ヘリカーゼ活性および改善された溶解性を有するＨＣＶＮＳ３タンパク質フラグメント
【課題】ヘリカーゼ活性および改善された溶解性を有する組換えＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメント、ヘリカーゼ活性および改善された溶解性を有する融合ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメント、ヘリカーゼ活性および改善された溶解性を有する短縮され変更されたＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントを提供すること。
【解決手段】ＨＣＶ ＮＳ３蛋白質に由来するヘリカーゼ活性を有する特定のアミノ酸配列を有する短縮型の精製されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ３ヘリカーゼフラグメント、あるいは１つまたはいくつかのアミノ酸挿入、アミノ酸欠失またはアミノ酸置換を有するその改変体であって、この改変体は、ヘリカーゼ活性を保持しかつ可溶性である。
【解決手段】ＨＣＶ ＮＳ３蛋白質に由来するヘリカーゼ活性を有する特定のアミノ酸配列を有する短縮型の精製されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ３ヘリカーゼフラグメント、あるいは１つまたはいくつかのアミノ酸挿入、アミノ酸欠失またはアミノ酸置換を有するその改変体であって、この改変体は、ヘリカーゼ活性を保持しかつ可溶性である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の分子生物学およびウイルス学に関する。さらに詳細には、本発明は、（１）抽出およびアッセイ緩衝液中での改善された溶解性を有する、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質のカルボキシ末端ヘリカーゼフラグメント、（２）改善された溶解性を有する新規のＮＳ３タンパク質ヘリカーゼフラグメントの発現方法、（３）改善された溶解性を有する組換えＮＳ３タンパク質ヘリカーゼフラグメント；（４）ＮＳ３タンパク質ヘリカーゼ変異体フラグメント；および（５）ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質ヘリカーゼフラグメントを、可能性のある治療剤としてのヘリカーゼインヒビターをスクリーニングするために用いる方法。
【背景技術】
【０００２】
非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）は、ウイルスにより誘導されると考えられている伝染性疾患（または疾患ファミリー）であり、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、またはエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）により引き起こされるような他の形態のウイルス関連肝疾患とは区別できる。疫学的証拠は、３つのタイプのＮＡＮＢＨがあり得ることを示唆する：水媒介流行タイプ；血液または注射針に関連するタイプ；および散発的に生じる（コミュニティー獲得）タイプ。しかし、原因因子の数は不明である。しかし最近、新規のウイルス種であるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が、血液関連ＮＡＮＢＨ（ＢＢ−ＮＡＮＢＨ）の主要な（唯一ではない場合）原因として同定されている。例えば、ＰＣＴ
ＷＯ８９／０４６６９９およびＷＯ９２／０２６４２；欧州特許明細書第３１８，２１６−Ｂ号および欧州特許出願公開第３８８，２３２−Ａ号および第３９８，７４８−Ａ号（それぞれ本明細書中で参考として援用される）を参照。Ｃ型肝炎は、米国および日本を含む多くの国において輸血関連肝炎の主要な形態のようである。肝細胞癌の誘導にＨＣＶが関与している証拠もある。従って、ＨＣＶ感染を処置するための有効な方法（現在はない）についてのニーズが存在する。
【０００３】
ＨＣＶはプラス鎖ＲＮＡウイルスである。感染の際、そのゲノムＲＮＡは、ウイルスタンパク質および細胞タンパク質により少なくとも１０の異なるウイルスタンパク質にプロセシングされる大きなポリタンパク質を産生する。他のプラス鎖ＲＮＡウイルスと同様に、そのプラス鎖の複製はマイナス鎖ＲＮＡの最初の合成を包含する。このマイナス鎖ＲＮＡ（これは複製中間産物である）は、子孫ゲノムＲＮＡの産生のためのテンプレートとして働く。このプロセスは、２つまたはそれ以上のウイルスがコードする酵素（ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡヘリカーゼを含む）により行われると考えられる。ＲＮＡポリメラーゼは、子孫ＲＮＡの産生のためにテンプレートＲＮＡを複製する。この酵素は、ＤＮＡテンプレートからはＲＮＡ分子を合成しない。
【０００４】
ＲＮＡヘリカーゼは、一本鎖ＲＮＡ分子に存在する二次構造を巻き戻す。ヘリカーゼはまた、二本鎖ＲＮＡを一本鎖形態に巻き戻す。ゲノムＨＣＶ ＲＮＡ分子は広範な二次構造を含む。ＨＣＶ ＲＮＡの複製中間産物は、プラス鎖およびマイナス鎖のＲＮＡ分子からなる二本鎖ＲＮＡとして存在すると考えられる。ＲＮＡヘリカーゼの活性は、巻き戻された一本鎖ＲＮＡ分子をテンプレートとして必要とするＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに重要であると考えられる。従って、ヘリカーゼの生物学的活性は、ＨＣＶ複製に必要であると考えられる。
【０００５】
フラビウイルス科の３つの属（フラビウイルス、ペスチウイルス、およびＨＣＶ）のＮ
Ｓ３タンパク質は、セリンタイププロテイナーゼの保存配列モチーフ、およびヌクレオシドトリホスファターゼ（ＮＴＰａｓｅ）／ＲＮＡヘリカーゼの保存配列モチーフを有することが示されている。ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質のＮ’末端の１／３は、ＮＳ３−ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ接合部を切断するトリプシン様セリンプロテイナーゼであることが示されている（Ｆａｉｌａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６８：３７５３−３７６０（１９９４））。ＮＳ３ Ｃ’末端フラグメントの２／３は、ＮＴＰａｓｅ／ＲＮＡヘリカーゼ活性をコードすることが示されている（Ｃｈｏｏら、ＰＮＡＳ、８８：２４５１−２４５５（１９９１）、およびＧｏｒｂａｌｅｎｙａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７：４７１３−４７２９（１９８９））。Ｓｕｚｉｃｈらは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現したＨＣＶ ＮＳ３のカルボキシ末端フラグメントの２／３が、ポリヌクレオチド刺激性ＮＴＰａｓｅ活性を有することを示した（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、６７：６１５２−６１５８（１９９３））。Ｇｗａｃｋらは、「ＮＴＰａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ ＮＳ３
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ．、５（２）：１７１−１７５（１９９５）において、２つのＨＣＶ ＮＳ３タンパク質ｐ７０およびｐ４３がバキュロウイルス発現系で発現されることを示した。ｐ７０は、ＮＳ３モノクローナル抗体により阻害される特異的なＮＴＰａｓｅ活性を示した。Ｗａｒｒｅｎｅｒら（「Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ ＮＳ３（ｐ８０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｏｓｓｅｓｓｅｓ ＲＮＡ Ｈｅｌｉｃａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１７２０−１７２６（１９９５））は、バキュロウイルス発現系において発現されたウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）ＮＳ３タンパク質が、ＲＮＡヘリカーゼ活性を有することを示した。ＪＰ ０６ ３１９５８３Ａは、バキュロウイルスの非必須領域へのＨＣＶヘリカーゼ遺伝子の導入による、ＨＣＶによりコードされるヘリカーゼタンパク質の調製を記載している。ヘリカーゼアミノ酸配列は、ＨＣＶポリタンパク質の１２００〜１５００として報告されている。上記の全ての書類はその全体が本明細書中で参考として援用される。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ８９／０４６６９９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第ＷＯ９２／０２６４２号パンフレット
【特許文献３】欧州特許第３１８，２１６号明細書
【特許文献４】欧州特許出願公開第３８８，２３２号明細書
【特許文献５】特開平６−３１９５８３号公報
【非特許文献１】Ｆａｉｌａら、「Both NS3 and NS4A are required for proteolytic processing of hepatitis C virus nonstructural proteins.」、Journal of virology、米国、American Society For Microbiology、1994年６月、68(6)、3753-60頁
【非特許文献２】Ｃｈｏｏら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、米国、National Academy of Sciences、１９９１年、８８、２４５１−２４５５頁
【非特許文献３】Gorbalenyaら、「Two related superfamilies of putative helicases involved in replication, recombination, repair and expression of DNA and RNA genomes.」、Nucleic acids research.、英国、Oxford University Press、1989年６月２６日、17(12)、4713-30頁
【非特許文献４】Ｓｕｚｉｃｈら、「Hepatitis C virus NS3 protein polynucleotide-stimulated nucleoside triphosphatase and comparison with the related pestivirus and flavivirus enzymes.」、Journal of virology.、米国、American Society For Microbiology、1993年１０月、67(10)、6152-8頁
【非特許文献５】Ｇｗａｃｋら、「ＮＴＰａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ」、Molecular cell.、米国、Cell Press、１９９５年、５（２）、１７１−１７５頁
【非特許文献６】Ｗａｒｒｅｎｅｒら、「Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ ＮＳ３（ｐ８０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｏｓｓｅｓｓｅｓ ＲＮＡ Ｈｅｌｉｃａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Journal of virology、米国、American Society For Microbiology、１９９５年、６９、１７２０−１７２６頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ヘリカーゼ活性および改善された溶解性を有する組換えＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメント、ヘリカーゼ活性および改善された溶解性を有する融合ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメント、ヘリカーゼ活性および改善された溶解性を有する短縮され変更されたＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメント、ならびにこれらのためのクローニングおよび発現ベクター、ならびにこれらのタンパク質フラグメントを、化合物がＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害し、従ってＨＣＶ複製を阻害し得るかどうかを評価するためのスクリーニングアッセイで使用するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１つの局面において、本発明は、配列番号２に示される配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼフラグメントを含む組成物を提供する。
【０００８】
好ましい実施態様において、上記フラグメントは、化学合成または組換えＤＮＡ発現により産生され得る。
【０００９】
さらに好ましい実施態様において、上記フラグメントは、アミノ酸１５６１〜１６５７にそのカルボキシ末端を有し得る。
【００１０】
さらに好ましい実施態様において、上記フラグメントは、アミノ酸１１９３〜アミノ酸１２２３にそのアミノ末端を有し得る。
【００１１】
別の局面において、本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を実質的に有するＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼフラグメントに融合した適切な融合パートナーを含む融合タンパク質を提供する。
【００１２】
好ましい実施態様において、上記融合パートナーは、ヒトスーパーオキシドジスムターゼを含み得る。
【００１３】
さらに好ましい実施態様において、上記フラグメントは、化学合成または組換えＤＮＡ発現により産生され得る。
【００１４】
さらに好ましい実施態様において、上記ヘリカーゼフラグメントは、アミノ酸１５６１〜アミノ酸１６５７にそのカルボキシ末端を有し得る。
【００１５】
さらに好ましい実施態様において、上記ヘリカーゼフラグメントは、アミノ酸１１９３〜アミノ酸１２２３にそのアミノ末端を有し得る。
【００１６】
好ましい実施態様において、上記融合パートナーは、ユビキチンであり得る。
【００１７】
別の局面において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を実質的に有するＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【００１８】
別の局面において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を実質的に有するＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼフラグメントおよび融合パートナーを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【００１９】
好ましい実施態様において、上記融合パートナーは、ｈＳＯＤ、酵母α因子、ＩＬ−２Ｓ、ユビキチン、βガラクトシダーゼ、βラクタマーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびウレアーゼからなる群より選択され得る。
【００２０】
さらに好ましい実施態様において、上記ヘリカーゼフラグメントは、アミノ酸１５６１〜アミノ酸１６５７にそのカルボキシ末端を有し得る。
【００２１】
さらに好ましい実施態様において、上記ヘリカーゼフラグメントは、アミノ酸１１９３〜アミノ酸１２２３にそのアミノ末端を有し得る。
【００２２】
別の局面において、本発明は、化合物をＣ型肝炎ウイルスに対する活性についてアッセイするための方法であって：
配列番号２に示される配列と実質的に同じ配列を有するＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼフラグメントを提供する工程；
このフラグメントを、ＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害し得る化合物と接触させる工程；および
このＣ型肝炎ウイルスヘリカーゼの活性の阻害を測定する工程、
を包含する方法を提供する。
【００２３】
好ましい実施態様において、上記フラグメントは、アミノ酸１５６１〜アミノ酸１６５７にそのカルボキシ末端を有し得る。
【００２４】
さらに好ましい実施態様において、上記フラグメントは、アミノ酸１１９３〜アミノ酸１２２３にそのアミノ末端を有し得る。
【００２５】
別の局面において、本発明は、宿主細胞中でＨＣＶ ＮＳ３活性ヘリカーゼフラグメントを産生するための発現ベクターであって：
配列番号２に示す配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
このフラグメントをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連絡された、この宿主細胞中で機能する転写および翻訳調節配列；および
選択マーカー
を含むベクターを提供する。
【００２６】
好ましい実施態様において、本発明は、発現の際に融合タンパク質を形成するために、上記フラグメントをコードするポリヌクレオチドに連結された、融合パートナーをコードする配列をさらに含み得る。
【００２７】
好ましい実施態様において、上記融合パートナーは、ｈＳＯＤ、酵母α因子、ＩＬ−２Ｓ、ユビキチン、βガラクトシダーゼ、βラクタマーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびウレアーゼからなる群より選択され得る。
【００２８】
さらに好ましい実施態様において、上記フラグメントは、アミノ酸１５６１〜アミノ酸１６５７にそのカルボキシ末端を有し得る。
【００２９】
さらに好ましい実施態様において、上記フラグメントは、アミノ酸１１９３〜アミノ酸１２２３にそのアミノ末端を有し得る。
【発明の効果】
【００３０】
本発明により、ヘリカーゼ活性および改善された溶解性を有する組換えＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメント、ヘリカーゼ活性および改善された溶解性を有する融合ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメント、ヘリカーゼ活性および改善された溶解性を有する短縮され変更されたＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメント、ならびにこれらのためのクローニングおよび発現ベクター、ならびにこれらのタンパク質フラグメントを、化合物がＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害し、従ってＨＣＶ複製を阻害し得るかどうかを評価するためのスクリーニングアッセイで使用するための方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
発明の実施態様
Ａ．定義
用語「Ｃ型肝炎ウイルス」および「ＨＣＶ」は、ＢＢ−ＮＡＮＢＨの主要な病因因子であるウイルス種をいう。そのプロトタイプの単離体は、ＰＣＴ ＷＯ８９／０４６６９９；欧州特許出願公開第３１８，２１６号、第３８８，２３２号、および第３９８，７４８号、ならびにＰＣＴ ＷＯ９２／０２６４２に同定されている。本明細書中で使用される「ＨＣＶ」は、Ｃ型肝炎を引き起こし得る病原性株および弱毒化株またはそれ由来の欠損干渉粒子を含む。ＨＣＶゲノムはＲＮＡから構成される。ＲＮＡを有するウイルスは比較的高率で自発的に変異し、その率は、取り込んだヌクレオチドあたり１０−３から１０−４のオーダーと報告されている（ＦｉｅｌｄｓおよびＫｎｉｐｅ、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」（１９８６、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．））。遺伝子型の異種性および流動性は、ＲＮＡウイルスの固有の特徴であるので、ＨＣＶ種には複数の株／単離体（毒性または無毒性であり得る）が存在する。
【００３２】
ＨＣＶのいくつかの異なる株／単離体、特に株または単離体ＣＤＣ／ＨＣＶＩ（ＨＣＶ１ともいう）についての情報が、本明細書中に開示されている。１つの株または単離体からの情報（例えば、部分的なゲノム配列）は、当業者が標準的な技法を用いて、新規の株
／単離体を単離すること、およびこのような新規の株／単離体がＨＣＶであるかどうかを同定することを可能にするに十分である。代表的には、異なる株（多くのヒト血清（および異なる地理的領域）から得られ得る）が、ＨＣＶ１のゲノム配列からの情報を用いて単離される。
【００３３】
ＨＣＶは、現在、他の２つの属がペスチウイルスおよびフラビウイルスであるフラビウイルス科の新規の属として分類されている。フラビウイルス科は、小さなエンベロープを有するヒト病原体である多くのウイルスを含む。フラビウイルス粒子の形態および組成は公知であり、Ｍ．Ａ．Ｂｒｉｎｔｏｎ、「Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｔｈｅ Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ Ａｎｄ Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ」（シリーズ編者、Ｆｒａｅｎｋｅｌ−ＣｏｎｒａｔおよびＷａｇｎｅｒ、巻編者、ＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒおよびＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９８６）、３２７〜３７４頁に記載されている。一般に、形態に関しては、フラビウイルスは、脂質二重層により囲まれている中央のヌクレオキャプシドを含む。ビリオンは球状であり、約４０〜５０ｎｍの直径を有する。そのコアは直径約２５〜３０ｎｍである。ビリオンエンベロープの外表面にそって、直径約２ｎｍの末端瘤を有する長さ約５〜１０ｎｍの突起がある。この科の代表的な例には、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、デング熱ウイルスが挙げられる。これらは、ＨＣＶのＲＮＡゲノムよりわずかに大きく、約３５００アミノ酸のポリタンパク質前駆体をコードするプラス鎖ＲＮＡゲノム（約１１，０００ヌクレオチド）を有する。個々のウイルスタンパク質は、この前駆体ポリペプチドから切断される。
