プロペンアミド誘導体の重合物からなる癌転移抑制剤
【構成】 下記一般式（Ｉ）で表されるプロペンアミド誘導体の重合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有してなる癌転移抑制剤。
一般式（Ｉ）
H2C=CR1-CO-［NH-R2-CO］-(［Ｘ］- Arg-Gly-Asp-［Ｙ］）n -Z式中、Ｒ1は水素原子、メチル基、エチル基を表し、Ｒ2は炭素数が１〜11の直鎖又は分岐のアルキレン基を表し、該アルキレン基中の炭素原子は−Ｏ−を介して連結していてもよい。Ｘ，ＹはＳｅｒ，Ｇｌｙ，Ｖａｌ，Ｔｈｒ，Ｐｒｏ及びＧｌｎから選択されるアミノ酸残基またはこれらのアミノ酸残基から構成されるペプチド残基を表し、Ｚは−ＯＨ，−ＯＲ3，−ＮＲ4Ｒ5を表し、Ｒ3,Ｒ4,Ｒ5は水素原子、メチル、エチル基の中から選択される。ｎは１〜３の整数を表す。また、式中の［ ］は［ ］内の残基が存在してもしなくてもよいことを示す。
【効果】 本発明のプロペンアミド誘導体重合物は、細胞接着性蛋白質のコア配列に比べて細胞接着性が大きく、癌転移抑制作用等の種々の生物活性を有し、毒性の問題も殆どない。また、その構造も単純であり合成も容易であり、医薬としての価値は高いものである。
一般式（Ｉ）
H2C=CR1-CO-［NH-R2-CO］-(［Ｘ］- Arg-Gly-Asp-［Ｙ］）n -Z式中、Ｒ1は水素原子、メチル基、エチル基を表し、Ｒ2は炭素数が１〜11の直鎖又は分岐のアルキレン基を表し、該アルキレン基中の炭素原子は−Ｏ−を介して連結していてもよい。Ｘ，ＹはＳｅｒ，Ｇｌｙ，Ｖａｌ，Ｔｈｒ，Ｐｒｏ及びＧｌｎから選択されるアミノ酸残基またはこれらのアミノ酸残基から構成されるペプチド残基を表し、Ｚは−ＯＨ，−ＯＲ3，−ＮＲ4Ｒ5を表し、Ｒ3,Ｒ4,Ｒ5は水素原子、メチル、エチル基の中から選択される。ｎは１〜３の整数を表す。また、式中の［ ］は［ ］内の残基が存在してもしなくてもよいことを示す。
【効果】 本発明のプロペンアミド誘導体重合物は、細胞接着性蛋白質のコア配列に比べて細胞接着性が大きく、癌転移抑制作用等の種々の生物活性を有し、毒性の問題も殆どない。また、その構造も単純であり合成も容易であり、医薬としての価値は高いものである。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ａｒｇ-Ｇｌｙ-Ａｓｐのトリペプチドを必須単位として有するプロペンアミド誘導体の重合物またはその薬理学的に許容される塩の癌転移抑制剤としての用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】フィブロネクチンは細胞−細胞外基質の接着に関与する蛋白質であり、血小板凝集や癌転移にも関与していると考えられている。これらの相互作用は一連の細胞表面のレセプターにより仲介され、フィブロネクチンは分子量約２５万の巨大分子であるにもかかわらず、これらのレセプターはその中のArg-Gly-Asp配列を特異的に認識することが明らかにされ、レセプターとの相互作用に重要なものであることが報告されている（ネイチャー(Nature)、第309巻、30頁、1984年）。このArg-Gly-Asp配列はビトロネクチン等の他の接着性蛋白質にも存在しており、フィブロネクチンは上記コア配列を介して、被接着細胞のレセプターと接合し、その情報を接着細胞に伝達する。また、ヘパリン、コラーゲン、フィブリン等の生体高分子との結合能も有し、細胞と間質結合組織との接着、細胞の分化、増殖に関与しているとも考えられている。この様に、細胞接着活性蛋白質は、種々の生物活性を有するため、医薬、医用材料への応用が検討されている。
【０００３】例えば、Arg-Gly-Asp 配列を有する種々の鎖状および環状のオリゴペプチドを用いて血小板凝集を阻害する方法（高分子学会予稿集(Polymer Preprints, Japan)、第38巻、3149頁、1989年、特開平2-174797号）、Arg-Gly-Asp 配列を有するペプチドを細胞移動抑制剤として用いる方法（特開平2-4716号）、Arg-Gly-Aspを固定化したPMMA膜を細胞接着膜として用いる方法(高分子学会予稿集(Polymer Preprints,Japan)、第37巻、705頁、1988年）が報告されている。また、ポリマーにArg-Gly-Aspを必須構成単位とするペプチドを共有結合させ、動物細胞培養基体、生体複合人工臓器用基体として用いる方法（特開平1-309682号、特開平1-305960号）、Arg-Gly-Asp-Ser配列を有するポリペプチドを体外血液用血小板保護剤として用いる方法（特開昭64-6217号）等も開示されている。
【０００４】さらに近年、細胞接着活性蛋白質は、癌転移に関係する物質としても注目されてきている。癌転移の一連の段階において、癌細胞は種々の宿主細胞や生体高分子と接触する。このときフィブロネクチンのような細胞接着分子が存在すると、該細胞は多細胞塊を形成し、癌細胞の増殖や生存をより容易にする。ところがこの際、フィブロネクチンの接着コアであるトリペプチドArg-Gly-Aspが共存すると、競争的に癌細胞上のレセプターと接合することにより癌転移阻害活性を示すことが報告されている（サイエンス、第２３８巻、４６７ページ、１９８６年）。更に、効果の増強をはかる目的で、この配列を有するオリゴペプチド、環状オリゴペプチド、あるいはその繰り返し構造を有するポリペプチドを用いた癌転移抑制方法も開示されている((Int.J.Biol.Macromol.)、第11巻、23頁、1989年、同誌、第11巻、226頁、1989年、(Jpn.J.Cancer Res.)第60巻、722頁、1989年、特開平2-174797号）。
【０００５】上述のように、フィブロネクチン等の細胞接着活性蛋白質あるいはそのペプチド断片は様々な生物活性を有しておりその関連物質を医薬品として応用する技術の開発が望まれていた。特に、接着コア配列の癌転移抑制作用は医薬品として応用価値が高い物と考えられる。そこで、本発明者らは高分子物質が多様な性状、機能を有し生体との間で示される相互作用も低分子の場合と非常に異なっていることに着目し、接着コア配列の持つ生物活性を充分に保持し、血流中でより安定で、重大な副作用も示さず且つ合成も容易な新規な化合物を求めて鋭意研究を行なった結果、Arg-Gly-Aspのトリペプチドを必須単位として有する新規な水溶性プロペンアミド誘導体重合物とその薬理学的に許容される塩を見出し本研究を完成したのである。
【０００６】尚、細胞接着分子の不溶性高分子基体への連結という観点でArg-Gly-Aspを必須単位とするオリゴペプチドを高分子担体に導入した例は見られるが、活性増強や安定性向上を目的として、Arg-Gly-Aspを必須単位とするオリゴペプチドを側鎖に有する水溶性のプロペンアミド誘導体重合物を癌転移抑制剤へ応用する例は知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的は、レセプターの結合能の増強および血液中での安定化が図られ、かつより簡便な手法で生産可能なArg-Gly-Aspのトリペプチドを必須単位として有する新規なプロペンアミド誘導体の重合物とその薬理学的に許容される塩を含有する医薬組成物を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】従って本発明は、下記一般式（Ｉ）で表されるプロペンアミド誘導体の重合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有してなる癌転移抑制剤である。
一般式（Ｉ）
H2C=CR1-CO-［NH-R2-CO］-(［Ｘ］- Arg-Gly-Asp-［Ｙ］）n -Z
【０００９】式中、Ｒ1は水素原子、メチル基、エチル基を表し、Ｒ2は炭素数が１〜１１の直鎖又は分岐のアルキレン基を表し、該アルキレン基中の炭素原子は−Ｏ−を介して連結していてもよい。Ｘ，ＹはＳｅｒ，Ｇｌｙ，Ｖａｌ，Ｔｈｒ，Ｐｒｏ及びＧｌｎから選択されるアミノ酸残基またはこれらのアミノ酸残基から構成されるペプチド残基を表し、Ｚは−ＯＨ，−ＯＲ3，−ＮＲ4Ｒ5を表し、Ｒ3,Ｒ4,Ｒ5は水素原子、メチル、エチル基の中から選択される。ｎは１〜３の整数を表す。また、式中の［ ］は［ ］内の残基が存在してもしなくてもよいことを示す。
【００１０】プロペンアミド誘導体の重合物またはその塩の平均分子量は、好ましくは１０万以下、特に好ましくは５０００〜５万の範囲で、室温で水溶性であることが好ましい。本発明のプロペンアミド誘導体重合物に含まれる接着性ペプチドに用いられるアミノ酸はＬ体、Ｄ体どちらでもよいが、好ましくはＬ体である。
【００１１】本発明のプロペンアミド誘導体重合物の塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩等の無機酸との塩や、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩等の有機酸との塩が挙げられ、そのような塩への変換は慣用手段で行なうことができる。
【００１２】ペプチド合成方法は特に限定されないが、液相法、固相法、および自動合成装置による合成方法が挙げられる。これらの合成方法の詳細については、生化学実験講座「タンパク質の化学IV」ｐ２０７−４９５（日本生化学会編、東京化学同人）、「続生化学実験講座タンパク質の化学（下）」（日本生化学会編、東京化学同人）、「ペプチド合成の基礎と実験」（泉屋等編、丸善）に記載されている。また、市販されている合成ペプチドを利用することも可能である。
【００１３】プロペン酸誘導体と細胞接着性ペプチドとの結合方法としては、活性エステル法、混合酸無水物法、アジド法、酸塩化物法、対称酸無水物法、ＤＣＣ法、ＤＣＣ−添加物法、カルボニルジイミダゾール法等を利用したアミド結合合成方法が挙げられる。さらに、プロペンアミド誘導体の重合物は一般のラジカル重合法、イオン重合法により得られる。重合物はゲル濾過法、透析法、その他既知の方法により特定の分子量分画を行なうことができる。
【００１４】本発明のプロペンアミド誘導体の重合物またはその塩は、細胞接着性蛋白質のコア配列Ａｒｇ-Ｇｌｙ-Ａｓｐを有し、該コア配列を介して細胞接着性蛋白質と同様の機序で細胞に接着する。そのため、細胞接着性蛋白のアゴニストまたはアンタゴニストとして種々の生理活性を示し、免疫調整作用、創傷治癒作用、毛細血管中で起こる癌細胞による血小板凝集抑制作用、神経疾患治癒作用などの広範な生物活性が認められている。従って、本発明のプロペンアミド誘導体の重合物またはその塩は、その少なくとも一種を、場合により慣用の担体または医薬用助剤とともに、癌転移抑制剤、創傷治癒剤、免疫調整剤、血小板凝集粘着抑制剤として患者に投与することが可能である。その投与量は、非経口投与の場合、０．２μｇ／ｋｇ（体重）〜４００ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲、経口投与の場合、０．６μｇ／ｋｇ（体重）〜１．２ｇ／ｋｇ（体重）の範囲で、症状、年齢、体重等に基づいて決定される。
【００１５】本発明のプロペンアミド誘導体の重合物またはその塩は、非経口、経口のいずれの経路によっても投与可能であるが、ペプチド系医薬に一般に使用されている投与方法、即ち、非経口投与方法、例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等によって投与するのが好ましい。そのような投与方法に用いられる注射用製剤を製造する場合、本発明のプロペンアミド誘導体の重合物またはその塩を、例えば、後記実施例で示すようにＰＢＳまたは生理食塩水に溶解して注射用製剤としてもよく、あるいは０．１Ｎ程度の酢酸水等に溶解した後、凍結乾燥製剤としてもよい。このような製剤には、グリシンやアルブミン等の慣用の安定剤を添加してもよい。さらに、本発明のプロペンアミド誘導体の重合物またはその塩は、例えばリポソーム中に包容したマイクロカプセル剤あるいはミクロスフェア状、ハイドロゲル状とすれば、経口投与することも可能であり、座剤、舌下錠、点鼻スプレー剤等の形にすれば、消化菅以外の粘膜からも吸収させることも可能である。
【００１６】
【実施例】以下実施例により本発明を詳細に説明するが本発明はこれに限定されるものではない。
【００１７】製造例１ モノマー１の合成β−アラニン１７．８ｇ（０．２ｍｏｌ）の水酸化ナトリウム水溶液にメタクリル酸クロリド２０．９ｇ（０．２ｍｏｌ）を氷冷下滴下し、４時間撹拌後塩酸により中和した。減圧濃縮により濃縮し沈殿した塩化ナトリウムをろ別した。濃縮液をクロロホルムで抽出し、乾燥後減圧濃縮してクロロホルムを留去した。濃縮物をエーテルで洗浄しモノマー１を白色固体として１７．６ｇ得た（収率５６％）。
【００１８】モノマー１ＣＨ2＝ＣＣＨ3−ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＯＨ
