マンガンペルオキシダーゼの製造方法
【課題】マンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させることができる促進物質を添加した培地を用いて担子菌を培養する、マンガンペルオキシダーゼの製造方法の提供。
【解決手段】マンガン塩を含有する培地で担子菌を培養し、マンガンペルオキシダーゼを製造する方法であって、該培地中のマンガン塩濃度が２５０〜９００μｍｏｌ／Ｌであり、該培地は、さらにリグニンの酸分解物あるいは下記一般式（１）で表される化合物又はその塩を含有するマンガンペルオキシダーゼの製造方法（式中、Ｒは水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であり；Ｘは水素原子又は水酸基であり；ｌ及びｎは０又は１であり；ｍは１〜３の整数であり；ｍが２又は３である場合には複数の−［（ＣＨ２）ｌ−ＯＲ］は互いに同一でも異なっていても良い。）。
【解決手段】マンガン塩を含有する培地で担子菌を培養し、マンガンペルオキシダーゼを製造する方法であって、該培地中のマンガン塩濃度が２５０〜９００μｍｏｌ／Ｌであり、該培地は、さらにリグニンの酸分解物あるいは下記一般式（１）で表される化合物又はその塩を含有するマンガンペルオキシダーゼの製造方法（式中、Ｒは水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であり；Ｘは水素原子又は水酸基であり；ｌ及びｎは０又は１であり；ｍは１〜３の整数であり；ｍが２又は３である場合には複数の−［（ＣＨ２）ｌ−ＯＲ］は互いに同一でも異なっていても良い。）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、担子菌を培養してマンガンペルオキシダーゼを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マンガンペルオキシダーゼは酸化還元酵素の一種であり、ビフェノールの合成に有用であるだけでなく、パルプ漂白やダイオキシンなど有害物質の分解除去への利用が考えられている。マンガンペルオキシダーゼは、白色腐朽菌などの担子菌を培養することによって、その産生物として得ることができるが、その際、培地中のマンガン塩濃度がマンガンペルオキシダーゼの生産性に影響することが従来から知られている（非特許文献１参照）。
【０００３】
また、担子菌を培養する際に、培地へ添加することでマンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させることができる物質として、ベラトリルアルコールが知られている（非特許文献１参照）。
【非特許文献１】Ｐ．Ｂｏｎｎａｒｍｅ ａｎｄ Ｔ．Ｗ．Ｊｅｆｆｒｉｅｓ， Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．５６ Ｐ．２１０−２１７(１９９０)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
非特許文献１には、１９．７８ｍｇ／Ｌ（後述のバニラルアセトンを基質とした活性評価法による活性値として１９１５ｎｍｏｌ／ｍｉｎ，ｍｌ、培地単位体積あたりの産生量）の生産性でマンガンペルオキシダーゼを製造したことが記載されている。しかし、マンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させることができるマンガン塩の最適な濃度範囲については記載されておらず、また、マンガン塩及びベラトリルアルコール以外の培地中の成分と、マンガンペルオキシダーゼの生産性との関係についても記載されていない。そして、マンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させる物質については、これまでにベラトリルアルコール以外にはほとんど報告されていないのが現状である。
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みて為されたものであり、培地に含まれるマンガン塩などの成分をマンガンペルオキシダーゼの産生に適した濃度範囲に調整し、さらにマンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させることができる促進物質を含む培地を用いて担子菌を培養する、生産性の高いマンガンペルオキシダーゼの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、マンガンペルオキシダーゼの産生に最適な培地中のマンガン塩濃度が、従来知られていなかった特定の範囲に存在すること、また、培地中のグルコース濃度にも最適な濃度範囲が存在することを見出した。さらに、マンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させることができる促進物質として、特定の構造を有する化学物質群を見出した。その結果、これまでにない高い生産性でマンガンペルオキシダーゼが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、マンガン塩を含有する培地で担子菌を培養し、マンガンペルオキシダーゼを製造する方法であって、該培地中のマンガン塩濃度が２５０〜９００μｍｏｌ／Ｌであり、該培地は、さらにリグニンの酸分解物あるいは下記一般式（１）で表される化合物又はその塩を含有することを特徴とするマンガンペルオキシダーゼの製造方法を提供するものである。
【０００８】
【化１】
【０００９】
（式中、Ｒは水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であり；Ｘは水素原子又は水酸基であり；ｌ及びｎは０又は１であり；ｍは１〜３の整数であり；ｍが２又は３である場合には複数の−［（ＣＨ２）ｌ−ＯＲ］は互いに同一でも異なっていても良い。）
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、担子菌培養によるマンガンペルオキシダーゼの生産性を、従来に比し飛躍的に向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明について詳しく説明する。なお、以下において、単位「ｍＭ」は「ｍｍｏｌ／Ｌ」を、単位「μＭ」は「μｍｏｌ／Ｌ」をそれぞれ示す。