【００３４】
ＨＣＶのゲノムは、約１０，０００ヌクレオチドを含む一本鎖ＲＮＡのようである。ゲノムはプラス鎖であり、約３，０００アミノ酸のポリタンパク質をコードする連続した翻訳オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。ＯＲＦにおいて、構造タンパク質はＮ末端領域の最初の約１／４中にコードされ、ポリタンパク質の大部分は非構造タンパク質に属しているようである。全ての公知のウイルス配列と比較した場合、フラビウイルス科の非構造タンパク質およびペスチウイルス（これもまた、現在、フラビウイルス科の一部であると考えられている）との小さいが重要な共直線性（ｃｏ−ｌｉｎｅａｒ）相同性が観察される。
【００３５】
ＨＣＶポリタンパク質は、翻訳の間または翻訳後、宿主およびウイルスのプロテアーゼによりプロセシングされる。ＨＣＶの遺伝子地図は次のとおりである：アミノ末端からカルボキシ末端へ、ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｃ）、エンペロープタンパク質（Ｅ１）および（Ｅ２）、ならびに非構造タンパク質２、３、４（ａ＋ｂ）および５（ａ＋ｂ）（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、およびＮＳ５）。ＨＣＶ１のヌクレオチド配列にコードされた推定アミノ酸に基づくと、ＨＣＶポリタンパク質の先端のＮ末端の小さなドメインは、フラビウイルスポリタンパク質のＮ末端で見出されたヌクレオキャプシドタンパク質（Ｃ）と、サイズと塩基性残基の高い含有率との両方が類似しているようである。ＨＣＶおよび黄熱ウイルス（ＹＦＶ）の非構造タンパク質２、３、４および５（ＮＳ２〜５）は、アミノ酸配列は異なるが類似のサイズおよびハイドロパシー性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）の対応部分を有するようである。Ｍ、Ｅ、およびＮＳ１タンパク質を含むＹＦＶポリタンパク質の領域に対応するＨＣＶの領域は、配列が異なるだけでなく、サイズおよびハイドロパシー性が全く異なるようである。従って、ＨＣＶゲノムの特定のドメインは、本明細書中で、例えば、Ｅ１、Ｅ２、またはＮＳ２として言及され得るが、これらの名称は、単に言及の利便性のためであることが理解されるべきである；ＨＣＶファミリーとフラビウイルスとの間にはまだ理解されていない重要な相違があり得、これらの相違が表面化するにつれ、ドメインの名称は変化し得る。
【００３６】
ＨＣＶの株または単離体の進化関係のため、推定ＨＣＶ株および単離体は、ポリペプチドレベルでのそれらの相同性により同定され得る。本明細書中で開示される単離体に関し
て、新規のＨＣＶ株または単離体は、ポリペプチドレベルで、少なくとも約４０％相同であることが予想され、いくつかは約７０％以上相同であると、およびいくつかはさらに約８０％以上相同であると予想される：いくつかは約９０％以上相同であり得る。アミノ酸配列の相同性を決定するための技法は当該分野で公知である。例えば、アミノ酸配列が直接決定され、そして本明細書中に記載された配列と比較され得る。あるいは、推定ＨＣＶのゲノム物質のヌクレオチド配列が、（通常は、ｃＤＮＡ中間産物を介して）決定され得、そしてそれにコードされるアミノ酸配列が決定され得、そして対応する領域が比較され得る。
【００３７】
用語「ヘリカーゼ活性を示すＮＳ３タンパク質フラグメント」または「ＮＳ３タンパク質ヘリカーゼフラグメント」は、ヘリカーゼ活性を示すＨＣＶ ＮＳ３タンパク質に由来する酵素、特にＨＣＶゲノムのＮＳ３ドメインのカルボキシ末端側２／３にコードされるポリペプチドの部分をいう。一般には、プロテアーゼ活性を示すＨＣＶ ＮＳ３タンパク質の部分、すなわちアミノ末端側１／３に見いだされる部分は除かれる。ＨＣＶの少なくとも１つの株が、ＮＳ３タンパク質フラグメント中のアミノ酸残基の次の配列、すなわち、図１に示されるＮＳ３タンパク質のおよそアミノ酸１１９３〜１６５７により、またはこの配列中に実質的にコードされると考えられるヘリカーゼ活性を示すＮＳ３タンパク質フラグメントを含有する。このようなヘリカーゼフラグメントの配列を以下に記載する：
【００３８】
【化１】
。
【００３９】
ヘリカーゼフラグメントの上記ＮおよびＣ末端は推定であり、実際の末端は、ＮＳ３ドメイン全体をコードするＤＮＡ構築物の適切な宿主中での発現およびプロセシングにより規定される。ＨＣＶのようなＲＮＡウイルスは、多くの変化を示すことが知られるので、この配列は株ごとに変化し得ることが理解される。さらに、ヘリカーゼ活性を示すＮＳ３タンパク質フラグメントは、前駆体ポリタンパク質から切断されるので、実際のＮおよびＣ末端は変化し得る：ヘリカーゼアミノ酸配列の変化は、ヘリカーゼ活性に関して異なる末端を生じ得る。従って、アミノ末端およびカルボキシ末端はＨＣＶの株ごとに異なり得る。活性に必要な最小配列が確かに存在し、本明細書中で決定された。ＮＳ３フラグメントの配列は、任意の所望の数の塩基対を除くために、コード配列の５’または３’末端（またはその両方）での制限エンドヌクレアーゼを用いた切断後、エキソヌクレアーゼを用いて適切な発現ベクターを処理することによって、一端または両端で短縮され得る。次いで、得られたコードポリヌクレオチドが発現され、そして配列が決定される。この様式で、得られた産物の活性がアミノ酸配列と相関づけられ得る：限られた一連のこのような実験（累進的に多くの数の塩基対を除去する）は、ヘリカーゼ活性に必要な最小の内部配列を決定する。ＨＣＶ ＮＳ３フラグメントの配列は、ヘリカーゼ活性を十分に保持しつつ、特にカルボキシ末端で、およそ５０アミノ酸まで、実質的に短縮され得る。引き続くカルボキシ短縮は、ついにはヘリカーゼ活性の損失を生じてしまう。１３５アミノ酸あたりでのさらなるカルボキシ短縮は、ＮＴＰａｓｅ活性の損失を生じる。ＮＳ３フラグメントのアミノ末端（すなわち、ＨＣＶ−１アミノ酸配列の１１９０あたりから始まるフラグメント）はまた、ヘリカーゼ活性を損失することなく、ある程度短縮され得る。しかし驚くことに、２０アミノ酸程度までの推定ヘリカーゼドメインのアミノ末端短縮は、精製およびアッセイ緩衝液中のフラグメントの溶解性の増加を生じる。一般に、ＮＳ３タンパク質は緩衝液に不溶である。ヘリカーゼＮ末端のおよそ２０アミノ酸を欠失させた場合、フラグメントは緩衝液に可溶になる。しかし、およそ３５アミノ酸を欠失させた場合、フラグメントはＮＴＰａｓｅおよびヘリカーゼ活性の両方を失う。ＮＳ３タンパク質のアミノ末端部分（すなわち、アミノ酸１０２７あたりから始まる部分）が、プロテアーゼ活性を示すことは公知である。しかし、プロテアーゼ活性は、本発明のＨＣＶヘリカーゼに必要ではなく、実際、プロテアーゼ活性を示すＮＳ３のアミノ末端フラグメントは、ヘリカーゼまたは本発明のフラグメントから除かれる。
【００４０】
「ＨＣＶ ＮＳ３フラグメントヘリカーゼアナログ」は、上記のヘリカーゼ活性を有するＮＳ３カルボキシフラグメントから、天然のヘリカーゼフラグメントのアミノ酸配列に対する欠失、変更および／または付加により変化するポリペプチドをいう。ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼフラグメントアナログとして、上記の短縮型ヘリカーゼフラグメント、ならびにＨＣＶ ＮＳ３フラグメントヘリカーゼ変異体、およびＨＣＶ ＮＳ３タンパク質ヘリカーゼフラグメント、短縮型ＮＳ３タンパク質ヘリカーゼフラグメントまたはＮＳ３フラグメントヘリカーゼ変異体を含む融合ヘリカーゼフラグメントが挙げられる。ＨＣＶ
ＮＳ３フラグメントヘリカーゼ変異体を形成するための変更は、好ましくは保存的アミノ酸置換であり、そこでは、アミノ酸は類似の性質の別の天然に存在するアミノ酸と置き換えられる。例えば、次の置換が「保存的」と考えられる：
【００４１】
【化２】
。
【００４２】
非保存的変化は、一般に、上記アミノ酸の１つを異なるグループのアミノ酸と置換すること（例えば、ＡｓｎとＧｌｕの置換）、あるいは上記アミノ酸のいずれかを、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、またはＰｒｏと置換することである。通常のアミノ酸を含む置換は、所望のタンパク質をコードする発現ベクターの部位特異的変異誘発、およびそれに続く変更形態の発現により簡便に実行される。また、合成または半合成法によりアミノ酸を変更し得る。例えば、単離したタンパク質の適切な化学処理により、システインまたはセリン残基をセレノシステインに変換し得る。あるいは、標準的なインビトロタンパク質合成法において、非通常なアミノ酸を組み込み得る。代表的には、変異体中の天然配列に対して変化、欠失、または付加した残基の総数は、約２０を超えず、好ましくは約１０を超えず、そして最も好ましくは約５を超えない。
【００４３】
用語、融合タンパク質は、一般には、２つまたはそれ以上の個々のタンパク質から得られるアミノ酸配列を含むポリペプチドをいう。本発明において、「融合タンパク質」は、非ＨＣＶタンパク質またはポリペプチド（「融合パートナー」）に融合された、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼフラグメント、短縮体、変異体、またはそれらの機能的部分を含むポリペプチドを示すために用いられる。融合タンパク質は、融合遺伝子の発現により最も簡便に産生される。この融合遺伝子は、あるポリペプチドの一部分を５’末端に、異なるポリペプチドの一部分を３’末端にコードする。ここで、それらの異なる部分は、適切な宿主中で発現され得る１つのリーディングフレーム内で結合されている。融合タンパク質のカルボキシ末端にＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼフラグメントまたはアナログを位置させること、およびアミノ末端に機能性酵素フラグメントを用いることが本発明では好ましい（しかし必要はない）。ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼフラグメントは、通常、大きなポリタンパク質内に発現される。ヘリカーゼフラグメントは、細胞輸送シグナル（例えば、輸出または分泌シグナル）を含むことは期待出来ない。適切な機能性酵素フラグメントは、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼフラグメントと融合して発現した場合、定量可能な活性を示すポリペプチドである。例としての酵素には、βガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、βラクタマーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）、ウレアーゼなどが含まれるが、これらに限定されない。これらの酵素は、産生された融合タンパク質の量が、単純な呈色アッセイにより定量され得るので都合がよい。あるいは、金属結合カラムによる単純な検出および融合パートナーに特異的な抗体を用いる融合タンパク質の定量を可能にするため、フラグメントまたは抗原性タンパク質を用い得る。本発明に好ましい融合パートナーは、カルボキシ末端の６つのヒスチジン残基である。
【００４４】
Ｂ．全般的な方法
本発明の実施は、一般に、当該分野の技術の範囲内である分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来技法を使用する。このような技法は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（１９８９）；「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５年）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｎ」（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｓｌａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６年）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４年）；シリーズ「Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８７）１５４および１５５（それぞれ、ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ編ならびにＷｕ編）；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７年）、「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｓｃｏｐｅｓ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、第二版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．、１９８７年）；および「Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、第Ｉ巻〜第ＩＶ巻（ＷｅｉｒおよびＢｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年）を参照。
【００４５】
示された宿主に適合する適切な制御配列を使用する場合、原核および真核宿主細胞の両方とも、所望のコード配列を発現するために有用である。原核宿主中では、Ｅ．ｃｏｌｉが最も頻繁に使用される。原核生物用の発現制御配列は、プロモーター（必要に応じて、オペレーター部分を含む）、およびリボソーム結合部位を含む。原核宿主に適合するトランスファーベクターは、一般に、例えば、ｐＢＲ３２２（アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性を与えるオペロンを含有するプラスミド）、および種々のｐＵＣベクター（これもまた、抗生物質耐性マーカーを与える配列を含有する）由来である。これらのプラスミドは市販されている。マーカーは、選択によって、成功した形質転換体を得るために使用され得る。一般的に使用される原核生物の制御配列には、Ｔ７バクテリオファージプロモーター（ＤｕｎｎおよびＳｔｕｄｉｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）１６６：４７７）、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）１９８：１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８０）８：４０５７）、ならびにλ由来ＰＬプロモーターおよびＮ遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８）、ならびに、ｔｒｐおよびｌａｃ ＵＶ５プロモーター配列由来のハイブリッドｔａｃプロモーター（Ｄｅ Ｂｏｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８３）２９２：１２８）が含まれる。前述の系はＥ．ｃｏｌｉと特に適合し、所望であれば、ＢａｃｉｌｌｕｓまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株のような他の原核宿主が、対応する制御配列とともに使用され得る。
【００４６】
真核宿主には、培養系では酵母および哺乳動物細胞が含まれるが、これらに限定されない。酵母発現宿主には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｉｃｈｉａなどが含まれる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓならびにＫ．ｌａｃｔｉｓは、最も一般的に使用される酵母宿主ならびに好都合なカビ宿主である。酵母適合ベクターは、野生型株に重金属に対する耐性を、または栄養要求性変異体に原栄養性を与えることによって、成功した形質転換体の選択を可能にするマーカーを有する。酵母適合ベクターは、２ｍ複製起点（Ｂｒｏａｃｈら、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８３）１０１：３０７
）を、ＣＥＮ３とＡＲＳ１との組合せ、または、複製を確実にする他の手段（例えば、適切なフラグメントの宿主細胞ゲノムへの組み込みを生じる配列）を使用し得る。酵母ベクターのための制御配列は、当該分野で公知であり、３−ホスホグリセレートキナーゼ用のプロモーター（Ｒ．Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８０）２５５：２０７３）を含む、解糖酵素の合成用プロモーター（Ｈｅｓｓら、Ｊ Ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ（１９６８）７：１４９；Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９７８），１７：４９００）を包含する。ターミネーター（例えば、エノラーゼ遺伝子に由来するターミネーター（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８１）２５６：１３８５））もまた包含され得る。特に有用な制御系は、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）調節可能プロモーター、ＧＡＰＤＨ由来のターミネーター、および分泌が所望であれば、酵母α−因子由来のリーダー配列を含む制御系である（本明細書に参考として援用される米国特許第４，８７０，００８号を参照）。
【００４７】
本発明に好ましい発現系は、融合パートナーとしてユビキチンリーダーを使用する。１９８９年８月７日出願の係属出願ＵＳＳＮ ７／３９０，５９９は、酵母ユビキチン融合タンパク質の高発現用ベクターを開示した。酵母ユビキチンは、発現に際して融合タンパク質から自動的に切断される７６アミノ酸ポリペプチドを提供する。ユビキチンアミノ酸配列の以下のとおりである：
【００４８】
【化３】
。
【００４９】
Ｏｚｋａｙｎａｋら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１２：６６３−６６もまた参照。ユビキチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ３８０Ａ ＤＮＡ合成機を使用して、Ｂａｒｒら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８８）２６８：１６７１−７８の技法に従い、標準的な方法によって合成され得る。適切なリンカーを使用して、ユビキチン遺伝子は、適切なベクターへ挿入され、ＨＣＶヘリカーゼをコードする配列またはそのフラグメントに連結され得る。
【００５０】
さらに、作動可能に連結された転写調節領域および転写開始領域は、野生型生物では天然には結合していないものであり得る。これらの系は、１９８４年１０月３日公開のＥＰＯ第１２０，５５１号；１９８４年８月２２日公開のＥＰＯ第１１６，２０１号、および１９８５年１２月１８日公開のＥＰＯ第１６４，５５６号に詳細に記載され、これらはすべて本発明と共有され、全体が本明細書に参考として援用される。
【００５１】
発現用の宿主として入手可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、および他の多数の細胞株を含む、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株を包含する。哺乳動物細胞に適切なプロモーターもまた、当該分野で公知であり、ウイルスプロモーター（例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７３：１１３）、ラウス肉腫ウイ
ルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、およびウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）由来のプロモーター）を包含する。哺乳動物細胞はまた、ターミネーター配列およびポリＡ付加配列を必要とし得る。発現を増大させるエンハンサー配列もまた包含され得、遺伝子増幅を促進する配列（例えば、メトトレキセート耐性遺伝子）もまた望ましくあり得る。これらの配列は当該分野で公知である。
【００５２】
哺乳動物細胞における複製に適したベクターは、当該分野で公知であり、ウイルスレプリコン、またはＨＣＶエピトープをコードする適切な配列の宿主ゲノムへの組み込みを確実にする配列を包含し得る。例えば、外来ＤＮＡを発現するために使用される別のベクターは、ワクシニアウイルスである。この場合には、異種ＤＮＡはワクシニアゲノムに挿入される。外来ＤＮＡをワクシニアウイルスゲノムへ挿入するための技法は、当該分野で公知であり、例えば、相同組換えを利用し得る。異種ＤＮＡは、一般に、ウイルスに対して必須ではない遺伝子、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）（これはまた選択マーカーも提供する）に挿入される。組換えウイルスの構築を非常に容易にするプラスミドベクターは、記載されている（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ（１９８４）４９：８５７；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９８５）５：３４０３；Ｍｏｓｓ、ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＶＥＣＴＯＲＳ ＦＯＲ ＭＡＭＭＬＩＡＮ ＣＥＬＬＳ（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ、１９８７）、１０頁を参照）。ＨＣＶポリペプチドの発現は、次いで、組換え生ワクシニアウイルスに感染した細胞または動物に生じる。
