ポリ−３−ヒドロキシ酪酸の抽出法
【構成】 テトラヒドロフランまたはその誘導体を抽出溶剤として菌体からポリ−３−ヒドロキシ酪酸を抽出する。
【効果】 安全で、入手しやすく、しかも安価な抽出溶剤を用い、乾燥菌体あるいは湿菌体の如何を問わず、これら菌体からポリ−３−ヒドロキシ酪酸を高収率で抽出できる。しかも抽出後の溶液を室温に冷却するだけでポリ−３−ヒドロキシ酪酸をゲル化あるいは析出させることが出来、容易に回収することが可能である。
【効果】 安全で、入手しやすく、しかも安価な抽出溶剤を用い、乾燥菌体あるいは湿菌体の如何を問わず、これら菌体からポリ−３−ヒドロキシ酪酸を高収率で抽出できる。しかも抽出後の溶液を室温に冷却するだけでポリ−３−ヒドロキシ酪酸をゲル化あるいは析出させることが出来、容易に回収することが可能である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、菌体内に蓄積した３−ヒドロキシ酪酸単位からなるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下ＰＨＢと記す）を菌体から抽出する方法に関する。更に詳しくは、テトラヒドロフランまたはその誘導体を抽出溶剤として用い、菌体からＰＨＢを溶剤抽出する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ポリ−３−ヒドロキシ酪酸は、数多くの微生物のエネルギー貯蔵物質として菌体内部に蓄積され、生物分解性と生物適合性をもつ熱可塑性高分子である。近年、合成プラスチックが環境汚染や資源循環の観点から深刻な社会問題となっている。それ故、ＰＨＢは、“クリーン”プラスチックとして注目され、使用期間が比較的短い商品の包装や手術糸、骨折固定用材などの医療材料および医薬や農薬を徐々に放出する徐放性システムなど多方面への応用可能な有用な天然高分子であり長年にわたり期待されている。
【０００３】ＰＨＢの製造は、細菌例えばシュードモナス（Pseudomonas ）属、アルカリゲネス（Alcaligenes ）属、プロトモナス（Protomonas）属、アゾトバクター（ Azotobacter）属、ノカルジア（Nocardia）属等の細菌を培養し菌体内にＰＨＢを顆粒状に蓄積せしめた後、菌体を培養液より集菌し、その菌体から分離精製して行われる。
【０００４】菌体からのＰＨＢの分離精製は、菌体と抽出溶剤とを接触させ菌体よりＰＨＢを抽出する方法と、菌体のＰＨＢ以外の成分を酵素などで取り除く方法が知られている。溶剤抽出に従来用いられている溶剤としてクロロホルム（特開昭57-65193号）、塩化メチレン（特開昭57-65193号）、ピリジン（米国特許第3036959 ）などが知られている。しかし、これらの溶剤では、乾燥菌体からしか抽出できず湿菌体からＰＨＢを抽出できないため培養液から得られた菌体を乾燥する工程が必要となってくる。また、抽出後得られた抽出液に、メタノール等のＰＨＢを溶解しない溶剤を添加しＰＨＢを析出させなければならない。その際、そのＰＨＢ非溶解性溶剤を多量に必要とし、非常に大きな製造設備が必要となり経済的な方法とはいい難い。特開平2-69187 には溶剤による湿菌体からのＰＨＢの抽出方法が記載されているが、ここで用いられる溶剤はいずれも特殊なものであり経済性等の点で工業的に不十分である。
【０００５】一方、溶剤抽出法による精製では菌株による差異が見られないのに比べ、ＰＨＢ以外の成分を酵素などで可溶化して取り除く精製法では湿菌体を使用することができるが、酵素、界面活性剤等の効果が菌株により著しく異なり、高純度のＰＨＢを得るためには数多くの工程が必要になる場合がある 。