【００１９】製造例２〜１０ モノマー２〜１０の合成製造例１と同様の方法によりアクリル酸クロリドと４−アミノ酪酸、エタクリル酸クロリドと５−アミノ吉草酸、メタクリル酸と６−アミノカプロン酸、アクリル酸と１２−アミノラウリン酸、アクリル酸とロイシン、メタクリル酸とグルタミン、アクリル酸と２（２−アミノエトキシ）プロピオン酸、メタクリル酸と２（２−アミノエトキシ）酢酸、メタクリル酸とグリシルグリシンとの反応により以下のプロペン酸誘導体を製造した。
【００２０】モノマー２ＣＨ2＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＯＨ収率 ５２％
【００２１】モノマー３ＣＨ2＝ＣＣ2Ｈ5ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＯＨ収率 ６１％
【００２２】モノマー４ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ収率 ６９％
【００２３】モノマー５ＣＨ2＝ＣＨＣＯＮＨ−（ＣＨ2）11−ＣＯＯＨ収率 ７１％
【００２４】モノマー６ＣＨ2＝ＣＨＣＯＮＨ−ＣＨ（iso-Ｃ4Ｈ9）−ＣＯＯＨ収率 ６４％
【００２５】モノマー７ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨ2収率 ５９％
【００２６】モノマー８ＣＨ2＝ＣＨＣＯＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−０−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＯＨ収率 ６８％
【００２７】モノマー９ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−ＣＯＯＨ収率 ７４％
【００２８】モノマー１０ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨ−ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯＯＨ収率 ７０％
【００２９】製造例１１ ポリマー１１の合成製造例１で合成したカルボキシエチルメタクリルアミドをラジカル重合により重合した。カルボキシエチルメタクリルアミド２ｇを２０ｍｌのＤＭＦに溶解し、和光純薬製のラジカル開始剤Ｖ65（２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル））１０ｍｇを加え窒素気流下６５℃で４時間重合した。重合物は酢酸エチルで沈殿させた後、スペクトラポア７（分子分画量 ３０００）を用い純水に対して透析し低分子量画分を除いた後凍結乾燥した。収量は１．２４ｇであった。
【００３０】ポリマー１１Ｈ−（ＣＨ2−ＣＨＣＨ3（ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ））n分子量は東ソー（株）製ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムを用い、移動相は０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）とし、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで測定した。ＰＥＧ換算分子量は約３００００であった。
【００３１】製造例１２〜２７ ペプチドモノマー１２〜２１、２３〜２７及び２９の合成上記で製造したプロペンアミド酸誘導体に細胞接着性ペプチドを結合したペプチドモノマーに使用する細胞接着性ペプチドは、固相法、液相法いずれの方法でも得ることができるが、下記のようにして固相法により製造した接着性ペプチドを使用してペプチドモノマー１２〜２１、２３〜２７及び２９を製造した。以下に各ペプチドモノマーの収率、アミノ酸分析及び質量スペクトルを示す。
【００３２】接着性ペプチドの固相法よる合成Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ方式によるペプチド合成装置を用いて合成を行なった。α−アミノ酸の保護には、Ｂｏｃ基を用いＡｒｇ-Ｇｌｙ-Ａｓｐを必須単位として含むオリゴペプチドを合成しその末端に製造例１〜１０に示したプロペン酸誘導体およびアクリル酸、メタクリル酸、エタクリル酸を縮合させた。トリフルオロメタンスルホン酸を用いて樹脂からの切断及び側鎖保護基の除去を行ない、分取用ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で精製し、単一ピークを示すプロペンアミド誘導体を得た。これを、陰イオン交換樹脂カラム（アンバーライトＩＲＡ−４００；Ｃｌ型）を通し塩酸塩とした。
【００３３】以下、アミノ酸残基、保護基、試薬について以下の略号を使用する。
【００３４】
Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニルＯＢｚｌ ：ベンジルエステルＨＯＢｔ ：ヒドロキシベンゾトリアゾールＯＳｕ ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドＯＮｂ ：ニトロベンジルエステルＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸ＤＣＣ ：ジシクロヘキシルカルボジイミドＤＣウレア ：シクロヘキシルウレアＭｔｓ ：メシチレンスルホニルＤＭＦ ：ジメチルホルムアミドＴ ：Ｔｈｒ スレオニンＲ ：Ａｒｇ アルギニンＧ ：Ｇｌｙ グリシンＤ ：Ａｓｐ アスパラギン酸Ｓ ：Ｓｅｒ セリンＰ ：Ｐｒｏ プロリンＶ ：Ｖａｌ バリンＱ ：Ｇｌｎ グルタミン
【００３５】ペプチドモノマー１２ＣＨ2＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−ＲＧＤ収率３５％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９９８２Ｇ：１．０３１９Ｄ：０．９９７１４−アミノ酪酸：１．０２４マススペクトル Ｍ+： ４８６
【００３６】ペプチドモノマー１３ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−（ＲＧＤ）2収率２４％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：１．９５６８Ｇ：２．１００４Ｄ：１．９６７３β−アラニン：１．０２５７マススペクトル Ｍ+： ８１５
【００３７】ペプチドモノマー１４ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−（ＲＧＤ）3収率１７％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：２．８３８２Ｇ：３．１１２１Ｄ：２．９４５１β−アラニン：１．０２８７マススペクトル Ｍ+： １１４４
【００３８】ペプチドモノマー１５ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−ＧＲＧＤＳ収率１０％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：１．０４８４Ｇ：２．１９６５Ｄ：１．０３３３Ｓ：１．１０３２β−アラニン：１．０４４９マススペクトル Ｍ+： ６３０
【００３９】ペプチドモノマー１６ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−ＲＧＤＳ収率 ３３％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９９８９Ｇ：１．１００８Ｄ：０．９５９６Ｓ：０．８９９１β−アラニン：１．００５４マススペクトル Ｍ+： ５７３
【００４０】ペプチドモノマー１７ＣＨ2＝ＣＣ2Ｈ5ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−ＲＧＤＳ収率 ３１％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９８７４Ｇ：０．９９２７Ｄ：０．９９３５Ｓ：０．８８６９４−アミノ酪酸：０.７４１マススペクトル Ｍ+： ６１５
【００４１】ペプチドモノマー１８ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）5−ＣＯ−ＲＧＤＳ収率 ３０％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９７５５Ｇ：１．０３６１Ｄ：０．９６７１Ｓ：０．８９４３マススペクトル Ｍ+： ６１５
【００４２】ペプチドモノマー１９ＣＨ2＝ＣＨＣＯＮＨ−（ＣＨ2）11−ＣＯ−ＲＧＤＳ収率 ２７％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９６４７Ｇ：１．０５７０Ｄ：０．９８８４Ｓ：０．８６０３マススペクトル Ｍ+： ６８６
【００４３】ペプチドモノマー２０ＣＨ2＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ（isoＣ4Ｈ9）ＣＯ−ＲＧＤＳ収率 ３１％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９８１４Ｇ：１．０５１９Ｄ：０．９７３１Ｓ：０．８９８９ロイシン：０．９８５３マススペクトル Ｍ+： ６０１
【００４４】ペプチドモノマー２１ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯ−ＲＧＤＳ）ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨ2収率 ３３％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９７７１Ｇ：１．０５０１Ｄ：０．９６５１Ｓ：０．８９６９グルタミン酸：０．９５８７マススペクトル Ｍ+： ６３０
【００４５】ペプチドモノマー２３ＣＨ2＝ＣＣ2Ｈ5ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）4−ＣＯ−ＧＲＧＤＳ収率 ３５％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９５８２Ｇ：２．０３７１Ｄ：０．９８７４Ｓ：０．８７３３マススペクトル Ｍ+： ６７２
【００４６】ペプチドモノマー２４ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯ−ＧＲＧＤＳＰ収率 ２６％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９６６９Ｇ：２．０５５２Ｄ：０．９８０９Ｓ：０．８６７７Ｐ：０．９５４６マススペクトル Ｍ+： ６５６
【００４７】ペプチドモノマー２５ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯ−ＧＧＧＲＧＤＳ収率 ３０％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９５５４Ｇ：４．００１１Ｄ：０．９３８０Ｓ：０．８５１８マススペクトル Ｍ+： ６５９
【００４８】ペプチドモノマー２６ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2ＣＯ−ＧＲＧＤＳ収率 ２４％アミノ酸分析（nmol/50μl)R: 1.0480G: 2.1073D: 0.9884S: 0.9005マススペクトル Ｍ+ ： 659
【００４９】ペプチドモノマー２７ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−ＲＧＤＴ収率 ３０％アミノ酸分析（nmol/50μl)R: 1.0612G: 0.9879D: 1.0265T: 0.8996β−アラニン : 0.9973マススペクトル Ｍ+ ： 586
【００５０】ペプチドモノマー２９ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯ−ＶＶＶＲＧＤＳ収率 １９％アミノ酸分析（nmol/50μl)R :0.9647G :1.0518D :0.9896S :1.0391V :3.0996マススペクトル Ｍ+ ：７８４
【００５１】製造例２８ ペプチドモノマー３０の合成（液相法）
ペプチドモノマー３０ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−ＲＧＤＳ上記ペプチドモノマー３０を逐次延長法により以下に記す経路で液相法で合成したペプチドを使用して製造した。
（A）Ｂｏｃ Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＯＢｚｌの合成ＢｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ）６０ｇ（０．２ｍｏｌ）を４００ｍｌの酢酸エチルに加え、さらにトリエチルアミン２１ｇ（０．２ｍｏｌ）臭化ベンジル３５．４ｇ（０．２ｍｏｌ）を加えて還流下４時間反応した。冷却後塩を濾別した後ＮａＨＣＯ3水溶液、ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。これをＮａ2ＳＯ4で乾燥した後減圧乾固し、白色粉末５４ｇ（収率６８％）を得た。