【００５３】
ワクシニアベクターからＨＣＶポリペプチドが発現するかどうかを検出するため、ＢＳＣ １細胞を、組換えベクターに感染させ、発現を可能にする条件下で、顕微鏡スライド上で増殖させ得る。次いで、細胞はアセトン固定され、そして組換え発現ベクター中のＨＣＶセグメントが由来したＨＣＶゲノム領域にコードされるポリペプチドに対する抗ＨＣＶ抗体を含有することが既知である血清を使用して、免疫蛍光アッセイが実施され得る。
【００５４】
真核生物またはウイルスゲノムの発現用の他の系は、昆虫細胞、およびこれらの細胞での使用に適したベクターを包含する。これらの系は、当該分野で公知であり、例えば、バキュロウイルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核ポリヘドロシスウイルス（ＡｃＮＰＶ）由来の昆虫発現移入ベクター（これはヘルパー非依存性ウイルス発現ベクターである）を包含する。この系由来の発現ベクターは、通常、異種遺伝子の発現を駆動するために強力なウイルスポリヘドリン遺伝子プロモーターを使用する。ＡｃＮＰＶへの外来遺伝子の導入用に、現在最も一般的に使用される移入ベクターは、ｐＡｃ３７３である（ＰＣＴ ＷＯ８９／０４６６９９およびＵＳＳＮ ７／４５６，６３７を参照）。当業者に公知の他の多くのベクターもまた、改良発現用に設計された。これらには、例えば、ｐＶＬ９８５（これは、ポリヘドリン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変え、このＡＴＴから３２ｂｐ下流にＢａｍＨＩクローニング部位を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｖｉｒｏｌ（１９８９）１７：３１を参照）を包含する。非融合外来タンパク質の高レベル発現のためのＡｃＮＰＶ移入ベクターは、係属出願ＰＣＴ ＷＯ８９／０４６６９９およびＵＳＳＮ ７／４５６，６３７に記載されている。単一のＢａｍＨＩ部位が、ポリヘドリン遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧに関して−８位の後に配置される。ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩ、ＳｓｔＩの切断部位はいずれも存在しない。非融合外来タンパク質の良好な発現は、通常、ＡＴＧ開始シグナルに先行する適切な翻訳開始シグナルを含有する短いリーダー配列を理想的には有する外来遺伝子を必要とする。プラスミドはまた、ポリヘドリンポリアデニル化シグナル、ならびに選択およびＥ．ｃｏｌｉでの増殖のためのアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子および複製起点を含有する。
【００５５】
バキュロウイルスの所望部位へ異種ＤＮＡを導入するための方法は、当該分野で公知で
ある。（ＳｕｍｍｅｒおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５：Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９８３）３：２１５６−２１６５；ならびにＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｖｉｒｏｌ（１９８９）１７：３１を参照）。例えば、異種ＤＮＡは、相同組換えによって、ポリヘドリン遺伝子のような遺伝子へ挿入され得るか、または、所望のバキュロウイルス遺伝子中に操作された制限酵素部位に挿入され得る。この挿入される配列は、ポリタンパク質の全部または種々のセグメントをコードする配列、またはウイルスポリペプチドをコードする他のｏｒｆであり得る。例えば、インサートは、ポリタンパク質に由来する以下の番号のアミノ酸セグメントをコードし得る：アミノ酸１〜１０７８；アミノ酸３３２〜６６２；アミノ酸４０６〜６６２；アミノ酸１５６〜３２８、およびアミノ酸１９９〜３２８。
【００５６】
翻訳後修飾（例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質分解切断、およびリン酸化）のためのシグナルは、昆虫細胞によって認識されるようである。分泌および核蓄積に必要なシグナルもまた、無脊椎動物細胞と脊椎動物細胞との間で保存されるようである。無脊椎動物細胞において有効な、脊椎動物細胞由来のシグナル配列の例は、当該分野で公知であり、例えば、細胞からの分泌をシグナルするヒトインターロイキン−２−シグナル（ＩＬ２Ｓ）は、昆虫細胞内で認識され、適切に除去される。
【００５７】
形質転換は、例えば、ポリヌクレオチドのウイルス内へのパッケージングおよびウイルスによる宿主細胞の形質導入を含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞へ導入するための公知方法、ならびにポリヌクレオチドの直接取り込みにより得る。使用される形質転換手順は、形質転換される宿主に依存する。直接取り込みによる細菌の形質転換は、一般に、塩化カルシウムまたは塩化ルビジウムでの処理を用いる（Ｃｏｈｅｎ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９７２）６９：２１１０；Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８２））。直接取り込みによる酵母の形質転換は、Ｈｉｎｎｅｎら、ＰｒｏｃＮａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９７８）７５：１９２９の方法を用いて実施され得る。直接取り込みによる哺乳動物の形質転換は、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ
Ｅｂ、Ｖｉｏｌ（１９７８）５２：５４６のリン酸カルシウム沈澱法、またはその種々の公知の変法を使用して実施され得る。細胞（特に哺乳動物細胞）に、組換えポリヌクレオチドを導入する他の方法には、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソームへのカプセル化、およびポリヌクレオチドの核への直接マイクロインジェクションが含まれる。
【００５８】
ベクター構築は、当該分野で公知の技法を使用する。部位特異ＤＮＡ切断は、適切な制限酵素を用いて、これらの市販の酵素の製造者によって一般的に特定された条件下で、処置することによって実施され得る。一般に、約１ｍｇのプラスミドまたはＤＮＡ配列は、約２０ｍＬの緩衝溶液中１単位の酵素によって、３７℃にて１〜２時間のインキュベーションにより切断される。制限酵素とのインキュベーション後、タンパク質は、フェノール／クロロホルム抽出により除去され、ＤＮＡはエタノールでの沈澱によって回収される。切断されたフラグメントは、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８０）６５：４９９−５６０に記載されている一般的な手順に従って、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲルの電気泳動法を用いて分離され得る。
【００５９】
粘着末端化切断フラグメントは、混合物中に存在する適切なデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）とともに、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）を使用して、平滑末端化され得る。Ｓ１ヌクレアーゼによる処理もまた
使用され得、任意の一本鎖ＤＮＡ部分の加水分解を生じる。
【００６０】
連結は、標準的な緩衝液および温度条件下で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよびＡＴＰを使用して実施される；粘着末端連結は、平滑末端連結より少ないＡＴＰおよび少ないリガーゼを必要とする。ベクターフラグメントが連結混合物の一部分として使用されるときは、そのベクターフラグメントは、しばしば、細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）またはウシ腸アルカリホスファターゼで処理されて、５’−ホスフェートが除去され、従って、ベクターの再連結が防がれる。あるいは、不必要なフラグメントの制限酵素消化が、連結を防ぐために使用され得る。
【００６１】
連結混合物は、Ｅ．ｃｏｌｉのような適切なクローニング宿主へ形質転換され、成功した形質転換体は、組み込まれたマーカー（例えば、抗生物質耐性）によって選択され、正確な構築物についてスクリーニングされる。
【００６２】
合成オリゴヌクレオチドは、Ｗａｒｎｅｒ、ＤＮＡ（１９８４）３：４０１によって記載されているような自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して調製され得る。所望であれば、合成鎖は、標準的な反応条件下にて、３２Ｐ−ＡＴＰの存在下で、ポリヌクレオチドキナーゼでの処理によって、３２Ｐで標識され得る。
【００６３】
ｃＤＮＡライブラリーから単離されたものを含むＤＮＡ配列は、公知の技法、例えば、部位特異的変異誘発（例えば、Ｚｏｌｌｅｒ、Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８２）１０：６４８７を参照）によって修飾され得る。簡潔に述べると、修飾されるＤＮＡは、一本鎖配列としてファージへパッケージされ、修飾されるＤＮＡの一部分に相補的な合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、ＤＮＡポリメラーゼによって二本鎖ＤＮＡに変換される。ここで、所望の修飾はプライマー配列に含まれる。得られた二本鎖ＤＮＡは、ファージ支持宿主細菌へ形質転換される。ファージの各鎖のコピーを含有する形質転換細菌の培養物は、寒天中にプレートされてプラークを得る。理論的には、新しいプラークの５０％が、変異配列を有するファージを含有し、残りの５０％は元の配列を有する。プラークの複製物は、適切な鎖とのハイブリダイゼーションを可能にするが、非修飾配列とのハイブリダイゼーションは可能でない温度および条件下で、標識された合成プローブにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションによって同定された配列は、回収されてクローン化される。
【００６４】
ＤＮＡライブラリーは、ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９７５）７３：３９６１の手順を使用して、プローブされ得る。簡潔に述べれば、この手順において、プローブされるＤＮＡは、ニトロセルロースフィルター上に固定され、変性され、そして０〜５０％ホルムアミド、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸Ｎａ、各々０．０２％（ｗｔ／ｖ）のウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、およびＦｉｃｏｌｌ（登録商標）、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）、０．１％ ＳＤＳ、ならびに１００ｍｇ／ｍＬキャリア変性ＤＮＡを含有する緩衝液でプレハイブリダイズされる。緩衝液中のホルムアミドの割合、ならびにプレハイブリダイゼーションおよび続くハイブリダイゼーション工程の時間および温度条件は、必要なストリンジェンシーに依存する。より低いストリンジェンシー条件が必要なオリゴマープローブは、一般に、低い割合のホルムアミド、より低い温度、およびより長いハイブリダイゼーション時間で用いられる。３０または４０ヌクレオチド以上を含むプローブ（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノム配列由来のプローブ）は、一般に、より高い温度（例えば約４０〜４２℃）、および高い割合のホルムアミド（例えば５０％）を用いる。プレハイブリダイゼーション後、５’−３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブは緩衝液に添加され、フィルターは、ハイブリダイゼーション条件下で、この混合物中でインキュベートされる。洗浄後、処理されたフィルターをオートラジオグラフィーに供し、ハイブリダイ
ズしたプローブの位置を示す；元の寒天プレート上の対応する位置のＤＮＡが、所望のＤＮＡの供給源として使用される。
【００６５】
ルーチンのベクター構築のために、連結混合物が、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＨＢ１０１または他の適切な宿主へ形質転換され、成功した形質転換体が抗生物質耐性または他のマーカーによって選択される。次に、形質転換体からのプラスミドが、通常、クロラムフェニコール増幅（Ｃｌｅｗｅｌｌ、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（１９７２）１１０：６６７）の後、Ｃｌｅｗｅｌｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９６９）６２：１１５９の方法に従って調製される。ＤＮＡが単離され、そして、通常、制限酵素分析および／または配列決定によって分析される。配列決定は、Ｍｅｓｓｉｎｇら、Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８１）９：３０９によりさらに記載されるように、Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９７７）７４：５４６３のジデオキシ法によって、またはＭａｘａｍら、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８０）６５：４９９の方法によって実施され得る。バンド圧縮に伴う問題（これは、時に、ＧＣリッチ領域で観察される）は、Ｂａｒｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８６）４：４２８に従って、Ｔ−デアゾグアノシンの使用により克服された。
【００６６】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が、抗原または抗体のいずれかの濃度を測定するために使用され得る。この方法は、酵素と抗原または抗体のいずれかとの結合に依存し、定量標識として結合酵素活性を使用する。抗体を測定するためには、既知の抗原を、固相（例えば、マイクロタイターディッシュ、プラスティックカップ、ディップスティック、プラスティックビーズなど）に固定し、試験血清希釈物とともにインキュベートし、洗浄し、酵素で標識された抗免疫グロブリンとともにインキュベートし、そして再度洗浄する。標識に適した酵素は当該分野で公知であり、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を包含する。固相に結合した酵素活性は、通常、特異基質を添加し、そして生成物形成または基質利用を比色決定することにより測定される。結合した酵素活性は、結合した抗体の量の正の関数である。
【００６７】
抗原を測定するためには、既知の特異抗体を固相に結合し、抗原を含む試験物質を添加し、インキュベーション後、その固相を洗浄し、酵素標識二次抗体を添加する。洗浄後、基質を添加し、酵素活性を比色的に測定し、これが抗原濃度と関連する。
【００６８】
フラビウイルス科の３つの属（フラビウイルス、ペスチウイルス、およびＨＣＶ）のＮＳ３タンパク質は、セリンタイププロテイナーゼの配列モチーフおよびヌクレオシドトリホスファターゼ（ＮＴＰａｓｅ）／ＲＮＡヘリカーゼの配列モチーフを保存している（図２を参照）。ＮＳ３タンパク質フラグメントのカルボキシ側２／３のＮＴＰａｓｅ／ＲＮＡヘリカーゼは、ＤＥＡＤボックスファミリーに属する。ＤＥＡＤボックスタンパク質ファミリーは、８つの高度に保存されたアミノ酸モチーフを有し、その１つが、ＡＴＰａｓｅモチーフとしても知られるＤＥＡＤ領域である。ＤＥＡＤタンパク質ファミリーは３つのサブファミリーからなる：ＤＥＡＤタンパク質、ＤＥＡＨタンパク質、およびＤＥＸＨタンパク質。図３は、ＤＥＸＨタンパク質ファミリーの保存配列モチーフ、およびＨＣＶ
ＮＳ３の対応するモチーフを示す。ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質は、ＤＥＸＨタンパク質サブファミリー中にその分類を生じるＤＥＣＨの配列モチーフを有する。
【００６９】
本明細書に開示されるＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントは、他の公知のＲＮＡヘリカーゼと類似する特性を有する。すなわち、それらは、二価カチオン（Ｍｎ２＋またはＭｇ２＋）およびＡＴＰの存在下でのみ、ＲＮＡヘリカーゼ活性を示す。より低レベルのＡＴＰ（約１ｍＭ）では、いずれのカチオン量の増加も、ＮＳ３フラグメントの酵素活性を阻害する。ＡＴＰ濃度が高い（約５ｍＭ）ときは、ヘリカーゼ活性は、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋カチオンが高濃度で存在するときでさえ、高レベルのままである。ＨｅＬａ細胞
から精製されたＲＮＡヘリカーゼＡは、そのコファクターとしてＭｇ２＋のみを必要とし、Ｍｎ２＋はＭｇ２＋の代用にはならない（本明細書に参考として援用される、Ｌｅｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．２６７：４３９８−４４０７（１９９２）を参照）。ペスチウイルスＮＳ３およびワクシニアウイルスＲＮＡヘリカーゼは、両カチオンを使用することが示されている。同様に、本明細書に開示されるＨＣＶ ＮＳ３タンパク質ヘリカーゼフラグメントは、両金属イオンを利用し得る。
【００７０】
ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質ヘリカーゼフラグメントのヘリカーゼ活性は、ｐＨ特異的であるようだ。実施例の実験はｐＨ６．５で実施された。しかし、ｐＨを７．６に増大させると、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質ヘリカーゼフラグメントは、１０％未満の鎖分離を示し、他の全ての成分は一定に保たれた（データは示さず）。ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質ヘリカーゼフラグメントのこれらの特性は、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質ヘリカーゼが、ペスチウイルスＮＳ３ ＲＮＡヘリカーゼ（これはｐＨ感受性であることが知られている）と同様の性質を有することを暗示する。
【００７１】
ＲＮＡヘリカーゼ活性は、２つの方法で、Ｅ．ｃｏｌｉの夾雑物に由来しないことが実証された。第一は、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントインサートを含まないｐＥＴ２１ｂプラスミドを、ネガティブコントロールとして使用した。ネガティブコントロール細胞培養物からの同じ抽出画分の酵素活性を試験し、検出可能なレベルのＮＴＰａｓｅもＲＮＡヘリカーゼ活性も存在しなかった。第二は、ＮＳ３タンパク質フラグメントのヘリカーゼ活性は、ＮＳ３特異モノクローナル抗体により阻害されたが、無関係な抗体はこの活性に影響しなかった。これらの結果から、ヘリカーセ活性は、Ｅ．ｃｏｌｉの夾雑物由来ではなく、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメント由来であることが決定された。
【００７２】
試験されたＲＮＡヘリカーゼの大部分は、一本鎖領域に結合し、次いで、一方向または両方向に移動することにより、二本鎖ＲＮＡを巻き戻した。３’および５’末端の両方に一本鎖領域を有する基質を使用した。Ｓｕｚｉｃｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７：６１５２−６１５８（１９９３）は、ＨＣＶ ＮＳ３のＣ’末端の２／３が、全てのＮＴＰおよびｄＮＴＰを加水分解し得ることを示した。このＮＴＰａｓｅ活性は、本明細書に開示されるＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントで観察された（データは示さず）。本明細書に記載される短縮型ＮＳ３タンパク質フラグメントが、Ｎ末端プロテイナーゼドメインの欠失にもかかわらず生化学的ヘリカーゼ活性を有することを示す結果は、プロテイナーゼおよびＮＴＰａｓｅドメインが独立して働き得ることを示唆する。
【００７３】
本発明のヘリカーゼ活性を示すＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントは、それらが、精製およびアッセイ緩衝液に可溶である（一方、ＮＳ３タンパク質全体は、一般的に可溶ではない）ので、有利である。ヘリカーゼフラグメントの溶解性は、最初に、種々のベクター由来のいくつかのクローンおよび融合タンパク質を構築することによって決定された。例えば、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を有するｐＧＥＸ−２Ｔベクターを使用して、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質（すなわち、ＨＣＶ−１の１０２７〜１６５７ａ．ａ．）をクローン化した。ＧＳＴとＨＣＶ ＮＳ３タンパク質との得られた融合タンパク質は不溶性であった。すなわち、単離された融合タンパク質の唯一の部分は、細菌抽出物の不溶性部分からのものであった。その融合タンパク質を、６Ｍ尿素を用いて変性することによって可溶化した。変性融合タンパク質が、濃度段階勾配に対する一連の透析により、再び折り畳まれた場合、再生融合タンパク質の小画分のみが正しく再び折り畳まれ、そして酵素活性は再生タンパク質には観察されなかった。ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質を、ｐＭＡＬベクターを用いて、マルトース結合タンパク質と融合した場合、この融合タンパク質は可溶であった。しかし、マルトース結合タンパク質それ自体が約４０ｋＤａあるので、この融合タンパク質の分子量は、比較的大きかった（Ｍ．Ｗ．１１０ｋＤａ）。従って、このような融合タンパク質は使用に望ましくない。さらに、マ
