTTGTG
［配列番号１０］表１のセットＡのリバースプライマー
TCGCGAACGAAGTTCAGG
［配列番号１１］表１のセットＢのフォワードプライマー
GCCGGTGGCAAGGAGAGCATGCACATGGGCGACCCTC
［配列番号１２］表１のセットＢのリバースプライマー
CACTGGCCTACTGACGGACC
［配列番号１３］表１のセットＣのフォワードプライマー
GGTCCGTCAGTAGGCCAGTG
［配列番号１４］表１のセットＣのリバースプライマー
GGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号１５］表１のセットＤのフォワードプライマー
TGGTGGCGGTGTTGTG
［配列番号１６］表１のセットＤのリバースプライマー
CACTGGCCTACTGACGGACC
［配列番号１７］表１のセットＥのフォワードプライマー
GCCGGTGGCAAGGAGAGCATGCACATGGGCGACCCTC
［配列番号１８］表１のセットＥのリバースプライマー
GGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号１９］表１のセットＦのフォワードプライマー
TGGTGGCGGTGTTGTG
［配列番号２０］表１のセットＦのリバースプライマー
GGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号２１］ｐＲ６６３２の有するクロラムフェニコール耐性遺伝子塩基配列に相補的なフォワードプライマー
GTTACAATAGCGACGGAGAG
［配列番号２２］ｐＲ６６３２の有するクロラムフェニコール耐性遺伝子塩基配列に相補的なリバースプライマー
AGGTTAGTGACATTAGAAAACC
［配列番号２３］表４のセットＧのフォワードプライマー
ATTAAAGCTTCCAAGGTGAGGGGACGC
［配列番号２４］表４のセットＧのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号２５］表４のセットＨのフォワードプライマー
ATTAAAGCTTCCAAGGTGAGGGGACGC
［配列番号２６］表４のセットＨのリバースプライマー
AAAAAAGCTTCGGCGGCCAGGTCGGTGTTGATGC
［配列番号２７］表４のセットＩのフォワードプライマー
TTTTAAGCTTCGGGTGAGGCAACCAGAAC
［配列番号２８］表４のセットＩのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号２９］表４のセットＪのフォワードプライマー
ATTGGAAGCTTCGTGAGACCAGTCC
［配列番号３０］表４のセットＪのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号３１］表４のセットＫのフォワードプライマー
TTTTAAGCTTGGACTAGCCGGCGTTGC
［配列番号３２］表４のセットＫのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号３３］表４のセットＬのフォワードプライマー
AAGGGTAAGCTTCGGTCAGGCTGGACGGTGCGTGG
［配列番号３４］表４のセットＬのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号３５］表４のセットＭのフォワードプライマー
AAGGAAGCTTGTGCGCTAAGCCGTGTACG
［配列番号３６］表４のセットＭのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号３７］表４のセットＯのフォワードプライマー
TTTTAAGCTTCTCGTACCCCGCGTCTCAG
［配列番号３８］表４のセットＯのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号３９］表４のセットＰのフォワードプライマー
CACCCGAAGCTTCTCGTGTGAGCGCTGCG
［配列番号４０］表４のセットＰのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号４１］表４のセットＱのフォワードプライマー
AGGTTAAGCTTGGTCCGTCAGTAGGCCAGTG
［配列番号４２］表４のセットＱのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号４３］ｐＲ６６３２の有するテトラサイクリン耐性遺伝子塩基配列に相補的なフォワードプライマー
GTAACCAGCCAACTAATGAC
［配列番号４４］ｐＲ６６３２の有するテトラサイクリン耐性遺伝子塩基配列に相補的なリバースプライマー
CTCGTAATGGTTGTAGTTGC
［配列番号４５］ｐＫＲ１００における複製領域からｏｒｆ１領域およびｏｒｆ２領域を除いた領域
CGGTCAGGCTGGACGGTGCGTGGTCATAAACCGTGGGTCGGTTCGGAGAGCCGGGGGGTGGCTTCCTATCGTCGTGAGATGAGCAGAGAACGCTATGAGCCGATGAGTGAGGCCCGGTTGGAAGTCGCTTGGATGGTCGTGTTGCTGGGGTGTGCGCTGGTTCTTATGGGTGGGGTGGCCCTGGATGTGTTGATCGATCATCTCGCTGTCAGCTTCGCCTTGGCGGGGGTGCCGAGTGTGTTGGTGGTGGCGGTGTTGTGGCGGCGGCACGTGCGCTAAGCCGTGTACGGGCACAGAAAAAGCCGGGTGGTAGAGCCCGGCTTTTTCCGTGGGGGAGAGTCTCGTACCCCGCGTCTCAGTGTCCTGCACACCGGTCGTGATGCCTACTGCCGCTACACGGAGCAAAGCTATGCGTTATGTGCCATAAACGCGGATCGCCCTTCGTCCAGCTCGTGGAGCTGGCTGAGTGCCTATGTGCCATAGGCGGGCGGGGGCACCCGAGCGGGCTCGTGTGAGCGCTGCGCTGGGCATAGGGAAGGCCGGGCGCTAGCCCAGCCCTCCATGGGGGCAGAGGGCCCCGTGGTGTTGAGAGTGGCGAGCCCTACTGAGGGTCCTCGAAGGCGTCGGGGGCGCTTCGTGTCCTCTTCAGTTTTTGATCCCTGGCGTCCTGAACTTCGTTCGCGACTGCCTCCGGGGTGCCGGTGGCAAGGAGAGCATGCAC
［配列番号４６］ＤＮＡ結合タンパク質結合配列１
TCGGAGCTCCGA
［配列番号４７］ＤＮＡ結合タンパク質結合配列２
TGATCGATCA
［配列番号４８］繰り返しモチーフ配列の反復単位１
TGGCGTGGTCGTTG
［配列番号４９］繰り返しモチーフ配列の反復単位２
GCGCTGGGGTG
［配列番号５０］繰り返しモチーフ配列の反復単位３
TGGGGCTGTGGTGG
［配列番号５１］繰り返しモチーフ配列の反復単位４
GCGGTGGTGTG
［配列番号５２］繰り返しモチーフ配列の反復単位５
GGGCCGGGGTTG
［配列番号５３］繰り返しモチーフ配列の反復単位６
GCCGGGGTTGT
［配列番号５４］繰り返しモチーフ配列の反復単位７
TGGTCGTGTTG
［配列番号５５］繰り返しモチーフ配列の反復単位８
TGTTGCTGGGGTG
［配列番号５６］繰り返しモチーフ配列の反復単位９
TGGCGGTGTTGTGG
［配列番号５７］繰り返しモチーフ配列の反復単位１０
GGGGTGCCGGTGG
［配列番号５８］酸化剤感受性配列１
TGTGGGGTGGCCCCTCAGCGAAATA
［配列番号５９］酸化剤感受性配列２
GGCCTCTCAGC
［配列番号６０］酸化剤感受性配列３
CTGCGGGCACCTCCTAC
［配列番号６１］酸化剤感受性配列４
GGTGAGGGGTAACCC
［配列番号６２］酸化剤感受性配列５
GTGGGGTGGC
［配列番号６３］酸化剤感受性配列６
GGGGGGTGGCTTCCTATCG
［配列番号６４］酸化剤感受性配列７
GTGGGGTGGCCC
［配列番号６５］酸化剤感受性配列８
TGTGGCGGCGGCACGTGCGCTAA
［配列番号６６］酸化剤感受性配列９
GCGGGGGCACCCGA
［配列番号６７］酸化剤感受性配列１０
CTGAGGGTCCTC
［配列番号６８］逆方向反復配列１
GAAAAAGCCGGGCTGCTGCCCGGCTTTTTC
［配列番号６９］逆方向反復配列２
CACAGAAAAAGCCGGGTGGTAGAGCCCGGCTTTTTCCGTG
【０１１３】
本明細書におけるコクリア エスピー ＭＢＥ１３１（Ｋｏｃｕｒｉａ ｓｐ． ＭＢＥ１３１）株は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１８８５として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにおいて、平成２２年１月６日付で寄託されている微生物である。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明を用いて、宿主細胞としてコクリア属細菌に有用遺伝子を導入すれば、有用な生物学的機能が付与された形質転換体を得ることができる。このような形質転換体は、宿主細胞に本来備わっている高い有機溶媒耐性、重金属耐性、増殖能力等をさらに向上させ得るものであり、食品工業、燃料・医薬化成品の製造、環境浄化などの分野において有効に利用され得る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学的手法を用いた微生物の機能向上に寄与する技術に関する。詳しくは、コクリア（Kocuria）属細菌由来のプラスミドベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
ミクロコッカセア（Micrococcaceae）科細菌には、食品工業、医薬品製造業、化学工業、環境浄化などの分野において有用性が認められているものが多い。たとえば、チーズなどの乳製品の作製などにプロピオン酸菌（propionibacteria）が使用されている。また、Ｌ−グルタミンの生産菌としては、ブレビバクテリア（Brevibacteria）属細菌が知られている。
【０００３】
しかし、これらの細菌の野生株は、生産物の生成能が低い、培養が困難である、といった種々の問題を抱える。そこで、このような問題を解決するために、これらの細菌に遺伝子操作を施し、生産物の生成能や環境適合性などを高めた変異株を得る試みがなされている。その際に利用されるのが、これらの細菌において自律的に複製可能なプラスミドなどのベクターである。たとえば、プロピオン酸菌に利用可能なベクターには、特許文献１に記載されているものがある。
【０００４】
ミクロコッカセア科に属する細菌として、コクリア（Kocuria）属細菌が知られている。コクリア属細菌は高度な有機溶媒耐性、重金属耐性および増殖能力を示し、燃料や医薬化成品の製造、環境浄化などの分野での利用が期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−１１２７９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、コクリア属細菌に外来遺伝子を安定保持させる技術は知られていない。この細菌を用いて遺伝子工学的手法による微生物改変に成功したという例もない。結果として、新たな生物学的機能を付与することや本来の機能の最適化を図ることもできないことから、コクリア属細菌は産業界でほとんど利用されていない。
【０００７】
そこで、本発明は、コクリア属細菌を産業上有効に利用するために、コクリア属細菌を遺伝子工学的に改変するための技術を提供することを、発明が解決しようとする課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を進めた結果、比較的サイズの小さい取り扱いの容易な環状プラスミドを有する新規なコクリア属細菌であるコクリア エスピー ＭＢＥ１３１（Ｋｏｃｕｒｉａ ｓｐ． ＭＢＥ１３１）株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８８５；以下、ＭＢＥ１３１株とよぶ場合もある）を相模湾内の深度約２０００ｍの底泥から単離することに成功した。
【０００９】
本発明者らは、ＭＢＥ１３１株から取得したプラスミドをｐＫＲ１００と名付け、外来遺伝子および大腸菌内で自律的に複製可能なプラスミドを連結して、ＭＢＥ１３１株および大腸菌に対するシャトルベクターを構築した。このシャトルベクターをＭＢＥ１３１株および大腸菌に導入したところ、いずれの細菌内でも外来遺伝子が発現した。
【００１０】
さらに本発明者らは、プラスミドｐＫＲ１００についてさらに検討を進めたところ、プラスミドｐＫＲ１００におけるＤＮＡ複製を担うと推測される領域（複製領域）を解明した。次いでプラスミドｐＫＲ１００における複製領域と異なる領域に外来遺伝子を挿入した組換えプラスミドを用意し、これをＭＢＥ１３１株と異なるコクリア属細菌であるコクリア リゾフィラ ＤＣ２２０１（Ｋｏｃｕｒｉａ ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ ＤＣ２２０１）株（ＮＢＲＣ１０３２１７）に導入した。その結果、該組換えプラスミドは、コクリア リゾフィラ ＤＣ２２０１株においても外来遺伝子を発現し、かつ、自律的に複製可能であった。
【００１１】
本発明は以上の知見に基づいて完成されたものである。したがって、本発明によれば、ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列と；レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列と；配列番号４５に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列とを含む複製領域を有する、細菌内で自律的に複製可能な環状のプラスミドが提供される。
【００１２】
本発明の別の側面によれば、ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列と；レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列と；ＤＮＡ結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列とを含む複製領域を有する、細菌内で自律的に複製可能な環状のプラスミドが提供される。
【００１３】
本発明の別の側面によれば、ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列と；レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列と；ＤＮＡ結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列、酸化剤感受性配列ならびに逆方向反復配列を含む塩基配列とを含む複製領域を有する、細菌内で自律的に複製可能な環状のプラスミドが提供される。
【００１４】
好ましくは、本発明のプラスミドは、複製領域において、ＤＮＡ結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列のうち、ＤＮＡ結合タンパク質結合配列を１個以上かつ繰り返しモチーフ配列を２個以上含む。
【００１５】
好ましくは、ＤＮＡ結合タンパク質結合配列は、ＣＡＣＣＧＧＴＧ、ＡＣＣＧＧＴＧ、ＣＣＧＧＴＧ、ＡＣＣＧＧＴ、ＣＡＣＡＧＧＴ、ＣＡＣＣＧＧＴ、ＣＡＣＣＧＧ、ＧＴＧＣＧＣＡＣ、ＧＧＣＣＧＧＣＣ、ＴＣＧＧＡＧＣＴＣＣＧＡ（配列番号４６）、ＴＣＣＣＧＧＧＡ、ＴＧＣＣＧＧＣＡ、ＴＧＡＴＣＧＡＴＣＡ（配列番号４７）およびＧＣＡＣＧＴＧＣからなる群から選ばれる。
【００１６】
好ましくは、繰り返しモチーフ配列の反復単位は、ＴＧＧＣＧＴＧＧＴＣＧＴＴＧ（配列番号４８）、ＧＣＧＣＴＧＧＧＧＴＧ（配列番号４９）、ＴＧＧＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号５０）、ＧＣＧＧＴＧＧＴＧ、ＧＣＧＧＴＧＧＴＧＴＧ（配列番号５１）、ＧＧＧＣＣＧＧＧＧＴＴＧ（配列番号５２）、ＧＣＣＧＧＧＧＴＴＧＴ（配列番号５３）、ＴＧＧＴＣＧＴＧＴＴＧ（配列番号５４）、ＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＧＴＧ（配列番号５５）、ＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＴＧＧ（配列番号５６）およびＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＴＧＧ（配列番号５７）からなる群から選ばれる。
