ペプチド−ポリマー細胞培養物品およびその製造方法
重合部分を含有するように官能化されたペプチドである、官能化ペプチドモノマーが開示されている。培地中の細胞、特に治療に使用される細胞の培養を支持できる合成表面として有用なペプチドポリマーを形成するためのこれらの官能化ペプチドモノマーの使用も開示されている。表面を製造する方法およびその表面を使用する方法も開示されている。
【発明の詳細な説明】
【先願の米国特許出願の恩恵の主張】
【０００１】
本出願は、２００９年７月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／２２９６１５号の恩恵を主張するものである。この書類の内容およびここに述べられた刊行物、特許および特許文献の全開示が、ここに引用される。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、ペプチド−ポリマー細胞培養表面と物品、および官能化細胞結合ペプチドの合成モノマーとの重合によるペプチド−ポリマー細胞培養物品を調製する方法に関する。より詳しくは、本開示は、既知組成培地中の未分化幹細胞を含む、細胞の培養を支持するための、細胞結合ペプチドを有する合成表面および物品に関する。
【０００３】
配列表
本出願は、２０１０年７月２２日に作成された、８ｋｂのサイズを有する「2010722_SP09-244_ST25.txt」という名前のテキスト・ファイルとして、米国特許商標庁にＥＦＳ−Ｗｅｂを通じて電子的に提出された配列表を含む。配列表の電子出願のために、電子的に提出された配列表は、米国特許法施行規則第１．８２１条（ｃ）により要求されるハードコピーおよび第１．８２１条（ｅ）により要求されるコンピュータ読み取り可能な形態（ＣＲＦ）の両方として働く。この配列表に含まれる情報がここに引用される。
【背景技術】
【０００４】
疾病の治療のためにヒトに導入される細胞である治療用細胞が開発されている。治療用細胞の例としては、３種の胚葉のいずれにも分化し、人体のどの成人細胞タイプも生じる能力を有するヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）などの多能性(pluripotent)幹細胞が挙げられる。幹細胞のこの性質のために、糖尿病、脊髄損傷、心臓病などの数多くの重い細胞変性疾患のための新たな治療法を開発する可能性が与えられる。しかしながら、そのような治療用細胞に基づく治療の開発にはいくつか障害がある。細胞と組織の培養において適切な数の治療用細胞を得て維持すること、並びにこれらの細胞が細胞培養中に望ましくないように変化しないように確実にすることが、治療用細胞の培養を開発し制御する上で重要である。例えば、ｈＥＳＣの細胞培養などの幹細胞培養は、典型的に、細胞銀行または細胞株からの小数の細胞が播種され、次いで、所望の治療用途にとって分化が望ましくなるまで、未分化状態で増幅させられる。これを行うために、ｈＥＳＣまたはそれらの分化細胞は、現在、支持細胞層、血清、またはニュージャージー州、フランクリン・レイクス所在のBDから入手できるＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）などの動物由来成分を含有する表面または培地の存在下で培養されている。培養環境へのこれらの動物由来添加物のために、細胞が、患者に移り得るまたはｈＥＳＣの一般的な培養および維持を損ない得る潜在的に有害なウイルスまたは他の病原菌に曝露される。その上、そのような生物学的製剤は、バッチのばらつき、免疫応答および限られた貯蔵寿命を被りやすい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の実施の形態において、官能化ペプチドモノマーであって、ペプチドが、（メタ）アクリレート部分などの重合部分を含有するように官能化されているペプチドモノマーが開示されている。実施の形態において、官能化ペプチドモノマーは、式：Am - Sy - Xaan - Sy1 - Z - Sy2 - Am1により記載することができ、ここで、Ａは重合部分であり、ｍは１から６までの整数であり、ｍ１は１から６までの整数であり、Ｘａａnは独立して任意のアミノ酸であり、ｎは０から２０までの整数であり、Ｓはスペーサであり、ｙは０から３０までの整数であり、ｙ１は０から３０までの整数であり、ｙ２は０から３０までの整数であり、Ｚは細胞接着性ペプチドである。
【０００６】
ある実施の形態において、細胞接着性ペプチドは、細胞接着性ペプチドであってよく、ＲＧＤ配列、例えば、KGGGQKCIVQTTSWSQCSKS (配列番号1); GGGQKCIVQTTSWSQCSKS(配列番号2); KYGLALERKDHSG (配列番号3); YGLALERKDHSG (配列番号4); KGGSINNNRWHSIYITRFGNMGS (配列番号5); GGSINNNRWHSIYITRFGNMGS (配列番号6); KGGTWYKIAFQRNRK (配列番号7); GGTWYKIAFQRNRK (配列番号8); KGGTSIKIRGTYSER (配列番号9); GGTSIKIRGTYSER (配列番号10); KYGTDIRVTLNRLNTF (配列番号11); YGTDIRVTLNRLNTF (配列番号12); KYGSETTVKYIFRLHE (配列番号13); YGSETTVKYIFRLHE(配列番号14); KYGKAFDITYVRLKF (配列番号15); YGKAFDITYVRLKF(配列番号16); KYGAASIKVAVSADR (配列番号17); YGAASIKVAVSADR(配列番号18); KGGNGEPRGDTYRAY(配列番号19); GGNGEPRGDTYRAY (配列番号20) CGGNGEPRGDTYRAY (配列番号21); GGNGEPRGDTRAY (配列番号22); KYGRKRLQVQLSIRT (配列番号23); YGRKRLQVQLSIRT(配列番号24); KGGRNIAEIIKDI (配列番号25); GGRNIAEIIKDI (配列番号26); KGGPQVTRGDVFTMP (配列番号27); GGPQVTRGDVFTMP(配列番号28); GGPQVTRGDVFTMPK (配列番号29); GRGDSPK (配列番号30); KGGAVTGRGDSPASS(配列番号31); GGAVTGRGDSPASS (配列番号32); YaalPQVTRGNVFTMP (配列番号33); 環状であってもよいRGDYK (配列番号34)、またはそれらの組合せを有する細胞接着性ペプチドであってよい。
【０００７】
実施の形態において、官能化ペプチドモノマーの接着性ペプチドは、KGGPQVTRGDVFTMP (配列番号27) または GGPQVTRGDVFTMP (配列番号28), GGNGEPRGDTYRAY (配列番号18) またはKGGNGEPRGDTYRAY (配列番号19)を含む。実施の形態において、光重合性部分は、アクリレートまたはメタクリレート、例えば、メタクリル酸を含む。実施の形態において、スペーサは、例えば、ＰＥＧ4であってよい、ポリエチレンオキシドである。
【０００８】
追加の実施の形態において、本発明は、細胞培養表面を製造する方法であって、官能化ペプチドモノマーおよび少なくとも１種類の（メタ）アクリレートモノマーの混合物を提供し、この混合物を細胞培養基体に施し、モノマーを重合させて、ペプチド−ポリマーを形成する各工程を有してなる方法を提供する。実施の形態において、（メタ）アクリレートモノマーは、ＨＥＭＡ、ＴＥＧＤＭＡ、グリセロールモノメタクリレートまたはグリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレートまたはそれらの組合せを含む。実施の形態において、メタクリレートモノマーは、ＨＥＭＡおよびＴＥＧＤＡの組合せを含む。
【０００９】
本発明の追加の実施の形態において、前記ペプチド−ポリマー培養表面上において既知組成培地中で未分化のヒト胚性幹細胞の単離個体群を培養する方法が記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施の形態による細胞培養表面を製造する方法の実施の形態を示す流れ図
【図２】細胞培養表面の実施の形態を製造する方法を示す説明図
【図３】細胞培養表面上に分布した蛍光標識ペプチドポリマーの蛍光強度を示す図
【図４】Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＭＧ、図４Ａ）、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）（図４Ｂ）対照表面および本発明の官能化ペプチドグラフト化表面の実施の形態上で培養したＨ７ヒト胚性幹細胞の顕微鏡写真
【図５】Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＭＧ、図５Ａ）、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）（図５Ｂ）対照表面、および官能化ペプチドグラフト化表面の２つの実施の形態（（Ｃ，Ｄ）および（Ｅ，Ｆ））上で培養したＨ７クリスタル・バイオレット染色ヒト胚性幹細胞の顕微鏡写真。図５ＣおよびＤは同じ条件を示す。図５ＥおよびＦは同じ条件を示す。
【図６】Corning Incorporatedからのｌａｍｉｎｉｎ（商標）表面（図６ＡおよびＥ）、ＨＥＭＡおよびＴＥＧＤＭＡにより製造された環状官能化ＲＧＤペプチド表面（図６ＢおよびＦ）、グリセロールメタクリレートにより製造された環状官能化ＲＧＤペプチド表面（図６ＣおよびＧ）、およびCorning IncorporatedからのＳｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）表面（図６ＤおよびＨ）上で増殖した神経前駆細胞の顕微鏡写真
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の実施の形態において、官能化ペプチドモノマーであって、ペプチドが、（メタ）アクリレート部分などの重合部分を含有するように官能化されているペプチドモノマーが開示されている。実施の形態において、官能化ペプチドモノマーは、式：Am - Sy - Xaan - Sy1 - Z - Sy2 - Am1により記載することができ、ここで、Ａは重合部分であり、ｍは１から６までの整数であり、ｍ１は０から６までの整数であり、Ｘａａnは独立して任意のアミノ酸であり、ｎは０から６までの整数であり、Ｓはスペーサであり、ｙは０から３０までの整数であり、ｙ１は０から３０までの整数であり、ｙ２は０から３０までの整数であり、Ｚは細胞接着性ペプチドである。実施の形態において、この官能化ペプチドモノマーを使用して、高分子細胞培養表面を形成する方法、およびそのように製造された高分子細胞培養表面を使用する方法も開示されている。実施の形態において、重合部分は、ペプチドのカルボキシル末端およびアミノ末端の両方にまたはその近くに存在する。
【００１２】
細胞培養の分野において、細胞を測定可能な様式で培養するには、病原体を含まず、比較的安価であり、安定であり、信頼性があり、培地中の細胞の長期培養を支持する表面が必要である。このことは、治療用細胞を提供することを目的とする細胞培養、すなわち、疾患の治療のためにヒトに導入される、または再導入される細胞を提供することを目的とする細胞培養に特に当てはまる。細胞培養に関する現行の技術は、マウス腫瘍抽出物由来の、ニュージャージー州、フランクリン・レイクス所在のBDから入手できるＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）などの動物産物由来の表面を含むが、これらの表面は、治療に使用される細胞の支持体には望ましくない。
【００１３】
本発明の実施の形態は、アクリレートまたはメタクリレート官能化細胞接着性ペプチドの親水性アクリレートまたはメタクリレートモノマーおよび架橋剤とのフリーラジカル重合によって調製されたペプチド模倣細胞培養表面または被覆を提供する。実施の形態において、測定可能であり、加工が容易であり、対費用効果的であり、Ｔ−７５フラスコおよびＴ−２２５フラスコなどのより大きい表面積で治療上の価値のためにヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）などの培養が難しい細胞の成長および増殖を促進させられるペプチド模倣表面を形成する方法も提供される。実施の形態において、本発明は、ペプチド模倣表面を製造するための、容易で、対費用効果的であり、製造に調和する(manufacturing friendly)プロセスを提供する。実施の形態において、これらの表面は、接着性ペプチドに化学的に結合しており、治療用途に要求される細胞量を産生するための熱可塑性表面の大きなフットプリントに被覆できる、ゆるく架橋した親水性高分子表面である。
【００１４】
以下の詳細な説明において、その一部を構成し、デバイス、システムおよび方法のいくつかの特定の実施の形態が実例として示されている、添付の図面を参照する。他の実施の形態も考えられ、本開示の範囲または精神から逸脱せずに実施してよいことが理解されよう。したがって、以下の詳細な説明は、制限の意味で解釈すべきではない。
【００１５】
ここに使用した全ての科学用語および技術用語は、他に別記しない限り、当該技術分野で一般に使用されている意味を有する。ここに与えられる定義は、ここに頻繁に使用されている特定の用語の理解を容易にするためであり、本開示の範囲を制限することを意味するものではない。
【００１６】
本明細書および添付の特許請求の範囲に用いられるように、文脈がそうではないと明白に示していない限り、単数形は、複数の対象を有する実施の形態を包含する。本明細書および添付の特許請求の範囲に用いられるように、文脈がそうではないと明白に示していない限り、「または」という用語は、「および／または」を含む意味で一般に使用されている。
【００１７】
ここに用いたように、「有する(have)」、「有している(having)」「含む(include)」、「含んでいる(including)」、「含む(comprise)」、「含んでいる(comprising)」などは、限定を設定しない意味で使用されており、一般に、「含んでいるが、それに制限されない」ことを意味する。例えば、合成または組換えタンパク質またはペプチドを組み込んだ表面を含む合成細胞培養表面は、疾病の治療のためにヒトに導入される細胞を支持するのに適している。合成ペプチドおよびタンパク質は、多くの場合、ＲＧＤなどの細胞接着配列を含む。実施の形態において、細胞接着配列は、細胞外基質起源のインテグリン結合配列であってよい。
【００１８】
ＲＧＤ配列を含むいくつかの例示の合成ペプチドおよびタンパク質は、ラミニン、ビトロネクチン、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）などのタンパク質から特定されてきた。これらの配列のいくつかが表１に示されている。培地中の生存細胞を支持するのに要求されるペプチドの量を減少させる合成表面が望ましい。何故ならば、ペプチドは高価であり、それゆえ、ペプチドをそれほど必要としない表面は安上がりであるからである。その上、製造が容易であり、貯蔵安定性であり、滅菌手法を通じて安定であり、水性細胞培養条件への長期の曝露を通じて安定である合成表面も望ましい。
【００１９】
実施の形態において、官能化ペプチドは以下の式（式１）：
式１： Am - Sy - Xaan - Sy1 - Z - Sy2 - Am1
を有する。
【００２０】
実施の形態において、少なくとも２つの重合性部分（Ａ）を担持するように修飾または官能化されたペプチドまたはポリペプチド（Ｚ）が提供され、ここで、Ａは、例えば、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、マレイミドまたはフマレートを含む、α、β不飽和基またはエチレン不飽和基であり、そのような重合性基の１つが、官能化ペプチドのカルボキシル末端とアミノ末端の各末端にまたはその近くにある。本開示の目的に関して、「にまたはその近くに(at or near)」は、重合性部分（Ａ）が、ペプチド配列に隣接しているか、または１つ以上のスペーサによりペプチド配列から隔てられていてよく、ここで、スペーサはポリエチレンオキシドスペーサまたはアミノ酸スペーサまたはそれらの組合せであってよいことを意味する。本開示の目的に関して、「官能化ペプチド」は、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、マレイミドまたはフマレート基などの、少なくとも２つ重合部分または重合性部分、および必要に応じて、スペーサ（Ｓ）および／または追加のアミノ酸配列（Ｘａａ）を組み込むように修飾されたペプチドを意味する。エポキシド官能基が、重合性部分であってもよい。
【００２１】
実施の形態において、これらの重合部分は、エネルギー源に曝露された際にポリマーを形成できる。実施の形態において、光重合部分が、アミノ酸の側鎖を通じて官能化ペプチドに結合されている。例えば、メタクリレート、アクリルアミド、およびマレイミド部分が、リシンアミノ酸（Ｘａａ−ＭＡＡ、ここで、Ｘａａはリシンであり、ＭＡＡはメタクリル酸である）の側鎖に結合されていてよいが、官能化ペプチドを形成するために、任意の他のカルボキシル官能化アクリレート、メタクリレートおよびアクリルアミドであって差し支えない。重合部分は、細胞接着性ペプチドにおける、またはＸａａn基における、アミノ酸の側鎖に結合されていてもよい。
【００２２】
Ａが独立して重合部分である、式１に示されるように、ｍは、実施の形態において、１から６までの整数であり、ｍ１は１から６までの整数である。実施の形態において、官能化ペプチドは、必要に応じて、スペーサを含んでもよい。実施の形態において、重合部分（ＡmおよびＡm1）は、アミノ酸（例えば、ＫまたはＲ）の側鎖に結合されていてもよく、もしくはアミノ酸またはペプチドのＮ末端に結合されていてもよい。重合部分は、ポリエチレンオキシドを通じて、リシンなどのアミノ酸の側鎖を通じて、またはアミノ酸のＮ末端で、スペーサＳpに付着している。
【００２３】
実施の形態において、（Ｓy、Ｓy1およびＳy2）は、例えば、式（Ｏ−ＣＨ2ＣＨＲ’）m2により表され、Ｒ’がＨまたはＣＨ3であり、ｍ２が０から２０までの整数である、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含む、ポリアルキレンオキシドであってよい。実施の形態において、ポリアルキレンオキシドの比較的短い鎖が望ましい。例えば、実施の形態において、ｙ、ｙ１およびｙ２は、ＰＥＧ2、ＰＥＧ4、ＰＥＧ6、ＰＥＧ8、ＰＥＧ10、ＰＥＧ12もしくはＰＰＧ2、ＰＰＧ4、ＰＰＧ6、ＰＰＧ8、ＰＰＧ10、ＰＰＧ12またはＰＰＧ20であってよい。実施の形態において、スペーサは、２０以下の反復単位を有するポリエチレンオキシド（すなわち、ＰＥＧ4、ＰＥＧ6、ＰＥＧ8、ＰＥＧ10、ＰＥＧ12、ＰＥＧ14、ＰＥＧ16、ＰＥＧ18またはＰＥＧ20）である。
【００２４】
実施の形態において、Ｓy、Ｓy1および／またはＳy2は、官能基を有するＰＰＧまたはＰＥＧである。例えば、ＰＥＧまたはＰＰＧスペーサは、マレイミド、チオール、アミン、シラン、アルデヒド、エポキシド、イソシアネート、アクリレートまたはカルボキシル基を有してもよい。実施の形態において、ＰＥＧスペーサは、アミン官能基を有するＰＥＧであるＪＥＦＦＡＭＩＮＥ（登録商標）である。追加の実施の形態において、ＰＥＧまたはＰＰＧは分岐していてもよい。例えば、分岐ＰＥＧまたはＰＰＧは、Ｙ型分岐または星型ＰＥＧまたはＰＰＧであってよい。実施の形態において、これらの分岐ＰＥＧまたはＰＰＧスペーサは、多数のペプチドを、１つの官能化ペプチドを通じて基材に結合することが可能になるであろう。
【００２５】
Ｘａａは、独立して、存在してもしなくてもよい任意のアミノ酸、もしくは３０までのアミノ酸（ｎが０から３０までの整数である場合）、２０までのアミノ酸（ｎが０から２０までの整数である場合）、１０までのアミノ酸（ｎが０から１０までの整数である場合）、６までのアミノ酸（ｎが０から６までの整数である場合）、または３までのアミノ酸（ｎが０から３までの整数である場合）の基である。実施の形態において、Ｘａａアミノ酸は、光重合性基と結合できるリシンアミノ酸を含有する。実施の形態において、Ｘａａアミノ酸配列は、例えば、LysGlyGly または LysTyrGlyなどの配列であってよい。「独立して」という用語は、各ａａが別のアミノ酸と異なってもよいことを示すようにここに使用される。実施の形態において、Ｘａａはアセチル化されている。アミノ酸Ｘａａnは、それを分解から保護するためにアセチル化および／またはアミド化されていてもよい。実施の形態において、Ｘａａは親水性アミノ酸であってよい。例えば、Ｘａａnは、リシン、グリシン、グルタミン酸、セリン、アスパラギン酸またはアルギニンアミノ酸であってよく、これらは末端アミノ酸であってもよい。例えば、実施の形態において、Ｘａａnは、ＸａａがＧであり、ｎ＝１から２０であるアミノ酸Ｘａａnであってよく、またはＸａａnは、ＸａａがＫであり、ｎ＝１から２０、またはＸａａがＫであり、ｎが１以上であるアミノ酸であってよく、Ｘａａnは、ＸａａがＤであり、ｎ＝１から２０であるアミノ酸Ｘａａnであってよく、またはＸａａnは、ＸａａがＥであり、ｎ＝１から２０であるアミノ酸Ｘａａnであってよい。例えば、官能化ペプチドは、イプシロンリシン側鎖から生じた一連のリシンスペーサ長までのMAA-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-VN-ペプチド (リシンアルファ末端へのＮ末端付着) または Ac-(Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-MAA)-VN-ペプチド (メタクリレート結合) であってよい。ＭＡＡは、スペーサ長のＮ末端に付着していて差し支えなく、またはリシン側鎖に形成されても差し支えない。実施の形態において、Ｘａａnは、LysGlyGly または LysTyrGlyなどの３つのアミノ酸配列であってよい。実施の形態において、Ｘａａnは、一連の同じアミノ酸である。Ｘａａnは、リシン、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンアミノ酸などの親水性アミノ酸であってよい。実施の形態において、Ｘａａnは、末端リシンまたはアルギニンを有してよい。
【００２６】
ペプチドＺは細胞接着性ペプチドであってよい。本開示の目的に関して、細胞接着性ペプチドは、細胞培養における表面、もしくはインビボの他の細胞または細胞外基質のいずれかに対する細胞結合を向上させることが公知のまたは後に特定される配列を含有するアミノ酸配列である、ペプチドまたはポリペプチド（これらの用語は相互に交換可能である）である。そのようなペプチドはＲＧＤ配列を含有してもよい。その上、ペプチドは、安定性を提供し、小さなアミノ酸配列が切断されるのを防ぐためにアセチル化またはアミド化されていてもよい。本開示の目的に関して、ペプチドまたはポリペプチドは、化学的に合成される、または組換え方法により作製されるアミノ酸配列である。しかしながら、本開示の目的に関して、ペプチドまたはポリペプチドは、タンパク質の断片であって、完全なタンパク質ではない。その上、実施の形態において、ペプチドまたはポリペプチドは、動物源から単離されない。実施の形態において、ペプチドまたはポリペプチドは、１が０から３までの整数であり、Ｙａａが任意のアミノ酸であっても、または例えば、リシンであってもよい、ビトロネクチンペプチド配列である、YaalProGlnValThrArgGlyAspValPheThrMetPro (配列番号33)のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２７】
実施の形態に使用してよいペプチド（Ｚ）の例が表１に列記されている。しかしながら、どのような適切なペプチド配列を使用してもよい。
【表１−１】
【表１−２】
【００２８】