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来技術における上記したような課題を解決し、安価で入手しやすい溶剤を用いて湿菌体のままでＰＨＢを抽出でき、しかもその抽出溶液からＰＨＢを容易に得ることができる抽出方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等は、安価で入手しやすい溶剤を用いて湿菌体のままでＰＨＢを抽出でき、しかもその抽出溶液からＰＨＢを容易に得ることができる抽出方法について鋭意検討を重ねた結果、意外にも室温ではＰＨＢをほとんど溶解しないテトラヒドロフラン及びその誘導体が、６０℃以上、好ましくは８０℃以上ではＰＨＢの良溶剤となってＰＨＢを高濃度に溶解することを見出した。また、これらの溶剤が乾燥菌体だけでなく、湿菌体からも高収率で抽出可能であることも見いだした。更に、溶解したＰＨＢは溶解液を冷却することでほとんど全て析出またはゲル化し、多量のＰＨＢ非溶解性溶剤を用いずとも高純度のＰＨＢが得られることを見いだした。本発明に使用される抽出溶剤はテトラヒドロフラン及びその誘導体がある。テトラヒドロフランの誘導体としては、２−メチルテトラヒドロフラン、３−メチルテトラヒドロフランなどが挙げられる。これらの溶剤のうち、テトラヒドロフランおよび３−メチルテトラヒドロフランが本発明の抽出溶剤として特に好ましい。
【０００８】すなわち、本発明は菌株を問わず、ＰＨＢを含有する菌体よりＰＨＢを抽出精製する方法において、テトラヒドロフランまたはその誘導体を抽出溶剤として用いることを特徴とするＰＨＢの抽出法に関するものである。また、本発明におけるＰＨＢを含有する菌体とは、ＰＨＢを菌体内に蓄積した細菌細胞であり、このような細菌として例えば、アゾトバクター ビネランディー（Azotobacter vinelandii）、アルカリゲネス ユウトロフス（Alcaligenes eutrophus ）、プロトモナス エクストルクエンス（Protomonas extorquens ）等に属するものが挙げられる。その菌体は上記の細菌をグルコース、フラクトース、メタノール、酢酸、酪酸などの炭素源、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、ペプトンなどの窒素源、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム等のリン酸源およびその他細菌の増殖に必要なミネラル、微量栄養源を含む培地で、炭素源以外の菌体増殖に必須の栄養素などが増殖の制限因子となるようにして好気的に培養し、その培養液から遠心分離等の方法で集菌して得られる。もちろん、その菌体を更に乾燥したもの、またはメタノール、アセトン等の脂質溶剤で洗浄乾燥したものも菌体として用いることができる。
【０００９】本発明の方法により実際に菌体から抽出溶剤を用いてＰＨＢを抽出する際、その抽出溶剤が、菌体を除く全液体に対して７０重量％以上含有されていれば良い。すなわち、３０重量％未満の範囲であれば、湿菌体により持ち込まれる水のようなＰＨＢ非溶解性溶剤が含まれていても良い。ＰＨＢ非溶解性溶剤の割合が３０重量％を超える場合、ＰＨＢの溶解性が低くなったり、ＰＨＢ溶液の粘度が高くなったり、ＰＨＢの劣化をもたらしたりするおそれがあるので好ましくない。抽出溶剤は、最終的にＰＨＢ濃度が３〜１０％になるように加えるのが適当である。その抽出温度は、６０℃以上、好ましくは８０℃以上である。
【００１０】純粋なＰＨＢを得るために、ＰＨＢを含有する菌体を、好ましくは発酵槽溶液の遠心分離によって発酵槽溶液から単離する。単離された菌体を本発明による抽出剤の１つ中で攪はんし、６０〜１３０℃の温度に加熱し、２０〜８０分この温度で抽出する。この際、ＰＨＢ濃度は３〜１０％に、水分濃度は３０％を超えないようにする。次いでＰＨＢを溶解含有した抽出溶剤を不溶性菌体と分離する。この際、ＰＨＢを溶解含有した抽出溶剤は加圧状態であり、分離を行うときは加圧状態で行っても良いが、６０℃まで冷却した後分離しても良い。これは、６０℃に保温してあれば数時間、少なくとも２時間は溶解したＰＨＢが析出してこないからである。分離は常法で行うことができる。この場合加熱された濾過器を使用するのが有利である。というのは分離がこの方法で問題なく簡単に行われるからである。その後ＰＨＢを含有する分離された溶液を室温程度に冷却し、溶解したＰＨＢを完全にゲル化または析出させる。ＰＨＢの単離は、冷却したＰＨＢ溶解溶液から液体を濾過、遠心分離など通常の方法で行われる。単離されたＰＨＢを水、メタノール、エタノール、アセトン、またはその混合物で後洗浄し、次いで乾燥する。ＰＨＢの乾燥は、常法、たとえば気流乾燥、真空乾燥などで行われる。