ルトース結合タンパク質ドメインを、これとＨＣＶ ＮＳ３タンパク質とを含有する融合タンパク質から分離するのは困難である。さらに、ｐＥＴ２１ｂベクターを利用して、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質ドメイン（アミノ酸１０２７〜１６５７）を発現させた。このタンパク質の発現レベルは非常に低く、ほんの少量のタンパク質のみが単離された。
【００７４】
従って、例えば、ｐＥＴベクター系における本発明のＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントは、以下の利点を提供する：
１）ｐＭＡＬまたはｐＧＥＸベクターのプロモーターと比較した場合、より良好なＴ７プロモーター系；
２）ヘリカーゼ活性を有する発現ＮＳ３タンパク質フラグメントの溶解性の増大；
３）融合タンパク質から非ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントを除去する必要性の排除；および
４）ニッケルカラムクロマトグラフィーを用いる簡便な精製工程。
さらに、ヘリカーゼ活性を有する可溶性ＮＳ３タンパク質フラグメントは、不溶性の完全長タンパク質に対していくつかの利点を有する。第一に、可溶性タンパク質フラグメントは、精製および酵素アッセイにおける使用のために、変性および再折り畳みの必要がない。不溶性タンパク質またはフラグメントは、精製のために、尿素またはグアニジン−ＨＣｌによって変性される必要があり、次いで、タンパク質フラグメントの再折り畳みおよびその酵素活性の回収の前に、尿素またはグアニジン−ＨＣｌを除去するため、濃度段階勾配に対して透析されなければならない。第二に、発現系からの可溶性ＮＳ３タンパク質フラグメントの収率は、不溶性ＮＳ３タンパク質フラグメントの収率より高い。変性−再折り畳みプロセスの間に、不溶性タンパク質フラグメントは、大部分の細胞抽出物中で損失される。第三に、不溶性ＮＳ３タンパク質の酵素活性は、再折り畳み後には観察され得ない。
【００７５】
ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質の可溶性ヘリカーゼフラグメントは、組合せライブラリーから特異ヘリカーゼインヒビターについてスクリーニングするために使用され得る。スクリーニングアッセイは、ヘリカーゼフラグメントの巻き戻し活性を調べることにより、ポリアクリルアミドゲルにおける二本鎖テンプレートＲＮＡの移動度シフトに基いて実施され得る。スクリーニングアッセイはまた、マイクロタイターディッシュ（９６ウェルプレート）形式において自動化され得る。後者のアッセイにおいて、二本鎖テンプレートＲＮＡは、一方の鎖の５’末端をビオチンで標識され、そして他方の鎖の５’末端を３２Ｐで用いて標識される。この標識テンプレートは、ストレプトアビジンでコートされているウェルの底に接着され得る。添加されたフラグメントのヘリカーゼ活性は、ウェル上清に存在する置換した３２Ｐ標識ＲＮＡ鎖からの放射活性をカウントすることによって測定され得る。組合せライブラリーに存在する潜在的なヘリカーゼインヒビターは、ヘリカーゼフラグメントによる鎖置換反応の特異阻害を検出することによって見出され得る。
【００７６】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ３タンパク質は、セリンプロテイナーゼ、ヌクレオチドトリホスファターゼ（ＮＴＰａｓｅ）、およびＲＮＡヘリカーゼのアミノ酸モチーフを含む。ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質のカルボキシフラグメントが精製され、そしてこれはＲＮＡヘリカーゼ活性を有した。アミノ末端からの欠失により、タンパク質は可溶性になった。カルボキシ末端からの欠失は、少なくとも５０アミノ酸の欠失までは、ヘリカーゼ活性の消失を生じない。ヘリカーゼ活性は、ＡＴＰならびにＭｇ２＋およびＭｎ２＋のような二価カチオンを必要とする。ヘリカーゼ活性は、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質に特異的なモノクローナル抗体によりブロックされた。
【実施例】
【００７７】
Ｃ．実施例
下記の実施例は、当業者へのさらなるガイドとして提供され、いかなる方法においても
本発明の限定として解釈されるべきではない。
実施例１
ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質の発現および精製
ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質のカルボキシ側２／３を発現させるために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ＨＣＶ−１ ｃＤＮＡ由来のアミノ酸１１９３〜１６５７を含む１．４Ｋｂ ＤＮＡフラグメントを増幅した。使用したセンスプライマーは、ＪＣＫ−１ ５’−ＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＡＣＴＴＴＡＴＣＣＣＴ−３’（配列番号４）であり、そしてアンチセンスプライマーはＪＣＫ−７ ５’−ＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＡＣＧＡＣＣＴＣＧ−３’（配列番号５）であった。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてｐＥＴ２１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＷＩから購入した）１のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。組換えプラスミドをｐＥＴ２１ｂ−ＮＳ３ＨＣＶと呼び、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）へ形質転換し、そして挿入された領域を配列決定によって確認した。ｐＥＴ２１ｂ−ＮＳ３ＨＣＶは、ＨＣＶ ＮＳ３のカルボキシ末端の４６６アミノ酸残基からなり、そしてより容易な精製のために、Ｃ末端にＨｉｓタグ（６つのヒスチジン）およびｐＥＴ発現ベクター由来のさらなる１９残基を含有した。ＨＣＶ ＮＳ３ Ｈｉｓタグ融合タンパク質の約５４ｋＤａ（４８１アミノ酸残基）を、組換えプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）から１ｍＭ ＩＰＴＧによって誘導して、１０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地中で細胞を指数的に増殖させた（図５レーン１および２を参照）２。２００ｍｌの培養物から純度約９５％のタンパク質４００ｍｇを得た。３７℃にて３時間培養後、細胞を回収し破砕した。細胞抽出物の可溶性部分を、金属結合カラムに負荷した。樹脂結合タンパク質を、１Ｍイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．９を用いて溶出した。溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、タンパク質含有画分をプールし、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．９に対して４時間透析した。ポリエチレンイミンセルロースＴＬＣ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）上でのＮＴＰａｓｅアッセイを、Ｓｕｚｉｃｈらに以前に記載されたように実施して、最終的な精製タンパク質が活性コンホメーションを有することを確認した。精製タンパク質はＮＴＰａｓｅ活性を示した（データは示さず）。１ ネガティブコントロールとして、インサートを含まないｐＥＴ２１ｂプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した。ネガティイブコントロール細胞培養物を、ｐＥＴ２１ｂ−ＮＳ３ＨＣＶと同じ精製工程でプロセシングした。ネガティブコントロールは酵素活性を示さなかった（図６レーン１を参照）。２ 約５０ｋＤａの１つ以上のタンパク質バンドが、ＩＰＴＧ誘導によって出現したが、５４ｋＤａ ＮＳ３−Ｈｉｓ融合タンパク質のみを、金属結合アフィニティーカラムから精製した（図５レーン３を参照）。
実施例２
ＲＮＡヘリカーゼに対する基質の調製
図４は、ＲＮＡヘリカーゼの基質として使用された二本鎖ＲＮＡの構造を示す。長鎖を、ＰｖｕＩＩで切断されたｐＧＥＭ１のインビトロ転写によって調製し、そして短鎖をＢａｍＨＩ消化ｐＳＰ６５から転写した。両鎖を、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、製造者のマニュアルに従って転写した。転写反応後、各アリコートをＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理し、フェノール：クロロホルムで抽出し、そしてエタノールで沈澱させた。各ＲＮＡ鎖を、２５ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．６、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）を用いて再懸濁し、そして混合した。この混合物を１００℃に５分間加熱し、６５℃で３０分間インキュベートし、そして２５℃で一晩インキュベートした。長鎖ＲＮＡを、［α−３２Ｐ］−ＣＴＰで標識し、そして標識基質の比活性は、１〜１．５×１０５ｃｐｍ／ｐｍｏｌ ｄｓ ＲＮＡ基質であった３。二本鎖ＲＮＡを、６％未変性ポリアクリルアミドゲル（３０：０．８）上で電気泳動し、ｄｓ ＲＮＡの位置をオートラジオグラフィーにより同定した。ＲＮＡ基質を回収するために、切り出したゲルフラグメントを、４００μｌの溶出緩衝液（０．
５Ｍ酢酸アンモニウム、０．１％ＳＤＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中で粉砕し、４℃で２時間激しく振盪した。上清をクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させて、ＲＮＡペレットをＤ．Ｗ．中に溶解させた。３ 鎖置換を、放射標識した長鎖のバンドシフトによって観察した。
実施例３
ＲＮＡヘリカーゼアッセイ
ＲＮＡヘリカーゼアッセイを２０μｌの次の反応混合物中で実施した：１ｐｍｏｌ ＮＳ３ ＨＣＶタンパク質フラグメント、０．５ｐｍｏｌ ｄｓ ＲＮＡ基質、２５ｍＭ ＭＯＰＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５）、５ｍＭＡＴＰ、３ｍＭ ＭｎＣｌ２、２ｍＭ ＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、および２．５Ｕ ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）。この反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。反応を、５μｌの５×終止緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、０．１％ＮＰ−４０、０．１％ブロモフェノールブルー、０．１％キシレンシアノール、および５０％グリセロール）を添加することによって停止させた。各アリコートを６％未変性ポリアクリルアミドゲル（３０：０．８）に負荷し、８０Ｖで３時間電気泳動した。ｄｓ
ＲＮＡ基質および巻き戻しＲＮＡ鎖をオートラジオグラフィーにより可視化した。ＮＳ３タンパク質フラグメントのヘリカーゼ活性に対するＡＴＰおよび二価金属イオンの効果を、１ｍＭまたは５ｍＭ ＡＴＰの存在下で、１、２、３、４、および６ｍＭのＭｎ２＋またはＭｇ２＋を用いて同じ反応を実施して調べた。鎖分離効率を、ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、バンドの放射活性をカウントすることによって計算した。種々の濃度のＡＴＰおよび二価カチオンでの、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントの活性変化については、図７を参照。ＨＣＶ ＮＳ３ ＲＮＡヘリカーゼフラグメントは、Ｍｇ２＋およびＭｎ２＋のような二価イオンを必要とした（図６レーン２〜５を参照）。Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋イオンが存在する場合のみ、鎖置換が観察された（図６レーン２および４を参照）。これら二価カチオンまたはＡＴＰのいずれかを欠く場合、ｄｓ ＲＮＡは巻き戻されなかった（図６レーン３、５、および７を参照）。一価カリウムイオンは、これらの条件下で、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントのヘリカーゼ活性を活性化しなかった（図６レーン６を参照）。１ｍＭ ＡＴＰでは、ヘリカーゼ活性は、５ｍＭのときより低かった（図６レーン８を参照）。ＮＳ３の酵素活性は、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントのモノクローナル抗体によって阻害され（図６レーン９を参照）、そして２つの異なる濃度の非特異抗体によってはブロックされなかった（図６レーン１０および１１を参照）。
【００７８】
上記のように、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントのＲＮＡヘリカーゼ活性は、二価カチオンおよびＡＴＰに依存した。低濃度のＡＴＰ（１ｍＭ）では、ＮＳ３のヘリカーゼ活性は、二価カチオンの低い濃度で最も高く、カチオン濃度が増加すると、ヘリカーゼ活性は減少した。高濃度のＡＴＰ（５ｍＭ）で、ほとんどの基質が、試験した全カチオン濃度で、巻き戻された。Ｍｎ２＋またはＭｇ２＋のいずれかのカチオン濃度が３ｍＭまたは４ｍＭのとき、ヘリカーゼ活性は最高であった。従って、ヘリカーゼ活性は、より低いＡＴＰ濃度で、二価カチオン濃度に対してより感受性であるようだ。さらに、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントは、Ｍｇ２＋に対してわずかに片寄りを示した。
実施例４
短縮型ＨＣＶ ＮＳ３フラグメントのヘリカーゼ活性についての試験
種々のサイズのＨＣＶ ＮＳ３フラグメントを、上記のように発現および精製した。次いで、そのフラグメントを、上記のようにヘリカーゼ活性について、そして、当該分野で公知のようにＮＴＰａｓｅ活性について試験した。図９は、試験したフラグメントおよびそのフラグメントがヘリカーゼ／ＮＴＰａｓｅ活性を示したどうかを示す。以下のフラグメントを試験した：番号１、完全長ヘリカーゼフラグメント（すなわち、ＨＣＶ ＮＳ３ドメインのアミノ酸１１９３〜アミノ酸１６５７）、ＡＴＣＣ寄託番号９７３０６；番号２、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼドメインのＣ末端から１０アミノ酸を欠失させたＨＣＶ
ＮＳ３フラグメント（すなわち、ＨＣＶ ＮＳ３ドメインのアミノ酸１１９３〜アミノ酸１６４８）、ＡＴＣＣ寄託番号９７３０７；番号３、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼドメインのＣ末端から３０アミノ酸を欠失させたＨＣＶ ＮＳ３フラグメント（すなわち、ＨＣＶ
ＮＳ３ドメインのアミノ酸１１９３〜アミノ酸１６３８）、ＡＴＣＣ寄託番号９７３０８；番号４、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼドメインのＣ末端から５０アミノ酸を欠失させたＨＣＶ ＮＳ３フラグメント（すなわち、ＨＣＶ ＮＳ３ドメインのアミノ酸１１９３〜アミノ酸１６０８）、ＡＴＣＣ寄託番号９７３０９；番号５、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼドメインのＣ末端から９７アミノ酸を欠失させたＨＣＶ ＮＳ３フラグメント（すなわち、ＨＣＶ ＮＳ３ドメインのアミノ酸１１９３〜アミノ酸１６５１）、ＡＴＣＣ寄託番号９７３１０；番号６、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼドメインのＣ末端から１３５アミノ酸を欠失させたＨＣＶ ＮＳ３フラグメント（すなわち、ＨＣＶ ＮＳ３ドメインのアミノ酸１２０９〜アミノ酸１６５７）、ＡＴＣＣ寄託番号９７３１１；番号７、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼドメインのＮ末端から１６アミノ酸を欠失させたＨＣＶ ＮＳ３フラグメント（すなわち、ＨＣＶ ＮＳ３ドメインのアミノ酸１２０９〜アミノ酸１６５７）、ＡＴＣＣ寄託番号９７３１２；および番号８、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼドメインのＮ末端から３２アミノ酸を欠失させたＨＣＶ ＮＳ３フラグメント（すなわち、ＨＣＶ ＮＳ３ドメインのアミノ酸１２２５〜アミノ酸１６５７）、ＡＴＣＣ寄託番号９７３１３。
【００７９】
図９に示されているように、短縮型変異体である番号５、６、および８の変異体は、ＲＮＡヘリカーゼ活性を示さなかった。しかし、変異体７は、たとえその活性が番号１の（完全長）タンパク質の約半分であったとしても、ＮＴＰａｓｅ活性を確かに示した。図８は、短縮型変異体のＲＮＡヘリカーゼアッセイを示す。上方のバンドはｄｓＲＮＡを示し、下方のバンドは３２Ｐで標識されたｓｓＲＮＡを示す。煮沸ＲＮＡは、５分間煮沸後の変性ｄｓＲＮＡを示し、従ってｓｓＲＮＡに対するコントロールであった。図８および９の両方に示されているように、短縮型フラグメント番号５、６、および８は、ＲＮＡヘリカーゼ活性を消失した。
実施例５
ＨＣＶ ＮＳ３フラグメントの溶解性測定
ｐＥＴ２１ｂ−ＨＣＶＮＳ３ベクターからの発現タンパク質の溶解性を、以下の方法によって測定した：ＩＴＰＧ誘導細胞を５分間６０００Ｇにて回収した。次いで、細胞を、１×結合緩衝液（５ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．９）を用いて再懸濁した。次いで、再懸濁した細胞を、ドライアイス−エタノールバス中で凍結させ、氷上で解凍して、２分間超音波処理した。細胞抽出物を２７０００Ｇで３０分間遠心分離した。細胞抽出物の可溶性部分（上清）および細胞抽出物の不溶性部分（ペレット）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ウエスタンブロットを、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントに対するモノクローナル抗体を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥについて実施した場合、発現タンパク質は、細胞抽出物の可溶性部分中にのみ観察された。
【００８０】
標記寄託番号の下でＡＴＣＣに寄託された上記材料は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項の下に維持される。これらの寄託物は、当業者に対する便宜として提供されるのであって、寄託物が米国特許法１１２条の下で要求されることを認めるものではない。寄託物に含有されるポリヌクレオチド配列、およびこれによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書に参考として援用され、そして本明細書に記載されている配列となんらかの矛盾する事象において照合される。寄託物を製造、使用、または販売するためにはライセンスを必要とし得、このようなライセンスは本願明細書により承諾されない。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１はＨＣＶ−１のＮＳ３タンパク質の配列を示す。これは、ＨＣＶ−１ポリタンパク質のおよそアミノ酸１０２７〜１６５７である（配列番号１）。
【図２】図２はＨＣＶ ＮＳ３タンパク質の模式図である。数字は、ＨＣＶ−１ポリタンパク質のアミノ酸の位置を示す。
【図３】図３は、ＤＥＸＨボックスＲＮＡヘリカーゼタンパク質の保存配列モチーフおよびＨＣＶＮＳ３タンパク質のＲＮＡヘリカーゼドメインの匹敵する配置を示す。ボックス間の数字はアミノ酸残基における距離を示す。
【図４】図４は、ＲＮＡヘリカーゼアッセイのための二本鎖ＲＮＡ基質の構造を示す。太線は３２Ｐ標識ＲＮＡ鎖を示す。細線は非標識ＲＮＡ鎖を示す。
【図５】図５はＥ．ｃｏｌｉからのＨＣＶ ＮＳ３の発現および精製を示す。Ｍ：タンパク質サイズマーカー、レーン１：非誘導細胞由来の総タンパク質、レーン２：３時間ＩＰＴＧ誘導細胞由来の総タンパク質、レーン３：ニッケル結合クロマトグラフィにより精製したＨＣＶ ＮＳ３：Ｈｉｓタグ融合タンパク質。
【図６】図６は、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントのＲＮＡヘリカーゼアッセイの結果を示す。レーン（−）酵素：ＮＳ３タンパク質を含まないｄｓ ＲＮＡ。レーン煮沸（ｂｏｉｌｅｄ）：熱変性させたｄｓ ＲＮＡ。レーン１；ネガティブコントロール細胞（ｐＥＴベクターのみ）由来の画分、レーン２：３ｍＭ Ｍｎ２＋、レーン３：Ｍｎ２＋なし、レーン４：３ｍＭ Ｍｇ２＋、レーン５：Ｍｇ２＋なし、レーン６：３ｍＭ ＫＣｌ、レーン７：ＡＴＰなし、レーン８：１ｍＭ ＡＴＰ、レーン９：ＮＳ３タンパク質をＮＳ３特異的モノクローナル抗体とプレインキュベートしたもの、レーン１０、１１：ＮＳ３タンパク質を抗コネクシンモノクローナル抗体とそれぞれ２０μｌあたり０．５μｇ、１．０μｇでプレインキュベートしたもの。モノクローナル抗体を、ＮＳ３タンパク質と室温で５分間プレインキュベートした。
【図７】図７は、異なるＡＴＰおよび二価カチオン濃度での、ヘリカーゼ活性を有するＨＣＶＮＳ３ ＲＮＡフラグメントの活性プロフィールを示す。カチオンの効果を２つの異なるＡＴＰ濃度（１ｍＭおよび５ｍＭ）で試験した。
【図８】図８は、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質の種々の短縮型フラグメントの活性を示す。