【００５２】（B）ＢｏｃＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＯＢｚｌの合成ＢｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ）ＯＢｚｌ ３０ｇ（７８ｍｍｏｌ）にＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2＝１／１ ２００ｍｌを加え室温で１時間撹拌した後、ＴＦＡとＣＨ2Ｃｌ2を減圧濃縮した。これを酢酸エチルに溶解しＮａＨＣＯ3水溶液で中和した後ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。Ｎａ2ＳＯ4で乾燥してから酢酸エチルを減圧留去した。
【００５３】この化合物と、ＢｏｃＡｓｐ（ＯＢｚｌ）ＯＳｕ ３２．８ｇ（７８ ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2５００ｍｌに溶解し終夜撹拌した。減圧下ＣＨ2Ｃｌ2を留去してから酢酸エチルに溶解した。ＮａＨＣＯ3水溶液、１Ｍクエン酸水溶液、ＮａＣｌ水溶液の順に洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥してから減圧乾固して白色粉末を４１ｇ（収率８９％）得た。
【００５４】（C）ＢｏｃＧｌｙＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＯＢｚｌの合成ＢｏｃＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＯＢｚｌ３５ｇ（５９ｍｍｏｌ）にＴＦＡ：ＣＨ2Ｃｌ2＝１：１を２００ｍｌを加えて、室温で１時間撹拌した後、ＴＦＡとＣＨ2Ｃｌ2を減圧濃縮した。これを酢酸エチルに溶解しＮａＨＣＯ3水溶液で中和した後ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥してから酢酸エチルを減圧留去した。
【００５５】この化合物とＢｏｃＧｌｙの９．８ｇ（５９ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、ＤＣＣ１２．２ｇ（５９ｍｍｏｌ）を氷冷下加え３時間撹拌してから、さらに室温で終夜撹拌した。ＤＣウレアをろ別してから減圧濃縮し酢酸エチルに溶解した。ＮａＨＣＯ3水溶液、１Ｍクエン酸水溶液、ＮａＣｌ水溶液の順に洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥してから減圧乾固して白色粉末を３０．５ｇ（収率７５％）得た。
【００５６】（D）ＢｏｃＡｒｇ（Ｍｔｓ）ＧｌｙＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＯＢｚｌの合成ＢｏｃＧｌｙＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＯＢｚｌの２５ｇ（３９ｍｍｏｌ）にＴＦＡ：ＣＨ2Ｃｌ2＝１：１の２００ｍｌを加えて室温で１時間撹拌した後、ＴＦＡとＣＨ2Ｃｌ2 を減圧濃縮した。これを酢酸エチルに溶解しＮａＨＣＯ3水溶液で中和した後ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。Ｎａ2ＳＯ4で乾燥してから酢酸エチルを減圧留去した。
【００５７】この化合物とＢｏｃＡｒｇ（Ｍｔｓ）１７．８ｇ（３９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ４００ｍｌに溶解し、ＤＣＣの８．０ｇ（３９ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔの６．８ｇ（４５ｍｍｏｌ）を氷冷下加え３時間撹拌してから、さらに室温で終夜撹拌した。ＤＣウレアを濾別してから減圧濃縮し酢酸エチルに溶解した。ＮａＨＣＯ3水溶液、１Ｍクエン酸水溶液、ＮａＣｌ水溶液の順に洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥してから減圧乾固して白色粉末を１９．５ｇ（収率５０％）得た。
【００５８】（E）ペプチドモノマー３０の合成ＢｏｃＡｒｇ（Ｍｔｓ）ＧｌｙＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＯＢｚｌの１５．０ｇ（１５ｍｍｏｌ）にＴＦＡ：ＣＨ2Ｃｌ2＝１：１ １００ｍｌ加えて室温で１時間撹拌した後、ＴＦＡとＣＨ2Ｃｌ2 を減圧濃縮した。これを酢酸エチルに溶解しＮａＨＣＯ3水溶液で中和した後ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。Ｎａ2ＳＯ4で乾燥してから酢酸エチルを減圧留去した。
【００５９】この化合物とカルボキシエチルメタクリルアミド２．４ｇ（１５ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2 ２００ｍｌに溶解しＤＣＣ３．１ｇ（１５ｍｍｏｌ）を氷冷下加え３時間撹拌してから、さらに室温で終夜撹拌した。減圧濃縮してからアセトンを加え生じたＤＣウレアをろ別した。減圧濃縮後、酢酸エチルに続いてエーテルで洗浄し、減圧乾燥して白色粉末を１０．０ｇ（収率６５％）得た。
【００６０】この化合物１０ｇ（９．８ｍｍｏｌ）のＴＦＡ溶液に、１Ｍートリフルオロメタンスルホン酸−チオアニソール−ｍ−クレゾールのＴＦＡ溶液を氷冷下加えて１時間反応させ、ペプチド側鎖および末端の保護基の脱保護を行なった。反応液をエーテル中に投入しオイル状の沈殿物を蒸留水に溶解し酢酸エチルで洗浄した後、陰イオン交換樹脂カラム（アンバーライトＩＲＡ−４００；Ｃｌ型）に通して塩酸塩とし凍結乾燥した。白色固体としてペプチドモノマー３０が４．８ｇ（収率８０％）得られた。以下にアミノ酸分析と質量スペクトルを示す。
アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９８７７Ｇ：０．９９１６Ｄ：０．９８９９Ｓ：０．８８９１β−アラニン：１．０１１５マススペクトル Ｍ+： ５７３
【００６１】製造例２９ ペプチドモノマー３１の合成ペプチドモノマー３１ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−ＲＧＤＳＧ−ＮＨ2製造例２８と同様な方法でペプチドモノマー３１を製造した。以下に製造に使用した試薬及び各収量、並びにペプチドモノマー３１のアミノ酸分析と質量スペクトルを示す。
（A）ＢｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ）ＧｌｙＮＨ2の合成 ＢｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ） ： ５９ｇ（０．２ｍｏｌ）
ＧｌｙＮＨ2・ＨＣｌ ： ２２．１ｇ（０．２ｍｏｌ）
Ｎ−メチルモルホリン ： ２０．２ｇ（０．２ｍｏｌ）
ＣＨ2Ｃｌ2 ： ８００ｍｌ ＤＣＣ ：４１．２ｇ（０．２ｍｏｌ）
（A）の収量 ５８．３ｇ（収率８３％）
【００６２】
（B）ＢｏｃＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＧｌｙＮＨ2の合成 （１）の生成物 ：５６．２ｇ（０．１６ｍｏｌ）
ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ：２００ｍｌ／２００ｍｌ ＢｏｃＡｓｐ（ＯＢｚｌ） ：５１．７ｇ（０．１６ｍｏｌ）
ＣＨ2Ｃｌ2 ：８００ｍｌ ＤＣＣ ：３３ｇ（０．１６ｍｏｌ）
（B）の収量 ７１．２ｇ（収率 ８０％）
【００６３】
（C）ＢｏｃＧｌｙＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＧｌｙＮＨ2の合成 （B）の生成物 ：６６．７ｇ（０．１２ｍｏｌ）
ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ：２００ｍｌ／２００ｍｌ ＢｏｃＧｌｙ ：５１．７ｇ（０．１２ｍｏｌ）
ＣＨ2Ｃｌ2 ：７００ｍｌ ＤＣＣ ：２４．７（０．１２ｍｏｌ）
（C）の収量 ６１．８ｇ（収率 ８４％）
【００６４】
（D）ＢｏｃＡｒｇ（Ｍｔｓ）ＧｌｙＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＧｌｙＮＨ2 の合成 （C）の生成物 ：６１．３ｇ（０．１ｍｏｌ ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ：２００ｍｌ／２００ｍｌ ＢｏｃＡｒｇ（Ｍｔｓ） ：４５．６ｇ（０．１ｍｏｌ）
ＤＭＦ ：８００ｍｌ ＤＣＣ ：２２．５（０．１ｍｏｌ）
ＨＯＢｔ ：１４ｇ（０．１ｍｏｌ）
（D）の収量 ４２．８ｇ（収率 ４５％）
【００６５】
（E）ペプチドモノマー３１の合成 （D）の生成物 ：５．０ｇ（５．３ｍｍｏｌ）
ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ：５０ｍｌ／５０ｍｌ カルボキシエチルメタクリルアミド ：０．８３ｇ（５．３ｍｍｏｌ）
ＤＭＦ ：５０ｍｌ ＤＣＣ ：１．１ｇ（５．３ｍｍｏｌ）
ＨＯＢｔ ：０．７２ｇ（５．３ｍｍｏｌ）
１Ｍ−トリフルオロメタンスルホン酸−チオアニソール− ｍ−クレゾールのＴＦＡ溶液： ２５０ｍｌ アンバーライトＩＲＡ−４００；Ｃｌ型処理ペプチドモノマー３１の収量 ２．２９ｇ（収率 ６５％）
アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９５１７Ｇ：２．１００４Ｄ：０．９７５３Ｓ：０．８９２６β−アラニン：１．０１４３マススペクトル Ｍ+： ６２９
【００６６】製造例３０ ペプチドモノマー２２の合成ペプチドモノマー２２ＣＨ2＝ＣＨＣＯ−ＧＧＲＧＤＳ−ＮＨ2 製造例２９と同様な方法で上記ペプチドモノマー２２を製造した。以下に製造に使用した試薬及び各収量並びにペプチドモノマー２２のアミノ酸分析と質量スペクトルを示す。
（A) BocAsp(OBzl)Ser(Bzl)NH2の合成BocAsp(OBzl) ： 32.3 g (0.1 mol)Ser(Bzl)NH2 HCl ： 23.0 g (0.1 mol)N-メチルモルフォリン ： 10.1 g (0.1 mol)CH2Cl2 ： 500 mlDCC ： 20.6 g (0.1 mol)(A)の収量 44.2 g （収率 88 ％）
【００６７】(B)BocGlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)NH2 の合成(A)の生成物 ：25.0 g (0.05 mol)TFA/CH2Cl2 ：150 ml/150 mlBocGly ： 8.75 g (0.01 mol)CH2Cl2 ： 300 mlDCC ：10.3 g (0.05 mol)(B)の収量 26.1 g （収率 91 ％）
【００６８】(C)BocArg(Mts)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)NH2 の合成（B）の生成物 ： 17.3 g (0.03 mol)TFA/CH2Cl2 ： 100 ml/100mlBocArg(Mts) ：13.7 g (0.03mol)DMF ：250 mlDCC ：6.18 g (0.03 mol)HOBt ：4.0 g (0.03mol)(c)の収量 17.5 g （収率 63 ％）
【００６９】(D)BocGlyArg(Mts)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)NH2の合成(C)の生成物 ：9.3 g (0.01 mol)TFA/CH2Cl2 ： 100 ml/100mlBocGly ： 1.75 g (0.01 mol)DMF ： 80 mlDCC ： 2.06 g (0.01 mol)HOBt ： 1.36 g (0.01mol)(D)の収量 6.53 g （収率 65 ％）
【００７０】(E)BocGlyGlyArg(Mts)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)NH2 の合成(D) の生成物 ： 5.02 g (0.005 mol)TFA/CH2Cl2 ： 50 ml/50 mlBocGly ： 0.88 g (0.005 mol)DMF ： 200 mlDCC ： 1.03 g (0.005 mol)HOBt ： 0.68 g (0.005 mol)(e)の収量 3.84 g （収率 70 ％）
