マイクロチップの製造方法、物理マスク、及びマイクロチップ
【課題】密閉系のチャンバーを構成する凹部の底面にだけ足場因子が配されたマイクロチップの製造方法、その製造方法に用いうる物理マスク、及びマイクロチップの提供。
【解決手段】細胞培養用のチャンバー４となる凹部及び流路１１となる溝部が表面に形成された基板２、凹部に装入可能な凸部が備えられた物理マスク、並びに凹部及び溝部を覆う天板３を準備して、基板２の表面、凹部及び溝部に、細胞の接着を促す足場因子を吸着させる工程Ａと、物理マスクの凸部を基板２の凹部に装入し、前記凸部によって前記凹部の底面の少なくとも一部を覆って、底面に吸着した足場因子を保護する工程Ｂと、覆った底面以外に吸着した足場因子を除去する工程Ｃと、凹部に装入した物理マスクを取り外す工程Ｄと、基板２の表面に天板３を接合させて、凹部及び溝部に蓋をする工程Ｅと、を含むマイクロチップ１の製造方法。
【解決手段】細胞培養用のチャンバー４となる凹部及び流路１１となる溝部が表面に形成された基板２、凹部に装入可能な凸部が備えられた物理マスク、並びに凹部及び溝部を覆う天板３を準備して、基板２の表面、凹部及び溝部に、細胞の接着を促す足場因子を吸着させる工程Ａと、物理マスクの凸部を基板２の凹部に装入し、前記凸部によって前記凹部の底面の少なくとも一部を覆って、底面に吸着した足場因子を保護する工程Ｂと、覆った底面以外に吸着した足場因子を除去する工程Ｃと、凹部に装入した物理マスクを取り外す工程Ｄと、基板２の表面に天板３を接合させて、凹部及び溝部に蓋をする工程Ｅと、を含むマイクロチップ１の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養を用いた分析に適したマイクロチップの製造方法、該製造方法において使用しうる物理マスク、及び該マイクロチップに関する。より詳しくは、細胞接着を促す足場因子が配されたマイクロチップの製造方法、該製造方法において使用しうる物理マスク、及び該マイクロチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の微細加工技術やLab on a Chip関連の技術の発展に伴い、１枚のチップ上にアレイ状に構成された微細構造の中で細胞を培養、解析、操作することで、様々な細胞アッセイや細胞操作を効率的に行う方法が報告されている。例えば、本発明者らが報告した非特許文献１やアメリカの研究グループが報告した非特許文献２では、複数の薬剤の細胞毒性を一度に試験することのできるマイクロチップが記載されている。
既報の細胞アッセイ用マイクロチップの多くはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で製作されているが、ＰＤＭＳ上に直接接着させて培養できる細胞の種類は非常に限られている。様々な細胞に対するアッセイをオンチップで実現するには、個々の細胞に適切な培養環境をマイクロスケールで構築する技術が必要である。また、生体内における細胞機能の発現には、多くの場合、足場因子や液性因子によって構成される複数の分化誘導因子が協調して働いていることが非特許文献３や非特許文献４に記載されている。一般的に、生体から採取した初代培養細胞を生体外で培養するためには、適切な足場因子や液性因子によって構成される培養環境の中で培養する必要がある。また、生体外で幹細胞を特定の細胞に分化誘導するためには、多数の分化誘導因子を複合的なシステムとして作用させる必要がある。さらに、ES細胞の分化誘導能は細胞株ごとに大きく異なることが非特許文献５に報告されている。このように幹細胞の分化誘導プロセスは複雑かつ多様であり、幹細胞を特定の細胞に分化させるための最適な培養環境を、細胞株ごとに網羅的に探索する必要がある。しかしながら、膨大な数の液性因子と足場因子の組み合わせの中から個々の細胞の培養に最適な環境を探索するには、従来技術では非常に煩雑な手作業や高価なロボットが必要となっていた。また、膨大な数の液性因子と足場因子の組み合わせを煩雑な手作業で構築するのは時間がかかり、かつ複数回にわたる試験を行った場合の信頼性が低下しやすいという問題もあった。
【０００３】
細胞培養に関するこれらの問題を解決するため、本発明者らは “微小培養環境アレイチップ”を開発し、非特許論文６で報告した。微小培養環境アレイチップは、非特許論文１に記載されている灌流培養マイクロチャンバーアレイチップの一種であり、マイクロチャンバーアレイ、細胞懸濁液および異なる４種類の液性因子を含む培地を導入するためのマイクロ流路、並びに導入ポートを備えている。このマイクロチャンバーアレイは、底部に異なる３種類の細胞接着性タンパク質を修飾したマイクロチャンバー、および修飾していないマイクロチャンバーによって構成されており、合計で４種類の足場因子を、細胞培養の為の足場として提供する。さらに、このマイクロチャンバー内に培地を供給することによって、培地に含まれる４種類の液性因子と４種類の足場因子の組み合わせからなる４×４＝１６通りの培養環境をマイクロチャンバーアレイ上に構築できる。これら複数の培養環境の中から、細胞培養に適した環境をスクリーニングできる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】S. Sugiura, J. Edahiro, K. Kikuchi, K. Sumaru, and T. Kanamori, Biotechnol. Bioeng., 100, 1156 (2008).
【非特許文献２】Z. Wang, M.-C. Kim, M. Marquez and T. Thorsen, Lab Chip, 7, 740 (2007).
【非特許文献３】M. A. Schwartz and M. H. Ginsberg, Nat. Cell Biol., 4, E65 (2002).
【非特許文献４】K. M. Yamada and S. Even-Ram, Nat. Cell Biol., 4, E75 (2002).
【非特許文献５】K. Osafune, et al.,Nat. Biotechnol., 26, 313 (2008).
【非特許文献６】K. Hattori, S. Sugiura, and T. Kanamori, Biotechnology J., 5, 463 (2010).
【非特許文献７】K. Hattori, S. Sugiura and T. Kanamori, Lab Chip, 11, 212 (2011).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
マイクロチップに備えられたチャンバー中で種々の細胞を培養するためには、当該チャンバーの内壁に、細胞接着性タンパク質等の足場因子を配しておくことが望まれる。この際、チャンバー以外の流路に足場因子を配すると、細胞が流路に接着してしまい、流路の詰まり等の不具合を生じる問題がある。そのため、非特許文献７で開示されたマイクロチップの製造方法では、凹部が形成された天板とその凹部を覆う平滑な基板とを接合させてチャンバーを形成する際、ステンシル法によって足場因子のパターニングを行い、足場因子を基板平面のうち天板の凹部に臨む領域に限定して配している。この方法によればチャンバーの底部を構成する基板平面に限定して足場因子を配することができるので、当該マイクロチップに細胞懸濁液を流入させることによって、足場因子が配されたチャンバーの底部に限定して当該細胞を接着させて、培養することができる。
【０００６】
しかしながら、上記ステンシル法を用いた場合、ステンシルと基板を位置合わせした後に足場因子のパターニングを行い、ステンシルを剥がし、さらに基板と凹部が形成された天板を位置合わせした後に貼り合わせるといった複雑な製造工程が必要となる問題がある。また、上記方法ではチャンバーを構成する基板の凹部に足場因子を配することができない。チャンバーの底部を構成する平滑な基板に接着した細胞は、流路を流通する液体の流れを受け易く、その物理的な圧力が細胞培養に影響を及ぼす虞がある。このため、密閉系のチャンバーを構成する凹部の底面で細胞培養することが可能なマイクロチップの開発が望まれている。
【０００７】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、密閉系のチャンバーを構成する凹部の底面にだけ足場因子が配されたマイクロチップの製造方法、その製造方法に用いうる物理マスク、及びマイクロチップの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の請求項１に記載のマイクロチップの製造方法は、細胞培養用のチャンバー及び前記チャンバーに接続された流路が形成されたマイクロチップの製造方法であって、前記チャンバーとなる凹部及び前記流路となる溝部が表面に形成された基板、前記凹部に装入可能な凸部が備えられた物理マスク、並びに前記凹部及び溝部を覆う天板を準備して、前記基板の表面、凹部及び溝部に、細胞の接着を促す足場因子を吸着させる工程Ａと、前記物理マスクの凸部を前記基板の凹部に装入し、前記凸部によって前記凹部の底面の少なくとも一部を覆って、前記底面に吸着した前記足場因子を保護する工程Ｂと、前記覆った底面以外に吸着した前記足場因子を除去する工程Ｃと、前記凹部に装入した前記物理マスクを取り外す工程Ｄと、前記基板の表面に前記天板を接合させて、前記凹部及び溝部に蓋をする工程Ｅと、を含むことを特徴とする。
本発明の請求項２に記載のマイクロチップの製造方法は、請求項１において、前記工程Ｃにおいて、前記基板の表面及び溝部をプラズマ処理することによって、前記保護した足場因子以外の前記足場因子を除去することを特徴とする。
本発明の請求項３に記載のマイクロチップの製造方法は、請求項２において、前記工程Ｃにおいて、前記基板の表面及び前記天板の表面をプラズマ処理で活性化した後、前記工程Ｅにおいて、前記活性化された表面同士を圧着することによって、前記接合を行うことを特徴とする。
本発明の請求項４に記載のマイクロチップの製造方法は、請求項１〜３のいずれか一項において、前記足場因子が、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ゼラチン、又はポリリジンを含むことを特徴とする。
本発明の請求項５に記載の物理マスクは、請求項１〜４のいずれか一項に記載のマイクロチップの製造方法において使用する物理マスクであって、基体と、前記基体表面から突き出すように配された前記凸部とを少なくとも備え、前記凸部は柱状であり、その直径が前記凹部の直径よりも小さく、前記凸部の先端は、前記凹部の底面に密着可能な面形状であり、前記凸部の突き出す高さが、前記凹部の深さよりも長いことを特徴とする。
本発明の請求項６に記載の物理マスクは、請求項５において、前記物理マスクの材質が、ポリテトラフルオロエチレンであることを特徴とする。
本発明の請求項７に記載のマイクロチップは、細胞培養用のチャンバーとなる凹部及び前記チャンバーに接続された流路となる溝部が形成された基板と、前記凹部及び溝部を覆う天板と、を少なくとも備えたマイクロチップであって、前記凹部の底面にのみ、細胞接着を促す足場因子が配されていることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のマイクロチップの製造方法によれば、チャンバー底部にのみ足場因子を配したマイクロチップを簡単な工程で製造できる。
本発明の物理マスクによれば、基体から突き出した凸部を、チャンバーとなる凹部に装入し、凹部の底面に対して凸部の先端の面を密着させることによって、チャンバー底部の足場因子を物理的にマスクして保護することができる。この結果、マスクした領域以外の基板表面に対して物理的若しくは化学的な処理を施すことができ、不要な足場因子を一括して基板表面から除去することができる。
本発明のマイクロチップによれば、シールされて密閉系となっているチャンバーに、流路を通して細胞懸濁液を流入させることによって、当該チャンバーの底部の足場因子に細胞を接着させて培養することができる。足場因子によって当該細胞を安定に維持できるので、チャンバー内に別の溶液を流入させた場合にも、流入の勢いによって細胞が剥離する虞はない。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の第１の例のマイクロチップの全体を示す平面図である。
【図２】マイクロチップの要部を拡大した平面図である。
【図３】マイクロチップの要部を拡大した断面図である。
【図４】マイクロチップの要部を示す平面図である。
【図５】マイクロチップの製造に用いる基板、物理マスク及び天板の模式的な断面図である。
【図６】足場因子で表面を修飾した基板の模式的な断面図である。
【図７】足場因子で表面を修飾した基板の凹部に、物理マスクの凸部を装入した状態を示す模式的な断面図である。
【図８】足場因子で表面を修飾した基板の凹部に、物理マスクの凸部を装入した状態で、プラズマ処理を行っている様子を示す模式的な断面図である。
【図９】図８において、基板３についても同時にプラズマ処理を行っている様子を示す模式的な断面図である。
【図１０】製造された本発明にかかるマイクロチップの模式的な断面図である。
【図１１】基体２に物理マスク３０を装入して保持するための固定器具の模式的な断面図である。
【図１２】本発明にかかる物理マスクの一例の模式的な断面図である。
【図１３】本発明にかかるマイクロチップの製造方法の一例を示す斜視図である。
【図１４】本発明にかかるマイクロチップの製造方法の一例を示す斜視図である。
【図１５】本発明にかかるマイクロチップの製造方法の一例を示す斜視図である。
【図１６】試験結果を示す写真である。
【図１７】試験結果を示す写真である。
【図１８】試験結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、好適な実施の形態に基づき、図面を参照して本発明を説明する。
＜＜マイクロチップ＞＞
本発明の第１の例であるマイクロチップ１について、図１〜３に示す。
図１は、マイクロチップ１の全体を示す平面図であり、図２はマイクロチップ１の要部を拡大した平面図であり、図３はマイクロチップ１の要部を拡大した断面図である。
以下の説明において、マイクロチップ１の「長手方向」は、図１における矢印ｔの方向を意味し、マイクロチップ１の「短手方向」は、図１における矢印ｕの方向を意味するものとする。
【００１２】
図２および図３に示すように、マイクロチップ１は、平板状の基板２と、これに重ね合わされる平板状の天板３とによって構成することができる。
基板２の、天板３に対向する面２ａ（表面２ａ）には、試料液を導入して、細胞が培養されるチャンバー４となる凹部５が形成されている。