【００１２】
[使用する微生物]
本発明で使用される担子菌としては、例えば、ファネロケーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属、フレビア（Ｐｈｌｅｂｉａ）属、レンティヌラ（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）属、フェルリナス（Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ）属などに属する白色腐朽菌を挙げることができる。これらの中でも、ファネロケーテ属に属する菌が好ましい。ファネロケーテ属に属する菌の中でも、好ましいものとして、例えば、ファネロケーテ クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ファネロケーテ フラヴィド−アルバ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｆｌａｖｉｄｏ−ａｌｂａ）、ファネロケーテ ソルディダ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｓｏｒｄｉｄａ）、ファネロケーテ マグノリエ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）に属する菌等を挙げることができ、より好ましいものとして、ファネロケーテ クリソスポリウムに属する菌を挙げることができる。具体的には、例えば、ファネロケーテ クリソスポリウムＢＫＭ−Ｆ−１７６７（ＡＴＣＣ２４７２５）、ファネロケーテ クリソスポリウムＳＣ２６（ＡＴＣＣ６４３１４）、ファネロケーテ クリソスポリウムＭＥ４４６（ＡＴＣＣ３４５４１）、ファネロケーテ クリソスポリウムＨＨＢ−６２５１−ｓｐ（ＡＴＣＣ３４５４０）、ファネロケーテ クリソスポリウムＯＧＣ１０１（ＡＴＣＣ２０１５４２）、ファネロケーテ クリソスポリウム ＩＮＡ−１２（ＣＮＣＭ Ｉ−３９８）、ファネロケーテ クリソスポリウムＩ−１５１２ （ＣＮＣＭ Ｉ−１５１２）を挙げることができ、中でも特に好ましいものとしてファネロケーテ クリソスポリウムＢＫＭ−Ｆ−１７６７（ＡＴＣＣ２４７２５）が挙げられる。
また、これらを宿主とした遺伝子組換え体であってもよい。
【００１３】
[培地成分]
（促進物質）
本発明で用いる培地は、必須成分としてリグニンの酸分解物あるいは下記一般式（１）で表される化合物（以下、化合物（１）と略記する）又はその塩を含有する（以下、リグニンの酸分解物、化合物（１）、化合物（１）の塩をまとめて促進物質と略記することがある。）。このような促進物質を用いることで、マンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させることができる。なかでも、調製や入手の容易さから、化合物（１）又はその塩を用いるのが好ましい。
【００１４】
【化２】
【００１５】
（式中、Ｒは水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であり；Ｘは水素原子又は水酸基であり；ｌ及びｎは０又は１であり；ｍは１〜３の整数であり；ｍが２又は３である場合には複数の−［（ＣＨ２）ｌ−ＯＲ］は互いに同一でも異なっていても良い。）
【００１６】
式中、Ｒは水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基である。炭素数１〜３のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基が挙げられる。なかでも、マンガンペルオキシダーゼの生産性向上効果に特に優れることから、メチル基又はエチル基が好ましく、メチル基が特に好ましい。
Ｘは水素原子又は水酸基である。
【００１７】
ｌは０又は１であり、０であることが好ましい。
ｎは０又は１である。
ｍは１〜３の整数であり、２又は３であることが好ましい。ｍが２又は３である場合には、複数の−［（ＣＨ２）ｌ−ＯＲ］は互いに同一でも異なっていても良いが、Ｒが水素原子であるものとＲが炭素数１〜３のアルキル基であるものとが共存している方が好ましい。特にｎが０である場合には、複数の−［（ＣＨ２）ｌ−ＯＲ］について、Ｒがすべて水素原子でないものが好ましい。一方、ｎが１であり且つＸが水素原子である場合には、複数の−［（ＣＨ２）ｌ−ＯＲ］について、Ｒが水素原子であるものを含まないものが好ましい。
【００１８】
化合物（１）の中でも好ましいものとして、例えば、下記式（１１）〜（１７）で表される化合物（以下、それぞれ化合物（１１）〜（１７）と略記する）が挙げられる。化合物（１１）〜（１７）は、低濃度でもマンガンペルオキシダーゼの生産性向上効果に優れるだけでなく、可燃性や急性毒性などの危険性が低く安全性にも優れるものであり、その使用に際しては、特殊な操作や設備を必要としない。したがって、安全且つ低コストでマンガンペルオキシダーゼを製造できる。そして、マンガンペルオキシダーゼの生産性向上効果に特に優れることから、化合物（１）の中でもより好ましいものとして、化合物（１１）〜（１３）及び（１７）が挙げられ、特に好ましいものとして化合物（１１）が挙げられる。
化合物（１）は、市販品を用いても良いし、常法に従って調製したものを用いても良い。
【００１９】
【化３】
【００２０】
化合物（１）の塩は、化合物（１）に無機塩基又は有機塩基を作用させることで得られるものであり、例えば、化合物（１）がカルボキシ基や水酸基を有するものであれば、その水素原子が適当なカチオン種で置換されたものである。そして具体的には、例えば、化合物（１）のナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。また、化合物（１）の塩として市販品があれば、それを用いても良い。
【００２１】
リグニンの酸分解物とは、リグニンに硫酸、塩酸、硝酸等の強酸を作用させて分解処理を行ったものであり、その中には通常、前記化合物（１）が含有されると推測される。そしてリグニンは、例えば、セルロースを前記強酸で処理することで得られるので、バイオマスなど、セルロースを含有する原料を公知の手法により前記強酸で一貫処理すれば、リグニンの酸分解物が得られる。得られたリグニンの酸分解物は、必要に応じて精製してから用いれば良い。処理に用いる強酸としては、硫酸が好ましい。