【図９】図９は、種々の短縮型ＨＣＶ ＮＳ３フラグメントを示し、これらフラグメントがヘリカーゼ／ＮＴＰａｓｅ活性を示すかどうかを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の分子生物学およびウイルス学に関する。さらに詳細には、本発明は、（１）抽出およびアッセイ緩衝液中での改善された溶解性を有する、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質のカルボキシ末端ヘリカーゼフラグメント、（２）改善された溶解性を有する新規のＮＳ３タンパク質ヘリカーゼフラグメントの発現方法、（３）改善された溶解性を有する組換えＮＳ３タンパク質ヘリカーゼフラグメント；（４）ＮＳ３タンパク質ヘリカーゼ変異体フラグメント；および（５）ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質ヘリカーゼフラグメントを、可能性のある治療剤としてのヘリカーゼインヒビターをスクリーニングするために用いる方法。
【背景技術】
【０００２】
非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）は、ウイルスにより誘導されると考えられている伝染性疾患（または疾患ファミリー）であり、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、またはエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）により引き起こされるような他の形態のウイルス関連肝疾患とは区別できる。疫学的証拠は、３つのタイプのＮＡＮＢＨがあり得ることを示唆する：水媒介流行タイプ；血液または注射針に関連するタイプ；および散発的に生じる（コミュニティー獲得）タイプ。しかし、原因因子の数は不明である。しかし最近、新規のウイルス種であるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が、血液関連ＮＡＮＢＨ（ＢＢ−ＮＡＮＢＨ）の主要な（唯一ではない場合）原因として同定されている。例えば、ＰＣＴ
ＷＯ８９／０４６６９９およびＷＯ９２／０２６４２；欧州特許明細書第３１８，２１６−Ｂ号および欧州特許出願公開第３８８，２３２−Ａ号および第３９８，７４８−Ａ号（それぞれ本明細書中で参考として援用される）を参照。Ｃ型肝炎は、米国および日本を含む多くの国において輸血関連肝炎の主要な形態のようである。肝細胞癌の誘導にＨＣＶが関与している証拠もある。従って、ＨＣＶ感染を処置するための有効な方法（現在はない）についてのニーズが存在する。
【０００３】
ＨＣＶはプラス鎖ＲＮＡウイルスである。感染の際、そのゲノムＲＮＡは、ウイルスタンパク質および細胞タンパク質により少なくとも１０の異なるウイルスタンパク質にプロセシングされる大きなポリタンパク質を産生する。他のプラス鎖ＲＮＡウイルスと同様に、そのプラス鎖の複製はマイナス鎖ＲＮＡの最初の合成を包含する。このマイナス鎖ＲＮＡ（これは複製中間産物である）は、子孫ゲノムＲＮＡの産生のためのテンプレートとして働く。このプロセスは、２つまたはそれ以上のウイルスがコードする酵素（ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡヘリカーゼを含む）により行われると考えられる。ＲＮＡポリメラーゼは、子孫ＲＮＡの産生のためにテンプレートＲＮＡを複製する。この酵素は、ＤＮＡテンプレートからはＲＮＡ分子を合成しない。
【０００４】
ＲＮＡヘリカーゼは、一本鎖ＲＮＡ分子に存在する二次構造を巻き戻す。ヘリカーゼはまた、二本鎖ＲＮＡを一本鎖形態に巻き戻す。ゲノムＨＣＶ ＲＮＡ分子は広範な二次構造を含む。ＨＣＶ ＲＮＡの複製中間産物は、プラス鎖およびマイナス鎖のＲＮＡ分子からなる二本鎖ＲＮＡとして存在すると考えられる。ＲＮＡヘリカーゼの活性は、巻き戻された一本鎖ＲＮＡ分子をテンプレートとして必要とするＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに重要であると考えられる。従って、ヘリカーゼの生物学的活性は、ＨＣＶ複製に必要であると考えられる。
【０００５】
フラビウイルス科の３つの属（フラビウイルス、ペスチウイルス、およびＨＣＶ）のＮ
Ｓ３タンパク質は、セリンタイププロテイナーゼの保存配列モチーフ、およびヌクレオシドトリホスファターゼ（ＮＴＰａｓｅ）／ＲＮＡヘリカーゼの保存配列モチーフを有することが示されている。ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質のＮ’末端の１／３は、ＮＳ３−ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ接合部を切断するトリプシン様セリンプロテイナーゼであることが示されている（Ｆａｉｌａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６８：３７５３−３７６０（１９９４））。ＮＳ３ Ｃ’末端フラグメントの２／３は、ＮＴＰａｓｅ／ＲＮＡヘリカーゼ活性をコードすることが示されている（Ｃｈｏｏら、ＰＮＡＳ、８８：２４５１−２４５５（１９９１）、およびＧｏｒｂａｌｅｎｙａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７：４７１３−４７２９（１９８９））。Ｓｕｚｉｃｈらは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現したＨＣＶ ＮＳ３のカルボキシ末端フラグメントの２／３が、ポリヌクレオチド刺激性ＮＴＰａｓｅ活性を有することを示した（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、６７：６１５２−６１５８（１９９３））。Ｇｗａｃｋらは、「ＮＴＰａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ ＮＳ３
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ．、５（２）：１７１−１７５（１９９５）において、２つのＨＣＶ ＮＳ３タンパク質ｐ７０およびｐ４３がバキュロウイルス発現系で発現されることを示した。ｐ７０は、ＮＳ３モノクローナル抗体により阻害される特異的なＮＴＰａｓｅ活性を示した。Ｗａｒｒｅｎｅｒら（「Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ ＮＳ３（ｐ８０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｏｓｓｅｓｓｅｓ ＲＮＡ Ｈｅｌｉｃａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１７２０−１７２６（１９９５））は、バキュロウイルス発現系において発現されたウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）ＮＳ３タンパク質が、ＲＮＡヘリカーゼ活性を有することを示した。ＪＰ ０６ ３１９５８３Ａは、バキュロウイルスの非必須領域へのＨＣＶヘリカーゼ遺伝子の導入による、ＨＣＶによりコードされるヘリカーゼタンパク質の調製を記載している。ヘリカーゼアミノ酸配列は、ＨＣＶポリタンパク質の１２００〜１５００として報告されている。上記の全ての書類はその全体が本明細書中で参考として援用される。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ８９／０４６６９９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第ＷＯ９２／０２６４２号パンフレット
【特許文献３】欧州特許第３１８，２１６号明細書
【特許文献４】欧州特許出願公開第３８８，２３２号明細書
【特許文献５】特開平６−３１９５８３号公報
【非特許文献１】Ｆａｉｌａら、「Both NS3 and NS4A are required for proteolytic processing of hepatitis C virus nonstructural proteins.」、Journal of virology、米国、American Society For Microbiology、1994年６月、68(6)、3753-60頁
【非特許文献２】Ｃｈｏｏら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、米国、National Academy of Sciences、１９９１年、８８、２４５１−２４５５頁
【非特許文献３】Gorbalenyaら、「Two related superfamilies of putative helicases involved in replication, recombination, repair and expression of DNA and RNA genomes.」、Nucleic acids research.、英国、Oxford University Press、1989年６月２６日、17(12)、4713-30頁
【非特許文献４】Ｓｕｚｉｃｈら、「Hepatitis C virus NS3 protein polynucleotide-stimulated nucleoside triphosphatase and comparison with the related pestivirus and flavivirus enzymes.」、Journal of virology.、米国、American Society For Microbiology、1993年１０月、67(10)、6152-8頁
【非特許文献５】Ｇｗａｃｋら、「ＮＴＰａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ」、Molecular cell.、米国、Cell Press、１９９５年、５（２）、１７１−１７５頁
【非特許文献６】Ｗａｒｒｅｎｅｒら、「Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ ＮＳ３（ｐ８０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｏｓｓｅｓｓｅｓ ＲＮＡ Ｈｅｌｉｃａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Journal of virology、米国、American Society For Microbiology、１９９５年、６９、１７２０−１７２６頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ヘリカーゼ活性および改善された溶解性を有する組換えＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメント、ヘリカーゼ活性および改善された溶解性を有する融合ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメント、ヘリカーゼ活性および改善された溶解性を有する短縮され変更されたＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメント、ならびにこれらのためのクローニングおよび発現ベクター、ならびにこれらのタンパク質フラグメントを、化合物がＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害し、従ってＨＣＶ複製を阻害し得るかどうかを評価するためのスクリーニングアッセイで使用するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１つの局面において、本発明は、配列番号２に示される配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼフラグメントを含む組成物を提供する。
【０００８】
好ましい実施態様において、上記フラグメントは、化学合成または組換えＤＮＡ発現により産生され得る。
【０００９】
さらに好ましい実施態様において、上記フラグメントは、アミノ酸１５６１〜１６５７にそのカルボキシ末端を有し得る。
【００１０】
さらに好ましい実施態様において、上記フラグメントは、アミノ酸１１９３〜アミノ酸１２２３にそのアミノ末端を有し得る。
【００１１】
別の局面において、本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を実質的に有するＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼフラグメントに融合した適切な融合パートナーを含む融合タンパク質を提供する。
【００１２】
好ましい実施態様において、上記融合パートナーは、ヒトスーパーオキシドジスムターゼを含み得る。
【００１３】
さらに好ましい実施態様において、上記フラグメントは、化学合成または組換えＤＮＡ発現により産生され得る。
【００１４】
さらに好ましい実施態様において、上記ヘリカーゼフラグメントは、アミノ酸１５６１〜アミノ酸１６５７にそのカルボキシ末端を有し得る。
【００１５】
さらに好ましい実施態様において、上記ヘリカーゼフラグメントは、アミノ酸１１９３〜アミノ酸１２２３にそのアミノ末端を有し得る。
【００１６】
好ましい実施態様において、上記融合パートナーは、ユビキチンであり得る。
【００１７】
別の局面において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を実質的に有するＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【００１８】
別の局面において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を実質的に有するＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼフラグメントおよび融合パートナーを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【００１９】
好ましい実施態様において、上記融合パートナーは、ｈＳＯＤ、酵母α因子、ＩＬ−２Ｓ、ユビキチン、βガラクトシダーゼ、βラクタマーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびウレアーゼからなる群より選択され得る。
【００２０】
さらに好ましい実施態様において、上記ヘリカーゼフラグメントは、アミノ酸１５６１〜アミノ酸１６５７にそのカルボキシ末端を有し得る。
【００２１】
さらに好ましい実施態様において、上記ヘリカーゼフラグメントは、アミノ酸１１９３〜アミノ酸１２２３にそのアミノ末端を有し得る。
【００２２】
別の局面において、本発明は、化合物をＣ型肝炎ウイルスに対する活性についてアッセイするための方法であって：
配列番号２に示される配列と実質的に同じ配列を有するＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼフラグメントを提供する工程；
このフラグメントを、ＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害し得る化合物と接触させる工程；および
このＣ型肝炎ウイルスヘリカーゼの活性の阻害を測定する工程、
を包含する方法を提供する。
【００２３】
好ましい実施態様において、上記フラグメントは、アミノ酸１５６１〜アミノ酸１６５７にそのカルボキシ末端を有し得る。
【００２４】
さらに好ましい実施態様において、上記フラグメントは、アミノ酸１１９３〜アミノ酸１２２３にそのアミノ末端を有し得る。
【００２５】
別の局面において、本発明は、宿主細胞中でＨＣＶ ＮＳ３活性ヘリカーゼフラグメントを産生するための発現ベクターであって：
配列番号２に示す配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
このフラグメントをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連絡された、この宿主細胞中で機能する転写および翻訳調節配列；および
選択マーカー
を含むベクターを提供する。
【００２６】
好ましい実施態様において、本発明は、発現の際に融合タンパク質を形成するために、上記フラグメントをコードするポリヌクレオチドに連結された、融合パートナーをコードする配列をさらに含み得る。
【００２７】
好ましい実施態様において、上記融合パートナーは、ｈＳＯＤ、酵母α因子、ＩＬ−２Ｓ、ユビキチン、βガラクトシダーゼ、βラクタマーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびウレアーゼからなる群より選択され得る。
【００２８】
さらに好ましい実施態様において、上記フラグメントは、アミノ酸１５６１〜アミノ酸１６５７にそのカルボキシ末端を有し得る。
【００２９】
さらに好ましい実施態様において、上記フラグメントは、アミノ酸１１９３〜アミノ酸１２２３にそのアミノ末端を有し得る。
【発明の効果】
【００３０】
本発明により、ヘリカーゼ活性および改善された溶解性を有する組換えＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメント、ヘリカーゼ活性および改善された溶解性を有する融合ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメント、ヘリカーゼ活性および改善された溶解性を有する短縮され変更されたＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメント、ならびにこれらのためのクローニングおよび発現ベクター、ならびにこれらのタンパク質フラグメントを、化合物がＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害し、従ってＨＣＶ複製を阻害し得るかどうかを評価するためのスクリーニングアッセイで使用するための方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
発明の実施態様
Ａ．定義
用語「Ｃ型肝炎ウイルス」および「ＨＣＶ」は、ＢＢ−ＮＡＮＢＨの主要な病因因子であるウイルス種をいう。そのプロトタイプの単離体は、ＰＣＴ ＷＯ８９／０４６６９９；欧州特許出願公開第３１８，２１６号、第３８８，２３２号、および第３９８，７４８号、ならびにＰＣＴ ＷＯ９２／０２６４２に同定されている。本明細書中で使用される「ＨＣＶ」は、Ｃ型肝炎を引き起こし得る病原性株および弱毒化株またはそれ由来の欠損干渉粒子を含む。ＨＣＶゲノムはＲＮＡから構成される。ＲＮＡを有するウイルスは比較的高率で自発的に変異し、その率は、取り込んだヌクレオチドあたり１０−３から１０−４のオーダーと報告されている（ＦｉｅｌｄｓおよびＫｎｉｐｅ、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」（１９８６、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．））。遺伝子型の異種性および流動性は、ＲＮＡウイルスの固有の特徴であるので、ＨＣＶ種には複数の株／単離体（毒性または無毒性であり得る）が存在する。
【００３２】
ＨＣＶのいくつかの異なる株／単離体、特に株または単離体ＣＤＣ／ＨＣＶＩ（ＨＣＶ１ともいう）についての情報が、本明細書中に開示されている。１つの株または単離体からの情報（例えば、部分的なゲノム配列）は、当業者が標準的な技法を用いて、新規の株
／単離体を単離すること、およびこのような新規の株／単離体がＨＣＶであるかどうかを同定することを可能にするに十分である。代表的には、異なる株（多くのヒト血清（および異なる地理的領域）から得られ得る）が、ＨＣＶ１のゲノム配列からの情報を用いて単離される。
【００３３】
ＨＣＶは、現在、他の２つの属がペスチウイルスおよびフラビウイルスであるフラビウイルス科の新規の属として分類されている。フラビウイルス科は、小さなエンベロープを有するヒト病原体である多くのウイルスを含む。フラビウイルス粒子の形態および組成は公知であり、Ｍ．Ａ．Ｂｒｉｎｔｏｎ、「Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｔｈｅ Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ Ａｎｄ Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ」（シリーズ編者、Ｆｒａｅｎｋｅｌ−ＣｏｎｒａｔおよびＷａｇｎｅｒ、巻編者、ＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒおよびＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９８６）、３２７〜３７４頁に記載されている。一般に、形態に関しては、フラビウイルスは、脂質二重層により囲まれている中央のヌクレオキャプシドを含む。ビリオンは球状であり、約４０〜５０ｎｍの直径を有する。そのコアは直径約２５〜３０ｎｍである。ビリオンエンベロープの外表面にそって、直径約２ｎｍの末端瘤を有する長さ約５〜１０ｎｍの突起がある。この科の代表的な例には、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、デング熱ウイルスが挙げられる。これらは、ＨＣＶのＲＮＡゲノムよりわずかに大きく、約３５００アミノ酸のポリタンパク質前駆体をコードするプラス鎖ＲＮＡゲノム（約１１，０００ヌクレオチド）を有する。個々のウイルスタンパク質は、この前駆体ポリペプチドから切断される。
【００３４】
ＨＣＶのゲノムは、約１０，０００ヌクレオチドを含む一本鎖ＲＮＡのようである。ゲノムはプラス鎖であり、約３，０００アミノ酸のポリタンパク質をコードする連続した翻訳オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。ＯＲＦにおいて、構造タンパク質はＮ末端領域の最初の約１／４中にコードされ、ポリタンパク質の大部分は非構造タンパク質に属しているようである。全ての公知のウイルス配列と比較した場合、フラビウイルス科の非構造タンパク質およびペスチウイルス（これもまた、現在、フラビウイルス科の一部であると考えられている）との小さいが重要な共直線性（ｃｏ−ｌｉｎｅａｒ）相同性が観察される。
【００３５】