【００１７】
好ましくは、本発明のプラスミドは、複製領域において、酸化剤感受性配列を１個以上含む。
【００１８】
好ましくは、酸化剤感受性配列は、ＴＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＧＣＧＡＡＡＴＡ（配列番号５８）、ＧＧＣＣＴＣＴＣＡＧＣ（配列番号５９）、ＣＴＧＣＧＧＧＣＡＣＣＴＣＣＴＡＣ（配列番号６０）、ＴＴＣＧＡＴＧＡＧ、ＧＧＴＧＡＧＧＧＧＴＡＡＣＣＣ（配列番号６１）、ＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣ（配列番号６２）、ＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＴＴＣＣＴＡＴＣＧ（配列番号６３）、ＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣ（配列番号６４）、ＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＧＴＧＣＧＣＴＡＡ（配列番号６５）、ＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＣＣＧＡ（配列番号６６）およびＣＴＧＡＧＧＧＴＣＣＴＣ（配列番号６７）からなる群から選ばれる。
【００１９】
好ましくは、本発明のプラスミドは、複製領域において、逆方向反復配列を１個以上含む。
【００２０】
好ましくは、逆方向反復配列は、ＧＡＡＡＡＡＧＣＣＧＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＴＴＴＴＴＣ（配列番号６８）およびＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＧＣＣＧＧＧＴＧＧＴＡＧＡＧＣＣＣＧＧＣＴＴＴＴＴＣＣＧＴＧ（配列番号６９）からなる群から選ばれる。
【００２１】
好ましくは、レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列は、ＲｅｐＡタンパク質遺伝子の塩基配列である。
【００２２】
好ましくは、レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列は、配列番号２に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、レプリカーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。
【００２３】
好ましくは、ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列は、ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質遺伝子の塩基配列である。
【００２４】
好ましくは、ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質をコードする塩基配列である。
【００２５】
好ましくは、複製領域は、配列番号３に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である。
【００２６】
好ましくは、細菌は、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）属細菌である。
【００２７】
本発明の別の側面によれば、制限酵素認識部位およびその数（制限酵素認識部位：数）として、ＳｍａＩ：２、ＳｐｈＩ：１、ＳａｌＩ：１、ＸｈｏＩ：１およびＢａｍＨＩ：１を含む、コクリア属細菌内で自律的に複製可能な環状のプラスミドが提供される。
【００２８】
好ましくは、本発明のプラスミドは、制限酵素認識部位ＳｍａＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩをこの順で含む。
【００２９】
好ましくは、本発明のプラスミドは、塩基対数が３．０×１０３〜３．４×１０３である。
【００３０】
好ましくは、本発明のプラスミドは、以下の制限酵素地図（Ｉ）
【化１】
で示される。
【００３１】
好ましくは、本発明のプラスミドは、配列番号３または４に記載の塩基配列を含む。
【００３２】
好ましくは、本発明のプラスミドは、コクリア エスピー ＭＢＥ１３１（Ｋｏｃｕｒｉａ ｓｐ． ＭＢＥ１３１）株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８８５）に由来する。
【００３３】
本発明の別の側面によれば、配列番号３に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む、ＤＮＡ断片が提供される。
【００３４】
本発明の別の側面によれば、本発明のＤＮＡ断片の塩基配列を含む、ベクターが提供される。
【００３５】
本発明の別の側面によれば、本発明のプラスミド、本発明のＤＮＡ断片、または本発明のベクターを含有してなる、形質転換体が提供される。
【発明の効果】
【００３６】
本発明のプラスミドによれば、コクリア属細菌において外来遺伝子を導入かつ発現させるためのベクターを構築できる。したがって、本発明のプラスミドを用いれば、コクリア属細菌などの宿主細胞に有用遺伝子を導入することができ、宿主細胞に新たな生物学的機能を付与することや宿主細胞の本来の機能を向上させることが可能である。
【００３７】
本発明のＤＮＡ断片およびベクターを用いれば、コクリア属細菌および他の細菌において自律的に複製可能なシャトルベクターを製造することができる。本発明の形質転換体には、宿主細胞に新たな生物学的機能を付与したものや宿主細胞の本来の機能を向上させたものなどがあり、用途に応じて種々の分野で利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ｐＫＲ１００の制限酵素地図に２つのオープンリーディングフレームを加入した図である。
【図２】ＯＲＦ１およびＯＲＦ２をそれぞれコードする塩基配列の領域を明示したｐＫＲ１００の塩基配列を示した図である。
【図３】ＯＲＦ１およびＯＲＦ２をそれぞれコードする塩基配列の領域を明示したｐＫＲ１００の塩基配列を示した図である（図２の続き）。
【図４】例６に示すｐＫＲ１００におけるＤＮＡ複製領域を調べた結果を示した図である。図４に示すＤＮＡ断片を含むプラスミドのうち、「＋」は複製が認められたプラスミド、「−」は複製が確認できなかったプラスミドを示す。
【図５】例３におけるコクリア エスピー ＭＢＥ１３１（Kocuria sp. ＭＢＥ１３１）株およびコクリア ロゼア（Kocuria rosea）標準株からのＤＮＡ抽出によるプラスミド検出結果を示した図である。レーン１は、ＭＢＥ１３１株から抽出したＤＮＡを示す。レーン２は、コクリア ロゼア標準株から抽出したＤＮＡを示す。レーン３は、ＤＮＡサイズマーカーを示す。
【図６】例３におけるＭＢＥ１３１株およびコクリア ロゼア標準株から抽出したＤＮＡを鋳型として、表１に記載のプライマーセットＡ〜Ｆを用いたＰＣＲを実施した場合のプラスミドの検出結果を示した図である。
【図７】例３におけるＭＢＥ１３１株およびコクリア ロゼア標準株の細胞溶解液に含まれるＤＮＡを鋳型として、表１に記載のプライマーセットＡ〜Ｆを用いたＰＣＲを実施した場合のプラスミドの検出結果を示した図である。
【図８】例５における、ＭＢＥ１３１形質転換株へ導入された組換えプラスミドｐＲ６６３２のＰＣＲによる検出結果を示した図である。レーン１は、ＤＮＡサイズマーカーを示す。
【図９】例５における、ＭＢＥ１３１形質転換株へ導入された組換えプラスミドｐＲ６６３２の制限酵素消化パターンによる確認結果を示した図である。レーン１は、ＤＮＡサイズマーカーを示す。
【図１０】例７におけるＤＣ２２０１株に導入されたプラスミドpＲ６６３２のＰＣＲによる検出結果を示した図である。レーン３は、ＤＮＡサイズマーカーを示す。
【図１１Ａ】配列番号３に記載の塩基配列とアクチノシンネマ ミラム ＤＳＭ４３８２７株の塩基配列とのアライメント結果を示す。
【図１１Ｂ】配列番号３に記載の塩基配列とアクチノシンネマ ミラム ＤＳＭ４３８２７株の塩基配列とのアライメント結果を示す（図１１Ａの続き）。
【図１１Ｃ】配列番号３に記載の塩基配列とアクチノシンネマ ミラム ＤＳＭ４３８２７株の塩基配列とのアライメント結果を示す（図１１Ｂの続き）。
【図１２】例８における各種合成プラスミドのコクリア属細菌内でのプラスミド保持率（％）を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、本発明の詳細について説明する。
［１］プラスミド（１）
まず、本発明のプラスミドの一実施態様である、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）属細菌内で自律的に複製可能な環状のプラスミドについて説明する。なお、本明細書における「自律的な複製」とは、プラスミドが宿主細菌の細胞質内に存在して、宿主の染色体ＤＮＡとは独立して複製および／または増殖することをいう。
【００４０】
コクリア属細菌は、マイクロコッカシニア（Micrococcineae）亜目におけるマイクロコッカシア（Micrococcaceae）科に属する、菌糸を作らないグラム陽性の球菌の一種である。コクリア属細菌は多種多様な分離源から分離されており、たとえば、ほ乳類の皮膚、土壌、根圏、発酵食品、臨床検体、淡水、海底堆積物などから単離されている。コクリア属細菌の同定方法は、これまでに知られている方法を制限なく使用できるが、たとえば、微生物ゲノムの１６Ｓ ｒＲＮＡ領域に基づく遺伝子工学的な系統解析や微生物の生理・生化学的な性質に基づく同定法を採用できる。
【００４１】
本発明のプラスミドは、たとえば、制限酵素認識部位およびその数によって表わすことができる。本発明のプラスミドの好ましい一実施態様は、制限酵素認識部位およびその数（制限酵素認識部位：数）として、ＳｍａＩ：２、ＳｐｈＩ：１、ＳａｌＩ：１、ＸｈｏＩ：１およびＢａｍＨＩ：１を含む。この態様において、制限酵素ＳｍａＩが認識する部位は２箇所、ＳｐｈＩが認識する部位は１箇所、ＳａｌＩが認識する部位は１箇所、ＸｈｏＩが認識する部位は１箇所、およびＢａｍＨＩが認識する部位は１箇所である。
【００４２】
本発明のプラスミドのより好ましい一実施態様は、制限酵素認識部位ＳｍａＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩをこの順で含む。
【００４３】
本発明のプラスミドにおける制限酵素認識部位の確認方法は特に制限されないが、たとえば、プラスミドの塩基配列を決定し、次いで制限酵素認識部位を照合して確認する方法や、プラスミドを制限酵素処理し、次いでアガロースゲル電気泳動にかけて生じるバンドのパターンから制限酵素認識部位を確認する方法を採用することができる。
【００４４】
本発明のプラスミドは、ＧＣ含量が６０〜７０％であることが好ましい。なお、後述する本発明の具体的態様の一つである、図１で示されるプラスミドｐＫＲ１００は、ＧＣ含量が約６３％である。ＧＣ含量を確認する方法は特に制限されないが、たとえば、プラスミドの全塩基配列を決定し、次いで塩基配列ＧおよびＣの数を算出する方法や、プラスミドを塩基単位にまで加水分解し、ＨＰＬＣなどのクロマトグラフィーを利用してＧとＣの数を算出する方法を採用することができる。
【００４５】
本発明のプラスミドは、コクリア属細菌内で自律的に複製可能であれば特に制限されず、種々の態様が想定され得るが、その全体の大きさは約３．２×１０３塩基対、好ましくは３．０×１０３〜３．４×１０３塩基対である。この「約３．２×１０３塩基対」はコクリア属細菌から単離した天然のプラスミドの塩基対数をいい、コクリア属細菌内で自律的に複製および／または増殖する機能を担うと推測される領域（以下、複製領域ともよぶ）以外の領域を切り出すことや、外来遺伝子を挿入することによって、その塩基対数は可変である。
【００４６】
本発明のプラスミドの好ましい一実施態様は、たとえば、以下の制限酵素地図（Ｉ）
【化１】
で示される制限酵素認識部位を含む。このようなプラスミドのより具体的な態様は、図１で示されるプラスミドｐＫＲ１００である。
【００４７】
図１において、ｏｒｆ１およびｏｒｆ２は、それぞれ異なるオープンリーディングフレームを示す。ｏｒｆ１によってコードされるタンパク質（ＯＲＦ１）は７０アミノ酸からなり、分子量は８．１ｋＤａおよび等電点は１０．４であると推定される。ＯＲＦ１は、２次構造予測により、ランダムコイル構造で隔てられた２つのヘリックス構造を有すると推定されることから、ヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）構造を形成するＤＮＡ結合タンパク質またはその類似体であると推測される。本明細書では、このようなヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）構造を形成すると推定されるＤＮＡ結合タンパク質およびその類似体を総称して、ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質とよぶ。さらに、ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質をコードする塩基配列を、ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子とよぶ。
【００４８】
ｏｒｆ２によってコードされるタンパク質（ＯＲＦ２）は３８５アミノ酸からなり、分子量は４１ｋＤａであり、等電点は１１．１であると推定される。ＯＲＦ２は、ロドコッカス ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）由来のｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ＲｅｐＡ（アクセッション番号ＹＰ_３４５１６４）と３１％の相同性（８０／２５７アミノ酸、Ｅ−ｖａｌｕｅ ６ｅ−６）がある。本明細書では、このようなＲｅｐＡと３０％以上の相同性を有し、かつ、ＲｅｐＡと類似の活性があるものと推測されるタンパク質を、レプリカーゼ様タンパク質とよぶ。また、レプリカーゼ様タンパク質をコードする塩基配列を、レプリカーゼ様タンパク質遺伝子とよぶ。
【００４９】
図１によって示されるプラスミドは、ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子であるｏｒｆ１と、レプリカーゼ様タンパク質遺伝子であるｏｒｆ２とを含有する。ｏｒｆ２のコードするタンパク質は、θ型の複製様式を持つプラスミドであるマイコバクテリウム フォーツイツム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）由来プラスミドｐＡＬ５０００にコードされるＲｅｐＡ（アクセッション番号ＡＡＡ９８１７１、７４／２６３アミノ酸配列の一致（同一性 ２８％））やｐＡＬ５０００に関連したプラスミドであるロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）由来のプラスミドｐＮＣ５００にコードされるＲｅｐＡ（アクセッション番号ＢＡＦ４５３８９、６０／２１０アミノ酸配列の一致（同一性 ２８％））に相同性を示すことから、本発明のプラスミドは複製が安定しているθ（シータ）型のプラスミドである可能性が高い。したがって、本発明のプラスミドは、好ましくは、複製様式がθ型のプラスミドである。
【００５０】
図１によって示されるプラスミドの塩基配列は、図１に示される制限酵素認識部位ならびにＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子およびレプリカーゼ様タンパク質遺伝子を含めば特に制限されないが、好ましくは図２および３によって示される塩基配列（配列番号４）を含む。
【００５１】
図２によって示される塩基配列は、ｏｒｆ１の上流にＨ−ｓｉｔｅ−ｌｉｋｅ ｓｅｑを含む（図２における小文字で表わされた配列）。Ｈ−ｓｉｔｅ−ｌｉｋｅ ｓｅｑは、マイコバクテリウム フォーツイツム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）由来のプラスミドｐＡＬ５０００の複製開始領域に存在する複製タンパク質結合部位として知られているＨｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｉｔｅ（Ｈ−ｓｉｔｅ）に含まれるＧＣｂｏｘと呼ばれる配列に相同性を示す配列をいう（Stolt P, Stoker NG., Nucleic Acids Res. 1997, 25(19):3840-6.を参照）。また、ｐＡＬ５０００におけるＨ−ｓｉｔｅは、ＧＣｂｏｘと呼ばれる８塩基からなる１００％一致パリンドロームを含むことを構造特徴としている。このことより、本明細書では、８塩基以上からなる１００％一致パリンドローム構造を有する配列もまた、Ｈ−ｓｉｔｅ−ｌｉｋｅ ｓｅｑとよぶ。さらに、本明細書では、Ｈ−ｓｉｔｅ−ｌｉｋｅ ｓｅｑなどのように、複製タンパク質のようなＤＮＡ結合タンパク質に結合する配列をＤＮＡ結合タンパク質結合配列とよぶ。