本開示の目的に関して、「環状官能化ペプチド」は、重合部分と、必要に応じて、低分子量ポリアルキレングリコール部分またはアミノ酸配列の形態にあるスペーサとを含むように修飾もされている環状ペプチド配列を意味する。環状官能化ペプチドの例は、例えば、RGDYK(配列番号34)であり、これは、環状形態にあり、c(RGDyK)(配列番号34)と書くことができ、この環状ペプチドは、以下の式（式２）に示される：
式２：
【００２９】
本開示の目的に関して、「環状官能化ペプチド」は、以下の式（式３）にしたがって示すことができる：
式３： Zc- Sy - Xaan-Am
実施の形態において、式３によれば、Ｚcは環状ペプチドであり、Ｓy、ＸａａnおよびＡmは先に定義されている。例えば、官能化ペプチドは、式２に示された式の環状形態にある配列RGDYK (配列番号34)を有する環状官能化ペプチドであってよく、ここで、Ａは、リシン側鎖を通じてリシン（Ｋ）アミノ酸に付着したメタクリレート部分であり、ｍ＝１、ｙ＝０およびｎ＝０である。
【００３０】
これらの環状官能化ペプチドは、必要に応じて、ペプチドと重合部分との間にスペーサ部分を有してもよい。スペーサ（Ｓy）は、例えば、ｙ＝０から２０である反復単位を有するポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）であってよい。
【００３１】
環状官能化ペプチドの実施の形態において、Ｓyは、例えば、式(O-CH2CHR’)m2により表されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含むポリアルキレンオキシドであってよく、ここで、Ｒ’はＨまたはＣＨ3であり、ｍ２は０から２０までの整数である。実施の形態において、比較的短い鎖のポリアルキレンオキシドが望ましい。例えば、実施の形態において、Ｓyは、ＰＥＧ2、ＰＥＧ4、ＰＥＧ6、ＰＥＧ8、ＰＥＧ10、ＰＥＧ12もしくはＰＰＧ2、ＰＰＧ4、ＰＰＧ6、ＰＰＧ8、ＰＰＧ10、ＰＰＧ12またはＰＰＧ20であってよい。もしくは、実施の形態において、スペーサＳは、ポリエチレンオキシドスペーサおよびアミノ酸スペーサをどのような組合せで含んでもよい。実施の形態において、Ｓは、パルミチン酸、ステアリン酸、ラウリン酸またはヘキサエチレンジアミンなどの疎水性スペーサであってもよい。実施の形態において、Ｓは、メタクリル酸カルボキシエチルであってよい。
【００３２】
他には、細胞培養表面の調製のために、タンパク質またはペプチドで化学修飾された（メタ）アクリル酸誘導体の使用が開示された（米国特許第５６４３５６１号明細書、以下’５６１特許）。’５６１特許において、ペプチド配列と重合部分との間にスペーサを使用することは開示されていない。他には、細胞接着性ペプチド配列および重合部分と組み合わされた長鎖ＰＥＧスペーサの使用が開示された。例えば、Hern, D.L., and Hubbell, J.A., Incorporation of Adhesion Peptides into Nonadhesive Hydrogels Useful for Tissue Resurfacing, Journal of Biomedical Materials Research Part A Vol. 39, Issue 2, pp. 266-276 (Hern & Hubbell)には、重合部分に結合した細胞接着性ペプチドの使用と、主にＰＥＧからなるヒドロゲル細胞培養表面を形成するためにＰＥＧジアクリレートと組み合わされた（ＰＥＧジアクリレートと共重合された）長鎖ポリアルキレンオキシドスペーサ（ＰＥＧ７５）を介して重合部分に結合した細胞接着性ペプチドの使用が開示されている。しかしながら、HernおよびHubbellは、重合部分に直接結合した細胞接着性ペプチドの使用により、提供された細胞結合タンパク質配列への細胞の特異的結合を支持しない細胞培養表面が生成されたことを開示している。すなわち、ＰＥＧスペーサアームのない結合を通じて含まれたペプチドを含有するヒドロゲル上で播種された細胞は、非特異的に、すなわち、血清タンパク質を要求する様式で、接着し、提供されたペプチドの正確な正体に依存しなかった。HernおよびHubbellによれば、このことは望ましくなかった。主にＰＥＧのヒドロゲル高分子材料と組み合われた長鎖ＰＥＧ（分子量３４００のＰＥＧ）の使用は、特異的細胞結合を支持した。HernおよびHubbellは、Ｒ’がＨまたはＣＨ3であり、ｍ２が０から２０までの整数である(O-CH2CHR’)m2などの短鎖ＰＥＧスペーサの使用に関しては、言及していない。その上、HernおよびHubbellの開示は、主にＰＥＧからなる表面に関する（ｍが２から８までの整数であり、ｎが１００超、好ましくは２０００の整数である（５段、６４行から６段、２行まで）、式((CH2)m-O)n）の二官能性ＰＥＧの使用を開示している米国特許第７６１５５９３号明細書も参照のこと）。
【００３３】
ここに開示された表面は、実施の形態において、官能化ペプチドが結合される、グリセロールメタクリレートおよび／またはＨＥＭＡ親水性ベース基体を有する。ＨＥＭＡおよびグリセロールメタクリレートは、ＰＥＧと比べて、異なる細胞培養特徴を有する。ＰＥＧは非結合表面である。すなわち、タンパク質はＰＥＧに吸着されず、細胞はＰＥＧ表面に結合しない。ＰＥＧは、一般に、２０度未満の接触角を有する。ＨＥＭＡおよびグリセロールメタクリレートは、ＰＥＧほど非結合性ではなく、ここに開示された実施の形態にしたがって調製された表面は、３６度と５６度の間の接触角を有する。理論により拘束することを意図するものではないが、組成全体におけるこれらの差により、ここに開示された官能化ペプチドが、特異的細胞結合特徴を有する機能性細胞培養表面を提供できるであろう。ここで、ＰＥＧスペーサを持たないペプチドを有する主にＰＥＧの表面は、HernおよびHubbellに開示されたような適切な細胞培養表面を提供しなかった。
【００３４】
その上、ペプチドのカルボキシル末端とアミノ末端両方にまたはその近くに重合性部分（ポリペプチドに固有のアミノ部分以外の）の存在は開示されていない。官能化ペプチドまたはポリペプチドは、どのような密度で、好ましくは細胞の培養を支持するのに適切な密度で、基体に提供してもよい。官能化ペプチドは、実施の形態において被覆された基体の表面積により推測できるポリマー−ペプチド基質上とのその中でｍｍ2当たり約２ピコモルから５０ピコモルのペプチド密度を与える約０．２５ｍＭから２．０ｍＭの濃度で基体に提供してもよい。例えば、官能化ペプチドは、ポリマー−ペプチドのゆるく架橋した網目構造内で、０．２５ピコモル／ｍｍ2超、０．５ピコモル／ｍｍ2超、１ピコモル／ｍｍ2超、５ピコモル／ｍｍ2超、６ピコモル／ｍｍ2超、７ピコモル／ｍｍ2超、８ピコモル／ｍｍ2超、９ピコモル／ｍｍ2超、１０ピコモル／ｍｍ2超、１２ピコモル／ｍｍ2超、１５ピコモル／ｍｍ2超、２０ピコモル／ｍｍ2超、４０ピコモル／ｍｍ2超の密度で存在してよい。存在するペプチドの量は、ポリマー−ペプチド層の組成、ポリマー−ペプチド層の厚さ、およびポリペプチド自体の性質に応じて、様々であり得ることが理解されよう。実施例において以下に論じられるように、より高い密度のペプチドが、既知組成培地における未分化幹細胞の付着および増殖をよりよく支持することができるであろう。
【００３５】
本発明の官能化ペプチドの実施の形態が表２に記載されている。
【表２】
【００３６】
本発明の実施の形態において、光重合性部分を含有するポリペプチドである、官能化ポリペプチドを含むモノマーの組合せが基体上に提供され、モノマーと官能化ポリペプチドの組合せはその場で重合される。本発明の実施の形態は、未分化状態のヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）などの培養が難しい細胞の成長および増殖を刺激できるペプチド官能化合成層を製造するために光活性親水性モノマーおよび架橋剤と組み合わされた細胞接着性光活性部分をその場で被覆するためのプロセスを提供する。実施の形態において、これらの被覆は、細胞接着性であるペプチドを含有する。実施の形態において、細胞接着性ペプチドはＲＧＤ配列を有する。しかしながら、ペプチドは、ＲＧＤペプチド配列を有するペプチドには限定されない。実施の形態において、メタクリレート官能化ペプチドは、表面の界面に示されおり、および／または基質内に埋め込まれており、異なる細胞応答を引き出すために異なる親水性モノマーと組み合わされると同時に、異なるモル濃度で配合されている。光活性または光重合性官能基としては、ビトロネクチンおよびラミニンペプチド配列が挙げられる。それらは、直鎖状または環状であって差し支えなく、架橋剤として働く、または架橋されたときにより制限された環状ペプチド構造を模倣する光活性基を少なくとも２つペプチド上に含有することもできる。
【００３７】
本発明の細胞培養表面を形成するために使用されるモノマーおよび官能化ペプチドの混合物の実施の形態の例が、表３〜８に示されている。
【００３８】
表３は、親水性モノマーとしてのＨＥＭＡおよび親水性架橋剤としてのＴＥＧＤＭＡと組み合わされたＢＳＰ−メタクリレート（MAA-配列番号19）の希釈を示している。
【表３】
【００３９】
表４は、親水性モノマーとしてのＨＥＭＡおよび親水性架橋剤としてのＴＥＧＤＭＡと組み合わされたＶＮ−メタクリレート（MAA-配列番号27）の希釈を示している。
【表４】
【００４０】
表５は、親水性モノマーとしてのＨＥＭＡおよび親水性架橋剤としてのＴＥＧＤＭＡと組み合わされた、ＰＥＯスペーサリンカーを含むＶＮ−メタクリレート（MAA-PEG4-配列番号27）の希釈を示すライブラリの配合を示している。
【表５】
【００４１】
表６は、親水性モノマーとしてのグリセロールモノメタクリレートおよび親水性架橋剤としてのグリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレートと組み合わされた、ＰＥＯスペーサリンカーを含むＶＮ−メタクリレート（MAA-PEG4-配列番号27）の希釈を示すライブラリの配合を示している。
【表６】
【００４２】
表７は、親水性モノマーとしてのＨＥＭＡおよび親水性架橋剤としてのＴＥＧＤＭＡと組み合わされた、ＰＥＯスペーサリンカーを含むＶＮ−モノメタクリレートおよびＶＮ−ジメタクリレート（MAA-PEG4-配列番号27）のライブラリ希釈を示している。
【表７】
【００４３】
表８は、親水性モノマーとしてのグリセロールモノメタクリレートおよび親水性架橋剤としてのグリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレートと組み合わされたＶＮ−メタクリレート（MAA-配列番号27）の希釈を示すライブラリの配合を示している。
【表８】
【００４４】
試験した実際のライブラリは、合成ポリマー基質中に存在するペプチドの量と細胞応答との間の相関関係を示した。表面ＨＥＭＡ−１００−ＶＮ−２Ａに示された基質中に存在するペプチドの全体量の増加により、細胞接着と伸長が著しく増加したのが分かる。
【００４５】
追加の実施の形態において、環状官能化ポリマーペプチド表面を、官能化ペプチド（配列番号34）を使用して製造した。この表面は、２４．８μｇ／ｃｍ2および９．４μｇ／ｃｍ2で存在する２−ヒドロキシエチルメタクリレート（親水性モノマー）およびテトラエチレングリコールジメタクリレート架橋剤と組み合わされた１ｍＭ（２．９μｇ／ｃｍ2）のシクロ(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys(MAA)) (配列番号34)からなった。
【００４６】
調製した別のヒドロゲル配合物は、８０μＬの２−ヒドロキシエチルメタクリレートおよび３０μＬのテトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート、並びに３０μＬのDarocur 1173（エタノール中１０％）、２０μＬのIrgacure 819（エタノール中１％）および溶媒としての９．９２ｍｌのエタノールを含有した。１ｍｇの環状ＲＧＤ−ＶＮ−ＭＡＡを４０μＬの18 Mega OHM水中に１０μＬずつ増加させながら溶解させた。１ｍＭのペプチド濃度の溶液１ｍｌの合計について、９６０μＬのアクリレートヒドロゲルを、溶解したペプチドに加えた。
【００４７】
実施の形態において、ペプチド含有する高分子細胞培養表面を製造する方法が提示される。実施の形態において、ペプチド含有高分子細胞培養表面を製造する方法は、（１）ペプチド−（メタ）アクリレートモノマーを混合する工程；（２）モノマーを細胞培養基体に提供する工程；（３）モノマーを硬化または重合させて、ポリマーを形成する工程；および（４）洗浄する工程を提供する。実施の形態において、追加の工程としては、乾燥工程、細胞培養基体に蓋を提供する工程、滅菌工程、ペプチド含有高分子細胞培養表面を有する細胞培養物品を包装および／または出荷する工程が挙げられるであろう。例えば、実施の形態において、少なくとも１種類の（メタ）アクリレートモノマーの存在下で、ペプチドを含有するメタクリレートを基体に提供してもよい。
【００４８】
図１は、細胞培養表面を製造する方法のある実施の形態を示す流れ図である。実施の形態において、光活性化学物質グラフト化によって親水性表面上に細胞結合ペプチドを提供する方法が提供される。これらの方法は、（１１０）官能化ペプチド（ｆペプチド）をモノマーと混合する工程；（１２０）混合物を細胞培養基体に施す工程；（１３０）例えば、ＵＶ／ＶＩＳエネルギーへの曝露により、モノマーおよび官能化ペプチドを重合させて、このモノマーおよび官能化ペプチドを硬化させる工程；（１４０）洗浄する工程；（１５０）乾燥させる工程；（１６０）蓋無しフラスコに蓋を施す（例えば、フラスコに蓋を溶着する）、滅菌、ラベル貼り、包装および出荷などの、随意的な追加の処理の各工程を含む。工程（１２０）において、官能化ペプチドおよびモノマーの混合物を、液体分配法、回転被覆法、吹き付け被覆法、または他の方法を含む当該技術分野で公知のどのような手段によって、基体の表面に提供してもよい。工程（１３０）において、硬化または重合工程は、重合性部分の性質に応じて、当該技術分野で公知のどのような手段によって行ってもよく、モノマー混合物中への光開始剤の導入、および紫外線、可視線または熱エネルギーへの表面の曝露を含むであろう。工程（１４０）において、洗浄工程は、液体分配法および撹拌の有無にかかわらず、定温放置を含む、当該技術分野で公知のどのような手段によって行ってもよく、ここで、液体は、水、水中に希釈された低級アルコール、または他の溶媒であってよい。工程１５０において、乾燥工程は、真空および／または熱の施用によって行ってもよい。工程１６０において、蓋は、溶着、ヒートシール法、圧力シール法、取外し可能なシール法、または任意の他の方法を含む、当該技術分野で公知のどのような手段によって細胞培養基体に提供してもよい。滅菌工程は、例えば、エタノールへの曝露、ガンマ線照射、または他の方法によって行ってよい。
【００４９】
実施の形態において、工程１１０では、層を形成する組成物は、モノマー以外に、界面活性剤、湿潤剤、光開始剤、連鎖移動剤、熱重合開始剤、触媒および活性剤などの追加の化合物を１種類以上含んでもよい。どのような適切な重合開始剤を使用してもよい。当業者は、モノマーに使用するのに適した、適切な開始剤、例えば、ラジカル開始剤またはカチオン開始剤を選択することが容易にできるであろう。様々な実施の形態において、フリーラジカルモノマーを生成して連鎖重合を開始するために、紫外線が使用される。しかしながら、紫外線開始剤の代わりに、可視光開始剤および低温開始剤を使用して、紫外線などのより有害なまたは損害を与える照射線源への曝露から、ペプチドを保護してもよい。
【００５０】
熱開始剤、光開始剤または室温開始剤を含むどのような適切な開始剤を使用してもよい。重合開始剤の例としては、有機過酸化物、アゾ化合物、キノン、ニトロソ化合負物、ハロゲン化アシル、ヒドラゾン、メルカプト化合物、ピリリウム化合物、イミダゾール、クロロトリアジン、ベンゾイン、ベンゾインアルキルエーテル、ジケトン、フェノン、またはそれらの混合物が挙げられる。室温重合のための開始剤として、過硫酸カリウムを使用してもよい。適切な市販の紫外線活性化および可視光活性化光開始剤の例は、ニューヨーク州、タリータウン所在のCiba Specialty Chemicalsから市販されている、IRGACURE 651, IRGACURE 184, IRGACURE 369, IRGACURE 819, DAROCUR 4265 および DAROCUR 1173、並びにBASF（ノースカロライナ州、シャーロット所在）から市販されている、LUCIRIN TPO および LUCIRIN TPO-Lなどの商標を有する。
【００５１】
追加の開始剤としては、例えば、（ＶＡ−０４４）２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二塩酸塩；（ＢＡ０４６Ｂ）２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二硫酸塩二水和物；（ＶＡ−５０）２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩；（ＶＡ−０５７）２，２’−アゾビス［Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン］水和物；（ＶＡ−０６０）２，２’−アゾビス｛２−［１−（２−ヒドロキシエチル）−２−イミダゾリン−２−イル］プロパン｝二塩酸塩；（ＶＡ−０６１）２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］；（ＶＡ−０６７）２，２’−アゾビス（１−アミノ−１−ピロリジノ−２−エチルプロパン）二塩酸塩；（ＶＡ−０８０）２，２’−アゾビス｛２−メチル−Ｎ−［１，１−ビス（ヒドロキシメチル）−２−ヒドロキシエチル］プロパンアミドまたは（ＶＡ−０８６）２，２’−アゾビス［２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロパンアミド］を含む熱重合に使用できる水溶性アゾ開始剤が挙げられるであろう。（Ｖ−７０）２，２’−アゾビス（４−メトキシ−２．４−ジメチルバレロニトリル）；（Ｖ−６５）２，２’−アゾビス（２．４−ジメチルバレロニトリル）；（Ｖ−６０１）ジメチル２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオネート）；（Ｖ−５９）２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）；（Ｖ−４０）１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）；（ＶＦ−０９６）２，２’−アゾビス［Ｎ−（２−プロペニル）−２−メチルプロピオンアミド］；（Ｖ−３０）１−［（１−シアノ−１−メチルエチル）アゾ］ホルムアミド；（ＶＡｍ−１１０）２，２’−アゾビス（Ｎ−ブチル−２−メチルプロピオンアミド）また（ＶＡｍ−１１１）２，２’−アゾビス（Ｎ−シクロヘキシル−２−メチルプロピオンアミド）などの油溶性アゾ開始剤を熱重合に使用してもよい。これらの開始剤は、例えば、バージニア州、リッチモンド所在のWAKO Chemicalsから入手できる。その上、ＰＥＧ主鎖を有するアゾ開始剤などのマクロ開始剤を熱重合に使用してもよい。
【００５２】
光増感剤を適切な開始剤系に含ませてもよい。代表的な光増感剤は、カルボニル基または第三級アミノ基もしくはそれらの混合物を有する。カルボニル基を有する光増感剤としては、ベンゾフェノン、アセトフェノン、ベンジル、ベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、キサントン、チオキサントン、９，１０−アントラキノン、および他の芳香族ケトンが挙げられる。第三級アミンを有する光増感剤としては、メチルジエタノールアミン、エチルジエタノールアミン、トリエタノールアミン、フェニルメチルエタノールアミン、および安息香酸ジメチルアミノエチルが挙げられる。市販の光増感剤としては、英国、クローリー所在のBiddle Sawyer Corp.からのQUANTICURE ITX, QUANTICURE QTX, QUANTICURE PTX, QUANTICURE EPDが挙げられる。
【００５３】
一般に、光増感剤または光開始剤系の量は、約０．０１から１０質量％まで様々であろう。
【００５４】
カチオン開始剤の例としては、アリールスルホニウム塩などのオニウムカチオンの塩、並びにイオンアレーン系などの有機金属塩が挙げられる。
【００５５】
実施の形態において、基体は、セラミック基体、ガラス、プラスチック、ポリマーまたはコポリマー、それらの任意の組合せ、またはある材料の別の材料上の被覆を含む細胞を培養するのに適したどのような材料であってもよい。基体は、平らであっても、形造られていてもよい。そのような基体としては、ソーダ石灰ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス、Ｖｙｃｏｒガラス、石英ガラスなどのガラス材料；シリコン；ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（ジメチルシロキサン）モノメタクリレート、環状オレフィンポリマー、フルオロカーボンポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンイミンなどの樹状ポリマーを含むプラスチックまたはポリマー；酢酸ビニル−無水マレイン酸共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、エチレン−アクリル酸重合体またはこれらの誘導体などの共重合体が挙げられる。ここに用いたように、「環状オレフィンコポリマー」は、複数のモノマー種から形成されたポリマーを意味し、ここで、それらのモノマー種の内の少なくとも１種類が環状オレフィンモノマーであり、少なくとも１種類の他のモノマー種は、環状オレフィンモノマー種ではない。多くの実施の形態において、環状オレフィンコポリマーは、エチレンおよびノルボルネンモノマーから形成される。環状オレフィンコポリマー樹脂は、日本国のBoedeker Plastics, Inc.からのＴＯＰＡＳ（登録商標）およびケンタッキー州、ルイビル所在のZeon Chemicals,L.P.からのＺｅｏｎｏｒの商標名で市販されている。実施の形態において、基体は、ポリマー基質の保持力を向上させるように処理してもよい。例えば、基体を、負の電荷、正の電荷を提供する、より親水性の表面を形成する、またはポリマー基質の基体への接着を向上させる化学官能基を形成する化学処理またはプラズマ処理により処理してもよい。例えば、そのような処理としては、疎水性または親水性相互作用、立体相互作用、親和性またはファンデルワールス力が挙げられるであろう。
【００５６】
ペプチド官能化合成細胞培養層を形成するために、モノマーおよび官能化ペプチドを重合させる。バルク相（実質的に無溶媒）または溶媒相中で重合されていようとなかろうと、モノマーは、適切な開始機構を通じて重合される。そのような機構の多くが当該技術分野において公知である。例えば、温度を上昇させて、熱開始剤を活性化させてもよい；光開始剤を、適切な波長の光などへの曝露によって活性化させてもよい。数多くの実施の形態によれば、モノマーまたはモノマー混合物は、紫外線を使用して硬化される。硬化は、酸素阻害を防ぐために、窒素保護などの不活性ガス保護下で行うことが好ましい。ガス保護と組み合わせた適切な紫外線は、ポリマーの転化を増加させ、被覆の完全性を確実にし、細胞毒性を減少させるであろう。
【００５７】
実施の形態において、前記層を溶媒で一回以上洗浄して、未反応モノマーまたは低分子量ポリマー種などの不純物を除去してもよい。様々な実施の形態において、層は、エタノールまたはエタノール水溶液、例えば、７０％のエタノール、９０％超のエタノール、９５％超のエタノールまたは約９９％のエタノールで洗浄される。７０％のエタノール溶媒による洗浄は、毒性であるかもしれない不純物を除去するように働くだけでなく、細胞の培養前に表面を滅菌するように働くことができる。