ＨＣＶポリタンパク質は、翻訳の間または翻訳後、宿主およびウイルスのプロテアーゼによりプロセシングされる。ＨＣＶの遺伝子地図は次のとおりである：アミノ末端からカルボキシ末端へ、ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｃ）、エンペロープタンパク質（Ｅ１）および（Ｅ２）、ならびに非構造タンパク質２、３、４（ａ＋ｂ）および５（ａ＋ｂ）（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、およびＮＳ５）。ＨＣＶ１のヌクレオチド配列にコードされた推定アミノ酸に基づくと、ＨＣＶポリタンパク質の先端のＮ末端の小さなドメインは、フラビウイルスポリタンパク質のＮ末端で見出されたヌクレオキャプシドタンパク質（Ｃ）と、サイズと塩基性残基の高い含有率との両方が類似しているようである。ＨＣＶおよび黄熱ウイルス（ＹＦＶ）の非構造タンパク質２、３、４および５（ＮＳ２〜５）は、アミノ酸配列は異なるが類似のサイズおよびハイドロパシー性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）の対応部分を有するようである。Ｍ、Ｅ、およびＮＳ１タンパク質を含むＹＦＶポリタンパク質の領域に対応するＨＣＶの領域は、配列が異なるだけでなく、サイズおよびハイドロパシー性が全く異なるようである。従って、ＨＣＶゲノムの特定のドメインは、本明細書中で、例えば、Ｅ１、Ｅ２、またはＮＳ２として言及され得るが、これらの名称は、単に言及の利便性のためであることが理解されるべきである；ＨＣＶファミリーとフラビウイルスとの間にはまだ理解されていない重要な相違があり得、これらの相違が表面化するにつれ、ドメインの名称は変化し得る。
【００３６】
ＨＣＶの株または単離体の進化関係のため、推定ＨＣＶ株および単離体は、ポリペプチドレベルでのそれらの相同性により同定され得る。本明細書中で開示される単離体に関し
て、新規のＨＣＶ株または単離体は、ポリペプチドレベルで、少なくとも約４０％相同であることが予想され、いくつかは約７０％以上相同であると、およびいくつかはさらに約８０％以上相同であると予想される：いくつかは約９０％以上相同であり得る。アミノ酸配列の相同性を決定するための技法は当該分野で公知である。例えば、アミノ酸配列が直接決定され、そして本明細書中に記載された配列と比較され得る。あるいは、推定ＨＣＶのゲノム物質のヌクレオチド配列が、（通常は、ｃＤＮＡ中間産物を介して）決定され得、そしてそれにコードされるアミノ酸配列が決定され得、そして対応する領域が比較され得る。
【００３７】
用語「ヘリカーゼ活性を示すＮＳ３タンパク質フラグメント」または「ＮＳ３タンパク質ヘリカーゼフラグメント」は、ヘリカーゼ活性を示すＨＣＶ ＮＳ３タンパク質に由来する酵素、特にＨＣＶゲノムのＮＳ３ドメインのカルボキシ末端側２／３にコードされるポリペプチドの部分をいう。一般には、プロテアーゼ活性を示すＨＣＶ ＮＳ３タンパク質の部分、すなわちアミノ末端側１／３に見いだされる部分は除かれる。ＨＣＶの少なくとも１つの株が、ＮＳ３タンパク質フラグメント中のアミノ酸残基の次の配列、すなわち、図１に示されるＮＳ３タンパク質のおよそアミノ酸１１９３〜１６５７により、またはこの配列中に実質的にコードされると考えられるヘリカーゼ活性を示すＮＳ３タンパク質フラグメントを含有する。このようなヘリカーゼフラグメントの配列を以下に記載する：
【００３８】
【化１】
。
【００３９】
ヘリカーゼフラグメントの上記ＮおよびＣ末端は推定であり、実際の末端は、ＮＳ３ドメイン全体をコードするＤＮＡ構築物の適切な宿主中での発現およびプロセシングにより規定される。ＨＣＶのようなＲＮＡウイルスは、多くの変化を示すことが知られるので、この配列は株ごとに変化し得ることが理解される。さらに、ヘリカーゼ活性を示すＮＳ３タンパク質フラグメントは、前駆体ポリタンパク質から切断されるので、実際のＮおよびＣ末端は変化し得る：ヘリカーゼアミノ酸配列の変化は、ヘリカーゼ活性に関して異なる末端を生じ得る。従って、アミノ末端およびカルボキシ末端はＨＣＶの株ごとに異なり得る。活性に必要な最小配列が確かに存在し、本明細書中で決定された。ＮＳ３フラグメントの配列は、任意の所望の数の塩基対を除くために、コード配列の５’または３’末端（またはその両方）での制限エンドヌクレアーゼを用いた切断後、エキソヌクレアーゼを用いて適切な発現ベクターを処理することによって、一端または両端で短縮され得る。次いで、得られたコードポリヌクレオチドが発現され、そして配列が決定される。この様式で、得られた産物の活性がアミノ酸配列と相関づけられ得る：限られた一連のこのような実験（累進的に多くの数の塩基対を除去する）は、ヘリカーゼ活性に必要な最小の内部配列を決定する。ＨＣＶ ＮＳ３フラグメントの配列は、ヘリカーゼ活性を十分に保持しつつ、特にカルボキシ末端で、およそ５０アミノ酸まで、実質的に短縮され得る。引き続くカルボキシ短縮は、ついにはヘリカーゼ活性の損失を生じてしまう。１３５アミノ酸あたりでのさらなるカルボキシ短縮は、ＮＴＰａｓｅ活性の損失を生じる。ＮＳ３フラグメントのアミノ末端（すなわち、ＨＣＶ−１アミノ酸配列の１１９０あたりから始まるフラグメント）はまた、ヘリカーゼ活性を損失することなく、ある程度短縮され得る。しかし驚くことに、２０アミノ酸程度までの推定ヘリカーゼドメインのアミノ末端短縮は、精製およびアッセイ緩衝液中のフラグメントの溶解性の増加を生じる。一般に、ＮＳ３タンパク質は緩衝液に不溶である。ヘリカーゼＮ末端のおよそ２０アミノ酸を欠失させた場合、フラグメントは緩衝液に可溶になる。しかし、およそ３５アミノ酸を欠失させた場合、フラグメントはＮＴＰａｓｅおよびヘリカーゼ活性の両方を失う。ＮＳ３タンパク質のアミノ末端部分（すなわち、アミノ酸１０２７あたりから始まる部分）が、プロテアーゼ活性を示すことは公知である。しかし、プロテアーゼ活性は、本発明のＨＣＶヘリカーゼに必要ではなく、実際、プロテアーゼ活性を示すＮＳ３のアミノ末端フラグメントは、ヘリカーゼまたは本発明のフラグメントから除かれる。
【００４０】
「ＨＣＶ ＮＳ３フラグメントヘリカーゼアナログ」は、上記のヘリカーゼ活性を有するＮＳ３カルボキシフラグメントから、天然のヘリカーゼフラグメントのアミノ酸配列に対する欠失、変更および／または付加により変化するポリペプチドをいう。ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼフラグメントアナログとして、上記の短縮型ヘリカーゼフラグメント、ならびにＨＣＶ ＮＳ３フラグメントヘリカーゼ変異体、およびＨＣＶ ＮＳ３タンパク質ヘリカーゼフラグメント、短縮型ＮＳ３タンパク質ヘリカーゼフラグメントまたはＮＳ３フラグメントヘリカーゼ変異体を含む融合ヘリカーゼフラグメントが挙げられる。ＨＣＶ
ＮＳ３フラグメントヘリカーゼ変異体を形成するための変更は、好ましくは保存的アミノ酸置換であり、そこでは、アミノ酸は類似の性質の別の天然に存在するアミノ酸と置き換えられる。例えば、次の置換が「保存的」と考えられる：
【００４１】
【化２】
。
【００４２】
非保存的変化は、一般に、上記アミノ酸の１つを異なるグループのアミノ酸と置換すること（例えば、ＡｓｎとＧｌｕの置換）、あるいは上記アミノ酸のいずれかを、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、またはＰｒｏと置換することである。通常のアミノ酸を含む置換は、所望のタンパク質をコードする発現ベクターの部位特異的変異誘発、およびそれに続く変更形態の発現により簡便に実行される。また、合成または半合成法によりアミノ酸を変更し得る。例えば、単離したタンパク質の適切な化学処理により、システインまたはセリン残基をセレノシステインに変換し得る。あるいは、標準的なインビトロタンパク質合成法において、非通常なアミノ酸を組み込み得る。代表的には、変異体中の天然配列に対して変化、欠失、または付加した残基の総数は、約２０を超えず、好ましくは約１０を超えず、そして最も好ましくは約５を超えない。
【００４３】
用語、融合タンパク質は、一般には、２つまたはそれ以上の個々のタンパク質から得られるアミノ酸配列を含むポリペプチドをいう。本発明において、「融合タンパク質」は、非ＨＣＶタンパク質またはポリペプチド（「融合パートナー」）に融合された、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼフラグメント、短縮体、変異体、またはそれらの機能的部分を含むポリペプチドを示すために用いられる。融合タンパク質は、融合遺伝子の発現により最も簡便に産生される。この融合遺伝子は、あるポリペプチドの一部分を５’末端に、異なるポリペプチドの一部分を３’末端にコードする。ここで、それらの異なる部分は、適切な宿主中で発現され得る１つのリーディングフレーム内で結合されている。融合タンパク質のカルボキシ末端にＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼフラグメントまたはアナログを位置させること、およびアミノ末端に機能性酵素フラグメントを用いることが本発明では好ましい（しかし必要はない）。ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼフラグメントは、通常、大きなポリタンパク質内に発現される。ヘリカーゼフラグメントは、細胞輸送シグナル（例えば、輸出または分泌シグナル）を含むことは期待出来ない。適切な機能性酵素フラグメントは、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼフラグメントと融合して発現した場合、定量可能な活性を示すポリペプチドである。例としての酵素には、βガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、βラクタマーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）、ウレアーゼなどが含まれるが、これらに限定されない。これらの酵素は、産生された融合タンパク質の量が、単純な呈色アッセイにより定量され得るので都合がよい。あるいは、金属結合カラムによる単純な検出および融合パートナーに特異的な抗体を用いる融合タンパク質の定量を可能にするため、フラグメントまたは抗原性タンパク質を用い得る。本発明に好ましい融合パートナーは、カルボキシ末端の６つのヒスチジン残基である。
【００４４】
Ｂ．全般的な方法
本発明の実施は、一般に、当該分野の技術の範囲内である分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来技法を使用する。このような技法は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（１９８９）；「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５年）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｎ」（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｓｌａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６年）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４年）；シリーズ「Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８７）１５４および１５５（それぞれ、ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ編ならびにＷｕ編）；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７年）、「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｓｃｏｐｅｓ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、第二版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．、１９８７年）；および「Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、第Ｉ巻〜第ＩＶ巻（ＷｅｉｒおよびＢｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年）を参照。
【００４５】
示された宿主に適合する適切な制御配列を使用する場合、原核および真核宿主細胞の両方とも、所望のコード配列を発現するために有用である。原核宿主中では、Ｅ．ｃｏｌｉが最も頻繁に使用される。原核生物用の発現制御配列は、プロモーター（必要に応じて、オペレーター部分を含む）、およびリボソーム結合部位を含む。原核宿主に適合するトランスファーベクターは、一般に、例えば、ｐＢＲ３２２（アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性を与えるオペロンを含有するプラスミド）、および種々のｐＵＣベクター（これもまた、抗生物質耐性マーカーを与える配列を含有する）由来である。これらのプラスミドは市販されている。マーカーは、選択によって、成功した形質転換体を得るために使用され得る。一般的に使用される原核生物の制御配列には、Ｔ７バクテリオファージプロモーター（ＤｕｎｎおよびＳｔｕｄｉｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）１６６：４７７）、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）１９８：１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８０）８：４０５７）、ならびにλ由来ＰＬプロモーターおよびＮ遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８）、ならびに、ｔｒｐおよびｌａｃ ＵＶ５プロモーター配列由来のハイブリッドｔａｃプロモーター（Ｄｅ Ｂｏｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８３）２９２：１２８）が含まれる。前述の系はＥ．ｃｏｌｉと特に適合し、所望であれば、ＢａｃｉｌｌｕｓまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株のような他の原核宿主が、対応する制御配列とともに使用され得る。
【００４６】
真核宿主には、培養系では酵母および哺乳動物細胞が含まれるが、これらに限定されない。酵母発現宿主には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｉｃｈｉａなどが含まれる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓならびにＫ．ｌａｃｔｉｓは、最も一般的に使用される酵母宿主ならびに好都合なカビ宿主である。酵母適合ベクターは、野生型株に重金属に対する耐性を、または栄養要求性変異体に原栄養性を与えることによって、成功した形質転換体の選択を可能にするマーカーを有する。酵母適合ベクターは、２ｍ複製起点（Ｂｒｏａｃｈら、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８３）１０１：３０７
）を、ＣＥＮ３とＡＲＳ１との組合せ、または、複製を確実にする他の手段（例えば、適切なフラグメントの宿主細胞ゲノムへの組み込みを生じる配列）を使用し得る。酵母ベクターのための制御配列は、当該分野で公知であり、３−ホスホグリセレートキナーゼ用のプロモーター（Ｒ．Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８０）２５５：２０７３）を含む、解糖酵素の合成用プロモーター（Ｈｅｓｓら、Ｊ Ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ（１９６８）７：１４９；Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９７８），１７：４９００）を包含する。ターミネーター（例えば、エノラーゼ遺伝子に由来するターミネーター（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８１）２５６：１３８５））もまた包含され得る。特に有用な制御系は、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）調節可能プロモーター、ＧＡＰＤＨ由来のターミネーター、および分泌が所望であれば、酵母α−因子由来のリーダー配列を含む制御系である（本明細書に参考として援用される米国特許第４，８７０，００８号を参照）。
【００４７】
本発明に好ましい発現系は、融合パートナーとしてユビキチンリーダーを使用する。１９８９年８月７日出願の係属出願ＵＳＳＮ ７／３９０，５９９は、酵母ユビキチン融合タンパク質の高発現用ベクターを開示した。酵母ユビキチンは、発現に際して融合タンパク質から自動的に切断される７６アミノ酸ポリペプチドを提供する。ユビキチンアミノ酸配列の以下のとおりである：
【００４８】
【化３】
。
【００４９】
Ｏｚｋａｙｎａｋら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１２：６６３−６６もまた参照。ユビキチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ３８０Ａ ＤＮＡ合成機を使用して、Ｂａｒｒら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８８）２６８：１６７１−７８の技法に従い、標準的な方法によって合成され得る。適切なリンカーを使用して、ユビキチン遺伝子は、適切なベクターへ挿入され、ＨＣＶヘリカーゼをコードする配列またはそのフラグメントに連結され得る。
【００５０】
さらに、作動可能に連結された転写調節領域および転写開始領域は、野生型生物では天然には結合していないものであり得る。これらの系は、１９８４年１０月３日公開のＥＰＯ第１２０，５５１号；１９８４年８月２２日公開のＥＰＯ第１１６，２０１号、および１９８５年１２月１８日公開のＥＰＯ第１６４，５５６号に詳細に記載され、これらはすべて本発明と共有され、全体が本明細書に参考として援用される。
【００５１】
発現用の宿主として入手可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、および他の多数の細胞株を含む、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株を包含する。哺乳動物細胞に適切なプロモーターもまた、当該分野で公知であり、ウイルスプロモーター（例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７３：１１３）、ラウス肉腫ウイ
ルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、およびウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）由来のプロモーター）を包含する。哺乳動物細胞はまた、ターミネーター配列およびポリＡ付加配列を必要とし得る。発現を増大させるエンハンサー配列もまた包含され得、遺伝子増幅を促進する配列（例えば、メトトレキセート耐性遺伝子）もまた望ましくあり得る。これらの配列は当該分野で公知である。
【００５２】
哺乳動物細胞における複製に適したベクターは、当該分野で公知であり、ウイルスレプリコン、またはＨＣＶエピトープをコードする適切な配列の宿主ゲノムへの組み込みを確実にする配列を包含し得る。例えば、外来ＤＮＡを発現するために使用される別のベクターは、ワクシニアウイルスである。この場合には、異種ＤＮＡはワクシニアゲノムに挿入される。外来ＤＮＡをワクシニアウイルスゲノムへ挿入するための技法は、当該分野で公知であり、例えば、相同組換えを利用し得る。異種ＤＮＡは、一般に、ウイルスに対して必須ではない遺伝子、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）（これはまた選択マーカーも提供する）に挿入される。組換えウイルスの構築を非常に容易にするプラスミドベクターは、記載されている（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ（１９８４）４９：８５７；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９８５）５：３４０３；Ｍｏｓｓ、ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＶＥＣＴＯＲＳ ＦＯＲ ＭＡＭＭＬＩＡＮ ＣＥＬＬＳ（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ、１９８７）、１０頁を参照）。ＨＣＶポリペプチドの発現は、次いで、組換え生ワクシニアウイルスに感染した細胞または動物に生じる。
【００５３】
ワクシニアベクターからＨＣＶポリペプチドが発現するかどうかを検出するため、ＢＳＣ １細胞を、組換えベクターに感染させ、発現を可能にする条件下で、顕微鏡スライド上で増殖させ得る。次いで、細胞はアセトン固定され、そして組換え発現ベクター中のＨＣＶセグメントが由来したＨＣＶゲノム領域にコードされるポリペプチドに対する抗ＨＣＶ抗体を含有することが既知である血清を使用して、免疫蛍光アッセイが実施され得る。
【００５４】
真核生物またはウイルスゲノムの発現用の他の系は、昆虫細胞、およびこれらの細胞での使用に適したベクターを包含する。これらの系は、当該分野で公知であり、例えば、バキュロウイルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核ポリヘドロシスウイルス（ＡｃＮＰＶ）由来の昆虫発現移入ベクター（これはヘルパー非依存性ウイルス発現ベクターである）を包含する。この系由来の発現ベクターは、通常、異種遺伝子の発現を駆動するために強力なウイルスポリヘドリン遺伝子プロモーターを使用する。ＡｃＮＰＶへの外来遺伝子の導入用に、現在最も一般的に使用される移入ベクターは、ｐＡｃ３７３である（ＰＣＴ ＷＯ８９／０４６６９９およびＵＳＳＮ ７／４５６，６３７を参照）。当業者に公知の他の多くのベクターもまた、改良発現用に設計された。これらには、例えば、ｐＶＬ９８５（これは、ポリヘドリン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変え、このＡＴＴから３２ｂｐ下流にＢａｍＨＩクローニング部位を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｖｉｒｏｌ（１９８９）１７：３１を参照）を包含する。非融合外来タンパク質の高レベル発現のためのＡｃＮＰＶ移入ベクターは、係属出願ＰＣＴ ＷＯ８９／０４６６９９およびＵＳＳＮ ７／４５６，６３７に記載されている。単一のＢａｍＨＩ部位が、ポリヘドリン遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧに関して−８位の後に配置される。ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩ、ＳｓｔＩの切断部位はいずれも存在しない。非融合外来タンパク質の良好な発現は、通常、ＡＴＧ開始シグナルに先行する適切な翻訳開始シグナルを含有する短いリーダー配列を理想的には有する外来遺伝子を必要とする。プラスミドはまた、ポリヘドリンポリアデニル化シグナル、ならびに選択およびＥ．ｃｏｌｉでの増殖のためのアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子および複製起点を含有する。