【００２２】
促進物質は、一種を単独で用いても良いし、二種以上を併用しても良い。二種以上を併用する場合には、その組み合わせは特に限定されない。
【００２３】
促進物質の培地中の濃度は、０．１〜１０ｍＭとすることが好ましく、０．２〜５ｍＭとすることがより好ましい。上記範囲の上限よりも高い濃度としても勿論構わないが、このような低い濃度範囲であっても、十分なマンガンペルオキシダーゼの生産性向上効果が得られる。
【００２４】
本発明は、マンガンペルオキシダーゼの生産性向上効果を有する物質として、特定の構造を有する化学物質群（化合物（１））をはじめて見出したものである。そして、以下に述べるように最適な濃度のマンガン塩と併用することで、マンガンペルオキシダーゼの生産性を飛躍的に向上させることができるものである。
【００２５】
（マンガン塩）
本発明で用いる培地は、必須成分としてさらにマンガン塩を含有する。そして、使用することができるマンガン塩としては、例えば、硫酸マンガン、塩化マンガン、酢酸マンガン、炭酸マンガン、シュウ酸マンガン、硝酸マンガン、リン酸マンガン及びこれらの水和物などが挙げられる。
本発明では、これらマンガン塩の培地中濃度を２５０μＭ以上、好ましくは２５０〜９００μＭ、より好ましくは３００〜８００μＭとなるよう設定することで、担子菌の培養を良好に行うことができ、マンガンペルオキシダーゼの生産性を飛躍的に向上させることができる。担子菌の培養によってマンガンペルオキシダーゼを製造する場合、培地中のマンガン塩濃度がマンガンペルオキシダーゼの生産性に影響を与えることは報告されている（非特許文献１）が、マンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させるのに適したマンガン塩濃度についてはこれまで知られておらず、本発明では、例えば、非特許文献１に記載の方法に対して２〜３倍程度の高い生産性でマンガンペルオキシダーゼを製造することができる。
【００２６】
（炭素源）
本発明で使用する培地は、炭素源としてグルコースを含むことが好ましい。担子菌の培養で通常使用する炭素源としては、グルコース以外にグリセロール及びセルロースなどが挙げられ、本発明でもこれらを培地に含んでも良いが、培地中のグルコース濃度を好ましくは０．５質量％以上、より好ましくは１〜４質量％、特に好ましくは１．５〜３質量％となるよう設定することで、他の炭素源を用いた場合よりも、担子菌の培養を良好に行うことができ、マンガンペルオキシダーゼの生産性を飛躍的に向上させることができる。マンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させるために適切な培地中のグルコース濃度はこれまで知られておらず、本発明では、培地中のグルコース濃度を上記範囲、中でも１．５〜３質量％とすることで、特に高いマンガンペルオキシダーゼの生産性向上効果が得られる。前記の培地成分のマンガン塩濃度、及び炭素源としてのグルコース濃度を最適な条件とすることで、通常の２倍以上のマンガンペルオキシダーゼの生産性向上効果が得られる。
【００２７】
（その他の培地成分）
また本発明の培地は、前記の促進物質、マンガン塩及び炭素源以外に、窒素源、ビタミン、リン酸、界面活性剤、緩衝液、マンガン以外の各種金属塩等を含んでいてもよい。例えば、窒素源としては、酒石酸アンモニウムを始めとするアンモニウム塩などが挙げられる。ビタミンとしては、例えば、チアミンなどが挙げられる。界面活性剤としては、例えば、ツイーン８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、トリトンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、ホウ酸緩衝液などが挙げられる。マンガン以外の各種金属塩としては、例えば、硫酸マグネシウム、硫酸コバルト、硫酸亜鉛、硫酸カリウムアルミニウム、硫酸銅、硫酸第一鉄などの硫酸鉄、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸二水素カリウムなどのリン酸カリウム、モリブデン酸ナトリウムなど、あるいはこれらの水和物などが挙げられる。
またｐＨ調整剤として、塩酸、硫酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなど、通常使用される各種酸、アルカリを含んでいてもよい。これらの他、キレート剤としてニトリロ三酢酸などを含んでいてもよい。
なお、培地は調製後にオートクレーブ滅菌することが好ましい。
【００２８】
[培養条件]
本発明における担子菌の培養方法は、固体培養、液体培養のいずれであってもよいが、培養のし易さから液体培養が好ましい。担子菌の培養に適した培養温度は２０〜４５℃であるが、３５〜３７℃程度であることがより好ましい。また、培地のｐＨは３．５〜７．５が好ましく、４．０〜７．０がより好ましい。ｐＨの調整には各種の緩衝液や塩酸又は硫酸など通常用いられる酸、あるいは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニアなど、通常用いられるアルカリを使用することができる。
【００２９】
担子菌の培養は、静置培養、振とう培養及び撹拌培養のいずれでも行うことができる。従来、担子菌の培養を撹拌培養で良好に行うことは困難であったが、例えば、培養至適温度±２℃の温度で培養し、次いで当該温度と培養至適温度との差の絶対値より、培養至適温度との差の絶対値が大きくなるようにシフトさせた温度で培養を行うことによって、撹拌培養でも担子菌を良好に培養することができ、マンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させることができる。
この時、温度シフトのタイミングは、菌体増殖中期以降となるようにすることが好ましい。ここで菌体増殖中期とは、菌体の増殖が最も活発な対数増殖期を過ぎた直後の時期を指す。そして、撹拌培養とは、菌体を担体等に担持せず培地中に浮遊させた状態とし、撹拌翼等により培地を撹拌しながら菌体を培養することを指す。撹拌培養を行う際の撹拌速度は、培地量等により適宜選択すれば良い。
