プロテインチップ前処理キット
【課題】 数十個〜数百個程度の中規模個数のタンパク質検体を検査するのに適したプロテインチップ前処理キットを提供する。
【解決手段】 抗原又は抗体が付着される基板と、前記抗原又は抗体に液体試薬を供給するための少なくとも１枚以上の治具とからなり、前記治具は前記抗原又は抗体のアレイの本数に対応する本数の流路を有し、前記流路の両端は貫通孔を介して大気に連通していることを特徴とするプロテインチップ前処理キット。
【解決手段】 抗原又は抗体が付着される基板と、前記抗原又は抗体に液体試薬を供給するための少なくとも１枚以上の治具とからなり、前記治具は前記抗原又は抗体のアレイの本数に対応する本数の流路を有し、前記流路の両端は貫通孔を介して大気に連通していることを特徴とするプロテインチップ前処理キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質を検出するためのプロテインチップを作製するための前処理キットに関する。更に詳細には、本発明は数十〜数百個のタンパク質検体を一度に処理することができるプロテインチップ前処理キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオテクノロジー技術の著しい発展により、ゲノム解析が急速に進んだ。ゲノム解析の結果は、疾病の診断、治療の他、創薬などにも活用されている。最近は、ポストゲノム時代を迎えるにあたり、タンパク質の機能解析に注目が集まっている。
【０００３】
一般に医学検査材料となる体液や組織には非常に多くの種類のタンパク質やペプチドが含まれている。臨床検査の場では、数え切れないほど多くのタンパク質やペプチドが、しかもそれぞれ異なる濃度で含まれた試料の中の、或る特定のタンパク質のみを定量又は定性する必要が生じる。アルブミンのように大量に存在するタンパク質であれば、例えば、電気泳動を行ってバンドの太さを比較するだけで良い場合もあるが、他のタンパク質に比べて微量しか存在しないタンパク質やペプチドを相手にする場合は、特異性の高さ（目的の物質を狭雑する他のタンパク質からどれだけ正確に区別できるか）と定量性の良さ（どれだけ微量で正確に量れるか）が同時に求められる。このような目的に合致する検査法として抗体の特異性を用いた方法が開発された。すなわち、目的のタンパク質又はペプチドのみと反応し、狭雑する他のタンパク質とは反応しない抗体により先ず「特異性」を確保し、抗原抗体反応は比較的定量的に起こるので抗体の量がわかっていれば抗原の量を容易に求めることができる。従来は抗体の標識に放射性同位元素を使用してきたが、利用できる施設が限られ、試薬と検出器を含めて費用もかなり高価になる欠点があったので、放射性同位元素を酵素に置き換え、抗体に結合した酵素の反応で抗原を定性及び定量する方法として「酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法」が新たに開発された（例えば、特許文献１参照）。ＥＬＩＳＡ法には直接吸着法とサンドイッチ法の二種類があるが、何れの方法も、安価で簡便であるため、現在ホルモンや微量タンパク質あるいは感染性微生物抗原の検出と定量に極めて広範に用いられている。
【０００４】
図８はＥＬＩＳＡ法の直接吸着法を説明する模式図である。ステップ（１）において、プラスチック、ガラスなどのような基板１００の固相表面に抗原（例えば、ＨＩＶ抗原）１０２を、例えば、アミノカップリング法、表面チオールカップリング法又はリガンドチオールカップリング法などの方法により付着させる。ステップ（２）において、被検サンプル（例えば、血清）を注ぐ。サンプル中に抗体（例えば、抗ＨＩＶ抗体（ＨＩＶに感染すると平均１２週位で産生され、ＨＩＶ抗原に特異的に結合する））１０４があれば、抗原１０２と反応し、結合する。次いで、ステップ（３）において、標識物質として、酵素付き二次抗体１０６を注ぐ。この酵素付き二次抗体１０６は被検サンプル中の抗体１０４と特異的に結合することができる。その後、ステップ（４）において、酵素付き抗体１０６の酵素と反応して発色する物質１０８を注ぐ。ステップ（５Ａ）において、反応生成物１１０の発色状態を測定する。ステップ（５Ｂ）に示されるように、被検サンプル中に抗体（例えば、抗ＨＩＶ抗体）１０４がなければ、発色物質１０８を注いでも、反応しないので発色しない。
【０００５】
ＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法では、抗原１０２の代わりに先ず基板１００に目的のタンパク質に特異的な一次抗体を結合させておき、目的物質を含む溶液を加えると、溶液中の抗原が「抗原抗体反応」により抗体に結合する。その後、酵素標識二次抗体をを加え、一次抗体に結合していた目的物質を定性及び定量する。
【０００６】
従来、ＥＬＩＳＡ法などを実施する場合、サンプル数が数千個に及ぶ場合がある。このような多量のサンプルを処理するため、プロテインアレイチップが用いられている。プロテインアレイチップはプロテオゲン(Proteogen)社から市販されている全自動のマイアクロアレイヤー（例えば、Proteogen CM-1000）により作製、処理することができる。この装置の特徴は、ガラス基板上に抗原を付着させるために、ガラス基板上に「プロリンカー」と呼ばれる固定化試薬を予め固着させておくことである。この装置によれば、スポット径１００〜３００μｍ、スポットピッチ１０μｍ、スポット密度最大４９００スポット／ｃｍ２で、２５．４ｍｍｘ７６．２ｍｍのスタンダードフォーマットスライドガラスを使用することができる。
【０００７】
しかし、このような装置は数千万円以上もする非常に高価な装置であり、検体数が数十〜数百程度の小規模な検査には使用できないか、又は使用した場合、非常に不経済となる。このため、検体数が数十〜数百程度の小規模な検査を行う場合は、マイクロタイタープレートなどを用いて手作業で行わなければならなかった。各穴毎に抗原を付着し、その後、被検サンプルを注ぎ、二次抗体を注ぎ、発色物質を注いでいたのでは作業時間が冗長になるばかりか、検査効率も大幅に低下する。各穴毎に作業するのではなく、マイクロタイタープレート全体に抗原を付着し、各穴毎に被検サンプル、二次抗体又は発色物質を注ぐ方式が試みられたが、最初の抗原が無駄になるばかりか、後の作業は各穴毎に行うので作業時間はさほど短縮されない。
【０００８】
【特許文献１】特公平６−１１３３５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、数十個〜数百個程度の中規模個数のタンパク質検体を検査するのに適したプロテインチップ前処理キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するための手段として請求項１に係る発明は、抗原又は抗体が付着される基板と、前記抗原又は抗体に液体試薬を供給するための少なくとも１枚以上の治具とからなり、前記治具は前記抗原又は抗体のアレイの本数に対応する本数の流路を有し、前記流路の両端は貫通孔を介して大気に連通していることを特徴とするプロテインチップ前処理キットである。
【００１１】
基板上に付着された抗原又は抗体のアレイの本数に対応する本数の流路を有する液体試薬供給治具を使用することにより、基板と液体試薬供給治具を貼り合わせることにより、基板上の抗原又は抗体のアレイに液体試薬を簡単に供給することができる。
【００１２】
前記課題を解決するための手段として請求項２に係る発明は、前記液体試薬供給治具が、前記抗原又は抗体のアレイの行数に対応する本数の流路を有する治具と、前記抗原又は抗体のアレイの列数に対応する本数の流路を有する治具との２枚からなることを特徴とする請求項１記載のプロテインチップ前処理キットである。
【００１３】
基板上に付着された抗原又は抗体のアレイの行数と列数が異なる場合に、行数と列数にそれぞれ対応する本数の流路を有する２種類の液体試薬供給治具を使用することにより、液体試薬供給を更に容易にすることができる。
【００１４】
前記課題を解決するための手段として請求項３に係る発明は、前記基板の上面には、複数の貫通孔を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製ポリマーシートが貼り合わされ、前記基板と前記貫通孔とによりウエルを形成していることを特徴とする請求項１又は２に記載のプロテインチップ前処理キットである。
