プリオン分解酵素による天然ケーシングの浄化法
【課題】異常プリオンを有し得る天然ケーシングから異常プリオンを除去し、天然ケーシングを浄化する。
【解決手段】異常プリオンを有し得る天然ケーシングに、酵素Ｅ７７、ケラチナーゼやプロペラーゼから選択される異常プリオン分解酵素を加えて、分解酵素の活動に有効な温度でインキュベートする。インキュベートの終了後に、分解酵素の活動を阻害させる阻害剤を添加して、分解酵素による反応を停止させる。さらに、水洗により分解酵素を除去することで失活させる。
【解決手段】異常プリオンを有し得る天然ケーシングに、酵素Ｅ７７、ケラチナーゼやプロペラーゼから選択される異常プリオン分解酵素を加えて、分解酵素の活動に有効な温度でインキュベートする。インキュベートの終了後に、分解酵素の活動を阻害させる阻害剤を添加して、分解酵素による反応を停止させる。さらに、水洗により分解酵素を除去することで失活させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異常プリオンを分解酵素を用いて分解除去する天然ケーシングの浄化法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、我が国において海綿状脳症に羅患した牛が確認され、プリオン病発症機序の解明および治療・予防法の開発が緊急課題となっている。しかし、異常プリオンを大量に入手することは困難であること、また牛プリオンタンパク質を用いた研究がＰ３以上の安全レベルを有する研究室に限られているなど研究を進める上で限界がある。
【０００３】
本発明者は、既に特許出願第２００３−２７００８４号明細書において、構造と化学的性質が異常プリオンのそれらと類似している過塩素酸可溶性蛋白質（以下、ＰＳＰという）を見出し、これをプリオン分解酵素のモデル基質として用いて、難分解性蛋白質分解能を有するストレプトミセス・エスピー(Streptomyces sp.)に属する新規な微生物が産生する難分解性蛋白質プロテアーゼ（プリオン分解酵素Ｅ７７）を発見し、提案した。
【０００４】
羊腸は天然ケーシングとしてソーセージの皮（ケーシング）に利用されている。ところで、フランスでは羊にＢＳＥを実験的に感染させると、ＢＳＥが感染することが報告されている。しかし現在までのところ自然界ではＢＳＥに感染した羊は確認されていない。将来にＢＳＥに感染された羊腸が発生する可能性がある。
【０００５】
その結果、羊腸のケーシング業界には、ＢＳＥに感染された羊腸からＢＳＥあるいはスクレーピープリオンを浄化する方法を事前に開発する要求がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って本発明の課題は、異常プリオンを有し得る天然ケーシングから異常プリオンを除去し、天然ケーシングを浄化する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は鋭意研究した結果、異常プリオンを有し得る天然ケーシングに異常プリオン分解酵素を加え、該分解酵素の活動に有効な温度でインキュベートし、インキュベート終了後に阻害剤を添加して反応を停止させ、水洗により分解酵素を失活した場合に、天然ケーシングの異常プリオンを除去し浄化できることを見出した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明で使用する異常プリオン分解酵素には、酵素Ｅ７７、ケラチナーゼ(Keratinase)およびプロペラーゼ(Properase) がある。
【０００９】
酵素Ｅ７７は特許出願第２００３−２７００８４号明細書に記載されそしてZaho Hui, Doi H, Kanouchi H, Matsuura Y, Mohri S, Nonomura S, Oka T. "Alkaline serin protease Produced by Streptomyces sp. degrades PrPSC.", Biochem. Biophs.Res. Comun. 321, 45-50 (2004) で既に論文発表されている。
【００１０】