【００１１】
【実施例】次に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
実施例１プロトモナス エクストルクエンス (Protomonas extorquens) Ｋ（微工研菌寄第８３９５号）をメタノールを唯一の炭素源とする完全合成培地を用いて、窒素供給を菌体増殖の制限因子になるようにして回分培養を行い、その発酵槽溶液の遠心分離によって湿菌体を得た。この湿菌体は、水分含有率８２重量％、菌体乾燥重量に対するＰＨＢ含有率５９．５％であり、菌体中ＰＨＢの分子量は２×１０5 であった。この湿菌体２２．９ｇとテトラヒドロフラン５０ｍｌとを耐圧管中に入れ、１２０℃で６０分処理した。その後６０℃に冷却した後、６０℃に加温した吸引濾過器で不溶性菌体を分離した後、溶液を室温まで冷却した。冷却によってＰＨＢは完全にゲル化して沈澱した。沈澱したゲルを吸引濾取した後、メタノールを加えて十分に攪はんして洗浄した。次いで、ゲルを吸引濾過、乾燥し１．８８ｇ（理論値の７７％に相当する）のＰＨＢ粉末を得た。得られた粉末の純度は約１００％であり、分子量は１．５×１０5 であった。
【００１２】実施例２実施例１と同様な手法で得られた水分含有率６７重量％、菌体乾燥重量に対するＰＨＢ含有率５９．５％、菌体中ＰＨＢの分子量が２×１０5 である湿菌体１５．６ｇと３−メチルテトラヒドロフラン５０ｍｌとを耐圧管に入れ、１２０℃で６０分処理した。その後６０℃に冷却した後、６０℃に加温した吸引濾過器で不溶性菌体を分離した後、溶液を室温まで冷却した。この場合ＰＨＢは完全にゲル化し沈澱した。その沈澱したゲルを吸引濾取した後、メタノールを加え十分に攪はんして洗浄した。次いで、ゲルを吸引濾過、乾燥し、２．４８ｇ（理論値の８１％に相当する）のＰＨＢ粉末を得た。得られた粉末の純度は約１００％であり、分子量は１．６×１０5 であった。
【００１３】実施例３実施例１と同様な湿菌体をテトラヒドロフランを抽出溶剤に用い、実施例１で示した抽出操作を８０℃で行い、その後６０℃に冷却した後、６０℃に加温した吸引濾過器で不溶性菌体を分離した後、溶液を室温まで冷却した。冷却によって沈澱したゲルを吸引濾取した後、メタノールを加え十分に攪はんして洗浄した。次いで吸引濾過、乾燥し１．９２ｇのＰＨＢ（理論値の７８％に相当する）の粉末を得た。その粉末の純度は約１００％であり、分子量は１．８×１０5 であった。
【００１４】実施例４プロトモナス エクストルクエンス (Protomonas extorquens) Ｋ（微工研菌寄第８３９５号）を実施例１で示したのと同様にメタノールを炭素源とし、窒素供給を菌体増殖の制限因子になるようにして回分培養を行い、その発酵槽溶液の遠心分離によって得られた湿菌体を凍結乾燥し、菌体乾燥重量に対するＰＨＢ含有率が４４％、菌体中ＰＨＢの分子量が１．４×１０5 である乾燥菌体を得た。この乾燥菌体２．５ｇを２０ｍｌのテトラヒドロフランに懸濁し、１２０℃、６０分抽出を行った。その後６０℃に冷却した後、６０℃に加温した吸引濾過器で不溶性菌体を分離した後、溶液を室温まで冷却した。この冷却によってＰＨＢは完全にゲル化して沈澱した。沈澱したゲルを吸引濾取した後、メタノールを加え十分に攪はんして洗浄した。次いで、ゲルを吸引濾過、乾燥し、０．９７ｇ（理論値の８８％に相当する）のＰＨＢ粉末を得た。得られた粉末の純度は９８％であり、分子量は１．３×１０5 であった。