そして、温度シフト後の培養においては、酸素を含む気体、好ましくは分圧８０〜１００％の酸素を供給することが好ましい。
【００３０】
本発明の製造方法によれば、培地に前記促進物質を含有させ、さらに培地中のマンガン塩濃度を２５０〜９００μｍｏｌ／Ｌとすることで、マンガンペルオキシダーゼの生産性を従来よりも飛躍的に向上させることができ、例えば、非特許文献１に記載の方法における生産性の最高値が１９．７８ｍｇ／Ｌ（バニラルアセトンを基質とした活性評価法による活性値として１９１５ｎｍｏｌ／ｍｉｎ，ｍｌ、培地単位体積あたりの産生量）であるのに対して、本発明では２５ｍｇ／Ｌ（バニラルアセトンを基質とした活性評価法による活性値として約２４２０ｎｍｏｌ／ｍｉｎ，ｍｌ）以上のマンガンペルオキシダーゼが得られる。
また、培地中のグルコース濃度を特に好ましくは１．５〜３．０質量％と設定することで、マンガンペルオキシダーゼの生産性を従来よりも飛躍的に向上させることができる。
特に好適なマンガン塩濃度とグルコース濃度を選択した場合には、約３０〜約６０ｍｇ／Ｌ（バニラルアセトンを基質とした活性評価法による活性値として約２９００〜約５７００ｎｍｏｌ／ｍｉｎ，ｍｌ）程度のマンガンペルオキシダーゼが得られる。
そして、促進物質として安全性にも優れるものが使用できるので、特殊な操作や設備を必要としない。さらに、担子菌の培養は撹拌培養でも良好に行うことができるので、通常汎用される発酵槽を用いることもできる。したがって製造上の制約条件も少ないので、安全且つ低コストでマンガンペルオキシダーゼを製造できる。
なお、マンガンペルオキシダーゼの生産性は、例えば、後述の実施例に記載のように、バニラルアセトンを基質とした活性評価法によるマンガンペルオキシダーゼの活性値を測定することで算出することができる。また、この時得られた活性値を、濃度既知のＭｎＰ溶液の活性値と比較することにより、マンガンペルオキシダーゼの濃度ｍｇ／Ｌを算出しても良い。
【実施例】
【００３１】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に何ら限定されるものではない。
[実施例１]マンガン塩濃度とマンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）の生産性
（培地）
下記表１に示した各培地１Ｌを調製した。なお、表１中の６×トレースエレメンツの組成を表２に示した。そして、２Ｌ容量の三角フラスコに各培地を入れ、通気性の栓をして１２１℃、２０分間のオートクレーブ処理で滅菌した。
【００３２】
【表１】
【００３３】
【表２】
【００３４】
（培養）
前記の各培地にファネロケーテ クリソスポリウム ＢＫＭ−Ｆ−１７６７ （ＡＴＣＣ２４７２５）を植菌し、３５℃、１２０ｒｐｍで振盪（回転）培養を開始した。３日後、化合物（１１）（ｐ−メトキシフェノール）をそれぞれ濃度が１．５ｍＭとなるように１８６．２ｍｇ添加し、栓を通気用チューブの付いたシリコン栓に交換してから、フラスコ内の空気を酸素で置換した。通気用チューブをピンチコックで止め、培養を継続した。その後は１日２回、培養液のサンプリングと前記酸素供給操作を繰り返した。採取したサンプルは下記酵素活性測定に供した。
【００３５】
（ＭｎＰ活性測定）
ＭｎＰ活性は、４−（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｂｕｔｅｎｅ−２−ｏｎｅ（バニラルアセトン）を基質とした酸化反応の光学的測定により決定した。すなわち、分光光度計用石英セルを反応容器とし、この反応容器中に、蒸留水３８９μＬ、５００ｍＭ酒石酸ナトリウム（ｐＨ５．０）１００μＬ、５０ｍＭ硫酸マンガン１μＬ、２０ｍＭバニラルアセトン２．５μＬ、培養液（希釈）サンプル５μＬを入れ、これに対し１０ｍＭ過酸化水素２．５μＬを添加することで反応を開始した。
そして、分光光度計ＵＶ−１６５０ＰＣ（株式会社島津製作所製）を用いて、反応液のＵＶ３３４ｎｍにおける吸収の減少をモニタすることで反応初速度を測定した。バニラルアセトンのモル吸光係数として１８３００Ｍ−１ｃｍ−１を採用し、ＭｎＰ活性ｎｍｏｌ／ｍｉｎ，ｍｌを算出した。また、ここで得られた活性値を、濃度既知のＭｎＰ溶液の活性値と比較することにより、培養液サンプル中のＭｎＰの濃度ｍｇ／Ｌも併せて算出した。
試験区ａ〜ｆそれぞれにおけるＭｎＰの濃度の最高値を採用し、培地中硫酸マンガン濃度との関係を図１にまとめた。その結果、硫酸マンガン濃度が４５２．４μＭのとき最もＭｎＰ活性（生産性）が高く、５６２５ｎｍｏｌ／ｍｉｎ，ｍｌ（５８．１ｍｇ／Ｌ）となった。
【００３６】
[実施例２]グルコース濃度とＭｎＰの生産性
各試験区の培養液組成が下記表３の通りであること以外は実施例１と同様の方法にて担子菌の培養を行い、ＭｎＰの活性を測定した。試験区ｇ〜ｋそれぞれにおけるＭｎＰの濃度の最高値を採用し、培地中グルコース濃度との関係を図２にまとめた。その結果、グルコース濃度が２％のとき最もＭｎＰ活性（生産性）が高く、４４ｍｇ／Ｌとなった。
【００３７】
【表３】
【００３８】
[実施例３] 各種促進物質を用いて振とう培養した場合のＭｎＰの生産性（試験区ｌ〜ｒ）
培地組成が下記の通りであること、促進物質として加える化合物種およびその濃度が表４に記載の通りであること以外は、実施例１と同様の方法にて担子菌の培養を行い、ＭｎＰの活性を測定した。試験区ｌ〜ｒそれぞれにおけるＭｎＰの濃度の最高値を採用し、結果を表４にまとめた。いずれの試験区においても２５ｍｇ／Ｌ以上のＭｎＰ生産性が認められた。
【００３９】
（培地）
水にグルコース（２０ｇ）、酒石酸アンモニウム（０．２２ｇ）、６×トレースエレメンツ（２５．３５ｍｌ）、リン酸二水素カリウム（２ｇ）、硫酸マグネシウム七水和物（０．５ｇ）、塩化カルシウム二水和物（０．１ｇ）、チアミン塩酸塩（１ｍｇ）、酢酸（０．６ｇ）、水酸化ナトリウム（０．２ｇ）、ツイ−ン８０（０．５ｇ）を溶解し、塩酸でｐＨ４．５に調整後、更に水を加えて１ｋｇとした。
【００４０】
[実施例４]促進物質としてｐ−メトキシフェノールを用いて撹拌培養した場合のＭｎＰの生産性（試験区ｓ）
下記組成の培地を、ｐＨ電極を備えた５Ｌ容量発酵槽Ｂｉｏｎｅｅｒ−Ｎ型（株式会社丸菱バイオエンジ製）に仕込み、１２１℃、２０分間のオートクレーブ処理で滅菌した。
（培地）