ケラチナーゼ(Keratinase)は、J.P.M.Langeveld, J. J. Wang, D.F.M. Van de Wiel, G.C.Shih, G.Protein in brain stem from infected cattle and sheep. J.Infect. Dis. 188 (2003) 1782-1789で論文発表されている。ケラチナーゼは、酵素処理する前に異常プリオンを有する天然ケーシングを１００℃で前処理する必要がある。ズブチリシン酵素(Subtilisin-enzyme) であるプロペラーゼは、 A.H.McLeod, H.Murdoch, J.Dickinson, M.J.Dennis, G.A.Hall, "Proteolytic inactivation of the bovine spongiform encephalopathy agent.", Biochem. Biophys.Res.Commun. 317 (2004) 1165-1170 で論文発表されている。この酵素の場合には異常プリオンを分解するのに６０℃で３０分以上のインキュベーションが必要である。
【００１１】
酵素Ｅ７７では３５〜３７℃、特に好ましくは３７℃でインキュベートすることで目的を達成できるので特に有利である。
【００１２】
以下の実施例によって本発明を更に詳細に説明する。
【００１３】
実施例:
１．異常プリオン混入モデル天然ケーシングの作製
羊腸を水洗した後、端から約１ｃｍ切り取り、０．５Ｍ グリセリン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ８）４００μＬを含む１．５ｍＬのエッペドルフチューブに加え、そこへ２６３ｋのスクレイピープリオンを含むハムスター１５％脳乳剤を１２５μＬ加え、よく混和した。チューブから２０μＬを取り、電気泳動ならびにＥＣＬプロットによって検討した結果、異常プリオンが確認され、異常プリオン混入モデルケーシングであることが確認された（図１）。即ち、図１のＢ中の−ＰＫが正常プリオンと異常プリオンの両者が存在することを示している。
２．Ｅ７７による異常プリオン混入モデルケーシングの浄化
羊腸を水洗した後、端から約１ｃｍ切り取り、０．５Ｍ グリセリン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ １１）４００μＬを含む１．５ｍＬのエッペドルフチューブに加え、そこへ２６３ｋのスクレイピープリオンを含むハムスター１５％脳乳剤を１２５μＬ加え、よく混和した。更に酵素Ｅ７７を２５μＬ（１ｍｇ／ｍＬ）を加えて３７℃で１０分間、３０分間および６０分間インキュベートした。インキュベート終了後、最終濃度１ｍＭのＰＭＳＦ(Phenylmethane-sulphonylfluoride: セリンプロテアーゼの阻害剤) を加えて反応を終了させた。異常プリオンの分解を確認するために、チューブから２０μＬを取り、電気泳動ならびにＥＣＬプロットを行った（図２）。その結果、１０分間のインキュベートによって異常プリオンは図３から判る通り検出されず、完全に分解されていることが確認された。異常プリオン分解に関するＥ７７の濃度依存性を検討したところ、図４から判る通り、ハムスター１５％脳乳剤１２５μＬに対して２５μｇの酵素量の所で異常プリオンが完全に消化され、２５μｇの酵素量が適正であることが判った。また、２０℃から３７℃までインキュベーション温度の効果を検討した結果、図５から判る通り、Ｅ７７では３５℃からプリオン分解が可能であり、３７℃では十分にプリオン分解がされていることが判った。
【００１４】
一方、反応終了後の酵素の失活について水洗の硬化を検討した。図２に示した方法での反応の終了後に、遠心して上清を除き、５００μＬの蒸留水を加えて羊腸を２回洗浄した。洗浄後、再び４００μＬの蒸留水とスクレイピープリオンを含むハムスター１５％脳乳剤１２５μＬを加え、良く混和し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後２０μＬを電気泳動にかけ、ＥＣＬプロットによって異常プリオン分解活性を検討した。図６から判る通り、羊腸に加えられたＥ７７は羊腸の水洗によって酵素が完全に除去された。
３．Ｅ７７処理後の羊腸の形態学的変化
Ｅ７７処理後の羊腸の形態学的変化を検討した。Ｅ７７処理後のサンプルについて切片を作製後、アザン染色（コラーゲンを染色）し、顕微鏡にて観察した。Ｅ７７処理１０分間では、羊腸に何ら変化は観察されなかったが、３０分間処理によって腸管組織の薄層化が観察された（図７）。これは、長時間の処理によってコラーゲン層が一部消化されたものと考えられる。一方、１０分間処理した小腸切片の拡大像をコントロールと比較した結果、コントロールにおいて輪筋層や縦筋層由来の組織が観察されたのに対し、Ｅ７７処理後は、筋層由来の組織が消化されてコラーゲン層のみになりソーセージ皮の材料として理想的な羊腸となることが明らかにされた（図８）。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａは異常プリオン混入ケーシングモデルの作製の概略的工程図である。図１Ｂは異常プリオン混入天然ケーシングモデルにおける異常プリオンの検出を示す電気泳動並びにＥＣＬプロットである。