【００１５】実施例５アルカリゲネス ユウトロフス (Alcaligenes eutrophus) NCIB 11509をグルコースを炭素源とし、窒素供給を菌体増殖の制限因子になるようにして好気的に回分培養を行い、その発酵槽溶液の遠心分離によって得られた湿菌体を凍結乾燥し、菌体乾燥重量に対するＰＨＢ含有率が５３％、菌体中ＰＨＢの分子量が３．０×１０5 である乾燥菌体を得た。この乾燥菌体３．０ｇをテトラヒドロフラン４０ｍｌに懸濁し、１２０℃、６０分抽出を行った。その後６０℃に冷却した後、６０℃に加温した吸引濾過器で不溶性菌体を分離した後、溶液を室温まで冷却した。この冷却によってＰＨＢは完全にゲル化して沈澱した。沈澱したゲルを吸引濾取した後、メタノールを加え十分に攪はんして洗浄した。次いで、ゲルを吸引濾過、乾燥し、１．３５ｇ（理論値の８５％に相当する）のＰＨＢ粉末を得た。得られた粉末の純度は９９％であり、分子量は２．５×１０5 であった。
【００１６】実施例におけるＰＨＢの分子量の測定は、ゲルクロマトグラフィー（ShodexGPC K, 90 cmカラム、溶媒：クロロホルム, 1.0ml/min 、ポリスチレンスタンダード、ＲＩ検出）によって行った。また菌体のＰＨＢ含有率、得られたＰＨＢの純度の測定は、ＰＨＢをメチルエステル化してガスクロマトグラフィーにより行った。水分含有率は、乾燥減量により測定した。
【００１７】
【発明の効果】本発明により、安全で、入手が容易で、しかも安価な溶剤を用いて乾燥菌体、湿菌体のいずれからも少なくとも９８％の極めて高純度のＰＨＢを良好な収率で取得可能となる。また、抽出後、ＰＨＢ溶解溶液を冷却するのみで溶解したＰＨＢのほとんど全てがゲル化または析出し、容易に回収できる。
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、菌体内に蓄積した３−ヒドロキシ酪酸単位からなるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下ＰＨＢと記す）を菌体から抽出する方法に関する。更に詳しくは、テトラヒドロフランまたはその誘導体を抽出溶剤として用い、菌体からＰＨＢを溶剤抽出する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ポリ−３−ヒドロキシ酪酸は、数多くの微生物のエネルギー貯蔵物質として菌体内部に蓄積され、生物分解性と生物適合性をもつ熱可塑性高分子である。近年、合成プラスチックが環境汚染や資源循環の観点から深刻な社会問題となっている。それ故、ＰＨＢは、“クリーン”プラスチックとして注目され、使用期間が比較的短い商品の包装や手術糸、骨折固定用材などの医療材料および医薬や農薬を徐々に放出する徐放性システムなど多方面への応用可能な有用な天然高分子であり長年にわたり期待されている。
【０００３】ＰＨＢの製造は、細菌例えばシュードモナス（Pseudomonas ）属、アルカリゲネス（Alcaligenes ）属、プロトモナス（Protomonas）属、アゾトバクター（ Azotobacter）属、ノカルジア（Nocardia）属等の細菌を培養し菌体内にＰＨＢを顆粒状に蓄積せしめた後、菌体を培養液より集菌し、その菌体から分離精製して行われる。
【０００４】菌体からのＰＨＢの分離精製は、菌体と抽出溶剤とを接触させ菌体よりＰＨＢを抽出する方法と、菌体のＰＨＢ以外の成分を酵素などで取り除く方法が知られている。溶剤抽出に従来用いられている溶剤としてクロロホルム（特開昭57-65193号）、塩化メチレン（特開昭57-65193号）、ピリジン（米国特許第3036959 ）などが知られている。しかし、これらの溶剤では、乾燥菌体からしか抽出できず湿菌体からＰＨＢを抽出できないため培養液から得られた菌体を乾燥する工程が必要となってくる。また、抽出後得られた抽出液に、メタノール等のＰＨＢを溶解しない溶剤を添加しＰＨＢを析出させなければならない。その際、そのＰＨＢ非溶解性溶剤を多量に必要とし、非常に大きな製造設備が必要となり経済的な方法とはいい難い。特開平2-69187 には溶剤による湿菌体からのＰＨＢの抽出方法が記載されているが、ここで用いられる溶剤はいずれも特殊なものであり経済性等の点で工業的に不十分である。