【００１５】
基板上面に複数の貫通孔を有するＰＤＭＳ製ポリマーシートを貼り合わせることにより複数個のウエルを有するマイクロタイタープレートが形成されるので、このウエルを抗原叉は抗体付着アレイとして使用することができる。
【００１６】
前記課題を解決するための手段として請求項４に係る発明は、前記基板の上面には、複数の貫通孔を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製ポリマーシートが貼り合わされ、前記基板と前記貫通孔とによりウエルを形成しており、前記ＰＤＭＳ製ポリマーシートの上部四辺の端部のうちの少なくとも一つの辺端部にＰＤＭＳ製液体試薬供給治具の端部が、前記ウエルと前記液体試薬供給治具の流路との位置が整合するように、自己吸着されていることを特徴とする請求項１記載のプロテインチップ前処理キットである。
【００１７】
ＰＤＭＳ製液体試薬供給治具の流路とＰＤＭＳ製ポリマーシートのウエルとが予め位置合わせされた状態で、ＰＤＭＳ製液体試薬供給治具の端部がＰＤＭＳ製ポリマーシートの端部に恒久接着されているので、ＰＤＭＳ製液体試薬供給治具を使用する際、流路とアレイとの位置合わせが不要となる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の液体試薬供給治具を使用すれば、抗原又は抗体及び／又は液体試薬の使用量を節約できるばかりか、これらの乾燥を防ぐことができる。また、本発明のプロテインチップ前処理キットによれば、従来の数千万円もする高価なスポッターを使用したのと同じ処理作業を実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、図面を参照しながら本発明の検査治具の好ましい実施態様について説明する。図１は本発明のプロテインチップ前処理キット１の一例の分解図である。本発明のプロテインチップ前処理キット１は基本的に、図１（Ａ）に示される、抗原又は抗体７が付着された又はこれら抗原又は抗体を付着すべき基板３と、この基板３の抗原又は抗体付着面上に着脱可能に積重又は貼り合わされる少なくとも１枚以上の液体試薬供給治具５とからなる。図１（Ｂ）は、行（横列）用液体試薬供給治具５−１であり、図１（Ｃ）は、列（縦列）用液体試薬供給治具５−２である。
【００２０】
基板３に行（横列）用液体試薬供給治具５−１を積重又は貼り合わせて所定の液体試薬の注入が完了したら、基板３から行（横列）用液体試薬供給治具５−１を剥がし、次いで、基板３に列（縦列）用液体試薬供給治具５−２を積重又は貼り合わせて別の液体試薬を注入する。その後、基板３から列用液体試薬供給治具５−２を剥がし、基板３だけにしてから所望の定性及び定量測定を行う。抗原又は抗体７の配列が正方形状であれば、行用液体試薬供給治具５−１と、列用液体試薬供給治具５−２とを共用することができるので、液体試薬供給治具は１枚でもかまわないが、“コンタミネーション”を避けるために、使用する液体試薬毎に液体試薬供給治具５を使い分けることが好ましい。従って、本発明のプロテインチップ前処理キット１では、使用する液体試薬の種類に応じた枚数の液体試薬供給治具５を使用することが好ましい。
【００２１】
基板３へ抗原又は抗体７を付着させる方法自体は本発明の構成要件ではない。従って、基板３へ抗原又は抗体７を付着させるには、例えば、アミノカップリング法、表面チオールカップリング法又はリガンドチオールカップリング法などの公知慣用の方法を使用することができる。何れの付着方法を使用するにしても、基板３へ抗原又は抗体７を付着させるために、本発明者らが先に出願した特願２００４−０７５６５４の明細書に記載されているような、複数個の貫通穴を有するポリマーシートを使用することが好ましい。このポリマーシートを使用すれば、スポッターなどの様な高価な装置を使用しなくても、基板３上に抗原又は抗体７を容易に規則的に整然と配列させることができる。
【００２２】
図２（Ａ）はこのようなポリマーシートの一例の平面図であり、図２（Ｂ）は図２（Ａ）におけるＢ−Ｂ線に沿った断面図であり、図２（Ｃ）はポリマーシートの使用状態を示す一例の断面図である。ポリマーシート１０は例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのポリマーから形成されている。その他のポリマーも使用できる。シート１０のサイズ自体は用途に応じて任意のサイズを選択することができる。従って、シート１０は正方形、長方形、円形、楕円形、三角形、五角以上の多角形など任意の形状をとることができる。シート１０には用途に応じて任意の個数（例えば、９６個）の貫通穴１３が形成されている。シート１０の厚さは数百μｍ〜数十ｍｍ程度（例えば、２００μｍ〜１０ｍｍ）である。貫通穴１３の断面形状は図示された矩形状のものに限定されない。円形状、楕円状、三角形状、五角以上の多角形状など様々な形状を採ることもできる。図２（Ｃ）に示されるように、ポリマーシート１０の下部に基板３を貼着することにより、ポリマーシート１０の貫通穴１３の下部が遮蔽され、ウエル１５が形成されるので、得られた構造物１７を化学分析用のマイクロタイタープレートとして使用することができる。抗原又は抗体はウエル１５の底部（すなわち、基板３の上面）に付着される。
基板３はガラス、合成樹脂、金属、撥水紙など任意の材料から形成されたものを使用できる。ポリマーシート１０がＰＤＭＳから形成されている場合、基板３はガラス製であることが好ましい。ＰＤＭＳとガラスは容易に恒久接着することができるからである。
構造物１７のウエル１５内に抗原を含む溶液（直接吸着法）又は抗体を含む溶液（サンドイッチ法）を注入し、余分な溶液を廃棄すれば、基板３の上面に目的とする抗原又は抗体を付着（又は結合）させることができる。基板３の上面に目的とする抗原又は抗体を付着（又は結合）させた後、所望により、ポリマーシート１０を基板３上に残置することもできるし、基板３から剥離し、除去することもできる。
【００２３】
図１に示されるように、液体試薬供給治具５−１及び５−２は、抗原又は抗体７の横及び縦の列数に相当する本数の流路２０を有する。図３は図１におけるIII-III線に沿った断面図である。各流路２０の下面は遮蔽されていない。各流路２０の両端には貫通孔２２ａ及び２２ｂが配設されている。液体試薬供給治具５−１及び５−２はプラスチック製又はガラス製であることが好ましい。プラスチックは例えば、ＰＤＭＳ、ポリカーボネート樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリアクリル樹脂、ナイロン樹脂、ポリエチレン樹脂などである。液体試薬供給治具の形成材料としては、基板３又はポリマーシート１０との密着性に優れ、しかも常用の光リソグラフィー法により容易に量産可能なＰＤＭＳが好ましい。液体試薬供給治具５の厚さは数百μｍ〜数ｍｍ程度であることが好ましい。流路２０の幅は抗原又は抗体７の付着幅、若しくはポリマーシート１０のウエル１５の開口幅と同等か又は小さいことが好ましい。
【００２４】
図４Ａに示されるように、図３の液体試薬供給治具５−１を図２（Ｃ）の構造物１７の上面に積重又は貼り合わせる。図４Ｂは図４ＡにおけるＢ−Ｂ線に沿った部分概要断面図である。
ウエル１５の底部には抗原又は抗体７が付着されている。貫通孔２２ａ又は２２ｂの一方から液体試薬（例えば、アルブミンなどのタンパク溶液、一次抗体、酵素標識二次抗体、発色試薬、水など）を注入し、余分な液体試薬は他方の貫通孔から排出する。各流路毎に注入する液体試薬を変えることができる。従って、構造物１７がマイクロタイタープレートである場合、行（横列）用液体試薬供給治具５−１及び列（縦列）用液体試薬供給治具５−２を使用すると、各抗原又は抗体７毎に試薬を全て変えることができる。例えば、行（横列）と、列（縦列）を組み合わせることにより、第１行第１列〜第８行第１２列の全ての抗原について異なる液体試薬を注入することができる。従って、本発明の液体試薬供給治具を使用すれば、抗原又は抗体の個数（例えば、９６個）と同じ個数の異なる反応相を１個のチップ上で実施することができる。本発明の液体試薬供給治具５はウエル１５の底部に抗原又は抗体を付着（又は結合）させる目的にも使用できる。この場合、行及び／又は列毎に異なる抗原又は抗体を付着（又は結合）させることができる。本発明の液体試薬供給治具５を使用すれば、各流路当たりの液体注入量を約３μＬ以下にまで抑制することができ、液体試薬類の無駄使いが避けられる。また、治具５でウエル１５がカバーされているため、ウエル内の抗原又は抗体ばかりかその他の液体試薬類が乾燥・蒸発することも防止できる。