凹部５は、平面視円形の主空間凹部５ａと、主空間凹部５ａの外周側に、これを囲んで形成された外周空間凹部５ｂとからなる。外周空間凹部５ｂは、主空間凹部５ａより浅く形成されている。
図３に示すように、チャンバー４は、主空間凹部５ａ内の空間（主空間部４ａ）と、外周空間凹部５ｂ内の空間（外周空間部４ｂ）とからなる。
【００１３】
図１および図２に示すように、チャンバー４は、複数の行および複数の列からなる行列をなすように２次元的に配列される。
図示例では、合計６４のチャンバー部４が、８行および８列からなる行列をなすようアレイ状に配列されている。行を構成するチャンバー４は、長手方向（矢印ｔ方向）に沿って並び、列を構成するチャンバー４は、短手方向（矢印ｕ方向）に沿って並んでいる。各チャンバー４は、互いに間隔をおいて配列されている。
符号９Ａ〜９Ｈはそれぞれチャンバー部４がなす８つの行を示し、符号１０Ａ〜１０Ｈはそれぞれチャンバー部４がなす８つの列を示す。
【００１４】
基板２の表面２ａには、凹部５（チャンバー４）に連通する入口流路７と出口流路１５とが形成されている。
入口流路７は、長手方向に沿って形成された送液流路１１と、送液流路１１から分岐して各チャンバー４に連通する複数の導入流路１２とを有し、これら導入流路１２はそれぞれチャンバー部４に接続されているため、貯留部２１からの試料液を、送液流路１１から導入流路１２を経てチャンバー部４に導入することができる。
【００１５】
図１および図４に示すように、入口流路７は４つ形成され（入口流路７Ａ〜７Ｄという）、それぞれが異なる貯留部２１（貯留部２１Ａ〜２１Ｄという）に接続されている。
入口流路７Ａの送液流路１１Ａは第１行９Ａと第２行９Ｂの間に延在し、入口流路７Ｂの送液流路１１Ｂは第３行９Ｃと第４行９Ｄの間に延在し、入口流路７Ｃの送液流路１１Ｃは第５行９Ｅと第６行９Ｆの間に延在し、入口流路７Ｄの送液流路１１Ｄは第７行９Ｇと第８行９Ｈの間に延在している。
入口流路７Ａの送液流路１１Ａから分岐した第１導入流路１２Ａは、第１行９Ａと第２行９Ｂの各チャンバー４に接続され、入口流路７Ｂの送液流路１１Ｂから分岐した第２導入流路１２Ｂは、第３行９Ｃと第４行９Ｄの各チャンバー４に接続され、入口流路７Ｃの送液流路１１Ｃから分岐した第３導入流路１２Ｃは、第５行９Ｅと第６行９Ｆの各チャンバー４に接続され、入口流路７Ｄの送液流路１１Ｄから分岐した第４導入流路１２Ｄは、第７行９Ｇと第８行９Ｈの各チャンバー４に接続されている。
【００１６】
図４に示すように、マイクロチップ１では、入口流路７Ａ〜７Ｄが上記構成であるため、貯留部２１Ａからの試料液６Ａを入口流路７Ａから第１行９Ａおよび第２行９Ｂのチャンバー４に導入でき、貯留部２１Ｂからの試料液６Ｂを入口流路７Ｂから第３行９Ｃおよび第４行９Ｄのチャンバー４に導入でき、貯留部２１Ｃからの試料液６Ｃを第５行９Ｅと第６行９Ｆのチャンバー４に導入でき、貯留部２１Ｄからの試料液６Ｄを第７行９Ｇと第８行９Ｈのチャンバー４に導入できる。
したがって、各貯留部に所望の試料液を導入することによって、各チャンバー４に所望の試料液を導入することができる。
【００１７】
図１および図４に示すように、出口流路１５は、各チャンバー４に連通する複数の導出流路１３と、これら複数の導出流路１３が接続される排出流路１４とを有し、チャンバー４内の液を導出流路１３から排出流路１４を経て排出部２２に排出することができる。排出流路１４は長手方向に沿って形成されている。
図４に示すように、出口流路１５は、５つ形成され（出口流路１５Ａ〜１５Ｅという）、出口流路１５Ａの排出流路１４Ａは、第１行９Ａの外側（図４における上方）に形成され、出口流路１５Ｂの排出流路１４Ｂは、第２行９Ｂと第３行９Ｃの間に延在し、出口流路１５Ｃの排出流路１４Ｃは、第４行９Ｄと第５行９Ｅの間に延在し、出口流路１５Ｄの排出流路１４Ｄは、第６行９Ｆと第７行９Ｇの間に延在し、出口流路１５Ｅの排出流路１４Ｅは、第８行９Ｈの外側（図４における下方）に形成されている。
【００１８】
図４に示すように、出口流路１５Ａの導出流路１３Ａは、第１行９Ａのチャンバー４に接続され、出口流路１５Ｂの導出流路１３Ｂは、第２行９Ｂと第３行９Ｃのチャンバー４に接続され、出口流路１５Ｃの導出流路１３Ｃは、第４行９Ｄと第５行９Ｅのチャンバー４に接続され、出口流路１５Ｄの導出流路１３Ｄは、第６行９Ｆと第７行９Ｇのチャンバー４に接続され、出口流路１５Ｅの導出流路１３Ｅは、第８行９Ｈのチャンバー４に接続されている。
【００１９】
導出流路１３は、導入流路１２に比べて断面積を大きくするか、若しくは導入流路１２より短く形成することによって、導入流路１２に比べて流通抵抗を小さくすることができる。その結果、チャンバー４内の圧力が過度に上昇するのを防ぐことができる。
図示例では、導入流路１２と導出流路１３は、凹部５の外周空間凹部５ｂに連通している。導入流路１２と導出流路１３の連通箇所は、主空間凹部５ａを挟んで向かい合う位置とするのが好ましい。向かい合う位置とすることによって、導入流路１２から流入された試料液をチャンバー４内に充分拡散させることがより容易となる。
【００２０】
本発明にかかるマイクロチップ１において、チャンバー４を構成する凹部５の底面５ｃには、足場因子８が配されている（図３参照）。
足場因子８は、底面５ｃの少なくとも一部の領域に配されていればよく、底面５ｃの全領域に配されていてもよい。足場因子８が配された領域に細胞が接着するので、当該領域を広くするほど、細胞を接着して培養できる領域が広くなるので好ましい。
【００２１】
チャンバー４の底面５ｃは必ずしも平坦な平面である必要はなく、湾曲した曲面であってもよく、用途に応じた段差や突起が設けられていてもよい。後述する物理マスクの先端の面形状と密着させるために、底面５ｃは当該面形状にフィットする形状（例えば平坦な面）であることが好ましい。
【００２２】
チャンバー４を構成する凹部５において、主空間凹部５ａの側面５ｄ又は外周空間凹部５ｂの底面にも、足場因子８が配されていてもよい。ただし、底面５ｃに接着した細胞の培養環境（培養条件）と側面５ｄに接着した細胞の培養環境（培養条件）とは、厳密には異なるので、より正確に培養環境を揃える必要がある場合は、底面５ｃのみに足場因子８を配することが好ましい。
なお、前述の通り、本発明にかかるマイクロチップ１において、入口流路７及び出口流路１５に足場因子８は配されていないので、細胞が流路に接着して当該流路を目詰まりさせてしまうことを防止できる。
【００２３】
チャンバー４を構成する天板３の、基板２に対向する面３ａ（下面３ａ）の形状は特に制限されず、例えば平坦にすればよい。平坦であると、チャンバー４内を観察することがより容易となりうる。
【００２４】
以上で説明したように、本発明にかかるマイクロチップ１は、細胞培養用のチャンバー４となる凹部５及びチャンバー４に接続された流路１２，１３となる溝部Ｒが形成された基板２と、凹部５及び溝部Ｒを覆う天板３と、を少なくとも備えたマイクロチップであって、凹部５の底面５ｃにのみ、細胞接着を促す足場因子８が配されているものである。
【００２５】
マイクロチップ１のチャンバー４に細胞及び緩衝液を含む細胞懸濁液を流入させる方法としては、例えば以下のように行うことができる。
まず、細胞懸濁液を貯留部２１に注ぎ、排出部２２側を陰圧とすることによって、入口流路７の送液流路１１及び導入流路１２を介して、前記細胞懸濁液をチャンバー４に引き込むことができる。つぎに、当該細胞懸濁液をチャンバー４に滞留させて、細胞をチャンバー４の底面５ｃに沈降させる。所定時間のうちに、当該細胞は底面５ｃに配された足場因子８に接着する。つづいて、再び排出部２２側を陰圧とすることによって、出口流路１５の導出流路１３及び排出流路１４を介して、接着しなかった死細胞を含む緩衝液を、チャンバー４から排出部２２へ排出することができる。さらに、貯留部２１に前記細胞懸濁液に代えて、細胞培養に必要な栄養素等を含む培養液を導入して、排出部２２側を継続的に陰圧とすることによって、チャンバー４の底面５ｃに接着した細胞に対して、必要な養分等を常時供給することができる。また、前記培養液に種々の薬剤を含ませることによって、当該薬剤が当該細胞に与える影響を調べることができる。
【００２６】
ここでは、細胞懸濁液を導入流路１２を介して流入させる方法を示した。図２に示したように導入流路１２は比較的細長い流路となっているので、培養する細胞の種類や大きさによっては、導入流路１２を通すことが困難な場合も考えられる。この場合には、上記例とは逆方向に細胞懸濁液を送液して、当該細胞をチャンバー４へ流入させればよい。すなわち、細胞懸濁液を排出部２２に導入して、貯留部２１を陰圧とし、出口流路１５を介して前記細胞懸濁液をチャンバー４に引き込むことができる。上記例と同様に細胞を接着させた後、細胞を懸濁していた緩衝液を入口流路７から排出することができる。
このように、マイクロチップ１の送液の方向は、用途や目的に応じて、適宜調整することができる。
【００２７】
本発明にかかるマイクロチップは、図１〜４に示したマイクロチップ１の構成に限られない。貯留部の形状や大きさや数、流路の幅や深さや経路や数、チャンバーの形状や大きさや数等は、当該マイクロチップの用途や目的に応じて適宜設計することができる。
マイクロチップ１のチャンバー４は、図３に示したように、主空間部４ａの他に外周空間部４ｂが設けられている。外周空間部４ｂが設けられていることにより、チャンバー４内に液体を流入させた際に、チャンバー４内を元々満たしていた気体を全てチャンバー４外へ排出することがより容易にできる。
したがって、本発明にかかるマイクロチップのチャンバーには、主空間部４に加えて外周空間部４ｂが設けられていることが好ましい。また、外周空間部４ｂを設けず、主空間部４ａだけでチャンバー４を構成してもよい。
【００２８】
本発明にかかるマイクロチップ１において、チャンバー４を構成する凹部５の底面５ｃにのみ足場因子８が配されているので、細胞が入口流路７及び出口流路１５に接着することを防止できる。したがって、本発明のマイクロチップを用いることによって、足場因子８が配された凹部５の底面５ｃに試験対象である細胞を接着させて培養することができ、当該培養細胞に対する薬剤スクリーニング等の試験を、信頼性の高い培養環境（培養条件）で行うことができる。
培養細胞が足場因子を介して接着するメカニズムとしては、細胞表面に存在するインテグリン、カドヘリン等の接着タンパク質が足場因子８に接着することが一因として考えられる。
【００２９】
本発明にかかるマイクロチップ１において培養する細胞は、特に限定されず、例えばヒトを含む動物由来の細胞、植物由来の細胞、微生物由来の細胞等を目的に応じて使用できる。
培養可能な細胞の具体例としては、造血幹細胞、骨髄系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞などの体性幹細胞や胚性幹細胞、人工多能性幹細胞等が挙げられる。また、好中球、好酸球、好塩基球、単球、リンパ球（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞等）等の白血球や、血小板、赤血球、血管内皮細胞、リンパ系幹細胞、赤芽球、骨髄芽球、単芽球、巨核芽球および巨核球等の血液細胞、内皮系細胞、上皮系細胞、肝実質細胞、膵ラ島細胞等が例示できる。
【００３０】
＜＜マイクロチップの製造方法＞＞
本発明にかかるマイクロチップの製造方法の第一態様を、図５〜１０を参照して説明する。図５〜１０は、前述のマイクロチップ１を構成する基板２及び天板３の厚み方向の断面を、単純化した模式図である。
【００３１】
本発明にかかるマイクロチップの製造方法の第一態様は、図１に示した細胞培養用のチャンバー４及びチャンバー４に接続された流路１２，１３が形成されたマイクロチップ１の製造方法の一例であり、少なくとも以下の工程Ａ〜Ｅの工程を含むものである。
【００３２】
まず、図５に示すように、チャンバー４となる第一凹部５、導入流路１２（入口流路７）及び導出流路１３（出口流路１５）となる溝部Ｒが表面２ａに形成された基板２、第一凹部５に装入可能な凸部３１が備えられた物理マスク３０、並びに第一凹部５及び溝部Ｒを覆う天板３を準備する。
基板２には、第一凹部５及び溝部Ｒの他に、貯留部２１となる第二凹部５’及び排出部２２となる第三凹部５”も形成されている。図５では、図を簡略化するために第一凹部５を１個だけ描いてある。言うまでもないが、第一凹部５、第二凹部５’、第三凹部５”、及び溝部Ｒは、必要に応じて複数形成されていてよい。
また、天板３には、第二凹部５’及び第三凹部５”に対応する位置にスルーホールＴが設けられている。
【００３３】
基板２は、公知の方法によって作製されたものを用いることができる。基板２が樹脂製である場合、例えばレプリカモールディング法によって、第一〜第三凹部５，５’，５”及び溝部Ｒが一括して形成された基板２を作製できる。別の公知方法としては、例えば樹脂、ガラス、シリコン等の材料からなる平板の表面に、フォトリソグラフでレジストマスクを形成し、ＲＩＥ(Reactive Ion Etching)等のエッチング方法によって、第一〜第三凹部５，５’，５”及び溝部Ｒを形成することによって、基板２を作製することができる。また、レーザー加工、ＮＣ加工、光造形加工、射出成型加工、ナノインプリント加工等の方法を適宜使用することもできる。
【００３４】
基板２および天板３の材料は特に制限されず、例えば樹脂（プラスチック）、ガラス、シリコン等が使用できる。チャンバー４内の培養細胞を光学的に観察することが容易であるので、前記材料は透明材料であることが好ましく、具体的には樹脂及びガラスが好ましい。また、プラズマ処理によって基板２及び天板３の表面を活性化して、当該表面同士を圧着することによって、基板２と天板３とを接合できるので、前記材料は樹脂であることがより好ましい。前記樹脂としては、シリコーン系樹脂{例えばポリジメチルシロキサン(ＰＤＭＳ）}、アクリル系樹脂（例えばポリメタクリル酸メチル）、スチレン系樹脂（例えばポリスチレン）が高い透明性を有するため更に好ましい。
【００３５】
ＰＤＭＳの表面に直に接着できる細胞の種類は極めて少ないので、ＰＤＭＳからなる基板２を使用することによって、流路に細胞が接着してしまうことを防止できる。またＰＤＭＳは酸素透過性が高いので細胞培養用途のマイクロチップを作製する材料として適している。
したがって、基板２及び天板３の材料としては、ＰＤＭＳが特に好ましい。また、基板２及び天板３のうち、前記細胞懸濁液が接触する箇所のみをＰＤＭＳで構成してもよい。基板２及び天板３の材料は同じであっても異なっていてもよく、例えば基板２をＰＤＭＳ製とし、天板３をガラス製とすることができる。
【００３６】