【０００５】一方、溶剤抽出法による精製では菌株による差異が見られないのに比べ、ＰＨＢ以外の成分を酵素などで可溶化して取り除く精製法では湿菌体を使用することができるが、酵素、界面活性剤等の効果が菌株により著しく異なり、高純度のＰＨＢを得るためには数多くの工程が必要になる場合がある 。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来技術における上記したような課題を解決し、安価で入手しやすい溶剤を用いて湿菌体のままでＰＨＢを抽出でき、しかもその抽出溶液からＰＨＢを容易に得ることができる抽出方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等は、安価で入手しやすい溶剤を用いて湿菌体のままでＰＨＢを抽出でき、しかもその抽出溶液からＰＨＢを容易に得ることができる抽出方法について鋭意検討を重ねた結果、意外にも室温ではＰＨＢをほとんど溶解しないテトラヒドロフラン及びその誘導体が、６０℃以上、好ましくは８０℃以上ではＰＨＢの良溶剤となってＰＨＢを高濃度に溶解することを見出した。また、これらの溶剤が乾燥菌体だけでなく、湿菌体からも高収率で抽出可能であることも見いだした。更に、溶解したＰＨＢは溶解液を冷却することでほとんど全て析出またはゲル化し、多量のＰＨＢ非溶解性溶剤を用いずとも高純度のＰＨＢが得られることを見いだした。本発明に使用される抽出溶剤はテトラヒドロフラン及びその誘導体がある。テトラヒドロフランの誘導体としては、２−メチルテトラヒドロフラン、３−メチルテトラヒドロフランなどが挙げられる。これらの溶剤のうち、テトラヒドロフランおよび３−メチルテトラヒドロフランが本発明の抽出溶剤として特に好ましい。
【０００８】すなわち、本発明は菌株を問わず、ＰＨＢを含有する菌体よりＰＨＢを抽出精製する方法において、テトラヒドロフランまたはその誘導体を抽出溶剤として用いることを特徴とするＰＨＢの抽出法に関するものである。また、本発明におけるＰＨＢを含有する菌体とは、ＰＨＢを菌体内に蓄積した細菌細胞であり、このような細菌として例えば、アゾトバクター ビネランディー（Azotobacter vinelandii）、アルカリゲネス ユウトロフス（Alcaligenes eutrophus ）、プロトモナス エクストルクエンス（Protomonas extorquens ）等に属するものが挙げられる。その菌体は上記の細菌をグルコース、フラクトース、メタノール、酢酸、酪酸などの炭素源、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、ペプトンなどの窒素源、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム等のリン酸源およびその他細菌の増殖に必要なミネラル、微量栄養源を含む培地で、炭素源以外の菌体増殖に必須の栄養素などが増殖の制限因子となるようにして好気的に培養し、その培養液から遠心分離等の方法で集菌して得られる。もちろん、その菌体を更に乾燥したもの、またはメタノール、アセトン等の脂質溶剤で洗浄乾燥したものも菌体として用いることができる。
【０００９】本発明の方法により実際に菌体から抽出溶剤を用いてＰＨＢを抽出する際、その抽出溶剤が、菌体を除く全液体に対して７０重量％以上含有されていれば良い。すなわち、３０重量％未満の範囲であれば、湿菌体により持ち込まれる水のようなＰＨＢ非溶解性溶剤が含まれていても良い。ＰＨＢ非溶解性溶剤の割合が３０重量％を超える場合、ＰＨＢの溶解性が低くなったり、ＰＨＢ溶液の粘度が高くなったり、ＰＨＢの劣化をもたらしたりするおそれがあるので好ましくない。抽出溶剤は、最終的にＰＨＢ濃度が３〜１０％になるように加えるのが適当である。その抽出温度は、６０℃以上、好ましくは８０℃以上である。