【００５２】
図２によって示される塩基配列は、ｏｒｆ１の上流に酸化剤感受性配列を含む（図２における上部に点線がある斜体で表わされた配列）。一般的に、ＤＮＡ上のＨ−ｓｉｔｅにＤＮＡ結合タンパク質であるＲｅｐＢタンパク質が結合すると、該ＤＮＡにおいて折れ曲がりが起きることが知られている（Chatterjee S, Basu A, Basu A, Das Gupta SK., J Bacteriol. 2007, 189(23):8584-92.を参照）。このＤＮＡの折れ曲がり部分の周辺に、酸化剤に感受性を示す塩基配列の領域（酸化剤感受性配列とよぶ）が存在する。酸化剤感受性配列が酸化剤に感受性を示すということは、このような配列においてＤＮＡの解離が起きていると推測できる。したがって、酸化剤感受性配列から複製が開始されることが示唆される。酸化剤感受性配列およびその周辺の塩基配列として、ＴＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＧＣＧＡＡＡＴＡ（配列番号５８）とその相補鎖が知られている。図２によって示される塩基配列は、図示している通りに、配列番号５８およびその相補鎖に相同性のある配列を、酸化剤感受性配列として含む。
【００５３】
図２によって示される塩基配列は、ｏｒｆ１の上流に近似的な繰り返しモチーフ配列（順方向反復配列）を含む（図２における下部に実線がある太文字で表わされた配列）。また、図２によって示される塩基配列は、ｏｒｆ１の上流およびｏｒｆ１とｏｒｆ２との間に近似的な逆方向反復配列を含む（図２における下部に矢印がある配列）。一般的に、θ（シータ）型プラスミドファミリーの複製とコピー数制御には、繰り返しモチーフ配列であるイテロン（ｉｔｅｒｏｎ）がシスエレメント（ｃｉｓ−ｅｌｅｍｅｎｔ）として重要な働きを担うことが知られている（Chattoraj DK., Mol Microbiol. 2000, 37(3):467-76.およびCha KI, Lim K, Jang S, Lim W, Kim T, Chang H., J Microbiol Biotechnol. 2007, 17(11):1841-7.を参照）。シスエレメントとは、それ自体が保有している遺伝子制御を担う要素を指し、ゲノムや他のプラスミドなど外部から供給されることが可能な要素（トランスエレメント（ｔｒａｎｓ−ｅｌｅｍｅｎｔ））と区別される。たとえば、θ型プラスミドであるｐＣＤ３．４では、１個のイテロン削除によってコピー数が低下し、プラスミドの安定性が低下するという報告がある（van Belkum MJ, Stiles ME., Microbiology. 2006, 152:171-8.を参照）。また、θ型プラスミドであるｐ７０５／５では、ｒｅｐＡ遺伝子のプロモーター領域に存在する逆方向反復配列にＲｅｐＡタンパク質が結合することにより、ＲｅｐＡタンパク質の転写が抑制され、プラスミドのコピー数が調節されるとの報告がある（上記Cha KIらの文献を参照）。一方で、逆方向反復配列が見いだされないθ型プラスミドも存在するとの報告もある（上記van Belkum MJらの文献を参照）。
【００５４】
たとえば、ｐＡＬ５０００において、繰り返しモチーフ配列（イテロン）、ｒｅｐＡ遺伝子およびｒｅｐＢ遺伝子がｐＡＬ５０００の自律的な複製を担う配列と推測されている。ｐＡＬ５０００由来のｒｅｐＡ遺伝子およびｒｅｐＢ遺伝子を有さず、かつ、ｐＡＬ５０００由来の繰り返しモチーフ配列を有するプラスミドに、他のプラスミドに由来するＲｅｐＡタンパク質およびＲｅｐＢタンパク質をトランスに供給すれば、このｐＡＬ５０００由来の繰り返しモチーフ配列を有するプラスミドは複製可能となるとの報告がある（Stolt P, Stoker NG., Microbiology.1996, 142 (Pt 10):2795-802.を参照)。この文献の報告からもわかる通り、繰り返しモチーフ配列はプラスミドの不和合性やコピー数、安定性に関与するシスエレメントであると推測される。
【００５５】
本発明者らは、例８に示す通り、図２によって示される塩基配列のうち、複数の繰り返しモチーフ配列および１個の逆方向反復配列を１セット含む、第１０３１−３１７０位の塩基配列（配列番号３）の領域を含むプラスミドｐＫＲ１４１を作製し、このｐＫＲ１４１がコクリア属細菌内で自律的に複製可能であることを見出した。したがって、図２によって示される塩基配列の第１０３１−３１７０位の塩基配列を除く領域については、外来遺伝子を導入または置換することが可能である。
【００５６】
配列番号３に記載の塩基配列はユニークな塩基配列である。たとえば、配列番号３に記載の塩基配列について、ＤＤＢＪによるＦＡＳＴＡ検索によって相同性検索を実施すると、塩基配列の同一性が約５４％である、アクチノシンネマ ミラム ＤＳＭ４３８２７（Actinosynnema mirum DSM 43827）株が最上位に示される（http://fasta.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html；ＦＡＳＴＡ検索について、Pearson WR, Lipman DJ., (1988), Proc Natl Acad Sci U S A. 85(8):2444-8、 Lipman DJ, Pearson WR., (1985), Science. 227(4693):1435-41、および、Wilbur WJ, Lipman DJ., (1983), Proc Natl Acad Sci U S A. 80(3):726-30を参照）。配列番号３に記載の塩基配列とアクチノシンネマ ミラム ＤＳＭ４３８２７株の塩基配列とのアライメント結果を図１１に示す。
【００５７】
配列番号３に記載の塩基配列はユニークな塩基配列であることから、コクリア属細菌に由来するプラスミドであって、直線状に一本鎖化した形態で、配列番号３に記載の塩基配列のうち連続する５００塩基以上、好ましくは１０００塩基以上、より好ましくは１５００塩基以上、さらに好ましくは１７００塩基以上、なおさらに好ましくは１９００塩基以上の塩基配列に相補的な塩基配列を含むＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプラスミドは、コクリア属細菌内で自律的に増幅する可能性が高い。したがって、このようなプラスミドもまた、本発明のプラスミドに含まれる。
【００５８】
本明細書における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、たとえば、コロニーもしくはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．５〜２．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、４０〜７５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、好ましくは０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。プローブの調製やハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）などに記載されている方法に準じて実施することができる。なお、当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度などの条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブ長さ、反応時間などの諸条件を加味して、本発明のプラスミドにおいて複製領域を得るための条件を設定することができる。
【００５９】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ断片としては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性（同一性）を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡ断片が挙げられる。
【００６０】
配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、たとえば、配列番号３に記載の塩基配列において１から数個、好ましくは１から５０個、より好ましくは１から３０個、さらに好ましくは１から２０個、なおさらに好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の塩基の欠失、置換および／または付加された塩基配列を含む。
【００６１】
「塩基の欠失」とは配列中の塩基に欠落もしくは消失があること、「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていること、および、「塩基の付加」とは塩基が付け加えられていることをそれぞれ意味する。
【００６２】
配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むプラスミドがコクリア属細菌内で自律的に複製可能か否かは、実施例に記載の方法により確認することができる。この方法は、概略すると、配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列と薬剤耐性遺伝子とを連結させた組換えプラスミドを用意し、次いで該組換えプラスミドをコクリア属細菌に導入して形質転換体を製造し、次いで薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤の存在下で該形質転換体を培養し、次いで該形質転換体の増殖を確認することを含む。
【００６３】
図２および３（配列番号４）によって示される塩基配列を有するプラスミドは、コクリア エスピー ＭＢＥ１３１（Ｋｏｃｕｒｉａ ｓｐ． ＭＢＥ１３１）株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８８５）（以下、単にＭＢＥ１３１株とよぶ場合もある）から単離することができる。ただし、本発明のプラスミドは、ＭＢＥ１３１株から単離されるプラスミドであって、配列番号４に記載の塩基配列の全部を含まず、少なくとも配列番号３に記載の塩基配列を含むプラスミドであってもよい。
【００６４】
コクリア属細菌からプラスミドを抽出する方法は特に制限されないが、たとえば、コクリア属細菌をＹＴＮＭ培地などの適当な培地を用いて、コクリア属細菌の増殖に適した条件、たとえば、１５〜３０℃で、１〜３日間静置または振盪培養により増殖し、次いで遠心分離などの操作によって菌体を回収し、次いでリゾチーム処理などによって菌体の細胞壁を溶解し、次いでＨｉｇｈ ｐｕｒｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ロシュ社製）などのプラスミド抽出キットを用いてプラスミドを回収する方法を挙げることができる。
【００６５】
コクリア属細菌から抽出されたプラスミドが、配列番号３または４によって示される塩基配列を含むか否かを確認する方法は、特に制限されないが、たとえば、配列番号３または４によって示される塩基配列の情報を基に作製したＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーション法やｐＫＲ１００の制限酵素地図を基に制限酵素処理した後に、処理後に生じるＤＮＡサイズをアガロースゲル電気泳動によって確認する方法などが挙げられる。
【００６６】
本発明のプラスミドの別の入手方法として、たとえば、ＭＢＥ１３１株やその他のコクリア属細菌から抽出したプラスミドの中から、配列番号３または４に記載の塩基配列の情報を基に合成した、該塩基配列にハイブリダイズし得るプローブやＰＣＲ用のプライマーセットを用いて単離することができる。
【００６７】
本発明のプラスミドによれば、外来遺伝子と連結して、次いでエレクトロポレーション法、プロトプラスト法、カルシウムイオンを用いる方法などのこれまでに知られているＤＮＡ導入法によって、コクリア属細菌などの宿主細胞に導入することにより、外来遺伝子を発現する形質転換体を製造することができる。
【００６８】
本発明のプラスミドは、コクリア属細菌と異なる宿主細胞において自律的に複製可能なプラスミドのＤＮＡ複製領域と連結させることにより、コクリア属細菌とこれとは異なる宿主細胞において自律的に複製可能なシャトルベクターを構築することができる。本発明のプラスミドを用いたシャトルベクターの構築方法は特に制限されないが、たとえば、本発明のプラスミドの全部またはＤＮＡ複製を担う領域を含む一部を、ｐＨＹ３００ＰＬＫなどの大腸菌内で自律的に複製可能なプラスミドのマルチクローニングサイトに連結することにより、宿主細胞をコクリア属細菌および大腸菌とするシャトルベクターを構築することができる。
【００６９】
［２］プラスミド（２）
本発明の別の態様として、以下（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの、細菌内、好ましくはコクリア属細菌その他ミクロコッカセア科細菌内で自律的に複製する機能を担うと推測される複製領域を有する環状プラスミドが挙げられる：
（Ａ）ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列と；レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列と；配列番号４５に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列とを含む複製領域。
（Ｂ）ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列と；レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列と；ＤＮＡ結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列とを含む複製領域。
（Ｃ）ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列と；レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列と；ＤＮＡ結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列、酸化剤感受性配列ならびに逆方向反復配列を含む塩基配列とを含む複製領域。
【００７０】
ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡに結合し得る構造を持ったタンパク質であり、ホメオドメイン(homeodomain)、ジンクフィンガードメイン(Zinc finger domain)、ウイングドヘリックス(winged helix)、ロイシンジッパータンパク質(Leucine zipper protein)、ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質(helix-loop-helix : HLH protein)、ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質(helix-turn-helix : HTH protein)などに構造上分類されている。本発明のプラスミドの複製領域（Ａ）〜（Ｃ）におけるＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列としては、たとえば、上記のＤＮＡ結合タンパク質の遺伝子の塩基配列を制限なく挙げられるが、好ましくはヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質遺伝子の塩基配列であり、より好ましくは配列番号１に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質をコードする塩基配列である。
【００７１】
レプリカーゼ様タンパク質は、核酸のリン酸エステル骨格に沿って核酸の二重らせんや二次構造を解くレプリカーゼ活性を有するタンパク質であり、種々の構造を取りうる。レプリケーションタンパク質（またはレプリカーゼ）の機能についての記載としては、文献Hiraga S, Sugiyama T, Itoh T., J Bacteriol. 1994 Dec;176(23):7233-43の記載があり、たとえば「Ｒｅｐタンパク質は、特異的にオリジンに結合し、かつ、オリジンにてユニークなプライマーＲＮＡを合成する」との記載が挙げられる。
【００７２】