【００７１】(F) ペプチドモノマー２２の合成(E) の生成物 ： 3.23 g (0.003 mol)TFA/CH2Cl2 ： 40 ml/40 mlメタクリル酸 ：0.22 g (0.003 mol)DMF ： 60 mlDCC ： 0.62 g (0.003 mol)HOBt ： 0.41 g (0.003 mol)1M−トリフルオロメタンスルホン酸−チオアニソール−m-クレゾールのＴＦＡ溶液： 25 mlアンバーライトIRA-400;Cl型処理ペプチドモノマー22の収量 2.6 gアミノ酸分析（nmol/50μl)R: 0.9845G: 3.1361D: 0.9554S: 0.8879マススペクトル Ｍ+ : 600
【００７２】製造例３１ ペプチドモノマー２８の合成ペプチドモノマー２８ＣＨ2＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−ＲＧＤＳＰ−Ｎ（ＣＨ3）2製造例３０と同様の方法でペプチドモノマー２８を製造した。以下に製造に使用した試薬及び各収量、並びにペプチドモノマー２８のアミノ酸分析と質量スペクトルを示す。
【００７３】(A)BocSer(Bzl)ProN(CH3)2の合成BocSer(Bzl) ：29.5 g (0.1mol)ProN(CH3)2 HCl ：17.8 g (0.1 mol)Ｎ−メチルモルホリン ：10.1 g (0.1 mol)CH2Cl2 ：500 mlDCC ：20.6 g (0.1 mol)(A)の収量 31.6 g （収率 45 ％）
【００７４】(B) BocAsp(OBzl)Ser(Bzl)ProN(CH3)2の合成（A)の生成物 ： 22.8 g (0.05 mol)TFA/CH2Cl2 ： 150 ml/ 150 mlBocAsp(OBzl) ： 16.2 g (0.05 mol)CH2Cl2 ：500 mlDCC ： 10.3 g (0.05mol)(B)の収量 24.8 g （収率 79 ％）
【００７５】(C)BocGlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)ProN(CH3)2 の合成(B) の生成物 ： 12.5 g (0.02 mol)TFA/CH2Cl2 ： 150 ml/150 mlBocGly ： 3.5 g (0.02mol)CH2Cl2 ： 350 mlDCC ： 4.1 g (0.02 mol)(C)の収量 10.2 g （収率 75 ％）
【００７６】(D)BocArg(Mts)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)ProN(CH3)2 の合成(C) の生成物 ： 6.8 g (0.01 mol)TFA/CH2Cl2 ：100 ml/100mlBocArg(Mts) ：4.6 g (0.01 mol)DMF ：150 mlDCC ：2.06 g (0.01mol)HOBt ：1.36 g (0.01mol)(D)の収量 5.8 g （収率 57 ％）
【００７７】(E) ペプチドモノマー２８の合成(D) の生成物 ： 1.02 g (0.001 mol)TFA/CH2Cl2 ： 100 ml/100 mlカルボキシエチルメタクリルアミド： 0.143 g (0.001 mol)DMF ： 100 mlDCC ： 0.206 g (0.001 mol)HOBt ： 0.13 g (0.00mol)1M−トリフルオロメタンスルホン酸−チオアニソール−m-クレゾールのTFA溶液 ： 50 mlペプチドモノマー28の収量 0.6 gアミノ酸分析（nmol/50μl)R : 1.0761G : 1.0049D : 0.9959P : 1.0834マススペクトル Ｍ+ : 611
【００７８】製造例３２ 目的物（本発明のプロペンアミド誘導体重合物）３２の合成ペプチドモノマー１５の５００ｍｇを水５ｍｌに溶解し、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整した後、開始剤として過硫酸カリウム２．５ｍｇと亜硫酸水素ナトリウム１．０ｍｇを加え窒素気流下２０℃で２０時間重合し目的物３２を得た。
【００７９】スペクトラポア７分子分画量３０００を用いて純水に対して透析し低分子量分を除いた後凍結乾燥させた（収量２４０ｍｇ）。ゲルクロマトグラフィーにより目的物３２の分子量分画を行なった。分子量は製造例１１と同様の方法で測定した。
画分１ 分子量約 ４８０００ （目的物３２−１）
画分２ 分子量約 ２１０００ （目的物３２−２）
画分３ 分子量約 １２０００ （目的物３２−３）
【００８０】製造例３３ 目的物３２−４の合成（開始剤量の変更）
上記製造例３２において開始剤を下記のものに変更してペプチドモノマー１５の重合を行い、目的物３４−４を製造した。下記に収量と分子量を示す。
開始剤 過硫酸カリウム１０ｍｇ亜硫酸水素ナトリウム４ｍｇ収量 １８０ｍｇ（目的物３２−４）
分子量 約５０００
【００８１】製造例３４〜５２ 目的物３３〜５１の合成製造例３２及び３３と同様の方法でペプチドモノマー１２〜１４及び１６〜３１の重合を行ない、目的物３３〜５１を製造した。各ポリマーの収量及び分子量を以下に示す。
──────────────────────────────── 目的物No. モノマーNo. ポリマー収量(mg) 分子量 ──────────────────────────────── ３３ １２ ２３０ １５０００ ３４ １３ １８０ １３０００ ３５ １４ １９０ １５０００ ３６ １６ １５０ １１０００ ３７ １７ ２４０ １６０００ ３８ １８ １２０ ８０００ ３９ １９ １７０ １００００ ４０ ２０ １４０ ９０００ ４１ ２１ １７０ １１０００ ４２ ２２ １３０ １２０００ ４３ ２３ １５０ ９０００ ４４ ２４ １４０ ８０００ ４５ ２５ １３０ ８０００ ４６ ２６ １７０ １００００ ４７ ２７ ２００ １５０００ ４８ ２８ １９０ １３０００ ４９ ２９ １５０ １００００ ５０ ３０ １２０ １５０００ ５１ ３１ １８０ ７５００ ────────────────────────────────
【００８２】試験例１（実験的肺転移）
以下のような試験を行い、本発明の化合物の癌転移阻止作用について検討した。目的物３２−３、目的物３２−４、目的物３５、目的物３７、目的物３９、目的物４０、目的物４４、目的物４６、目的物４９、目的物５０を各々１０００μgと、非常に転移性の強い癌細胞であるB16-BL6 メラノーマ細胞を各々PBS中で混合後、その０.2mlを１群５匹のC57BL/6の雄マウスに静脈注射した。注射された混合物0.2 ml中にはB16-BL6 細胞が５×104 個含まれていた。投与１４日後にマウスの肺における癌細胞コロニー数を数えて対照のPBS投与群と比較した（実験１）。その結果を表１に示す。この結果から明らかな通り、目的物３２、３５、３９、４０、４４、４６、４９あるいは５０の投与により肺への癌転移は顕著に抑制された。これに対して、Arg-Gly-Asp 及び接着性ペプチドを含まないポリマー１１の投与ではそのような転移の抑制は見られなかった。同表に示すように,本発明の化合物中の活性ペプチドArg-Gly-Aspや Arg-Gly-Asp-Ser 等の含量が４００〜９００μg/1000μgであることを考慮すると、少ない量で高い効果を発現していることがわかる。
【００８３】更に、目的物３２、３５、３７、４７、５０の投与量をそれぞれ５００μgに減じて上記実験１と同様の方法でマウスに投与したときの効果を検討した（実験２）。表１に示す結果によれば、本発明の化合物はいずれも、対照のPBS投与群に比べて顕著な転移抑制効果を示した。また、本発明の化合物群をB16-BL 6細胞と混合せずにB16-BL 6細胞を投与した５分後にマウスに静脈投与しても、やはり高い転移抑制効果が得られた。この結果は、本発明の化合物を静脈注射等の適当な方法で投与して、癌の転移抑制効果が得られることを示している。
【００８４】
表１ B16-BL6メラノーマ細胞の注射で誘発された癌の実験的肺転移に対するポ リペプチドの効果────────────────────────────────────投与化合物 投与時** 投与量 肺への転移数 有効ペプチド含量 （μg） 平均±SD（範囲） （μg/投与量）
────────────────────────────────────実験１ＰＢＳ（未処理）同時 −−−− 85±20 (53-101) 目的物３２−３ 同時 １０００ 14±３ (11-18)* 676目的物３２−４ 同時 １０００ 16±13 (2-33)* 676 目的物 ３５ 同時 １０００ 20±７ (6-12)* 910 目的物 ３７ 同時 １０００ 16±６ (8-14)* 706 目的物 ３９ 同時 １０００ 18±８ (8-13)* 619 目的物 ４０ 同時 １０００ 25±９ (12-25)* 738 目的物 ４４ 同時 １０００ 21±10 (10-22)* 894 目的物 ４６ 同時 １０００ 12±９ (4-19)* 652 目的物 ４９ 同時 １０００ 22±10 (6-29)* 552 目的物 ５０ 同時 １０００ 8±５ (2-12)* 753 ＲＧＤ 同時 １０００ 66±16 (13-20) ＲＧＤＳ 同時 １０００ 42±18 (14-60)* ＧＲＧＤＳ 同時 １０００ 40±15 (26-59) ＧＧＲＧＤＳＰ 同時 １０００ 45±20 (28-70) ポリマー１１ 同時 １０００ 74±14 (57-89)
【００８５】
実験２ＰＢＳ（未処理）同時 −−−− 64±11 (48-85) 目的物３２−３ 同時 ５００ 21±８ (12-24)* 別個 ５００ 30±９ (18-27)* 目的物 ３５ 同時 ５００ 16±13 (2-33) 別個 ５００ 19±８ (13-29)* 目的物 ３７ 同時 ５００ 20±６ (13-28) 目的物 ４７ 同時 ５００ 14±５ (8-18)* 目的物 ５０ 同時 ５００ 13±４ (8-18)* ──────────────────────────────────── * t検定で未処理対照と比較して p＜0.001** 「同時」は投与化合物と癌細胞を同時に注射したことを示し、「別個」は投与化合物と癌細胞を別々に注射したことを示す。
【００８６】試験例２ 自然転移モデルによる癌転移抑制効果さらに本発明の化合物群が癌の転移を抑制することを自然転移モデルによって確認した。即ち、B16-BL6細胞を１群５匹のC57BL/マウスの足踵に移植し、移植後一定期間内に本発明の化合物群を５０μgまたは１００μgを移植癌部に直接単回あるいは複数回局所投与した。移植後２１日目に癌部を切除し、その２週間後にマウスを解剖し肺への癌の転移を調べた。その結果を表２に示す。癌移植後７日目に本発明の化合物群を１００μgを単回投与しその後２日毎に複数回投与することにより、または７、１０、１３、及び１６日目に５０μgずつ複数回投与することにより、移植癌自体の増殖は抑制されなかったものの、肺への癌の転移は顕著に抑制された。
【００８７】
表２ 足踵に投与したＢ１６−ＢＬ６メラノーマ細胞の自然肺転移モデルにおけ るプロペンアミド誘導体重合物の抑制効果────────────────────────────────────投与化合物 投与量 投与日 ２１日目における （μg/マウス) 移植癌の大き 肺への転移数 さ（mm±SD) 平均±SD（範囲）
────────────────────────────────────未処理（PBS) 12±2 50±20(28ー86) 目的物32-3 100x7 7,9,11,13,15,17,19 12±2 24±12(5-36)目的物32-4 同上 同上 11±1 19±10(9ー36)目的物35 同上 同上 12±2 20±8(10ー31)目的物36 同上 同上 11±2 26±8(19ー43)目的物37 50X4 7,10,13,16 11±2 18±9(8-31) 目的物39 100x7 7,9,11,13,15,17,19 13±3 20±6(15-27)目的物42 同上 同上 12±2 9±5(1ー16) 目的物44 同上 同上 13±3 12±6(7ー22) 目的物49 同上 同上 13±3 17±7(7ー28) 目的物50 同上 同上 13±3 7±3(3ー10) RGDS 同上 同上 12±2 62±13(41ー77) GGRGDSP 同上 同上 12±2 45±17(26ー64) ──────────────────────────────────── * スチューデントのt検定で未処理群に対して p＜0.001
【００８８】試験例３ 毒性上記の試験において、本発明の化合物群は、宿主マウスの赤血球細胞や脾臓及び胸腺細胞に対する細胞毒性や血清蛋白質に対する好ましくない凝集作用を有しないことが確認された。
【００８９】
【発明の効果】以上説明した通り、本発明のプロペンアミド誘導体重合物は、細胞接着性蛋白質のコア配列に比べて細胞接着性が大きく、癌転移抑制作用等の種々の生物活性を有し、毒性の問題も殆どない。また、その構造も単純であり合成も容易であり、医薬としての価値は高いものである。