水にグルコース（５０ｇ）、酒石酸アンモニウム（０．５５ｇ）、６×トレースエレメンツ（６３．３７５ｍｌ）、リン酸二水素カリウム（５ｇ）、硫酸マグネシウム七水和物（１．２５ｇ）、塩化カルシウム二水和物（０．２５ｇ）、チアミン塩酸塩（２．５ｍｇ）、酢酸（３ｇ）、水酸化ナトリウム（１ｇ）、ツイ−ン８０（２．５ｇ）を溶解し、塩酸でｐＨ４．５に調整後、更に水を加えて２．５ｋｇとした。
【００４１】
（培養）
前記発酵槽にファネロケーテ クリソスポリウム ＢＫＭ−Ｆ−１７６７ （ＡＴＣＣ２４７２５）を植菌し、３５℃、空気供給０．５ｖｖｍ、フルゾーン翼（神鋼パンテック株式会社製）１５０ｒｐｍの条件で撹拌培養を開始した。培養中、培養液のｐＨは４．５を維持するよう、硫酸及び水酸化ナトリウムを用いて制御した。
３日後、ｐ−メトキシフェノールを最終濃度が０．５ｍＭとなるように１５５．２ｍｇ添加し、空気の供給を停止すると共に、３０ｍｌ／ｍｉｎで酸素供給を開始した。更にこのとき、培養温度を３５℃から２８℃にシフトさせた。培養を継続し、経時的に培養液を採取した。採取したサンプルの酵素活性を測定し、ＭｎＰ濃度を算出した結果、表４に示すように２５ｍｇ／Ｌ以上の生産性が認められた。
【００４２】
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、安価なマンガンペルオキシダーゼの供給に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】実施例１における、培地中の硫酸マンガン濃度とマンガンペルオキシダーゼの生産性との関係を示したグラフである。
【図２】実施例２における、培地中のグルコース濃度とマンガンペルオキシダーゼの生産性との関係を示したグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、担子菌を培養してマンガンペルオキシダーゼを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マンガンペルオキシダーゼは酸化還元酵素の一種であり、ビフェノールの合成に有用であるだけでなく、パルプ漂白やダイオキシンなど有害物質の分解除去への利用が考えられている。マンガンペルオキシダーゼは、白色腐朽菌などの担子菌を培養することによって、その産生物として得ることができるが、その際、培地中のマンガン塩濃度がマンガンペルオキシダーゼの生産性に影響することが従来から知られている（非特許文献１参照）。
【０００３】
また、担子菌を培養する際に、培地へ添加することでマンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させることができる物質として、ベラトリルアルコールが知られている（非特許文献１参照）。
【非特許文献１】Ｐ．Ｂｏｎｎａｒｍｅ ａｎｄ Ｔ．Ｗ．Ｊｅｆｆｒｉｅｓ， Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．５６ Ｐ．２１０−２１７(１９９０)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
非特許文献１には、１９．７８ｍｇ／Ｌ（後述のバニラルアセトンを基質とした活性評価法による活性値として１９１５ｎｍｏｌ／ｍｉｎ，ｍｌ、培地単位体積あたりの産生量）の生産性でマンガンペルオキシダーゼを製造したことが記載されている。しかし、マンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させることができるマンガン塩の最適な濃度範囲については記載されておらず、また、マンガン塩及びベラトリルアルコール以外の培地中の成分と、マンガンペルオキシダーゼの生産性との関係についても記載されていない。そして、マンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させる物質については、これまでにベラトリルアルコール以外にはほとんど報告されていないのが現状である。
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みて為されたものであり、培地に含まれるマンガン塩などの成分をマンガンペルオキシダーゼの産生に適した濃度範囲に調整し、さらにマンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させることができる促進物質を含む培地を用いて担子菌を培養する、生産性の高いマンガンペルオキシダーゼの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、マンガンペルオキシダーゼの産生に最適な培地中のマンガン塩濃度が、従来知られていなかった特定の範囲に存在すること、また、培地中のグルコース濃度にも最適な濃度範囲が存在することを見出した。さらに、マンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させることができる促進物質として、特定の構造を有する化学物質群を見出した。その結果、これまでにない高い生産性でマンガンペルオキシダーゼが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、マンガン塩を含有する培地で担子菌を培養し、マンガンペルオキシダーゼを製造する方法であって、該培地中のマンガン塩濃度が２５０〜９００μｍｏｌ／Ｌであり、該培地は、さらにリグニンの酸分解物あるいは下記一般式（１）で表される化合物又はその塩を含有することを特徴とするマンガンペルオキシダーゼの製造方法を提供するものである。
【０００８】
【化１】
【０００９】
（式中、Ｒは水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であり；Ｘは水素原子又は水酸基であり；ｌ及びｎは０又は１であり；ｍは１〜３の整数であり；ｍが２又は３である場合には複数の−［（ＣＨ２）ｌ−ＯＲ］は互いに同一でも異なっていても良い。）
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、担子菌培養によるマンガンペルオキシダーゼの生産性を、従来に比し飛躍的に向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明について詳しく説明する。なお、以下において、単位「ｍＭ」は「ｍｍｏｌ／Ｌ」を、単位「μＭ」は「μｍｏｌ／Ｌ」をそれぞれ示す。