本発明のプラスミドの複製領域（Ａ）〜（Ｃ）におけるレプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列としては、たとえば、ＲｅｐＡタンパク質の遺伝子の塩基配列が挙げられるが、好ましくは配列番号２に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、レプリカーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。
【００７３】
本発明のプラスミドの複製領域（Ａ）は、ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子の塩基配列およびレプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列に加えて、配列番号４５に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む。配列番号４５に記載の塩基配列またはを該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列には、本発明のプラスミドのコクリア属細菌内での自律的な複製に関与すると推測される領域である、ＤＮＡ結合タンパク質結合配列、繰り返しモチーフ配列、酸化剤感受性配列、逆方向反復配列などを含む。配列番号４５に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列は、ＤＮＡ結合タンパク質結合配列としてＴＧＣＣＧＧＣＡ、ＴＧＡＴＣＧＡＴＣＡ（配列番号４７）、ＧＣＡＣＧＴＧＣおよびＣＡＣＣＧＧＴからなる群から選ばれる少なくとも１種の配列；繰り返しモチーフ配列としてＧＧＧＣＣＧＧＧＧＴＴＧ（配列番号５２）、ＴＧＧＴＣＧＴＧＴＴＧ（配列番号５４）、ＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＧＴＧ（配列番号５５）、ＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＴＧＧ（配列番号５６）、およびＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＴＧＧ（配列番号５７）からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列；酸化剤感受性配列としてＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＴＴＣＣＴＡＴＣＧ（配列番号６３）、ＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣ（配列番号６４）、ＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＧＴＧＣＧＣＴＡＡ（配列番号６５）、ＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＣＣＧＡ（配列番号６６）およびＣＴＧＡＧＧＧＴＣＣＴＣ（配列番号６７）からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列；ならびに、逆方向反復配列としてＧＡＡＡＡＡＧＣＣＧＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＴＴＴＴＴＣ（配列番号６８）またはＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＧＣＣＧＧＧＴＧＧＴＡＧＡＧＣＣＣＧＧＣＴＴＴＴＴＣＣＧＴＧ（配列番号６９）を含むことが好ましい。
【００７４】
本発明のプラスミドの複製領域（Ｂ）および（Ｃ）におけるＤＮＡ結合タンパク質結合配列の具体例は、ＣＡＣＣＧＧＴＧ、ＡＣＣＧＧＴＧ、ＣＣＧＧＴＧ、ＡＣＣＧＧＴ、ＣＡＣＡＧＧＴ、ＣＡＣＣＧＧＴ、ＣＡＣＣＧＧ、ＧＴＧＣＧＣＡＣ、ＧＧＣＣＧＧＣＣ、ＴＣＧＧＡＧＣＴＣＣＧＡ（配列番号４６）、ＴＣＣＣＧＧＧＡ、ＴＧＣＣＧＧＣＡ、ＴＧＡＴＣＧＡＴＣＡ（配列番号４７）およびＧＣＡＣＧＴＧＣが挙げられる。
【００７５】
本発明のプラスミドの複製領域（Ｂ）および（Ｃ）における繰り返しモチーフ配列の反復単位の具体例は、ＴＧＧＣＧＴＧＧＴＣＧＴＴＧ（配列番号４８）、ＧＣＧＣＴＧＧＧＧＴＧ（配列番号４９）、ＴＧＧＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号５０）、ＧＣＧＧＴＧＧＴＧ、ＧＣＧＧＴＧＧＴＧＴＧ（配列番号５１）、ＧＧＧＣＣＧＧＧＧＴＴＧ（配列番号５２）、ＧＣＣＧＧＧＧＴＴＧＴ（配列番号５３）、ＴＧＧＴＣＧＴＧＴＴＧ（配列番号５４）、ＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＧＴＧ（配列番号５５）、ＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＴＧＧ（配列番号５６）およびＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＴＧＧ（配列番号５７）が挙げられる。
【００７６】
本発明のプラスミドの複製領域（Ｃ）の酸化剤感受性配列の具体例は、ＴＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＧＣＧＡＡＡＴＡ（配列番号５８）、ＧＧＣＣＴＣＴＣＡＧＣ（配列番号５９）、ＣＴＧＣＧＧＧＣＡＣＣＴＣＣＴＡＣ（配列番号６０）、ＴＴＣＧＡＴＧＡＧ、ＧＧＴＧＡＧＧＧＧＴＡＡＣＣＣ（配列番号６１）、ＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣ（配列番号６２）、ＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＴＴＣＣＴＡＴＣＧ（配列番号６３）、ＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣ（配列番号６４）、ＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＧＴＧＣＧＣＴＡＡ（配列番号６５）、ＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＣＣＧＡ（配列番号６６）およびＣＴＧＡＧＧＧＴＣＣＴＣ（配列番号６７）が挙げられる。
【００７７】
本発明のプラスミドの複製領域（Ｃ）の逆方向反復配列の具体例は、ＧＡＡＡＡＡＧＣＣＧＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＴＴＴＴＴＣ（配列番号６８）およびＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＧＣＣＧＧＧＴＧＧＴＡＧＡＧＣＣＣＧＧＣＴＴＴＴＴＣＣＧＴＧ（配列番号６９）が挙げられる。
【００７８】
後述する例２で述べている通り、ＤＮＡ結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列のいずれかまたはその両方を含む領域が、複製領域においてプラスミドの複製と安定保持に関与していると推測される。そこで、本発明のプラスミドの複製領域（Ｂ）および（Ｃ）は、ＤＮＡ結合タンパク質結合配列、繰り返しモチーフ配列またはＤＮＡ結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列を含む。また、本発明のプラスミドの複製領域（Ｂ）および（Ｃ）は、ＤＮＡ結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列のいずれかまたは両方を２個以上含み得る。
【００７９】
本発明のプラスミドの複製領域（Ｃ）は、酸化剤感受性配列および逆方向反復配列を含む。上記の通り、酸化剤感受性配列は複製の開始に関与すると推測される配列であり、かつ、逆方向反復配列はレプリカーゼ様タンパク質が結合し、結果的にプラスミドのコピー数を調節し得る配列である。本発明のプラスミドの複製領域（Ｃ）は、これらの配列を含有することにより、プラスミドの自律的な複製を制御し得る。なお、本発明のプラスミドの複製領域（Ａ）および（Ｂ）においても、逆方向反復配列を含むことが好ましい。
【００８０】
本発明のプラスミドの複製領域（Ａ）〜（Ｃ）における各配列の数や配置順序は、本発明のプラスミドが細菌内で自律的に複製可能であれば特に制限されず、種々の態様をとることができる。
【００８１】
本発明のプラスミドにおける複製領域（Ａ）〜（Ｃ）の具体例の一つは、配列番号３に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である。
【００８２】
［３］ＤＮＡ断片、ベクターおよび形質転換体
本発明の別の側面によれば、配列番号３に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ断片が提供される。本発明のＤＮＡ断片と外来遺伝子を連結させたものを、コクリア属細菌などの宿主細胞の染色体に、または環状化したプラスミドとして宿主細胞の細胞質内に導入することにより、外来遺伝子を発現する形質転換体が得られる。
【００８３】
本発明のＤＮＡ断片は、上記したＰＣＲ以外にも、これまでに知られているＤＮＡ合成方法を制限なく利用して合成できる。ＤＮＡ合成の具体例としては、配列番号３に記載の塩基配列の情報を基に、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などによって化学合成する方法〔J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967)；同 91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981)；同 24, 245 (1983)〕および配列番号３に記載の塩基配列に対して部位特異的突然変異を導入する方法〔Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987)；同 100, 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」、日本生化学会編, p105 (1986)〕などの遺伝子工学的な方法、ならびにこれらを組合せた方法などがあげられる。たとえば、ＤＮＡの合成は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置も使用できる。
【００８４】
本発明のＤＮＡ断片は、これまでに知られているベクター中に挿入した上で、該ベクターに対応する標的細胞に導入してもよい。このようなベクターは、例えば、自律的に複製することが可能なものでもよいし、標的細胞に導入された際に標的細胞の染色体に組み込まれ、染色体と共に複製されるものであってもよい。ベクターの好ましい例は、発現ベクターである。発現ベクターの具体例としては、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクターなどを挙げることができる。本発明のＤＮＡ断片は、発現ベクターにおいて転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）とともに機能的に連結される。プロモーターは標的細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、標的細胞の種類に応じて適宜選択することができる。
【００８５】
本発明のＤＮＡ断片を含むベクターもまた本発明の別の態様として含まれる。本発明のベクターの好ましい態様は、本発明のプラスミドである。さらに、本発明のプラスミドやベクターを含有してなる形質転換体もまた、本発明の別の態様として含まれる。
【００８６】
本明細書における、プライマーおよびプローブの調製、プラスミドＤＮＡの抽出、ライゲーション、ＤＮＡ導入、クローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーなどに記載の方法に準じて実施することができる。
【００８７】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００８８】
例１ コクリア属細菌由来プラスミドの単離
相模湾内の深度約２０００ｍの底泥から、アクチノマイセス亜目細菌の約２５０株を分離した。そのうち、コクリア属細菌であるコクリア エスピー ＭＢＥ１３１（Kocuria sp. ＭＢＥ１３１）株がプラスミドＤＮＡを含有することを次のように確認した。ＭＢＥ１３１株をＹＴＮＭ培地（１.６％ バクトトリプトン、０．５％ イーストイクストラクト、１％ 塩化ナトリウム、０．１％ 硫酸マグネシウム）中で２５℃２日間振盪培養した。この培養物から遠心操作により菌体を得た。リゾチーム（２ｍｇ／ｍＬ）を含有する２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液において３７℃で１時間保温し、菌体の細胞壁を溶解したのち、Ｈｉｇｈ ｐｕｒｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ロシュ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
【００８９】
例２ プラスミドｐＫＲ１００の塩基配列解析
例１で調製したプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩまたはＳａｌＩで消化して得られたフラグメントをプラスミドベクターｐＵＣ１８にそれぞれクローン化し、各全塩基配列を決定した。その結果、それぞれのクローンは全く同一の塩基配列からなる挿入断片を有している、環状プラスミドであることが分かった。本プラスミドをｐＫＲ１００と命名し、その塩基配列を配列番号４および図１に示した。また、本プラスミドの制限酵素マップに、ＯＲＦを記載したものを図１に示した。プラスミドｐＫＲ１００の塩基配列をＧＥＮＥＴＹＸ ＭＡＣプログラム第１２．１．１版(ＧＥＮＥＴＹＸ社製)を使用して解析した。プラスミドｐＫＲ１００は、３１８７塩基長であり、そのＧ＋Ｃ含量は６３％であった。
【００９０】
塩基番号１の１−１７５１番に示す領域には、近似的な繰り返しモチーフ配列からなるダイレクトリピート構造（図２において、塩基配列下に実線を付して太字で示した）、インバーテッドリピート（ヘアピン構造）（図２において、塩基配列下の矢印で示した）が多数検出された（図１を参照）。これにより本領域は、プラスミド複製やコピー数調節に関与する領域であることが示唆された。また、ｐＫＲ１００全長に対し、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣによるダイレクトリピート（繰り返しモチーフ配列）の検索を実施した。その結果、７４２−７５５と７５６−７６９番塩基に１４塩基対（ＴＧＧＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号５０））からなる１００％一致繰り返し配列が検出された。次に、１４塩基対からなる繰り返しモチーフ配列（ＴＧＧＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号５０））を用いてこれに相同性を示す領域の検索を実施した。１２７８−１２９１番塩基にはＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＴＧＧ（配列番号５６）が見出され７４２−７５５番塩基と１１／１４塩基が一致した。また、４１０−４２０、８７６−８８４、１０００−１０１１、１１７０−１１８２、１７２３−１７３５番塩基にも相同性を示す部分が存在した。繰り返しモチーフ配列（ＴＧＧＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号５０）、７４２−７５５および７５６−７６９番塩基）に相同性を示した１２７８−１２９１番塩基（ＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＴＧＧ（配列番号５６））に対しても同様にこれに相同性を示す領域の検索を行なった。その結果、７４２−７５５、３７６−３８９、８７６−８８６、１００２−１０１２、１１６４−１１７４番塩基が相同性を示した。よって、ｐＫＲ１００のこれらの近似的な繰り返し配列のいずれかがｐＫＲ１００の複製とコピー数制御に関与していることが示唆された。
【００９１】
ｐＫＲ１００全長に対し、ＧＥＮＥＴＹＸによるインバーテッドリピート＆コンプリメンタリー配列の検索を実施した。その結果、インバーテッドリピート配列が８０６−８３５、１３２２−１３６１番塩基に検出された。
【００９２】