【００２５】
図５Ａ及び図５Ｂは本発明のプロテインチップ前処理キット１で使用される液体試薬供給治具５の別の実施態様を示す平面図である。ＥＬＩＳＡ法では、固相（基板）に抗原又は抗体を付着させた後、固相表面を無関係なタンパク質で覆う「ブロッキング」処理が行われる。また、余計なタンパク質や抗原に結合しなかった抗体又は固相に結合しなかった抗原を洗い流す処理が行われる。このような場合、各流路２０内に一斉に液体を流すことが必要になる。図５Ａ及び図５Ｂに示される実施態様はこのような目的に使用するのに好適な液体試薬供給治具５−２及び５−３である。この液体試薬供給治具５−２及び５−３を使用すると作業時間を大幅に短縮することができる。
図５Ａの実施態様では、各流路２０の一端は拡大容積部２４に連通し、拡大容積部２４には大気に連通する貫通孔２６が配設されており、各流路の他端には貫通孔２８が配設されている。例えば、貫通孔２６から液体が拡大容積部２４に注入されると、液体は各流路２０を流れて、末端の各貫通孔２８から排出される。
図５Ｂの実施態様では、各流路２０の両端は拡大容積部２４ａ及び２４ｂにそれぞれ連通し、各拡大容積部２４ａ及び２４ｂに、大気に連通する貫通孔２６ａ及び２６ｂがそれぞれ配設されている。例えば、貫通孔２６ａから液体が拡大容積部２４ａに注入されると、液体は各流路２０を流れて、末端の拡大容積部２４ｂに集まり、貫通孔２６ｂから排出される。
【００２６】
図６は本発明のプロテインチップ前処理キット１Ａの別の実施態様の概要斜視図である。図１に示されたプロテインチップ前処理キット１では、基板３に対して液体試薬供給治具５−１及び５−２が別体として分離されており、必要に応じて各液体試薬供給治具５−１又は５−２を基板３上に積重又は貼り合わせて使用するが、その都度、基板３の抗原又は抗体アレイと治具の流路を位置合わせさせて積重又は貼り合わせなければならない。これに対して、図６のプロテインチップ前処理キット１Ａでは、ポリマーシートのウエルと液体試薬供給治具の流路が予め位置合わせされた状態で、４枚の液体試薬供給治具５−５〜５−８のそれぞれの一端がポリマーシート１０の上面に恒久接着されており、ポリマーシート１０と一体化されている。従って、異なる液体試薬供給治具を使用する場合でも、ウエルと流路の位置合わせをその都度行う必要が無い。ポリマーシート１０が矩形状なので、これに一体化し得る液体試薬供給治具は最大４個であるが、１個だけでもよく、２個又は３個でもよい。プロテインチップ前処理キット１Ａを使用する場合、例えば、先ず液体試薬供給治具５−５をポリマーシート１０の上面に折り重ねて貼り合わせ、貫通孔２２ａから流路２０を通してウエル１５内に液体試薬を供給し、余分な液体試薬は貫通孔２２ｂから排出する。行ウエルの処理が完了したら、液体試薬供給治具５−５をポリマーシート１０から引き剥がして起こし、次いで、列用の液体試薬供給治具５−７を倒してポリマーシート１０の上面に貼り合わせ、貫通孔２２ａから流路２０を通して列ウエル１５内に液体試薬を供給し、余分な液体試薬は貫通孔２２ｂから排出する。別の行用液体試薬供給治具５−６及び列用液体試薬供給治具５−８も同様にして使用される。プロテインチップ前処理キット１Ａにおいて、液体試薬供給治具として図５Ａ及び図５Ｂに示されるような治具５−３及び／又は５−４を使用することもできる。
【００２７】
図６のプロテインチップ前処理キット１Ａの利点は、液体試薬供給治具５−５〜５−８の各流路２０がポリマーシート１０のウエル１５の位置と予め位置合わせして一体化されているため、各液体試薬供給治具５−５〜５−８をポリマーシート１０に折り重ねるだけで液体試薬供給治具５−５〜５−８の各流路２０がポリマーシート１０のウエル１５に整合される。従って、図１のチップ１におけるような、液体試薬供給治具の流路２０とポリマーシート１０のウエル１５との面倒な整合作業が不要となる。
【００２８】
図６に示されるプロテインチップ前処理キット１Ａの製造方法を図７に示す。ステップ（１）において、ＰＤＭＳポリマーシート１０の上面にＰＤＭＳ製液体試薬供給治具５−５を流路２０とポリマーシート１０のウエル１５の位置が合致するように自己吸着させておく。次いで、ステップ（２）において、ＰＤＭＳ製液体試薬供給治具５−５の貫通孔２２ａ側の端部を引き剥がし、露出面を酸素プラズマ処理する。ＰＤＭＳ製液体試薬供給治具５−５は酸素プラズマ処理した部分でＰＤＭＳポリマーシート１０に恒久接着するが、その他の部分ではポリマーシート１０から剥離できる。従って、ステップ（３）において、恒久接着していない部分のＰＤＭＳ製液体試薬供給治具５−５をＰＤＭＳポリマーシート１０から剥離し、その剥離部分に別のＰＤＭＳ製液体試薬供給治具５−６を流路２０とポリマーシート１０のウエル１５の位置が合致するように自己吸着させる。次いで、ステップ（４）において、ＰＤＭＳ製液体試薬供給治具５−６の貫通孔２２ｂ側の端部を引き剥がし、露出面を酸素プラズマ処理する。ステップ（５）において、ポリマーシート１０に対して自己吸着していない部分のＰＤＭＳ製液体試薬供給治具５−６をポリマーシート１０から剥離し、ＰＤＭＳ製液体試薬供給治具５−７及び５−８について前記ステップ（３）〜ステップ（４）を繰り返す。異なるデザインの液体試薬供給治具を使用する場合は、既存の液体試薬供給治具のうちの何れかをポリマーシートから除去し、その除去した対応する位置に前記ステップ（３）〜ステップ（４）を繰り返すことにより異なるデザインの新たな液体試薬供給治具を配設することができる。
【実施例１】
【００２９】
（１）９６穴マイクロタイタープレートの作製
先ず、４インチウエハを準備した。プロセスの信頼性を得るために、レジストを使用する前に基板を洗浄・乾燥する必要があり、本実施例では、ピラニア・エッチング／クリーン（Ｈ２ＳＯ４およびＨ２Ｏ２）処理後、蒸留水でリンスした。その後、シリコンの表面酸化膜を除去するため、ＢＨＦ（バッファード弗酸）に１５分間浸し、蒸留水でリンスした。その後、表面の脱水のため、対流式のオーブン中で６０℃、３０分間程度ベークした。この表面処理済ウエハ上にＳＵ−８ネガティブフォトレジストを１０００ｒｐｍの回転速度で約２５秒間塗布し、溶媒を蒸発させ、膜を高密度化するためにソフトベークを６５℃で３０分間（ＳＴＥＰ１）、９５℃で９０分間（ＳＴＥＰ２）処理した。クーリング後、このレジスト膜上に、直径０．３５ｍｍ、穴と穴の間隔が１ｍｍの９６穴のパターンを有するマスクを被せ、露光装置（ユニオン光学製 ＰＥＭ−８００）で密着露光した。その後、レジスト膜の露光された部分の架橋を行うため６５℃で１５分間（ＳＴＥＰ１）、９５℃で２５分間（ＳＴＥＰ２）加温し、クーリング後、１−メトキシ−２−プロピル酢酸現像液で現像し、現像後、基板は短時間イソプロピルアルコール(IPA)でリンスした。その後、６５℃で３０分間乾燥後、１５０℃で５分間かけてハードベークし、レジスト厚２００μｍのマスターを完成させた。
このマスターの表面をフルオロカーボン（ＣＨＦ３）の存在下で反応性イオンエッチングシステムにより処理し、表面にＣＨＦ３剥離膜を形成した。マスターの剥離膜形成面上に、ＰＤＭＳプレポリマー混合液として、米国のダウ・コーニング社製のSYLGARD 184 SILICONE ELASTOMERを厚さ約２ｍｍになるように流し込み、脱気、加温（６５℃、４時間）した。４時間経過後、オーブンから取り出し、ＰＤＭＳモールドをマスターから剥離した。この剥離したＰＤＭＳモールドをガラス基板に自己吸着させ、２００μｍの隙間に更に、反応性イオンエッチングシステムにより、フルオロカーボン（ＣＨＦ３）処理後、２００μｍの隙間にＰＤＭＳプレポリマーを流し込んだ。流し込んだ後、６５℃で４時間加熱重合した。その後、まず、ＰＤＭＳモールドと、流し込んで加熱重合形成された目的のＰＤＭＳシートを同時にガラスから引き剥がし、別のガラスに貼り、目的のＰＤＭＳシートをガラスに押さえながら、ＰＤＭＳモールドを引き剥がした。その後、目的のＰＤＭＳシートをＯ２プラズマによりクリーニングした。クリーニングされた９６個の貫通穴を有するＰＤＭＳシートをガラス基板に恒久接着させ、９６穴マイクロタイタープレートを完成させた。