【００５８】
図２は、細胞培養表面の実施の形態を製造する方法を示す説明図である。図２において、例えば、テトラエチレングリコールジメタクリレート（ＴＥＧＤＭＡ）およびヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）などのアクリレートまたはメタクリレートモノマー２１０を、ＶＮ−メタクリレートまたはＢＳＰ−（メタクリレート）2などの官能化ペプチド２２０もしくは官能化ペプチド２２０の混合物と混合し、基体に施し、紫外線に曝露して、細胞培養用途に適したペプチド結合ポリマー２５０表面を形成する。式１を参照すると、ＶＮ−メタクリレートはAm - Sy - Xaan - Sy1 - Z - Sy2 - Am1であり、ＸａａはＬｙｓであり、アセチル化されており、ｎ＝１、「Ａ」はメタクリル酸（ＭＡＡ）であり、ｍ＝１、スペーサSyはなく（ｙ＝０）、スペーサSy1はなく（ｙ１＝０）、ペプチドＺは配列番号28であり、スペーサSy2はなく（ｙ２＝０）、Am1はない（ｍ１＝０）。式１を参照すると、ＢＳＰ−（メタクリレート）2はAm - Sy - Xaan - Sy1 - Z - Sy2 - Am1であり、ここで、「Ａm」はメタクリル酸（ＭＡＡ）（ｍ＝１）であり、スペーサSyはなく（ｙ＝０）、「Ｘａａ」はＬｙｓであり、アセチル化されており（ｎ＝１）、スペーサSy1はなく（ｙ１＝０）、ペプチドＺは配列番号19であり、スペーサSy2はなく（ｙ２＝０）、Am2はメタクリル酸または任意のカルボン酸官能化メタクリレートである。この実例において、第２のメタクリル酸部分は、ｃ−リンカーを介してペプチド配列のＮ末端に存在する。
【００５９】
図２は、ＵＶエネルギーへの曝露の際に（I-819またはD-1173などの光重合剤の存在下で）ポリマー基質中にペプチドを含有するポリマー基質を形成する、親水性モノマーとしてのＨＥＭＡおよび架橋剤としてのＴＥＧＤＭＡ（トリエチレングリコールジメタクリレート）と組み合わされたＶＮ−メタクリレートおよび／またはＢＳＰ−（メタクリレート）2を示す反応スキームを示している。
【００６０】
理論により制限するものではないが、ＶＮ−ジメタクリレートの架橋能力により、陽性の細胞応答に影響するであろう基質中のより安定な制限配置を形成したであろう。全体に、ペプチド密度の少ない他の表面と比べて、ＨＥＭＡ−１００−ＶＮ−２Ａ表面について、２〜３倍多く、細胞数が増加した。
【００６１】
実施の形態において、架橋したポリマー−ペプチド基質を形成するために、例えば、ヒドロエチルメタクリレートおよびテトラエチレングリコールジメタクリレートとのその場でのフリーラジカル光重合により反応される一連の官能化モノおよびジメタクリル化ペプチドが提供される。より親水性である他のモノマーも、配合ライブラリ中に提示されている。さらに、本発明により、基質中への非常に低いペプチドの供給濃度が可能になると同時に、光活性ペプチドの９５％超の利用が可能になる。このことは、従来の方法を超えた著しい改善を示す。詳しくは、本発明の方法の実施の形態は、例えば、Ｔ７５フラスコ中で回転被覆したときの０．６３ｍｇから２．４ｍｇと同等である０．７５ｍＬ〜１．５ｍＬのモノマー−ペプチド溶液を利用するのに対し、従来の方法では、１６．８ｍｇのペプチドが必要であり、先に述べたのと同じ様式の１％未満しか利用されなかった。本発明はまた、超音波吹き付け被覆法、浸漬被覆法および最大の材料を利用する溶液注型法などの、回転被覆法の域を超えた他の被覆技法まで広げることができる。別の重要な属性は、プラスチックの表面との化学的相互作用を起こさずに、熱可塑性樹脂を含む他の基体にこの方法を使用できる能力である。これは、プロセスからＤＭＦ溶媒を除去し、したがって、ベース基体としてのより安いプラスチック樹脂の使用を促進し、使用後のＤＭＦの廃棄の負担が減少する。
【００６２】
本発明の方法の実施の形態の別の利点は、全体の製造コストに大きな影響を及ぼすプロセス工程の著しい減少である。この方法は、細胞培養のための化学結合したペプチド表面の製造に対する新規の容易な合成経路を提供する。
【００６３】
実施の形態において、親水性モノマーは、例えば、グリセロールモノメタクリレート（ＧＬＹ−ＭＥＴＨ）、グリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレート（ＤＧＤＭＡ）、またはヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、またはテトラエチレングリコールジメタクリレート（ＴＥＧＤＭ）である。アクリレートおよびメタクリレートモノマーは、当該技術分野に公知のように合成しても、ペンシルベニア州、ウォリントン所在のPolysciences, Inc.、ミズーリ州、セントルイス所在のSigma Aldrich, Inc.、およびペンシルベニア州、エクストン所在のSartomer, Inc.などの供給メーカーから得てもよい。ポリペプチドは、当該技術分野に公知のように合成しても（あるいは分子生物学技法により産生しても）、またはカリフォルニア州、サニーベール所在のAmerican Peptide Corporation、ニュージャージー州、ピスカタウェイ所在のGen GenScript Corporation、およびカリフォルニア州、サンディエゴ所在のGenway Biotechnologyなどの供給メーカーから得てもよい。スペーサは、当該技術分野に公知のように合成しても、オハイオ州、パウエル所在のQuanta BioDesign, Ltd.から得られる個別(discrete)ポリエチレングリコール（ｄＰＥＧ）などのように、供給メーカーから得てもよい。本発明の細胞培養表面の実施の形態が、表３〜８に示されている。
【００６４】
図３は、細胞培養表面上に分布した蛍光標識ペプチドポリマーの蛍光密度を示している。この図において、ローダミン標識Ac-Lys-(MAA)-Gly-Gly-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2-TAMRA (Ac-K-MAA-配列番号-TAMRA)を、ＨＥＭＡおよびＴＥＧＤＭＡが配合された未標識メタクリレートペプチド配列中に０．２％加えた。ＴＡＭＲＡは、ペプチドを標識するために使用されるテトラメチルローダミン染料である。図３は、被覆が、縁のわずかな不均一を除いて、比較的均一であることを示している。
【００６５】
図４は、ニュージャージー州、フランクリン・レイクス所在のBDから得られる対照表面のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（図４Ａ）およびともに全てにここに引用する同時係属出願第１２／３６２，９７４号および同第１２／３６２７８２号の各明細書に記載された方法にしたがって製造されたビトロネクチンペプチド結合膨潤性アクリレート表面である、ニューヨーク州、コーニング所在のCorning Incorporatedから得られる対照表面のＳｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）（図４Ｂ）上で培養されたＨ７ヒト胚性幹細胞と比べた、本発明の実施の形態（図４Ｃ）の６ウェルプレート中に４日間に亘り培養したＨ７ヒト胚性幹細胞の顕微鏡写真を示している。図４に示されるように、本発明の実施の形態上で増殖したこれらの細胞の形態は、対照表面上のこれらの細胞の形態と似ているが、本発明の実施の形態上で増殖した細胞は、対照と比べると、より嚢胞性の形態を有する。
【００６６】
図５は、対照表面と比べた本発明の実施の形態における官能化ペプチド−ポリマー被覆表面上で培養したクリスタル・バイオレット染色Ｈ７ヒト胚性幹細胞の顕微鏡写真を示している。（図５Ａ）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、（図５Ｂ）Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）、先の表７に記載されたような（図５ＣおよびＤ）ＨＥＭＡ−１００−ＶＮ−２ＭＡＡ、および（図５ＥおよびＦ）ＨＥＭＡ−５０−ＶＮ−２ＭＡＡ上のクリスタル・バイオレット染色Ｈ７ｈＥＳＣ。図５ＤおよびＦは、ＨＥＭＡ−１００−ＶＮ−２ＭＡＡおよびＨＥＭＡ−５０−ＶＮ−２ＭＡＡについて示された重複実験である。図５は、本発明の実施の形態上で増殖したＨ７ｈＥＳＣ細胞が、現状の対照表面（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）およびＳｙｎｔｈｅｍａｘ（商標））上で増殖した細胞に匹敵することを示している。
【００６７】
図６Ａ〜Ｈは、Corning Incorporatedからのｌａｍｉｎｉｎ（商標）表面上（図６ＡおよびＥ）、ＨＥＭＡおよびＴＥＧＤＭＡにより製造された環状官能化ＲＧＤペプチド表面上（図６ＢおよびＦ）、グリセロールメタクリレートおよび１，３−ジグリセロレートジメタクリレートにより製造された環状官能化ＲＧＤペプチド（環状配列番号34）表面上（図６ＣおよびＧ）、並びにCorning IncorporatedからのＳｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）上（図６ＤおよびＨ）で増殖した、培養の１日後（図６Ａ〜Ｄ）および培養の３日後（図６Ｅ〜Ｈ）の神経前駆細胞の顕微鏡写真を示している。
【００６８】
実施の形態において、細胞培養表面は、細胞培養に適したどのような表面上に形成してもよい。細胞培養に適した物品の例としては、６，１２，９６，３８４，および１５３６ウェルプレートなどのシングルおよびマルチウェルプレート、瓶、ペトリ皿、フラスコ、ビーカー、プレート、ローラーボトル、区画および多区画培養スライドなどのスライド、試験管、カバースリップ、バッグ、膜、中空繊維、ビーズおよびマイクロキャリア、カップ、スピナーボトル、潅流チャンバ、バイオリアクタ、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）(Corning Incorporated)および発酵槽が挙げられる。
【００６９】
細胞は、（ｉ）調査研究に使用するため、または治療法を開発するために、既知組成培地内の合成表面上で培養される未分化幹細胞を十分な量で得ること、（ｉｉ）培養されている細胞の調査研究のため、（ｉｉｉ）治療法を開発するため、（ｉｖ）治療目的のため、（ｖ）例えば、ｃＤＮＡライブラリを作成することにより、遺伝子発現を研究するため、および（ｖｉ）薬物と毒性のスクリーニングを研究するため、を含むどのような適切な目的に使用してもよい。
【００７０】
本発明の方法の実施の形態により調製される細胞培養物品は、初代細胞、細胞株、組織および例えば、幹細胞、成人幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）または人工多能性細胞（ＩＰＣ）を含むどのような関連性のある細胞タイプの成長および増殖を促進するために効果的に提示することができる。実施の形態において、培養中のこれらの細胞は、治療用途に使用してもよい。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、未分化状態で培養において継続的に増殖する能力を有するので、本発明に使用するためのｈＥＳＣは株化細胞から得てもよい。株化されたヒト胚性幹細胞株の例としては、以下に限られないが、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３またはＨ１４（ウィスコンシン大学により株化されたＷｉＣｅｌｌから得られる）（Thompson (1998) Science 282:1145 ）；ｈＥＳＢＧＮ−０１、ｈＥＳＢＧＮ−０２、ｈＥＳＢＧＮ−０３（ジョージア州、アセンズ所在のBresaGen,Inc.）；ＨＥＳ−１、ＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、ＨＥＳ−４、ＨＥＳ−５、ＨＥＳ−６（シンガポール国のES Cell International, Inc.から）；ＨＳＦ−１、ＨＳＦ−６（カリフォルニア大学サンフランシスコ校から）；Ｉ３、Ｉ３．２、Ｉ３．３、Ｉ４、Ｉ６、Ｉ６．２、Ｊ３、Ｊ３．２（イスラエル国、ハイファ所在のイスラエル工科大学で誘導された）；ＵＣＳＦ−１およびＵＣＳＦ−２（Genbacev et al., Fertil. Steril. 83(5):1517-29, 2005）；ＨＵＥＳ１−１７株（Cowan et al., NEJM 350(13):1353-56, 2004）；およびＡＣＴ−１４株（Klimanskaya et al., Lancet, 365(9471):1636-41, 2005）が挙げられる。本発明に使用される胚性幹細胞は、初代胚組織から直接得てもよい。一般に、このことは、そうでなければ廃棄されるであろう、胚盤胞段階での凍結したインビトロ受精卵を使用して行われる。
【００７１】
他の適切な幹細胞としては、人工霊長類多能性幹（ｉＰＳ）細胞が挙げられる。本発明によるＯＰＣも、人工霊長類多能性幹（ｉＰＳ）細胞から分化されてもよい。ｉＰＳ細胞は、ｈＥＳＣなどの多能性幹細胞の表現型を獲得するように再プログラム化されるように、例えば、１つ以上の適切なベクターのトランスフェクションにより、遺伝子組み換えされた、ヒトなどの若いまたは成体の哺乳類から得られる、細胞を称する。これらの再プログラム化された細胞により獲得された表現型形質としては、胚盤胞から単離された幹細胞に似た形態、並びに胚盤胞由来の胚性幹細胞に似た表面抗原発現、遺伝子発現およびテロメラーゼ活性が挙げられる。ｉＰＳ細胞は、典型的に、初代胚葉：内胚葉、外胚葉および中胚葉の各々からの少なくとも１つの細胞タイプに分化する能力を有し、したがって、様々な細胞タイプへの分化に適している。ｈＥＳＣのようなｉＰＳ細胞は、免疫不全マウス、例えば、ＳＣＩＤマウスに注入されたときに、奇形種を形成する（Takahashi et al., (2007) Cell 131(5):861; Yu et al., (2007) Science318:5858）。
【００７２】
本発明の実施の形態は、全体の製造コストの著しい減少をもたらす、対費用効果的な様式で容易な製造プロセスで、官能化ペプチド−ポリマー被覆表面を作製するための効率的な技法を提供する。実施の形態において、その表面は、既知組成培地を使用して多能性（複数の潜在的な結果を有する）状態でヒト胚性幹細胞を含む細胞を培養するのに有用な表面である。本発明の実施の形態における合成表面と組み合わせた既知組成培地の使用が重要である。何故ならば、血清を使用すると、治療用途を意図した培養細胞にとって有害かもしれない不確定要因が細胞培養に導入されてしまうからである。
【００７３】
態様（１）において、官能化ペプチドモノマーであって、式：Am - Sy - Xaan - Sy1 - Z - Sy2 - Am1により記載され、ここで、Ａは重合部分であり、ｍは１から６までの整数であり、ｍ１は１から６までの整数であり、Ｘａａnは独立して任意のアミノ酸であり、ｎは０から６までの整数であり、Ｓはスペーサであり、ｙは０から３０までの整数であり、ｙ１は０から３０までの整数であり、ｙ２は０から３０までの整数であり、Ｚは細胞接着性ペプチドである、官能化ペプチドモノマーが提供される。態様（２）において、細胞接着性ペプチド（Ｚ）が、配列KGGGQKCIVQTTSWSQCSKS (配列番号1); GGGQKCIVQTTSWSQCSKS(配列番号2); KYGLALERKDHSG (配列番号3); YGLALERKDHSG (配列番号4); KGGSINNNRWHSIYITRFGNMGS (配列番号5); GGSINNNRWHSIYITRFGNMGS (配列番号6); KGGTWYKIAFQRNRK (配列番号7); GGTWYKIAFQRNRK (配列番号8); KGGTSIKIRGTYSER (配列番号9); GGTSIKIRGTYSER (配列番号10); KYGTDIRVTLNRLNTF (配列番号11); YGTDIRVTLNRLNTF (配列番号12); KYGSETTVKYIFRLHE (配列番号13); YGSETTVKYIFRLHE(配列番号14); KYGKAFDITYVRLKF (配列番号15); YGKAFDITYVRLKF(配列番号16); KYGAASIKVAVSADR (配列番号17); YGAASIKVAVSADR(配列番号18); KGGNGEPRGDTYRAY(配列番号19); GGNGEPRGDTYRAY (配列番号20) CGGNGEPRGDTYRAY (配列番号21); GGNGEPRGDTRAY (配列番号22); KYGRKRLQVQLSIRT (配列番号23); YGRKRLQVQLSIRT(配列番号24); KGGRNIAEIIKDI (配列番号25); GGRNIAEIIKDI (配列番号26); KGGPQVTRGDVFTMP (配列番号27); GGPQVTRGDVFTMP(配列番号28); GGPQVTRGDVFTMPK (配列番号29); GRGDSPK (配列番号30); KGGAVTGRGDSPASS(配列番号31); GGAVTGRGDSPASS (配列番号32); YaalPQVTRGNVFTMP (配列番号33); 直鎖または環状であってもよいRGDYK (配列番号34)、またはそれらの組合せを含むことを特徴とする態様１の官能化ペプチドモノマーが提供される。態様（３）において、細胞接着性ペプチドがKGGPQVTRGDVFTMP (配列番号27) または GGPQVTRGDVFTMP (配列番号28)を含むことを特徴とする態様１または２の官能化ペプチドモノマーが提供される。態様（４）において、重合部分Ａがアクリレートまたはメタクリレート部分を含むことを特徴とする態様１から３いずれかの官能化ペプチドモノマーが提供される。態様（５）において、重合部分がメタクリル酸であることを特徴とする態様１から４いずれかの官能化ペプチドモノマーが提供される。態様（６）において、スペーサが、２０以下の反復単位を有するポリエチレンオキシドであることを特徴とする態様１から５いずれかの官能化ペプチドモノマーが提供される。態様（７）において、スペーサがＰＥＧ4であることを特徴とする態様１から６いずれかの官能化ペプチドモノマーが提供される。
【００７４】
追加の態様（８）において、態様１から７いずれかの官能化ペプチドおよび少なくとも１種類の光重合性モノマーを含む混合物から形成されたポリマーが提供される。態様（９）において、少なくとも１種類の光重合性モノマーが、ＨＥＭＡ、ＴＥＧＤＭＡ、グリセロールモノメタクリレートまたはグリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレートであることを特徴とする態様８のポリマーが提供される。態様（１０）において、ポリマーが、官能化ペプチド、ＨＥＭＡおよびＴＥＧＤＡを含む混合物から形成されることを特徴とする態様８または９のポリマーが提供される。態様（１１）において、ポリマーが、官能化ペプチド、グリセロールモノメタクリレートおよびグリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレートを含む混合物から形成されることを特徴とする態様８から１０いずれかのポリマーが提供される。態様（１２）において、ポリマーがその場で形成されることを特徴とする態様８から１１いずれかのポリマーが提供される。
【００７５】
追加の態様（１３）において、細胞培養表面を製造する方法であって、官能化ペプチドモノマーおよび少なくとも１種類の（メタ）アクリレートモノマーの混合物を提供し、この混合物を細胞培養基体に施し、これらのモノマーをその場で重合させて、ペプチド−ポリマーを形成する各工程を有してなる方法が提供される。態様（１４）において、（メタ）アクリレートモノマーが、ＨＥＭＡ、ＴＥＧＤＭＡ、グリセロールモノメタクリレートまたはグリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレートまたはそれらの組合せを含むことを特徴とする態様１３の方法が提供される。態様（１５）において、メタクリレートモノマーが、ＨＥＭＡおよびＴＥＧＤＡの組合せを含むことを特徴とする態様１３または１４の方法が提供される。態様（１６）において、官能化ペプチドモノマーが、式：Am - Sy - Xaan - Sy1 - Z - Sy2 - Am1により記載され、ここで、Ａは重合部分であり、ｍは１から６までの整数であり、ｍ１は１から６までの整数であり、Ｘａａnは独立して任意のアミノ酸であり、ｎは０から６までの整数であり、Ｓはスペーサであり、ｙは０から３０までの整数であり、ｙ１は０から３０までの整数であり、ｙ２は０から３０までの整数であり、Ｚは細胞接着性ペプチドである、ことを特徴とする態様１３から１５いずれかの方法が提供される。態様（１７）において、ＸａａがＬｙｓであり、ｎ＝１であることを特徴とする態様１３から１６いずれかの方法が提供される。態様（１８）において、Ａがアクリレートまたはメタクリレートであることを特徴とする態様１３から１７いずれかの方法が提供される。態様（１９）において、ＳがＰＥＯであり、ｍ＝４であることを特徴とする態様１３から１８いずれかの方法が提供される。態様（２０）において、Ｚが、配列KGGGQKCIVQTTSWSQCSKS (配列番号1); GGGQKCIVQTTSWSQCSKS(配列番号2); KYGLALERKDHSG (配列番号3); YGLALERKDHSG (配列番号4); KGGSINNNRWHSIYITRFGNMGS (配列番号5); GGSINNNRWHSIYITRFGNMGS (配列番号6); KGGTWYKIAFQRNRK (配列番号7); GGTWYKIAFQRNRK (配列番号8); KGGTSIKIRGTYSER (配列番号9); GGTSIKIRGTYSER (配列番号10); KYGTDIRVTLNRLNTF (配列番号11); YGTDIRVTLNRLNTF (配列番号12); KYGSETTVKYIFRLHE (配列番号13); YGSETTVKYIFRLHE(配列番号14); KYGKAFDITYVRLKF (配列番号15); YGKAFDITYVRLKF(配列番号16); KYGAASIKVAVSADR (配列番号17); YGAASIKVAVSADR(配列番号18); KGGNGEPRGDTYRAY(配列番号19); GGNGEPRGDTYRAY (配列番号20) CGGNGEPRGDTYRAY (配列番号21); GGNGEPRGDTRAY (配列番号22); KYGRKRLQVQLSIRT (配列番号23); YGRKRLQVQLSIRT(配列番号24); KGGRNIAEIIKDI (配列番号25); GGRNIAEIIKDI (配列番号26); KGGPQVTRGDVFTMP (配列番号27); GGPQVTRGDVFTMP(配列番号28); GGPQVTRGDVFTMPK (配列番号29); GRGDSPK (配列番号30); KGGAVTGRGDSPASS(配列番号31); GGAVTGRGDSPASS (配列番号32); YaalPQVTRGNVFTMP (配列番号33); 直鎖または環状であってもよいRGDYK (配列番号34)、およびそれらの組合せからなる群より選択される細胞接着性ペプチドであることを特徴とする態様１３から１９いずれかの方法が提供される。
【００７６】
別の態様（２２）において、官能化環状ペプチドモノマーであって、式：Zc - Sy - Xaan - Amにより記載され、ここで、ＺCは細胞接着性環状ペプチドであり、Ｓはスペーサであり、ｙは０から３０までの整数であり、Ｘａａnは独立して任意のアミノ酸であり、ｎは０から６までの整数であり、Ａは重合部分であり、ｍは１から６までの整数である、官能化環状ペプチドモノマーが提供される。態様（２３）において、重合部分Ａがアクリレートまたはメタクリレート部分を含むことを特徴とする態様２２の官能化環状ペプチドモノマーが提供される。態様（２４）において、重合部分がメタクリル酸であることを特徴とする態様２２または２３の官能化環状ペプチドモノマーが提供される。態様（２５）において、スペーサが、２０以下の反復単位を有するポリエチレンオキシドである態様２２から２４いずれかの官能化環状ペプチドモノマーが提供される。態様（２６）において、スペーサがＰＥＧ4であることを特徴とする態様２２から２５いずれかの官能化環状ペプチドモノマーが提供される。