基板２及び天板３のうち、前記細胞懸濁液又は培養液に接触する領域には、撥水処理等の表面加工を施してもよい。撥水処理を行った箇所では、細胞が接着することを抑制できると共に、前記細胞懸濁液や培養液等の液体の流れを一層スムーズにすることができる。前記撥水処理としては、−（ＣＦ２）ｎ−ＣＦ３基を持つパーフルオロアルキル基含有シラン（ＦＡＳ）やポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）などのフッ素樹脂を用いて、当該表面を被膜する公知の方法が例示できる。
【００３７】
[工程Ａ]
図６に示すように、第一態様の工程Ａは、基板２の表面２ａ、第一凹部５、第二凹部５’、第三凹部５”、及び溝部Ｒに、細胞の接着を促す足場因子８を吸着させる（配する）工程である。
足場因子８は、導入する細胞の接着を促して培養できるものであれば特に制限されず、例えば公知の細胞接着性タンパク質を含むものが使用できる。
【００３８】
前記細胞接着性タンパク質としては、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ゼラチン、およびポリリジン等が挙げられる。これらの細胞接着性タンパク質は一種だけを用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。なお、前記ポリリジンはペプチドであるが、本明細書及び特許請求の範囲においては、細胞接着性タンパク質と細胞接着性ペプチドとを区別せずに、両方とも細胞接着性タンパク質と呼ぶ。前記細胞接着性ペプチドとしては、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ゼラチン等の細胞接着性タンパク質を加水分解した分解物や、化学合成したポリリジンのペプチド鎖等が例示できる。
【００３９】
足場因子８に含まれる細胞接着性タンパク質は、そこに接着する細胞の生理活性に影響を与えることがある。例えば、一の細胞接着性タンパク質においては当該細胞が増殖せず、他の細胞接着性タンパク質においては当該細胞が活発に増殖する、ということがあり得る。したがって、使用する細胞接着性タンパク質については、このような影響を加味して適宜選択することが好ましい。
【００４０】
基板２の表面２ａ、凹部５及び溝部Ｒに足場因子８を配する方法としては、足場因子８の細胞接着性が損なわれない方法であれば特に制限されず、例えば物理的若しくは化学的に吸着させる方法が好適な方法として挙げられる。具体的には、足場因子８を懸濁又は溶解した塗布液を基板２の表面２ａ側の全面に塗布する方法が挙げられる。
本発明において、最終的に足場因子８を配する箇所は第一凹部５の底面５ｃのみであるが、工程Ａにおいては、基板２の表面２ａ側の全面に塗布することが好ましい（図６参照）。底面５ｃのみに塗布することは比較的困難であり、当該塗布の操作が複雑なものとなってしまうからである。一方、前記全面に塗布する方法は比較的容易であり、当該塗布の操作を簡便化できる。
【００４１】
前記塗布液を全面に塗布する方法としては、例えばスピンコート法が挙げられる。また、前記塗布液に基板２を浸漬させる方法も挙げられる。浸漬中に超音波処理等を行うことによって、基板２の表面に付着し得る気泡を除いて、前記全面にムラなくより均一に塗布することができる。
前記足場因子８を表面２ａ、凹部５及び溝部Ｒに接触させることによって、接触した面に当該足場因子８を物理的若しくはな化学的に吸着させることができる。
【００４２】
前記接触の時間は特に制限されないが、１分以上の接触時間が好ましく、５分以上の接触時間がより好ましく、３０分以上の接触時間が更に好ましい。この下限値以上とすることにより、前記吸着をより確実にすることができる。上限値は特に制限されず、例えば１０時間程度とすれば、前記吸着をより一層確実にすることができる。
この物理的な吸着によれば、足場因子８が本来有する細胞接着性若しくは生理活性を実質的に損なうことなく、前記全面に吸着させることができる。
【００４３】
前記塗布液には、足場因子８の他に、前記吸着を促進させるポリマー等を配合してもよい。前記吸着をより確実に又はより迅速に行うことが可能となり得る。前記ポリマーとしては、公知のポリマーを用いればよい。
【００４４】
足場因子８を前記全面に吸着させるために、前記全面に予め高分子材料をグラフト結合させて、この高分子材料を介して足場因子８を前記全面に結合させる方法も可能である。
具体的には、例えばアクリル酸を含む液を前記全面に塗布し、光重合させることによって前記全面にポリアクリル酸をグラフト結合し、次いでこの全面に足場因子８を接触させて足場因子８の有するアミノ基とポリアクリル酸のカルボキシル基とを脱水縮合により結合させる方法（化学的吸着）を採用できる。
【００４５】
前記塗布液を塗布することによって足場因子８を前記全面に吸着させた後は、前記塗布液を除去して、水分を基板２から除去して乾燥させることが好ましい。後段の工程における各操作において、当該水分が邪魔になる場合があるためである。前記乾燥の方法は、エアブローや減圧乾燥法等の公知の方法が適用できる。前記乾燥の際、足場因子８も同様に乾燥させてよい。
【００４６】
[工程Ｂ]
図７に示すように、第一態様の工程Ｂは、物理マスク３０の凸部３１を基板２の第一凹部５に装入し、凸部３１によって第一凹部５の底面５ｃの少なくとも一部を覆って、底面５ｃに吸着した足場因子８を保護する工程である。
【００４７】
工程Ｂでは、図７に示すように、物理マスク３０を構成する基体３２の表面３２ａから突き出すように配された凸部３１の先端の面３１ａ（以下、端面３１ａという）を、第一凹部５の底面５ｃに密着するように押し付けた状態とすることが好ましい。この状態であると、端面３１ａと底面５ｃの間にある足場因子８を外部から遮断して、保護することができる。この状態で、後段の工程Ｃを行うことが好ましい。
【００４８】
本発明において、物理マスク３０の形状は特に制限されず、その凸部３１が第一凹部５に装入可能であり且つ凸部３１が第一凹部５の底面５ｃに配された足場因子８を外部から遮断して保護できるものであればよい。
本発明にかかる物理マスクは、例えば図５〜９に示すように、基体３２と、基体３２の表面３２ａから突き出すように配された凸部３１とを少なくとも備え、凸部３１は円柱状であり、その直径ｌが第一凹部５の直径Ｌよりも小さく、凸部３１の先端は、第一凹部５の底面５ｃに密着可能な平坦な面であり、凸部３１の突き出す高さｈが、第一凹部５の深さＨよりも長い、物理マスク３０が好適なものとして挙げられる。
【００４９】
基板２の第一凹部５のサイズは特に制限されず、例えば直径Ｌを１０００μｍ〜２０００μｍとして、深さＨを１５０μｍ〜３００μｍとすることができる。この場合、物理マスク３０の柱状の凸部３１のサイズは、例えば直径ｍをチャンバー４の直径Ｌよりも１０μｍ〜５０μｍ小さくして、高さｈをチャンバー４の深さＨよりも１０μｍ〜５０μｍ大きくすればよい。
【００５０】
物理マスク３０の凸部３１の形状は必ずしも円柱である必要はなく、例えば楕円柱、四角柱、五角柱、六角柱等の柱状であることが好ましい。第一凹部５の形状及び底面５ｃの形状に合わせて、適宜選択すればよい。凸部３１の形状が柱状である場合、柱の側面の一部を削いだ形状としてもよい。例えば、図１２に示すように、柱状の凸部３１の側面３１ｂを削いだ形状としてもよい。柱状の凸部３１の側面３１ｂを削ることによって、後段の工程Ｃにおいて、第一凹部５の側面５ｄに配された足場因子８の除去がより容易となり得る。
【００５１】
凸部３１が基体３２から突き出す角度は特に制限されない。凸部３１を第一凹部５の底面５ｃに押し付ける際の圧力負荷が容易となるため、前記角度は基体２の表面３２ａに対して直角であることが好ましい。
【００５２】
図７に示すように、凸部３１が基体３２の表面３２ａから突き出す高さｈは、基板２の第一凹部５の深さよりも長いことが好ましい。この構成であると、凸部３１の端面３１ａを第一凹部５の底面５ｃに密着させることがより容易となる。さらにこの構成の場合、物理マスク３０の表面３２ａと基板２の表面２ａとの距離Ｇを０よりも大きくすることができ、後段の工程Ｃで除去すべき領域に配された足場因子８を物理マスク３０が覆ってしまうことを防ぐことができる。
【００５３】
前記距離Ｇは、後段の工程Ｃにおいて基板の表面２ａ及び溝部Ｒに配された足場因子８を除去することが容易となることから、大きいほど好ましい。基板２の表面２ａの面積及び物理マスク３０の表面３２ａの面積にもよるが、通常、距離Ｇの下限値は１μｍ以上であればよく、５μｍ以上が好ましく、１０μｍ以上がより好ましい。
前記下限値以上とすることによって、前記プラズマ処理におけるプラズマや前記化学処理におけるアルカリ溶液若しくは酸溶液等の処理液が、基板２と物理マスク３０の基体２との隙間に入り込むことがより容易となり、第一凹部５の底面５ｃ以外に配された余分な足場因子８を除去することがより容易となり得る。距離Ｇの上限値は特に制限されず、例えば５０μｍ〜５ｍｍ程度とすることができる。
【００５４】
凸部３１の端面３１ａが第一凹部５の底面５ｃを保護する領域の面積は、広いほど好ましい。保護した領域に配された足場因子８において細胞を培養することができるので、当該領域の面積が広いほど、細胞培養に使用し得る面積が広くなる。例えば、第一凹部５の底面５ｃの全面積を１００％とした場合、保護する領域は６０％以上が好ましく、７５％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましい。
【００５５】
基体２の表面２ａに設けられた第一凹部５の個数が複数である場合、物理マスク３０を構成する基体３２において、凸部３１は、当該第一凹部の個数に対応させて、複数設けられていることが好ましい。複数の凸部３１を基体３２に設ける位置は、基体３２を基板２の表面２ａに対向させた際に、複数の第一凹部５に複数の凸部３１が各々臨む位置とすることが好ましい。この構成であれば、基体２の複数の第一凹部５の各底面５ｃに配された足場因子８を、一個の物理マスク３０によって一括して保護することができる。
【００５６】
物理マスク３０を構成する基体３２の形状は、凸部３１を保持して、凸部３１を基板２の第一凹部５に装入できるものであれば特に制限されず、例えば平板状、網状、棒状等が挙げられる。基体３２が網状である場合、当該網を構成する縦棒と横棒の交点に凸部３１を配すればよい。また、基体３２が棒状である場合、当該棒の所望の位置に凸部３１を配することができる。これらの物理マスクは、例えば樹脂基板を材料とした機械加工によって作製できる。
【００５７】
物理マスク３０の材質（材料）は、後段の工程Ｃにおける処理に耐えうる材料であれば特に制限されず、例えば種々の樹脂が適用可能である。図５〜９に示す物理マスク３０を構成する基体３２は、平板状のポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）製であり、凸部３１も同様にＰＴＦＥ製である。ＰＴＦＥは、後段の工程Ｃにおいて使用しうるプラズマ処理やアルカリ若しくは酸等の化学処理に耐性を有すると共に、剛性を有するので、プラズマ処理時における基板２の変形を防止できるので好ましい。したがって、本発明にかかる物理マスクの材質は、ＰＴＦＥであることが好ましい。
【００５８】
ところで、物理マスク３０の凸部３１を基板２の第一凹部５内に装入した状態で固定する方法として、例えば図１１に示すような固定器具４０を使用できる。図１１は、固定器具４０、物理マスク３０及び基体２の模式的な断面図である。
固定器具４０は、固定板４１及び押さえ板４２を備えており、固定板４１の表面には基板２を保持可能な凹状の固定部４５が設けられている。この固定部４５内に基体２を固定し、物理マスク３０の凸部３１を基体２の第一凹部５に装入した状態で、物理マスク３０の基体３２の上面３２ｂを押さえ板４２によって押さえる。押さえ板４２によって基体３２を押す圧力は、固定板４１の底面に配されたナット４４及び押さえ板４２の上面に配したネジ４３の締め具合によって調整できる。ナット４４及びネジ４３を配する複数の位置は、基板２の中心に対して点対称とすることが好ましい。押さえ板４２による押さえる力を、物理マスク３０の基体３２の上面に均等に負荷することができる。
【００５９】
[工程Ｃ]
図８又は図９に示すように、第一態様の工程Ｃは、基板２の第一凹部５の底面５ｃ以外に吸着した足場因子８を除去する工程である。
図８に示すように、物理マスク３０によって第一凹部５の底面５ｃを保護した状態で、基板２の表面をプラズマ処理することによって、保護された底面５ｃ以外に配された足場因子８を変性又は焼却して、足場因子８の細胞接着性を失わせることができる。
ここで、本発明において「足場因子を除去する」とは、当該足場因子の細胞接着性を除去することを意味し、当該足場因子の物理的実体を完全に除去することだけを意味するものではない。
【００６０】
工程Ｃにおいて足場因子８を除去する方法としては、基板２の損傷を極力抑制しつつ、物理マスク３０で保護した領域以外の足場因子８を除去できる方法であれば特に制限されない。例えばプラズマ処理又は化学薬品処理が好適な除去方法として挙げられる。
【００６１】
前記プラズマ処理における作動ガス（処理ガス）としては、アルゴンガス、窒素ガス、酸素ガス等のプラズマを用いることができる。当該ガスにはブタジエンガス、炭酸ガス等を混合してもよい。ブタジエンガスを混合することによって、プラズマ処理した基板２の表面２ａに薄膜を形成して、当該表面２ａの接着性をより高めることができる。また炭酸ガスを混合することによって、前記接着性を調整することもできる。
【００６２】
前記化学薬品処理としては、ＮａＯＨ、ＫＯＨ等のアルカリ水溶液、塩酸、クロム酸等の酸水溶液、又はハロゲン化炭化水素系溶剤を用いた表面処理が挙げられる。
また、足場因子８の除去方法として、コロナ放電処理、オゾン処理、ＵＶ照射処理、電子線照射処理、又は火炎による表面処理等を適用してもよい。
【００６３】
工程Ｃにおいて、物理マスク３０によって保護した足場因子８以外の足場因子８を除去する方法としては、別途の乾燥処理が不要なドライプロセスであり、基体２の損傷を最低限で抑えることができるので、プラズマ処理が好ましい。基板２の表面２ａ及び溝部Ｒをプラズマ処理することによって、不要な足場因子８を除去できる。
【００６４】
[工程Ｄ]
第一態様の工程Ｄは、第一凹部５に装入した物理マスク３０を取り外す工程である。
物理マスク３０を構成する基体３２を引き上げることによって、第一凹部５内に装入して、底面５ｃに押し付けていた凸部３１を引き上げればよい。物理マスク３０がＰＴＦＥ製である場合は、耐久性に優れるので、繰り返し使用できる。
【００６５】
[工程Ｅ]
図１０に示すように、第一態様の工程Ｅは、基板２の表面２ａに天板３を接合させて、第一凹部５及び溝部Ｒに蓋をする工程である。