（２）液体試薬供給治具の作製
先ず、４インチウエハを準備した。プロセスの信頼性を得るために、レジストを使用する前に基板を洗浄・乾燥する必要があり、本実施例では、ピラニア・エッチング／クリーン（Ｈ２ＳＯ４およびＨ２Ｏ２）処理後、蒸留水でリンスした。その後、シリコンの表面酸化膜を除去するため、ＢＨＦ（バッファード弗酸）に１５分間浸し、蒸留水でリンスした。その後、表面の脱水のため、対流式のオーブン中で６０℃、３０分間程度ベークした。この表面処理済ウエハ上にＳＵ−８ネガティブフォトレジストを１０００ｒｐｍの回転速度で約２５秒間塗布し、溶媒を蒸発させ、膜を高密度化するためにソフトベークを６５℃で３０分間（ＳＴＥＰ１）、９５℃で９０分間（ＳＴＥＰ２）処理した。クーリング後、このレジスト膜上に、貫通穴（注入口）２２ａ，２２ｂの直径１ｍｍ、流路２０の間隔０．３５ｍｍ、流路２０の深さ１００μｍ、流路２０の幅１ｍｍに相当するパターンを有するマスクを被せ、露光装置（ユニオン光学製 ＰＥＭ−８００）で密着露光した。その後、レジスト膜の露光された部分の架橋を行うため６５℃で１５分間（ＳＴＥＰ１）、９５℃で２５分間（ＳＴＥＰ２）加温し、クーリング後、１−メトキシ−２−プロピル酢酸現像液で現像し、現像後、基板は短時間イソプロピルアルコール(IPA)でリンスした。その後、６５℃で３０分間乾燥後、１５０℃で５分間かけてハードベークし、レジスト厚２００μｍのマスターを完成させた。
このマスターの表面をフルオロカーボン（ＣＨＦ３）の存在下で反応性イオンエッチングシステムにより処理し、表面にＣＨＦ３剥離膜を形成した。マスターの剥離膜形成面上に、ＰＤＭＳプレポリマー混合液として、米国のダウ・コーニング社製のSYLGARD 184 SILICONE ELASTOMERを厚さ約２ｍｍになるように流し込み、脱気、加温（６５℃、４時間）した。４時間経過後、オーブンから取り出し、ＰＤＭＳモールドをマスターから剥離した。この剥離したＰＤＭＳモールドをガラス基板に自己吸着させ、２００μｍの隙間に更に、反応性イオンエッチングシステムにより、フルオロカーボン（ＣＨＦ３）処理後、２００μｍの隙間にＰＤＭＳプレポリマーを流し込んだ。流し込んだ後、６５℃で４時間加熱重合した。その後、まず、ＰＤＭＳモールドと、流し込んで加熱重合形成された目的のＰＤＭＳ製液体試薬供給治具を同時にガラスから引き剥がし、別のガラスに貼り、目的のＰＤＭＳ製液体試薬供給治具をガラスに押さえながら、ＰＤＭＳモールドを引き剥がした。その後、目的のＰＤＭＳ製液体試薬供給治具をＯ２プラズマによりクリーニングした。クリーニングされたＰＤＭＳ製液体試薬供給治具を、その流路と前述の９６穴マイクロタイタープレートのウエルとの位置が整合するように、９６穴マイクロタイタープレート上面に自己吸着させた。
（３）液体注入
前記（２）で得られた、９６穴マイクロタイタープレートとＰＤＭＳ製液体試薬供給治具とを貼り合わせた本発明のプロテインチップ前処理キットにおいて、ＰＤＭＳ製液体試薬供給治具の一方の貫通孔から着色液を注入して流路内に流し込み、余剰の着色液を他方の貫通孔から排出させた。この作業を全ての行について行った。その後、ＰＤＭＳ製液体試薬供給治具を９６穴マイクロタイタープレートから剥離し、ウエル内を検査した。その結果、全てのウエル内に目的の着色液が充填されていることが確認された。
【００３０】
従って、本発明の液体試薬供給治具をマイクロタイタープレートと組み合わせて使用すれば、ＥＬＩＳＡ法で使用する一次抗体、二次抗体、発色試薬、洗浄液などの液体試薬類をウエル内に注入できることが理解できる。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明のプロテインチップ前処理キットは医学、獣医学、歯科学、薬学、生命科学、食品、農業、水産など様々な分野で活用できる。特に、蛍光抗体法、in situ Hibridization等に最適なチップとして、免疫疾患検査、細胞培養、ウィルス固定、病理検査、細胞診、生検組織診、血液検査、細菌検査、ＤＮＡ分析、ＲＮＡ分析などの広範な領域で使用できる。また、本発明のプロテインチップ前処理キットは、タンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ、タンパク質−リガンドの相互作用解析、及びタンパク質発現プロファイルの研究、診断用マイクロアレイチップの開発、新規医薬品のスクリーニングなどにも応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明のプロテインチップ１の一例の分解平面図であり、（Ａ）は抗原又は抗体が付着された基板３、（Ｂ）は行用液体試薬供給治具５−１、（Ｃ）は列用液体試薬供給治具５−２である。
【図２（Ａ）】本発明のプロテインチップで使用するのに適した複数個の貫通穴を有するポリマーシート１０の一例の部分平面図である。
【図２（Ｂ）】図２ＡにおけるＢ−Ｂ線に沿った部分断面図である。
【図２（Ｃ）】図２Ａのポリマーシート１０を基板３に貼り合わせることにより得られる構造物１７の一例の部分概要断面図である。
【図３】図１（Ｂ）におけるIII-III線に沿った部分断面図である。
【図４】（Ａ）は、図３の液体試薬供給治具５−１を図２（Ｃ）の構造物１７の上面に積重又は貼り合わせた状態を示す部分概要断面図であり、（Ｂ）は図４ＡにおけるＢ−Ｂ線に沿った部分概要断面図である。
【図５（Ａ）】本発明のプロテインチップ１で使用される液体試薬供給治具５の別の実施態様を示す平面図である。
【図５（Ｂ）】本発明のプロテインチップ１で使用される液体試薬供給治具５の別の実施態様を示す平面図である。
【図６】本発明のプロテインチップの別の実施態様の概要斜視図である。
【図７】図６に示されるプロテインチップの製造方法を説明する工程図である。
【図８】従来のＥＬＩＳＡ法を説明する工程図である。
【符号の説明】
【００３３】
１，１Ａ 本発明のプロテインチップ
３ 基板
５ 液体試薬供給治具
７ 抗原又は抗体
１０ ポリマーシート
１３ 貫通孔
１５ ウエル
１７ 構造体
２０ 流路
２２ａ，２２ｂ 貫通孔
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質を検出するためのプロテインチップを作製するための前処理キットに関する。更に詳細には、本発明は数十〜数百個のタンパク質検体を一度に処理することができるプロテインチップ前処理キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオテクノロジー技術の著しい発展により、ゲノム解析が急速に進んだ。ゲノム解析の結果は、疾病の診断、治療の他、創薬などにも活用されている。最近は、ポストゲノム時代を迎えるにあたり、タンパク質の機能解析に注目が集まっている。
【０００３】
一般に医学検査材料となる体液や組織には非常に多くの種類のタンパク質やペプチドが含まれている。臨床検査の場では、数え切れないほど多くのタンパク質やペプチドが、しかもそれぞれ異なる濃度で含まれた試料の中の、或る特定のタンパク質のみを定量又は定性する必要が生じる。アルブミンのように大量に存在するタンパク質であれば、例えば、電気泳動を行ってバンドの太さを比較するだけで良い場合もあるが、他のタンパク質に比べて微量しか存在しないタンパク質やペプチドを相手にする場合は、特異性の高さ（目的の物質を狭雑する他のタンパク質からどれだけ正確に区別できるか）と定量性の良さ（どれだけ微量で正確に量れるか）が同時に求められる。このような目的に合致する検査法として抗体の特異性を用いた方法が開発された。すなわち、目的のタンパク質又はペプチドのみと反応し、狭雑する他のタンパク質とは反応しない抗体により先ず「特異性」を確保し、抗原抗体反応は比較的定量的に起こるので抗体の量がわかっていれば抗原の量を容易に求めることができる。従来は抗体の標識に放射性同位元素を使用してきたが、利用できる施設が限られ、試薬と検出器を含めて費用もかなり高価になる欠点があったので、放射性同位元素を酵素に置き換え、抗体に結合した酵素の反応で抗原を定性及び定量する方法として「酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法」が新たに開発された（例えば、特許文献１参照）。ＥＬＩＳＡ法には直接吸着法とサンドイッチ法の二種類があるが、何れの方法も、安価で簡便であるため、現在ホルモンや微量タンパク質あるいは感染性微生物抗原の検出と定量に極めて広範に用いられている。