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ａｒｇ-Ｇｌｙ-Ａｓｐのトリペプチドを必須単位として有するプロペンアミド誘導体の重合物またはその薬理学的に許容される塩の癌転移抑制剤としての用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】フィブロネクチンは細胞−細胞外基質の接着に関与する蛋白質であり、血小板凝集や癌転移にも関与していると考えられている。これらの相互作用は一連の細胞表面のレセプターにより仲介され、フィブロネクチンは分子量約２５万の巨大分子であるにもかかわらず、これらのレセプターはその中のArg-Gly-Asp配列を特異的に認識することが明らかにされ、レセプターとの相互作用に重要なものであることが報告されている（ネイチャー(Nature)、第309巻、30頁、1984年）。このArg-Gly-Asp配列はビトロネクチン等の他の接着性蛋白質にも存在しており、フィブロネクチンは上記コア配列を介して、被接着細胞のレセプターと接合し、その情報を接着細胞に伝達する。また、ヘパリン、コラーゲン、フィブリン等の生体高分子との結合能も有し、細胞と間質結合組織との接着、細胞の分化、増殖に関与しているとも考えられている。この様に、細胞接着活性蛋白質は、種々の生物活性を有するため、医薬、医用材料への応用が検討されている。
【０００３】例えば、Arg-Gly-Asp 配列を有する種々の鎖状および環状のオリゴペプチドを用いて血小板凝集を阻害する方法（高分子学会予稿集(Polymer Preprints, Japan)、第38巻、3149頁、1989年、特開平2-174797号）、Arg-Gly-Asp 配列を有するペプチドを細胞移動抑制剤として用いる方法（特開平2-4716号）、Arg-Gly-Aspを固定化したPMMA膜を細胞接着膜として用いる方法(高分子学会予稿集(Polymer Preprints,Japan)、第37巻、705頁、1988年）が報告されている。また、ポリマーにArg-Gly-Aspを必須構成単位とするペプチドを共有結合させ、動物細胞培養基体、生体複合人工臓器用基体として用いる方法（特開平1-309682号、特開平1-305960号）、Arg-Gly-Asp-Ser配列を有するポリペプチドを体外血液用血小板保護剤として用いる方法（特開昭64-6217号）等も開示されている。
【０００４】さらに近年、細胞接着活性蛋白質は、癌転移に関係する物質としても注目されてきている。癌転移の一連の段階において、癌細胞は種々の宿主細胞や生体高分子と接触する。このときフィブロネクチンのような細胞接着分子が存在すると、該細胞は多細胞塊を形成し、癌細胞の増殖や生存をより容易にする。ところがこの際、フィブロネクチンの接着コアであるトリペプチドArg-Gly-Aspが共存すると、競争的に癌細胞上のレセプターと接合することにより癌転移阻害活性を示すことが報告されている（サイエンス、第２３８巻、４６７ページ、１９８６年）。更に、効果の増強をはかる目的で、この配列を有するオリゴペプチド、環状オリゴペプチド、あるいはその繰り返し構造を有するポリペプチドを用いた癌転移抑制方法も開示されている((Int.J.Biol.Macromol.)、第11巻、23頁、1989年、同誌、第11巻、226頁、1989年、(Jpn.J.Cancer Res.)第60巻、722頁、1989年、特開平2-174797号）。
【０００５】上述のように、フィブロネクチン等の細胞接着活性蛋白質あるいはそのペプチド断片は様々な生物活性を有しておりその関連物質を医薬品として応用する技術の開発が望まれていた。特に、接着コア配列の癌転移抑制作用は医薬品として応用価値が高い物と考えられる。そこで、本発明者らは高分子物質が多様な性状、機能を有し生体との間で示される相互作用も低分子の場合と非常に異なっていることに着目し、接着コア配列の持つ生物活性を充分に保持し、血流中でより安定で、重大な副作用も示さず且つ合成も容易な新規な化合物を求めて鋭意研究を行なった結果、Arg-Gly-Aspのトリペプチドを必須単位として有する新規な水溶性プロペンアミド誘導体重合物とその薬理学的に許容される塩を見出し本研究を完成したのである。
【０００６】尚、細胞接着分子の不溶性高分子基体への連結という観点でArg-Gly-Aspを必須単位とするオリゴペプチドを高分子担体に導入した例は見られるが、活性増強や安定性向上を目的として、Arg-Gly-Aspを必須単位とするオリゴペプチドを側鎖に有する水溶性のプロペンアミド誘導体重合物を癌転移抑制剤へ応用する例は知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的は、レセプターの結合能の増強および血液中での安定化が図られ、かつより簡便な手法で生産可能なArg-Gly-Aspのトリペプチドを必須単位として有する新規なプロペンアミド誘導体の重合物とその薬理学的に許容される塩を含有する医薬組成物を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】従って本発明は、下記一般式（Ｉ）で表されるプロペンアミド誘導体の重合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有してなる癌転移抑制剤である。
一般式（Ｉ）
H2C=CR1-CO-［NH-R2-CO］-(［Ｘ］- Arg-Gly-Asp-［Ｙ］）n -Z
【０００９】式中、Ｒ1は水素原子、メチル基、エチル基を表し、Ｒ2は炭素数が１〜１１の直鎖又は分岐のアルキレン基を表し、該アルキレン基中の炭素原子は−Ｏ−を介して連結していてもよい。Ｘ，ＹはＳｅｒ，Ｇｌｙ，Ｖａｌ，Ｔｈｒ，Ｐｒｏ及びＧｌｎから選択されるアミノ酸残基またはこれらのアミノ酸残基から構成されるペプチド残基を表し、Ｚは−ＯＨ，−ＯＲ3，−ＮＲ4Ｒ5を表し、Ｒ3,Ｒ4,Ｒ5は水素原子、メチル、エチル基の中から選択される。ｎは１〜３の整数を表す。また、式中の［ ］は［ ］内の残基が存在してもしなくてもよいことを示す。
【００１０】プロペンアミド誘導体の重合物またはその塩の平均分子量は、好ましくは１０万以下、特に好ましくは５０００〜５万の範囲で、室温で水溶性であることが好ましい。本発明のプロペンアミド誘導体重合物に含まれる接着性ペプチドに用いられるアミノ酸はＬ体、Ｄ体どちらでもよいが、好ましくはＬ体である。
【００１１】本発明のプロペンアミド誘導体重合物の塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩等の無機酸との塩や、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩等の有機酸との塩が挙げられ、そのような塩への変換は慣用手段で行なうことができる。
【００１２】ペプチド合成方法は特に限定されないが、液相法、固相法、および自動合成装置による合成方法が挙げられる。これらの合成方法の詳細については、生化学実験講座「タンパク質の化学IV」ｐ２０７−４９５（日本生化学会編、東京化学同人）、「続生化学実験講座タンパク質の化学（下）」（日本生化学会編、東京化学同人）、「ペプチド合成の基礎と実験」（泉屋等編、丸善）に記載されている。また、市販されている合成ペプチドを利用することも可能である。
【００１３】プロペン酸誘導体と細胞接着性ペプチドとの結合方法としては、活性エステル法、混合酸無水物法、アジド法、酸塩化物法、対称酸無水物法、ＤＣＣ法、ＤＣＣ−添加物法、カルボニルジイミダゾール法等を利用したアミド結合合成方法が挙げられる。さらに、プロペンアミド誘導体の重合物は一般のラジカル重合法、イオン重合法により得られる。重合物はゲル濾過法、透析法、その他既知の方法により特定の分子量分画を行なうことができる。
【００１４】本発明のプロペンアミド誘導体の重合物またはその塩は、細胞接着性蛋白質のコア配列Ａｒｇ-Ｇｌｙ-Ａｓｐを有し、該コア配列を介して細胞接着性蛋白質と同様の機序で細胞に接着する。そのため、細胞接着性蛋白のアゴニストまたはアンタゴニストとして種々の生理活性を示し、免疫調整作用、創傷治癒作用、毛細血管中で起こる癌細胞による血小板凝集抑制作用、神経疾患治癒作用などの広範な生物活性が認められている。従って、本発明のプロペンアミド誘導体の重合物またはその塩は、その少なくとも一種を、場合により慣用の担体または医薬用助剤とともに、癌転移抑制剤、創傷治癒剤、免疫調整剤、血小板凝集粘着抑制剤として患者に投与することが可能である。その投与量は、非経口投与の場合、０．２μｇ／ｋｇ（体重）〜４００ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲、経口投与の場合、０．６μｇ／ｋｇ（体重）〜１．２ｇ／ｋｇ（体重）の範囲で、症状、年齢、体重等に基づいて決定される。
【００１５】本発明のプロペンアミド誘導体の重合物またはその塩は、非経口、経口のいずれの経路によっても投与可能であるが、ペプチド系医薬に一般に使用されている投与方法、即ち、非経口投与方法、例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等によって投与するのが好ましい。そのような投与方法に用いられる注射用製剤を製造する場合、本発明のプロペンアミド誘導体の重合物またはその塩を、例えば、後記実施例で示すようにＰＢＳまたは生理食塩水に溶解して注射用製剤としてもよく、あるいは０．１Ｎ程度の酢酸水等に溶解した後、凍結乾燥製剤としてもよい。このような製剤には、グリシンやアルブミン等の慣用の安定剤を添加してもよい。さらに、本発明のプロペンアミド誘導体の重合物またはその塩は、例えばリポソーム中に包容したマイクロカプセル剤あるいはミクロスフェア状、ハイドロゲル状とすれば、経口投与することも可能であり、座剤、舌下錠、点鼻スプレー剤等の形にすれば、消化菅以外の粘膜からも吸収させることも可能である。
【００１６】
【実施例】以下実施例により本発明を詳細に説明するが本発明はこれに限定されるものではない。
【００１７】製造例１ モノマー１の合成β−アラニン１７．８ｇ（０．２ｍｏｌ）の水酸化ナトリウム水溶液にメタクリル酸クロリド２０．９ｇ（０．２ｍｏｌ）を氷冷下滴下し、４時間撹拌後塩酸により中和した。減圧濃縮により濃縮し沈殿した塩化ナトリウムをろ別した。濃縮液をクロロホルムで抽出し、乾燥後減圧濃縮してクロロホルムを留去した。濃縮物をエーテルで洗浄しモノマー１を白色固体として１７．６ｇ得た（収率５６％）。
【００１８】モノマー１ＣＨ2＝ＣＣＨ3−ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＯＨ
【００１９】製造例２〜１０ モノマー２〜１０の合成製造例１と同様の方法によりアクリル酸クロリドと４−アミノ酪酸、エタクリル酸クロリドと５−アミノ吉草酸、メタクリル酸と６−アミノカプロン酸、アクリル酸と１２−アミノラウリン酸、アクリル酸とロイシン、メタクリル酸とグルタミン、アクリル酸と２（２−アミノエトキシ）プロピオン酸、メタクリル酸と２（２−アミノエトキシ）酢酸、メタクリル酸とグリシルグリシンとの反応により以下のプロペン酸誘導体を製造した。
【００２０】モノマー２ＣＨ2＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＯＨ収率 ５２％
【００２１】モノマー３ＣＨ2＝ＣＣ2Ｈ5ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＯＨ収率 ６１％
【００２２】モノマー４ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ収率 ６９％
【００２３】モノマー５ＣＨ2＝ＣＨＣＯＮＨ−（ＣＨ2）11−ＣＯＯＨ収率 ７１％
【００２４】モノマー６ＣＨ2＝ＣＨＣＯＮＨ−ＣＨ（iso-Ｃ4Ｈ9）−ＣＯＯＨ収率 ６４％
【００２５】モノマー７ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨ2収率 ５９％
【００２６】モノマー８ＣＨ2＝ＣＨＣＯＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−０−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＯＨ収率 ６８％
【００２７】モノマー９ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−ＣＯＯＨ収率 ７４％
【００２８】モノマー１０ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨ−ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＯＯＨ収率 ７０％
【００２９】製造例１１ ポリマー１１の合成製造例１で合成したカルボキシエチルメタクリルアミドをラジカル重合により重合した。カルボキシエチルメタクリルアミド２ｇを２０ｍｌのＤＭＦに溶解し、和光純薬製のラジカル開始剤Ｖ65（２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル））１０ｍｇを加え窒素気流下６５℃で４時間重合した。重合物は酢酸エチルで沈殿させた後、スペクトラポア７（分子分画量 ３０００）を用い純水に対して透析し低分子量画分を除いた後凍結乾燥した。収量は１．２４ｇであった。