【００１０】純粋なＰＨＢを得るために、ＰＨＢを含有する菌体を、好ましくは発酵槽溶液の遠心分離によって発酵槽溶液から単離する。単離された菌体を本発明による抽出剤の１つ中で攪はんし、６０〜１３０℃の温度に加熱し、２０〜８０分この温度で抽出する。この際、ＰＨＢ濃度は３〜１０％に、水分濃度は３０％を超えないようにする。次いでＰＨＢを溶解含有した抽出溶剤を不溶性菌体と分離する。この際、ＰＨＢを溶解含有した抽出溶剤は加圧状態であり、分離を行うときは加圧状態で行っても良いが、６０℃まで冷却した後分離しても良い。これは、６０℃に保温してあれば数時間、少なくとも２時間は溶解したＰＨＢが析出してこないからである。分離は常法で行うことができる。この場合加熱された濾過器を使用するのが有利である。というのは分離がこの方法で問題なく簡単に行われるからである。その後ＰＨＢを含有する分離された溶液を室温程度に冷却し、溶解したＰＨＢを完全にゲル化または析出させる。ＰＨＢの単離は、冷却したＰＨＢ溶解溶液から液体を濾過、遠心分離など通常の方法で行われる。単離されたＰＨＢを水、メタノール、エタノール、アセトン、またはその混合物で後洗浄し、次いで乾燥する。ＰＨＢの乾燥は、常法、たとえば気流乾燥、真空乾燥などで行われる。
【００１１】
【実施例】次に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
実施例１プロトモナス エクストルクエンス (Protomonas extorquens) Ｋ（微工研菌寄第８３９５号）をメタノールを唯一の炭素源とする完全合成培地を用いて、窒素供給を菌体増殖の制限因子になるようにして回分培養を行い、その発酵槽溶液の遠心分離によって湿菌体を得た。この湿菌体は、水分含有率８２重量％、菌体乾燥重量に対するＰＨＢ含有率５９．５％であり、菌体中ＰＨＢの分子量は２×１０5 であった。この湿菌体２２．９ｇとテトラヒドロフラン５０ｍｌとを耐圧管中に入れ、１２０℃で６０分処理した。その後６０℃に冷却した後、６０℃に加温した吸引濾過器で不溶性菌体を分離した後、溶液を室温まで冷却した。冷却によってＰＨＢは完全にゲル化して沈澱した。沈澱したゲルを吸引濾取した後、メタノールを加えて十分に攪はんして洗浄した。次いで、ゲルを吸引濾過、乾燥し１．８８ｇ（理論値の７７％に相当する）のＰＨＢ粉末を得た。得られた粉末の純度は約１００％であり、分子量は１．５×１０5 であった。
【００１２】実施例２実施例１と同様な手法で得られた水分含有率６７重量％、菌体乾燥重量に対するＰＨＢ含有率５９．５％、菌体中ＰＨＢの分子量が２×１０5 である湿菌体１５．６ｇと３−メチルテトラヒドロフラン５０ｍｌとを耐圧管に入れ、１２０℃で６０分処理した。その後６０℃に冷却した後、６０℃に加温した吸引濾過器で不溶性菌体を分離した後、溶液を室温まで冷却した。この場合ＰＨＢは完全にゲル化し沈澱した。その沈澱したゲルを吸引濾取した後、メタノールを加え十分に攪はんして洗浄した。次いで、ゲルを吸引濾過、乾燥し、２．４８ｇ（理論値の８１％に相当する）のＰＨＢ粉末を得た。得られた粉末の純度は約１００％であり、分子量は１．６×１０5 であった。
【００１３】実施例３実施例１と同様な湿菌体をテトラヒドロフランを抽出溶剤に用い、実施例１で示した抽出操作を８０℃で行い、その後６０℃に冷却した後、６０℃に加温した吸引濾過器で不溶性菌体を分離した後、溶液を室温まで冷却した。冷却によって沈澱したゲルを吸引濾取した後、メタノールを加え十分に攪はんして洗浄した。次いで吸引濾過、乾燥し１．９２ｇのＰＨＢ（理論値の７８％に相当する）の粉末を得た。その粉末の純度は約１００％であり、分子量は１．８×１０5 であった。