ｐＫＲ１００において、１−１７５１番に示す領域には、マイコバクテリウム フォーツイツム（Mycobacteriu fortuitum）由来のプラスミドｐＡＬ５０００の複製開始領域に存在する複製タンパク質結合部位として知られているＨｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｉｔｅ（Ｈ−ｓｉｔｅ）中のＧＣｂｏｘと呼ばれる配列に相同性を示す配列が検出された（図１において、小文字で示した）。また、ｐＫＲ１００全長に対し、Ｈ−ｓｉｔｅ（ＤＮＡ結合タンパク質結合配列）の中で、最も重要な８塩基対からなるＧＣｂｏｘと呼ばれる配列ＣＡＣＣＧＧＴＧを用いて遺伝子解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ ｖｅｒ．１２．１．０（ＧＥＮＥＴＹＸ社製）による相同性検索を実施した。その結果、連続する７塩基が完全一致する箇所が、ｐＫＲ１００の４４２−４４８番の塩基配列、１３９９−１４０５番の塩基配列に検出された。これらのＨ−ｓｉｔｅ−ｌｉｋｅ ｓｅｑがＲｅｐＢタンパク質とプラスミドの結合の際に重要な役割を担う塩基配列であると予測できる。したがって、これらのＨ−ｓｉｔｅ−ｌｉｋｅ ｓｅｑは、単独または両方とも、ｐＫＲ１００の複製に関与すると予想される。
【００９３】
複製開始に関与すると推測される酸化剤感受性配列について、ｐＫＲ１００全長を対象に、ＴＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＧＣＧＡＡＡＴＡ（配列番号５８）を用いてＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣによる相同性検索を行った。その結果、上記配列に相同性を示す箇所が、ｐＫＲ１００の非ｏｒｆ領域に検出された。ＴＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＧＣＧＡＡＡＴＡ（配列番号５８）に相同性を示す配列部分の内の一つがｐＫＲ１００の複製開始点となる可能性が高いと思われる。特に、ＴＧＴＧＧＧＧは１２００−１２１１番塩基（ＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣ（配列番号６４））、３７０−３７９番塩基（ＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣ（配列番号６２））には高い相同性が見いだされた。また、その他にも相同性を示す配列が複数箇所検出された。これらの配列のうちいずれか１つまたは複数が、ＤＮＡの解離点として複製開始に関与する可能性は高いと推測される。
【００９４】
以上の通り、ｐＫＲ１００の非ｏｒｆ領域のうち、近似的な繰り返しモチーフ配列からなるダイレクトリピートまたはＨ−ｓｉｔｅ様配列のいずれかまたはその両方を含む領域が、プラスミドの複製と安定保持に関する機能を有する領域と推測される。
【００９５】
続いて、オープンリーディングフレーム解析を行なったところ、２つのオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ１とｏｒｆ２）が存在すること示唆された（図１を参照）。ｏｒｆ１のコードするタンパク質（ＯＲＦ１）は７０アミノ酸からなり、推定分子量は８．１ｋＤａ、等電点は１０．４と算出された。ｏｒｆ１がコードするアミノ酸配列の相同性検索を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）の ＢＬＡＳＴプログラムを使用して行った。しかし、ＯＲＦ１に一致するアミノ酸配列はデータベース上に見出されなかった。
【００９６】
ＯＲＦ１のアミノ酸配列を用いてAPSSP2: Advanced Protein Secondary Structure Prediction Server（http://www.imtech.res.in/raghava/apssp2/）（Raghava, G. P. S. (2002) APSSP2 : A combination method for protein secondary structure prediction based on neural network and example based learning. CASP5. A-132.を参照）により２次構造予測を行なったところ、ランダムコイル構造で隔てられた２つのヘリックス構造を有することが推定され、ＤＮＡ結合タンパク質において典型的に見出される特徴的なヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）構造を形成するＤＮＡ結合タンパク質であることが示唆された。ｏｒｆ２のコードするタンパク質（ＯＲＦ２）は３８５アミノ酸からなり、推定分子量は４１ｋＤａ、等電点は１１．１と算出された。ＯＲＦ２と一致するタンパク質をＮＣＢＩのＢＬＡＳＴプログラムにより検索したところ、 レプリカーゼスーパーファミリータンパク質に相同性を示した。しかし、最も相同性が高いものとして、わずか３１％（８０／２５７アミノ酸、Ｅ−ｖａｌｕｅ ６ｅ−６）の一致性を示すロドコッカス ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）由来のｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ（アクセッション番号ＹＰ_３４５１６４）がヒットしたにすぎなかった。ＯＲＦ２はプラスミドｐＫＲ１００の複製に関与するタンパク質であることが示唆された。
【００９７】
例３ ＭＢＥ１３１株の系統解析
例１で得たＭＢＥ１３１株の総ＤＮＡより、配列番号７および８に記載の塩基配列からなるプライマーセットを用いて１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅した。増幅断片をＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ （ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製し、その塩基配列を決定した。ＭＢＥ１３１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は、データベースに登録されているコクリア ロゼア（Kocuria rosea）標準株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列（アクセッション番号 Ｘ８７７５６）に対して、９９％の塩基配列の同一性を示した。これによりＭＢＥ１３１株は、系統分類学的にコクリア ロゼアに最も近縁の種であると想定される。
【００９８】
例４ コクリア エスピー ＭＢＥ１３１株とコクリア ロゼア標準株との比較
ＭＢＥ１３１株を、ＹＴＭＮ培地で２５℃、２日間培養し、得られた菌体から例１と同様の手順で、プラスミド精製キットを用いたプラスミド抽出操作を行った。一方、菌株保存機関に保存されているコクリア属細菌であるコクリア ロゼア 標準株（ＮＢＲＣ１５５８８）を同条件で培養し、培養物から得られた菌体を同様の操作に供した。続いて、前述の２株より抽出した各ＤＮＡ溶液をアガロース電気泳動に供した（図５を参照）。その結果、ＭＢＥ１３１株の場合には、プラスミドＤＮＡのバンドが検出されたが、コクリア ロゼア標準株では検出されなかった。
【００９９】
また、抽出した各ＤＮＡ溶液を鋳型として、ｐＫＲ１００の塩基配列に相補的な配列を有するフォワードプライマーおよびリバースプライマーのプライマーセットＡ−Ｆ（表１）を用いてＰＣＲを実施した。
【表１】
【０１００】
ＰＣＲでは、ＬＡ ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、熱変性条件：９８℃にて３０秒間、アニーリング条件：６２℃にて、６０秒間、伸長条件：７２℃にて２分間の反応を１サイクルとして、これを合計３０サイクル繰り返した。得られたＰＣＲ反応物をアガロース電気泳動に供したところ、ＭＢＥ１３１株から得られたＤＮＡ溶液を鋳型として用いた場合は、配列番号１に基づいて算出される大きさと一致する増幅断片が検出されたが、コクリア ロゼア標準株から得られたＤＮＡ溶液を鋳型として用いた場合は、増幅断片は検出されなかった（図６を参照）。なお、図６のレーン、プライマーセットおよび鋳型に用いたＤＮＡの関係を表２に示す。
【表２】
【０１０１】
さらに、ＭＢＥ１３１株またはコクリア ロゼア標準株を０．１ｍｇ／ｍＬ プロテアーゼＫを含む０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ溶液にけん濁し、６５℃にて２０分間保温した後、１００℃にて１０分間加熱し、細胞溶解液を調整した。各菌株より得られた細胞溶解液を鋳型ＤＮＡ溶液として、前述のプライマーセットＡ−Ｆ(表１)を用いたＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応では、ＬＡ ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、熱変性条件：９８℃にて３０秒間、アニーリング条件：６２℃にて、６０秒間、伸長条件：７２℃にて２分間の反応を１サイクルとして、これを合計３０サイクル繰り返した。得られたＰＣＲ反応物をアガロース電気泳動に供したところ、ＭＢＥ１３１株から得られた細胞溶解液を鋳型ＤＮＡ溶液として用いた場合は、配列番号１に基づいて算出される大きさと一致する増幅断片が検出されたが、コクリア ロゼア標準株から得られた細胞溶解液を鋳型ＤＮＡ溶液として用いた場合は、増幅断片は検出されなかった（図７を参照）。以上の結果より、プラスミドｐＫＲ１００は、コクリア ロゼア 標準株には存在しないことが分かった。なお、図７のレーン、プライマーセットおよび鋳型に用いたＤＮＡの関係を表３に示す。
【表３】
【０１０２】
例５ シャトルベクターの構築
プラスミドｐＫＲ１００の配列番号４の７−３１７０番に示す塩基配列を含むＤＮＡ断片とスタフィロコッカス オーレウス（Staphyrococcus aureus）由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子を、ｐＨＹ３００ＰＬＫのマルチクローニングサイトに連結し、大腸菌とのシャトルベクターｐＲ６６３２を構築した。コクリア属細菌ＭＢＥ１３１株の形質転換は、ｐＲ６６３２を有する大腸菌ＨＢ１０１の形質転換体から調製したプラスミドを用いて、以下の諸条件からなるエレクトロポレーションによって実施した。プラスミドＤＮＡ ０．１〜１０μg；電場強度６〜２５ｋＶ／ｃｍ；抵抗５０〜９００Ω。細胞のパルス処理後のインキュベーション時間は３０℃で３時間とした。
【０１０３】
２μg／ｍＬのクロラムフェニコールまたは４μg／ｍＬのテトラサイクリン含有のＹＴＮＭ寒天培地上で、３０℃で５〜７日間培養した。増殖したコロニーを、０．１ｍｇ／ｍＬ プロテアーゼＫを含む０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ溶液にけん濁し、６５℃にて２０分間保温した後、１００℃にて１０分間加熱し、細胞溶解液を調整した。得られた細胞溶解液を鋳型ＤＮＡ溶液として、ｐＲ６６３２の有するクロラムフェニコール耐性遺伝子塩基配列に相補的なプライマーセット（配列番号２１および２２に記載の塩基配列からなるプライマーセット）を用いたＰＣＲを行った。本ＰＣＲではクロラムフェニコール耐性遺伝子はＭＢＥ１３１野生株およびプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫには存在しないため、導入されたｐＲ６６３２の選択的検出が可能である。ＰＣＲでは、ＬＡ ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、熱変性条件：９８℃にて３０秒間、アニーリング条件：６０℃にて、６０秒間、伸長条件：７２℃にて１分間の反応を１サイクルとして、これを合計３０サイクル繰り返した。得られたＰＣＲ反応物をアガロース電気泳動に供したところ、ＭＢＥ１３１株形質転換株から得られた細胞溶解液を鋳型ＤＮＡ溶液として用いた場合は、ｐＲ６６３２の塩基配列から算出される増幅断片が検出された（図８のレーン２を参照）。比較として、野生型のＭＢＥ１３１株を用いて同試験を行ったが、増幅断片は検出されなかった（図８のレーン３を参照）。
【０１０４】
一方、ＭＢＥ１３１形質転換体をＹＴＮＭ培地で３０℃にて１日培養し、例１と同様にプラスミド精製キットを用いてプラスミド抽出操作を行った。得られたＤＮＡ溶液を用いて、大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。大腸菌形質転換体から同プラスミド精製キットを用いてプラスミドを調製し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動に供した（図９を参照）。比較対象として、同制限酵素で消化したｐＨＹ３００ＰＬＫも同時に泳動した（図９のレーン２）。その結果、制限酵素消化パターンより、得られたＭＢＥ１３１形質転換株が有するプラスミドは、ｐＲ６６３２であることが分かった（図９のレーン３）。
【０１０５】
その結果、プラスミドｐＲ６６３２は、ＭＢＥ１３１株中で複製・保持されることが分かった。ｐＫＲ１００を有するＭＢＥ１３１株が持つＹＴＮＭ固体培地上でのクロラムフェニコール耐性が１μg／ｍＬ未満であるのに対し、ｐＲ６６３２で形質転換されたＭＢＥ１３１株は５０μg／ｍＬのクロラムフェニコールに耐性を示した。また、ｐＲ６６３２はエンテロコッカス ファエカリス（Enterococcus faecalis）由来のテトラサイクリン遺伝子も有しており、ｐＫＲ１００を有するＭＢＥ１３１株が持つテトラサイクリン耐性が３μg／ｍＬ未満であるのに対し、ｐＲ６６３２で形質転換されたＭＢＥ１３１株は１００μg／ｍＬのテトラサイクリンに耐性を示した。従って、ｐＫＲ１００を含むプラスミドはＭＢＥ１３１株において、異種外来遺伝子を保持、発現させるためのベクターとして機能すると考えられる。
【０１０６】
例６ 複製を担う領域の特定
プラスミドｐＫＲ１００の一部を含む種々のＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。ｐＨＹ３００ＰＬＫのマルチクローニングサイトに上述のクロラムフェニコール耐性遺伝子を連結し、さらに図４に示した各断片を連結した。構築した各プラスミドで大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、大腸菌ＨＢ１０１形質転換体からプラスミドを調製した。調製したプラスミドを用いて、上述の方法でＭＢＥ１３１株を形質転換した。その結果、配列番号１の１０３１−３１７０番の塩基配列を含む断片を有するプラスミドを用いた場合にＭＢＥ１３１株を形質転換することができた（図４を参照）。従って、配列番号１に示す１０３１−３１７０番の塩基配列で示す領域はＭＢＥ１３１株中でプラスミドの複製・保持を担う領域であるといえる。なお、配列番号１の１０３１−３１７０番の塩基配列を含む断片は、次のようにして得た。プラスミドｐＫＲ１００を鋳型として、表４に示すＧからＱのフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマーセットから選ばれる一組のプライマーセットを用いて、ＰＣＲ反応を行なった。
【表４】
【０１０７】
ＰＣＲ反応では、ＬＡ ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、熱変性条件：９４から９８℃にて１５から３０秒間、アニーリング条件：５５から６８℃にて、１５から６０秒間、伸長条件：７２℃にて２から５分間の反応を１サイクルとして、これを合計３０サイクル繰り返した。
【０１０８】
例７ 異種を宿主細胞とした形質転換体の作製
プラスミドｐＲ６６３２を用いて、種の異なるコクリア属細菌Kocuria rhizophila ＤＣ２２０１（ＮＢＲＣ１０３２１７）を形質転換した。形質転換体を２μg／ｍＬのクロラムフェニコールまたは４μg／ｍＬのテトラサイクリン含有のＹＴＮＭ寒天培地上で、３０℃で５〜７日間培養した。増殖したコロニーを、０．１ｍｇ／ｍＬ プロテアーゼＫを含む０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ溶液にけん濁し、６５℃にて２０分間保温した後、１００℃にて１０分間加熱し、細胞溶解液を調整した。得られた細胞溶解液を鋳型ＤＮＡ溶液として、ｐＲ６６３２の有するクロラムフェニコール耐性遺伝子塩基配列に相補的なプライマーセット（配列番号２１および２２の塩基配列からなるフォワードプライマーおよびリバースプライマー）、テトラサイクリン耐性遺伝子塩基配列に相補的なプライマーセット（配列番号４３および４４の塩基配列からなるフォワードプライマーおよびリバースプライマー）、を用いたＰＣＲを行った。
【０１０９】