【００３０】ポリマー１１Ｈ−（ＣＨ2−ＣＨＣＨ3（ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ））n分子量は東ソー（株）製ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムを用い、移動相は０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）とし、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで測定した。ＰＥＧ換算分子量は約３００００であった。
【００３１】製造例１２〜２７ ペプチドモノマー１２〜２１、２３〜２７及び２９の合成上記で製造したプロペンアミド酸誘導体に細胞接着性ペプチドを結合したペプチドモノマーに使用する細胞接着性ペプチドは、固相法、液相法いずれの方法でも得ることができるが、下記のようにして固相法により製造した接着性ペプチドを使用してペプチドモノマー１２〜２１、２３〜２７及び２９を製造した。以下に各ペプチドモノマーの収率、アミノ酸分析及び質量スペクトルを示す。
【００３２】接着性ペプチドの固相法よる合成Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ方式によるペプチド合成装置を用いて合成を行なった。α−アミノ酸の保護には、Ｂｏｃ基を用いＡｒｇ-Ｇｌｙ-Ａｓｐを必須単位として含むオリゴペプチドを合成しその末端に製造例１〜１０に示したプロペン酸誘導体およびアクリル酸、メタクリル酸、エタクリル酸を縮合させた。トリフルオロメタンスルホン酸を用いて樹脂からの切断及び側鎖保護基の除去を行ない、分取用ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で精製し、単一ピークを示すプロペンアミド誘導体を得た。これを、陰イオン交換樹脂カラム（アンバーライトＩＲＡ−４００；Ｃｌ型）を通し塩酸塩とした。
【００３３】以下、アミノ酸残基、保護基、試薬について以下の略号を使用する。
【００３４】
Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニルＯＢｚｌ ：ベンジルエステルＨＯＢｔ ：ヒドロキシベンゾトリアゾールＯＳｕ ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドＯＮｂ ：ニトロベンジルエステルＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸ＤＣＣ ：ジシクロヘキシルカルボジイミドＤＣウレア ：シクロヘキシルウレアＭｔｓ ：メシチレンスルホニルＤＭＦ ：ジメチルホルムアミドＴ ：Ｔｈｒ スレオニンＲ ：Ａｒｇ アルギニンＧ ：Ｇｌｙ グリシンＤ ：Ａｓｐ アスパラギン酸Ｓ ：Ｓｅｒ セリンＰ ：Ｐｒｏ プロリンＶ ：Ｖａｌ バリンＱ ：Ｇｌｎ グルタミン
【００３５】ペプチドモノマー１２ＣＨ2＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−ＲＧＤ収率３５％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９９８２Ｇ：１．０３１９Ｄ：０．９９７１４−アミノ酪酸：１．０２４マススペクトル Ｍ+： ４８６
【００３６】ペプチドモノマー１３ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−（ＲＧＤ）2収率２４％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：１．９５６８Ｇ：２．１００４Ｄ：１．９６７３β−アラニン：１．０２５７マススペクトル Ｍ+： ８１５
【００３７】ペプチドモノマー１４ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−（ＲＧＤ）3収率１７％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：２．８３８２Ｇ：３．１１２１Ｄ：２．９４５１β−アラニン：１．０２８７マススペクトル Ｍ+： １１４４
【００３８】ペプチドモノマー１５ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−ＧＲＧＤＳ収率１０％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：１．０４８４Ｇ：２．１９６５Ｄ：１．０３３３Ｓ：１．１０３２β−アラニン：１．０４４９マススペクトル Ｍ+： ６３０
【００３９】ペプチドモノマー１６ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−ＲＧＤＳ収率 ３３％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９９８９Ｇ：１．１００８Ｄ：０．９５９６Ｓ：０．８９９１β−アラニン：１．００５４マススペクトル Ｍ+： ５７３
【００４０】ペプチドモノマー１７ＣＨ2＝ＣＣ2Ｈ5ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−ＲＧＤＳ収率 ３１％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９８７４Ｇ：０．９９２７Ｄ：０．９９３５Ｓ：０．８８６９４−アミノ酪酸：０.７４１マススペクトル Ｍ+： ６１５
【００４１】ペプチドモノマー１８ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）5−ＣＯ−ＲＧＤＳ収率 ３０％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９７５５Ｇ：１．０３６１Ｄ：０．９６７１Ｓ：０．８９４３マススペクトル Ｍ+： ６１５
【００４２】ペプチドモノマー１９ＣＨ2＝ＣＨＣＯＮＨ−（ＣＨ2）11−ＣＯ−ＲＧＤＳ収率 ２７％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９６４７Ｇ：１．０５７０Ｄ：０．９８８４Ｓ：０．８６０３マススペクトル Ｍ+： ６８６
【００４３】ペプチドモノマー２０ＣＨ2＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ（isoＣ4Ｈ9）ＣＯ−ＲＧＤＳ収率 ３１％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９８１４Ｇ：１．０５１９Ｄ：０．９７３１Ｓ：０．８９８９ロイシン：０．９８５３マススペクトル Ｍ+： ６０１
【００４４】ペプチドモノマー２１ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨＣＨ（ＣＯ−ＲＧＤＳ）ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨ2収率 ３３％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９７７１Ｇ：１．０５０１Ｄ：０．９６５１Ｓ：０．８９６９グルタミン酸：０．９５８７マススペクトル Ｍ+： ６３０
【００４５】ペプチドモノマー２３ＣＨ2＝ＣＣ2Ｈ5ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）4−ＣＯ−ＧＲＧＤＳ収率 ３５％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９５８２Ｇ：２．０３７１Ｄ：０．９８７４Ｓ：０．８７３３マススペクトル Ｍ+： ６７２
【００４６】ペプチドモノマー２４ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯ−ＧＲＧＤＳＰ収率 ２６％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９６６９Ｇ：２．０５５２Ｄ：０．９８０９Ｓ：０．８６７７Ｐ：０．９５４６マススペクトル Ｍ+： ６５６
【００４７】ペプチドモノマー２５ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯ−ＧＧＧＲＧＤＳ収率 ３０％アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９５５４Ｇ：４．００１１Ｄ：０．９３８０Ｓ：０．８５１８マススペクトル Ｍ+： ６５９
【００４８】ペプチドモノマー２６ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2ＣＯ−ＧＲＧＤＳ収率 ２４％アミノ酸分析（nmol/50μl)R: 1.0480G: 2.1073D: 0.9884S: 0.9005マススペクトル Ｍ+ ： 659
【００４９】ペプチドモノマー２７ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−ＲＧＤＴ収率 ３０％アミノ酸分析（nmol/50μl)R: 1.0612G: 0.9879D: 1.0265T: 0.8996β−アラニン : 0.9973マススペクトル Ｍ+ ： 586
【００５０】ペプチドモノマー２９ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯ−ＶＶＶＲＧＤＳ収率 １９％アミノ酸分析（nmol/50μl)R :0.9647G :1.0518D :0.9896S :1.0391V :3.0996マススペクトル Ｍ+ ：７８４
【００５１】製造例２８ ペプチドモノマー３０の合成（液相法）
ペプチドモノマー３０ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−ＲＧＤＳ上記ペプチドモノマー３０を逐次延長法により以下に記す経路で液相法で合成したペプチドを使用して製造した。
（A）Ｂｏｃ Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＯＢｚｌの合成ＢｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ）６０ｇ（０．２ｍｏｌ）を４００ｍｌの酢酸エチルに加え、さらにトリエチルアミン２１ｇ（０．２ｍｏｌ）臭化ベンジル３５．４ｇ（０．２ｍｏｌ）を加えて還流下４時間反応した。冷却後塩を濾別した後ＮａＨＣＯ3水溶液、ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。これをＮａ2ＳＯ4で乾燥した後減圧乾固し、白色粉末５４ｇ（収率６８％）を得た。
【００５２】（B）ＢｏｃＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＯＢｚｌの合成ＢｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ）ＯＢｚｌ ３０ｇ（７８ｍｍｏｌ）にＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2＝１／１ ２００ｍｌを加え室温で１時間撹拌した後、ＴＦＡとＣＨ2Ｃｌ2を減圧濃縮した。これを酢酸エチルに溶解しＮａＨＣＯ3水溶液で中和した後ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。Ｎａ2ＳＯ4で乾燥してから酢酸エチルを減圧留去した。
【００５３】この化合物と、ＢｏｃＡｓｐ（ＯＢｚｌ）ＯＳｕ ３２．８ｇ（７８ ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2５００ｍｌに溶解し終夜撹拌した。減圧下ＣＨ2Ｃｌ2を留去してから酢酸エチルに溶解した。ＮａＨＣＯ3水溶液、１Ｍクエン酸水溶液、ＮａＣｌ水溶液の順に洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥してから減圧乾固して白色粉末を４１ｇ（収率８９％）得た。
【００５４】（C）ＢｏｃＧｌｙＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＯＢｚｌの合成ＢｏｃＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＯＢｚｌ３５ｇ（５９ｍｍｏｌ）にＴＦＡ：ＣＨ2Ｃｌ2＝１：１を２００ｍｌを加えて、室温で１時間撹拌した後、ＴＦＡとＣＨ2Ｃｌ2を減圧濃縮した。これを酢酸エチルに溶解しＮａＨＣＯ3水溶液で中和した後ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥してから酢酸エチルを減圧留去した。