【図２】図２は異常プリオン混入天然ケーシングの異常プリオン分解酵素Ｅ７７による浄化工程の概略図である。
【図３】図３は異常プリオン混入天然ケーシングの異常プリオン分解酵素による浄化結果を電気泳動並びにＥＣＬプロットで示したものである。
【図４】図４は異常プリオンモデル系における酵素の適性量を検討した結果を、電気泳動並びにＥＣＬプロットで示している。
【図５】図５は異常プリオンモデル系における適性反応温度を、電気泳動並びにＥＣＬプロットで示している。
【図６】図６は水洗による酵素反応の阻止を、電気泳動並びにＥＣＬプロットで確認したものである。
【図７】図７は異常プリオン分解酵素Ｅ７７処理後の羊腸の形態学的変化を確かめた顕微鏡写真である。
【図８】図８は異常プリオン分解酵素Ｅ７７処理後の羊腸の形態学的変化を確かめた拡大した顕微鏡写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異常プリオンを分解酵素を用いて分解除去する天然ケーシングの浄化法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、我が国において海綿状脳症に羅患した牛が確認され、プリオン病発症機序の解明および治療・予防法の開発が緊急課題となっている。しかし、異常プリオンを大量に入手することは困難であること、また牛プリオンタンパク質を用いた研究がＰ３以上の安全レベルを有する研究室に限られているなど研究を進める上で限界がある。
【０００３】
本発明者は、既に特許出願第２００３−２７００８４号明細書において、構造と化学的性質が異常プリオンのそれらと類似している過塩素酸可溶性蛋白質（以下、ＰＳＰという）を見出し、これをプリオン分解酵素のモデル基質として用いて、難分解性蛋白質分解能を有するストレプトミセス・エスピー(Streptomyces sp.)に属する新規な微生物が産生する難分解性蛋白質プロテアーゼ（プリオン分解酵素Ｅ７７）を発見し、提案した。
【０００４】
羊腸は天然ケーシングとしてソーセージの皮（ケーシング）に利用されている。ところで、フランスでは羊にＢＳＥを実験的に感染させると、ＢＳＥが感染することが報告されている。しかし現在までのところ自然界ではＢＳＥに感染した羊は確認されていない。将来にＢＳＥに感染された羊腸が発生する可能性がある。
【０００５】
その結果、羊腸のケーシング業界には、ＢＳＥに感染された羊腸からＢＳＥあるいはスクレーピープリオンを浄化する方法を事前に開発する要求がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って本発明の課題は、異常プリオンを有し得る天然ケーシングから異常プリオンを除去し、天然ケーシングを浄化する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は鋭意研究した結果、異常プリオンを有し得る天然ケーシングに異常プリオン分解酵素を加え、該分解酵素の活動に有効な温度でインキュベートし、インキュベート終了後に阻害剤を添加して反応を停止させ、水洗により分解酵素を失活した場合に、天然ケーシングの異常プリオンを除去し浄化できることを見出した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明で使用する異常プリオン分解酵素には、酵素Ｅ７７、ケラチナーゼ(Keratinase)およびプロペラーゼ(Properase) がある。
【０００９】
酵素Ｅ７７は特許出願第２００３−２７００８４号明細書に記載されそしてZaho Hui, Doi H, Kanouchi H, Matsuura Y, Mohri S, Nonomura S, Oka T. "Alkaline serin protease Produced by Streptomyces sp. degrades PrPSC.", Biochem. Biophs.Res. Comun. 321, 45-50 (2004) で既に論文発表されている。
【００１０】