【００５５】
バキュロウイルスの所望部位へ異種ＤＮＡを導入するための方法は、当該分野で公知で
ある。（ＳｕｍｍｅｒおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５：Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９８３）３：２１５６−２１６５；ならびにＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｖｉｒｏｌ（１９８９）１７：３１を参照）。例えば、異種ＤＮＡは、相同組換えによって、ポリヘドリン遺伝子のような遺伝子へ挿入され得るか、または、所望のバキュロウイルス遺伝子中に操作された制限酵素部位に挿入され得る。この挿入される配列は、ポリタンパク質の全部または種々のセグメントをコードする配列、またはウイルスポリペプチドをコードする他のｏｒｆであり得る。例えば、インサートは、ポリタンパク質に由来する以下の番号のアミノ酸セグメントをコードし得る：アミノ酸１〜１０７８；アミノ酸３３２〜６６２；アミノ酸４０６〜６６２；アミノ酸１５６〜３２８、およびアミノ酸１９９〜３２８。
【００５６】
翻訳後修飾（例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質分解切断、およびリン酸化）のためのシグナルは、昆虫細胞によって認識されるようである。分泌および核蓄積に必要なシグナルもまた、無脊椎動物細胞と脊椎動物細胞との間で保存されるようである。無脊椎動物細胞において有効な、脊椎動物細胞由来のシグナル配列の例は、当該分野で公知であり、例えば、細胞からの分泌をシグナルするヒトインターロイキン−２−シグナル（ＩＬ２Ｓ）は、昆虫細胞内で認識され、適切に除去される。
【００５７】
形質転換は、例えば、ポリヌクレオチドのウイルス内へのパッケージングおよびウイルスによる宿主細胞の形質導入を含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞へ導入するための公知方法、ならびにポリヌクレオチドの直接取り込みにより得る。使用される形質転換手順は、形質転換される宿主に依存する。直接取り込みによる細菌の形質転換は、一般に、塩化カルシウムまたは塩化ルビジウムでの処理を用いる（Ｃｏｈｅｎ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９７２）６９：２１１０；Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８２））。直接取り込みによる酵母の形質転換は、Ｈｉｎｎｅｎら、ＰｒｏｃＮａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９７８）７５：１９２９の方法を用いて実施され得る。直接取り込みによる哺乳動物の形質転換は、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ
Ｅｂ、Ｖｉｏｌ（１９７８）５２：５４６のリン酸カルシウム沈澱法、またはその種々の公知の変法を使用して実施され得る。細胞（特に哺乳動物細胞）に、組換えポリヌクレオチドを導入する他の方法には、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソームへのカプセル化、およびポリヌクレオチドの核への直接マイクロインジェクションが含まれる。
【００５８】
ベクター構築は、当該分野で公知の技法を使用する。部位特異ＤＮＡ切断は、適切な制限酵素を用いて、これらの市販の酵素の製造者によって一般的に特定された条件下で、処置することによって実施され得る。一般に、約１ｍｇのプラスミドまたはＤＮＡ配列は、約２０ｍＬの緩衝溶液中１単位の酵素によって、３７℃にて１〜２時間のインキュベーションにより切断される。制限酵素とのインキュベーション後、タンパク質は、フェノール／クロロホルム抽出により除去され、ＤＮＡはエタノールでの沈澱によって回収される。切断されたフラグメントは、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８０）６５：４９９−５６０に記載されている一般的な手順に従って、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲルの電気泳動法を用いて分離され得る。
【００５９】
粘着末端化切断フラグメントは、混合物中に存在する適切なデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）とともに、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）を使用して、平滑末端化され得る。Ｓ１ヌクレアーゼによる処理もまた
使用され得、任意の一本鎖ＤＮＡ部分の加水分解を生じる。
【００６０】
連結は、標準的な緩衝液および温度条件下で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよびＡＴＰを使用して実施される；粘着末端連結は、平滑末端連結より少ないＡＴＰおよび少ないリガーゼを必要とする。ベクターフラグメントが連結混合物の一部分として使用されるときは、そのベクターフラグメントは、しばしば、細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）またはウシ腸アルカリホスファターゼで処理されて、５’−ホスフェートが除去され、従って、ベクターの再連結が防がれる。あるいは、不必要なフラグメントの制限酵素消化が、連結を防ぐために使用され得る。
【００６１】
連結混合物は、Ｅ．ｃｏｌｉのような適切なクローニング宿主へ形質転換され、成功した形質転換体は、組み込まれたマーカー（例えば、抗生物質耐性）によって選択され、正確な構築物についてスクリーニングされる。
【００６２】
合成オリゴヌクレオチドは、Ｗａｒｎｅｒ、ＤＮＡ（１９８４）３：４０１によって記載されているような自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して調製され得る。所望であれば、合成鎖は、標準的な反応条件下にて、３２Ｐ−ＡＴＰの存在下で、ポリヌクレオチドキナーゼでの処理によって、３２Ｐで標識され得る。
【００６３】
ｃＤＮＡライブラリーから単離されたものを含むＤＮＡ配列は、公知の技法、例えば、部位特異的変異誘発（例えば、Ｚｏｌｌｅｒ、Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８２）１０：６４８７を参照）によって修飾され得る。簡潔に述べると、修飾されるＤＮＡは、一本鎖配列としてファージへパッケージされ、修飾されるＤＮＡの一部分に相補的な合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、ＤＮＡポリメラーゼによって二本鎖ＤＮＡに変換される。ここで、所望の修飾はプライマー配列に含まれる。得られた二本鎖ＤＮＡは、ファージ支持宿主細菌へ形質転換される。ファージの各鎖のコピーを含有する形質転換細菌の培養物は、寒天中にプレートされてプラークを得る。理論的には、新しいプラークの５０％が、変異配列を有するファージを含有し、残りの５０％は元の配列を有する。プラークの複製物は、適切な鎖とのハイブリダイゼーションを可能にするが、非修飾配列とのハイブリダイゼーションは可能でない温度および条件下で、標識された合成プローブにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションによって同定された配列は、回収されてクローン化される。
【００６４】
ＤＮＡライブラリーは、ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９７５）７３：３９６１の手順を使用して、プローブされ得る。簡潔に述べれば、この手順において、プローブされるＤＮＡは、ニトロセルロースフィルター上に固定され、変性され、そして０〜５０％ホルムアミド、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸Ｎａ、各々０．０２％（ｗｔ／ｖ）のウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、およびＦｉｃｏｌｌ（登録商標）、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）、０．１％ ＳＤＳ、ならびに１００ｍｇ／ｍＬキャリア変性ＤＮＡを含有する緩衝液でプレハイブリダイズされる。緩衝液中のホルムアミドの割合、ならびにプレハイブリダイゼーションおよび続くハイブリダイゼーション工程の時間および温度条件は、必要なストリンジェンシーに依存する。より低いストリンジェンシー条件が必要なオリゴマープローブは、一般に、低い割合のホルムアミド、より低い温度、およびより長いハイブリダイゼーション時間で用いられる。３０または４０ヌクレオチド以上を含むプローブ（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノム配列由来のプローブ）は、一般に、より高い温度（例えば約４０〜４２℃）、および高い割合のホルムアミド（例えば５０％）を用いる。プレハイブリダイゼーション後、５’−３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブは緩衝液に添加され、フィルターは、ハイブリダイゼーション条件下で、この混合物中でインキュベートされる。洗浄後、処理されたフィルターをオートラジオグラフィーに供し、ハイブリダイ
ズしたプローブの位置を示す；元の寒天プレート上の対応する位置のＤＮＡが、所望のＤＮＡの供給源として使用される。
【００６５】
ルーチンのベクター構築のために、連結混合物が、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＨＢ１０１または他の適切な宿主へ形質転換され、成功した形質転換体が抗生物質耐性または他のマーカーによって選択される。次に、形質転換体からのプラスミドが、通常、クロラムフェニコール増幅（Ｃｌｅｗｅｌｌ、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（１９７２）１１０：６６７）の後、Ｃｌｅｗｅｌｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９６９）６２：１１５９の方法に従って調製される。ＤＮＡが単離され、そして、通常、制限酵素分析および／または配列決定によって分析される。配列決定は、Ｍｅｓｓｉｎｇら、Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８１）９：３０９によりさらに記載されるように、Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９７７）７４：５４６３のジデオキシ法によって、またはＭａｘａｍら、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８０）６５：４９９の方法によって実施され得る。バンド圧縮に伴う問題（これは、時に、ＧＣリッチ領域で観察される）は、Ｂａｒｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８６）４：４２８に従って、Ｔ−デアゾグアノシンの使用により克服された。
【００６６】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が、抗原または抗体のいずれかの濃度を測定するために使用され得る。この方法は、酵素と抗原または抗体のいずれかとの結合に依存し、定量標識として結合酵素活性を使用する。抗体を測定するためには、既知の抗原を、固相（例えば、マイクロタイターディッシュ、プラスティックカップ、ディップスティック、プラスティックビーズなど）に固定し、試験血清希釈物とともにインキュベートし、洗浄し、酵素で標識された抗免疫グロブリンとともにインキュベートし、そして再度洗浄する。標識に適した酵素は当該分野で公知であり、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を包含する。固相に結合した酵素活性は、通常、特異基質を添加し、そして生成物形成または基質利用を比色決定することにより測定される。結合した酵素活性は、結合した抗体の量の正の関数である。
【００６７】
抗原を測定するためには、既知の特異抗体を固相に結合し、抗原を含む試験物質を添加し、インキュベーション後、その固相を洗浄し、酵素標識二次抗体を添加する。洗浄後、基質を添加し、酵素活性を比色的に測定し、これが抗原濃度と関連する。
【００６８】
フラビウイルス科の３つの属（フラビウイルス、ペスチウイルス、およびＨＣＶ）のＮＳ３タンパク質は、セリンタイププロテイナーゼの配列モチーフおよびヌクレオシドトリホスファターゼ（ＮＴＰａｓｅ）／ＲＮＡヘリカーゼの配列モチーフを保存している（図２を参照）。ＮＳ３タンパク質フラグメントのカルボキシ側２／３のＮＴＰａｓｅ／ＲＮＡヘリカーゼは、ＤＥＡＤボックスファミリーに属する。ＤＥＡＤボックスタンパク質ファミリーは、８つの高度に保存されたアミノ酸モチーフを有し、その１つが、ＡＴＰａｓｅモチーフとしても知られるＤＥＡＤ領域である。ＤＥＡＤタンパク質ファミリーは３つのサブファミリーからなる：ＤＥＡＤタンパク質、ＤＥＡＨタンパク質、およびＤＥＸＨタンパク質。図３は、ＤＥＸＨタンパク質ファミリーの保存配列モチーフ、およびＨＣＶ
ＮＳ３の対応するモチーフを示す。ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質は、ＤＥＸＨタンパク質サブファミリー中にその分類を生じるＤＥＣＨの配列モチーフを有する。
【００６９】
本明細書に開示されるＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントは、他の公知のＲＮＡヘリカーゼと類似する特性を有する。すなわち、それらは、二価カチオン（Ｍｎ２＋またはＭｇ２＋）およびＡＴＰの存在下でのみ、ＲＮＡヘリカーゼ活性を示す。より低レベルのＡＴＰ（約１ｍＭ）では、いずれのカチオン量の増加も、ＮＳ３フラグメントの酵素活性を阻害する。ＡＴＰ濃度が高い（約５ｍＭ）ときは、ヘリカーゼ活性は、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋カチオンが高濃度で存在するときでさえ、高レベルのままである。ＨｅＬａ細胞
から精製されたＲＮＡヘリカーゼＡは、そのコファクターとしてＭｇ２＋のみを必要とし、Ｍｎ２＋はＭｇ２＋の代用にはならない（本明細書に参考として援用される、Ｌｅｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．２６７：４３９８−４４０７（１９９２）を参照）。ペスチウイルスＮＳ３およびワクシニアウイルスＲＮＡヘリカーゼは、両カチオンを使用することが示されている。同様に、本明細書に開示されるＨＣＶ ＮＳ３タンパク質ヘリカーゼフラグメントは、両金属イオンを利用し得る。
【００７０】
ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質ヘリカーゼフラグメントのヘリカーゼ活性は、ｐＨ特異的であるようだ。実施例の実験はｐＨ６．５で実施された。しかし、ｐＨを７．６に増大させると、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質ヘリカーゼフラグメントは、１０％未満の鎖分離を示し、他の全ての成分は一定に保たれた（データは示さず）。ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質ヘリカーゼフラグメントのこれらの特性は、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質ヘリカーゼが、ペスチウイルスＮＳ３ ＲＮＡヘリカーゼ（これはｐＨ感受性であることが知られている）と同様の性質を有することを暗示する。
【００７１】
ＲＮＡヘリカーゼ活性は、２つの方法で、Ｅ．ｃｏｌｉの夾雑物に由来しないことが実証された。第一は、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントインサートを含まないｐＥＴ２１ｂプラスミドを、ネガティブコントロールとして使用した。ネガティブコントロール細胞培養物からの同じ抽出画分の酵素活性を試験し、検出可能なレベルのＮＴＰａｓｅもＲＮＡヘリカーゼ活性も存在しなかった。第二は、ＮＳ３タンパク質フラグメントのヘリカーゼ活性は、ＮＳ３特異モノクローナル抗体により阻害されたが、無関係な抗体はこの活性に影響しなかった。これらの結果から、ヘリカーセ活性は、Ｅ．ｃｏｌｉの夾雑物由来ではなく、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメント由来であることが決定された。
【００７２】
試験されたＲＮＡヘリカーゼの大部分は、一本鎖領域に結合し、次いで、一方向または両方向に移動することにより、二本鎖ＲＮＡを巻き戻した。３’および５’末端の両方に一本鎖領域を有する基質を使用した。Ｓｕｚｉｃｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７：６１５２−６１５８（１９９３）は、ＨＣＶ ＮＳ３のＣ’末端の２／３が、全てのＮＴＰおよびｄＮＴＰを加水分解し得ることを示した。このＮＴＰａｓｅ活性は、本明細書に開示されるＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントで観察された（データは示さず）。本明細書に記載される短縮型ＮＳ３タンパク質フラグメントが、Ｎ末端プロテイナーゼドメインの欠失にもかかわらず生化学的ヘリカーゼ活性を有することを示す結果は、プロテイナーゼおよびＮＴＰａｓｅドメインが独立して働き得ることを示唆する。
【００７３】
本発明のヘリカーゼ活性を示すＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントは、それらが、精製およびアッセイ緩衝液に可溶である（一方、ＮＳ３タンパク質全体は、一般的に可溶ではない）ので、有利である。ヘリカーゼフラグメントの溶解性は、最初に、種々のベクター由来のいくつかのクローンおよび融合タンパク質を構築することによって決定された。例えば、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を有するｐＧＥＸ−２Ｔベクターを使用して、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質（すなわち、ＨＣＶ−１の１０２７〜１６５７ａ．ａ．）をクローン化した。ＧＳＴとＨＣＶ ＮＳ３タンパク質との得られた融合タンパク質は不溶性であった。すなわち、単離された融合タンパク質の唯一の部分は、細菌抽出物の不溶性部分からのものであった。その融合タンパク質を、６Ｍ尿素を用いて変性することによって可溶化した。変性融合タンパク質が、濃度段階勾配に対する一連の透析により、再び折り畳まれた場合、再生融合タンパク質の小画分のみが正しく再び折り畳まれ、そして酵素活性は再生タンパク質には観察されなかった。ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質を、ｐＭＡＬベクターを用いて、マルトース結合タンパク質と融合した場合、この融合タンパク質は可溶であった。しかし、マルトース結合タンパク質それ自体が約４０ｋＤａあるので、この融合タンパク質の分子量は、比較的大きかった（Ｍ．Ｗ．１１０ｋＤａ）。従って、このような融合タンパク質は使用に望ましくない。さらに、マ
ルトース結合タンパク質ドメインを、これとＨＣＶ ＮＳ３タンパク質とを含有する融合タンパク質から分離するのは困難である。さらに、ｐＥＴ２１ｂベクターを利用して、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質ドメイン（アミノ酸１０２７〜１６５７）を発現させた。このタンパク質の発現レベルは非常に低く、ほんの少量のタンパク質のみが単離された。
【００７４】
従って、例えば、ｐＥＴベクター系における本発明のＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントは、以下の利点を提供する：
１）ｐＭＡＬまたはｐＧＥＸベクターのプロモーターと比較した場合、より良好なＴ７プロモーター系；
２）ヘリカーゼ活性を有する発現ＮＳ３タンパク質フラグメントの溶解性の増大；
３）融合タンパク質から非ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントを除去する必要性の排除；および
４）ニッケルカラムクロマトグラフィーを用いる簡便な精製工程。
さらに、ヘリカーゼ活性を有する可溶性ＮＳ３タンパク質フラグメントは、不溶性の完全長タンパク質に対していくつかの利点を有する。第一に、可溶性タンパク質フラグメントは、精製および酵素アッセイにおける使用のために、変性および再折り畳みの必要がない。不溶性タンパク質またはフラグメントは、精製のために、尿素またはグアニジン−ＨＣｌによって変性される必要があり、次いで、タンパク質フラグメントの再折り畳みおよびその酵素活性の回収の前に、尿素またはグアニジン−ＨＣｌを除去するため、濃度段階勾配に対して透析されなければならない。第二に、発現系からの可溶性ＮＳ３タンパク質フラグメントの収率は、不溶性ＮＳ３タンパク質フラグメントの収率より高い。変性−再折り畳みプロセスの間に、不溶性タンパク質フラグメントは、大部分の細胞抽出物中で損失される。第三に、不溶性ＮＳ３タンパク質の酵素活性は、再折り畳み後には観察され得ない。