基板２の表面２ａに対して天板３の下面３ａを接合させる方法としては特に制限されず、例えば基板２の表面２ａに接着性を付与して、下面３ａを圧着させることによって接合させる公知の方法が適用できる。
前記接着性を付与する方法としては、基板２の表面２ａに接着剤を塗布する方法、基板２の表面２ａをプラズマ処理する方法等が挙げられる。
【００６６】
前段の工程Ｃにおいて、余分な足場因子８を除去するためにプラズマ処理を行う場合、当該プラズマ処理の処理室内に天板３を置いて、足場因子８の除去と同時に、天板３の下面３ａをプラズマ処理することが好ましい（図９参照）。
すなわち、本発明のマイクロチップの製造方法では、工程Ｃにおいて、前記プラズマ処理によって、基板２の表面２ａ及び天板３の表面３ａ（下面３ａ）をプラズマ処理で活性化した後、工程Ｅにおいて、前記活性化された表面同士を圧着することによって、前記接合を行うことが好ましい。この方法によれば、工程Ｃにおけるプラズマ処理によって、余分な足場因子８を除去できると共に、基板２の表面２ａに天板３を接合させるための前処理を行うことができるので、製造工程をより簡便化して製造効率を高められる。
【００６７】
前記プラズマ処理等によって基板２の表面２ａ及び／又は天板３の下面３ａに接着性を付与して、表面２ａと下面３ａとを合わせて圧着することによって、第一凹部５、第二凹部５’、第三凹部５”及び各溝部Ｒをシールして、貯留部２１、チャンバー４、送液流路１１、導入流路１２、導出流路１３、排出流路１４及び排出部２２を備えたマイクロチップ１を製造することができる（図１０参照）。なお、天板３において、第二凹部５’及び第三凹部５”に対応する位置にはスルーホールＴが各々設けられているので、貯留部２１及び排出部２２は、当該スルーホールＴを介して外部に連通している。
【００６８】
前記プラズマ処理の強度及び処理時間は、基板２、天板３、足場因子８、及びプラズマの種類によっても異なるが、例えば基板２及び天板３がＰＤＭＳであり、足場因子８が前記細胞接着性タンパク質であり、酸素プラズマを用いる場合、前記プラズマ処理は１００Ｗで１秒〜３０秒が好ましく、１秒〜２０秒がより好ましく、１秒〜１０秒が更に好ましい。下限値以上であることにより、足場因子８を充分に除去して、基板２及び天板３の接合面を充分に表面改質して接着性を付与することができる。上限値以下であることにより、基板２及び天板３の損傷を最小限に抑えることができる。
また、前記プラズマ処理における電力としては、１００〜２００Ｗが好ましい。前記電力範囲の下限値以上であると一層充分に表面改質することができ、上限値以下であると処理対象である基板及び天板の変形を抑制し易い。前記プラズマを発生させる処理室の圧力としては、５〜１０Ｐａが好ましい。前記処理室へのプラズマ作動ガス（処理ガス）の流入量としては、１００ｍＬ／分〜２００ｍｌ／分が好ましい。プラズマ処理が適切に行われたことは、例えばＰＤＭＳ基板の場合、その表面の水接触角が２５〜４０°となることによって確認できる。
【００６９】
本発明にかかるマイクロチップの製造方法は、本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて、前記工程Ａ〜Ｅ以外の工程又はステップを含んでいてもよい。
【実施例】
【００７０】
アレイ状に配置された複数の第一凹部５及び溝部Ｒが表面に形成された基板２をフォトリソグラフィ及びＰＤＭＳのレプリカモールディングによって作製した（図１３参照）。
基板２の表面に形成した微細構造は、個々に独立した６４個のチャンバー４（マイクロチャンバー）となる第一凹部５と合計9本の流路（マイクロ流路）となる溝部Ｒで構成されている。また、細胞導入ポート２１（貯留部２１）となる第二凹部５’及び薬剤導入ポート２２（排出部２２）となる第三凹部５”がそれぞれ４個ずつ形成されている。細胞導入ポート２１から細胞懸濁液をマイクロチャンバー内に導入でき、薬剤導入ポート２２から異なる液性因子を含む4種類の培地を灌流できるように設計されている。
【００７１】
以下の手順で、細胞接着性タンパク質を酸素プラズマによってパターニングすると同時に、プラズマボンディングによってマイクロチップ１を組み立てた。
１）PDMS製の基板２の表面に１００Ｗ、３秒の条件で酸素プラズマを照射して、基板表面を親水化（活性化）した後、第一凹部５のアレイ全面に１００μＭのコラーゲン水溶液若しくはフィブロネクチン水溶液を塗布し、３分間、３７℃の条件で当該細胞接着性タンパク質（足場因子８）を基板表面に物理的に吸着させた。
２）第一凹部５の形状に寸法が適合する凸部３１が、第一凹部５の配置に対応するように基体３２の表面に備えられたテフロン（登録商標）製の物理マスク３０を、基板２上に位置合わせして置き、各凸部３１を各第一凹部５に装入した（図１３参照）。
３）第一凹部５以外の領域に吸着した細胞接着性タンパク質を分解除去する目的、及び基板２を構成するPDMS表面の活性化を行う目的で、基体２及び物理マスク３０を図示しないホルダー（固定器具）で固定して、酸素プラズマを１００Ｗ、１０秒の条件で照射した（図１４参照）。この際、天板３も同時にプラズマ照射した。
４）ホルダーを分解し、物理マスク３０を取って、基体２及び天板３を圧着して接合さることによって、各マイクロチャンバー及び流路をシールして、細胞導入ポート２１、流路１１、チャンバー４、及び薬剤導入ポート２２を備えたマイクロチップ１を作製した（図１５参照）。
【００７２】
上記方法による足場因子８のパターニングの状態を観察するため、蛍光色素であるFITCで標識したコラーゲン又はTRITCで標識したフィブロネクチンを使用して、上記方法によってパターニングした。パターニング後の第一凹部５を蛍光観察したところ、細胞接着性タンパク質の種類に依らず、物理マスク３０の凸部３１のパターン通りに、すなわちマイクロチャンバー４の底部５ｃにのみ直径１ｍｍ程度の円形スポットで、細胞接着性タンパク質が固定化されていることが確認できた（図１６参照）。
【００７３】
図１６（ａ）は、FITC標識コラーゲンを吸着させたマイクロチャンバー４を蛍光顕微鏡で観察した写真であり、図１６（ｂ）は、プラズマ処理によるパターニング後の写真である。パターニング後のマイクロチャンバー４の底面５ｃにはFITC標識コラーゲンが除去されずに残っている。一方、底面５ｃ以外に配された当該コラーゲンは、プラズマ処理によって除去されていることが明らかである。
図１６（ｃ）は、TRITC標識フィブロネクチンを吸着させたマイクロチャンバー４を蛍光顕微鏡で観察した写真であり、図１６（ｄ）は、プラズマ処理によるパターニング後の写真である。パターニングの結果は、コラーゲンの場合と同様である。
【００７４】
マイクロチップ１の薬剤導入ポート２２に４種類の色素溶液を注入し、２０〜１００ｋＰａの圧力を印加することによって、マイクロチャンバー４を介して細胞導入ポート２１まで流した。注入した４種類の色素溶液は、漏れたり、混じり合わずに、各マイクロチャンバーに導入された（図１7参照）。このことは、流路に圧力を印加して液体を流した場合においても当該液体のリークが生じない程度に、基板２と天板３との充分な接着強度（接合強度）が得られたことを意味する。したがって、酸素プラズマ照射によって、物理マスク３０で保護した領域以外の細胞接着性タンパク質が充分に分解除去されると共に、除去された細胞接着性タンパク質層の下にあるＰＤＭＳ基板の表面２ａが充分に活性化されて、接合に必要な接着性が付与されたことが明らかである。
【００７５】
作製したマイクロチップ１中で、CHO細胞及びNIH3T3細胞の培養を行った。足場因子８としてコラーゲン又はフィブロネクチンを配したマイクロチャンバー４を用いた。各足場因子８を配したチャンバー４において、２４時間の静置培養によって各細胞は底面に接着し、進展した。ついで、４８時間の灌流培養によって各細胞は増殖した。その結果を図１８に示す。
【００７６】
図１８（ａ）は足場因子８を配していないマイクロチャンバーにおけるCHO細胞（24時間後）であり、図１８（ｂ）は足場因子８を配していないマイクロチャンバーにおけるNIH3T3細胞（24時間後）であり、図１８（ｃ，ｇ）はコラーゲンを配したマイクロチャンバー４におけるCHO細胞（24時間後、48時間後）であり、図１８（ｄ，ｈ）はコラーゲンを配したマイクロチャンバー４におけるNIH3T3細胞（24時間後、48時間後）であり、図１８（ｅ，ｉ）はフィブロネクチンを配したマイクロチャンバーにおけるCHO細胞（24時間後、48時間後）であり、図１８（ｆ，ｊ）はフィブロネクチンを配したマイクロチャンバーにおけるNIH3T3細胞（24時間後、48時間後）である。
【００７７】
CHO細胞、NIH3T3細胞の何れも、足場因子８の無いPDMS表面２ａにはほとんど接着しなかった（図１８（ａ，ｂ））。一方、足場因子８を上記パターニング方法によって配した場合には、細胞が当該足場因子８に接着して増殖した。したがって、当該足場因子８は、上記プラズマ処理の際に物理マスク３０によって保護されており、その細胞接着性を失わなかったことが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明を用いることで、培養環境を網羅的に解析するマイクロチップを簡便に作製することができ、細胞株ごとに異なる性質を有する幹細胞の分化誘導条件を個別に効率的に探索することが可能となる。したがって患者由来のiPS細胞を特定の組織に分化させ、疾患モデル細胞を作成する際の分化誘導プロセスが劇的に効率化する。将来的には、患者ごとに最適な条件で分化誘導された細胞や組織を用いるテーラーメード再生医療の実現につながると考えられる。また、幹細胞に限らず細胞の機能や運命は、液性因子と足場因子によって構成される外部環境に依存する複雑な細胞内シグナル伝達を経て決定されている。本発明によって実現する新たな研究ツールは、このような複雑な生命システムの動作原理の解明にも利用されていくことが期待される。
【符号の説明】
【００７９】
１…マイクロチップ、２…基板、２ａ…基板の表面、３…天板、３ａ…天板の下面、Ｔ…スルーホール、４…チャンバー、４ａ…主空間部、４ｂ…外周空間部、５…凹部（第一凹部）、５’…第二凹部、５”…第三凹部、５ａ…主空間凹部、５ｂ…外周空間凹部、５ｃ…凹部の底面、５ｄ…凹部の側面、Ｒ…溝部、Ｈ…凹部の深さ、Ｌ…凹部の直径、６，６Ａ〜６Ｄ…試料液、７，７Ａ〜７Ｄ…入口流路、８…足場因子、１１，１１Ａ〜１１Ｄ…送液流路、１２，１２Ａ〜１２Ｄ…導入流路、１３，１３Ａ〜１３Ｄ…導出流路、１４，１４Ａ〜１４Ｄ…排出流路、１５，１５Ａ〜１５Ｅ…出口流路、２１…貯留部、２２…排出部、３０…物理マスク、３１…凸部、３１ａ…凸部の先端の面（端面）、３２…基体、３２ａ…基体の表面（下面）、３２ｂ…基体の上面、ｈ…凸部の高さ、ｌ…柱状凸部の直径、Ｇ…基体表面と基板表面との距離（隙間の距離）、Ｐ…プラズマ、４０…固定器具、４１…固定板、４２…押さえ板、４３…ネジ、４４…ナット、４５…固定部。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養を用いた分析に適したマイクロチップの製造方法、該製造方法において使用しうる物理マスク、及び該マイクロチップに関する。より詳しくは、細胞接着を促す足場因子が配されたマイクロチップの製造方法、該製造方法において使用しうる物理マスク、及び該マイクロチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の微細加工技術やLab on a Chip関連の技術の発展に伴い、１枚のチップ上にアレイ状に構成された微細構造の中で細胞を培養、解析、操作することで、様々な細胞アッセイや細胞操作を効率的に行う方法が報告されている。例えば、本発明者らが報告した非特許文献１やアメリカの研究グループが報告した非特許文献２では、複数の薬剤の細胞毒性を一度に試験することのできるマイクロチップが記載されている。
既報の細胞アッセイ用マイクロチップの多くはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で製作されているが、ＰＤＭＳ上に直接接着させて培養できる細胞の種類は非常に限られている。様々な細胞に対するアッセイをオンチップで実現するには、個々の細胞に適切な培養環境をマイクロスケールで構築する技術が必要である。また、生体内における細胞機能の発現には、多くの場合、足場因子や液性因子によって構成される複数の分化誘導因子が協調して働いていることが非特許文献３や非特許文献４に記載されている。一般的に、生体から採取した初代培養細胞を生体外で培養するためには、適切な足場因子や液性因子によって構成される培養環境の中で培養する必要がある。また、生体外で幹細胞を特定の細胞に分化誘導するためには、多数の分化誘導因子を複合的なシステムとして作用させる必要がある。さらに、ES細胞の分化誘導能は細胞株ごとに大きく異なることが非特許文献５に報告されている。このように幹細胞の分化誘導プロセスは複雑かつ多様であり、幹細胞を特定の細胞に分化させるための最適な培養環境を、細胞株ごとに網羅的に探索する必要がある。しかしながら、膨大な数の液性因子と足場因子の組み合わせの中から個々の細胞の培養に最適な環境を探索するには、従来技術では非常に煩雑な手作業や高価なロボットが必要となっていた。また、膨大な数の液性因子と足場因子の組み合わせを煩雑な手作業で構築するのは時間がかかり、かつ複数回にわたる試験を行った場合の信頼性が低下しやすいという問題もあった。
【０００３】
細胞培養に関するこれらの問題を解決するため、本発明者らは “微小培養環境アレイチップ”を開発し、非特許論文６で報告した。微小培養環境アレイチップは、非特許論文１に記載されている灌流培養マイクロチャンバーアレイチップの一種であり、マイクロチャンバーアレイ、細胞懸濁液および異なる４種類の液性因子を含む培地を導入するためのマイクロ流路、並びに導入ポートを備えている。このマイクロチャンバーアレイは、底部に異なる３種類の細胞接着性タンパク質を修飾したマイクロチャンバー、および修飾していないマイクロチャンバーによって構成されており、合計で４種類の足場因子を、細胞培養の為の足場として提供する。さらに、このマイクロチャンバー内に培地を供給することによって、培地に含まれる４種類の液性因子と４種類の足場因子の組み合わせからなる４×４＝１６通りの培養環境をマイクロチャンバーアレイ上に構築できる。これら複数の培養環境の中から、細胞培養に適した環境をスクリーニングできる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】S. Sugiura, J. Edahiro, K. Kikuchi, K. Sumaru, and T. Kanamori, Biotechnol. Bioeng., 100, 1156 (2008).