【００１４】実施例４プロトモナス エクストルクエンス (Protomonas extorquens) Ｋ（微工研菌寄第８３９５号）を実施例１で示したのと同様にメタノールを炭素源とし、窒素供給を菌体増殖の制限因子になるようにして回分培養を行い、その発酵槽溶液の遠心分離によって得られた湿菌体を凍結乾燥し、菌体乾燥重量に対するＰＨＢ含有率が４４％、菌体中ＰＨＢの分子量が１．４×１０5 である乾燥菌体を得た。この乾燥菌体２．５ｇを２０ｍｌのテトラヒドロフランに懸濁し、１２０℃、６０分抽出を行った。その後６０℃に冷却した後、６０℃に加温した吸引濾過器で不溶性菌体を分離した後、溶液を室温まで冷却した。この冷却によってＰＨＢは完全にゲル化して沈澱した。沈澱したゲルを吸引濾取した後、メタノールを加え十分に攪はんして洗浄した。次いで、ゲルを吸引濾過、乾燥し、０．９７ｇ（理論値の８８％に相当する）のＰＨＢ粉末を得た。得られた粉末の純度は９８％であり、分子量は１．３×１０5 であった。
【００１５】実施例５アルカリゲネス ユウトロフス (Alcaligenes eutrophus) NCIB 11509をグルコースを炭素源とし、窒素供給を菌体増殖の制限因子になるようにして好気的に回分培養を行い、その発酵槽溶液の遠心分離によって得られた湿菌体を凍結乾燥し、菌体乾燥重量に対するＰＨＢ含有率が５３％、菌体中ＰＨＢの分子量が３．０×１０5 である乾燥菌体を得た。この乾燥菌体３．０ｇをテトラヒドロフラン４０ｍｌに懸濁し、１２０℃、６０分抽出を行った。その後６０℃に冷却した後、６０℃に加温した吸引濾過器で不溶性菌体を分離した後、溶液を室温まで冷却した。この冷却によってＰＨＢは完全にゲル化して沈澱した。沈澱したゲルを吸引濾取した後、メタノールを加え十分に攪はんして洗浄した。次いで、ゲルを吸引濾過、乾燥し、１．３５ｇ（理論値の８５％に相当する）のＰＨＢ粉末を得た。得られた粉末の純度は９９％であり、分子量は２．５×１０5 であった。
【００１６】実施例におけるＰＨＢの分子量の測定は、ゲルクロマトグラフィー（ShodexGPC K, 90 cmカラム、溶媒：クロロホルム, 1.0ml/min 、ポリスチレンスタンダード、ＲＩ検出）によって行った。また菌体のＰＨＢ含有率、得られたＰＨＢの純度の測定は、ＰＨＢをメチルエステル化してガスクロマトグラフィーにより行った。水分含有率は、乾燥減量により測定した。
【００１７】
【発明の効果】本発明により、安全で、入手が容易で、しかも安価な溶剤を用いて乾燥菌体、湿菌体のいずれからも少なくとも９８％の極めて高純度のＰＨＢを良好な収率で取得可能となる。また、抽出後、ＰＨＢ溶解溶液を冷却するのみで溶解したＰＨＢのほとんど全てがゲル化または析出し、容易に回収できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 ポリ−３−ヒドロキシ酪酸を含有する菌体からポリ−３−ヒドロキシ酪酸を抽出するに際して、テトラヒドロフランまたはその誘導体を抽出溶剤として使用することを特徴とするポリ−３−ヒドロキシ酪酸の抽出法。
【請求項２】 抽出温度を６０℃以上とする請求項１記載の抽出法。
【請求項３】 抽出溶剤が、テトラヒドロフランまたは３−メチルテトラヒドロフランである請求項１記載の抽出法。
【請求項１】 ポリ−３−ヒドロキシ酪酸を含有する菌体からポリ−３−ヒドロキシ酪酸を抽出するに際して、テトラヒドロフランまたはその誘導体を抽出溶剤として使用することを特徴とするポリ−３−ヒドロキシ酪酸の抽出法。
【請求項２】 抽出温度を６０℃以上とする請求項１記載の抽出法。
【請求項３】 抽出溶剤が、テトラヒドロフランまたは３−メチルテトラヒドロフランである請求項１記載の抽出法。
【公開番号】特開平７−７９７８８
【公開日】平成７年（１９９５）３月２８日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平５−２３０３３４
【出願日】平成５年（１９９３）９月１６日
【出願人】（０００００４４６６）三菱瓦斯化学株式会社 (1,281)
【公開日】平成７年（１９９５）３月２８日
【国際特許分類】
【出願日】平成５年（１９９３）９月１６日
【出願人】（０００００４４６６）三菱瓦斯化学株式会社 (1,281)
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