【００７５】
ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質の可溶性ヘリカーゼフラグメントは、組合せライブラリーから特異ヘリカーゼインヒビターについてスクリーニングするために使用され得る。スクリーニングアッセイは、ヘリカーゼフラグメントの巻き戻し活性を調べることにより、ポリアクリルアミドゲルにおける二本鎖テンプレートＲＮＡの移動度シフトに基いて実施され得る。スクリーニングアッセイはまた、マイクロタイターディッシュ（９６ウェルプレート）形式において自動化され得る。後者のアッセイにおいて、二本鎖テンプレートＲＮＡは、一方の鎖の５’末端をビオチンで標識され、そして他方の鎖の５’末端を３２Ｐで用いて標識される。この標識テンプレートは、ストレプトアビジンでコートされているウェルの底に接着され得る。添加されたフラグメントのヘリカーゼ活性は、ウェル上清に存在する置換した３２Ｐ標識ＲＮＡ鎖からの放射活性をカウントすることによって測定され得る。組合せライブラリーに存在する潜在的なヘリカーゼインヒビターは、ヘリカーゼフラグメントによる鎖置換反応の特異阻害を検出することによって見出され得る。
【００７６】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ３タンパク質は、セリンプロテイナーゼ、ヌクレオチドトリホスファターゼ（ＮＴＰａｓｅ）、およびＲＮＡヘリカーゼのアミノ酸モチーフを含む。ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質のカルボキシフラグメントが精製され、そしてこれはＲＮＡヘリカーゼ活性を有した。アミノ末端からの欠失により、タンパク質は可溶性になった。カルボキシ末端からの欠失は、少なくとも５０アミノ酸の欠失までは、ヘリカーゼ活性の消失を生じない。ヘリカーゼ活性は、ＡＴＰならびにＭｇ２＋およびＭｎ２＋のような二価カチオンを必要とする。ヘリカーゼ活性は、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質に特異的なモノクローナル抗体によりブロックされた。
【実施例】
【００７７】
Ｃ．実施例
下記の実施例は、当業者へのさらなるガイドとして提供され、いかなる方法においても
本発明の限定として解釈されるべきではない。
実施例１
ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質の発現および精製
ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質のカルボキシ側２／３を発現させるために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ＨＣＶ−１ ｃＤＮＡ由来のアミノ酸１１９３〜１６５７を含む１．４Ｋｂ ＤＮＡフラグメントを増幅した。使用したセンスプライマーは、ＪＣＫ−１ ５’−ＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＡＣＴＴＴＡＴＣＣＣＴ−３’（配列番号４）であり、そしてアンチセンスプライマーはＪＣＫ−７ ５’−ＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＡＣＧＡＣＣＴＣＧ−３’（配列番号５）であった。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてｐＥＴ２１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＷＩから購入した）１のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。組換えプラスミドをｐＥＴ２１ｂ−ＮＳ３ＨＣＶと呼び、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）へ形質転換し、そして挿入された領域を配列決定によって確認した。ｐＥＴ２１ｂ−ＮＳ３ＨＣＶは、ＨＣＶ ＮＳ３のカルボキシ末端の４６６アミノ酸残基からなり、そしてより容易な精製のために、Ｃ末端にＨｉｓタグ（６つのヒスチジン）およびｐＥＴ発現ベクター由来のさらなる１９残基を含有した。ＨＣＶ ＮＳ３ Ｈｉｓタグ融合タンパク質の約５４ｋＤａ（４８１アミノ酸残基）を、組換えプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）から１ｍＭ ＩＰＴＧによって誘導して、１０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地中で細胞を指数的に増殖させた（図５レーン１および２を参照）２。２００ｍｌの培養物から純度約９５％のタンパク質４００ｍｇを得た。３７℃にて３時間培養後、細胞を回収し破砕した。細胞抽出物の可溶性部分を、金属結合カラムに負荷した。樹脂結合タンパク質を、１Ｍイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．９を用いて溶出した。溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、タンパク質含有画分をプールし、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．９に対して４時間透析した。ポリエチレンイミンセルロースＴＬＣ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）上でのＮＴＰａｓｅアッセイを、Ｓｕｚｉｃｈらに以前に記載されたように実施して、最終的な精製タンパク質が活性コンホメーションを有することを確認した。精製タンパク質はＮＴＰａｓｅ活性を示した（データは示さず）。１ ネガティブコントロールとして、インサートを含まないｐＥＴ２１ｂプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した。ネガティイブコントロール細胞培養物を、ｐＥＴ２１ｂ−ＮＳ３ＨＣＶと同じ精製工程でプロセシングした。ネガティブコントロールは酵素活性を示さなかった（図６レーン１を参照）。２ 約５０ｋＤａの１つ以上のタンパク質バンドが、ＩＰＴＧ誘導によって出現したが、５４ｋＤａ ＮＳ３−Ｈｉｓ融合タンパク質のみを、金属結合アフィニティーカラムから精製した（図５レーン３を参照）。
実施例２
ＲＮＡヘリカーゼに対する基質の調製
図４は、ＲＮＡヘリカーゼの基質として使用された二本鎖ＲＮＡの構造を示す。長鎖を、ＰｖｕＩＩで切断されたｐＧＥＭ１のインビトロ転写によって調製し、そして短鎖をＢａｍＨＩ消化ｐＳＰ６５から転写した。両鎖を、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、製造者のマニュアルに従って転写した。転写反応後、各アリコートをＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理し、フェノール：クロロホルムで抽出し、そしてエタノールで沈澱させた。各ＲＮＡ鎖を、２５ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．６、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）を用いて再懸濁し、そして混合した。この混合物を１００℃に５分間加熱し、６５℃で３０分間インキュベートし、そして２５℃で一晩インキュベートした。長鎖ＲＮＡを、［α−３２Ｐ］−ＣＴＰで標識し、そして標識基質の比活性は、１〜１．５×１０５ｃｐｍ／ｐｍｏｌ ｄｓ ＲＮＡ基質であった３。二本鎖ＲＮＡを、６％未変性ポリアクリルアミドゲル（３０：０．８）上で電気泳動し、ｄｓ ＲＮＡの位置をオートラジオグラフィーにより同定した。ＲＮＡ基質を回収するために、切り出したゲルフラグメントを、４００μｌの溶出緩衝液（０．
５Ｍ酢酸アンモニウム、０．１％ＳＤＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中で粉砕し、４℃で２時間激しく振盪した。上清をクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させて、ＲＮＡペレットをＤ．Ｗ．中に溶解させた。３ 鎖置換を、放射標識した長鎖のバンドシフトによって観察した。
実施例３
ＲＮＡヘリカーゼアッセイ
ＲＮＡヘリカーゼアッセイを２０μｌの次の反応混合物中で実施した：１ｐｍｏｌ ＮＳ３ ＨＣＶタンパク質フラグメント、０．５ｐｍｏｌ ｄｓ ＲＮＡ基質、２５ｍＭ ＭＯＰＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５）、５ｍＭＡＴＰ、３ｍＭ ＭｎＣｌ２、２ｍＭ ＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、および２．５Ｕ ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）。この反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。反応を、５μｌの５×終止緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、０．１％ＮＰ−４０、０．１％ブロモフェノールブルー、０．１％キシレンシアノール、および５０％グリセロール）を添加することによって停止させた。各アリコートを６％未変性ポリアクリルアミドゲル（３０：０．８）に負荷し、８０Ｖで３時間電気泳動した。ｄｓ
ＲＮＡ基質および巻き戻しＲＮＡ鎖をオートラジオグラフィーにより可視化した。ＮＳ３タンパク質フラグメントのヘリカーゼ活性に対するＡＴＰおよび二価金属イオンの効果を、１ｍＭまたは５ｍＭ ＡＴＰの存在下で、１、２、３、４、および６ｍＭのＭｎ２＋またはＭｇ２＋を用いて同じ反応を実施して調べた。鎖分離効率を、ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、バンドの放射活性をカウントすることによって計算した。種々の濃度のＡＴＰおよび二価カチオンでの、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントの活性変化については、図７を参照。ＨＣＶ ＮＳ３ ＲＮＡヘリカーゼフラグメントは、Ｍｇ２＋およびＭｎ２＋のような二価イオンを必要とした（図６レーン２〜５を参照）。Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋イオンが存在する場合のみ、鎖置換が観察された（図６レーン２および４を参照）。これら二価カチオンまたはＡＴＰのいずれかを欠く場合、ｄｓ ＲＮＡは巻き戻されなかった（図６レーン３、５、および７を参照）。一価カリウムイオンは、これらの条件下で、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントのヘリカーゼ活性を活性化しなかった（図６レーン６を参照）。１ｍＭ ＡＴＰでは、ヘリカーゼ活性は、５ｍＭのときより低かった（図６レーン８を参照）。ＮＳ３の酵素活性は、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントのモノクローナル抗体によって阻害され（図６レーン９を参照）、そして２つの異なる濃度の非特異抗体によってはブロックされなかった（図６レーン１０および１１を参照）。
【００７８】
上記のように、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントのＲＮＡヘリカーゼ活性は、二価カチオンおよびＡＴＰに依存した。低濃度のＡＴＰ（１ｍＭ）では、ＮＳ３のヘリカーゼ活性は、二価カチオンの低い濃度で最も高く、カチオン濃度が増加すると、ヘリカーゼ活性は減少した。高濃度のＡＴＰ（５ｍＭ）で、ほとんどの基質が、試験した全カチオン濃度で、巻き戻された。Ｍｎ２＋またはＭｇ２＋のいずれかのカチオン濃度が３ｍＭまたは４ｍＭのとき、ヘリカーゼ活性は最高であった。従って、ヘリカーゼ活性は、より低いＡＴＰ濃度で、二価カチオン濃度に対してより感受性であるようだ。さらに、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントは、Ｍｇ２＋に対してわずかに片寄りを示した。
実施例４
短縮型ＨＣＶ ＮＳ３フラグメントのヘリカーゼ活性についての試験
種々のサイズのＨＣＶ ＮＳ３フラグメントを、上記のように発現および精製した。次いで、そのフラグメントを、上記のようにヘリカーゼ活性について、そして、当該分野で公知のようにＮＴＰａｓｅ活性について試験した。図９は、試験したフラグメントおよびそのフラグメントがヘリカーゼ／ＮＴＰａｓｅ活性を示したどうかを示す。以下のフラグメントを試験した：番号１、完全長ヘリカーゼフラグメント（すなわち、ＨＣＶ ＮＳ３ドメインのアミノ酸１１９３〜アミノ酸１６５７）、ＡＴＣＣ寄託番号９７３０６；番号２、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼドメインのＣ末端から１０アミノ酸を欠失させたＨＣＶ
ＮＳ３フラグメント（すなわち、ＨＣＶ ＮＳ３ドメインのアミノ酸１１９３〜アミノ酸１６４８）、ＡＴＣＣ寄託番号９７３０７；番号３、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼドメインのＣ末端から３０アミノ酸を欠失させたＨＣＶ ＮＳ３フラグメント（すなわち、ＨＣＶ
ＮＳ３ドメインのアミノ酸１１９３〜アミノ酸１６３８）、ＡＴＣＣ寄託番号９７３０８；番号４、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼドメインのＣ末端から５０アミノ酸を欠失させたＨＣＶ ＮＳ３フラグメント（すなわち、ＨＣＶ ＮＳ３ドメインのアミノ酸１１９３〜アミノ酸１６０８）、ＡＴＣＣ寄託番号９７３０９；番号５、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼドメインのＣ末端から９７アミノ酸を欠失させたＨＣＶ ＮＳ３フラグメント（すなわち、ＨＣＶ ＮＳ３ドメインのアミノ酸１１９３〜アミノ酸１６５１）、ＡＴＣＣ寄託番号９７３１０；番号６、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼドメインのＣ末端から１３５アミノ酸を欠失させたＨＣＶ ＮＳ３フラグメント（すなわち、ＨＣＶ ＮＳ３ドメインのアミノ酸１２０９〜アミノ酸１６５７）、ＡＴＣＣ寄託番号９７３１１；番号７、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼドメインのＮ末端から１６アミノ酸を欠失させたＨＣＶ ＮＳ３フラグメント（すなわち、ＨＣＶ ＮＳ３ドメインのアミノ酸１２０９〜アミノ酸１６５７）、ＡＴＣＣ寄託番号９７３１２；および番号８、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼドメインのＮ末端から３２アミノ酸を欠失させたＨＣＶ ＮＳ３フラグメント（すなわち、ＨＣＶ ＮＳ３ドメインのアミノ酸１２２５〜アミノ酸１６５７）、ＡＴＣＣ寄託番号９７３１３。
【００７９】
図９に示されているように、短縮型変異体である番号５、６、および８の変異体は、ＲＮＡヘリカーゼ活性を示さなかった。しかし、変異体７は、たとえその活性が番号１の（完全長）タンパク質の約半分であったとしても、ＮＴＰａｓｅ活性を確かに示した。図８は、短縮型変異体のＲＮＡヘリカーゼアッセイを示す。上方のバンドはｄｓＲＮＡを示し、下方のバンドは３２Ｐで標識されたｓｓＲＮＡを示す。煮沸ＲＮＡは、５分間煮沸後の変性ｄｓＲＮＡを示し、従ってｓｓＲＮＡに対するコントロールであった。図８および９の両方に示されているように、短縮型フラグメント番号５、６、および８は、ＲＮＡヘリカーゼ活性を消失した。
実施例５
ＨＣＶ ＮＳ３フラグメントの溶解性測定
ｐＥＴ２１ｂ−ＨＣＶＮＳ３ベクターからの発現タンパク質の溶解性を、以下の方法によって測定した：ＩＴＰＧ誘導細胞を５分間６０００Ｇにて回収した。次いで、細胞を、１×結合緩衝液（５ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．９）を用いて再懸濁した。次いで、再懸濁した細胞を、ドライアイス−エタノールバス中で凍結させ、氷上で解凍して、２分間超音波処理した。細胞抽出物を２７０００Ｇで３０分間遠心分離した。細胞抽出物の可溶性部分（上清）および細胞抽出物の不溶性部分（ペレット）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ウエスタンブロットを、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントに対するモノクローナル抗体を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥについて実施した場合、発現タンパク質は、細胞抽出物の可溶性部分中にのみ観察された。
【００８０】
標記寄託番号の下でＡＴＣＣに寄託された上記材料は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項の下に維持される。これらの寄託物は、当業者に対する便宜として提供されるのであって、寄託物が米国特許法１１２条の下で要求されることを認めるものではない。寄託物に含有されるポリヌクレオチド配列、およびこれによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書に参考として援用され、そして本明細書に記載されている配列となんらかの矛盾する事象において照合される。寄託物を製造、使用、または販売するためにはライセンスを必要とし得、このようなライセンスは本願明細書により承諾されない。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１はＨＣＶ−１のＮＳ３タンパク質の配列を示す。これは、ＨＣＶ−１ポリタンパク質のおよそアミノ酸１０２７〜１６５７である（配列番号１）。
【図２】図２はＨＣＶ ＮＳ３タンパク質の模式図である。数字は、ＨＣＶ−１ポリタンパク質のアミノ酸の位置を示す。
【図３】図３は、ＤＥＸＨボックスＲＮＡヘリカーゼタンパク質の保存配列モチーフおよびＨＣＶＮＳ３タンパク質のＲＮＡヘリカーゼドメインの匹敵する配置を示す。ボックス間の数字はアミノ酸残基における距離を示す。
【図４】図４は、ＲＮＡヘリカーゼアッセイのための二本鎖ＲＮＡ基質の構造を示す。太線は３２Ｐ標識ＲＮＡ鎖を示す。細線は非標識ＲＮＡ鎖を示す。
【図５】図５はＥ．ｃｏｌｉからのＨＣＶ ＮＳ３の発現および精製を示す。Ｍ：タンパク質サイズマーカー、レーン１：非誘導細胞由来の総タンパク質、レーン２：３時間ＩＰＴＧ誘導細胞由来の総タンパク質、レーン３：ニッケル結合クロマトグラフィにより精製したＨＣＶ ＮＳ３：Ｈｉｓタグ融合タンパク質。
【図６】図６は、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質フラグメントのＲＮＡヘリカーゼアッセイの結果を示す。レーン（−）酵素：ＮＳ３タンパク質を含まないｄｓ ＲＮＡ。レーン煮沸（ｂｏｉｌｅｄ）：熱変性させたｄｓ ＲＮＡ。レーン１；ネガティブコントロール細胞（ｐＥＴベクターのみ）由来の画分、レーン２：３ｍＭ Ｍｎ２＋、レーン３：Ｍｎ２＋なし、レーン４：３ｍＭ Ｍｇ２＋、レーン５：Ｍｇ２＋なし、レーン６：３ｍＭ ＫＣｌ、レーン７：ＡＴＰなし、レーン８：１ｍＭ ＡＴＰ、レーン９：ＮＳ３タンパク質をＮＳ３特異的モノクローナル抗体とプレインキュベートしたもの、レーン１０、１１：ＮＳ３タンパク質を抗コネクシンモノクローナル抗体とそれぞれ２０μｌあたり０．５μｇ、１．０μｇでプレインキュベートしたもの。モノクローナル抗体を、ＮＳ３タンパク質と室温で５分間プレインキュベートした。
【図７】図７は、異なるＡＴＰおよび二価カチオン濃度での、ヘリカーゼ活性を有するＨＣＶＮＳ３ ＲＮＡフラグメントの活性プロフィールを示す。カチオンの効果を２つの異なるＡＴＰ濃度（１ｍＭおよび５ｍＭ）で試験した。
【図８】図８は、ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質の種々の短縮型フラグメントの活性を示す。
【図９】図９は、種々の短縮型ＨＣＶ ＮＳ３フラグメントを示し、これらフラグメントがヘリカーゼ／ＮＴＰａｓｅ活性を示すかどうかを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を有する短縮型の精製されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ３ヘリカーゼフラグメント、あるいは、１つまたはいくつかのアミノ酸挿入、アミノ酸欠失またはアミノ酸置換を有するその改変体であって、該改変体は、ヘリカーゼ活性を保持しかつ可溶性である、フラグメント。
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を有する短縮型の精製されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ３ヘリカーゼフラグメント、あるいは、１つまたはいくつかのアミノ酸挿入、アミノ酸欠失またはアミノ酸置換を有するその改変体であって、該改変体は、ヘリカーゼ活性を保持しかつ可溶性である、フラグメント。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００６−２７１３８８（Ｐ２００６−２７１３８８Ａ）
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１２９６８３（Ｐ２００６−１２９６８３）
【出願日】平成１８年５月８日（２００６．５．８）
【分割の表示】特願２００３−４１８７７７（Ｐ２００３−４１８７７７）の分割
【原出願日】平成８年９月１２日（１９９６．９．１２）
【出願人】（５９１０７６８１１）カイロン コーポレイション (265)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月８日（２００６．５．８）
【分割の表示】特願２００３−４１８７７７（Ｐ２００３−４１８７７７）の分割
【原出願日】平成８年９月１２日（１９９６．９．１２）
【出願人】（５９１０７６８１１）カイロン コーポレイション (265)
【Ｆターム（参考）】
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