ケラチナーゼ(Keratinase)は、J.P.M.Langeveld, J. J. Wang, D.F.M. Van de Wiel, G.C.Shih, G.Protein in brain stem from infected cattle and sheep. J.Infect. Dis. 188 (2003) 1782-1789で論文発表されている。ケラチナーゼは、酵素処理する前に異常プリオンを有する天然ケーシングを１００℃で前処理する必要がある。ズブチリシン酵素(Subtilisin-enzyme) であるプロペラーゼは、 A.H.McLeod, H.Murdoch, J.Dickinson, M.J.Dennis, G.A.Hall, "Proteolytic inactivation of the bovine spongiform encephalopathy agent.", Biochem. Biophys.Res.Commun. 317 (2004) 1165-1170 で論文発表されている。この酵素の場合には異常プリオンを分解するのに６０℃で３０分以上のインキュベーションが必要である。
【００１１】
酵素Ｅ７７では３５〜３７℃、特に好ましくは３７℃でインキュベートすることで目的を達成できるので特に有利である。
【００１２】
以下の実施例によって本発明を更に詳細に説明する。
【００１３】
実施例:
１．異常プリオン混入モデル天然ケーシングの作製
羊腸を水洗した後、端から約１ｃｍ切り取り、０．５Ｍ グリセリン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ８）４００μＬを含む１．５ｍＬのエッペドルフチューブに加え、そこへ２６３ｋのスクレイピープリオンを含むハムスター１５％脳乳剤を１２５μＬ加え、よく混和した。チューブから２０μＬを取り、電気泳動ならびにＥＣＬプロットによって検討した結果、異常プリオンが確認され、異常プリオン混入モデルケーシングであることが確認された（図１）。即ち、図１のＢ中の−ＰＫが正常プリオンと異常プリオンの両者が存在することを示している。
２．Ｅ７７による異常プリオン混入モデルケーシングの浄化
羊腸を水洗した後、端から約１ｃｍ切り取り、０．５Ｍ グリセリン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ １１）４００μＬを含む１．５ｍＬのエッペドルフチューブに加え、そこへ２６３ｋのスクレイピープリオンを含むハムスター１５％脳乳剤を１２５μＬ加え、よく混和した。更に酵素Ｅ７７を２５μＬ（１ｍｇ／ｍＬ）を加えて３７℃で１０分間、３０分間および６０分間インキュベートした。インキュベート終了後、最終濃度１ｍＭのＰＭＳＦ(Phenylmethane-sulphonylfluoride: セリンプロテアーゼの阻害剤) を加えて反応を終了させた。異常プリオンの分解を確認するために、チューブから２０μＬを取り、電気泳動ならびにＥＣＬプロットを行った（図２）。その結果、１０分間のインキュベートによって異常プリオンは図３から判る通り検出されず、完全に分解されていることが確認された。異常プリオン分解に関するＥ７７の濃度依存性を検討したところ、図４から判る通り、ハムスター１５％脳乳剤１２５μＬに対して２５μｇの酵素量の所で異常プリオンが完全に消化され、２５μｇの酵素量が適正であることが判った。また、２０℃から３７℃までインキュベーション温度の効果を検討した結果、図５から判る通り、Ｅ７７では３５℃からプリオン分解が可能であり、３７℃では十分にプリオン分解がされていることが判った。
【００１４】
一方、反応終了後の酵素の失活について水洗の硬化を検討した。図２に示した方法での反応の終了後に、遠心して上清を除き、５００μＬの蒸留水を加えて羊腸を２回洗浄した。洗浄後、再び４００μＬの蒸留水とスクレイピープリオンを含むハムスター１５％脳乳剤１２５μＬを加え、良く混和し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後２０μＬを電気泳動にかけ、ＥＣＬプロットによって異常プリオン分解活性を検討した。図６から判る通り、羊腸に加えられたＥ７７は羊腸の水洗によって酵素が完全に除去された。
３．Ｅ７７処理後の羊腸の形態学的変化