【非特許文献２】Z. Wang, M.-C. Kim, M. Marquez and T. Thorsen, Lab Chip, 7, 740 (2007).
【非特許文献３】M. A. Schwartz and M. H. Ginsberg, Nat. Cell Biol., 4, E65 (2002).
【非特許文献４】K. M. Yamada and S. Even-Ram, Nat. Cell Biol., 4, E75 (2002).
【非特許文献５】K. Osafune, et al.,Nat. Biotechnol., 26, 313 (2008).
【非特許文献６】K. Hattori, S. Sugiura, and T. Kanamori, Biotechnology J., 5, 463 (2010).
【非特許文献７】K. Hattori, S. Sugiura and T. Kanamori, Lab Chip, 11, 212 (2011).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
マイクロチップに備えられたチャンバー中で種々の細胞を培養するためには、当該チャンバーの内壁に、細胞接着性タンパク質等の足場因子を配しておくことが望まれる。この際、チャンバー以外の流路に足場因子を配すると、細胞が流路に接着してしまい、流路の詰まり等の不具合を生じる問題がある。そのため、非特許文献７で開示されたマイクロチップの製造方法では、凹部が形成された天板とその凹部を覆う平滑な基板とを接合させてチャンバーを形成する際、ステンシル法によって足場因子のパターニングを行い、足場因子を基板平面のうち天板の凹部に臨む領域に限定して配している。この方法によればチャンバーの底部を構成する基板平面に限定して足場因子を配することができるので、当該マイクロチップに細胞懸濁液を流入させることによって、足場因子が配されたチャンバーの底部に限定して当該細胞を接着させて、培養することができる。
【０００６】
しかしながら、上記ステンシル法を用いた場合、ステンシルと基板を位置合わせした後に足場因子のパターニングを行い、ステンシルを剥がし、さらに基板と凹部が形成された天板を位置合わせした後に貼り合わせるといった複雑な製造工程が必要となる問題がある。また、上記方法ではチャンバーを構成する基板の凹部に足場因子を配することができない。チャンバーの底部を構成する平滑な基板に接着した細胞は、流路を流通する液体の流れを受け易く、その物理的な圧力が細胞培養に影響を及ぼす虞がある。このため、密閉系のチャンバーを構成する凹部の底面で細胞培養することが可能なマイクロチップの開発が望まれている。
【０００７】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、密閉系のチャンバーを構成する凹部の底面にだけ足場因子が配されたマイクロチップの製造方法、その製造方法に用いうる物理マスク、及びマイクロチップの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の請求項１に記載のマイクロチップの製造方法は、細胞培養用のチャンバー及び前記チャンバーに接続された流路が形成されたマイクロチップの製造方法であって、前記チャンバーとなる凹部及び前記流路となる溝部が表面に形成された基板、前記凹部に装入可能な凸部が備えられた物理マスク、並びに前記凹部及び溝部を覆う天板を準備して、前記基板の表面、凹部及び溝部に、細胞の接着を促す足場因子を吸着させる工程Ａと、前記物理マスクの凸部を前記基板の凹部に装入し、前記凸部によって前記凹部の底面の少なくとも一部を覆って、前記底面に吸着した前記足場因子を保護する工程Ｂと、前記覆った底面以外に吸着した前記足場因子を除去する工程Ｃと、前記凹部に装入した前記物理マスクを取り外す工程Ｄと、前記基板の表面に前記天板を接合させて、前記凹部及び溝部に蓋をする工程Ｅと、を含むことを特徴とする。
本発明の請求項２に記載のマイクロチップの製造方法は、請求項１において、前記工程Ｃにおいて、前記基板の表面及び溝部をプラズマ処理することによって、前記保護した足場因子以外の前記足場因子を除去することを特徴とする。
本発明の請求項３に記載のマイクロチップの製造方法は、請求項２において、前記工程Ｃにおいて、前記基板の表面及び前記天板の表面をプラズマ処理で活性化した後、前記工程Ｅにおいて、前記活性化された表面同士を圧着することによって、前記接合を行うことを特徴とする。
本発明の請求項４に記載のマイクロチップの製造方法は、請求項１〜３のいずれか一項において、前記足場因子が、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ゼラチン、又はポリリジンを含むことを特徴とする。
本発明の請求項５に記載の物理マスクは、請求項１〜４のいずれか一項に記載のマイクロチップの製造方法において使用する物理マスクであって、基体と、前記基体表面から突き出すように配された前記凸部とを少なくとも備え、前記凸部は柱状であり、その直径が前記凹部の直径よりも小さく、前記凸部の先端は、前記凹部の底面に密着可能な面形状であり、前記凸部の突き出す高さが、前記凹部の深さよりも長いことを特徴とする。
本発明の請求項６に記載の物理マスクは、請求項５において、前記物理マスクの材質が、ポリテトラフルオロエチレンであることを特徴とする。
本発明の請求項７に記載のマイクロチップは、細胞培養用のチャンバーとなる凹部及び前記チャンバーに接続された流路となる溝部が形成された基板と、前記凹部及び溝部を覆う天板と、を少なくとも備えたマイクロチップであって、前記凹部の底面にのみ、細胞接着を促す足場因子が配されていることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のマイクロチップの製造方法によれば、チャンバー底部にのみ足場因子を配したマイクロチップを簡単な工程で製造できる。
本発明の物理マスクによれば、基体から突き出した凸部を、チャンバーとなる凹部に装入し、凹部の底面に対して凸部の先端の面を密着させることによって、チャンバー底部の足場因子を物理的にマスクして保護することができる。この結果、マスクした領域以外の基板表面に対して物理的若しくは化学的な処理を施すことができ、不要な足場因子を一括して基板表面から除去することができる。
本発明のマイクロチップによれば、シールされて密閉系となっているチャンバーに、流路を通して細胞懸濁液を流入させることによって、当該チャンバーの底部の足場因子に細胞を接着させて培養することができる。足場因子によって当該細胞を安定に維持できるので、チャンバー内に別の溶液を流入させた場合にも、流入の勢いによって細胞が剥離する虞はない。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の第１の例のマイクロチップの全体を示す平面図である。
【図２】マイクロチップの要部を拡大した平面図である。
【図３】マイクロチップの要部を拡大した断面図である。
【図４】マイクロチップの要部を示す平面図である。
【図５】マイクロチップの製造に用いる基板、物理マスク及び天板の模式的な断面図である。
【図６】足場因子で表面を修飾した基板の模式的な断面図である。
【図７】足場因子で表面を修飾した基板の凹部に、物理マスクの凸部を装入した状態を示す模式的な断面図である。
【図８】足場因子で表面を修飾した基板の凹部に、物理マスクの凸部を装入した状態で、プラズマ処理を行っている様子を示す模式的な断面図である。
【図９】図８において、基板３についても同時にプラズマ処理を行っている様子を示す模式的な断面図である。
【図１０】製造された本発明にかかるマイクロチップの模式的な断面図である。
【図１１】基体２に物理マスク３０を装入して保持するための固定器具の模式的な断面図である。
【図１２】本発明にかかる物理マスクの一例の模式的な断面図である。
【図１３】本発明にかかるマイクロチップの製造方法の一例を示す斜視図である。
【図１４】本発明にかかるマイクロチップの製造方法の一例を示す斜視図である。
【図１５】本発明にかかるマイクロチップの製造方法の一例を示す斜視図である。
【図１６】試験結果を示す写真である。
【図１７】試験結果を示す写真である。
【図１８】試験結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、好適な実施の形態に基づき、図面を参照して本発明を説明する。
＜＜マイクロチップ＞＞
本発明の第１の例であるマイクロチップ１について、図１〜３に示す。
図１は、マイクロチップ１の全体を示す平面図であり、図２はマイクロチップ１の要部を拡大した平面図であり、図３はマイクロチップ１の要部を拡大した断面図である。
以下の説明において、マイクロチップ１の「長手方向」は、図１における矢印ｔの方向を意味し、マイクロチップ１の「短手方向」は、図１における矢印ｕの方向を意味するものとする。
【００１２】
図２および図３に示すように、マイクロチップ１は、平板状の基板２と、これに重ね合わされる平板状の天板３とによって構成することができる。
基板２の、天板３に対向する面２ａ（表面２ａ）には、試料液を導入して、細胞が培養されるチャンバー４となる凹部５が形成されている。
凹部５は、平面視円形の主空間凹部５ａと、主空間凹部５ａの外周側に、これを囲んで形成された外周空間凹部５ｂとからなる。外周空間凹部５ｂは、主空間凹部５ａより浅く形成されている。
図３に示すように、チャンバー４は、主空間凹部５ａ内の空間（主空間部４ａ）と、外周空間凹部５ｂ内の空間（外周空間部４ｂ）とからなる。
【００１３】
図１および図２に示すように、チャンバー４は、複数の行および複数の列からなる行列をなすように２次元的に配列される。
図示例では、合計６４のチャンバー部４が、８行および８列からなる行列をなすようアレイ状に配列されている。行を構成するチャンバー４は、長手方向（矢印ｔ方向）に沿って並び、列を構成するチャンバー４は、短手方向（矢印ｕ方向）に沿って並んでいる。各チャンバー４は、互いに間隔をおいて配列されている。
符号９Ａ〜９Ｈはそれぞれチャンバー部４がなす８つの行を示し、符号１０Ａ〜１０Ｈはそれぞれチャンバー部４がなす８つの列を示す。
【００１４】
基板２の表面２ａには、凹部５（チャンバー４）に連通する入口流路７と出口流路１５とが形成されている。
入口流路７は、長手方向に沿って形成された送液流路１１と、送液流路１１から分岐して各チャンバー４に連通する複数の導入流路１２とを有し、これら導入流路１２はそれぞれチャンバー部４に接続されているため、貯留部２１からの試料液を、送液流路１１から導入流路１２を経てチャンバー部４に導入することができる。
【００１５】
図１および図４に示すように、入口流路７は４つ形成され（入口流路７Ａ〜７Ｄという）、それぞれが異なる貯留部２１（貯留部２１Ａ〜２１Ｄという）に接続されている。
入口流路７Ａの送液流路１１Ａは第１行９Ａと第２行９Ｂの間に延在し、入口流路７Ｂの送液流路１１Ｂは第３行９Ｃと第４行９Ｄの間に延在し、入口流路７Ｃの送液流路１１Ｃは第５行９Ｅと第６行９Ｆの間に延在し、入口流路７Ｄの送液流路１１Ｄは第７行９Ｇと第８行９Ｈの間に延在している。
入口流路７Ａの送液流路１１Ａから分岐した第１導入流路１２Ａは、第１行９Ａと第２行９Ｂの各チャンバー４に接続され、入口流路７Ｂの送液流路１１Ｂから分岐した第２導入流路１２Ｂは、第３行９Ｃと第４行９Ｄの各チャンバー４に接続され、入口流路７Ｃの送液流路１１Ｃから分岐した第３導入流路１２Ｃは、第５行９Ｅと第６行９Ｆの各チャンバー４に接続され、入口流路７Ｄの送液流路１１Ｄから分岐した第４導入流路１２Ｄは、第７行９Ｇと第８行９Ｈの各チャンバー４に接続されている。
【００１６】
図４に示すように、マイクロチップ１では、入口流路７Ａ〜７Ｄが上記構成であるため、貯留部２１Ａからの試料液６Ａを入口流路７Ａから第１行９Ａおよび第２行９Ｂのチャンバー４に導入でき、貯留部２１Ｂからの試料液６Ｂを入口流路７Ｂから第３行９Ｃおよび第４行９Ｄのチャンバー４に導入でき、貯留部２１Ｃからの試料液６Ｃを第５行９Ｅと第６行９Ｆのチャンバー４に導入でき、貯留部２１Ｄからの試料液６Ｄを第７行９Ｇと第８行９Ｈのチャンバー４に導入できる。
したがって、各貯留部に所望の試料液を導入することによって、各チャンバー４に所望の試料液を導入することができる。
【００１７】
図１および図４に示すように、出口流路１５は、各チャンバー４に連通する複数の導出流路１３と、これら複数の導出流路１３が接続される排出流路１４とを有し、チャンバー４内の液を導出流路１３から排出流路１４を経て排出部２２に排出することができる。排出流路１４は長手方向に沿って形成されている。
図４に示すように、出口流路１５は、５つ形成され（出口流路１５Ａ〜１５Ｅという）、出口流路１５Ａの排出流路１４Ａは、第１行９Ａの外側（図４における上方）に形成され、出口流路１５Ｂの排出流路１４Ｂは、第２行９Ｂと第３行９Ｃの間に延在し、出口流路１５Ｃの排出流路１４Ｃは、第４行９Ｄと第５行９Ｅの間に延在し、出口流路１５Ｄの排出流路１４Ｄは、第６行９Ｆと第７行９Ｇの間に延在し、出口流路１５Ｅの排出流路１４Ｅは、第８行９Ｈの外側（図４における下方）に形成されている。
【００１８】
図４に示すように、出口流路１５Ａの導出流路１３Ａは、第１行９Ａのチャンバー４に接続され、出口流路１５Ｂの導出流路１３Ｂは、第２行９Ｂと第３行９Ｃのチャンバー４に接続され、出口流路１５Ｃの導出流路１３Ｃは、第４行９Ｄと第５行９Ｅのチャンバー４に接続され、出口流路１５Ｄの導出流路１３Ｄは、第６行９Ｆと第７行９Ｇのチャンバー４に接続され、出口流路１５Ｅの導出流路１３Ｅは、第８行９Ｈのチャンバー４に接続されている。
【００１９】
導出流路１３は、導入流路１２に比べて断面積を大きくするか、若しくは導入流路１２より短く形成することによって、導入流路１２に比べて流通抵抗を小さくすることができる。その結果、チャンバー４内の圧力が過度に上昇するのを防ぐことができる。
図示例では、導入流路１２と導出流路１３は、凹部５の外周空間凹部５ｂに連通している。導入流路１２と導出流路１３の連通箇所は、主空間凹部５ａを挟んで向かい合う位置とするのが好ましい。向かい合う位置とすることによって、導入流路１２から流入された試料液をチャンバー４内に充分拡散させることがより容易となる。
【００２０】
本発明にかかるマイクロチップ１において、チャンバー４を構成する凹部５の底面５ｃには、足場因子８が配されている（図３参照）。