【００１２】
[使用する微生物]
本発明で使用される担子菌としては、例えば、ファネロケーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属、フレビア（Ｐｈｌｅｂｉａ）属、レンティヌラ（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）属、フェルリナス（Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ）属などに属する白色腐朽菌を挙げることができる。これらの中でも、ファネロケーテ属に属する菌が好ましい。ファネロケーテ属に属する菌の中でも、好ましいものとして、例えば、ファネロケーテ クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ファネロケーテ フラヴィド−アルバ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｆｌａｖｉｄｏ−ａｌｂａ）、ファネロケーテ ソルディダ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｓｏｒｄｉｄａ）、ファネロケーテ マグノリエ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｍａｇｎｏｌｉａｅ）に属する菌等を挙げることができ、より好ましいものとして、ファネロケーテ クリソスポリウムに属する菌を挙げることができる。具体的には、例えば、ファネロケーテ クリソスポリウムＢＫＭ−Ｆ−１７６７（ＡＴＣＣ２４７２５）、ファネロケーテ クリソスポリウムＳＣ２６（ＡＴＣＣ６４３１４）、ファネロケーテ クリソスポリウムＭＥ４４６（ＡＴＣＣ３４５４１）、ファネロケーテ クリソスポリウムＨＨＢ−６２５１−ｓｐ（ＡＴＣＣ３４５４０）、ファネロケーテ クリソスポリウムＯＧＣ１０１（ＡＴＣＣ２０１５４２）、ファネロケーテ クリソスポリウム ＩＮＡ−１２（ＣＮＣＭ Ｉ−３９８）、ファネロケーテ クリソスポリウムＩ−１５１２ （ＣＮＣＭ Ｉ−１５１２）を挙げることができ、中でも特に好ましいものとしてファネロケーテ クリソスポリウムＢＫＭ−Ｆ−１７６７（ＡＴＣＣ２４７２５）が挙げられる。
また、これらを宿主とした遺伝子組換え体であってもよい。
【００１３】
[培地成分]
（促進物質）
本発明で用いる培地は、必須成分としてリグニンの酸分解物あるいは下記一般式（１）で表される化合物（以下、化合物（１）と略記する）又はその塩を含有する（以下、リグニンの酸分解物、化合物（１）、化合物（１）の塩をまとめて促進物質と略記することがある。）。このような促進物質を用いることで、マンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させることができる。なかでも、調製や入手の容易さから、化合物（１）又はその塩を用いるのが好ましい。
【００１４】
【化２】
【００１５】
（式中、Ｒは水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であり；Ｘは水素原子又は水酸基であり；ｌ及びｎは０又は１であり；ｍは１〜３の整数であり；ｍが２又は３である場合には複数の−［（ＣＨ２）ｌ−ＯＲ］は互いに同一でも異なっていても良い。）
【００１６】
式中、Ｒは水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基である。炭素数１〜３のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基が挙げられる。なかでも、マンガンペルオキシダーゼの生産性向上効果に特に優れることから、メチル基又はエチル基が好ましく、メチル基が特に好ましい。
Ｘは水素原子又は水酸基である。
【００１７】
ｌは０又は１であり、０であることが好ましい。
ｎは０又は１である。
ｍは１〜３の整数であり、２又は３であることが好ましい。ｍが２又は３である場合には、複数の−［（ＣＨ２）ｌ−ＯＲ］は互いに同一でも異なっていても良いが、Ｒが水素原子であるものとＲが炭素数１〜３のアルキル基であるものとが共存している方が好ましい。特にｎが０である場合には、複数の−［（ＣＨ２）ｌ−ＯＲ］について、Ｒがすべて水素原子でないものが好ましい。一方、ｎが１であり且つＸが水素原子である場合には、複数の−［（ＣＨ２）ｌ−ＯＲ］について、Ｒが水素原子であるものを含まないものが好ましい。
【００１８】
化合物（１）の中でも好ましいものとして、例えば、下記式（１１）〜（１７）で表される化合物（以下、それぞれ化合物（１１）〜（１７）と略記する）が挙げられる。化合物（１１）〜（１７）は、低濃度でもマンガンペルオキシダーゼの生産性向上効果に優れるだけでなく、可燃性や急性毒性などの危険性が低く安全性にも優れるものであり、その使用に際しては、特殊な操作や設備を必要としない。したがって、安全且つ低コストでマンガンペルオキシダーゼを製造できる。そして、マンガンペルオキシダーゼの生産性向上効果に特に優れることから、化合物（１）の中でもより好ましいものとして、化合物（１１）〜（１３）及び（１７）が挙げられ、特に好ましいものとして化合物（１１）が挙げられる。
化合物（１）は、市販品を用いても良いし、常法に従って調製したものを用いても良い。
【００１９】
【化３】
【００２０】
化合物（１）の塩は、化合物（１）に無機塩基又は有機塩基を作用させることで得られるものであり、例えば、化合物（１）がカルボキシ基や水酸基を有するものであれば、その水素原子が適当なカチオン種で置換されたものである。そして具体的には、例えば、化合物（１）のナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。また、化合物（１）の塩として市販品があれば、それを用いても良い。
【００２１】
リグニンの酸分解物とは、リグニンに硫酸、塩酸、硝酸等の強酸を作用させて分解処理を行ったものであり、その中には通常、前記化合物（１）が含有されると推測される。そしてリグニンは、例えば、セルロースを前記強酸で処理することで得られるので、バイオマスなど、セルロースを含有する原料を公知の手法により前記強酸で一貫処理すれば、リグニンの酸分解物が得られる。得られたリグニンの酸分解物は、必要に応じて精製してから用いれば良い。処理に用いる強酸としては、硫酸が好ましい。