【００７７】
別の態様（２７）において、態様２２から２６いずれかの官能化環状ペプチドおよび少なくとも１種類の光重合性モノマーを含む混合物から形成されたポリマーが提供される。態様（２８）において、少なくとも１種類の光重合性モノマーが、ＨＥＭＡ、ＴＥＧＤＭＡ、グリセロールモノメタクリレートまたはグリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレートであることを特徴とする態様２７のポリマーが提供される。態様（２９）において、ポリマーが、官能化ペプチド、ＨＥＭＡおよびＴＥＧＤＡを含む混合物から形成されることを特徴とする態様２７または２８のポリマーが提供される。態様（３０）において、ポリマーが、官能化ペプチド、グリセロールモノメタクリレートおよびグリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレートを含む混合物から形成されることを特徴とする態様２７から２９いずれかのポリマーが提供される。
【００７８】
ある態様において、態様２７から３０いずれかのポリマーから形成された細胞培養表面上でヒト胚性幹細胞を培養する方法であって、細胞培養用培地内にあるヒト胚性幹細胞をポリマーに提供し、細胞をポリマー上で培養する各工程を有してなる方法が提供される。別の態様において、態様２７から３０いずれかのポリマーから形成された細胞培養表面上で神経前駆幹細胞を培養する方法であって、細胞培養用培地内にある神経前駆幹細胞をポリマーに提供し、細胞をポリマー上で培養する各工程を有してなる方法が提供される。
【００７９】
以下において、上述した物品および方法の様々な実施の形態について説明する非限定的実施例が提示される。
【実施例】
【００８０】
省略形： （ＢＳＰ−メタクリレート）、Ac-Lys(MAA)-Gly-Gly-Asn-Gly-Glu-Pro-Arg-Gly-Asp-Thr-Tyr-Arg-Ala-Tyr-NH2 または Ac-K-MAA-配列番号19-NH2；（ＶＮ−メタクリレート）、- Ac-Lys(MAA)-Gly-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2 または Ac-K-MAA-配列番号27-NH2；（ＭＡＡ−ＰＥＧ4−ＶＮ）、MAA-PEG4-Lys-Gly-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2 または MAA-PEG4-配列番号27；（ＢＳＰ−ＤＩＭＡＡ）、MAA-Lys-Gly-Gly-Asn-Gly-Glu-Pro-Arg-Gly-Asp-Thr-Tyr-Arg-Ala-Tyr-NH2-MAA または MAA-配列番号-MAA；（ＧＤＧＭＤＭＡ）−グリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレート；（ＧＭＭＡ）−グリセロールモノメタクリレート；ＴＥＧＤＭＡ−テトラエチレングリコールジメタクリレート；ＨＥＭＡ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート；ＥｔＯＨ−エタノール；Ｉ−８１９、Darocure 1173。
【００８１】
材料： アクリレートヒドロゲル配合物のフリーラジカル重合に使用した光開始剤であるIgracure-819（ホスフィンオキシド、フェニルビス（２，４，６−トリメチルベンゾイル））およびDarocur 1173（２−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニル−１−プロパン）をCiba Specialty Chemicals（デラウェア州、ニューポート所在）から得て、さらに精製せずに使用した。親水性架橋剤、テトラエチレングリコールジメタクリレート（８６６８０）、（４５４９８２）およびグリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレート（４７５８０７）の全てを、プロダクト仕様書に記載されているような純度でSigma-Aldrichから購入した。親水性モノマーの２−ヒドロキシエチルメタクリレート、＋９９％（４７７０２８）はSigma-Aldrichから購入し、一方で、配合物に使用した他の親水性モノマーのグリセロールモノメタクリレート異性体（０４１８０）は、さらに精製せずに、Polysciences Incorporatedから購入した。Ac-Lys(MAA)-Gly-Gly-Asn-Gly-Glu-Pro-Arg-Gly-Asp-Thr-Tyr-Arg-Ala-Tyr-NH2 (配列番号19), Ac-Lys(MAA)-Gly-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2 (SEQ ID NO:27), または (MAA-PEG4-VN), MAA-PEG4-Lys-Gly-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2 (配列番号27), Ac-Lys(MAA)-Gly-Gly-Asn-Gly-Glu-Pro-Arg-Gly-Asp-Thr-Tyr-Arg-Ala-Tyr-NH2 (配列番号19), MAA-Lys(MAA)-Gly-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2 (配列番号27), C[Arg-Gly-Asp-DTyr-Lys]-[MAA] (配列番号34) もしくは c(RGDyK)(配列番号34)は全て、カリフォルニア州、サニーベール所在のAmerican Peptide Corporationから購入し、以下のプロセスによって合成した：
官能化ペプチドの合成のための一般プロセス：
Ac-Lys(MAA)-Gly-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2 (配列番号27)の調製： このペプチドは、Ｆｍｏｃ成分により１５ミリモルのFmoc-Rinkアミド樹脂上で合成した。アミノ酸に使用した保護基は：ＡｓｐおよびＴｈｒについてはｔ−ブチル基、ＧｌｎについてはＴｒｔ基、ＡｒｇについてはＰｂｆ、ＬｙｓについてはＩｖｄｄｅ。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸は、EMD Biosciencesから購入した。カップリングおよび切断のための試薬は、Aldrichから購入した。溶媒は、Fisher Scientificから購入した。ペプチド鎖を、Ｆｍｏｃ保護基の反復除去および保護されたアミノ酸のカップリングにより、樹脂上に作製した。ＤＩＣおよびＨＯＢｔをカップリング剤として使用し、ＮＭＭを塩基として使用した。ＤＭＦ中２０％のピペリジンを脱−Ｆｍｏｃ化剤として使用した。ｌｖｄｄｅをＤＭＦ中２％のヒドラジンによって除去した後に、リシンの側鎖にメタクリル酸（ＭＡＡ）をカップリングさせた。最後のカップリング後、側鎖保護基の切断と除去のために、樹脂をＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ2Ｏ（９５：３：２、ｖ／ｖ／ｖ）で処理した。粗製ペプチドを冷たいエーテルから沈殿させ、濾過により収集した。収量３３．０グラム（合成収率１９４．２％）。１７ｇの粗製ペプチドを逆相ＨＰＬＣによって精製した；９０％超の純度の収集分画を貯留し、凍結乾燥させた。最終生成物の収量９．２５ｇ（精製収率５４．４％）。
【００８２】
（ＭＡＡ−ＰＥＧ4−ＶＮ）：MAA-PEG4-Lys-Gly-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2 （配列番号27）の調製： このペプチドは、Ｆｍｏｃ成分により１ミリモルのFmoc-Rinkアミド樹脂上で合成した。アミノ酸に使用した保護基は：ＡｓｐおよびＴｈｒについてはｔ−ブチル基、ＧｌｎについてはＴｒｔ基、ＡｒｇについてはＰｂｆ、ＬｙｓについてはＢｏｃ。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸は、EMD Biosciencesから購入した；Ｆｏｍｃ−ＰＥＧ4−ＯＨはQuanta BioDesignから購入した。カップリングおよび切断のための試薬は、Aldrichから購入した。溶媒は、Fisher Scientificから購入した。ペプチド鎖を、Ｆｍｏｃ保護基の反復除去および保護されたアミノ酸のカップリングにより、樹脂上に作製した。ＨＢＴＵおよびＨＯＢｔをカップリング剤として使用し、ＮＭＭを塩基として使用した。ＤＭＦ中２０％のピペリジンを脱−Ｆｍｏｃ化剤として使用した。Ｆｍｏｃ保護基の除去後に、ＰＥＧ4のアミノ基にメタクリル酸（ＭＡＡ）をカップリングさせた。最後のカップリング後、側鎖保護基の切断と除去のために、樹脂をＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ2Ｏ（９５：３：２、ｖ／ｖ／ｖ）で処理した。粗製ペプチドを冷たいエーテルから沈殿させ、濾過により収集した。収量４．０グラム（合成収率２１０．１％）。粗製ペプチドを逆相ＨＰＬＣによって精製した；９０％超の純度の収集分画を貯留し、凍結乾燥させた。最終生成物の収量１．０３５ｇ（精製収率２５．９％）。
【００８３】
生成物は、９０％以上の純度でAmerican Peptideにより提供され、さらに精製せずに使用した。エタノールは、プロセスにおいて非反応性希釈剤として使用し、Sigma-Aldrichから購入した。
【００８４】
官能化ペプチドポリマー配合物を調製するための一般手法：
別個の１０ｍｌのシンチレーション・バイアル中に、４００μＬの２−ヒドロキシエチルメタクリレートを加え、その後、４０μＬのテトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート、１５μＬのDarocure 1173（エタノール中１０％）、５０μＬのIrgacure 819（エタノール中１％）および９．５ｍｌのエタノールを加えた。この配合は、エタノール中１％の配合物になる。グリセロールモノメタクリレート異性体およびグリセロール１，３−ジグリセロールジメタクリレートを含むライブラリについて、それぞれ、４００μＬおよび４０μＬの同じ容量を使用した。Ac-Lys(MAA)-Gly-Gly-Asn-Gly-Glu-Pro-Arg-Gly-Asp-Thr-Tyr-Arg-Ala-Tyr-NH2 (MAA-配列番号19), Ac-Lys(MAA)-Gly-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2 (MAA-配列番号28)を加えて、表３，４および８において先に記載したモノマー配合物、１０ｍｌ当たり８．７４ｍｇ、６．５５ｍｇ、４．３７ｍｇ、２．１９ｍｇおよび０．８７ｍｇのペプチド勾配を作成した。一方で、表５および６に示されたそれぞれの配合物に、MAA-PEG4-Lys-Gly-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2 (MAA-PEG4-配列番号28)を４．３７ｍｇ、３．２８ｍｇ、２．１９ｍｇ、１．０９ｍｇおよび０．４３７ｍｇで加えた。Ac-Lys(MAA)-Gly-Gly-Asn-Gly-Glu-Pro-Arg-Gly-Asp-Thr-Tyr-Arg-Ala-Tyr-NH2-MAA (MAA-配列番号19)を２．０ｍｇ、１．５ｍｇ、１．０ｍｇおよび０．５ｍｇで加えたが、表７に見られるように、８．０ｍｇほどまで増加させても差し支えない。ＰＡ、ＰＢ、ＰＣ、ＰＤ、ＰＥおよびＰＦの表記は、ペプチドと混合された配合物を称する。数は、細胞応答を試験するために作成したペプチド勾配を称する。
【００８５】
環状官能化ペプチドポリマー配合物を調製するための一般手法：
１０ｍｌのシンチレーション・バイアル中に、８０μＬのグリセロールモノメタクリレートを８μＬのグリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレートと共に加えた。その後、１５μＬのDarocure 1173（エタノール中１０％）、５０μＬのIrgacure 819（エタノール中１％）および溶媒としての９．９２ｍｌのエタノールも加えた。この配合は、エタノール中１％の配合物になる。この配合物を、６ウェルプレートに被覆するために取って置いた。
【００８６】
８０μＬのグリセロールモノメタクリレートおよび３０μＬのテトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート、並びに３０μＬのDarocure 1173（エタノール中１０％）、２０μＬのIrgacure 819（エタノール中１％）および溶媒としての９．９２ｍｌのエタノールを含有する、別のヒドロゲル配合物のＨＥＭＡ／ＴＥＧＤＭＡ／環状ペプチド表面を、スクリーニングのために調製した。１ｍｇの官能化環状ペプチド(c(RGDyK-MAA)(配列番号34))を、１０μＬの増加量で４０μＬの18 Mega OHM水中に溶解させた。合計で１ｍｌの１ｍＭのペプチド濃度溶液となるように、溶解したペプチドに９６０μＬのアクリレートヒドロゲルを加えた。
【００８７】
３ｍｌのシンチレーション・バイアル中に、１ｍｇの官能化環状ペプチドのc(RGDyK-MAA)(配列番号34)または１．７ｍｇの官能化環状ペプチドのc(RGDyK-MAA)(配列番号34)いずれかを使用した。乾燥ペプチドに、８０μＬの18 Mega OHM水を２０μＬの増加量で、ペプチドが溶解するまで加えた。溶解したペプチドに、１９２０μＬのアクリレートヒドロゲル（グリセロールモノメタクリレート＋１，３−ジグリセロレートジメタクリレートまたはＨＥＭＡ＋ＴＥＧＤＭＡいずれか）を、合計で２ｍｌの０．５ｍＭのペプチド濃度溶液となるように加えた。
【００８８】
６ウェルプレート中のペプチド−ポリマー配合物の被覆のための一般手法：
Ｃｅｌｌｂｉｎｄ（登録商標）（ニューヨーク州、コーニング所在のCorning Incorporated）処理したポリスチレン製６ウェルプレート（６−ｗｐ）を包装から取り出し、連続的に窒素ガスでパージした大型の窒素パージボックス内に入れた。パージボックス内の湿度レベルは、配合物の分配前に３０％未満であった。半自動ピペッターを使用して、各ウェル中に２６μＬを分配した。配合物をウェル表面に広げた後、硬化前に、５分間に亘り２５から３０ｉｎ Ｈｇの真空乾燥器内で溶媒のエタノールを除去した。
【００８９】
ペプチド−ポリマー被覆をＵＶ硬化するための手法
INPRO Technologies, Inc.からの「Xenon Model RC-801高強度パルス化紫外線（ＵＶ）硬化システム」を硬化に使用した。硬化中に不活性雰囲気（被覆のための）を生成するために、プレートは窒素で常にパージされていた。硬化時間を設定した（すなわち、この研究において６０秒間）。
【００９０】
ペプチド−ポリマー被覆プレートの洗浄のための手法：
ペプチド−アクリレート比較のＵＶ硬化後、１〜５ｍｌのエタノールをプレートのウェル中に分配し、振盪器に配置して、どのような残留モノマーも除去するために、３０〜６０分間に亘り撹拌した。６ウェルプレートを18 Mega OHM水で５回濯ぎ、次いで、一晩乾燥させ、細胞試験のために提出した。
【００９１】
ヒト胚性幹細胞を培養するための手法：
Ｈ７ｈＥＳ細胞がGeron Corporationとの提携契約の一部として提供され、これをそのプロトコルにしたがって培養した。手短に言うと、細胞を、ＭＧ−被覆ＴＣＴフラスコ内の既知組成培地（Ｘ−Ｖｉｖｏ−１０、８０ｎｇ／ｍｌのｈｂＦＧＦ、５ｎｇ／ｍｌのｈＴＧＦ−β１）中で培養した。Geronの継代培養手法を使用して、細胞を、１０×１０6細胞／Ｔ７５フラスコの播種密度で４〜５日毎に継代培養した。実験に関して、細胞を既知組成培地中で１×１０6／ウェルの密度で６ウェルプレート内に播種した。細胞形態を毎日観察した。細胞数、コロニー形態、および分布の目視評価のために、４日目に細胞をクリスタル・バイオレットで染色した。
【００９２】
神経前駆幹細胞を培養するための手法：
Millipore（カリフォルニア州、テメキュラ所在）からのＲｅＮｃｅｌｌ ＶＭ細胞を、ラミニン被覆Ｔ７５ｃｍ２組織培養フラスコ（ニューヨーク州、コーニング）上で、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２および２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（カリフォルニア州、テメキュラ所在のmillipore）を含有するＲｅＮｃｅｌｌ ＮＳＣ維持培地（カリフォルニア州、テメキュラ所在のmillipore）中において規定通りに伸長させた。未分化細胞の維持と増殖のために、培地を一日おきに替えた。培養中の全ての細胞は、９５％空気／５％ＣＯ2の湿潤雰囲気内において３７℃に維持した。細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（カリフォルニア州、テメキュラ所在のmillipore）を使用して週に一度継代培養した。
【００９３】
未分化神経前駆幹細胞は、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２および２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含有するＲｅＮｃｅｌｌ ＮＳＣ維持培地中、ウェル当たり１５００００細胞で６ウェルプレート内に播種した。播種から２４時間後、細胞付着および細胞形態を、Ｚｉｅｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ倒立顕微鏡を使用して評価した。４日間に亘り各表面で細胞を増殖させた。播種から２日目と３日目に、細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ処理によって表面から分離させ、計数した。倍増時間を、増殖曲線の対数期で計算した（以前は、播種後２日目と３日目の間で推測された）。ラミニン被覆ＴＣＴマイクロプレートを、神経前駆幹細胞増殖に関する陽性対照として使用した。神経前駆幹細胞を、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２および２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含有するＲｅＮｃｅｌｌ ＮＳＣ維持培地中、ウェル当たり２５００００細胞で６ウェルプレート内に播種し、９５％空気／５％ＣＯ2のにおいて３７℃で培養した。翌日、各ウェルから培地を除去し、ＦＧＦ−２およびＥＧＦを含有しない新しいＲｅＮｃｅｌｌ ＮＳＣ維持培地と交換することによって、分化を開始した。培地を１０日間に亘り２〜３日毎にＲｅＮｃｅｌｌ ＮＳＣ維持培地と交換した。
【００９４】
図４および５は、本発明のペプチド−ポリマー細胞培養表面の実施の形態と比べた、対照表面Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）およびＳｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）上で培養したＨ７ヒト胚性幹細胞の顕微鏡写真を示している。ペプチド−ポリマーは、培養の４日後に対照表面に見られたものに近い、ヒト幹細胞の増殖および形態を示した。
【００９５】
図６Ａ〜Ｈは、Corning Incorporatedからのｌａｍｉｎｉｎ（商標）表面上（図６ＡおよびＥ）、ＨＥＭＡおよびＴＥＧＤＭＡにより製造された環状官能化ＲＧＤペプチド表面上（図６ＢおよびＦ）、グリセロールメタクリレートおよび１，３−ジグリセロレートジメタクリレートにより製造された環状官能化ＲＧＤペプチド（環状配列番号34）表面上（図６ＣおよびＧ）、並びにCorning IncorporatedからのＳｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）上（図６ＤおよびＨ）で増殖した、培養の１日後（図６Ａ〜Ｄ）および培養の３日後（図６Ｅ〜Ｈ）の神経前駆細胞の顕微鏡写真を示している。
【００９６】
それゆえ、ペプチド−ポリマー細胞培養物品およびその製造方法に実施の形態が開示されている。ここに記載されたアレイ、組成物、キット、物品および方法は、開示されたものとは違う実施の形態により実施できることが当業者には認識されるであろう。開示された実施の形態は、制限ではなく、説明の目的で提示されている。
【先願の米国特許出願の恩恵の主張】
【０００１】
本出願は、２００９年７月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／２２９６１５号の恩恵を主張するものである。この書類の内容およびここに述べられた刊行物、特許および特許文献の全開示が、ここに引用される。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、ペプチド−ポリマー細胞培養表面と物品、および官能化細胞結合ペプチドの合成モノマーとの重合によるペプチド−ポリマー細胞培養物品を調製する方法に関する。より詳しくは、本開示は、既知組成培地中の未分化幹細胞を含む、細胞の培養を支持するための、細胞結合ペプチドを有する合成表面および物品に関する。
【０００３】
配列表
本出願は、２０１０年７月２２日に作成された、８ｋｂのサイズを有する「2010722_SP09-244_ST25.txt」という名前のテキスト・ファイルとして、米国特許商標庁にＥＦＳ−Ｗｅｂを通じて電子的に提出された配列表を含む。配列表の電子出願のために、電子的に提出された配列表は、米国特許法施行規則第１．８２１条（ｃ）により要求されるハードコピーおよび第１．８２１条（ｅ）により要求されるコンピュータ読み取り可能な形態（ＣＲＦ）の両方として働く。この配列表に含まれる情報がここに引用される。
【背景技術】
【０００４】
疾病の治療のためにヒトに導入される細胞である治療用細胞が開発されている。治療用細胞の例としては、３種の胚葉のいずれにも分化し、人体のどの成人細胞タイプも生じる能力を有するヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）などの多能性(pluripotent)幹細胞が挙げられる。幹細胞のこの性質のために、糖尿病、脊髄損傷、心臓病などの数多くの重い細胞変性疾患のための新たな治療法を開発する可能性が与えられる。しかしながら、そのような治療用細胞に基づく治療の開発にはいくつか障害がある。細胞と組織の培養において適切な数の治療用細胞を得て維持すること、並びにこれらの細胞が細胞培養中に望ましくないように変化しないように確実にすることが、治療用細胞の培養を開発し制御する上で重要である。例えば、ｈＥＳＣの細胞培養などの幹細胞培養は、典型的に、細胞銀行または細胞株からの小数の細胞が播種され、次いで、所望の治療用途にとって分化が望ましくなるまで、未分化状態で増幅させられる。これを行うために、ｈＥＳＣまたはそれらの分化細胞は、現在、支持細胞層、血清、またはニュージャージー州、フランクリン・レイクス所在のBDから入手できるＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）などの動物由来成分を含有する表面または培地の存在下で培養されている。培養環境へのこれらの動物由来添加物のために、細胞が、患者に移り得るまたはｈＥＳＣの一般的な培養および維持を損ない得る潜在的に有害なウイルスまたは他の病原菌に曝露される。その上、そのような生物学的製剤は、バッチのばらつき、免疫応答および限られた貯蔵寿命を被りやすい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の実施の形態において、官能化ペプチドモノマーであって、ペプチドが、（メタ）アクリレート部分などの重合部分を含有するように官能化されているペプチドモノマーが開示されている。実施の形態において、官能化ペプチドモノマーは、式：Am - Sy - Xaan - Sy1 - Z - Sy2 - Am1により記載することができ、ここで、Ａは重合部分であり、ｍは１から６までの整数であり、ｍ１は１から６までの整数であり、Ｘａａnは独立して任意のアミノ酸であり、ｎは０から２０までの整数であり、Ｓはスペーサであり、ｙは０から３０までの整数であり、ｙ１は０から３０までの整数であり、ｙ２は０から３０までの整数であり、Ｚは細胞接着性ペプチドである。