クロラムフェニコール耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子はＤＣ２２０１株ゲノム上には存在していないため、ｐＲ６６３２の選択的検出が可能である。ＰＣＲでは、ＬＡ ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、熱変性条件：９８℃にて３０秒間、アニーリング条件：６０℃にて、６０秒間、伸長条件：７２℃にて１分間の反応を１サイクルとして、これを合計３０サイクル繰り返した。得られたＰＣＲ反応物をアガロース電気泳動に供したところ、ＤＣ２２０１形質転換株から得られた細胞溶解液を鋳型ＤＮＡ溶液として用いた場合、ｐＲ６６３２の塩基配列から算出される増幅断片が検出された（図１０のレーン１および２を参照）。また、ＭＢＥ１３１株形質転換体を用いた場合に得られたＰＣＲ増幅断片の大きさとも良く一致した（図１０のレーン４および５を参照）。比較として、ＤＣ２２０１野生株を用いて同試験を行ったが、増幅断片は検出されなかった（図１０のレーン６および７を参照）ことから、検出された増幅断片は、導入されたプラスミドｐＲ６６３２に由来することが分かった。以上の結果より、プラスミドｐＲ６６３２はＤＣ２２０１株においても、複製および保持されることが分かった。
【０１１０】
このことから、プラスミドｐＲ６６３２は、さらに他の種の異なるコクリア属細菌中でも複製・保持されることが可能であると考えられる。プラスミドを有していないＤＣ２２０１株が持つＹＴＮＭ固体培地上でのクロラムフェニコール耐性が１μg／ｍＬ未満であるのに対し、ｐＲ６６３２で形質転換されたＤＣ２２０１株は１０μg／ｍＬのクロラムフェニコールに耐性を示した。従って、ｐＫＲ１００の複製を担う領域を含むプラスミドは、種の異なるコクリア属細菌においても、異種外来遺伝子を保持、発現させるためのベクターとして機能すると考えられる。
【０１１１】
例８ ｐＫＲ１００における非タンパク質コード領域の機能解析
ｐＫＲ１００の有するタンパクをコードしないＤＮＡ塩基配列の機能を確かめるために、以下の実験を行った。ｐＫＲ１００の一部が欠如したＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＫＲ１１１、ｐＫＲ１２１、ｐＫＲ１４１を作成した。これらのプラスミドはｐＲ６６３２と同様に、クロラムフェニコール耐性遺伝子を選択マーカーとして有している。ｐＫＲ１１１はｐＫＲ１００の３１２−３１７０番に由来するＤＮＡ断片を有し、ｐＫＲ１２１はｐＫＲ１００の５５９−３１７０番に由来するＤＮＡ断片を有し、ｐＫＲ１４１はｐＫＲ１００の１０３１−３１７０番に由来するＤＮＡ断片を有している。ｐＫＲ１１１およびｐＫＲ１２１はｐＲ６６３２と同様に、近似的な繰り返しモチーフ配列からなるダイレクトリピートとインバーテッドリピートからなる特徴的な配列を２セット有しているが、ｐＫＲ１４１では１セットのみである。各プラスミドを有する形質転換体ＭＢＥ１３１（ｐＲ６６３２）ＭＢＥ１３１（ｐＫＲ１１１）、ＭＢＥ１３１（ｐＫＲ１２１）、ＭＢＥ１３１（ｐＫＲ１４１）を２５℃にて、抗生物質を含有しないＹＴＮＭ培地中２０世代培養した。培養後の培養液を、抗生物質を含有しないＹＴＮＭ寒天培地に塗布し、２５℃にて３日間、単一コロニーを形成させた。固体寒天培地上に増殖した各コロニーを、抗生物質を含有していないＹＴＮＭ寒天培地とクロラムフェニコールを含有する個体寒天培地に同時にピックアップした。抗生物質を含有しない固体寒天培地に増殖したコロニー数に対する、クロラムフェニコール含有固体寒天培地に増殖したコロニー数を算出し、プラスミド保持率（％）とした（図１２を参照）。この結果、近似的な繰り返しモチーフ配列からなるダイレクトリピートとインバーテッドリピートからなる特徴的な配列を１セットしか有していないｐＫＲ１４１は他の被験プラスミドに比べて、プラスミド安定性が低いことが分かった。すなわち、ｐＫＲ１００の５５９−１０３１番塩基配列は、プラスミドの安定保持に関与する機能を持つことが分かった。また、さらにｐＫＲ１４１に存在するダイレクトリピートをした削除プラスミドはＭＢＥ１３１株中で複製不可能である（すでに記載の実施例、例６より）ことからダイレクトリピートとインバーテッドリピートからなる特徴的な配列は、ｐＫＲ１００の複製や安定保持に重要な役割を担っていると判断される。また、ｐＫＲ１００の５５９−３１７０番塩基は、プラスミドの複製、安定性に重要な役割を持つと判断される。
【０１１２】
以下に、本明細書に記載のある塩基配列を列記する。
［配列番号１］ｐＫＲ１００におけるｏｒｆ１領域
ATGGGCGACCCTCAGCTTGTAATGGGCTTTTTCCAGGTCTTCCTTCGTGCCTTTCTCGTACAGAGCGTCTGCTTCGAGAAGGGCCCATTCCGCTTCGACAAACTGCCGGGCAAGAAGTTTTTTGCTGGATGGCTTAGTCATGGCAAGGAACGTAGCTGCCGAAGTAGTGAAGGCTGTACAGATCCGACGCGGTTCGCGCGGGTCCGTCAGTAG
［配列番号２］ｐＫＲ１００におけるｏｒｆ２領域
GTGACCAGTGTAGGCACGCACCTTCCCTCGTCCACCAGCCCCGCCGCAACACGGCAGGCGGCTGTTCGGCAGGCATTTGTTAACCATTTAGGCGTGCGCCACGTGCGTGTGGCGGCCACCAAGAACGGTGCGCCGCGCACCGTTCCCATTGAGGCGTTAGGCGAGTTCGCCTTTTGGACGCCACCGGCCTGGCCCAACCTCGGATTGCTGACTATTGACGTCGACCGGGATGCGGCCGTGCTCGAGCTCTTCGCCGCCCCTGCCCTGCCGCATGTGGTCGTGGAGACCCCCCGCGGGGCCCAAGCGGTGTGGCTGATCGACCGAGTACACACCGGCCCGAACGCCCGCCCGCACCCGATCGCCTATGCCGAAACCGTAGGAAGCGCTTTGCGTGCCTCCCTGGATGGAGACTCGGCCGTGGATCCATTGCGCCCGGTACGTACCCGTAACCCCTGCTACAGACCTGCACAGCGCGATGTGTTCACCACTGCCCGCCCGCTAACGGCGCCCTACCGTCTCGGAGAGCTCCAGAAATCCCTGGATGCTGCTGGAGCATGGCCAACACGTCCTGAGCGCTCTCAGGCCCGTGGAAGGGCGCAGAAGGCCGTTGACGGAGTGTTCGTGGGCCGTAACGACGCCGTCAACCGCTCCACCTGGCTGACCGTGCGCTACGGACTCGAAAATGGTTCCGTGACTCACTGGACCGATGCCGACGTGCTGGAGCTGGCCCATGGCATTAACGAGGCCGTCGCTGCTGAGCAAGGCGTGCCGCCCTTACCCGAGGATCAAGTGCGCGACTTGGCTGTCTCGATCTGCCGGCATCAACACCGACCTGGCCGCCGAGCCATCTCCGGACAAGGCTCGGCCACCGCCCGCGCCCTCGGCGCTAAAGGCGGCGCAGCCCGTTCCGAGGCCAAAACCATTAGCGGGCGGCGCAACGTGGGCAAGGCGACCGCTGTGCGTTCCGCATCCGCGGCCTTGCGTTCTGAGAGCATCCGAATCCTGGCCGAGCAAGGGCACACCTACGAGGCCATTGCCGCCGCTGTCGGATGCTCCACTAAGACCGTTCAGCGTGCTCTTCGCGACCTCTGA
［配列番号３］ｐＫＲ１００における複製領域
CGGTCAGGCTGGACGGTGCGTGGTCATAAACCGTGGGTCGGTTCGGAGAGCCGGGGGGTGGCTTCCTATCGTCGTGAGATGAGCAGAGAACGCTATGAGCCGATGAGTGAGGCCCGGTTGGAAGTCGCTTGGATGGTCGTGTTGCTGGGGTGTGCGCTGGTTCTTATGGGTGGGGTGGCCCTGGATGTGTTGATCGATCATCTCGCTGTCAGCTTCGCCTTGGCGGGGGTGCCGAGTGTGTTGGTGGTGGCGGTGTTGTGGCGGCGGCACGTGCGCTAAGCCGTGTACGGGCACAGAAAAAGCCGGGTGGTAGAGCCCGGCTTTTTCCGTGGGGGAGAGTCTCGTACCCCGCGTCTCAGTGTCCTGCACACCGGTCGTGATGCCTACTGCCGCTACACGGAGCAAAGCTATGCGTTATGTGCCATAAACGCGGATCGCCCTTCGTCCAGCTCGTGGAGCTGGCTGAGTGCCTATGTGCCATAGGCGGGCGGGGGCACCCGAGCGGGCTCGTGTGAGCGCTGCGCTGGGCATAGGGAAGGCCGGGCGCTAGCCCAGCCCTCCATGGGGGCAGAGGGCCCCGTGGTGTTGAGAGTGGCGAGCCCTACTGAGGGTCCTCGAAGGCGTCGGGGGCGCTTCGTGTCCTCTTCAGTTTTTGATCCCTGGCGTCCTGAACTTCGTTCGCGACTGCCTCCGGGGTGCCGGTGGCAAGGAGAGCATGCACATGGGCGACCCTCAGCTTGTAATGGGCTTTTTCCAGGTCTTCCTTCGTGCCTTTCTCGTACAGAGCGTCTGCTTCGAGAAGGGCCCATTCCGCTTCGACAAACTGCCGGGCAAGAAGTTTTTTGCTGGATGGCTTAGTCATGGCAAGGAACGTAGCTGCCGAAGTAGTGAAGGCTGTACAGATCCGACGCGGTTCGCGCGGGTCCGTCAGTAGGCCAGTGATGGGCCATAGGGTGACCAGGAAAGAGTTGAGCCCCGGAGATTCCACCCTCCGGGGCTCGACTTCCCCGATTGATAGCGGCAATCAGGAGAAGCCTTGTGACCAGTGTAGGCACGCACCTTCCCTCGTCCACCAGCCCCGCCGCAACACGGCAGGCGGCTGTTCGGCAGGCATTTGTTAACCATTTAGGCGTGCGCCACGTGCGTGTGGCGGCCACCAAGAACGGTGCGCCGCGCACCGTTCCCATTGAGGCGTTAGGCGAGTTCGCCTTTTGGACGCCACCGGCCTGGCCCAACCTCGGATTGCTGACTATTGACGTCGACCGGGATGCGGCCGTGCTCGAGCTCTTCGCCGCCCCTGCCCTGCCGCATGTGGTCGTGGAGACCCCCCGCGGGGCCCAAGCGGTGTGGCTGATCGACCGAGTACACACCGGCCCGAACGCCCGCCCGCACCCGATCGCCTATGCCGAAACCGTAGGAAGCGCTTTGCGTGCCTCCCTGGATGGAGACTCGGCCGTGGATCCATTGCGCCCGGTACGTACCCGTAACCCCTGCTACAGACCTGCACAGCGCGATGTGTTCACCACTGCCCGCCCGCTAACGGCGCCCTACCGTCTCGGAGAGCTCCAGAAATCCCTGGATGCTGCTGGAGCATGGCCAACACGTCCTGAGCGCTCTCAGGCCCGTGGAAGGGCGCAGAAGGCCGTTGACGGAGTGTTCGTGGGCCGTAACGACGCCGTCAACCGCTCCACCTGGCTGACCGTGCGCTACGGACTCGAAAATGGTTCCGTGACTCACTGGACCGATGCCGACGTGCTGGAGCTGGCCCATGGCATTAACGAGGCCGTCGCTGCTGAGCAAGGCGTGCCGCCCTTACCCGAGGATCAAGTGCGCGACTTGGCTGTCTCGATCTGCCGGCATCAACACCGACCTGGCCGCCGAGCCATCTCCGGACAAGGCTCGGCCACCGCCCGCGCCCTCGGCGCTAAAGGCGGCGCAGCCCGTTCCGAGGCCAAAACCATTAGCGGGCGGCGCAACGTGGGCAAGGCGACCGCTGTGCGTTCCGCATCCGCGGCCTTGCGTTCTGAGAGCATCCGAATCCTGGCCGAGCAAGGGCACACCTACGAGGCCATTGCCGCCGCTGTCGGATGCTCCACTAAGACCGTTCAGCGTGCTCTTCGCGACCTCTGAAACAGTCTCC
［配列番号４］ｐＫＲ１００
ATAAGCCCAAGGTGAGGGGACGCTCCCCGGGCCTCTCAGCCCCCCCTCTGAGGGCTCCTGCGGGCACCTCCTACGATCCTCCGAACAGCCCTGATCGTCACACCTCATGCATCATTCGATGAGCCAGGTCTAGGTGACCAAACGCAGGCGGCCACAGACTCAGCTGCACTCTCATCGTGAGGTGCCCAGAGCGTCGCAACAAGGCACCGACCCAGCCTCAATTTTCATCCGCCGGCCTTAACGGCGACCGTCACTGTTGATGACTTTTGCTGTCCTCGAATCACCCTTCGCGGGTGAGGGGTAACCCGCTTCGGGTGAGGCAACCAGAACGGGTCCCTGTGCTCGGCTATGTGGTCGAGCAGGTGCCTGGTGGGGTGGCGTGGTCGTTGTCGGCGGGCCGGTTTCGGGCGCGCTGGGGTGACCTAGCTGTGCGCACCGAGGACCGGTGCGAAGGACAAGATGAGCGTCTTTCCCGAGGGCCGGCCAAAGAATGCAAGAGGTGTGACGACTTGGATCAGAGTTCGGAGCTCCGACGCATTGGGAGGTGATTGGGTGCAGCGTGAGACCAGTCCGTAGCGTTTGACGAATGCAAATGCGACGCGGGGACCAGGAGGCTAGACATCGTCGAGATATGGCTTGGATTCTGGTGCTGCTGGCTGGAGTGCAGGTGGGTTTGCTGGCGACGGTGATCGGTGTCTTGGTCGAGGACCTCGTGGTGGGCACTGTCGTTGCTTTGGTTCCTGGGGCTGTGGTGGTGGGGCTGTGGTGGCGGCGGTTTTTGGACTAGCCGGCGTTGCTGGGCATGGAAAAAGCCGGGCTGCTGCCCGGCTTTTTCTTCTGGGAGGCGGGGCCTGGTCAACCGGGCCTCCCGGGAAGCGGTGGTGTGAGCACGTCAGTTCCCGCCTCCAGTGTTGGCCGTTCTTCGGTTTGTTCCCAAAAGTGACGGCGATGGGTGGGTGGAAGGTCCCGTCCAGGTCTGATTTGCCGGCACAGGTTGCTGGGCCGGGGTTGTCCCCGTAGGGGTCTGTCCCGGTCAGGCTGGACGGTGCGTGGTCATAAACCGTGGGTCGGTTCGGAGAGCCGGGGGGTGGCTTCCTATCGTCGTGAGATGAGCAGAGAACGCTATGAGCCGATGAGTGAGGCCCGGTTGGAAGTCGCTTGGATGGTCGTGTTGCTGGGGTGTGCGCTGGTTCTTATGGGTGGGGTGGCCCTGGATGTGTTGATCGATCATCTCGCTGTCAGCTTCGCCTTGGCGGGGGTGCCGAGTGTGTTGGTGGTGGCGGTGTTGTGGCGGCGGCACGTGCGCTAAGCCGTGTACGGGCACAGAAAAAGCCGGGTGGTAGAGCCCGGCTTTTTCCGTGGGGGAGAGTCTCGTACCCCGCGTCTCAGTGTCCTGCACACCGGTCGTGATGCCTACTGCCGCTACACGGAGCAAAGCTATGCGTTATGTGCCATAAACGCGGATCGCCCTTCGTCCAGCTCGTGGAGCTGGCTGAGTGCCTATGTGCCATAGGCGGGCGGGGGCACCCGAGCGGGCTCGTGTGAGCGCTGCGCTGGGCATAGGGAAGGCCGGGCGCTAGCCCAGCCCTCCATGGGGGCAGAGGGCCCCGTGGTGTTGAGAGTGGCGAGCCCTACTGAGGGTCCTCGAAGGCGTCGGGGGCGCTTCGTGTCCTCTTCAGTTTTTGATCCCTGGCGTCCTGAACTTCGTTCGCGACTGCCTCCGGGGTGCCGGTGGCAAGGAGAGCATGCACATGGGCGACCCTCAGCTTGTAATGGGCTTTTTCCAGGTCTTCCTTCGTGCCTTTCTCGTACAGAGCGTCTGCTTCGAGAAGGGCCCATTCCGCTTCGACAAACTGCCGGGCAAGAAGTTTTTTGCTGGATGGCTTAGTCATGGCAAGGAACGTAGCTGCCGAAGTAGTGAAGGCTGTACAGATCCGACGCGGTTCGCGCGGGTCCGTCAGTAGGCCAGTGATGGGCCATAGGGTGACCAGGAAAGAGTTGAGCCCCGGAGATTCCACCCTCCGGGGCTCGACTTCCCCGATTGATAGCGGCAATCAGGAGAAGCCTTGTGACCAGTGTAGGCACGCACCTTCCCTCGTCCACCAGCCCCGCCGCAACACGGCAGGCGGCTGTTCGGCAGGCATTTGTTAACCATTTAGGCGTGCGCCACGTGCGTGTGGCGGCCACCAAGAACGGTGCGCCGCGCACCGTTCCCATTGAGGCGTTAGGCGAGTTCGCCTTTTGGACGCCACCGGCCTGGCCCAACCTCGGATTGCTGACTATTGACGTCGACCGGGATGCGGCCGTGCTCGAGCTCTTCGCCGCCCCTGCCCTGCCGCATGTGGTCGTGGAGACCCCCCGCGGGGCCCAAGCGGTGTGGCTGATCGACCGAGTACACACCGGCCCGAACGCCCGCCCGCACCCGATCGCCTATGCCGAAACCGTAGGAAGCGCTTTGCGTGCCTCCCTGGATGGAGACTCGGCCGTGGATCCATTGCGCCCGGTACGTACCCGTAACCCCTGCTACAGACCTGCACAGCGCGATGTGTTCACCACTGCCCGCCCGCTAACGGCGCCCTACCGTCTCGGAGAGCTCCAGAAATCCCTGGATGCTGCTGGAGCATGGCCAACACGTCCTGAGCGCTCTCAGGCCCGTGGAAGGGCGCAGAAGGCCGTTGACGGAGTGTTCGTGGGCCGTAACGACGCCGTCAACCGCTCCACCTGGCTGACCGTGCGCTACGGACTCGAAAATGGTTCCGTGACTCACTGGACCGATGCCGACGTGCTGGAGCTGGCCCATGGCATTAACGAGGCCGTCGCTGCTGAGCAAGGCGTGCCGCCCTTACCCGAGGATCAAGTGCGCGACTTGGCTGTCTCGATCTGCCGGCATCAACACCGACCTGGCCGCCGAGCCATCTCCGGACAAGGCTCGGCCACCGCCCGCGCCCTCGGCGCTAAAGGCGGCGCAGCCCGTTCCGAGGCCAAAACCATTAGCGGGCGGCGCAACGTGGGCAAGGCGACCGCTGTGCGTTCCGCATCCGCGGCCTTGCGTTCTGAGAGCATCCGAATCCTGGCCGAGCAAGGGCACACCTACGAGGCCATTGCCGCCGCTGTCGGATGCTCCACTAAGACCGTTCAGCGTGCTCTTCGCGACCTCTGAAACAGTCTCCGTCGAGGTGGACATTTC
［配列番号５］ｐＫＲ１００におけるｏｒｆ１によってコードされるＯＲＦ１
MTSVGTHLPSSTSPAATRQAAVRQAFVNHLGVRHVRVAATKNGAPRTVPIEALGEFAFWTPPAWPNLGLLTIDVDRDAAVLELFAAPALPHVVVETPRGAQAVWLIDRVHTGPNARPHPIAYAETVGSALRASLDGDSAVDPLRPVRTRNPCYRPAQRDVFTTARPLTAPYRLGELQKSLDAAGAWPTRPERSQARGRAQKAVDGVFVGRNDAVNRSTWLTVRYGLENGSVTHWTDADVLELAHGINEAVAAEQGVPPLPEDQVRDLAVSICRHQHRPGRRAISGQGSATARALGAKGGAARSEAKTISGRRNVGKATAVRSASAALRSESIRILAEQGHTYEAIAAAVGCSTKTVQRALRDL
［配列番号６］ｐＫＲ１００におけるｏｒｆ２によってコードされるＯＲＦ２
MGDPQLVMGFFQVFLRAFLVQSVCFEKGPFRFDKLPGKKFFAGWLSHGKERSCRSSEGCTDPTRFARVRQ
［配列番号７］ＭＢＥ１３１株の系統分類解析用のフォワードプライマー
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
［配列番号８］ＭＢＥ１３１株の系統分類解析用のリバースプライマー
AAAGGAGGTGATCCAGCC
［配列番号９］表１のセットＡのフォワードプライマー
TGGTGGCGGTGTTGTG
［配列番号１０］表１のセットＡのリバースプライマー
TCGCGAACGAAGTTCAGG
［配列番号１１］表１のセットＢのフォワードプライマー
GCCGGTGGCAAGGAGAGCATGCACATGGGCGACCCTC
［配列番号１２］表１のセットＢのリバースプライマー
CACTGGCCTACTGACGGACC
［配列番号１３］表１のセットＣのフォワードプライマー
GGTCCGTCAGTAGGCCAGTG
［配列番号１４］表１のセットＣのリバースプライマー
GGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号１５］表１のセットＤのフォワードプライマー
TGGTGGCGGTGTTGTG
［配列番号１６］表１のセットＤのリバースプライマー
CACTGGCCTACTGACGGACC
［配列番号１７］表１のセットＥのフォワードプライマー
GCCGGTGGCAAGGAGAGCATGCACATGGGCGACCCTC
［配列番号１８］表１のセットＥのリバースプライマー
GGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号１９］表１のセットＦのフォワードプライマー
TGGTGGCGGTGTTGTG
［配列番号２０］表１のセットＦのリバースプライマー
GGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号２１］ｐＲ６６３２の有するクロラムフェニコール耐性遺伝子塩基配列に相補的なフォワードプライマー
GTTACAATAGCGACGGAGAG
［配列番号２２］ｐＲ６６３２の有するクロラムフェニコール耐性遺伝子塩基配列に相補的なリバースプライマー
AGGTTAGTGACATTAGAAAACC
［配列番号２３］表４のセットＧのフォワードプライマー
ATTAAAGCTTCCAAGGTGAGGGGACGC
［配列番号２４］表４のセットＧのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号２５］表４のセットＨのフォワードプライマー
ATTAAAGCTTCCAAGGTGAGGGGACGC
［配列番号２６］表４のセットＨのリバースプライマー
AAAAAAGCTTCGGCGGCCAGGTCGGTGTTGATGC
［配列番号２７］表４のセットＩのフォワードプライマー
TTTTAAGCTTCGGGTGAGGCAACCAGAAC
［配列番号２８］表４のセットＩのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号２９］表４のセットＪのフォワードプライマー
ATTGGAAGCTTCGTGAGACCAGTCC
［配列番号３０］表４のセットＪのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号３１］表４のセットＫのフォワードプライマー
TTTTAAGCTTGGACTAGCCGGCGTTGC
［配列番号３２］表４のセットＫのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号３３］表４のセットＬのフォワードプライマー
AAGGGTAAGCTTCGGTCAGGCTGGACGGTGCGTGG
［配列番号３４］表４のセットＬのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号３５］表４のセットＭのフォワードプライマー
AAGGAAGCTTGTGCGCTAAGCCGTGTACG
［配列番号３６］表４のセットＭのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号３７］表４のセットＯのフォワードプライマー
TTTTAAGCTTCTCGTACCCCGCGTCTCAG
［配列番号３８］表４のセットＯのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号３９］表４のセットＰのフォワードプライマー
CACCCGAAGCTTCTCGTGTGAGCGCTGCG
［配列番号４０］表４のセットＰのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号４１］表４のセットＱのフォワードプライマー
AGGTTAAGCTTGGTCCGTCAGTAGGCCAGTG
［配列番号４２］表４のセットＱのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
［配列番号４３］ｐＲ６６３２の有するテトラサイクリン耐性遺伝子塩基配列に相補的なフォワードプライマー
GTAACCAGCCAACTAATGAC
［配列番号４４］ｐＲ６６３２の有するテトラサイクリン耐性遺伝子塩基配列に相補的なリバースプライマー
CTCGTAATGGTTGTAGTTGC
［配列番号４５］ｐＫＲ１００における複製領域からｏｒｆ１領域およびｏｒｆ２領域を除いた領域
CGGTCAGGCTGGACGGTGCGTGGTCATAAACCGTGGGTCGGTTCGGAGAGCCGGGGGGTGGCTTCCTATCGTCGTGAGATGAGCAGAGAACGCTATGAGCCGATGAGTGAGGCCCGGTTGGAAGTCGCTTGGATGGTCGTGTTGCTGGGGTGTGCGCTGGTTCTTATGGGTGGGGTGGCCCTGGATGTGTTGATCGATCATCTCGCTGTCAGCTTCGCCTTGGCGGGGGTGCCGAGTGTGTTGGTGGTGGCGGTGTTGTGGCGGCGGCACGTGCGCTAAGCCGTGTACGGGCACAGAAAAAGCCGGGTGGTAGAGCCCGGCTTTTTCCGTGGGGGAGAGTCTCGTACCCCGCGTCTCAGTGTCCTGCACACCGGTCGTGATGCCTACTGCCGCTACACGGAGCAAAGCTATGCGTTATGTGCCATAAACGCGGATCGCCCTTCGTCCAGCTCGTGGAGCTGGCTGAGTGCCTATGTGCCATAGGCGGGCGGGGGCACCCGAGCGGGCTCGTGTGAGCGCTGCGCTGGGCATAGGGAAGGCCGGGCGCTAGCCCAGCCCTCCATGGGGGCAGAGGGCCCCGTGGTGTTGAGAGTGGCGAGCCCTACTGAGGGTCCTCGAAGGCGTCGGGGGCGCTTCGTGTCCTCTTCAGTTTTTGATCCCTGGCGTCCTGAACTTCGTTCGCGACTGCCTCCGGGGTGCCGGTGGCAAGGAGAGCATGCAC
［配列番号４６］ＤＮＡ結合タンパク質結合配列１
TCGGAGCTCCGA
［配列番号４７］ＤＮＡ結合タンパク質結合配列２
TGATCGATCA
［配列番号４８］繰り返しモチーフ配列の反復単位１
TGGCGTGGTCGTTG
［配列番号４９］繰り返しモチーフ配列の反復単位２
GCGCTGGGGTG
［配列番号５０］繰り返しモチーフ配列の反復単位３
TGGGGCTGTGGTGG
［配列番号５１］繰り返しモチーフ配列の反復単位４
GCGGTGGTGTG
［配列番号５２］繰り返しモチーフ配列の反復単位５
GGGCCGGGGTTG
［配列番号５３］繰り返しモチーフ配列の反復単位６
GCCGGGGTTGT
［配列番号５４］繰り返しモチーフ配列の反復単位７
TGGTCGTGTTG
［配列番号５５］繰り返しモチーフ配列の反復単位８
TGTTGCTGGGGTG
［配列番号５６］繰り返しモチーフ配列の反復単位９
TGGCGGTGTTGTGG
［配列番号５７］繰り返しモチーフ配列の反復単位１０
GGGGTGCCGGTGG
［配列番号５８］酸化剤感受性配列１
TGTGGGGTGGCCCCTCAGCGAAATA
［配列番号５９］酸化剤感受性配列２
GGCCTCTCAGC
［配列番号６０］酸化剤感受性配列３
CTGCGGGCACCTCCTAC
［配列番号６１］酸化剤感受性配列４
GGTGAGGGGTAACCC
［配列番号６２］酸化剤感受性配列５
GTGGGGTGGC
［配列番号６３］酸化剤感受性配列６
GGGGGGTGGCTTCCTATCG
［配列番号６４］酸化剤感受性配列７
GTGGGGTGGCCC
［配列番号６５］酸化剤感受性配列８
TGTGGCGGCGGCACGTGCGCTAA
［配列番号６６］酸化剤感受性配列９
GCGGGGGCACCCGA
［配列番号６７］酸化剤感受性配列１０
CTGAGGGTCCTC
［配列番号６８］逆方向反復配列１
GAAAAAGCCGGGCTGCTGCCCGGCTTTTTC
［配列番号６９］逆方向反復配列２
CACAGAAAAAGCCGGGTGGTAGAGCCCGGCTTTTTCCGTG
【０１１３】
本明細書におけるコクリア エスピー ＭＢＥ１３１（Ｋｏｃｕｒｉａ ｓｐ． ＭＢＥ１３１）株は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１８８５として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにおいて、平成２２年１月６日付で寄託されている微生物である。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明を用いて、宿主細胞としてコクリア属細菌に有用遺伝子を導入すれば、有用な生物学的機能が付与された形質転換体を得ることができる。このような形質転換体は、宿主細胞に本来備わっている高い有機溶媒耐性、重金属耐性、増殖能力等をさらに向上させ得るものであり、食品工業、燃料・医薬化成品の製造、環境浄化などの分野において有効に利用され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列と；
レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列と；
配列番号４５に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列と
を含む複製領域を有する、細菌内で自律的に複製可能な環状のプラスミド。
【請求項２】
ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列と；
レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列と；
ＤＮＡ結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列と
を含む複製領域を有する、細菌内で自律的に複製可能な環状のプラスミド。
【請求項３】
ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列と；
レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列と；
ＤＮＡ結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列、酸化剤感受性配列ならびに逆方向反復配列を含む塩基配列と
を含む複製領域を有する、細菌内で自律的に複製可能な環状のプラスミド。
【請求項４】
複製領域において、ＤＮＡ結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列のうち、ＤＮＡ結合タンパク質結合配列を１個以上かつ繰り返しモチーフ配列を２個以上含む、請求項２または３に記載のプラスミド。
【請求項５】
ＤＮＡ結合タンパク質結合配列は、ＣＡＣＣＧＧＴＧ、ＡＣＣＧＧＴＧ、ＣＣＧＧＴＧ、ＡＣＣＧＧＴ、ＣＡＣＡＧＧＴ、ＣＡＣＣＧＧＴ、ＣＡＣＣＧＧ、ＧＴＧＣＧＣＡＣ、ＧＧＣＣＧＧＣＣ、ＴＣＧＧＡＧＣＴＣＣＧＡ（配列番号４６）、ＴＣＣＣＧＧＧＡ、ＴＧＣＣＧＧＣＡ、ＴＧＡＴＣＧＡＴＣＡ（配列番号４７）およびＧＣＡＣＧＴＧＣからなる群から選ばれる、請求項２〜４のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項６】
繰り返しモチーフ配列の反復単位は、ＴＧＧＣＧＴＧＧＴＣＧＴＴＧ（配列番号４８）、ＧＣＧＣＴＧＧＧＧＴＧ（配列番号４９）、ＴＧＧＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号５０）、ＧＣＧＧＴＧＧＴＧ、ＧＣＧＧＴＧＧＴＧＴＧ（配列番号５１）、ＧＧＧＣＣＧＧＧＧＴＴＧ（配列番号５２）、ＧＣＣＧＧＧＧＴＴＧＴ（配列番号５３）、ＴＧＧＴＣＧＴＧＴＴＧ（配列番号５４）、ＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＧＴＧ（配列番号５５）、ＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＴＧＧ（配列番号５６）およびＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＴＧＧ（配列番号５７）からなる群から選ばれる、請求項２〜５のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項７】