【００５５】この化合物とＢｏｃＧｌｙの９．８ｇ（５９ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、ＤＣＣ１２．２ｇ（５９ｍｍｏｌ）を氷冷下加え３時間撹拌してから、さらに室温で終夜撹拌した。ＤＣウレアをろ別してから減圧濃縮し酢酸エチルに溶解した。ＮａＨＣＯ3水溶液、１Ｍクエン酸水溶液、ＮａＣｌ水溶液の順に洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥してから減圧乾固して白色粉末を３０．５ｇ（収率７５％）得た。
【００５６】（D）ＢｏｃＡｒｇ（Ｍｔｓ）ＧｌｙＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＯＢｚｌの合成ＢｏｃＧｌｙＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＯＢｚｌの２５ｇ（３９ｍｍｏｌ）にＴＦＡ：ＣＨ2Ｃｌ2＝１：１の２００ｍｌを加えて室温で１時間撹拌した後、ＴＦＡとＣＨ2Ｃｌ2 を減圧濃縮した。これを酢酸エチルに溶解しＮａＨＣＯ3水溶液で中和した後ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。Ｎａ2ＳＯ4で乾燥してから酢酸エチルを減圧留去した。
【００５７】この化合物とＢｏｃＡｒｇ（Ｍｔｓ）１７．８ｇ（３９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ４００ｍｌに溶解し、ＤＣＣの８．０ｇ（３９ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔの６．８ｇ（４５ｍｍｏｌ）を氷冷下加え３時間撹拌してから、さらに室温で終夜撹拌した。ＤＣウレアを濾別してから減圧濃縮し酢酸エチルに溶解した。ＮａＨＣＯ3水溶液、１Ｍクエン酸水溶液、ＮａＣｌ水溶液の順に洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥してから減圧乾固して白色粉末を１９．５ｇ（収率５０％）得た。
【００５８】（E）ペプチドモノマー３０の合成ＢｏｃＡｒｇ（Ｍｔｓ）ＧｌｙＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＯＢｚｌの１５．０ｇ（１５ｍｍｏｌ）にＴＦＡ：ＣＨ2Ｃｌ2＝１：１ １００ｍｌ加えて室温で１時間撹拌した後、ＴＦＡとＣＨ2Ｃｌ2 を減圧濃縮した。これを酢酸エチルに溶解しＮａＨＣＯ3水溶液で中和した後ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。Ｎａ2ＳＯ4で乾燥してから酢酸エチルを減圧留去した。
【００５９】この化合物とカルボキシエチルメタクリルアミド２．４ｇ（１５ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2 ２００ｍｌに溶解しＤＣＣ３．１ｇ（１５ｍｍｏｌ）を氷冷下加え３時間撹拌してから、さらに室温で終夜撹拌した。減圧濃縮してからアセトンを加え生じたＤＣウレアをろ別した。減圧濃縮後、酢酸エチルに続いてエーテルで洗浄し、減圧乾燥して白色粉末を１０．０ｇ（収率６５％）得た。
【００６０】この化合物１０ｇ（９．８ｍｍｏｌ）のＴＦＡ溶液に、１Ｍートリフルオロメタンスルホン酸−チオアニソール−ｍ−クレゾールのＴＦＡ溶液を氷冷下加えて１時間反応させ、ペプチド側鎖および末端の保護基の脱保護を行なった。反応液をエーテル中に投入しオイル状の沈殿物を蒸留水に溶解し酢酸エチルで洗浄した後、陰イオン交換樹脂カラム（アンバーライトＩＲＡ−４００；Ｃｌ型）に通して塩酸塩とし凍結乾燥した。白色固体としてペプチドモノマー３０が４．８ｇ（収率８０％）得られた。以下にアミノ酸分析と質量スペクトルを示す。
アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９８７７Ｇ：０．９９１６Ｄ：０．９８９９Ｓ：０．８８９１β−アラニン：１．０１１５マススペクトル Ｍ+： ５７３
【００６１】製造例２９ ペプチドモノマー３１の合成ペプチドモノマー３１ＣＨ2＝ＣＣＨ3ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−ＲＧＤＳＧ−ＮＨ2製造例２８と同様な方法でペプチドモノマー３１を製造した。以下に製造に使用した試薬及び各収量、並びにペプチドモノマー３１のアミノ酸分析と質量スペクトルを示す。
（A）ＢｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ）ＧｌｙＮＨ2の合成 ＢｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ） ： ５９ｇ（０．２ｍｏｌ）
ＧｌｙＮＨ2・ＨＣｌ ： ２２．１ｇ（０．２ｍｏｌ）
Ｎ−メチルモルホリン ： ２０．２ｇ（０．２ｍｏｌ）
ＣＨ2Ｃｌ2 ： ８００ｍｌ ＤＣＣ ：４１．２ｇ（０．２ｍｏｌ）
（A）の収量 ５８．３ｇ（収率８３％）
【００６２】
（B）ＢｏｃＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＧｌｙＮＨ2の合成 （１）の生成物 ：５６．２ｇ（０．１６ｍｏｌ）
ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ：２００ｍｌ／２００ｍｌ ＢｏｃＡｓｐ（ＯＢｚｌ） ：５１．７ｇ（０．１６ｍｏｌ）
ＣＨ2Ｃｌ2 ：８００ｍｌ ＤＣＣ ：３３ｇ（０．１６ｍｏｌ）
（B）の収量 ７１．２ｇ（収率 ８０％）
【００６３】
（C）ＢｏｃＧｌｙＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＧｌｙＮＨ2の合成 （B）の生成物 ：６６．７ｇ（０．１２ｍｏｌ）
ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ：２００ｍｌ／２００ｍｌ ＢｏｃＧｌｙ ：５１．７ｇ（０．１２ｍｏｌ）
ＣＨ2Ｃｌ2 ：７００ｍｌ ＤＣＣ ：２４．７（０．１２ｍｏｌ）
（C）の収量 ６１．８ｇ（収率 ８４％）
【００６４】
（D）ＢｏｃＡｒｇ（Ｍｔｓ）ＧｌｙＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＧｌｙＮＨ2 の合成 （C）の生成物 ：６１．３ｇ（０．１ｍｏｌ ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ：２００ｍｌ／２００ｍｌ ＢｏｃＡｒｇ（Ｍｔｓ） ：４５．６ｇ（０．１ｍｏｌ）
ＤＭＦ ：８００ｍｌ ＤＣＣ ：２２．５（０．１ｍｏｌ）
ＨＯＢｔ ：１４ｇ（０．１ｍｏｌ）
（D）の収量 ４２．８ｇ（収率 ４５％）
【００６５】
（E）ペプチドモノマー３１の合成 （D）の生成物 ：５．０ｇ（５．３ｍｍｏｌ）
ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ：５０ｍｌ／５０ｍｌ カルボキシエチルメタクリルアミド ：０．８３ｇ（５．３ｍｍｏｌ）
ＤＭＦ ：５０ｍｌ ＤＣＣ ：１．１ｇ（５．３ｍｍｏｌ）
ＨＯＢｔ ：０．７２ｇ（５．３ｍｍｏｌ）
１Ｍ−トリフルオロメタンスルホン酸−チオアニソール− ｍ−クレゾールのＴＦＡ溶液： ２５０ｍｌ アンバーライトＩＲＡ−４００；Ｃｌ型処理ペプチドモノマー３１の収量 ２．２９ｇ（収率 ６５％）
アミノ酸分析(nmol/50μl)Ｒ：０．９５１７Ｇ：２．１００４Ｄ：０．９７５３Ｓ：０．８９２６β−アラニン：１．０１４３マススペクトル Ｍ+： ６２９
【００６６】製造例３０ ペプチドモノマー２２の合成ペプチドモノマー２２ＣＨ2＝ＣＨＣＯ−ＧＧＲＧＤＳ−ＮＨ2 製造例２９と同様な方法で上記ペプチドモノマー２２を製造した。以下に製造に使用した試薬及び各収量並びにペプチドモノマー２２のアミノ酸分析と質量スペクトルを示す。
（A) BocAsp(OBzl)Ser(Bzl)NH2の合成BocAsp(OBzl) ： 32.3 g (0.1 mol)Ser(Bzl)NH2 HCl ： 23.0 g (0.1 mol)N-メチルモルフォリン ： 10.1 g (0.1 mol)CH2Cl2 ： 500 mlDCC ： 20.6 g (0.1 mol)(A)の収量 44.2 g （収率 88 ％）
【００６７】(B)BocGlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)NH2 の合成(A)の生成物 ：25.0 g (0.05 mol)TFA/CH2Cl2 ：150 ml/150 mlBocGly ： 8.75 g (0.01 mol)CH2Cl2 ： 300 mlDCC ：10.3 g (0.05 mol)(B)の収量 26.1 g （収率 91 ％）
【００６８】(C)BocArg(Mts)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)NH2 の合成（B）の生成物 ： 17.3 g (0.03 mol)TFA/CH2Cl2 ： 100 ml/100mlBocArg(Mts) ：13.7 g (0.03mol)DMF ：250 mlDCC ：6.18 g (0.03 mol)HOBt ：4.0 g (0.03mol)(c)の収量 17.5 g （収率 63 ％）
【００６９】(D)BocGlyArg(Mts)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)NH2の合成(C)の生成物 ：9.3 g (0.01 mol)TFA/CH2Cl2 ： 100 ml/100mlBocGly ： 1.75 g (0.01 mol)DMF ： 80 mlDCC ： 2.06 g (0.01 mol)HOBt ： 1.36 g (0.01mol)(D)の収量 6.53 g （収率 65 ％）
【００７０】(E)BocGlyGlyArg(Mts)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)NH2 の合成(D) の生成物 ： 5.02 g (0.005 mol)TFA/CH2Cl2 ： 50 ml/50 mlBocGly ： 0.88 g (0.005 mol)DMF ： 200 mlDCC ： 1.03 g (0.005 mol)HOBt ： 0.68 g (0.005 mol)(e)の収量 3.84 g （収率 70 ％）
【００７１】(F) ペプチドモノマー２２の合成(E) の生成物 ： 3.23 g (0.003 mol)TFA/CH2Cl2 ： 40 ml/40 mlメタクリル酸 ：0.22 g (0.003 mol)DMF ： 60 mlDCC ： 0.62 g (0.003 mol)HOBt ： 0.41 g (0.003 mol)1M−トリフルオロメタンスルホン酸−チオアニソール−m-クレゾールのＴＦＡ溶液： 25 mlアンバーライトIRA-400;Cl型処理ペプチドモノマー22の収量 2.6 gアミノ酸分析（nmol/50μl)R: 0.9845G: 3.1361D: 0.9554S: 0.8879マススペクトル Ｍ+ : 600
【００７２】製造例３１ ペプチドモノマー２８の合成ペプチドモノマー２８ＣＨ2＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−ＲＧＤＳＰ−Ｎ（ＣＨ3）2製造例３０と同様の方法でペプチドモノマー２８を製造した。以下に製造に使用した試薬及び各収量、並びにペプチドモノマー２８のアミノ酸分析と質量スペクトルを示す。
【００７３】(A)BocSer(Bzl)ProN(CH3)2の合成BocSer(Bzl) ：29.5 g (0.1mol)ProN(CH3)2 HCl ：17.8 g (0.1 mol)Ｎ−メチルモルホリン ：10.1 g (0.1 mol)CH2Cl2 ：500 mlDCC ：20.6 g (0.1 mol)(A)の収量 31.6 g （収率 45 ％）
【００７４】(B) BocAsp(OBzl)Ser(Bzl)ProN(CH3)2の合成（A)の生成物 ： 22.8 g (0.05 mol)TFA/CH2Cl2 ： 150 ml/ 150 mlBocAsp(OBzl) ： 16.2 g (0.05 mol)CH2Cl2 ：500 mlDCC ： 10.3 g (0.05mol)(B)の収量 24.8 g （収率 79 ％）
【００７５】(C)BocGlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)ProN(CH3)2 の合成(B) の生成物 ： 12.5 g (0.02 mol)TFA/CH2Cl2 ： 150 ml/150 mlBocGly ： 3.5 g (0.02mol)CH2Cl2 ： 350 mlDCC ： 4.1 g (0.02 mol)(C)の収量 10.2 g （収率 75 ％）