【００２２】
促進物質は、一種を単独で用いても良いし、二種以上を併用しても良い。二種以上を併用する場合には、その組み合わせは特に限定されない。
【００２３】
促進物質の培地中の濃度は、０．１〜１０ｍＭとすることが好ましく、０．２〜５ｍＭとすることがより好ましい。上記範囲の上限よりも高い濃度としても勿論構わないが、このような低い濃度範囲であっても、十分なマンガンペルオキシダーゼの生産性向上効果が得られる。
【００２４】
本発明は、マンガンペルオキシダーゼの生産性向上効果を有する物質として、特定の構造を有する化学物質群（化合物（１））をはじめて見出したものである。そして、以下に述べるように最適な濃度のマンガン塩と併用することで、マンガンペルオキシダーゼの生産性を飛躍的に向上させることができるものである。
【００２５】
（マンガン塩）
本発明で用いる培地は、必須成分としてさらにマンガン塩を含有する。そして、使用することができるマンガン塩としては、例えば、硫酸マンガン、塩化マンガン、酢酸マンガン、炭酸マンガン、シュウ酸マンガン、硝酸マンガン、リン酸マンガン及びこれらの水和物などが挙げられる。
本発明では、これらマンガン塩の培地中濃度を２５０μＭ以上、好ましくは２５０〜９００μＭ、より好ましくは３００〜８００μＭとなるよう設定することで、担子菌の培養を良好に行うことができ、マンガンペルオキシダーゼの生産性を飛躍的に向上させることができる。担子菌の培養によってマンガンペルオキシダーゼを製造する場合、培地中のマンガン塩濃度がマンガンペルオキシダーゼの生産性に影響を与えることは報告されている（非特許文献１）が、マンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させるのに適したマンガン塩濃度についてはこれまで知られておらず、本発明では、例えば、非特許文献１に記載の方法に対して２〜３倍程度の高い生産性でマンガンペルオキシダーゼを製造することができる。
【００２６】
（炭素源）
本発明で使用する培地は、炭素源としてグルコースを含むことが好ましい。担子菌の培養で通常使用する炭素源としては、グルコース以外にグリセロール及びセルロースなどが挙げられ、本発明でもこれらを培地に含んでも良いが、培地中のグルコース濃度を好ましくは０．５質量％以上、より好ましくは１〜４質量％、特に好ましくは１．５〜３質量％となるよう設定することで、他の炭素源を用いた場合よりも、担子菌の培養を良好に行うことができ、マンガンペルオキシダーゼの生産性を飛躍的に向上させることができる。マンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させるために適切な培地中のグルコース濃度はこれまで知られておらず、本発明では、培地中のグルコース濃度を上記範囲、中でも１．５〜３質量％とすることで、特に高いマンガンペルオキシダーゼの生産性向上効果が得られる。前記の培地成分のマンガン塩濃度、及び炭素源としてのグルコース濃度を最適な条件とすることで、通常の２倍以上のマンガンペルオキシダーゼの生産性向上効果が得られる。
【００２７】
（その他の培地成分）
また本発明の培地は、前記の促進物質、マンガン塩及び炭素源以外に、窒素源、ビタミン、リン酸、界面活性剤、緩衝液、マンガン以外の各種金属塩等を含んでいてもよい。例えば、窒素源としては、酒石酸アンモニウムを始めとするアンモニウム塩などが挙げられる。ビタミンとしては、例えば、チアミンなどが挙げられる。界面活性剤としては、例えば、ツイーン８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、トリトンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、ホウ酸緩衝液などが挙げられる。マンガン以外の各種金属塩としては、例えば、硫酸マグネシウム、硫酸コバルト、硫酸亜鉛、硫酸カリウムアルミニウム、硫酸銅、硫酸第一鉄などの硫酸鉄、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸二水素カリウムなどのリン酸カリウム、モリブデン酸ナトリウムなど、あるいはこれらの水和物などが挙げられる。
またｐＨ調整剤として、塩酸、硫酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなど、通常使用される各種酸、アルカリを含んでいてもよい。これらの他、キレート剤としてニトリロ三酢酸などを含んでいてもよい。
なお、培地は調製後にオートクレーブ滅菌することが好ましい。
【００２８】
[培養条件]
本発明における担子菌の培養方法は、固体培養、液体培養のいずれであってもよいが、培養のし易さから液体培養が好ましい。担子菌の培養に適した培養温度は２０〜４５℃であるが、３５〜３７℃程度であることがより好ましい。また、培地のｐＨは３．５〜７．５が好ましく、４．０〜７．０がより好ましい。ｐＨの調整には各種の緩衝液や塩酸又は硫酸など通常用いられる酸、あるいは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニアなど、通常用いられるアルカリを使用することができる。
【００２９】
担子菌の培養は、静置培養、振とう培養及び撹拌培養のいずれでも行うことができる。従来、担子菌の培養を撹拌培養で良好に行うことは困難であったが、例えば、培養至適温度±２℃の温度で培養し、次いで当該温度と培養至適温度との差の絶対値より、培養至適温度との差の絶対値が大きくなるようにシフトさせた温度で培養を行うことによって、撹拌培養でも担子菌を良好に培養することができ、マンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させることができる。
この時、温度シフトのタイミングは、菌体増殖中期以降となるようにすることが好ましい。ここで菌体増殖中期とは、菌体の増殖が最も活発な対数増殖期を過ぎた直後の時期を指す。そして、撹拌培養とは、菌体を担体等に担持せず培地中に浮遊させた状態とし、撹拌翼等により培地を撹拌しながら菌体を培養することを指す。撹拌培養を行う際の撹拌速度は、培地量等により適宜選択すれば良い。