【０００４】
図８はＥＬＩＳＡ法の直接吸着法を説明する模式図である。ステップ（１）において、プラスチック、ガラスなどのような基板１００の固相表面に抗原（例えば、ＨＩＶ抗原）１０２を、例えば、アミノカップリング法、表面チオールカップリング法又はリガンドチオールカップリング法などの方法により付着させる。ステップ（２）において、被検サンプル（例えば、血清）を注ぐ。サンプル中に抗体（例えば、抗ＨＩＶ抗体（ＨＩＶに感染すると平均１２週位で産生され、ＨＩＶ抗原に特異的に結合する））１０４があれば、抗原１０２と反応し、結合する。次いで、ステップ（３）において、標識物質として、酵素付き二次抗体１０６を注ぐ。この酵素付き二次抗体１０６は被検サンプル中の抗体１０４と特異的に結合することができる。その後、ステップ（４）において、酵素付き抗体１０６の酵素と反応して発色する物質１０８を注ぐ。ステップ（５Ａ）において、反応生成物１１０の発色状態を測定する。ステップ（５Ｂ）に示されるように、被検サンプル中に抗体（例えば、抗ＨＩＶ抗体）１０４がなければ、発色物質１０８を注いでも、反応しないので発色しない。
【０００５】
ＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法では、抗原１０２の代わりに先ず基板１００に目的のタンパク質に特異的な一次抗体を結合させておき、目的物質を含む溶液を加えると、溶液中の抗原が「抗原抗体反応」により抗体に結合する。その後、酵素標識二次抗体をを加え、一次抗体に結合していた目的物質を定性及び定量する。
【０００６】
従来、ＥＬＩＳＡ法などを実施する場合、サンプル数が数千個に及ぶ場合がある。このような多量のサンプルを処理するため、プロテインアレイチップが用いられている。プロテインアレイチップはプロテオゲン(Proteogen)社から市販されている全自動のマイアクロアレイヤー（例えば、Proteogen CM-1000）により作製、処理することができる。この装置の特徴は、ガラス基板上に抗原を付着させるために、ガラス基板上に「プロリンカー」と呼ばれる固定化試薬を予め固着させておくことである。この装置によれば、スポット径１００〜３００μｍ、スポットピッチ１０μｍ、スポット密度最大４９００スポット／ｃｍ２で、２５．４ｍｍｘ７６．２ｍｍのスタンダードフォーマットスライドガラスを使用することができる。
【０００７】
しかし、このような装置は数千万円以上もする非常に高価な装置であり、検体数が数十〜数百程度の小規模な検査には使用できないか、又は使用した場合、非常に不経済となる。このため、検体数が数十〜数百程度の小規模な検査を行う場合は、マイクロタイタープレートなどを用いて手作業で行わなければならなかった。各穴毎に抗原を付着し、その後、被検サンプルを注ぎ、二次抗体を注ぎ、発色物質を注いでいたのでは作業時間が冗長になるばかりか、検査効率も大幅に低下する。各穴毎に作業するのではなく、マイクロタイタープレート全体に抗原を付着し、各穴毎に被検サンプル、二次抗体又は発色物質を注ぐ方式が試みられたが、最初の抗原が無駄になるばかりか、後の作業は各穴毎に行うので作業時間はさほど短縮されない。
【０００８】
【特許文献１】特公平６−１１３３５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、数十個〜数百個程度の中規模個数のタンパク質検体を検査するのに適したプロテインチップ前処理キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するための手段として請求項１に係る発明は、抗原又は抗体が付着される基板と、前記抗原又は抗体に液体試薬を供給するための少なくとも１枚以上の治具とからなり、前記治具は前記抗原又は抗体のアレイの本数に対応する本数の流路を有し、前記流路の両端は貫通孔を介して大気に連通していることを特徴とするプロテインチップ前処理キットである。
【００１１】
基板上に付着された抗原又は抗体のアレイの本数に対応する本数の流路を有する液体試薬供給治具を使用することにより、基板と液体試薬供給治具を貼り合わせることにより、基板上の抗原又は抗体のアレイに液体試薬を簡単に供給することができる。
【００１２】
前記課題を解決するための手段として請求項２に係る発明は、前記液体試薬供給治具が、前記抗原又は抗体のアレイの行数に対応する本数の流路を有する治具と、前記抗原又は抗体のアレイの列数に対応する本数の流路を有する治具との２枚からなることを特徴とする請求項１記載のプロテインチップ前処理キットである。
【００１３】
基板上に付着された抗原又は抗体のアレイの行数と列数が異なる場合に、行数と列数にそれぞれ対応する本数の流路を有する２種類の液体試薬供給治具を使用することにより、液体試薬供給を更に容易にすることができる。
【００１４】
前記課題を解決するための手段として請求項３に係る発明は、前記基板の上面には、複数の貫通孔を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製ポリマーシートが貼り合わされ、前記基板と前記貫通孔とによりウエルを形成していることを特徴とする請求項１又は２に記載のプロテインチップ前処理キットである。
【００１５】
基板上面に複数の貫通孔を有するＰＤＭＳ製ポリマーシートを貼り合わせることにより複数個のウエルを有するマイクロタイタープレートが形成されるので、このウエルを抗原叉は抗体付着アレイとして使用することができる。
【００１６】
前記課題を解決するための手段として請求項４に係る発明は、前記基板の上面には、複数の貫通孔を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製ポリマーシートが貼り合わされ、前記基板と前記貫通孔とによりウエルを形成しており、前記ＰＤＭＳ製ポリマーシートの上部四辺の端部のうちの少なくとも一つの辺端部にＰＤＭＳ製液体試薬供給治具の端部が、前記ウエルと前記液体試薬供給治具の流路との位置が整合するように、自己吸着されていることを特徴とする請求項１記載のプロテインチップ前処理キットである。
【００１７】
ＰＤＭＳ製液体試薬供給治具の流路とＰＤＭＳ製ポリマーシートのウエルとが予め位置合わせされた状態で、ＰＤＭＳ製液体試薬供給治具の端部がＰＤＭＳ製ポリマーシートの端部に恒久接着されているので、ＰＤＭＳ製液体試薬供給治具を使用する際、流路とアレイとの位置合わせが不要となる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の液体試薬供給治具を使用すれば、抗原又は抗体及び／又は液体試薬の使用量を節約できるばかりか、これらの乾燥を防ぐことができる。また、本発明のプロテインチップ前処理キットによれば、従来の数千万円もする高価なスポッターを使用したのと同じ処理作業を実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、図面を参照しながら本発明の検査治具の好ましい実施態様について説明する。図１は本発明のプロテインチップ前処理キット１の一例の分解図である。本発明のプロテインチップ前処理キット１は基本的に、図１（Ａ）に示される、抗原又は抗体７が付着された又はこれら抗原又は抗体を付着すべき基板３と、この基板３の抗原又は抗体付着面上に着脱可能に積重又は貼り合わされる少なくとも１枚以上の液体試薬供給治具５とからなる。図１（Ｂ）は、行（横列）用液体試薬供給治具５−１であり、図１（Ｃ）は、列（縦列）用液体試薬供給治具５−２である。
【００２０】