【００７６】(D)BocArg(Mts)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)ProN(CH3)2 の合成(C) の生成物 ： 6.8 g (0.01 mol)TFA/CH2Cl2 ：100 ml/100mlBocArg(Mts) ：4.6 g (0.01 mol)DMF ：150 mlDCC ：2.06 g (0.01mol)HOBt ：1.36 g (0.01mol)(D)の収量 5.8 g （収率 57 ％）
【００７７】(E) ペプチドモノマー２８の合成(D) の生成物 ： 1.02 g (0.001 mol)TFA/CH2Cl2 ： 100 ml/100 mlカルボキシエチルメタクリルアミド： 0.143 g (0.001 mol)DMF ： 100 mlDCC ： 0.206 g (0.001 mol)HOBt ： 0.13 g (0.00mol)1M−トリフルオロメタンスルホン酸−チオアニソール−m-クレゾールのTFA溶液 ： 50 mlペプチドモノマー28の収量 0.6 gアミノ酸分析（nmol/50μl)R : 1.0761G : 1.0049D : 0.9959P : 1.0834マススペクトル Ｍ+ : 611
【００７８】製造例３２ 目的物（本発明のプロペンアミド誘導体重合物）３２の合成ペプチドモノマー１５の５００ｍｇを水５ｍｌに溶解し、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整した後、開始剤として過硫酸カリウム２．５ｍｇと亜硫酸水素ナトリウム１．０ｍｇを加え窒素気流下２０℃で２０時間重合し目的物３２を得た。
【００７９】スペクトラポア７分子分画量３０００を用いて純水に対して透析し低分子量分を除いた後凍結乾燥させた（収量２４０ｍｇ）。ゲルクロマトグラフィーにより目的物３２の分子量分画を行なった。分子量は製造例１１と同様の方法で測定した。
画分１ 分子量約 ４８０００ （目的物３２−１）
画分２ 分子量約 ２１０００ （目的物３２−２）
画分３ 分子量約 １２０００ （目的物３２−３）
【００８０】製造例３３ 目的物３２−４の合成（開始剤量の変更）
上記製造例３２において開始剤を下記のものに変更してペプチドモノマー１５の重合を行い、目的物３４−４を製造した。下記に収量と分子量を示す。
開始剤 過硫酸カリウム１０ｍｇ亜硫酸水素ナトリウム４ｍｇ収量 １８０ｍｇ（目的物３２−４）
分子量 約５０００
【００８１】製造例３４〜５２ 目的物３３〜５１の合成製造例３２及び３３と同様の方法でペプチドモノマー１２〜１４及び１６〜３１の重合を行ない、目的物３３〜５１を製造した。各ポリマーの収量及び分子量を以下に示す。
──────────────────────────────── 目的物No. モノマーNo. ポリマー収量(mg) 分子量 ──────────────────────────────── ３３ １２ ２３０ １５０００ ３４ １３ １８０ １３０００ ３５ １４ １９０ １５０００ ３６ １６ １５０ １１０００ ３７ １７ ２４０ １６０００ ３８ １８ １２０ ８０００ ３９ １９ １７０ １００００ ４０ ２０ １４０ ９０００ ４１ ２１ １７０ １１０００ ４２ ２２ １３０ １２０００ ４３ ２３ １５０ ９０００ ４４ ２４ １４０ ８０００ ４５ ２５ １３０ ８０００ ４６ ２６ １７０ １００００ ４７ ２７ ２００ １５０００ ４８ ２８ １９０ １３０００ ４９ ２９ １５０ １００００ ５０ ３０ １２０ １５０００ ５１ ３１ １８０ ７５００ ────────────────────────────────
【００８２】試験例１（実験的肺転移）
以下のような試験を行い、本発明の化合物の癌転移阻止作用について検討した。目的物３２−３、目的物３２−４、目的物３５、目的物３７、目的物３９、目的物４０、目的物４４、目的物４６、目的物４９、目的物５０を各々１０００μgと、非常に転移性の強い癌細胞であるB16-BL6 メラノーマ細胞を各々PBS中で混合後、その０.2mlを１群５匹のC57BL/6の雄マウスに静脈注射した。注射された混合物0.2 ml中にはB16-BL6 細胞が５×104 個含まれていた。投与１４日後にマウスの肺における癌細胞コロニー数を数えて対照のPBS投与群と比較した（実験１）。その結果を表１に示す。この結果から明らかな通り、目的物３２、３５、３９、４０、４４、４６、４９あるいは５０の投与により肺への癌転移は顕著に抑制された。これに対して、Arg-Gly-Asp 及び接着性ペプチドを含まないポリマー１１の投与ではそのような転移の抑制は見られなかった。同表に示すように,本発明の化合物中の活性ペプチドArg-Gly-Aspや Arg-Gly-Asp-Ser 等の含量が４００〜９００μg/1000μgであることを考慮すると、少ない量で高い効果を発現していることがわかる。
【００８３】更に、目的物３２、３５、３７、４７、５０の投与量をそれぞれ５００μgに減じて上記実験１と同様の方法でマウスに投与したときの効果を検討した（実験２）。表１に示す結果によれば、本発明の化合物はいずれも、対照のPBS投与群に比べて顕著な転移抑制効果を示した。また、本発明の化合物群をB16-BL 6細胞と混合せずにB16-BL 6細胞を投与した５分後にマウスに静脈投与しても、やはり高い転移抑制効果が得られた。この結果は、本発明の化合物を静脈注射等の適当な方法で投与して、癌の転移抑制効果が得られることを示している。
【００８４】
表１ B16-BL6メラノーマ細胞の注射で誘発された癌の実験的肺転移に対するポ リペプチドの効果────────────────────────────────────投与化合物 投与時** 投与量 肺への転移数 有効ペプチド含量 （μg） 平均±SD（範囲） （μg/投与量）
────────────────────────────────────実験１ＰＢＳ（未処理）同時 −−−− 85±20 (53-101) 目的物３２−３ 同時 １０００ 14±３ (11-18)* 676目的物３２−４ 同時 １０００ 16±13 (2-33)* 676 目的物 ３５ 同時 １０００ 20±７ (6-12)* 910 目的物 ３７ 同時 １０００ 16±６ (8-14)* 706 目的物 ３９ 同時 １０００ 18±８ (8-13)* 619 目的物 ４０ 同時 １０００ 25±９ (12-25)* 738 目的物 ４４ 同時 １０００ 21±10 (10-22)* 894 目的物 ４６ 同時 １０００ 12±９ (4-19)* 652 目的物 ４９ 同時 １０００ 22±10 (6-29)* 552 目的物 ５０ 同時 １０００ 8±５ (2-12)* 753 ＲＧＤ 同時 １０００ 66±16 (13-20) ＲＧＤＳ 同時 １０００ 42±18 (14-60)* ＧＲＧＤＳ 同時 １０００ 40±15 (26-59) ＧＧＲＧＤＳＰ 同時 １０００ 45±20 (28-70) ポリマー１１ 同時 １０００ 74±14 (57-89)
【００８５】
実験２ＰＢＳ（未処理）同時 −−−− 64±11 (48-85) 目的物３２−３ 同時 ５００ 21±８ (12-24)* 別個 ５００ 30±９ (18-27)* 目的物 ３５ 同時 ５００ 16±13 (2-33) 別個 ５００ 19±８ (13-29)* 目的物 ３７ 同時 ５００ 20±６ (13-28) 目的物 ４７ 同時 ５００ 14±５ (8-18)* 目的物 ５０ 同時 ５００ 13±４ (8-18)* ──────────────────────────────────── * t検定で未処理対照と比較して p＜0.001** 「同時」は投与化合物と癌細胞を同時に注射したことを示し、「別個」は投与化合物と癌細胞を別々に注射したことを示す。
【００８６】試験例２ 自然転移モデルによる癌転移抑制効果さらに本発明の化合物群が癌の転移を抑制することを自然転移モデルによって確認した。即ち、B16-BL6細胞を１群５匹のC57BL/マウスの足踵に移植し、移植後一定期間内に本発明の化合物群を５０μgまたは１００μgを移植癌部に直接単回あるいは複数回局所投与した。移植後２１日目に癌部を切除し、その２週間後にマウスを解剖し肺への癌の転移を調べた。その結果を表２に示す。癌移植後７日目に本発明の化合物群を１００μgを単回投与しその後２日毎に複数回投与することにより、または７、１０、１３、及び１６日目に５０μgずつ複数回投与することにより、移植癌自体の増殖は抑制されなかったものの、肺への癌の転移は顕著に抑制された。
【００８７】
表２ 足踵に投与したＢ１６−ＢＬ６メラノーマ細胞の自然肺転移モデルにおけ るプロペンアミド誘導体重合物の抑制効果────────────────────────────────────投与化合物 投与量 投与日 ２１日目における （μg/マウス) 移植癌の大き 肺への転移数 さ（mm±SD) 平均±SD（範囲）
────────────────────────────────────未処理（PBS) 12±2 50±20(28ー86) 目的物32-3 100x7 7,9,11,13,15,17,19 12±2 24±12(5-36)目的物32-4 同上 同上 11±1 19±10(9ー36)目的物35 同上 同上 12±2 20±8(10ー31)目的物36 同上 同上 11±2 26±8(19ー43)目的物37 50X4 7,10,13,16 11±2 18±9(8-31) 目的物39 100x7 7,9,11,13,15,17,19 13±3 20±6(15-27)目的物42 同上 同上 12±2 9±5(1ー16) 目的物44 同上 同上 13±3 12±6(7ー22) 目的物49 同上 同上 13±3 17±7(7ー28) 目的物50 同上 同上 13±3 7±3(3ー10) RGDS 同上 同上 12±2 62±13(41ー77) GGRGDSP 同上 同上 12±2 45±17(26ー64) ──────────────────────────────────── * スチューデントのt検定で未処理群に対して p＜0.001
【００８８】試験例３ 毒性上記の試験において、本発明の化合物群は、宿主マウスの赤血球細胞や脾臓及び胸腺細胞に対する細胞毒性や血清蛋白質に対する好ましくない凝集作用を有しないことが確認された。
【００８９】
【発明の効果】以上説明した通り、本発明のプロペンアミド誘導体重合物は、細胞接着性蛋白質のコア配列に比べて細胞接着性が大きく、癌転移抑制作用等の種々の生物活性を有し、毒性の問題も殆どない。また、その構造も単純であり合成も容易であり、医薬としての価値は高いものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 下記一般式（Ｉ）で表されるプロペンアミド誘導体の重合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有してなる癌転移抑制剤。
一般式（Ｉ）
H2C=CR1-CO-［NH-R2-CO］-(［Ｘ］- Arg-Gly-Asp-［Ｙ］）n -Z（式中、Ｒ1は水素原子、メチル基またはエチル基を表し、Ｒ2は炭素数が１〜１１の直鎖又は分岐のアルキレン基を表し、該アルキレン基中の炭素原子は−Ｏ−を介して連結していてもよい。Ｘ，ＹはＳｅｒ，Ｇｌｙ，Ｖａｌ，Ｔｈｒ，Ｐｒｏ及びＧｌｎから選択されるアミノ酸残基またはこれらのアミノ酸残基から構成されるペプチド残基を表し、Ｚは−ＯＨ，−ＯＲ3または−ＮＲ4Ｒ5を表し、Ｒ3,Ｒ4,Ｒ5は水素原子、メチル、エチル基の中から選択される。ｎは１〜３の整数を表す。また、式中の［ ］は［ ］内の残基が存在してもしなくてもよいことを示す。）
【請求項１】 下記一般式（Ｉ）で表されるプロペンアミド誘導体の重合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有してなる癌転移抑制剤。
一般式（Ｉ）
H2C=CR1-CO-［NH-R2-CO］-(［Ｘ］- Arg-Gly-Asp-［Ｙ］）n -Z（式中、Ｒ1は水素原子、メチル基またはエチル基を表し、Ｒ2は炭素数が１〜１１の直鎖又は分岐のアルキレン基を表し、該アルキレン基中の炭素原子は−Ｏ−を介して連結していてもよい。Ｘ，ＹはＳｅｒ，Ｇｌｙ，Ｖａｌ，Ｔｈｒ，Ｐｒｏ及びＧｌｎから選択されるアミノ酸残基またはこれらのアミノ酸残基から構成されるペプチド残基を表し、Ｚは−ＯＨ，−ＯＲ3または−ＮＲ4Ｒ5を表し、Ｒ3,Ｒ4,Ｒ5は水素原子、メチル、エチル基の中から選択される。ｎは１〜３の整数を表す。また、式中の［ ］は［ ］内の残基が存在してもしなくてもよいことを示す。）
【公開番号】特開平５−９７６９９
【公開日】平成５年（１９９３）４月２０日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平３−２５８０９５
【出願日】平成３年（１９９１）１０月４日
【出願人】（０００００５２０１）富士写真フイルム株式会社 (7,609)
【公開日】平成５年（１９９３）４月２０日
【国際特許分類】
【出願日】平成３年（１９９１）１０月４日
【出願人】（０００００５２０１）富士写真フイルム株式会社 (7,609)
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