【０００６】
ある実施の形態において、細胞接着性ペプチドは、細胞接着性ペプチドであってよく、ＲＧＤ配列、例えば、KGGGQKCIVQTTSWSQCSKS (配列番号1); GGGQKCIVQTTSWSQCSKS(配列番号2); KYGLALERKDHSG (配列番号3); YGLALERKDHSG (配列番号4); KGGSINNNRWHSIYITRFGNMGS (配列番号5); GGSINNNRWHSIYITRFGNMGS (配列番号6); KGGTWYKIAFQRNRK (配列番号7); GGTWYKIAFQRNRK (配列番号8); KGGTSIKIRGTYSER (配列番号9); GGTSIKIRGTYSER (配列番号10); KYGTDIRVTLNRLNTF (配列番号11); YGTDIRVTLNRLNTF (配列番号12); KYGSETTVKYIFRLHE (配列番号13); YGSETTVKYIFRLHE(配列番号14); KYGKAFDITYVRLKF (配列番号15); YGKAFDITYVRLKF(配列番号16); KYGAASIKVAVSADR (配列番号17); YGAASIKVAVSADR(配列番号18); KGGNGEPRGDTYRAY(配列番号19); GGNGEPRGDTYRAY (配列番号20) CGGNGEPRGDTYRAY (配列番号21); GGNGEPRGDTRAY (配列番号22); KYGRKRLQVQLSIRT (配列番号23); YGRKRLQVQLSIRT(配列番号24); KGGRNIAEIIKDI (配列番号25); GGRNIAEIIKDI (配列番号26); KGGPQVTRGDVFTMP (配列番号27); GGPQVTRGDVFTMP(配列番号28); GGPQVTRGDVFTMPK (配列番号29); GRGDSPK (配列番号30); KGGAVTGRGDSPASS(配列番号31); GGAVTGRGDSPASS (配列番号32); YaalPQVTRGNVFTMP (配列番号33); 環状であってもよいRGDYK (配列番号34)、またはそれらの組合せを有する細胞接着性ペプチドであってよい。
【０００７】
実施の形態において、官能化ペプチドモノマーの接着性ペプチドは、KGGPQVTRGDVFTMP (配列番号27) または GGPQVTRGDVFTMP (配列番号28), GGNGEPRGDTYRAY (配列番号18) またはKGGNGEPRGDTYRAY (配列番号19)を含む。実施の形態において、光重合性部分は、アクリレートまたはメタクリレート、例えば、メタクリル酸を含む。実施の形態において、スペーサは、例えば、ＰＥＧ4であってよい、ポリエチレンオキシドである。
【０００８】
追加の実施の形態において、本発明は、細胞培養表面を製造する方法であって、官能化ペプチドモノマーおよび少なくとも１種類の（メタ）アクリレートモノマーの混合物を提供し、この混合物を細胞培養基体に施し、モノマーを重合させて、ペプチド−ポリマーを形成する各工程を有してなる方法を提供する。実施の形態において、（メタ）アクリレートモノマーは、ＨＥＭＡ、ＴＥＧＤＭＡ、グリセロールモノメタクリレートまたはグリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレートまたはそれらの組合せを含む。実施の形態において、メタクリレートモノマーは、ＨＥＭＡおよびＴＥＧＤＡの組合せを含む。
【０００９】
本発明の追加の実施の形態において、前記ペプチド−ポリマー培養表面上において既知組成培地中で未分化のヒト胚性幹細胞の単離個体群を培養する方法が記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施の形態による細胞培養表面を製造する方法の実施の形態を示す流れ図
【図２】細胞培養表面の実施の形態を製造する方法を示す説明図
【図３】細胞培養表面上に分布した蛍光標識ペプチドポリマーの蛍光強度を示す図
【図４】Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＭＧ、図４Ａ）、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）（図４Ｂ）対照表面および本発明の官能化ペプチドグラフト化表面の実施の形態上で培養したＨ７ヒト胚性幹細胞の顕微鏡写真
【図５】Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＭＧ、図５Ａ）、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）（図５Ｂ）対照表面、および官能化ペプチドグラフト化表面の２つの実施の形態（（Ｃ，Ｄ）および（Ｅ，Ｆ））上で培養したＨ７クリスタル・バイオレット染色ヒト胚性幹細胞の顕微鏡写真。図５ＣおよびＤは同じ条件を示す。図５ＥおよびＦは同じ条件を示す。
【図６】Corning Incorporatedからのｌａｍｉｎｉｎ（商標）表面（図６ＡおよびＥ）、ＨＥＭＡおよびＴＥＧＤＭＡにより製造された環状官能化ＲＧＤペプチド表面（図６ＢおよびＦ）、グリセロールメタクリレートにより製造された環状官能化ＲＧＤペプチド表面（図６ＣおよびＧ）、およびCorning IncorporatedからのＳｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）表面（図６ＤおよびＨ）上で増殖した神経前駆細胞の顕微鏡写真
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の実施の形態において、官能化ペプチドモノマーであって、ペプチドが、（メタ）アクリレート部分などの重合部分を含有するように官能化されているペプチドモノマーが開示されている。実施の形態において、官能化ペプチドモノマーは、式：Am - Sy - Xaan - Sy1 - Z - Sy2 - Am1により記載することができ、ここで、Ａは重合部分であり、ｍは１から６までの整数であり、ｍ１は０から６までの整数であり、Ｘａａnは独立して任意のアミノ酸であり、ｎは０から６までの整数であり、Ｓはスペーサであり、ｙは０から３０までの整数であり、ｙ１は０から３０までの整数であり、ｙ２は０から３０までの整数であり、Ｚは細胞接着性ペプチドである。実施の形態において、この官能化ペプチドモノマーを使用して、高分子細胞培養表面を形成する方法、およびそのように製造された高分子細胞培養表面を使用する方法も開示されている。実施の形態において、重合部分は、ペプチドのカルボキシル末端およびアミノ末端の両方にまたはその近くに存在する。
【００１２】
細胞培養の分野において、細胞を測定可能な様式で培養するには、病原体を含まず、比較的安価であり、安定であり、信頼性があり、培地中の細胞の長期培養を支持する表面が必要である。このことは、治療用細胞を提供することを目的とする細胞培養、すなわち、疾患の治療のためにヒトに導入される、または再導入される細胞を提供することを目的とする細胞培養に特に当てはまる。細胞培養に関する現行の技術は、マウス腫瘍抽出物由来の、ニュージャージー州、フランクリン・レイクス所在のBDから入手できるＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）などの動物産物由来の表面を含むが、これらの表面は、治療に使用される細胞の支持体には望ましくない。
【００１３】
本発明の実施の形態は、アクリレートまたはメタクリレート官能化細胞接着性ペプチドの親水性アクリレートまたはメタクリレートモノマーおよび架橋剤とのフリーラジカル重合によって調製されたペプチド模倣細胞培養表面または被覆を提供する。実施の形態において、測定可能であり、加工が容易であり、対費用効果的であり、Ｔ−７５フラスコおよびＴ−２２５フラスコなどのより大きい表面積で治療上の価値のためにヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）などの培養が難しい細胞の成長および増殖を促進させられるペプチド模倣表面を形成する方法も提供される。実施の形態において、本発明は、ペプチド模倣表面を製造するための、容易で、対費用効果的であり、製造に調和する(manufacturing friendly)プロセスを提供する。実施の形態において、これらの表面は、接着性ペプチドに化学的に結合しており、治療用途に要求される細胞量を産生するための熱可塑性表面の大きなフットプリントに被覆できる、ゆるく架橋した親水性高分子表面である。
【００１４】
以下の詳細な説明において、その一部を構成し、デバイス、システムおよび方法のいくつかの特定の実施の形態が実例として示されている、添付の図面を参照する。他の実施の形態も考えられ、本開示の範囲または精神から逸脱せずに実施してよいことが理解されよう。したがって、以下の詳細な説明は、制限の意味で解釈すべきではない。
【００１５】
ここに使用した全ての科学用語および技術用語は、他に別記しない限り、当該技術分野で一般に使用されている意味を有する。ここに与えられる定義は、ここに頻繁に使用されている特定の用語の理解を容易にするためであり、本開示の範囲を制限することを意味するものではない。
【００１６】
本明細書および添付の特許請求の範囲に用いられるように、文脈がそうではないと明白に示していない限り、単数形は、複数の対象を有する実施の形態を包含する。本明細書および添付の特許請求の範囲に用いられるように、文脈がそうではないと明白に示していない限り、「または」という用語は、「および／または」を含む意味で一般に使用されている。
【００１７】
ここに用いたように、「有する(have)」、「有している(having)」「含む(include)」、「含んでいる(including)」、「含む(comprise)」、「含んでいる(comprising)」などは、限定を設定しない意味で使用されており、一般に、「含んでいるが、それに制限されない」ことを意味する。例えば、合成または組換えタンパク質またはペプチドを組み込んだ表面を含む合成細胞培養表面は、疾病の治療のためにヒトに導入される細胞を支持するのに適している。合成ペプチドおよびタンパク質は、多くの場合、ＲＧＤなどの細胞接着配列を含む。実施の形態において、細胞接着配列は、細胞外基質起源のインテグリン結合配列であってよい。
【００１８】
ＲＧＤ配列を含むいくつかの例示の合成ペプチドおよびタンパク質は、ラミニン、ビトロネクチン、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）などのタンパク質から特定されてきた。これらの配列のいくつかが表１に示されている。培地中の生存細胞を支持するのに要求されるペプチドの量を減少させる合成表面が望ましい。何故ならば、ペプチドは高価であり、それゆえ、ペプチドをそれほど必要としない表面は安上がりであるからである。その上、製造が容易であり、貯蔵安定性であり、滅菌手法を通じて安定であり、水性細胞培養条件への長期の曝露を通じて安定である合成表面も望ましい。
【００１９】
実施の形態において、官能化ペプチドは以下の式（式１）：
式１： Am - Sy - Xaan - Sy1 - Z - Sy2 - Am1
を有する。
【００２０】
実施の形態において、少なくとも２つの重合性部分（Ａ）を担持するように修飾または官能化されたペプチドまたはポリペプチド（Ｚ）が提供され、ここで、Ａは、例えば、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、マレイミドまたはフマレートを含む、α、β不飽和基またはエチレン不飽和基であり、そのような重合性基の１つが、官能化ペプチドのカルボキシル末端とアミノ末端の各末端にまたはその近くにある。本開示の目的に関して、「にまたはその近くに(at or near)」は、重合性部分（Ａ）が、ペプチド配列に隣接しているか、または１つ以上のスペーサによりペプチド配列から隔てられていてよく、ここで、スペーサはポリエチレンオキシドスペーサまたはアミノ酸スペーサまたはそれらの組合せであってよいことを意味する。本開示の目的に関して、「官能化ペプチド」は、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、マレイミドまたはフマレート基などの、少なくとも２つ重合部分または重合性部分、および必要に応じて、スペーサ（Ｓ）および／または追加のアミノ酸配列（Ｘａａ）を組み込むように修飾されたペプチドを意味する。エポキシド官能基が、重合性部分であってもよい。
【００２１】
実施の形態において、これらの重合部分は、エネルギー源に曝露された際にポリマーを形成できる。実施の形態において、光重合部分が、アミノ酸の側鎖を通じて官能化ペプチドに結合されている。例えば、メタクリレート、アクリルアミド、およびマレイミド部分が、リシンアミノ酸（Ｘａａ−ＭＡＡ、ここで、Ｘａａはリシンであり、ＭＡＡはメタクリル酸である）の側鎖に結合されていてよいが、官能化ペプチドを形成するために、任意の他のカルボキシル官能化アクリレート、メタクリレートおよびアクリルアミドであって差し支えない。重合部分は、細胞接着性ペプチドにおける、またはＸａａn基における、アミノ酸の側鎖に結合されていてもよい。
【００２２】
Ａが独立して重合部分である、式１に示されるように、ｍは、実施の形態において、１から６までの整数であり、ｍ１は１から６までの整数である。実施の形態において、官能化ペプチドは、必要に応じて、スペーサを含んでもよい。実施の形態において、重合部分（ＡmおよびＡm1）は、アミノ酸（例えば、ＫまたはＲ）の側鎖に結合されていてもよく、もしくはアミノ酸またはペプチドのＮ末端に結合されていてもよい。重合部分は、ポリエチレンオキシドを通じて、リシンなどのアミノ酸の側鎖を通じて、またはアミノ酸のＮ末端で、スペーサＳpに付着している。
【００２３】
実施の形態において、（Ｓy、Ｓy1およびＳy2）は、例えば、式（Ｏ−ＣＨ2ＣＨＲ’）m2により表され、Ｒ’がＨまたはＣＨ3であり、ｍ２が０から２０までの整数である、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含む、ポリアルキレンオキシドであってよい。実施の形態において、ポリアルキレンオキシドの比較的短い鎖が望ましい。例えば、実施の形態において、ｙ、ｙ１およびｙ２は、ＰＥＧ2、ＰＥＧ4、ＰＥＧ6、ＰＥＧ8、ＰＥＧ10、ＰＥＧ12もしくはＰＰＧ2、ＰＰＧ4、ＰＰＧ6、ＰＰＧ8、ＰＰＧ10、ＰＰＧ12またはＰＰＧ20であってよい。実施の形態において、スペーサは、２０以下の反復単位を有するポリエチレンオキシド（すなわち、ＰＥＧ4、ＰＥＧ6、ＰＥＧ8、ＰＥＧ10、ＰＥＧ12、ＰＥＧ14、ＰＥＧ16、ＰＥＧ18またはＰＥＧ20）である。
【００２４】
実施の形態において、Ｓy、Ｓy1および／またはＳy2は、官能基を有するＰＰＧまたはＰＥＧである。例えば、ＰＥＧまたはＰＰＧスペーサは、マレイミド、チオール、アミン、シラン、アルデヒド、エポキシド、イソシアネート、アクリレートまたはカルボキシル基を有してもよい。実施の形態において、ＰＥＧスペーサは、アミン官能基を有するＰＥＧであるＪＥＦＦＡＭＩＮＥ（登録商標）である。追加の実施の形態において、ＰＥＧまたはＰＰＧは分岐していてもよい。例えば、分岐ＰＥＧまたはＰＰＧは、Ｙ型分岐または星型ＰＥＧまたはＰＰＧであってよい。実施の形態において、これらの分岐ＰＥＧまたはＰＰＧスペーサは、多数のペプチドを、１つの官能化ペプチドを通じて基材に結合することが可能になるであろう。
【００２５】
Ｘａａは、独立して、存在してもしなくてもよい任意のアミノ酸、もしくは３０までのアミノ酸（ｎが０から３０までの整数である場合）、２０までのアミノ酸（ｎが０から２０までの整数である場合）、１０までのアミノ酸（ｎが０から１０までの整数である場合）、６までのアミノ酸（ｎが０から６までの整数である場合）、または３までのアミノ酸（ｎが０から３までの整数である場合）の基である。実施の形態において、Ｘａａアミノ酸は、光重合性基と結合できるリシンアミノ酸を含有する。実施の形態において、Ｘａａアミノ酸配列は、例えば、LysGlyGly または LysTyrGlyなどの配列であってよい。「独立して」という用語は、各ａａが別のアミノ酸と異なってもよいことを示すようにここに使用される。実施の形態において、Ｘａａはアセチル化されている。アミノ酸Ｘａａnは、それを分解から保護するためにアセチル化および／またはアミド化されていてもよい。実施の形態において、Ｘａａは親水性アミノ酸であってよい。例えば、Ｘａａnは、リシン、グリシン、グルタミン酸、セリン、アスパラギン酸またはアルギニンアミノ酸であってよく、これらは末端アミノ酸であってもよい。例えば、実施の形態において、Ｘａａnは、ＸａａがＧであり、ｎ＝１から２０であるアミノ酸Ｘａａnであってよく、またはＸａａnは、ＸａａがＫであり、ｎ＝１から２０、またはＸａａがＫであり、ｎが１以上であるアミノ酸であってよく、Ｘａａnは、ＸａａがＤであり、ｎ＝１から２０であるアミノ酸Ｘａａnであってよく、またはＸａａnは、ＸａａがＥであり、ｎ＝１から２０であるアミノ酸Ｘａａnであってよい。例えば、官能化ペプチドは、イプシロンリシン側鎖から生じた一連のリシンスペーサ長までのMAA-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-VN-ペプチド (リシンアルファ末端へのＮ末端付着) または Ac-(Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-MAA)-VN-ペプチド (メタクリレート結合) であってよい。ＭＡＡは、スペーサ長のＮ末端に付着していて差し支えなく、またはリシン側鎖に形成されても差し支えない。実施の形態において、Ｘａａnは、LysGlyGly または LysTyrGlyなどの３つのアミノ酸配列であってよい。実施の形態において、Ｘａａnは、一連の同じアミノ酸である。Ｘａａnは、リシン、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンアミノ酸などの親水性アミノ酸であってよい。実施の形態において、Ｘａａnは、末端リシンまたはアルギニンを有してよい。
【００２６】
ペプチドＺは細胞接着性ペプチドであってよい。本開示の目的に関して、細胞接着性ペプチドは、細胞培養における表面、もしくはインビボの他の細胞または細胞外基質のいずれかに対する細胞結合を向上させることが公知のまたは後に特定される配列を含有するアミノ酸配列である、ペプチドまたはポリペプチド（これらの用語は相互に交換可能である）である。そのようなペプチドはＲＧＤ配列を含有してもよい。その上、ペプチドは、安定性を提供し、小さなアミノ酸配列が切断されるのを防ぐためにアセチル化またはアミド化されていてもよい。本開示の目的に関して、ペプチドまたはポリペプチドは、化学的に合成される、または組換え方法により作製されるアミノ酸配列である。しかしながら、本開示の目的に関して、ペプチドまたはポリペプチドは、タンパク質の断片であって、完全なタンパク質ではない。その上、実施の形態において、ペプチドまたはポリペプチドは、動物源から単離されない。実施の形態において、ペプチドまたはポリペプチドは、１が０から３までの整数であり、Ｙａａが任意のアミノ酸であっても、または例えば、リシンであってもよい、ビトロネクチンペプチド配列である、YaalProGlnValThrArgGlyAspValPheThrMetPro (配列番号33)のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２７】
実施の形態に使用してよいペプチド（Ｚ）の例が表１に列記されている。しかしながら、どのような適切なペプチド配列を使用してもよい。
【表１−１】
【表１−２】
【００２８】
本開示の目的に関して、「環状官能化ペプチド」は、重合部分と、必要に応じて、低分子量ポリアルキレングリコール部分またはアミノ酸配列の形態にあるスペーサとを含むように修飾もされている環状ペプチド配列を意味する。環状官能化ペプチドの例は、例えば、RGDYK(配列番号34)であり、これは、環状形態にあり、c(RGDyK)(配列番号34)と書くことができ、この環状ペプチドは、以下の式（式２）に示される：
式２：
【００２９】
本開示の目的に関して、「環状官能化ペプチド」は、以下の式（式３）にしたがって示すことができる：
式３： Zc- Sy - Xaan-Am
実施の形態において、式３によれば、Ｚcは環状ペプチドであり、Ｓy、ＸａａnおよびＡmは先に定義されている。例えば、官能化ペプチドは、式２に示された式の環状形態にある配列RGDYK (配列番号34)を有する環状官能化ペプチドであってよく、ここで、Ａは、リシン側鎖を通じてリシン（Ｋ）アミノ酸に付着したメタクリレート部分であり、ｍ＝１、ｙ＝０およびｎ＝０である。
【００３０】
これらの環状官能化ペプチドは、必要に応じて、ペプチドと重合部分との間にスペーサ部分を有してもよい。スペーサ（Ｓy）は、例えば、ｙ＝０から２０である反復単位を有するポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）であってよい。
【００３１】
環状官能化ペプチドの実施の形態において、Ｓyは、例えば、式(O-CH2CHR’)m2により表されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含むポリアルキレンオキシドであってよく、ここで、Ｒ’はＨまたはＣＨ3であり、ｍ２は０から２０までの整数である。実施の形態において、比較的短い鎖のポリアルキレンオキシドが望ましい。例えば、実施の形態において、Ｓyは、ＰＥＧ2、ＰＥＧ4、ＰＥＧ6、ＰＥＧ8、ＰＥＧ10、ＰＥＧ12もしくはＰＰＧ2、ＰＰＧ4、ＰＰＧ6、ＰＰＧ8、ＰＰＧ10、ＰＰＧ12またはＰＰＧ20であってよい。もしくは、実施の形態において、スペーサＳは、ポリエチレンオキシドスペーサおよびアミノ酸スペーサをどのような組合せで含んでもよい。実施の形態において、Ｓは、パルミチン酸、ステアリン酸、ラウリン酸またはヘキサエチレンジアミンなどの疎水性スペーサであってもよい。実施の形態において、Ｓは、メタクリル酸カルボキシエチルであってよい。
【００３２】
他には、細胞培養表面の調製のために、タンパク質またはペプチドで化学修飾された（メタ）アクリル酸誘導体の使用が開示された（米国特許第５６４３５６１号明細書、以下’５６１特許）。’５６１特許において、ペプチド配列と重合部分との間にスペーサを使用することは開示されていない。他には、細胞接着性ペプチド配列および重合部分と組み合わされた長鎖ＰＥＧスペーサの使用が開示された。例えば、Hern, D.L., and Hubbell, J.A., Incorporation of Adhesion Peptides into Nonadhesive Hydrogels Useful for Tissue Resurfacing, Journal of Biomedical Materials Research Part A Vol. 39, Issue 2, pp. 266-276 (Hern & Hubbell)には、重合部分に結合した細胞接着性ペプチドの使用と、主にＰＥＧからなるヒドロゲル細胞培養表面を形成するためにＰＥＧジアクリレートと組み合わされた（ＰＥＧジアクリレートと共重合された）長鎖ポリアルキレンオキシドスペーサ（ＰＥＧ７５）を介して重合部分に結合した細胞接着性ペプチドの使用が開示されている。しかしながら、HernおよびHubbellは、重合部分に直接結合した細胞接着性ペプチドの使用により、提供された細胞結合タンパク質配列への細胞の特異的結合を支持しない細胞培養表面が生成されたことを開示している。すなわち、ＰＥＧスペーサアームのない結合を通じて含まれたペプチドを含有するヒドロゲル上で播種された細胞は、非特異的に、すなわち、血清タンパク質を要求する様式で、接着し、提供されたペプチドの正確な正体に依存しなかった。HernおよびHubbellによれば、このことは望ましくなかった。主にＰＥＧのヒドロゲル高分子材料と組み合われた長鎖ＰＥＧ（分子量３４００のＰＥＧ）の使用は、特異的細胞結合を支持した。HernおよびHubbellは、Ｒ’がＨまたはＣＨ3であり、ｍ２が０から２０までの整数である(O-CH2CHR’)m2などの短鎖ＰＥＧスペーサの使用に関しては、言及していない。その上、HernおよびHubbellの開示は、主にＰＥＧからなる表面に関する（ｍが２から８までの整数であり、ｎが１００超、好ましくは２０００の整数である（５段、６４行から６段、２行まで）、式((CH2)m-O)n）の二官能性ＰＥＧの使用を開示している米国特許第７６１５５９３号明細書も参照のこと）。