基板３に行（横列）用液体試薬供給治具５−１を積重又は貼り合わせて所定の液体試薬の注入が完了したら、基板３から行（横列）用液体試薬供給治具５−１を剥がし、次いで、基板３に列（縦列）用液体試薬供給治具５−２を積重又は貼り合わせて別の液体試薬を注入する。その後、基板３から列用液体試薬供給治具５−２を剥がし、基板３だけにしてから所望の定性及び定量測定を行う。抗原又は抗体７の配列が正方形状であれば、行用液体試薬供給治具５−１と、列用液体試薬供給治具５−２とを共用することができるので、液体試薬供給治具は１枚でもかまわないが、“コンタミネーション”を避けるために、使用する液体試薬毎に液体試薬供給治具５を使い分けることが好ましい。従って、本発明のプロテインチップ前処理キット１では、使用する液体試薬の種類に応じた枚数の液体試薬供給治具５を使用することが好ましい。
【００２１】
基板３へ抗原又は抗体７を付着させる方法自体は本発明の構成要件ではない。従って、基板３へ抗原又は抗体７を付着させるには、例えば、アミノカップリング法、表面チオールカップリング法又はリガンドチオールカップリング法などの公知慣用の方法を使用することができる。何れの付着方法を使用するにしても、基板３へ抗原又は抗体７を付着させるために、本発明者らが先に出願した特願２００４−０７５６５４の明細書に記載されているような、複数個の貫通穴を有するポリマーシートを使用することが好ましい。このポリマーシートを使用すれば、スポッターなどの様な高価な装置を使用しなくても、基板３上に抗原又は抗体７を容易に規則的に整然と配列させることができる。
【００２２】
図２（Ａ）はこのようなポリマーシートの一例の平面図であり、図２（Ｂ）は図２（Ａ）におけるＢ−Ｂ線に沿った断面図であり、図２（Ｃ）はポリマーシートの使用状態を示す一例の断面図である。ポリマーシート１０は例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのポリマーから形成されている。その他のポリマーも使用できる。シート１０のサイズ自体は用途に応じて任意のサイズを選択することができる。従って、シート１０は正方形、長方形、円形、楕円形、三角形、五角以上の多角形など任意の形状をとることができる。シート１０には用途に応じて任意の個数（例えば、９６個）の貫通穴１３が形成されている。シート１０の厚さは数百μｍ〜数十ｍｍ程度（例えば、２００μｍ〜１０ｍｍ）である。貫通穴１３の断面形状は図示された矩形状のものに限定されない。円形状、楕円状、三角形状、五角以上の多角形状など様々な形状を採ることもできる。図２（Ｃ）に示されるように、ポリマーシート１０の下部に基板３を貼着することにより、ポリマーシート１０の貫通穴１３の下部が遮蔽され、ウエル１５が形成されるので、得られた構造物１７を化学分析用のマイクロタイタープレートとして使用することができる。抗原又は抗体はウエル１５の底部（すなわち、基板３の上面）に付着される。
基板３はガラス、合成樹脂、金属、撥水紙など任意の材料から形成されたものを使用できる。ポリマーシート１０がＰＤＭＳから形成されている場合、基板３はガラス製であることが好ましい。ＰＤＭＳとガラスは容易に恒久接着することができるからである。
構造物１７のウエル１５内に抗原を含む溶液（直接吸着法）又は抗体を含む溶液（サンドイッチ法）を注入し、余分な溶液を廃棄すれば、基板３の上面に目的とする抗原又は抗体を付着（又は結合）させることができる。基板３の上面に目的とする抗原又は抗体を付着（又は結合）させた後、所望により、ポリマーシート１０を基板３上に残置することもできるし、基板３から剥離し、除去することもできる。
【００２３】
図１に示されるように、液体試薬供給治具５−１及び５−２は、抗原又は抗体７の横及び縦の列数に相当する本数の流路２０を有する。図３は図１におけるIII-III線に沿った断面図である。各流路２０の下面は遮蔽されていない。各流路２０の両端には貫通孔２２ａ及び２２ｂが配設されている。液体試薬供給治具５−１及び５−２はプラスチック製又はガラス製であることが好ましい。プラスチックは例えば、ＰＤＭＳ、ポリカーボネート樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリアクリル樹脂、ナイロン樹脂、ポリエチレン樹脂などである。液体試薬供給治具の形成材料としては、基板３又はポリマーシート１０との密着性に優れ、しかも常用の光リソグラフィー法により容易に量産可能なＰＤＭＳが好ましい。液体試薬供給治具５の厚さは数百μｍ〜数ｍｍ程度であることが好ましい。流路２０の幅は抗原又は抗体７の付着幅、若しくはポリマーシート１０のウエル１５の開口幅と同等か又は小さいことが好ましい。
【００２４】
図４Ａに示されるように、図３の液体試薬供給治具５−１を図２（Ｃ）の構造物１７の上面に積重又は貼り合わせる。図４Ｂは図４ＡにおけるＢ−Ｂ線に沿った部分概要断面図である。
ウエル１５の底部には抗原又は抗体７が付着されている。貫通孔２２ａ又は２２ｂの一方から液体試薬（例えば、アルブミンなどのタンパク溶液、一次抗体、酵素標識二次抗体、発色試薬、水など）を注入し、余分な液体試薬は他方の貫通孔から排出する。各流路毎に注入する液体試薬を変えることができる。従って、構造物１７がマイクロタイタープレートである場合、行（横列）用液体試薬供給治具５−１及び列（縦列）用液体試薬供給治具５−２を使用すると、各抗原又は抗体７毎に試薬を全て変えることができる。例えば、行（横列）と、列（縦列）を組み合わせることにより、第１行第１列〜第８行第１２列の全ての抗原について異なる液体試薬を注入することができる。従って、本発明の液体試薬供給治具を使用すれば、抗原又は抗体の個数（例えば、９６個）と同じ個数の異なる反応相を１個のチップ上で実施することができる。本発明の液体試薬供給治具５はウエル１５の底部に抗原又は抗体を付着（又は結合）させる目的にも使用できる。この場合、行及び／又は列毎に異なる抗原又は抗体を付着（又は結合）させることができる。本発明の液体試薬供給治具５を使用すれば、各流路当たりの液体注入量を約３μＬ以下にまで抑制することができ、液体試薬類の無駄使いが避けられる。また、治具５でウエル１５がカバーされているため、ウエル内の抗原又は抗体ばかりかその他の液体試薬類が乾燥・蒸発することも防止できる。
【００２５】
図５Ａ及び図５Ｂは本発明のプロテインチップ前処理キット１で使用される液体試薬供給治具５の別の実施態様を示す平面図である。ＥＬＩＳＡ法では、固相（基板）に抗原又は抗体を付着させた後、固相表面を無関係なタンパク質で覆う「ブロッキング」処理が行われる。また、余計なタンパク質や抗原に結合しなかった抗体又は固相に結合しなかった抗原を洗い流す処理が行われる。このような場合、各流路２０内に一斉に液体を流すことが必要になる。図５Ａ及び図５Ｂに示される実施態様はこのような目的に使用するのに好適な液体試薬供給治具５−２及び５−３である。この液体試薬供給治具５−２及び５−３を使用すると作業時間を大幅に短縮することができる。
図５Ａの実施態様では、各流路２０の一端は拡大容積部２４に連通し、拡大容積部２４には大気に連通する貫通孔２６が配設されており、各流路の他端には貫通孔２８が配設されている。例えば、貫通孔２６から液体が拡大容積部２４に注入されると、液体は各流路２０を流れて、末端の各貫通孔２８から排出される。
図５Ｂの実施態様では、各流路２０の両端は拡大容積部２４ａ及び２４ｂにそれぞれ連通し、各拡大容積部２４ａ及び２４ｂに、大気に連通する貫通孔２６ａ及び２６ｂがそれぞれ配設されている。例えば、貫通孔２６ａから液体が拡大容積部２４ａに注入されると、液体は各流路２０を流れて、末端の拡大容積部２４ｂに集まり、貫通孔２６ｂから排出される。
【００２６】