足場因子８は、底面５ｃの少なくとも一部の領域に配されていればよく、底面５ｃの全領域に配されていてもよい。足場因子８が配された領域に細胞が接着するので、当該領域を広くするほど、細胞を接着して培養できる領域が広くなるので好ましい。
【００２１】
チャンバー４の底面５ｃは必ずしも平坦な平面である必要はなく、湾曲した曲面であってもよく、用途に応じた段差や突起が設けられていてもよい。後述する物理マスクの先端の面形状と密着させるために、底面５ｃは当該面形状にフィットする形状（例えば平坦な面）であることが好ましい。
【００２２】
チャンバー４を構成する凹部５において、主空間凹部５ａの側面５ｄ又は外周空間凹部５ｂの底面にも、足場因子８が配されていてもよい。ただし、底面５ｃに接着した細胞の培養環境（培養条件）と側面５ｄに接着した細胞の培養環境（培養条件）とは、厳密には異なるので、より正確に培養環境を揃える必要がある場合は、底面５ｃのみに足場因子８を配することが好ましい。
なお、前述の通り、本発明にかかるマイクロチップ１において、入口流路７及び出口流路１５に足場因子８は配されていないので、細胞が流路に接着して当該流路を目詰まりさせてしまうことを防止できる。
【００２３】
チャンバー４を構成する天板３の、基板２に対向する面３ａ（下面３ａ）の形状は特に制限されず、例えば平坦にすればよい。平坦であると、チャンバー４内を観察することがより容易となりうる。
【００２４】
以上で説明したように、本発明にかかるマイクロチップ１は、細胞培養用のチャンバー４となる凹部５及びチャンバー４に接続された流路１２，１３となる溝部Ｒが形成された基板２と、凹部５及び溝部Ｒを覆う天板３と、を少なくとも備えたマイクロチップであって、凹部５の底面５ｃにのみ、細胞接着を促す足場因子８が配されているものである。
【００２５】
マイクロチップ１のチャンバー４に細胞及び緩衝液を含む細胞懸濁液を流入させる方法としては、例えば以下のように行うことができる。
まず、細胞懸濁液を貯留部２１に注ぎ、排出部２２側を陰圧とすることによって、入口流路７の送液流路１１及び導入流路１２を介して、前記細胞懸濁液をチャンバー４に引き込むことができる。つぎに、当該細胞懸濁液をチャンバー４に滞留させて、細胞をチャンバー４の底面５ｃに沈降させる。所定時間のうちに、当該細胞は底面５ｃに配された足場因子８に接着する。つづいて、再び排出部２２側を陰圧とすることによって、出口流路１５の導出流路１３及び排出流路１４を介して、接着しなかった死細胞を含む緩衝液を、チャンバー４から排出部２２へ排出することができる。さらに、貯留部２１に前記細胞懸濁液に代えて、細胞培養に必要な栄養素等を含む培養液を導入して、排出部２２側を継続的に陰圧とすることによって、チャンバー４の底面５ｃに接着した細胞に対して、必要な養分等を常時供給することができる。また、前記培養液に種々の薬剤を含ませることによって、当該薬剤が当該細胞に与える影響を調べることができる。
【００２６】
ここでは、細胞懸濁液を導入流路１２を介して流入させる方法を示した。図２に示したように導入流路１２は比較的細長い流路となっているので、培養する細胞の種類や大きさによっては、導入流路１２を通すことが困難な場合も考えられる。この場合には、上記例とは逆方向に細胞懸濁液を送液して、当該細胞をチャンバー４へ流入させればよい。すなわち、細胞懸濁液を排出部２２に導入して、貯留部２１を陰圧とし、出口流路１５を介して前記細胞懸濁液をチャンバー４に引き込むことができる。上記例と同様に細胞を接着させた後、細胞を懸濁していた緩衝液を入口流路７から排出することができる。
このように、マイクロチップ１の送液の方向は、用途や目的に応じて、適宜調整することができる。
【００２７】
本発明にかかるマイクロチップは、図１〜４に示したマイクロチップ１の構成に限られない。貯留部の形状や大きさや数、流路の幅や深さや経路や数、チャンバーの形状や大きさや数等は、当該マイクロチップの用途や目的に応じて適宜設計することができる。
マイクロチップ１のチャンバー４は、図３に示したように、主空間部４ａの他に外周空間部４ｂが設けられている。外周空間部４ｂが設けられていることにより、チャンバー４内に液体を流入させた際に、チャンバー４内を元々満たしていた気体を全てチャンバー４外へ排出することがより容易にできる。
したがって、本発明にかかるマイクロチップのチャンバーには、主空間部４に加えて外周空間部４ｂが設けられていることが好ましい。また、外周空間部４ｂを設けず、主空間部４ａだけでチャンバー４を構成してもよい。
【００２８】
本発明にかかるマイクロチップ１において、チャンバー４を構成する凹部５の底面５ｃにのみ足場因子８が配されているので、細胞が入口流路７及び出口流路１５に接着することを防止できる。したがって、本発明のマイクロチップを用いることによって、足場因子８が配された凹部５の底面５ｃに試験対象である細胞を接着させて培養することができ、当該培養細胞に対する薬剤スクリーニング等の試験を、信頼性の高い培養環境（培養条件）で行うことができる。
培養細胞が足場因子を介して接着するメカニズムとしては、細胞表面に存在するインテグリン、カドヘリン等の接着タンパク質が足場因子８に接着することが一因として考えられる。
【００２９】
本発明にかかるマイクロチップ１において培養する細胞は、特に限定されず、例えばヒトを含む動物由来の細胞、植物由来の細胞、微生物由来の細胞等を目的に応じて使用できる。
培養可能な細胞の具体例としては、造血幹細胞、骨髄系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞などの体性幹細胞や胚性幹細胞、人工多能性幹細胞等が挙げられる。また、好中球、好酸球、好塩基球、単球、リンパ球（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞等）等の白血球や、血小板、赤血球、血管内皮細胞、リンパ系幹細胞、赤芽球、骨髄芽球、単芽球、巨核芽球および巨核球等の血液細胞、内皮系細胞、上皮系細胞、肝実質細胞、膵ラ島細胞等が例示できる。
【００３０】
＜＜マイクロチップの製造方法＞＞
本発明にかかるマイクロチップの製造方法の第一態様を、図５〜１０を参照して説明する。図５〜１０は、前述のマイクロチップ１を構成する基板２及び天板３の厚み方向の断面を、単純化した模式図である。
【００３１】
本発明にかかるマイクロチップの製造方法の第一態様は、図１に示した細胞培養用のチャンバー４及びチャンバー４に接続された流路１２，１３が形成されたマイクロチップ１の製造方法の一例であり、少なくとも以下の工程Ａ〜Ｅの工程を含むものである。
【００３２】
まず、図５に示すように、チャンバー４となる第一凹部５、導入流路１２（入口流路７）及び導出流路１３（出口流路１５）となる溝部Ｒが表面２ａに形成された基板２、第一凹部５に装入可能な凸部３１が備えられた物理マスク３０、並びに第一凹部５及び溝部Ｒを覆う天板３を準備する。
基板２には、第一凹部５及び溝部Ｒの他に、貯留部２１となる第二凹部５’及び排出部２２となる第三凹部５”も形成されている。図５では、図を簡略化するために第一凹部５を１個だけ描いてある。言うまでもないが、第一凹部５、第二凹部５’、第三凹部５”、及び溝部Ｒは、必要に応じて複数形成されていてよい。
また、天板３には、第二凹部５’及び第三凹部５”に対応する位置にスルーホールＴが設けられている。
【００３３】
基板２は、公知の方法によって作製されたものを用いることができる。基板２が樹脂製である場合、例えばレプリカモールディング法によって、第一〜第三凹部５，５’，５”及び溝部Ｒが一括して形成された基板２を作製できる。別の公知方法としては、例えば樹脂、ガラス、シリコン等の材料からなる平板の表面に、フォトリソグラフでレジストマスクを形成し、ＲＩＥ(Reactive Ion Etching)等のエッチング方法によって、第一〜第三凹部５，５’，５”及び溝部Ｒを形成することによって、基板２を作製することができる。また、レーザー加工、ＮＣ加工、光造形加工、射出成型加工、ナノインプリント加工等の方法を適宜使用することもできる。
【００３４】
基板２および天板３の材料は特に制限されず、例えば樹脂（プラスチック）、ガラス、シリコン等が使用できる。チャンバー４内の培養細胞を光学的に観察することが容易であるので、前記材料は透明材料であることが好ましく、具体的には樹脂及びガラスが好ましい。また、プラズマ処理によって基板２及び天板３の表面を活性化して、当該表面同士を圧着することによって、基板２と天板３とを接合できるので、前記材料は樹脂であることがより好ましい。前記樹脂としては、シリコーン系樹脂{例えばポリジメチルシロキサン(ＰＤＭＳ）}、アクリル系樹脂（例えばポリメタクリル酸メチル）、スチレン系樹脂（例えばポリスチレン）が高い透明性を有するため更に好ましい。
【００３５】
ＰＤＭＳの表面に直に接着できる細胞の種類は極めて少ないので、ＰＤＭＳからなる基板２を使用することによって、流路に細胞が接着してしまうことを防止できる。またＰＤＭＳは酸素透過性が高いので細胞培養用途のマイクロチップを作製する材料として適している。
したがって、基板２及び天板３の材料としては、ＰＤＭＳが特に好ましい。また、基板２及び天板３のうち、前記細胞懸濁液が接触する箇所のみをＰＤＭＳで構成してもよい。基板２及び天板３の材料は同じであっても異なっていてもよく、例えば基板２をＰＤＭＳ製とし、天板３をガラス製とすることができる。
【００３６】
基板２及び天板３のうち、前記細胞懸濁液又は培養液に接触する領域には、撥水処理等の表面加工を施してもよい。撥水処理を行った箇所では、細胞が接着することを抑制できると共に、前記細胞懸濁液や培養液等の液体の流れを一層スムーズにすることができる。前記撥水処理としては、−（ＣＦ２）ｎ−ＣＦ３基を持つパーフルオロアルキル基含有シラン（ＦＡＳ）やポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）などのフッ素樹脂を用いて、当該表面を被膜する公知の方法が例示できる。
【００３７】
[工程Ａ]
図６に示すように、第一態様の工程Ａは、基板２の表面２ａ、第一凹部５、第二凹部５’、第三凹部５”、及び溝部Ｒに、細胞の接着を促す足場因子８を吸着させる（配する）工程である。
足場因子８は、導入する細胞の接着を促して培養できるものであれば特に制限されず、例えば公知の細胞接着性タンパク質を含むものが使用できる。
【００３８】
前記細胞接着性タンパク質としては、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ゼラチン、およびポリリジン等が挙げられる。これらの細胞接着性タンパク質は一種だけを用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。なお、前記ポリリジンはペプチドであるが、本明細書及び特許請求の範囲においては、細胞接着性タンパク質と細胞接着性ペプチドとを区別せずに、両方とも細胞接着性タンパク質と呼ぶ。前記細胞接着性ペプチドとしては、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ゼラチン等の細胞接着性タンパク質を加水分解した分解物や、化学合成したポリリジンのペプチド鎖等が例示できる。
【００３９】
足場因子８に含まれる細胞接着性タンパク質は、そこに接着する細胞の生理活性に影響を与えることがある。例えば、一の細胞接着性タンパク質においては当該細胞が増殖せず、他の細胞接着性タンパク質においては当該細胞が活発に増殖する、ということがあり得る。したがって、使用する細胞接着性タンパク質については、このような影響を加味して適宜選択することが好ましい。
【００４０】
基板２の表面２ａ、凹部５及び溝部Ｒに足場因子８を配する方法としては、足場因子８の細胞接着性が損なわれない方法であれば特に制限されず、例えば物理的若しくは化学的に吸着させる方法が好適な方法として挙げられる。具体的には、足場因子８を懸濁又は溶解した塗布液を基板２の表面２ａ側の全面に塗布する方法が挙げられる。
本発明において、最終的に足場因子８を配する箇所は第一凹部５の底面５ｃのみであるが、工程Ａにおいては、基板２の表面２ａ側の全面に塗布することが好ましい（図６参照）。底面５ｃのみに塗布することは比較的困難であり、当該塗布の操作が複雑なものとなってしまうからである。一方、前記全面に塗布する方法は比較的容易であり、当該塗布の操作を簡便化できる。
【００４１】
前記塗布液を全面に塗布する方法としては、例えばスピンコート法が挙げられる。また、前記塗布液に基板２を浸漬させる方法も挙げられる。浸漬中に超音波処理等を行うことによって、基板２の表面に付着し得る気泡を除いて、前記全面にムラなくより均一に塗布することができる。
前記足場因子８を表面２ａ、凹部５及び溝部Ｒに接触させることによって、接触した面に当該足場因子８を物理的若しくはな化学的に吸着させることができる。
【００４２】
前記接触の時間は特に制限されないが、１分以上の接触時間が好ましく、５分以上の接触時間がより好ましく、３０分以上の接触時間が更に好ましい。この下限値以上とすることにより、前記吸着をより確実にすることができる。上限値は特に制限されず、例えば１０時間程度とすれば、前記吸着をより一層確実にすることができる。
この物理的な吸着によれば、足場因子８が本来有する細胞接着性若しくは生理活性を実質的に損なうことなく、前記全面に吸着させることができる。
【００４３】
前記塗布液には、足場因子８の他に、前記吸着を促進させるポリマー等を配合してもよい。前記吸着をより確実に又はより迅速に行うことが可能となり得る。前記ポリマーとしては、公知のポリマーを用いればよい。
【００４４】
足場因子８を前記全面に吸着させるために、前記全面に予め高分子材料をグラフト結合させて、この高分子材料を介して足場因子８を前記全面に結合させる方法も可能である。
具体的には、例えばアクリル酸を含む液を前記全面に塗布し、光重合させることによって前記全面にポリアクリル酸をグラフト結合し、次いでこの全面に足場因子８を接触させて足場因子８の有するアミノ基とポリアクリル酸のカルボキシル基とを脱水縮合により結合させる方法（化学的吸着）を採用できる。
【００４５】
前記塗布液を塗布することによって足場因子８を前記全面に吸着させた後は、前記塗布液を除去して、水分を基板２から除去して乾燥させることが好ましい。後段の工程における各操作において、当該水分が邪魔になる場合があるためである。前記乾燥の方法は、エアブローや減圧乾燥法等の公知の方法が適用できる。前記乾燥の際、足場因子８も同様に乾燥させてよい。