【００３３】
ここに開示された表面は、実施の形態において、官能化ペプチドが結合される、グリセロールメタクリレートおよび／またはＨＥＭＡ親水性ベース基体を有する。ＨＥＭＡおよびグリセロールメタクリレートは、ＰＥＧと比べて、異なる細胞培養特徴を有する。ＰＥＧは非結合表面である。すなわち、タンパク質はＰＥＧに吸着されず、細胞はＰＥＧ表面に結合しない。ＰＥＧは、一般に、２０度未満の接触角を有する。ＨＥＭＡおよびグリセロールメタクリレートは、ＰＥＧほど非結合性ではなく、ここに開示された実施の形態にしたがって調製された表面は、３６度と５６度の間の接触角を有する。理論により拘束することを意図するものではないが、組成全体におけるこれらの差により、ここに開示された官能化ペプチドが、特異的細胞結合特徴を有する機能性細胞培養表面を提供できるであろう。ここで、ＰＥＧスペーサを持たないペプチドを有する主にＰＥＧの表面は、HernおよびHubbellに開示されたような適切な細胞培養表面を提供しなかった。
【００３４】
その上、ペプチドのカルボキシル末端とアミノ末端両方にまたはその近くに重合性部分（ポリペプチドに固有のアミノ部分以外の）の存在は開示されていない。官能化ペプチドまたはポリペプチドは、どのような密度で、好ましくは細胞の培養を支持するのに適切な密度で、基体に提供してもよい。官能化ペプチドは、実施の形態において被覆された基体の表面積により推測できるポリマー−ペプチド基質上とのその中でｍｍ2当たり約２ピコモルから５０ピコモルのペプチド密度を与える約０．２５ｍＭから２．０ｍＭの濃度で基体に提供してもよい。例えば、官能化ペプチドは、ポリマー−ペプチドのゆるく架橋した網目構造内で、０．２５ピコモル／ｍｍ2超、０．５ピコモル／ｍｍ2超、１ピコモル／ｍｍ2超、５ピコモル／ｍｍ2超、６ピコモル／ｍｍ2超、７ピコモル／ｍｍ2超、８ピコモル／ｍｍ2超、９ピコモル／ｍｍ2超、１０ピコモル／ｍｍ2超、１２ピコモル／ｍｍ2超、１５ピコモル／ｍｍ2超、２０ピコモル／ｍｍ2超、４０ピコモル／ｍｍ2超の密度で存在してよい。存在するペプチドの量は、ポリマー−ペプチド層の組成、ポリマー−ペプチド層の厚さ、およびポリペプチド自体の性質に応じて、様々であり得ることが理解されよう。実施例において以下に論じられるように、より高い密度のペプチドが、既知組成培地における未分化幹細胞の付着および増殖をよりよく支持することができるであろう。
【００３５】
本発明の官能化ペプチドの実施の形態が表２に記載されている。
【表２】
【００３６】
本発明の実施の形態において、光重合性部分を含有するポリペプチドである、官能化ポリペプチドを含むモノマーの組合せが基体上に提供され、モノマーと官能化ポリペプチドの組合せはその場で重合される。本発明の実施の形態は、未分化状態のヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）などの培養が難しい細胞の成長および増殖を刺激できるペプチド官能化合成層を製造するために光活性親水性モノマーおよび架橋剤と組み合わされた細胞接着性光活性部分をその場で被覆するためのプロセスを提供する。実施の形態において、これらの被覆は、細胞接着性であるペプチドを含有する。実施の形態において、細胞接着性ペプチドはＲＧＤ配列を有する。しかしながら、ペプチドは、ＲＧＤペプチド配列を有するペプチドには限定されない。実施の形態において、メタクリレート官能化ペプチドは、表面の界面に示されおり、および／または基質内に埋め込まれており、異なる細胞応答を引き出すために異なる親水性モノマーと組み合わされると同時に、異なるモル濃度で配合されている。光活性または光重合性官能基としては、ビトロネクチンおよびラミニンペプチド配列が挙げられる。それらは、直鎖状または環状であって差し支えなく、架橋剤として働く、または架橋されたときにより制限された環状ペプチド構造を模倣する光活性基を少なくとも２つペプチド上に含有することもできる。
【００３７】
本発明の細胞培養表面を形成するために使用されるモノマーおよび官能化ペプチドの混合物の実施の形態の例が、表３〜８に示されている。
【００３８】
表３は、親水性モノマーとしてのＨＥＭＡおよび親水性架橋剤としてのＴＥＧＤＭＡと組み合わされたＢＳＰ−メタクリレート（MAA-配列番号19）の希釈を示している。
【表３】
【００３９】
表４は、親水性モノマーとしてのＨＥＭＡおよび親水性架橋剤としてのＴＥＧＤＭＡと組み合わされたＶＮ−メタクリレート（MAA-配列番号27）の希釈を示している。
【表４】
【００４０】
表５は、親水性モノマーとしてのＨＥＭＡおよび親水性架橋剤としてのＴＥＧＤＭＡと組み合わされた、ＰＥＯスペーサリンカーを含むＶＮ−メタクリレート（MAA-PEG4-配列番号27）の希釈を示すライブラリの配合を示している。
【表５】
【００４１】
表６は、親水性モノマーとしてのグリセロールモノメタクリレートおよび親水性架橋剤としてのグリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレートと組み合わされた、ＰＥＯスペーサリンカーを含むＶＮ−メタクリレート（MAA-PEG4-配列番号27）の希釈を示すライブラリの配合を示している。
【表６】
【００４２】
表７は、親水性モノマーとしてのＨＥＭＡおよび親水性架橋剤としてのＴＥＧＤＭＡと組み合わされた、ＰＥＯスペーサリンカーを含むＶＮ−モノメタクリレートおよびＶＮ−ジメタクリレート（MAA-PEG4-配列番号27）のライブラリ希釈を示している。
【表７】
【００４３】
表８は、親水性モノマーとしてのグリセロールモノメタクリレートおよび親水性架橋剤としてのグリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレートと組み合わされたＶＮ−メタクリレート（MAA-配列番号27）の希釈を示すライブラリの配合を示している。
【表８】
【００４４】
試験した実際のライブラリは、合成ポリマー基質中に存在するペプチドの量と細胞応答との間の相関関係を示した。表面ＨＥＭＡ−１００−ＶＮ−２Ａに示された基質中に存在するペプチドの全体量の増加により、細胞接着と伸長が著しく増加したのが分かる。
【００４５】
追加の実施の形態において、環状官能化ポリマーペプチド表面を、官能化ペプチド（配列番号34）を使用して製造した。この表面は、２４．８μｇ／ｃｍ2および９．４μｇ／ｃｍ2で存在する２−ヒドロキシエチルメタクリレート（親水性モノマー）およびテトラエチレングリコールジメタクリレート架橋剤と組み合わされた１ｍＭ（２．９μｇ／ｃｍ2）のシクロ(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys(MAA)) (配列番号34)からなった。
【００４６】
調製した別のヒドロゲル配合物は、８０μＬの２−ヒドロキシエチルメタクリレートおよび３０μＬのテトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート、並びに３０μＬのDarocur 1173（エタノール中１０％）、２０μＬのIrgacure 819（エタノール中１％）および溶媒としての９．９２ｍｌのエタノールを含有した。１ｍｇの環状ＲＧＤ−ＶＮ−ＭＡＡを４０μＬの18 Mega OHM水中に１０μＬずつ増加させながら溶解させた。１ｍＭのペプチド濃度の溶液１ｍｌの合計について、９６０μＬのアクリレートヒドロゲルを、溶解したペプチドに加えた。
【００４７】
実施の形態において、ペプチド含有する高分子細胞培養表面を製造する方法が提示される。実施の形態において、ペプチド含有高分子細胞培養表面を製造する方法は、（１）ペプチド−（メタ）アクリレートモノマーを混合する工程；（２）モノマーを細胞培養基体に提供する工程；（３）モノマーを硬化または重合させて、ポリマーを形成する工程；および（４）洗浄する工程を提供する。実施の形態において、追加の工程としては、乾燥工程、細胞培養基体に蓋を提供する工程、滅菌工程、ペプチド含有高分子細胞培養表面を有する細胞培養物品を包装および／または出荷する工程が挙げられるであろう。例えば、実施の形態において、少なくとも１種類の（メタ）アクリレートモノマーの存在下で、ペプチドを含有するメタクリレートを基体に提供してもよい。
【００４８】
図１は、細胞培養表面を製造する方法のある実施の形態を示す流れ図である。実施の形態において、光活性化学物質グラフト化によって親水性表面上に細胞結合ペプチドを提供する方法が提供される。これらの方法は、（１１０）官能化ペプチド（ｆペプチド）をモノマーと混合する工程；（１２０）混合物を細胞培養基体に施す工程；（１３０）例えば、ＵＶ／ＶＩＳエネルギーへの曝露により、モノマーおよび官能化ペプチドを重合させて、このモノマーおよび官能化ペプチドを硬化させる工程；（１４０）洗浄する工程；（１５０）乾燥させる工程；（１６０）蓋無しフラスコに蓋を施す（例えば、フラスコに蓋を溶着する）、滅菌、ラベル貼り、包装および出荷などの、随意的な追加の処理の各工程を含む。工程（１２０）において、官能化ペプチドおよびモノマーの混合物を、液体分配法、回転被覆法、吹き付け被覆法、または他の方法を含む当該技術分野で公知のどのような手段によって、基体の表面に提供してもよい。工程（１３０）において、硬化または重合工程は、重合性部分の性質に応じて、当該技術分野で公知のどのような手段によって行ってもよく、モノマー混合物中への光開始剤の導入、および紫外線、可視線または熱エネルギーへの表面の曝露を含むであろう。工程（１４０）において、洗浄工程は、液体分配法および撹拌の有無にかかわらず、定温放置を含む、当該技術分野で公知のどのような手段によって行ってもよく、ここで、液体は、水、水中に希釈された低級アルコール、または他の溶媒であってよい。工程１５０において、乾燥工程は、真空および／または熱の施用によって行ってもよい。工程１６０において、蓋は、溶着、ヒートシール法、圧力シール法、取外し可能なシール法、または任意の他の方法を含む、当該技術分野で公知のどのような手段によって細胞培養基体に提供してもよい。滅菌工程は、例えば、エタノールへの曝露、ガンマ線照射、または他の方法によって行ってよい。
【００４９】
実施の形態において、工程１１０では、層を形成する組成物は、モノマー以外に、界面活性剤、湿潤剤、光開始剤、連鎖移動剤、熱重合開始剤、触媒および活性剤などの追加の化合物を１種類以上含んでもよい。どのような適切な重合開始剤を使用してもよい。当業者は、モノマーに使用するのに適した、適切な開始剤、例えば、ラジカル開始剤またはカチオン開始剤を選択することが容易にできるであろう。様々な実施の形態において、フリーラジカルモノマーを生成して連鎖重合を開始するために、紫外線が使用される。しかしながら、紫外線開始剤の代わりに、可視光開始剤および低温開始剤を使用して、紫外線などのより有害なまたは損害を与える照射線源への曝露から、ペプチドを保護してもよい。
【００５０】
熱開始剤、光開始剤または室温開始剤を含むどのような適切な開始剤を使用してもよい。重合開始剤の例としては、有機過酸化物、アゾ化合物、キノン、ニトロソ化合負物、ハロゲン化アシル、ヒドラゾン、メルカプト化合物、ピリリウム化合物、イミダゾール、クロロトリアジン、ベンゾイン、ベンゾインアルキルエーテル、ジケトン、フェノン、またはそれらの混合物が挙げられる。室温重合のための開始剤として、過硫酸カリウムを使用してもよい。適切な市販の紫外線活性化および可視光活性化光開始剤の例は、ニューヨーク州、タリータウン所在のCiba Specialty Chemicalsから市販されている、IRGACURE 651, IRGACURE 184, IRGACURE 369, IRGACURE 819, DAROCUR 4265 および DAROCUR 1173、並びにBASF（ノースカロライナ州、シャーロット所在）から市販されている、LUCIRIN TPO および LUCIRIN TPO-Lなどの商標を有する。
【００５１】
追加の開始剤としては、例えば、（ＶＡ−０４４）２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二塩酸塩；（ＢＡ０４６Ｂ）２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二硫酸塩二水和物；（ＶＡ−５０）２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩；（ＶＡ−０５７）２，２’−アゾビス［Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン］水和物；（ＶＡ−０６０）２，２’−アゾビス｛２−［１−（２−ヒドロキシエチル）−２−イミダゾリン−２−イル］プロパン｝二塩酸塩；（ＶＡ−０６１）２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］；（ＶＡ−０６７）２，２’−アゾビス（１−アミノ−１−ピロリジノ−２−エチルプロパン）二塩酸塩；（ＶＡ−０８０）２，２’−アゾビス｛２−メチル−Ｎ−［１，１−ビス（ヒドロキシメチル）−２−ヒドロキシエチル］プロパンアミドまたは（ＶＡ−０８６）２，２’−アゾビス［２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロパンアミド］を含む熱重合に使用できる水溶性アゾ開始剤が挙げられるであろう。（Ｖ−７０）２，２’−アゾビス（４−メトキシ−２．４−ジメチルバレロニトリル）；（Ｖ−６５）２，２’−アゾビス（２．４−ジメチルバレロニトリル）；（Ｖ−６０１）ジメチル２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオネート）；（Ｖ−５９）２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）；（Ｖ−４０）１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）；（ＶＦ−０９６）２，２’−アゾビス［Ｎ−（２−プロペニル）−２−メチルプロピオンアミド］；（Ｖ−３０）１−［（１−シアノ−１−メチルエチル）アゾ］ホルムアミド；（ＶＡｍ−１１０）２，２’−アゾビス（Ｎ−ブチル−２−メチルプロピオンアミド）また（ＶＡｍ−１１１）２，２’−アゾビス（Ｎ−シクロヘキシル−２−メチルプロピオンアミド）などの油溶性アゾ開始剤を熱重合に使用してもよい。これらの開始剤は、例えば、バージニア州、リッチモンド所在のWAKO Chemicalsから入手できる。その上、ＰＥＧ主鎖を有するアゾ開始剤などのマクロ開始剤を熱重合に使用してもよい。
【００５２】
光増感剤を適切な開始剤系に含ませてもよい。代表的な光増感剤は、カルボニル基または第三級アミノ基もしくはそれらの混合物を有する。カルボニル基を有する光増感剤としては、ベンゾフェノン、アセトフェノン、ベンジル、ベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、キサントン、チオキサントン、９，１０−アントラキノン、および他の芳香族ケトンが挙げられる。第三級アミンを有する光増感剤としては、メチルジエタノールアミン、エチルジエタノールアミン、トリエタノールアミン、フェニルメチルエタノールアミン、および安息香酸ジメチルアミノエチルが挙げられる。市販の光増感剤としては、英国、クローリー所在のBiddle Sawyer Corp.からのQUANTICURE ITX, QUANTICURE QTX, QUANTICURE PTX, QUANTICURE EPDが挙げられる。
【００５３】
一般に、光増感剤または光開始剤系の量は、約０．０１から１０質量％まで様々であろう。
【００５４】
カチオン開始剤の例としては、アリールスルホニウム塩などのオニウムカチオンの塩、並びにイオンアレーン系などの有機金属塩が挙げられる。
【００５５】
実施の形態において、基体は、セラミック基体、ガラス、プラスチック、ポリマーまたはコポリマー、それらの任意の組合せ、またはある材料の別の材料上の被覆を含む細胞を培養するのに適したどのような材料であってもよい。基体は、平らであっても、形造られていてもよい。そのような基体としては、ソーダ石灰ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス、Ｖｙｃｏｒガラス、石英ガラスなどのガラス材料；シリコン；ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（ジメチルシロキサン）モノメタクリレート、環状オレフィンポリマー、フルオロカーボンポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンイミンなどの樹状ポリマーを含むプラスチックまたはポリマー；酢酸ビニル−無水マレイン酸共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、エチレン−アクリル酸重合体またはこれらの誘導体などの共重合体が挙げられる。ここに用いたように、「環状オレフィンコポリマー」は、複数のモノマー種から形成されたポリマーを意味し、ここで、それらのモノマー種の内の少なくとも１種類が環状オレフィンモノマーであり、少なくとも１種類の他のモノマー種は、環状オレフィンモノマー種ではない。多くの実施の形態において、環状オレフィンコポリマーは、エチレンおよびノルボルネンモノマーから形成される。環状オレフィンコポリマー樹脂は、日本国のBoedeker Plastics, Inc.からのＴＯＰＡＳ（登録商標）およびケンタッキー州、ルイビル所在のZeon Chemicals,L.P.からのＺｅｏｎｏｒの商標名で市販されている。実施の形態において、基体は、ポリマー基質の保持力を向上させるように処理してもよい。例えば、基体を、負の電荷、正の電荷を提供する、より親水性の表面を形成する、またはポリマー基質の基体への接着を向上させる化学官能基を形成する化学処理またはプラズマ処理により処理してもよい。例えば、そのような処理としては、疎水性または親水性相互作用、立体相互作用、親和性またはファンデルワールス力が挙げられるであろう。
【００５６】
ペプチド官能化合成細胞培養層を形成するために、モノマーおよび官能化ペプチドを重合させる。バルク相（実質的に無溶媒）または溶媒相中で重合されていようとなかろうと、モノマーは、適切な開始機構を通じて重合される。そのような機構の多くが当該技術分野において公知である。例えば、温度を上昇させて、熱開始剤を活性化させてもよい；光開始剤を、適切な波長の光などへの曝露によって活性化させてもよい。数多くの実施の形態によれば、モノマーまたはモノマー混合物は、紫外線を使用して硬化される。硬化は、酸素阻害を防ぐために、窒素保護などの不活性ガス保護下で行うことが好ましい。ガス保護と組み合わせた適切な紫外線は、ポリマーの転化を増加させ、被覆の完全性を確実にし、細胞毒性を減少させるであろう。
【００５７】
実施の形態において、前記層を溶媒で一回以上洗浄して、未反応モノマーまたは低分子量ポリマー種などの不純物を除去してもよい。様々な実施の形態において、層は、エタノールまたはエタノール水溶液、例えば、７０％のエタノール、９０％超のエタノール、９５％超のエタノールまたは約９９％のエタノールで洗浄される。７０％のエタノール溶媒による洗浄は、毒性であるかもしれない不純物を除去するように働くだけでなく、細胞の培養前に表面を滅菌するように働くことができる。
【００５８】
図２は、細胞培養表面の実施の形態を製造する方法を示す説明図である。図２において、例えば、テトラエチレングリコールジメタクリレート（ＴＥＧＤＭＡ）およびヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）などのアクリレートまたはメタクリレートモノマー２１０を、ＶＮ−メタクリレートまたはＢＳＰ−（メタクリレート）2などの官能化ペプチド２２０もしくは官能化ペプチド２２０の混合物と混合し、基体に施し、紫外線に曝露して、細胞培養用途に適したペプチド結合ポリマー２５０表面を形成する。式１を参照すると、ＶＮ−メタクリレートはAm - Sy - Xaan - Sy1 - Z - Sy2 - Am1であり、ＸａａはＬｙｓであり、アセチル化されており、ｎ＝１、「Ａ」はメタクリル酸（ＭＡＡ）であり、ｍ＝１、スペーサSyはなく（ｙ＝０）、スペーサSy1はなく（ｙ１＝０）、ペプチドＺは配列番号28であり、スペーサSy2はなく（ｙ２＝０）、Am1はない（ｍ１＝０）。式１を参照すると、ＢＳＰ−（メタクリレート）2はAm - Sy - Xaan - Sy1 - Z - Sy2 - Am1であり、ここで、「Ａm」はメタクリル酸（ＭＡＡ）（ｍ＝１）であり、スペーサSyはなく（ｙ＝０）、「Ｘａａ」はＬｙｓであり、アセチル化されており（ｎ＝１）、スペーサSy1はなく（ｙ１＝０）、ペプチドＺは配列番号19であり、スペーサSy2はなく（ｙ２＝０）、Am2はメタクリル酸または任意のカルボン酸官能化メタクリレートである。この実例において、第２のメタクリル酸部分は、ｃ−リンカーを介してペプチド配列のＮ末端に存在する。
【００５９】
図２は、ＵＶエネルギーへの曝露の際に（I-819またはD-1173などの光重合剤の存在下で）ポリマー基質中にペプチドを含有するポリマー基質を形成する、親水性モノマーとしてのＨＥＭＡおよび架橋剤としてのＴＥＧＤＭＡ（トリエチレングリコールジメタクリレート）と組み合わされたＶＮ−メタクリレートおよび／またはＢＳＰ−（メタクリレート）2を示す反応スキームを示している。
【００６０】
理論により制限するものではないが、ＶＮ−ジメタクリレートの架橋能力により、陽性の細胞応答に影響するであろう基質中のより安定な制限配置を形成したであろう。全体に、ペプチド密度の少ない他の表面と比べて、ＨＥＭＡ−１００−ＶＮ−２Ａ表面について、２〜３倍多く、細胞数が増加した。
【００６１】
実施の形態において、架橋したポリマー−ペプチド基質を形成するために、例えば、ヒドロエチルメタクリレートおよびテトラエチレングリコールジメタクリレートとのその場でのフリーラジカル光重合により反応される一連の官能化モノおよびジメタクリル化ペプチドが提供される。より親水性である他のモノマーも、配合ライブラリ中に提示されている。さらに、本発明により、基質中への非常に低いペプチドの供給濃度が可能になると同時に、光活性ペプチドの９５％超の利用が可能になる。このことは、従来の方法を超えた著しい改善を示す。詳しくは、本発明の方法の実施の形態は、例えば、Ｔ７５フラスコ中で回転被覆したときの０．６３ｍｇから２．４ｍｇと同等である０．７５ｍＬ〜１．５ｍＬのモノマー−ペプチド溶液を利用するのに対し、従来の方法では、１６．８ｍｇのペプチドが必要であり、先に述べたのと同じ様式の１％未満しか利用されなかった。本発明はまた、超音波吹き付け被覆法、浸漬被覆法および最大の材料を利用する溶液注型法などの、回転被覆法の域を超えた他の被覆技法まで広げることができる。別の重要な属性は、プラスチックの表面との化学的相互作用を起こさずに、熱可塑性樹脂を含む他の基体にこの方法を使用できる能力である。これは、プロセスからＤＭＦ溶媒を除去し、したがって、ベース基体としてのより安いプラスチック樹脂の使用を促進し、使用後のＤＭＦの廃棄の負担が減少する。
【００６２】