複製領域において、酸化剤感受性配列を１個以上含む、請求項２〜６のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項８】
酸化剤感受性配列は、ＴＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＧＣＧＡＡＡＴＡ（配列番号５８）、ＧＧＣＣＴＣＴＣＡＧＣ（配列番号５９）、ＣＴＧＣＧＧＧＣＡＣＣＴＣＣＴＡＣ（配列番号６０）、ＴＴＣＧＡＴＧＡＧ、ＧＧＴＧＡＧＧＧＧＴＡＡＣＣＣ（配列番号６１）、ＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣ（配列番号６２）、ＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＴＴＣＣＴＡＴＣＧ（配列番号６３）、ＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣ（配列番号６４）、ＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＧＴＧＣＧＣＴＡＡ（配列番号６５）、ＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＣＣＧＡ（配列番号６６）およびＣＴＧＡＧＧＧＴＣＣＴＣ（配列番号６７）からなる群から選ばれる、請求項７に記載のプラスミド。
【請求項９】
複製領域において、逆方向反復配列を１個以上含む、請求項２〜８のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項１０】
逆方向反復配列は、ＧＡＡＡＡＡＧＣＣＧＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＴＴＴＴＴＣ（配列番号６８）およびＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＧＣＣＧＧＧＴＧＧＴＡＧＡＧＣＣＣＧＧＣＴＴＴＴＴＣＣＧＴＧ（配列番号６９）からなる群から選ばれる、請求項９に記載のプラスミド。
【請求項１１】
レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列は、ＲｅｐＡタンパク質遺伝子の塩基配列である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項１２】
レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列は、配列番号２に記載の塩基配列、または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、レプリカーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項１３】
ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列は、ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質遺伝子の塩基配列である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項１４】
ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列、または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質をコードする塩基配列である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項１５】
複製領域は、配列番号３に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項１６】
細菌は、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）属細菌である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項１７】
制限酵素認識部位およびその数（制限酵素認識部位：数）として、ＳｍａＩ：２、ＳｐｈＩ：１、ＳａｌＩ：１、ＸｈｏＩ：１およびＢａｍＨＩ：１を含む、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）属細菌内で自律的に複製可能な環状のプラスミド。
【請求項１８】
制限酵素認識部位ＳｍａＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩをこの順で含む、請求項１７に記載のプラスミド。
【請求項１９】
塩基対数が３．０×１０３〜３．４×１０３である、請求項１７または１８に記載のプラスミド。
【請求項２０】
以下の制限酵素地図（Ｉ）
【化１】
で示される、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項２１】
配列番号３または４に記載の塩基配列を含む、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項２２】
コクリア エスピー ＭＢＥ１３１（Ｋｏｃｕｒｉａ ｓｐ． ＭＢＥ１３１）株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８８５）に由来する、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項２３】
配列番号３に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む、ＤＮＡ断片。
【請求項２４】
請求項２３に記載のＤＮＡ断片の塩基配列を含む、ベクター。
【請求項２５】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載のプラスミド、請求項２３に記載のＤＮＡ断片、または請求項２４に記載のベクターを含有してなる、形質転換体。
【請求項１】
ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列と；
レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列と；
配列番号４５に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列と
を含む複製領域を有する、細菌内で自律的に複製可能な環状のプラスミド。
【請求項２】
ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列と；
レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列と；
ＤＮＡ結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列と
を含む複製領域を有する、細菌内で自律的に複製可能な環状のプラスミド。
【請求項３】
ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列と；
レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列と；
ＤＮＡ結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列、酸化剤感受性配列ならびに逆方向反復配列を含む塩基配列と
を含む複製領域を有する、細菌内で自律的に複製可能な環状のプラスミド。
【請求項４】
複製領域において、ＤＮＡ結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列からなる群から選ばれる少なくとも１種の配列のうち、ＤＮＡ結合タンパク質結合配列を１個以上かつ繰り返しモチーフ配列を２個以上含む、請求項２または３に記載のプラスミド。
【請求項５】
ＤＮＡ結合タンパク質結合配列は、ＣＡＣＣＧＧＴＧ、ＡＣＣＧＧＴＧ、ＣＣＧＧＴＧ、ＡＣＣＧＧＴ、ＣＡＣＡＧＧＴ、ＣＡＣＣＧＧＴ、ＣＡＣＣＧＧ、ＧＴＧＣＧＣＡＣ、ＧＧＣＣＧＧＣＣ、ＴＣＧＧＡＧＣＴＣＣＧＡ（配列番号４６）、ＴＣＣＣＧＧＧＡ、ＴＧＣＣＧＧＣＡ、ＴＧＡＴＣＧＡＴＣＡ（配列番号４７）およびＧＣＡＣＧＴＧＣからなる群から選ばれる、請求項２〜４のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項６】
繰り返しモチーフ配列の反復単位は、ＴＧＧＣＧＴＧＧＴＣＧＴＴＧ（配列番号４８）、ＧＣＧＣＴＧＧＧＧＴＧ（配列番号４９）、ＴＧＧＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧ（配列番号５０）、ＧＣＧＧＴＧＧＴＧ、ＧＣＧＧＴＧＧＴＧＴＧ（配列番号５１）、ＧＧＧＣＣＧＧＧＧＴＴＧ（配列番号５２）、ＧＣＣＧＧＧＧＴＴＧＴ（配列番号５３）、ＴＧＧＴＣＧＴＧＴＴＧ（配列番号５４）、ＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＧＴＧ（配列番号５５）、ＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＴＧＧ（配列番号５６）およびＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＴＧＧ（配列番号５７）からなる群から選ばれる、請求項２〜５のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項７】
複製領域において、酸化剤感受性配列を１個以上含む、請求項２〜６のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項８】
酸化剤感受性配列は、ＴＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＧＣＧＡＡＡＴＡ（配列番号５８）、ＧＧＣＣＴＣＴＣＡＧＣ（配列番号５９）、ＣＴＧＣＧＧＧＣＡＣＣＴＣＣＴＡＣ（配列番号６０）、ＴＴＣＧＡＴＧＡＧ、ＧＧＴＧＡＧＧＧＧＴＡＡＣＣＣ（配列番号６１）、ＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣ（配列番号６２）、ＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＴＴＣＣＴＡＴＣＧ（配列番号６３）、ＧＴＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣ（配列番号６４）、ＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＧＴＧＣＧＣＴＡＡ（配列番号６５）、ＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＣＣＧＡ（配列番号６６）およびＣＴＧＡＧＧＧＴＣＣＴＣ（配列番号６７）からなる群から選ばれる、請求項７に記載のプラスミド。
【請求項９】
複製領域において、逆方向反復配列を１個以上含む、請求項２〜８のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項１０】
逆方向反復配列は、ＧＡＡＡＡＡＧＣＣＧＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＴＴＴＴＴＣ（配列番号６８）およびＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＧＣＣＧＧＧＴＧＧＴＡＧＡＧＣＣＣＧＧＣＴＴＴＴＴＣＣＧＴＧ（配列番号６９）からなる群から選ばれる、請求項９に記載のプラスミド。
【請求項１１】
レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列は、ＲｅｐＡタンパク質遺伝子の塩基配列である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項１２】
レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列は、配列番号２に記載の塩基配列、または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、レプリカーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項１３】
ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列は、ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質遺伝子の塩基配列である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項１４】
ＤＮＡ結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列、または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質をコードする塩基配列である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項１５】
複製領域は、配列番号３に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項１６】
細菌は、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）属細菌である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項１７】
制限酵素認識部位およびその数（制限酵素認識部位：数）として、ＳｍａＩ：２、ＳｐｈＩ：１、ＳａｌＩ：１、ＸｈｏＩ：１およびＢａｍＨＩ：１を含む、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）属細菌内で自律的に複製可能な環状のプラスミド。
【請求項１８】
制限酵素認識部位ＳｍａＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩをこの順で含む、請求項１７に記載のプラスミド。
【請求項１９】
塩基対数が３．０×１０３〜３．４×１０３である、請求項１７または１８に記載のプラスミド。
【請求項２０】
以下の制限酵素地図（Ｉ）
【化１】
で示される、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項２１】
配列番号３または４に記載の塩基配列を含む、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項２２】
コクリア エスピー ＭＢＥ１３１（Ｋｏｃｕｒｉａ ｓｐ． ＭＢＥ１３１）株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８８５）に由来する、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項２３】
配列番号３に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む、ＤＮＡ断片。
【請求項２４】
請求項２３に記載のＤＮＡ断片の塩基配列を含む、ベクター。
【請求項２５】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載のプラスミド、請求項２３に記載のＤＮＡ断片、または請求項２４に記載のベクターを含有してなる、形質転換体。
【図１１Ａ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ｂ】
【公開番号】特開２０１１−２１１９３８（Ｐ２０１１−２１１９３８Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−８１７７４（Ｐ２０１０−８１７７４）
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【出願人】（５０４１９４８７８）独立行政法人海洋研究開発機構 (110)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【出願人】（５０４１９４８７８）独立行政法人海洋研究開発機構 (110)
【Ｆターム（参考）】
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