【００４６】
[工程Ｂ]
図７に示すように、第一態様の工程Ｂは、物理マスク３０の凸部３１を基板２の第一凹部５に装入し、凸部３１によって第一凹部５の底面５ｃの少なくとも一部を覆って、底面５ｃに吸着した足場因子８を保護する工程である。
【００４７】
工程Ｂでは、図７に示すように、物理マスク３０を構成する基体３２の表面３２ａから突き出すように配された凸部３１の先端の面３１ａ（以下、端面３１ａという）を、第一凹部５の底面５ｃに密着するように押し付けた状態とすることが好ましい。この状態であると、端面３１ａと底面５ｃの間にある足場因子８を外部から遮断して、保護することができる。この状態で、後段の工程Ｃを行うことが好ましい。
【００４８】
本発明において、物理マスク３０の形状は特に制限されず、その凸部３１が第一凹部５に装入可能であり且つ凸部３１が第一凹部５の底面５ｃに配された足場因子８を外部から遮断して保護できるものであればよい。
本発明にかかる物理マスクは、例えば図５〜９に示すように、基体３２と、基体３２の表面３２ａから突き出すように配された凸部３１とを少なくとも備え、凸部３１は円柱状であり、その直径ｌが第一凹部５の直径Ｌよりも小さく、凸部３１の先端は、第一凹部５の底面５ｃに密着可能な平坦な面であり、凸部３１の突き出す高さｈが、第一凹部５の深さＨよりも長い、物理マスク３０が好適なものとして挙げられる。
【００４９】
基板２の第一凹部５のサイズは特に制限されず、例えば直径Ｌを１０００μｍ〜２０００μｍとして、深さＨを１５０μｍ〜３００μｍとすることができる。この場合、物理マスク３０の柱状の凸部３１のサイズは、例えば直径ｍをチャンバー４の直径Ｌよりも１０μｍ〜５０μｍ小さくして、高さｈをチャンバー４の深さＨよりも１０μｍ〜５０μｍ大きくすればよい。
【００５０】
物理マスク３０の凸部３１の形状は必ずしも円柱である必要はなく、例えば楕円柱、四角柱、五角柱、六角柱等の柱状であることが好ましい。第一凹部５の形状及び底面５ｃの形状に合わせて、適宜選択すればよい。凸部３１の形状が柱状である場合、柱の側面の一部を削いだ形状としてもよい。例えば、図１２に示すように、柱状の凸部３１の側面３１ｂを削いだ形状としてもよい。柱状の凸部３１の側面３１ｂを削ることによって、後段の工程Ｃにおいて、第一凹部５の側面５ｄに配された足場因子８の除去がより容易となり得る。
【００５１】
凸部３１が基体３２から突き出す角度は特に制限されない。凸部３１を第一凹部５の底面５ｃに押し付ける際の圧力負荷が容易となるため、前記角度は基体２の表面３２ａに対して直角であることが好ましい。
【００５２】
図７に示すように、凸部３１が基体３２の表面３２ａから突き出す高さｈは、基板２の第一凹部５の深さよりも長いことが好ましい。この構成であると、凸部３１の端面３１ａを第一凹部５の底面５ｃに密着させることがより容易となる。さらにこの構成の場合、物理マスク３０の表面３２ａと基板２の表面２ａとの距離Ｇを０よりも大きくすることができ、後段の工程Ｃで除去すべき領域に配された足場因子８を物理マスク３０が覆ってしまうことを防ぐことができる。
【００５３】
前記距離Ｇは、後段の工程Ｃにおいて基板の表面２ａ及び溝部Ｒに配された足場因子８を除去することが容易となることから、大きいほど好ましい。基板２の表面２ａの面積及び物理マスク３０の表面３２ａの面積にもよるが、通常、距離Ｇの下限値は１μｍ以上であればよく、５μｍ以上が好ましく、１０μｍ以上がより好ましい。
前記下限値以上とすることによって、前記プラズマ処理におけるプラズマや前記化学処理におけるアルカリ溶液若しくは酸溶液等の処理液が、基板２と物理マスク３０の基体２との隙間に入り込むことがより容易となり、第一凹部５の底面５ｃ以外に配された余分な足場因子８を除去することがより容易となり得る。距離Ｇの上限値は特に制限されず、例えば５０μｍ〜５ｍｍ程度とすることができる。
【００５４】
凸部３１の端面３１ａが第一凹部５の底面５ｃを保護する領域の面積は、広いほど好ましい。保護した領域に配された足場因子８において細胞を培養することができるので、当該領域の面積が広いほど、細胞培養に使用し得る面積が広くなる。例えば、第一凹部５の底面５ｃの全面積を１００％とした場合、保護する領域は６０％以上が好ましく、７５％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましい。
【００５５】
基体２の表面２ａに設けられた第一凹部５の個数が複数である場合、物理マスク３０を構成する基体３２において、凸部３１は、当該第一凹部の個数に対応させて、複数設けられていることが好ましい。複数の凸部３１を基体３２に設ける位置は、基体３２を基板２の表面２ａに対向させた際に、複数の第一凹部５に複数の凸部３１が各々臨む位置とすることが好ましい。この構成であれば、基体２の複数の第一凹部５の各底面５ｃに配された足場因子８を、一個の物理マスク３０によって一括して保護することができる。
【００５６】
物理マスク３０を構成する基体３２の形状は、凸部３１を保持して、凸部３１を基板２の第一凹部５に装入できるものであれば特に制限されず、例えば平板状、網状、棒状等が挙げられる。基体３２が網状である場合、当該網を構成する縦棒と横棒の交点に凸部３１を配すればよい。また、基体３２が棒状である場合、当該棒の所望の位置に凸部３１を配することができる。これらの物理マスクは、例えば樹脂基板を材料とした機械加工によって作製できる。
【００５７】
物理マスク３０の材質（材料）は、後段の工程Ｃにおける処理に耐えうる材料であれば特に制限されず、例えば種々の樹脂が適用可能である。図５〜９に示す物理マスク３０を構成する基体３２は、平板状のポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）製であり、凸部３１も同様にＰＴＦＥ製である。ＰＴＦＥは、後段の工程Ｃにおいて使用しうるプラズマ処理やアルカリ若しくは酸等の化学処理に耐性を有すると共に、剛性を有するので、プラズマ処理時における基板２の変形を防止できるので好ましい。したがって、本発明にかかる物理マスクの材質は、ＰＴＦＥであることが好ましい。
【００５８】
ところで、物理マスク３０の凸部３１を基板２の第一凹部５内に装入した状態で固定する方法として、例えば図１１に示すような固定器具４０を使用できる。図１１は、固定器具４０、物理マスク３０及び基体２の模式的な断面図である。
固定器具４０は、固定板４１及び押さえ板４２を備えており、固定板４１の表面には基板２を保持可能な凹状の固定部４５が設けられている。この固定部４５内に基体２を固定し、物理マスク３０の凸部３１を基体２の第一凹部５に装入した状態で、物理マスク３０の基体３２の上面３２ｂを押さえ板４２によって押さえる。押さえ板４２によって基体３２を押す圧力は、固定板４１の底面に配されたナット４４及び押さえ板４２の上面に配したネジ４３の締め具合によって調整できる。ナット４４及びネジ４３を配する複数の位置は、基板２の中心に対して点対称とすることが好ましい。押さえ板４２による押さえる力を、物理マスク３０の基体３２の上面に均等に負荷することができる。
【００５９】
[工程Ｃ]
図８又は図９に示すように、第一態様の工程Ｃは、基板２の第一凹部５の底面５ｃ以外に吸着した足場因子８を除去する工程である。
図８に示すように、物理マスク３０によって第一凹部５の底面５ｃを保護した状態で、基板２の表面をプラズマ処理することによって、保護された底面５ｃ以外に配された足場因子８を変性又は焼却して、足場因子８の細胞接着性を失わせることができる。
ここで、本発明において「足場因子を除去する」とは、当該足場因子の細胞接着性を除去することを意味し、当該足場因子の物理的実体を完全に除去することだけを意味するものではない。
【００６０】
工程Ｃにおいて足場因子８を除去する方法としては、基板２の損傷を極力抑制しつつ、物理マスク３０で保護した領域以外の足場因子８を除去できる方法であれば特に制限されない。例えばプラズマ処理又は化学薬品処理が好適な除去方法として挙げられる。
【００６１】
前記プラズマ処理における作動ガス（処理ガス）としては、アルゴンガス、窒素ガス、酸素ガス等のプラズマを用いることができる。当該ガスにはブタジエンガス、炭酸ガス等を混合してもよい。ブタジエンガスを混合することによって、プラズマ処理した基板２の表面２ａに薄膜を形成して、当該表面２ａの接着性をより高めることができる。また炭酸ガスを混合することによって、前記接着性を調整することもできる。
【００６２】
前記化学薬品処理としては、ＮａＯＨ、ＫＯＨ等のアルカリ水溶液、塩酸、クロム酸等の酸水溶液、又はハロゲン化炭化水素系溶剤を用いた表面処理が挙げられる。
また、足場因子８の除去方法として、コロナ放電処理、オゾン処理、ＵＶ照射処理、電子線照射処理、又は火炎による表面処理等を適用してもよい。
【００６３】
工程Ｃにおいて、物理マスク３０によって保護した足場因子８以外の足場因子８を除去する方法としては、別途の乾燥処理が不要なドライプロセスであり、基体２の損傷を最低限で抑えることができるので、プラズマ処理が好ましい。基板２の表面２ａ及び溝部Ｒをプラズマ処理することによって、不要な足場因子８を除去できる。
【００６４】
[工程Ｄ]
第一態様の工程Ｄは、第一凹部５に装入した物理マスク３０を取り外す工程である。
物理マスク３０を構成する基体３２を引き上げることによって、第一凹部５内に装入して、底面５ｃに押し付けていた凸部３１を引き上げればよい。物理マスク３０がＰＴＦＥ製である場合は、耐久性に優れるので、繰り返し使用できる。
【００６５】
[工程Ｅ]
図１０に示すように、第一態様の工程Ｅは、基板２の表面２ａに天板３を接合させて、第一凹部５及び溝部Ｒに蓋をする工程である。
基板２の表面２ａに対して天板３の下面３ａを接合させる方法としては特に制限されず、例えば基板２の表面２ａに接着性を付与して、下面３ａを圧着させることによって接合させる公知の方法が適用できる。
前記接着性を付与する方法としては、基板２の表面２ａに接着剤を塗布する方法、基板２の表面２ａをプラズマ処理する方法等が挙げられる。
【００６６】
前段の工程Ｃにおいて、余分な足場因子８を除去するためにプラズマ処理を行う場合、当該プラズマ処理の処理室内に天板３を置いて、足場因子８の除去と同時に、天板３の下面３ａをプラズマ処理することが好ましい（図９参照）。
すなわち、本発明のマイクロチップの製造方法では、工程Ｃにおいて、前記プラズマ処理によって、基板２の表面２ａ及び天板３の表面３ａ（下面３ａ）をプラズマ処理で活性化した後、工程Ｅにおいて、前記活性化された表面同士を圧着することによって、前記接合を行うことが好ましい。この方法によれば、工程Ｃにおけるプラズマ処理によって、余分な足場因子８を除去できると共に、基板２の表面２ａに天板３を接合させるための前処理を行うことができるので、製造工程をより簡便化して製造効率を高められる。
【００６７】
前記プラズマ処理等によって基板２の表面２ａ及び／又は天板３の下面３ａに接着性を付与して、表面２ａと下面３ａとを合わせて圧着することによって、第一凹部５、第二凹部５’、第三凹部５”及び各溝部Ｒをシールして、貯留部２１、チャンバー４、送液流路１１、導入流路１２、導出流路１３、排出流路１４及び排出部２２を備えたマイクロチップ１を製造することができる（図１０参照）。なお、天板３において、第二凹部５’及び第三凹部５”に対応する位置にはスルーホールＴが各々設けられているので、貯留部２１及び排出部２２は、当該スルーホールＴを介して外部に連通している。
【００６８】
前記プラズマ処理の強度及び処理時間は、基板２、天板３、足場因子８、及びプラズマの種類によっても異なるが、例えば基板２及び天板３がＰＤＭＳであり、足場因子８が前記細胞接着性タンパク質であり、酸素プラズマを用いる場合、前記プラズマ処理は１００Ｗで１秒〜３０秒が好ましく、１秒〜２０秒がより好ましく、１秒〜１０秒が更に好ましい。下限値以上であることにより、足場因子８を充分に除去して、基板２及び天板３の接合面を充分に表面改質して接着性を付与することができる。上限値以下であることにより、基板２及び天板３の損傷を最小限に抑えることができる。
また、前記プラズマ処理における電力としては、１００〜２００Ｗが好ましい。前記電力範囲の下限値以上であると一層充分に表面改質することができ、上限値以下であると処理対象である基板及び天板の変形を抑制し易い。前記プラズマを発生させる処理室の圧力としては、５〜１０Ｐａが好ましい。前記処理室へのプラズマ作動ガス（処理ガス）の流入量としては、１００ｍＬ／分〜２００ｍｌ／分が好ましい。プラズマ処理が適切に行われたことは、例えばＰＤＭＳ基板の場合、その表面の水接触角が２５〜４０°となることによって確認できる。
【００６９】
本発明にかかるマイクロチップの製造方法は、本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて、前記工程Ａ〜Ｅ以外の工程又はステップを含んでいてもよい。
【実施例】
【００７０】
アレイ状に配置された複数の第一凹部５及び溝部Ｒが表面に形成された基板２をフォトリソグラフィ及びＰＤＭＳのレプリカモールディングによって作製した（図１３参照）。
基板２の表面に形成した微細構造は、個々に独立した６４個のチャンバー４（マイクロチャンバー）となる第一凹部５と合計9本の流路（マイクロ流路）となる溝部Ｒで構成されている。また、細胞導入ポート２１（貯留部２１）となる第二凹部５’及び薬剤導入ポート２２（排出部２２）となる第三凹部５”がそれぞれ４個ずつ形成されている。細胞導入ポート２１から細胞懸濁液をマイクロチャンバー内に導入でき、薬剤導入ポート２２から異なる液性因子を含む4種類の培地を灌流できるように設計されている。
【００７１】
以下の手順で、細胞接着性タンパク質を酸素プラズマによってパターニングすると同時に、プラズマボンディングによってマイクロチップ１を組み立てた。
１）PDMS製の基板２の表面に１００Ｗ、３秒の条件で酸素プラズマを照射して、基板表面を親水化（活性化）した後、第一凹部５のアレイ全面に１００μＭのコラーゲン水溶液若しくはフィブロネクチン水溶液を塗布し、３分間、３７℃の条件で当該細胞接着性タンパク質（足場因子８）を基板表面に物理的に吸着させた。
２）第一凹部５の形状に寸法が適合する凸部３１が、第一凹部５の配置に対応するように基体３２の表面に備えられたテフロン（登録商標）製の物理マスク３０を、基板２上に位置合わせして置き、各凸部３１を各第一凹部５に装入した（図１３参照）。