本発明の方法の実施の形態の別の利点は、全体の製造コストに大きな影響を及ぼすプロセス工程の著しい減少である。この方法は、細胞培養のための化学結合したペプチド表面の製造に対する新規の容易な合成経路を提供する。
【００６３】
実施の形態において、親水性モノマーは、例えば、グリセロールモノメタクリレート（ＧＬＹ−ＭＥＴＨ）、グリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレート（ＤＧＤＭＡ）、またはヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、またはテトラエチレングリコールジメタクリレート（ＴＥＧＤＭ）である。アクリレートおよびメタクリレートモノマーは、当該技術分野に公知のように合成しても、ペンシルベニア州、ウォリントン所在のPolysciences, Inc.、ミズーリ州、セントルイス所在のSigma Aldrich, Inc.、およびペンシルベニア州、エクストン所在のSartomer, Inc.などの供給メーカーから得てもよい。ポリペプチドは、当該技術分野に公知のように合成しても（あるいは分子生物学技法により産生しても）、またはカリフォルニア州、サニーベール所在のAmerican Peptide Corporation、ニュージャージー州、ピスカタウェイ所在のGen GenScript Corporation、およびカリフォルニア州、サンディエゴ所在のGenway Biotechnologyなどの供給メーカーから得てもよい。スペーサは、当該技術分野に公知のように合成しても、オハイオ州、パウエル所在のQuanta BioDesign, Ltd.から得られる個別(discrete)ポリエチレングリコール（ｄＰＥＧ）などのように、供給メーカーから得てもよい。本発明の細胞培養表面の実施の形態が、表３〜８に示されている。
【００６４】
図３は、細胞培養表面上に分布した蛍光標識ペプチドポリマーの蛍光密度を示している。この図において、ローダミン標識Ac-Lys-(MAA)-Gly-Gly-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2-TAMRA (Ac-K-MAA-配列番号-TAMRA)を、ＨＥＭＡおよびＴＥＧＤＭＡが配合された未標識メタクリレートペプチド配列中に０．２％加えた。ＴＡＭＲＡは、ペプチドを標識するために使用されるテトラメチルローダミン染料である。図３は、被覆が、縁のわずかな不均一を除いて、比較的均一であることを示している。
【００６５】
図４は、ニュージャージー州、フランクリン・レイクス所在のBDから得られる対照表面のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（図４Ａ）およびともに全てにここに引用する同時係属出願第１２／３６２，９７４号および同第１２／３６２７８２号の各明細書に記載された方法にしたがって製造されたビトロネクチンペプチド結合膨潤性アクリレート表面である、ニューヨーク州、コーニング所在のCorning Incorporatedから得られる対照表面のＳｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）（図４Ｂ）上で培養されたＨ７ヒト胚性幹細胞と比べた、本発明の実施の形態（図４Ｃ）の６ウェルプレート中に４日間に亘り培養したＨ７ヒト胚性幹細胞の顕微鏡写真を示している。図４に示されるように、本発明の実施の形態上で増殖したこれらの細胞の形態は、対照表面上のこれらの細胞の形態と似ているが、本発明の実施の形態上で増殖した細胞は、対照と比べると、より嚢胞性の形態を有する。
【００６６】
図５は、対照表面と比べた本発明の実施の形態における官能化ペプチド−ポリマー被覆表面上で培養したクリスタル・バイオレット染色Ｈ７ヒト胚性幹細胞の顕微鏡写真を示している。（図５Ａ）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、（図５Ｂ）Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）、先の表７に記載されたような（図５ＣおよびＤ）ＨＥＭＡ−１００−ＶＮ−２ＭＡＡ、および（図５ＥおよびＦ）ＨＥＭＡ−５０−ＶＮ−２ＭＡＡ上のクリスタル・バイオレット染色Ｈ７ｈＥＳＣ。図５ＤおよびＦは、ＨＥＭＡ−１００−ＶＮ−２ＭＡＡおよびＨＥＭＡ−５０−ＶＮ−２ＭＡＡについて示された重複実験である。図５は、本発明の実施の形態上で増殖したＨ７ｈＥＳＣ細胞が、現状の対照表面（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）およびＳｙｎｔｈｅｍａｘ（商標））上で増殖した細胞に匹敵することを示している。
【００６７】
図６Ａ〜Ｈは、Corning Incorporatedからのｌａｍｉｎｉｎ（商標）表面上（図６ＡおよびＥ）、ＨＥＭＡおよびＴＥＧＤＭＡにより製造された環状官能化ＲＧＤペプチド表面上（図６ＢおよびＦ）、グリセロールメタクリレートおよび１，３−ジグリセロレートジメタクリレートにより製造された環状官能化ＲＧＤペプチド（環状配列番号34）表面上（図６ＣおよびＧ）、並びにCorning IncorporatedからのＳｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）上（図６ＤおよびＨ）で増殖した、培養の１日後（図６Ａ〜Ｄ）および培養の３日後（図６Ｅ〜Ｈ）の神経前駆細胞の顕微鏡写真を示している。
【００６８】
実施の形態において、細胞培養表面は、細胞培養に適したどのような表面上に形成してもよい。細胞培養に適した物品の例としては、６，１２，９６，３８４，および１５３６ウェルプレートなどのシングルおよびマルチウェルプレート、瓶、ペトリ皿、フラスコ、ビーカー、プレート、ローラーボトル、区画および多区画培養スライドなどのスライド、試験管、カバースリップ、バッグ、膜、中空繊維、ビーズおよびマイクロキャリア、カップ、スピナーボトル、潅流チャンバ、バイオリアクタ、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）(Corning Incorporated)および発酵槽が挙げられる。
【００６９】
細胞は、（ｉ）調査研究に使用するため、または治療法を開発するために、既知組成培地内の合成表面上で培養される未分化幹細胞を十分な量で得ること、（ｉｉ）培養されている細胞の調査研究のため、（ｉｉｉ）治療法を開発するため、（ｉｖ）治療目的のため、（ｖ）例えば、ｃＤＮＡライブラリを作成することにより、遺伝子発現を研究するため、および（ｖｉ）薬物と毒性のスクリーニングを研究するため、を含むどのような適切な目的に使用してもよい。
【００７０】
本発明の方法の実施の形態により調製される細胞培養物品は、初代細胞、細胞株、組織および例えば、幹細胞、成人幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）または人工多能性細胞（ＩＰＣ）を含むどのような関連性のある細胞タイプの成長および増殖を促進するために効果的に提示することができる。実施の形態において、培養中のこれらの細胞は、治療用途に使用してもよい。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、未分化状態で培養において継続的に増殖する能力を有するので、本発明に使用するためのｈＥＳＣは株化細胞から得てもよい。株化されたヒト胚性幹細胞株の例としては、以下に限られないが、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３またはＨ１４（ウィスコンシン大学により株化されたＷｉＣｅｌｌから得られる）（Thompson (1998) Science 282:1145 ）；ｈＥＳＢＧＮ−０１、ｈＥＳＢＧＮ−０２、ｈＥＳＢＧＮ−０３（ジョージア州、アセンズ所在のBresaGen,Inc.）；ＨＥＳ−１、ＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、ＨＥＳ−４、ＨＥＳ−５、ＨＥＳ−６（シンガポール国のES Cell International, Inc.から）；ＨＳＦ−１、ＨＳＦ−６（カリフォルニア大学サンフランシスコ校から）；Ｉ３、Ｉ３．２、Ｉ３．３、Ｉ４、Ｉ６、Ｉ６．２、Ｊ３、Ｊ３．２（イスラエル国、ハイファ所在のイスラエル工科大学で誘導された）；ＵＣＳＦ−１およびＵＣＳＦ−２（Genbacev et al., Fertil. Steril. 83(5):1517-29, 2005）；ＨＵＥＳ１−１７株（Cowan et al., NEJM 350(13):1353-56, 2004）；およびＡＣＴ−１４株（Klimanskaya et al., Lancet, 365(9471):1636-41, 2005）が挙げられる。本発明に使用される胚性幹細胞は、初代胚組織から直接得てもよい。一般に、このことは、そうでなければ廃棄されるであろう、胚盤胞段階での凍結したインビトロ受精卵を使用して行われる。
【００７１】
他の適切な幹細胞としては、人工霊長類多能性幹（ｉＰＳ）細胞が挙げられる。本発明によるＯＰＣも、人工霊長類多能性幹（ｉＰＳ）細胞から分化されてもよい。ｉＰＳ細胞は、ｈＥＳＣなどの多能性幹細胞の表現型を獲得するように再プログラム化されるように、例えば、１つ以上の適切なベクターのトランスフェクションにより、遺伝子組み換えされた、ヒトなどの若いまたは成体の哺乳類から得られる、細胞を称する。これらの再プログラム化された細胞により獲得された表現型形質としては、胚盤胞から単離された幹細胞に似た形態、並びに胚盤胞由来の胚性幹細胞に似た表面抗原発現、遺伝子発現およびテロメラーゼ活性が挙げられる。ｉＰＳ細胞は、典型的に、初代胚葉：内胚葉、外胚葉および中胚葉の各々からの少なくとも１つの細胞タイプに分化する能力を有し、したがって、様々な細胞タイプへの分化に適している。ｈＥＳＣのようなｉＰＳ細胞は、免疫不全マウス、例えば、ＳＣＩＤマウスに注入されたときに、奇形種を形成する（Takahashi et al., (2007) Cell 131(5):861; Yu et al., (2007) Science318:5858）。
【００７２】
本発明の実施の形態は、全体の製造コストの著しい減少をもたらす、対費用効果的な様式で容易な製造プロセスで、官能化ペプチド−ポリマー被覆表面を作製するための効率的な技法を提供する。実施の形態において、その表面は、既知組成培地を使用して多能性（複数の潜在的な結果を有する）状態でヒト胚性幹細胞を含む細胞を培養するのに有用な表面である。本発明の実施の形態における合成表面と組み合わせた既知組成培地の使用が重要である。何故ならば、血清を使用すると、治療用途を意図した培養細胞にとって有害かもしれない不確定要因が細胞培養に導入されてしまうからである。
【００７３】
態様（１）において、官能化ペプチドモノマーであって、式：Am - Sy - Xaan - Sy1 - Z - Sy2 - Am1により記載され、ここで、Ａは重合部分であり、ｍは１から６までの整数であり、ｍ１は１から６までの整数であり、Ｘａａnは独立して任意のアミノ酸であり、ｎは０から６までの整数であり、Ｓはスペーサであり、ｙは０から３０までの整数であり、ｙ１は０から３０までの整数であり、ｙ２は０から３０までの整数であり、Ｚは細胞接着性ペプチドである、官能化ペプチドモノマーが提供される。態様（２）において、細胞接着性ペプチド（Ｚ）が、配列KGGGQKCIVQTTSWSQCSKS (配列番号1); GGGQKCIVQTTSWSQCSKS(配列番号2); KYGLALERKDHSG (配列番号3); YGLALERKDHSG (配列番号4); KGGSINNNRWHSIYITRFGNMGS (配列番号5); GGSINNNRWHSIYITRFGNMGS (配列番号6); KGGTWYKIAFQRNRK (配列番号7); GGTWYKIAFQRNRK (配列番号8); KGGTSIKIRGTYSER (配列番号9); GGTSIKIRGTYSER (配列番号10); KYGTDIRVTLNRLNTF (配列番号11); YGTDIRVTLNRLNTF (配列番号12); KYGSETTVKYIFRLHE (配列番号13); YGSETTVKYIFRLHE(配列番号14); KYGKAFDITYVRLKF (配列番号15); YGKAFDITYVRLKF(配列番号16); KYGAASIKVAVSADR (配列番号17); YGAASIKVAVSADR(配列番号18); KGGNGEPRGDTYRAY(配列番号19); GGNGEPRGDTYRAY (配列番号20) CGGNGEPRGDTYRAY (配列番号21); GGNGEPRGDTRAY (配列番号22); KYGRKRLQVQLSIRT (配列番号23); YGRKRLQVQLSIRT(配列番号24); KGGRNIAEIIKDI (配列番号25); GGRNIAEIIKDI (配列番号26); KGGPQVTRGDVFTMP (配列番号27); GGPQVTRGDVFTMP(配列番号28); GGPQVTRGDVFTMPK (配列番号29); GRGDSPK (配列番号30); KGGAVTGRGDSPASS(配列番号31); GGAVTGRGDSPASS (配列番号32); YaalPQVTRGNVFTMP (配列番号33); 直鎖または環状であってもよいRGDYK (配列番号34)、またはそれらの組合せを含むことを特徴とする態様１の官能化ペプチドモノマーが提供される。態様（３）において、細胞接着性ペプチドがKGGPQVTRGDVFTMP (配列番号27) または GGPQVTRGDVFTMP (配列番号28)を含むことを特徴とする態様１または２の官能化ペプチドモノマーが提供される。態様（４）において、重合部分Ａがアクリレートまたはメタクリレート部分を含むことを特徴とする態様１から３いずれかの官能化ペプチドモノマーが提供される。態様（５）において、重合部分がメタクリル酸であることを特徴とする態様１から４いずれかの官能化ペプチドモノマーが提供される。態様（６）において、スペーサが、２０以下の反復単位を有するポリエチレンオキシドであることを特徴とする態様１から５いずれかの官能化ペプチドモノマーが提供される。態様（７）において、スペーサがＰＥＧ4であることを特徴とする態様１から６いずれかの官能化ペプチドモノマーが提供される。
【００７４】
追加の態様（８）において、態様１から７いずれかの官能化ペプチドおよび少なくとも１種類の光重合性モノマーを含む混合物から形成されたポリマーが提供される。態様（９）において、少なくとも１種類の光重合性モノマーが、ＨＥＭＡ、ＴＥＧＤＭＡ、グリセロールモノメタクリレートまたはグリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレートであることを特徴とする態様８のポリマーが提供される。態様（１０）において、ポリマーが、官能化ペプチド、ＨＥＭＡおよびＴＥＧＤＡを含む混合物から形成されることを特徴とする態様８または９のポリマーが提供される。態様（１１）において、ポリマーが、官能化ペプチド、グリセロールモノメタクリレートおよびグリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレートを含む混合物から形成されることを特徴とする態様８から１０いずれかのポリマーが提供される。態様（１２）において、ポリマーがその場で形成されることを特徴とする態様８から１１いずれかのポリマーが提供される。
【００７５】
追加の態様（１３）において、細胞培養表面を製造する方法であって、官能化ペプチドモノマーおよび少なくとも１種類の（メタ）アクリレートモノマーの混合物を提供し、この混合物を細胞培養基体に施し、これらのモノマーをその場で重合させて、ペプチド−ポリマーを形成する各工程を有してなる方法が提供される。態様（１４）において、（メタ）アクリレートモノマーが、ＨＥＭＡ、ＴＥＧＤＭＡ、グリセロールモノメタクリレートまたはグリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレートまたはそれらの組合せを含むことを特徴とする態様１３の方法が提供される。態様（１５）において、メタクリレートモノマーが、ＨＥＭＡおよびＴＥＧＤＡの組合せを含むことを特徴とする態様１３または１４の方法が提供される。態様（１６）において、官能化ペプチドモノマーが、式：Am - Sy - Xaan - Sy1 - Z - Sy2 - Am1により記載され、ここで、Ａは重合部分であり、ｍは１から６までの整数であり、ｍ１は１から６までの整数であり、Ｘａａnは独立して任意のアミノ酸であり、ｎは０から６までの整数であり、Ｓはスペーサであり、ｙは０から３０までの整数であり、ｙ１は０から３０までの整数であり、ｙ２は０から３０までの整数であり、Ｚは細胞接着性ペプチドである、ことを特徴とする態様１３から１５いずれかの方法が提供される。態様（１７）において、ＸａａがＬｙｓであり、ｎ＝１であることを特徴とする態様１３から１６いずれかの方法が提供される。態様（１８）において、Ａがアクリレートまたはメタクリレートであることを特徴とする態様１３から１７いずれかの方法が提供される。態様（１９）において、ＳがＰＥＯであり、ｍ＝４であることを特徴とする態様１３から１８いずれかの方法が提供される。態様（２０）において、Ｚが、配列KGGGQKCIVQTTSWSQCSKS (配列番号1); GGGQKCIVQTTSWSQCSKS(配列番号2); KYGLALERKDHSG (配列番号3); YGLALERKDHSG (配列番号4); KGGSINNNRWHSIYITRFGNMGS (配列番号5); GGSINNNRWHSIYITRFGNMGS (配列番号6); KGGTWYKIAFQRNRK (配列番号7); GGTWYKIAFQRNRK (配列番号8); KGGTSIKIRGTYSER (配列番号9); GGTSIKIRGTYSER (配列番号10); KYGTDIRVTLNRLNTF (配列番号11); YGTDIRVTLNRLNTF (配列番号12); KYGSETTVKYIFRLHE (配列番号13); YGSETTVKYIFRLHE(配列番号14); KYGKAFDITYVRLKF (配列番号15); YGKAFDITYVRLKF(配列番号16); KYGAASIKVAVSADR (配列番号17); YGAASIKVAVSADR(配列番号18); KGGNGEPRGDTYRAY(配列番号19); GGNGEPRGDTYRAY (配列番号20) CGGNGEPRGDTYRAY (配列番号21); GGNGEPRGDTRAY (配列番号22); KYGRKRLQVQLSIRT (配列番号23); YGRKRLQVQLSIRT(配列番号24); KGGRNIAEIIKDI (配列番号25); GGRNIAEIIKDI (配列番号26); KGGPQVTRGDVFTMP (配列番号27); GGPQVTRGDVFTMP(配列番号28); GGPQVTRGDVFTMPK (配列番号29); GRGDSPK (配列番号30); KGGAVTGRGDSPASS(配列番号31); GGAVTGRGDSPASS (配列番号32); YaalPQVTRGNVFTMP (配列番号33); 直鎖または環状であってもよいRGDYK (配列番号34)、およびそれらの組合せからなる群より選択される細胞接着性ペプチドであることを特徴とする態様１３から１９いずれかの方法が提供される。
【００７６】
別の態様（２２）において、官能化環状ペプチドモノマーであって、式：Zc - Sy - Xaan - Amにより記載され、ここで、ＺCは細胞接着性環状ペプチドであり、Ｓはスペーサであり、ｙは０から３０までの整数であり、Ｘａａnは独立して任意のアミノ酸であり、ｎは０から６までの整数であり、Ａは重合部分であり、ｍは１から６までの整数である、官能化環状ペプチドモノマーが提供される。態様（２３）において、重合部分Ａがアクリレートまたはメタクリレート部分を含むことを特徴とする態様２２の官能化環状ペプチドモノマーが提供される。態様（２４）において、重合部分がメタクリル酸であることを特徴とする態様２２または２３の官能化環状ペプチドモノマーが提供される。態様（２５）において、スペーサが、２０以下の反復単位を有するポリエチレンオキシドである態様２２から２４いずれかの官能化環状ペプチドモノマーが提供される。態様（２６）において、スペーサがＰＥＧ4であることを特徴とする態様２２から２５いずれかの官能化環状ペプチドモノマーが提供される。
【００７７】
別の態様（２７）において、態様２２から２６いずれかの官能化環状ペプチドおよび少なくとも１種類の光重合性モノマーを含む混合物から形成されたポリマーが提供される。態様（２８）において、少なくとも１種類の光重合性モノマーが、ＨＥＭＡ、ＴＥＧＤＭＡ、グリセロールモノメタクリレートまたはグリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレートであることを特徴とする態様２７のポリマーが提供される。態様（２９）において、ポリマーが、官能化ペプチド、ＨＥＭＡおよびＴＥＧＤＡを含む混合物から形成されることを特徴とする態様２７または２８のポリマーが提供される。態様（３０）において、ポリマーが、官能化ペプチド、グリセロールモノメタクリレートおよびグリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレートを含む混合物から形成されることを特徴とする態様２７から２９いずれかのポリマーが提供される。
【００７８】
ある態様において、態様２７から３０いずれかのポリマーから形成された細胞培養表面上でヒト胚性幹細胞を培養する方法であって、細胞培養用培地内にあるヒト胚性幹細胞をポリマーに提供し、細胞をポリマー上で培養する各工程を有してなる方法が提供される。別の態様において、態様２７から３０いずれかのポリマーから形成された細胞培養表面上で神経前駆幹細胞を培養する方法であって、細胞培養用培地内にある神経前駆幹細胞をポリマーに提供し、細胞をポリマー上で培養する各工程を有してなる方法が提供される。
【００７９】
以下において、上述した物品および方法の様々な実施の形態について説明する非限定的実施例が提示される。
【実施例】
【００８０】
省略形： （ＢＳＰ−メタクリレート）、Ac-Lys(MAA)-Gly-Gly-Asn-Gly-Glu-Pro-Arg-Gly-Asp-Thr-Tyr-Arg-Ala-Tyr-NH2 または Ac-K-MAA-配列番号19-NH2；（ＶＮ−メタクリレート）、- Ac-Lys(MAA)-Gly-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2 または Ac-K-MAA-配列番号27-NH2；（ＭＡＡ−ＰＥＧ4−ＶＮ）、MAA-PEG4-Lys-Gly-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2 または MAA-PEG4-配列番号27；（ＢＳＰ−ＤＩＭＡＡ）、MAA-Lys-Gly-Gly-Asn-Gly-Glu-Pro-Arg-Gly-Asp-Thr-Tyr-Arg-Ala-Tyr-NH2-MAA または MAA-配列番号-MAA；（ＧＤＧＭＤＭＡ）−グリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレート；（ＧＭＭＡ）−グリセロールモノメタクリレート；ＴＥＧＤＭＡ−テトラエチレングリコールジメタクリレート；ＨＥＭＡ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート；ＥｔＯＨ−エタノール；Ｉ−８１９、Darocure 1173。
【００８１】