Ｅ７７処理後の羊腸の形態学的変化を検討した。Ｅ７７処理後のサンプルについて切片を作製後、アザン染色（コラーゲンを染色）し、顕微鏡にて観察した。Ｅ７７処理１０分間では、羊腸に何ら変化は観察されなかったが、３０分間処理によって腸管組織の薄層化が観察された（図７）。これは、長時間の処理によってコラーゲン層が一部消化されたものと考えられる。一方、１０分間処理した小腸切片の拡大像をコントロールと比較した結果、コントロールにおいて輪筋層や縦筋層由来の組織が観察されたのに対し、Ｅ７７処理後は、筋層由来の組織が消化されてコラーゲン層のみになりソーセージ皮の材料として理想的な羊腸となることが明らかにされた（図８）。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａは異常プリオン混入ケーシングモデルの作製の概略的工程図である。図１Ｂは異常プリオン混入天然ケーシングモデルにおける異常プリオンの検出を示す電気泳動並びにＥＣＬプロットである。
【図２】図２は異常プリオン混入天然ケーシングの異常プリオン分解酵素Ｅ７７による浄化工程の概略図である。
【図３】図３は異常プリオン混入天然ケーシングの異常プリオン分解酵素による浄化結果を電気泳動並びにＥＣＬプロットで示したものである。
【図４】図４は異常プリオンモデル系における酵素の適性量を検討した結果を、電気泳動並びにＥＣＬプロットで示している。
【図５】図５は異常プリオンモデル系における適性反応温度を、電気泳動並びにＥＣＬプロットで示している。
【図６】図６は水洗による酵素反応の阻止を、電気泳動並びにＥＣＬプロットで確認したものである。
【図７】図７は異常プリオン分解酵素Ｅ７７処理後の羊腸の形態学的変化を確かめた顕微鏡写真である。
【図８】図８は異常プリオン分解酵素Ｅ７７処理後の羊腸の形態学的変化を確かめた拡大した顕微鏡写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異常プリオンを、分解酵素を用いて分解除去する天然ケーシングの浄化方法において、異常プリオンを有し得る天然ケーシングに異常プリオン分解酵素を加え、該分解酵素の活動に有効な温度でインキュベートし、インキュベート終了後に阻害剤を添加して反応を停止させ、水洗により分解酵素を失活させることを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
異常プリオン分解酵素が酵素Ｅ７７、ケラチナーゼ(Keratinase)およびプロペラーゼ(Properase) から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
異常プリオン分解酵素が酵素Ｅ７７である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
３７℃でインキュベートする、請求項３に記載の方法。
【請求項１】
異常プリオンを、分解酵素を用いて分解除去する天然ケーシングの浄化方法において、異常プリオンを有し得る天然ケーシングに異常プリオン分解酵素を加え、該分解酵素の活動に有効な温度でインキュベートし、インキュベート終了後に阻害剤を添加して反応を停止させ、水洗により分解酵素を失活させることを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
異常プリオン分解酵素が酵素Ｅ７７、ケラチナーゼ(Keratinase)およびプロペラーゼ(Properase) から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
異常プリオン分解酵素が酵素Ｅ７７である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
３７℃でインキュベートする、請求項３に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００６−１８０８２６（Ｐ２００６−１８０８２６Ａ）
【公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３８００６５（Ｐ２００４−３８００６５）
【出願日】平成１６年１２月２８日（２００４．１２．２８）
【出願人】（５０３０５２８３０）株式会社松永商会 (4)
【出願人】（０００１７３９１３）財団法人微生物化学研究会 (29)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月２８日（２００４．１２．２８）
【出願人】（５０３０５２８３０）株式会社松永商会 (4)
【出願人】（０００１７３９１３）財団法人微生物化学研究会 (29)
【Ｆターム（参考）】
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