３）第一凹部５以外の領域に吸着した細胞接着性タンパク質を分解除去する目的、及び基板２を構成するPDMS表面の活性化を行う目的で、基体２及び物理マスク３０を図示しないホルダー（固定器具）で固定して、酸素プラズマを１００Ｗ、１０秒の条件で照射した（図１４参照）。この際、天板３も同時にプラズマ照射した。
４）ホルダーを分解し、物理マスク３０を取って、基体２及び天板３を圧着して接合さることによって、各マイクロチャンバー及び流路をシールして、細胞導入ポート２１、流路１１、チャンバー４、及び薬剤導入ポート２２を備えたマイクロチップ１を作製した（図１５参照）。
【００７２】
上記方法による足場因子８のパターニングの状態を観察するため、蛍光色素であるFITCで標識したコラーゲン又はTRITCで標識したフィブロネクチンを使用して、上記方法によってパターニングした。パターニング後の第一凹部５を蛍光観察したところ、細胞接着性タンパク質の種類に依らず、物理マスク３０の凸部３１のパターン通りに、すなわちマイクロチャンバー４の底部５ｃにのみ直径１ｍｍ程度の円形スポットで、細胞接着性タンパク質が固定化されていることが確認できた（図１６参照）。
【００７３】
図１６（ａ）は、FITC標識コラーゲンを吸着させたマイクロチャンバー４を蛍光顕微鏡で観察した写真であり、図１６（ｂ）は、プラズマ処理によるパターニング後の写真である。パターニング後のマイクロチャンバー４の底面５ｃにはFITC標識コラーゲンが除去されずに残っている。一方、底面５ｃ以外に配された当該コラーゲンは、プラズマ処理によって除去されていることが明らかである。
図１６（ｃ）は、TRITC標識フィブロネクチンを吸着させたマイクロチャンバー４を蛍光顕微鏡で観察した写真であり、図１６（ｄ）は、プラズマ処理によるパターニング後の写真である。パターニングの結果は、コラーゲンの場合と同様である。
【００７４】
マイクロチップ１の薬剤導入ポート２２に４種類の色素溶液を注入し、２０〜１００ｋＰａの圧力を印加することによって、マイクロチャンバー４を介して細胞導入ポート２１まで流した。注入した４種類の色素溶液は、漏れたり、混じり合わずに、各マイクロチャンバーに導入された（図１7参照）。このことは、流路に圧力を印加して液体を流した場合においても当該液体のリークが生じない程度に、基板２と天板３との充分な接着強度（接合強度）が得られたことを意味する。したがって、酸素プラズマ照射によって、物理マスク３０で保護した領域以外の細胞接着性タンパク質が充分に分解除去されると共に、除去された細胞接着性タンパク質層の下にあるＰＤＭＳ基板の表面２ａが充分に活性化されて、接合に必要な接着性が付与されたことが明らかである。
【００７５】
作製したマイクロチップ１中で、CHO細胞及びNIH3T3細胞の培養を行った。足場因子８としてコラーゲン又はフィブロネクチンを配したマイクロチャンバー４を用いた。各足場因子８を配したチャンバー４において、２４時間の静置培養によって各細胞は底面に接着し、進展した。ついで、４８時間の灌流培養によって各細胞は増殖した。その結果を図１８に示す。
【００７６】
図１８（ａ）は足場因子８を配していないマイクロチャンバーにおけるCHO細胞（24時間後）であり、図１８（ｂ）は足場因子８を配していないマイクロチャンバーにおけるNIH3T3細胞（24時間後）であり、図１８（ｃ，ｇ）はコラーゲンを配したマイクロチャンバー４におけるCHO細胞（24時間後、48時間後）であり、図１８（ｄ，ｈ）はコラーゲンを配したマイクロチャンバー４におけるNIH3T3細胞（24時間後、48時間後）であり、図１８（ｅ，ｉ）はフィブロネクチンを配したマイクロチャンバーにおけるCHO細胞（24時間後、48時間後）であり、図１８（ｆ，ｊ）はフィブロネクチンを配したマイクロチャンバーにおけるNIH3T3細胞（24時間後、48時間後）である。
【００７７】
CHO細胞、NIH3T3細胞の何れも、足場因子８の無いPDMS表面２ａにはほとんど接着しなかった（図１８（ａ，ｂ））。一方、足場因子８を上記パターニング方法によって配した場合には、細胞が当該足場因子８に接着して増殖した。したがって、当該足場因子８は、上記プラズマ処理の際に物理マスク３０によって保護されており、その細胞接着性を失わなかったことが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明を用いることで、培養環境を網羅的に解析するマイクロチップを簡便に作製することができ、細胞株ごとに異なる性質を有する幹細胞の分化誘導条件を個別に効率的に探索することが可能となる。したがって患者由来のiPS細胞を特定の組織に分化させ、疾患モデル細胞を作成する際の分化誘導プロセスが劇的に効率化する。将来的には、患者ごとに最適な条件で分化誘導された細胞や組織を用いるテーラーメード再生医療の実現につながると考えられる。また、幹細胞に限らず細胞の機能や運命は、液性因子と足場因子によって構成される外部環境に依存する複雑な細胞内シグナル伝達を経て決定されている。本発明によって実現する新たな研究ツールは、このような複雑な生命システムの動作原理の解明にも利用されていくことが期待される。
【符号の説明】
【００７９】
１…マイクロチップ、２…基板、２ａ…基板の表面、３…天板、３ａ…天板の下面、Ｔ…スルーホール、４…チャンバー、４ａ…主空間部、４ｂ…外周空間部、５…凹部（第一凹部）、５’…第二凹部、５”…第三凹部、５ａ…主空間凹部、５ｂ…外周空間凹部、５ｃ…凹部の底面、５ｄ…凹部の側面、Ｒ…溝部、Ｈ…凹部の深さ、Ｌ…凹部の直径、６，６Ａ〜６Ｄ…試料液、７，７Ａ〜７Ｄ…入口流路、８…足場因子、１１，１１Ａ〜１１Ｄ…送液流路、１２，１２Ａ〜１２Ｄ…導入流路、１３，１３Ａ〜１３Ｄ…導出流路、１４，１４Ａ〜１４Ｄ…排出流路、１５，１５Ａ〜１５Ｅ…出口流路、２１…貯留部、２２…排出部、３０…物理マスク、３１…凸部、３１ａ…凸部の先端の面（端面）、３２…基体、３２ａ…基体の表面（下面）、３２ｂ…基体の上面、ｈ…凸部の高さ、ｌ…柱状凸部の直径、Ｇ…基体表面と基板表面との距離（隙間の距離）、Ｐ…プラズマ、４０…固定器具、４１…固定板、４２…押さえ板、４３…ネジ、４４…ナット、４５…固定部。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養用のチャンバー及び前記チャンバーに接続された流路が形成されたマイクロチップの製造方法であって、
前記チャンバーとなる凹部及び前記流路となる溝部が表面に形成された基板、前記凹部に装入可能な凸部が備えられた物理マスク、並びに前記凹部及び溝部を覆う天板を準備して、
前記基板の表面、凹部及び溝部に、細胞の接着を促す足場因子を吸着させる工程Ａと、
前記物理マスクの凸部を前記基板の凹部に装入し、前記凸部によって前記凹部の底面の少なくとも一部を覆って、前記底面に吸着した前記足場因子を保護する工程Ｂと、
前記覆った底面以外に吸着した前記足場因子を除去する工程Ｃと、
前記凹部に装入した前記物理マスクを取り外す工程Ｄと、
前記基板の表面に前記天板を接合させて、前記凹部及び溝部に蓋をする工程Ｅと、
を含むことを特徴とするマイクロチップの製造方法。
【請求項２】
前記工程Ｃにおいて、前記基板の表面及び溝部をプラズマ処理することによって、前記保護した足場因子以外の前記足場因子を除去することを特徴とする請求項１に記載のマイクロチップの製造方法。
【請求項３】
前記工程Ｃにおいて、前記基板の表面及び前記天板の表面をプラズマ処理で活性化した後、前記工程Ｅにおいて、前記活性化された表面同士を圧着することによって、前記接合を行うことを特徴とする請求項２に記載のマイクロチップの製造方法。
【請求項４】
前記足場因子が、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ゼラチン、又はポリリジンを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のマイクロチップの製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のマイクロチップの製造方法において使用する物理マスクであって、
基体と、前記基体表面から突き出すように配された前記凸部とを少なくとも備え、
前記凸部は柱状であり、その直径が前記凹部の直径よりも小さく、
前記凸部の先端は、前記凹部の底面に密着可能な面形状であり、
前記凸部の突き出す高さが、前記凹部の深さよりも長いことを特徴とする物理マスク。
【請求項６】
前記物理マスクの材質が、ポリテトラフルオロエチレンであることを特徴とする請求項５に記載の物理マスク。
【請求項７】
細胞培養用のチャンバーとなる凹部及び前記チャンバーに接続された流路となる溝部が形成された基板と、前記凹部及び溝部を覆う天板と、を少なくとも備えたマイクロチップであって、
前記凹部の底面にのみ、細胞接着を促す足場因子が配されていることを特徴とするマイクロチップ。
【請求項１】
細胞培養用のチャンバー及び前記チャンバーに接続された流路が形成されたマイクロチップの製造方法であって、
前記チャンバーとなる凹部及び前記流路となる溝部が表面に形成された基板、前記凹部に装入可能な凸部が備えられた物理マスク、並びに前記凹部及び溝部を覆う天板を準備して、
前記基板の表面、凹部及び溝部に、細胞の接着を促す足場因子を吸着させる工程Ａと、
前記物理マスクの凸部を前記基板の凹部に装入し、前記凸部によって前記凹部の底面の少なくとも一部を覆って、前記底面に吸着した前記足場因子を保護する工程Ｂと、
前記覆った底面以外に吸着した前記足場因子を除去する工程Ｃと、
前記凹部に装入した前記物理マスクを取り外す工程Ｄと、
前記基板の表面に前記天板を接合させて、前記凹部及び溝部に蓋をする工程Ｅと、
を含むことを特徴とするマイクロチップの製造方法。
【請求項２】
前記工程Ｃにおいて、前記基板の表面及び溝部をプラズマ処理することによって、前記保護した足場因子以外の前記足場因子を除去することを特徴とする請求項１に記載のマイクロチップの製造方法。
【請求項３】
前記工程Ｃにおいて、前記基板の表面及び前記天板の表面をプラズマ処理で活性化した後、前記工程Ｅにおいて、前記活性化された表面同士を圧着することによって、前記接合を行うことを特徴とする請求項２に記載のマイクロチップの製造方法。
【請求項４】
前記足場因子が、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ゼラチン、又はポリリジンを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のマイクロチップの製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のマイクロチップの製造方法において使用する物理マスクであって、
基体と、前記基体表面から突き出すように配された前記凸部とを少なくとも備え、
前記凸部は柱状であり、その直径が前記凹部の直径よりも小さく、
前記凸部の先端は、前記凹部の底面に密着可能な面形状であり、
前記凸部の突き出す高さが、前記凹部の深さよりも長いことを特徴とする物理マスク。
【請求項６】
前記物理マスクの材質が、ポリテトラフルオロエチレンであることを特徴とする請求項５に記載の物理マスク。
【請求項７】
細胞培養用のチャンバーとなる凹部及び前記チャンバーに接続された流路となる溝部が形成された基板と、前記凹部及び溝部を覆う天板と、を少なくとも備えたマイクロチップであって、
前記凹部の底面にのみ、細胞接着を促す足場因子が配されていることを特徴とするマイクロチップ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
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【図１８】
【公開番号】特開２０１２−２３５７４９（Ｐ２０１２−２３５７４９Ａ）
【公開日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１０７５９２（Ｐ２０１１−１０７５９２）
【出願日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２２年１１月１５日 インターネットアドレス「ＲＳＣ ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇのＬａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ 誌の２０１１年１１巻２号 ２１２−２１４（ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｓ．ｒｓｃ．ｏｒｇ／ｅｎ／Ｃｏｎｔｅｎｔ／ＡｒｔｉｃｌｅＬａｎｄｉｎｇ／２０１１／ＬＣ／ｃ０１ｃ００３９０ｅ）及びＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍａｔｅｒｉａｌ （Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｓｃ．ｏｒｇ／ｓｕｐｐｄａｔａ／１ｃ／ｃ０／ｃ０１ｃ００３９０ｅ／ｃ０１ｃ００３９０ｅ．ｐｄｆ）」に発表
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２２年１１月１５日 インターネットアドレス「ＲＳＣ ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇのＬａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ 誌の２０１１年１１巻２号 ２１２−２１４（ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｓ．ｒｓｃ．ｏｒｇ／ｅｎ／Ｃｏｎｔｅｎｔ／ＡｒｔｉｃｌｅＬａｎｄｉｎｇ／２０１１／ＬＣ／ｃ０１ｃ００３９０ｅ）及びＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍａｔｅｒｉａｌ （Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｓｃ．ｏｒｇ／ｓｕｐｐｄａｔａ／１ｃ／ｃ０／ｃ０１ｃ００３９０ｅ／ｃ０１ｃ００３９０ｅ．ｐｄｆ）」に発表
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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