材料： アクリレートヒドロゲル配合物のフリーラジカル重合に使用した光開始剤であるIgracure-819（ホスフィンオキシド、フェニルビス（２，４，６−トリメチルベンゾイル））およびDarocur 1173（２−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニル−１−プロパン）をCiba Specialty Chemicals（デラウェア州、ニューポート所在）から得て、さらに精製せずに使用した。親水性架橋剤、テトラエチレングリコールジメタクリレート（８６６８０）、（４５４９８２）およびグリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレート（４７５８０７）の全てを、プロダクト仕様書に記載されているような純度でSigma-Aldrichから購入した。親水性モノマーの２−ヒドロキシエチルメタクリレート、＋９９％（４７７０２８）はSigma-Aldrichから購入し、一方で、配合物に使用した他の親水性モノマーのグリセロールモノメタクリレート異性体（０４１８０）は、さらに精製せずに、Polysciences Incorporatedから購入した。Ac-Lys(MAA)-Gly-Gly-Asn-Gly-Glu-Pro-Arg-Gly-Asp-Thr-Tyr-Arg-Ala-Tyr-NH2 (配列番号19), Ac-Lys(MAA)-Gly-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2 (SEQ ID NO:27), または (MAA-PEG4-VN), MAA-PEG4-Lys-Gly-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2 (配列番号27), Ac-Lys(MAA)-Gly-Gly-Asn-Gly-Glu-Pro-Arg-Gly-Asp-Thr-Tyr-Arg-Ala-Tyr-NH2 (配列番号19), MAA-Lys(MAA)-Gly-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2 (配列番号27), C[Arg-Gly-Asp-DTyr-Lys]-[MAA] (配列番号34) もしくは c(RGDyK)(配列番号34)は全て、カリフォルニア州、サニーベール所在のAmerican Peptide Corporationから購入し、以下のプロセスによって合成した：
官能化ペプチドの合成のための一般プロセス：
Ac-Lys(MAA)-Gly-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2 (配列番号27)の調製： このペプチドは、Ｆｍｏｃ成分により１５ミリモルのFmoc-Rinkアミド樹脂上で合成した。アミノ酸に使用した保護基は：ＡｓｐおよびＴｈｒについてはｔ−ブチル基、ＧｌｎについてはＴｒｔ基、ＡｒｇについてはＰｂｆ、ＬｙｓについてはＩｖｄｄｅ。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸は、EMD Biosciencesから購入した。カップリングおよび切断のための試薬は、Aldrichから購入した。溶媒は、Fisher Scientificから購入した。ペプチド鎖を、Ｆｍｏｃ保護基の反復除去および保護されたアミノ酸のカップリングにより、樹脂上に作製した。ＤＩＣおよびＨＯＢｔをカップリング剤として使用し、ＮＭＭを塩基として使用した。ＤＭＦ中２０％のピペリジンを脱−Ｆｍｏｃ化剤として使用した。ｌｖｄｄｅをＤＭＦ中２％のヒドラジンによって除去した後に、リシンの側鎖にメタクリル酸（ＭＡＡ）をカップリングさせた。最後のカップリング後、側鎖保護基の切断と除去のために、樹脂をＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ2Ｏ（９５：３：２、ｖ／ｖ／ｖ）で処理した。粗製ペプチドを冷たいエーテルから沈殿させ、濾過により収集した。収量３３．０グラム（合成収率１９４．２％）。１７ｇの粗製ペプチドを逆相ＨＰＬＣによって精製した；９０％超の純度の収集分画を貯留し、凍結乾燥させた。最終生成物の収量９．２５ｇ（精製収率５４．４％）。
【００８２】
（ＭＡＡ−ＰＥＧ4−ＶＮ）：MAA-PEG4-Lys-Gly-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2 （配列番号27）の調製： このペプチドは、Ｆｍｏｃ成分により１ミリモルのFmoc-Rinkアミド樹脂上で合成した。アミノ酸に使用した保護基は：ＡｓｐおよびＴｈｒについてはｔ−ブチル基、ＧｌｎについてはＴｒｔ基、ＡｒｇについてはＰｂｆ、ＬｙｓについてはＢｏｃ。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸は、EMD Biosciencesから購入した；Ｆｏｍｃ−ＰＥＧ4−ＯＨはQuanta BioDesignから購入した。カップリングおよび切断のための試薬は、Aldrichから購入した。溶媒は、Fisher Scientificから購入した。ペプチド鎖を、Ｆｍｏｃ保護基の反復除去および保護されたアミノ酸のカップリングにより、樹脂上に作製した。ＨＢＴＵおよびＨＯＢｔをカップリング剤として使用し、ＮＭＭを塩基として使用した。ＤＭＦ中２０％のピペリジンを脱−Ｆｍｏｃ化剤として使用した。Ｆｍｏｃ保護基の除去後に、ＰＥＧ4のアミノ基にメタクリル酸（ＭＡＡ）をカップリングさせた。最後のカップリング後、側鎖保護基の切断と除去のために、樹脂をＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ2Ｏ（９５：３：２、ｖ／ｖ／ｖ）で処理した。粗製ペプチドを冷たいエーテルから沈殿させ、濾過により収集した。収量４．０グラム（合成収率２１０．１％）。粗製ペプチドを逆相ＨＰＬＣによって精製した；９０％超の純度の収集分画を貯留し、凍結乾燥させた。最終生成物の収量１．０３５ｇ（精製収率２５．９％）。
【００８３】
生成物は、９０％以上の純度でAmerican Peptideにより提供され、さらに精製せずに使用した。エタノールは、プロセスにおいて非反応性希釈剤として使用し、Sigma-Aldrichから購入した。
【００８４】
官能化ペプチドポリマー配合物を調製するための一般手法：
別個の１０ｍｌのシンチレーション・バイアル中に、４００μＬの２−ヒドロキシエチルメタクリレートを加え、その後、４０μＬのテトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート、１５μＬのDarocure 1173（エタノール中１０％）、５０μＬのIrgacure 819（エタノール中１％）および９．５ｍｌのエタノールを加えた。この配合は、エタノール中１％の配合物になる。グリセロールモノメタクリレート異性体およびグリセロール１，３−ジグリセロールジメタクリレートを含むライブラリについて、それぞれ、４００μＬおよび４０μＬの同じ容量を使用した。Ac-Lys(MAA)-Gly-Gly-Asn-Gly-Glu-Pro-Arg-Gly-Asp-Thr-Tyr-Arg-Ala-Tyr-NH2 (MAA-配列番号19), Ac-Lys(MAA)-Gly-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2 (MAA-配列番号28)を加えて、表３，４および８において先に記載したモノマー配合物、１０ｍｌ当たり８．７４ｍｇ、６．５５ｍｇ、４．３７ｍｇ、２．１９ｍｇおよび０．８７ｍｇのペプチド勾配を作成した。一方で、表５および６に示されたそれぞれの配合物に、MAA-PEG4-Lys-Gly-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2 (MAA-PEG4-配列番号28)を４．３７ｍｇ、３．２８ｍｇ、２．１９ｍｇ、１．０９ｍｇおよび０．４３７ｍｇで加えた。Ac-Lys(MAA)-Gly-Gly-Asn-Gly-Glu-Pro-Arg-Gly-Asp-Thr-Tyr-Arg-Ala-Tyr-NH2-MAA (MAA-配列番号19)を２．０ｍｇ、１．５ｍｇ、１．０ｍｇおよび０．５ｍｇで加えたが、表７に見られるように、８．０ｍｇほどまで増加させても差し支えない。ＰＡ、ＰＢ、ＰＣ、ＰＤ、ＰＥおよびＰＦの表記は、ペプチドと混合された配合物を称する。数は、細胞応答を試験するために作成したペプチド勾配を称する。
【００８５】
環状官能化ペプチドポリマー配合物を調製するための一般手法：
１０ｍｌのシンチレーション・バイアル中に、８０μＬのグリセロールモノメタクリレートを８μＬのグリセロール１，３−ジグリセロレートジメタクリレートと共に加えた。その後、１５μＬのDarocure 1173（エタノール中１０％）、５０μＬのIrgacure 819（エタノール中１％）および溶媒としての９．９２ｍｌのエタノールも加えた。この配合は、エタノール中１％の配合物になる。この配合物を、６ウェルプレートに被覆するために取って置いた。
【００８６】
８０μＬのグリセロールモノメタクリレートおよび３０μＬのテトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート、並びに３０μＬのDarocure 1173（エタノール中１０％）、２０μＬのIrgacure 819（エタノール中１％）および溶媒としての９．９２ｍｌのエタノールを含有する、別のヒドロゲル配合物のＨＥＭＡ／ＴＥＧＤＭＡ／環状ペプチド表面を、スクリーニングのために調製した。１ｍｇの官能化環状ペプチド(c(RGDyK-MAA)(配列番号34))を、１０μＬの増加量で４０μＬの18 Mega OHM水中に溶解させた。合計で１ｍｌの１ｍＭのペプチド濃度溶液となるように、溶解したペプチドに９６０μＬのアクリレートヒドロゲルを加えた。
【００８７】
３ｍｌのシンチレーション・バイアル中に、１ｍｇの官能化環状ペプチドのc(RGDyK-MAA)(配列番号34)または１．７ｍｇの官能化環状ペプチドのc(RGDyK-MAA)(配列番号34)いずれかを使用した。乾燥ペプチドに、８０μＬの18 Mega OHM水を２０μＬの増加量で、ペプチドが溶解するまで加えた。溶解したペプチドに、１９２０μＬのアクリレートヒドロゲル（グリセロールモノメタクリレート＋１，３−ジグリセロレートジメタクリレートまたはＨＥＭＡ＋ＴＥＧＤＭＡいずれか）を、合計で２ｍｌの０．５ｍＭのペプチド濃度溶液となるように加えた。
【００８８】
６ウェルプレート中のペプチド−ポリマー配合物の被覆のための一般手法：
Ｃｅｌｌｂｉｎｄ（登録商標）（ニューヨーク州、コーニング所在のCorning Incorporated）処理したポリスチレン製６ウェルプレート（６−ｗｐ）を包装から取り出し、連続的に窒素ガスでパージした大型の窒素パージボックス内に入れた。パージボックス内の湿度レベルは、配合物の分配前に３０％未満であった。半自動ピペッターを使用して、各ウェル中に２６μＬを分配した。配合物をウェル表面に広げた後、硬化前に、５分間に亘り２５から３０ｉｎ Ｈｇの真空乾燥器内で溶媒のエタノールを除去した。
【００８９】
ペプチド−ポリマー被覆をＵＶ硬化するための手法
INPRO Technologies, Inc.からの「Xenon Model RC-801高強度パルス化紫外線（ＵＶ）硬化システム」を硬化に使用した。硬化中に不活性雰囲気（被覆のための）を生成するために、プレートは窒素で常にパージされていた。硬化時間を設定した（すなわち、この研究において６０秒間）。
【００９０】
ペプチド−ポリマー被覆プレートの洗浄のための手法：
ペプチド−アクリレート比較のＵＶ硬化後、１〜５ｍｌのエタノールをプレートのウェル中に分配し、振盪器に配置して、どのような残留モノマーも除去するために、３０〜６０分間に亘り撹拌した。６ウェルプレートを18 Mega OHM水で５回濯ぎ、次いで、一晩乾燥させ、細胞試験のために提出した。
【００９１】
ヒト胚性幹細胞を培養するための手法：
Ｈ７ｈＥＳ細胞がGeron Corporationとの提携契約の一部として提供され、これをそのプロトコルにしたがって培養した。手短に言うと、細胞を、ＭＧ−被覆ＴＣＴフラスコ内の既知組成培地（Ｘ−Ｖｉｖｏ−１０、８０ｎｇ／ｍｌのｈｂＦＧＦ、５ｎｇ／ｍｌのｈＴＧＦ−β１）中で培養した。Geronの継代培養手法を使用して、細胞を、１０×１０6細胞／Ｔ７５フラスコの播種密度で４〜５日毎に継代培養した。実験に関して、細胞を既知組成培地中で１×１０6／ウェルの密度で６ウェルプレート内に播種した。細胞形態を毎日観察した。細胞数、コロニー形態、および分布の目視評価のために、４日目に細胞をクリスタル・バイオレットで染色した。
【００９２】
神経前駆幹細胞を培養するための手法：
Millipore（カリフォルニア州、テメキュラ所在）からのＲｅＮｃｅｌｌ ＶＭ細胞を、ラミニン被覆Ｔ７５ｃｍ２組織培養フラスコ（ニューヨーク州、コーニング）上で、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２および２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（カリフォルニア州、テメキュラ所在のmillipore）を含有するＲｅＮｃｅｌｌ ＮＳＣ維持培地（カリフォルニア州、テメキュラ所在のmillipore）中において規定通りに伸長させた。未分化細胞の維持と増殖のために、培地を一日おきに替えた。培養中の全ての細胞は、９５％空気／５％ＣＯ2の湿潤雰囲気内において３７℃に維持した。細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（カリフォルニア州、テメキュラ所在のmillipore）を使用して週に一度継代培養した。
【００９３】
未分化神経前駆幹細胞は、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２および２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含有するＲｅＮｃｅｌｌ ＮＳＣ維持培地中、ウェル当たり１５００００細胞で６ウェルプレート内に播種した。播種から２４時間後、細胞付着および細胞形態を、Ｚｉｅｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ倒立顕微鏡を使用して評価した。４日間に亘り各表面で細胞を増殖させた。播種から２日目と３日目に、細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ処理によって表面から分離させ、計数した。倍増時間を、増殖曲線の対数期で計算した（以前は、播種後２日目と３日目の間で推測された）。ラミニン被覆ＴＣＴマイクロプレートを、神経前駆幹細胞増殖に関する陽性対照として使用した。神経前駆幹細胞を、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２および２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含有するＲｅＮｃｅｌｌ ＮＳＣ維持培地中、ウェル当たり２５００００細胞で６ウェルプレート内に播種し、９５％空気／５％ＣＯ2のにおいて３７℃で培養した。翌日、各ウェルから培地を除去し、ＦＧＦ−２およびＥＧＦを含有しない新しいＲｅＮｃｅｌｌ ＮＳＣ維持培地と交換することによって、分化を開始した。培地を１０日間に亘り２〜３日毎にＲｅＮｃｅｌｌ ＮＳＣ維持培地と交換した。
【００９４】
図４および５は、本発明のペプチド−ポリマー細胞培養表面の実施の形態と比べた、対照表面Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）およびＳｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）上で培養したＨ７ヒト胚性幹細胞の顕微鏡写真を示している。ペプチド−ポリマーは、培養の４日後に対照表面に見られたものに近い、ヒト幹細胞の増殖および形態を示した。
【００９５】
図６Ａ〜Ｈは、Corning Incorporatedからのｌａｍｉｎｉｎ（商標）表面上（図６ＡおよびＥ）、ＨＥＭＡおよびＴＥＧＤＭＡにより製造された環状官能化ＲＧＤペプチド表面上（図６ＢおよびＦ）、グリセロールメタクリレートおよび１，３−ジグリセロレートジメタクリレートにより製造された環状官能化ＲＧＤペプチド（環状配列番号34）表面上（図６ＣおよびＧ）、並びにCorning IncorporatedからのＳｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）上（図６ＤおよびＨ）で増殖した、培養の１日後（図６Ａ〜Ｄ）および培養の３日後（図６Ｅ〜Ｈ）の神経前駆細胞の顕微鏡写真を示している。
【００９６】
それゆえ、ペプチド−ポリマー細胞培養物品およびその製造方法に実施の形態が開示されている。ここに記載されたアレイ、組成物、キット、物品および方法は、開示されたものとは違う実施の形態により実施できることが当業者には認識されるであろう。開示された実施の形態は、制限ではなく、説明の目的で提示されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
官能化ペプチドモノマーであって、該官能化ペプチドモノマーが、式：Ｘａａn（Ａm）−Ｓy−Ｚ−Ａm1により記載することができ、ここで、Ｘａａnは任意のアミノ酸であり、ｎは０から６までの整数であり、Ａは重合部分であり、ｍは０から３までの整数であり、ｍ１は０から３までの整数であり、Ｓyはスペーサであり、ｙは０から３０までの整数であり、Ｚは細胞接着性ペプチドである、官能化ペプチドモノマー。
【請求項２】
前記細胞接着性ペプチドが、配列：KGGGQKCIVQTTSWSQCSKS (配列番号1); GGGQKCIVQTTSWSQCSKS(配列番号2); KYGLALERKDHSG (配列番号3); YGLALERKDHSG (配列番号4); KGGSINNNRWHSIYITRFGNMGS (配列番号5); GGSINNNRWHSIYITRFGNMGS (配列番号6); KGGTWYKIAFQRNRK (配列番号7); GGTWYKIAFQRNRK (配列番号8); KGGTSIKIRGTYSER (配列番号9); GGTSIKIRGTYSER (配列番号10); KYGTDIRVTLNRLNTF (配列番号11); YGTDIRVTLNRLNTF (配列番号12); KYGSETTVKYIFRLHE (配列番号13); YGSETTVKYIFRLHE(配列番号14); KYGKAFDITYVRLKF (配列番号15); YGKAFDITYVRLKF(配列番号16); KYGAASIKVAVSADR (配列番号17); YGAASIKVAVSADR(配列番号18); KGGNGEPRGDTYRAY(配列番号19); GGNGEPRGDTYRAY (配列番号20) CGGNGEPRGDTYRAY (配列番号21); GGNGEPRGDTRAY (配列番号22); KYGRKRLQVQLSIRT (配列番号23); YGRKRLQVQLSIRT(配列番号24); KGGRNIAEIIKDI (配列番号25); GGRNIAEIIKDI (配列番号26); KGGPQVTRGDVFTMP (配列番号27); GGPQVTRGDVFTMP(配列番号28); GGPQVTRGDVFTMPK (配列番号29); GRGDSPK (配列番号30); KGGAVTGRGDSPASS(配列番号31); GGAVTGRGDSPASS (配列番号32); YaalPQVTRGNVFTMP (配列番号33); RGDYK (配列番号34)、またはそれらの組合せを含むことを特徴とする請求項１記載の官能化ペプチドモノマー。
【請求項３】
前記細胞接着性ペプチドが、KGGPQVTRGDVFTMP (配列番号27)またはGGPQVTRGDVFTMP(配列番号28)を含むことを特徴とする請求項１記載の官能化ペプチドモノマー。
【請求項４】
前記重合部分がメタクリル酸であることを特徴とする請求項３記載の官能化ペプチドモノマー。
【請求項５】
前記スペーサがポリエチレンオキシドであることを特徴とする請求項１記載の官能化ペプチドモノマー。
【請求項１】
官能化ペプチドモノマーであって、該官能化ペプチドモノマーが、式：Ｘａａn（Ａm）−Ｓy−Ｚ−Ａm1により記載することができ、ここで、Ｘａａnは任意のアミノ酸であり、ｎは０から６までの整数であり、Ａは重合部分であり、ｍは０から３までの整数であり、ｍ１は０から３までの整数であり、Ｓyはスペーサであり、ｙは０から３０までの整数であり、Ｚは細胞接着性ペプチドである、官能化ペプチドモノマー。
【請求項２】
前記細胞接着性ペプチドが、配列：KGGGQKCIVQTTSWSQCSKS (配列番号1); GGGQKCIVQTTSWSQCSKS(配列番号2); KYGLALERKDHSG (配列番号3); YGLALERKDHSG (配列番号4); KGGSINNNRWHSIYITRFGNMGS (配列番号5); GGSINNNRWHSIYITRFGNMGS (配列番号6); KGGTWYKIAFQRNRK (配列番号7); GGTWYKIAFQRNRK (配列番号8); KGGTSIKIRGTYSER (配列番号9); GGTSIKIRGTYSER (配列番号10); KYGTDIRVTLNRLNTF (配列番号11); YGTDIRVTLNRLNTF (配列番号12); KYGSETTVKYIFRLHE (配列番号13); YGSETTVKYIFRLHE(配列番号14); KYGKAFDITYVRLKF (配列番号15); YGKAFDITYVRLKF(配列番号16); KYGAASIKVAVSADR (配列番号17); YGAASIKVAVSADR(配列番号18); KGGNGEPRGDTYRAY(配列番号19); GGNGEPRGDTYRAY (配列番号20) CGGNGEPRGDTYRAY (配列番号21); GGNGEPRGDTRAY (配列番号22); KYGRKRLQVQLSIRT (配列番号23); YGRKRLQVQLSIRT(配列番号24); KGGRNIAEIIKDI (配列番号25); GGRNIAEIIKDI (配列番号26); KGGPQVTRGDVFTMP (配列番号27); GGPQVTRGDVFTMP(配列番号28); GGPQVTRGDVFTMPK (配列番号29); GRGDSPK (配列番号30); KGGAVTGRGDSPASS(配列番号31); GGAVTGRGDSPASS (配列番号32); YaalPQVTRGNVFTMP (配列番号33); RGDYK (配列番号34)、またはそれらの組合せを含むことを特徴とする請求項１記載の官能化ペプチドモノマー。
【請求項３】
前記細胞接着性ペプチドが、KGGPQVTRGDVFTMP (配列番号27)またはGGPQVTRGDVFTMP(配列番号28)を含むことを特徴とする請求項１記載の官能化ペプチドモノマー。
【請求項４】
前記重合部分がメタクリル酸であることを特徴とする請求項３記載の官能化ペプチドモノマー。
【請求項５】
前記スペーサがポリエチレンオキシドであることを特徴とする請求項１記載の官能化ペプチドモノマー。
【図２】
【図６】
【図６】
【公表番号】特表２０１３−５００９８０（Ｐ２０１３−５００９８０Ａ）
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２３０１７（Ｐ２０１２−５２３０１７）
【出願日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４３６１０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１４５９４
【国際公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【出願人】（３９７０６８２７４）コーニング インコーポレイテッド (1,222)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４３６１０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１４５９４
【国際公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【出願人】（３９７０６８２７４）コーニング インコーポレイテッド (1,222)
【Ｆターム（参考）】
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