図６は本発明のプロテインチップ前処理キット１Ａの別の実施態様の概要斜視図である。図１に示されたプロテインチップ前処理キット１では、基板３に対して液体試薬供給治具５−１及び５−２が別体として分離されており、必要に応じて各液体試薬供給治具５−１又は５−２を基板３上に積重又は貼り合わせて使用するが、その都度、基板３の抗原又は抗体アレイと治具の流路を位置合わせさせて積重又は貼り合わせなければならない。これに対して、図６のプロテインチップ前処理キット１Ａでは、ポリマーシートのウエルと液体試薬供給治具の流路が予め位置合わせされた状態で、４枚の液体試薬供給治具５−５〜５−８のそれぞれの一端がポリマーシート１０の上面に恒久接着されており、ポリマーシート１０と一体化されている。従って、異なる液体試薬供給治具を使用する場合でも、ウエルと流路の位置合わせをその都度行う必要が無い。ポリマーシート１０が矩形状なので、これに一体化し得る液体試薬供給治具は最大４個であるが、１個だけでもよく、２個又は３個でもよい。プロテインチップ前処理キット１Ａを使用する場合、例えば、先ず液体試薬供給治具５−５をポリマーシート１０の上面に折り重ねて貼り合わせ、貫通孔２２ａから流路２０を通してウエル１５内に液体試薬を供給し、余分な液体試薬は貫通孔２２ｂから排出する。行ウエルの処理が完了したら、液体試薬供給治具５−５をポリマーシート１０から引き剥がして起こし、次いで、列用の液体試薬供給治具５−７を倒してポリマーシート１０の上面に貼り合わせ、貫通孔２２ａから流路２０を通して列ウエル１５内に液体試薬を供給し、余分な液体試薬は貫通孔２２ｂから排出する。別の行用液体試薬供給治具５−６及び列用液体試薬供給治具５−８も同様にして使用される。プロテインチップ前処理キット１Ａにおいて、液体試薬供給治具として図５Ａ及び図５Ｂに示されるような治具５−３及び／又は５−４を使用することもできる。
【００２７】
図６のプロテインチップ前処理キット１Ａの利点は、液体試薬供給治具５−５〜５−８の各流路２０がポリマーシート１０のウエル１５の位置と予め位置合わせして一体化されているため、各液体試薬供給治具５−５〜５−８をポリマーシート１０に折り重ねるだけで液体試薬供給治具５−５〜５−８の各流路２０がポリマーシート１０のウエル１５に整合される。従って、図１のチップ１におけるような、液体試薬供給治具の流路２０とポリマーシート１０のウエル１５との面倒な整合作業が不要となる。
【００２８】
図６に示されるプロテインチップ前処理キット１Ａの製造方法を図７に示す。ステップ（１）において、ＰＤＭＳポリマーシート１０の上面にＰＤＭＳ製液体試薬供給治具５−５を流路２０とポリマーシート１０のウエル１５の位置が合致するように自己吸着させておく。次いで、ステップ（２）において、ＰＤＭＳ製液体試薬供給治具５−５の貫通孔２２ａ側の端部を引き剥がし、露出面を酸素プラズマ処理する。ＰＤＭＳ製液体試薬供給治具５−５は酸素プラズマ処理した部分でＰＤＭＳポリマーシート１０に恒久接着するが、その他の部分ではポリマーシート１０から剥離できる。従って、ステップ（３）において、恒久接着していない部分のＰＤＭＳ製液体試薬供給治具５−５をＰＤＭＳポリマーシート１０から剥離し、その剥離部分に別のＰＤＭＳ製液体試薬供給治具５−６を流路２０とポリマーシート１０のウエル１５の位置が合致するように自己吸着させる。次いで、ステップ（４）において、ＰＤＭＳ製液体試薬供給治具５−６の貫通孔２２ｂ側の端部を引き剥がし、露出面を酸素プラズマ処理する。ステップ（５）において、ポリマーシート１０に対して自己吸着していない部分のＰＤＭＳ製液体試薬供給治具５−６をポリマーシート１０から剥離し、ＰＤＭＳ製液体試薬供給治具５−７及び５−８について前記ステップ（３）〜ステップ（４）を繰り返す。異なるデザインの液体試薬供給治具を使用する場合は、既存の液体試薬供給治具のうちの何れかをポリマーシートから除去し、その除去した対応する位置に前記ステップ（３）〜ステップ（４）を繰り返すことにより異なるデザインの新たな液体試薬供給治具を配設することができる。
【実施例１】
【００２９】
（１）９６穴マイクロタイタープレートの作製
先ず、４インチウエハを準備した。プロセスの信頼性を得るために、レジストを使用する前に基板を洗浄・乾燥する必要があり、本実施例では、ピラニア・エッチング／クリーン（Ｈ２ＳＯ４およびＨ２Ｏ２）処理後、蒸留水でリンスした。その後、シリコンの表面酸化膜を除去するため、ＢＨＦ（バッファード弗酸）に１５分間浸し、蒸留水でリンスした。その後、表面の脱水のため、対流式のオーブン中で６０℃、３０分間程度ベークした。この表面処理済ウエハ上にＳＵ−８ネガティブフォトレジストを１０００ｒｐｍの回転速度で約２５秒間塗布し、溶媒を蒸発させ、膜を高密度化するためにソフトベークを６５℃で３０分間（ＳＴＥＰ１）、９５℃で９０分間（ＳＴＥＰ２）処理した。クーリング後、このレジスト膜上に、直径０．３５ｍｍ、穴と穴の間隔が１ｍｍの９６穴のパターンを有するマスクを被せ、露光装置（ユニオン光学製 ＰＥＭ−８００）で密着露光した。その後、レジスト膜の露光された部分の架橋を行うため６５℃で１５分間（ＳＴＥＰ１）、９５℃で２５分間（ＳＴＥＰ２）加温し、クーリング後、１−メトキシ−２−プロピル酢酸現像液で現像し、現像後、基板は短時間イソプロピルアルコール(IPA)でリンスした。その後、６５℃で３０分間乾燥後、１５０℃で５分間かけてハードベークし、レジスト厚２００μｍのマスターを完成させた。
このマスターの表面をフルオロカーボン（ＣＨＦ３）の存在下で反応性イオンエッチングシステムにより処理し、表面にＣＨＦ３剥離膜を形成した。マスターの剥離膜形成面上に、ＰＤＭＳプレポリマー混合液として、米国のダウ・コーニング社製のSYLGARD 184 SILICONE ELASTOMERを厚さ約２ｍｍになるように流し込み、脱気、加温（６５℃、４時間）した。４時間経過後、オーブンから取り出し、ＰＤＭＳモールドをマスターから剥離した。この剥離したＰＤＭＳモールドをガラス基板に自己吸着させ、２００μｍの隙間に更に、反応性イオンエッチングシステムにより、フルオロカーボン（ＣＨＦ３）処理後、２００μｍの隙間にＰＤＭＳプレポリマーを流し込んだ。流し込んだ後、６５℃で４時間加熱重合した。その後、まず、ＰＤＭＳモールドと、流し込んで加熱重合形成された目的のＰＤＭＳシートを同時にガラスから引き剥がし、別のガラスに貼り、目的のＰＤＭＳシートをガラスに押さえながら、ＰＤＭＳモールドを引き剥がした。その後、目的のＰＤＭＳシートをＯ２プラズマによりクリーニングした。クリーニングされた９６個の貫通穴を有するＰＤＭＳシートをガラス基板に恒久接着させ、９６穴マイクロタイタープレートを完成させた。
（２）液体試薬供給治具の作製
先ず、４インチウエハを準備した。プロセスの信頼性を得るために、レジストを使用する前に基板を洗浄・乾燥する必要があり、本実施例では、ピラニア・エッチング／クリーン（Ｈ２ＳＯ４およびＨ２Ｏ２）処理後、蒸留水でリンスした。その後、シリコンの表面酸化膜を除去するため、ＢＨＦ（バッファード弗酸）に１５分間浸し、蒸留水でリンスした。その後、表面の脱水のため、対流式のオーブン中で６０℃、３０分間程度ベークした。この表面処理済ウエハ上にＳＵ−８ネガティブフォトレジストを１０００ｒｐｍの回転速度で約２５秒間塗布し、溶媒を蒸発させ、膜を高密度化するためにソフトベークを６５℃で３０分間（ＳＴＥＰ１）、９５℃で９０分間（ＳＴＥＰ２）処理した。クーリング後、このレジスト膜上に、貫通穴（注入口）２２ａ，２２ｂの直径１ｍｍ、流路２０の間隔０．３５ｍｍ、流路２０の深さ１００μｍ、流路２０の幅１ｍｍに相当するパターンを有するマスクを被せ、露光装置（ユニオン光学製 ＰＥＭ−８００）で密着露光した。その後、レジスト膜の露光された部分の架橋を行うため６５℃で１５分間（ＳＴＥＰ１）、９５℃で２５分間（ＳＴＥＰ２）加温し、クーリング後、１−メトキシ−２−プロピル酢酸現像液で現像し、現像後、基板は短時間イソプロピルアルコール(IPA)でリンスした。その後、６５℃で３０分間乾燥後、１５０℃で５分間かけてハードベークし、レジスト厚２００μｍのマスターを完成させた。
このマスターの表面をフルオロカーボン（ＣＨＦ３）の存在下で反応性イオンエッチングシステムにより処理し、表面にＣＨＦ３剥離膜を形成した。マスターの剥離膜形成面上に、ＰＤＭＳプレポリマー混合液として、米国のダウ・コーニング社製のSYLGARD 184 SILICONE ELASTOMERを厚さ約２ｍｍになるように流し込み、脱気、加温（６５℃、４時間）した。４時間経過後、オーブンから取り出し、ＰＤＭＳモールドをマスターから剥離した。この剥離したＰＤＭＳモールドをガラス基板に自己吸着させ、２００μｍの隙間に更に、反応性イオンエッチングシステムにより、フルオロカーボン（ＣＨＦ３）処理後、２００μｍの隙間にＰＤＭＳプレポリマーを流し込んだ。流し込んだ後、６５℃で４時間加熱重合した。その後、まず、ＰＤＭＳモールドと、流し込んで加熱重合形成された目的のＰＤＭＳ製液体試薬供給治具を同時にガラスから引き剥がし、別のガラスに貼り、目的のＰＤＭＳ製液体試薬供給治具をガラスに押さえながら、ＰＤＭＳモールドを引き剥がした。その後、目的のＰＤＭＳ製液体試薬供給治具をＯ２プラズマによりクリーニングした。クリーニングされたＰＤＭＳ製液体試薬供給治具を、その流路と前述の９６穴マイクロタイタープレートのウエルとの位置が整合するように、９６穴マイクロタイタープレート上面に自己吸着させた。
（３）液体注入
前記（２）で得られた、９６穴マイクロタイタープレートとＰＤＭＳ製液体試薬供給治具とを貼り合わせた本発明のプロテインチップ前処理キットにおいて、ＰＤＭＳ製液体試薬供給治具の一方の貫通孔から着色液を注入して流路内に流し込み、余剰の着色液を他方の貫通孔から排出させた。この作業を全ての行について行った。その後、ＰＤＭＳ製液体試薬供給治具を９６穴マイクロタイタープレートから剥離し、ウエル内を検査した。その結果、全てのウエル内に目的の着色液が充填されていることが確認された。
【００３０】
従って、本発明の液体試薬供給治具をマイクロタイタープレートと組み合わせて使用すれば、ＥＬＩＳＡ法で使用する一次抗体、二次抗体、発色試薬、洗浄液などの液体試薬類をウエル内に注入できることが理解できる。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明のプロテインチップ前処理キットは医学、獣医学、歯科学、薬学、生命科学、食品、農業、水産など様々な分野で活用できる。特に、蛍光抗体法、in situ Hibridization等に最適なチップとして、免疫疾患検査、細胞培養、ウィルス固定、病理検査、細胞診、生検組織診、血液検査、細菌検査、ＤＮＡ分析、ＲＮＡ分析などの広範な領域で使用できる。また、本発明のプロテインチップ前処理キットは、タンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ、タンパク質−リガンドの相互作用解析、及びタンパク質発現プロファイルの研究、診断用マイクロアレイチップの開発、新規医薬品のスクリーニングなどにも応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明のプロテインチップ１の一例の分解平面図であり、（Ａ）は抗原又は抗体が付着された基板３、（Ｂ）は行用液体試薬供給治具５−１、（Ｃ）は列用液体試薬供給治具５−２である。
【図２（Ａ）】本発明のプロテインチップで使用するのに適した複数個の貫通穴を有するポリマーシート１０の一例の部分平面図である。
【図２（Ｂ）】図２ＡにおけるＢ−Ｂ線に沿った部分断面図である。
【図２（Ｃ）】図２Ａのポリマーシート１０を基板３に貼り合わせることにより得られる構造物１７の一例の部分概要断面図である。
【図３】図１（Ｂ）におけるIII-III線に沿った部分断面図である。
【図４】（Ａ）は、図３の液体試薬供給治具５−１を図２（Ｃ）の構造物１７の上面に積重又は貼り合わせた状態を示す部分概要断面図であり、（Ｂ）は図４ＡにおけるＢ−Ｂ線に沿った部分概要断面図である。
【図５（Ａ）】本発明のプロテインチップ１で使用される液体試薬供給治具５の別の実施態様を示す平面図である。
【図５（Ｂ）】本発明のプロテインチップ１で使用される液体試薬供給治具５の別の実施態様を示す平面図である。
【図６】本発明のプロテインチップの別の実施態様の概要斜視図である。
【図７】図６に示されるプロテインチップの製造方法を説明する工程図である。
【図８】従来のＥＬＩＳＡ法を説明する工程図である。
【符号の説明】
【００３３】
１，１Ａ 本発明のプロテインチップ
３ 基板
５ 液体試薬供給治具
７ 抗原又は抗体
１０ ポリマーシート
１３ 貫通孔
１５ ウエル
１７ 構造体
２０ 流路
２２ａ，２２ｂ 貫通孔
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原又は抗体が付着される基板と、前記抗原又は抗体に液体試薬を供給するための少なくとも１枚以上の治具とからなり、前記治具は前記抗原又は抗体のアレイの本数に対応する本数の流路を有し、前記流路の両端は貫通孔を介して大気に連通していることを特徴とするプロテインチップ前処理キット。
【請求項２】
前記液体試薬供給治具は、前記抗原又は抗体のアレイの行数に対応する本数の流路を有する治具と、前記抗原又は抗体のアレイの列数に対応する本数の流路を有する治具との２枚からなることを特徴とする請求項１記載のプロテインチップ前処理キット。
【請求項３】
前記基板の上面には、複数の貫通孔を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製ポリマーシートが貼り合わされ、前記基板と前記貫通孔とによりウエルを形成していることを特徴とする請求項１又は２に記載のプロテインチップ前処理キット。
【請求項４】
前記基板の上面には、複数の貫通孔を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製ポリマーシートが貼り合わされ、前記基板と前記貫通孔とによりウエルを形成しており、前記ＰＤＭＳ製ポリマーシートの上部四辺の端部のうちの少なくとも一つの辺端部にＰＤＭＳ製液体試薬供給治具の端部が、前記ウエルと前記液体試薬供給治具の流路との位置が整合するように、自己吸着されていることを特徴とする請求項１記載のプロテインチップ前処理キット。
【請求項１】
抗原又は抗体が付着される基板と、前記抗原又は抗体に液体試薬を供給するための少なくとも１枚以上の治具とからなり、前記治具は前記抗原又は抗体のアレイの本数に対応する本数の流路を有し、前記流路の両端は貫通孔を介して大気に連通していることを特徴とするプロテインチップ前処理キット。
【請求項２】
前記液体試薬供給治具は、前記抗原又は抗体のアレイの行数に対応する本数の流路を有する治具と、前記抗原又は抗体のアレイの列数に対応する本数の流路を有する治具との２枚からなることを特徴とする請求項１記載のプロテインチップ前処理キット。
【請求項３】
前記基板の上面には、複数の貫通孔を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製ポリマーシートが貼り合わされ、前記基板と前記貫通孔とによりウエルを形成していることを特徴とする請求項１又は２に記載のプロテインチップ前処理キット。
【請求項４】
前記基板の上面には、複数の貫通孔を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製ポリマーシートが貼り合わされ、前記基板と前記貫通孔とによりウエルを形成しており、前記ＰＤＭＳ製ポリマーシートの上部四辺の端部のうちの少なくとも一つの辺端部にＰＤＭＳ製液体試薬供給治具の端部が、前記ウエルと前記液体試薬供給治具の流路との位置が整合するように、自己吸着されていることを特徴とする請求項１記載のプロテインチップ前処理キット。
【図１】
【図２（Ａ）】
【図２（Ｂ）】
【図２（Ｃ）】
【図３】
【図４】
【図５（Ａ）】
【図５（Ｂ）】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２（Ａ）】
【図２（Ｂ）】
【図２（Ｃ）】
【図３】
【図４】
【図５（Ａ）】
【図５（Ｂ）】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００６−１２５９１３（Ｐ２００６−１２５９１３Ａ）
【公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３１１９２５（Ｐ２００４−３１１９２５）
【出願日】平成１６年１０月２７日（２００４．１０．２７）
【出願人】（００００００５２７）ペンタックス株式会社 (1,878)
【出願人】（５０２３３８４５４）フルイドウェアテクノロジーズ株式会社 (11)
【公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月２７日（２００４．１０．２７）
【出願人】（００００００５２７）ペンタックス株式会社 (1,878)
【出願人】（５０２３３８４５４）フルイドウェアテクノロジーズ株式会社 (11)
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