そして、温度シフト後の培養においては、酸素を含む気体、好ましくは分圧８０〜１００％の酸素を供給することが好ましい。
【００３０】
本発明の製造方法によれば、培地に前記促進物質を含有させ、さらに培地中のマンガン塩濃度を２５０〜９００μｍｏｌ／Ｌとすることで、マンガンペルオキシダーゼの生産性を従来よりも飛躍的に向上させることができ、例えば、非特許文献１に記載の方法における生産性の最高値が１９．７８ｍｇ／Ｌ（バニラルアセトンを基質とした活性評価法による活性値として１９１５ｎｍｏｌ／ｍｉｎ，ｍｌ、培地単位体積あたりの産生量）であるのに対して、本発明では２５ｍｇ／Ｌ（バニラルアセトンを基質とした活性評価法による活性値として約２４２０ｎｍｏｌ／ｍｉｎ，ｍｌ）以上のマンガンペルオキシダーゼが得られる。
また、培地中のグルコース濃度を特に好ましくは１．５〜３．０質量％と設定することで、マンガンペルオキシダーゼの生産性を従来よりも飛躍的に向上させることができる。
特に好適なマンガン塩濃度とグルコース濃度を選択した場合には、約３０〜約６０ｍｇ／Ｌ（バニラルアセトンを基質とした活性評価法による活性値として約２９００〜約５７００ｎｍｏｌ／ｍｉｎ，ｍｌ）程度のマンガンペルオキシダーゼが得られる。
そして、促進物質として安全性にも優れるものが使用できるので、特殊な操作や設備を必要としない。さらに、担子菌の培養は撹拌培養でも良好に行うことができるので、通常汎用される発酵槽を用いることもできる。したがって製造上の制約条件も少ないので、安全且つ低コストでマンガンペルオキシダーゼを製造できる。
なお、マンガンペルオキシダーゼの生産性は、例えば、後述の実施例に記載のように、バニラルアセトンを基質とした活性評価法によるマンガンペルオキシダーゼの活性値を測定することで算出することができる。また、この時得られた活性値を、濃度既知のＭｎＰ溶液の活性値と比較することにより、マンガンペルオキシダーゼの濃度ｍｇ／Ｌを算出しても良い。
【実施例】
【００３１】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に何ら限定されるものではない。
[実施例１]マンガン塩濃度とマンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）の生産性
（培地）
下記表１に示した各培地１Ｌを調製した。なお、表１中の６×トレースエレメンツの組成を表２に示した。そして、２Ｌ容量の三角フラスコに各培地を入れ、通気性の栓をして１２１℃、２０分間のオートクレーブ処理で滅菌した。
【００３２】
【表１】
【００３３】
【表２】
【００３４】
（培養）
前記の各培地にファネロケーテ クリソスポリウム ＢＫＭ−Ｆ−１７６７ （ＡＴＣＣ２４７２５）を植菌し、３５℃、１２０ｒｐｍで振盪（回転）培養を開始した。３日後、化合物（１１）（ｐ−メトキシフェノール）をそれぞれ濃度が１．５ｍＭとなるように１８６．２ｍｇ添加し、栓を通気用チューブの付いたシリコン栓に交換してから、フラスコ内の空気を酸素で置換した。通気用チューブをピンチコックで止め、培養を継続した。その後は１日２回、培養液のサンプリングと前記酸素供給操作を繰り返した。採取したサンプルは下記酵素活性測定に供した。
【００３５】
（ＭｎＰ活性測定）
ＭｎＰ活性は、４−（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−ｂｕｔｅｎｅ−２−ｏｎｅ（バニラルアセトン）を基質とした酸化反応の光学的測定により決定した。すなわち、分光光度計用石英セルを反応容器とし、この反応容器中に、蒸留水３８９μＬ、５００ｍＭ酒石酸ナトリウム（ｐＨ５．０）１００μＬ、５０ｍＭ硫酸マンガン１μＬ、２０ｍＭバニラルアセトン２．５μＬ、培養液（希釈）サンプル５μＬを入れ、これに対し１０ｍＭ過酸化水素２．５μＬを添加することで反応を開始した。
そして、分光光度計ＵＶ−１６５０ＰＣ（株式会社島津製作所製）を用いて、反応液のＵＶ３３４ｎｍにおける吸収の減少をモニタすることで反応初速度を測定した。バニラルアセトンのモル吸光係数として１８３００Ｍ−１ｃｍ−１を採用し、ＭｎＰ活性ｎｍｏｌ／ｍｉｎ，ｍｌを算出した。また、ここで得られた活性値を、濃度既知のＭｎＰ溶液の活性値と比較することにより、培養液サンプル中のＭｎＰの濃度ｍｇ／Ｌも併せて算出した。
試験区ａ〜ｆそれぞれにおけるＭｎＰの濃度の最高値を採用し、培地中硫酸マンガン濃度との関係を図１にまとめた。その結果、硫酸マンガン濃度が４５２．４μＭのとき最もＭｎＰ活性（生産性）が高く、５６２５ｎｍｏｌ／ｍｉｎ，ｍｌ（５８．１ｍｇ／Ｌ）となった。
【００３６】
[実施例２]グルコース濃度とＭｎＰの生産性
各試験区の培養液組成が下記表３の通りであること以外は実施例１と同様の方法にて担子菌の培養を行い、ＭｎＰの活性を測定した。試験区ｇ〜ｋそれぞれにおけるＭｎＰの濃度の最高値を採用し、培地中グルコース濃度との関係を図２にまとめた。その結果、グルコース濃度が２％のとき最もＭｎＰ活性（生産性）が高く、４４ｍｇ／Ｌとなった。
【００３７】
【表３】
【００３８】
[実施例３] 各種促進物質を用いて振とう培養した場合のＭｎＰの生産性（試験区ｌ〜ｒ）
培地組成が下記の通りであること、促進物質として加える化合物種およびその濃度が表４に記載の通りであること以外は、実施例１と同様の方法にて担子菌の培養を行い、ＭｎＰの活性を測定した。試験区ｌ〜ｒそれぞれにおけるＭｎＰの濃度の最高値を採用し、結果を表４にまとめた。いずれの試験区においても２５ｍｇ／Ｌ以上のＭｎＰ生産性が認められた。
【００３９】
（培地）
水にグルコース（２０ｇ）、酒石酸アンモニウム（０．２２ｇ）、６×トレースエレメンツ（２５．３５ｍｌ）、リン酸二水素カリウム（２ｇ）、硫酸マグネシウム七水和物（０．５ｇ）、塩化カルシウム二水和物（０．１ｇ）、チアミン塩酸塩（１ｍｇ）、酢酸（０．６ｇ）、水酸化ナトリウム（０．２ｇ）、ツイ−ン８０（０．５ｇ）を溶解し、塩酸でｐＨ４．５に調整後、更に水を加えて１ｋｇとした。
【００４０】
[実施例４]促進物質としてｐ−メトキシフェノールを用いて撹拌培養した場合のＭｎＰの生産性（試験区ｓ）
下記組成の培地を、ｐＨ電極を備えた５Ｌ容量発酵槽Ｂｉｏｎｅｅｒ−Ｎ型（株式会社丸菱バイオエンジ製）に仕込み、１２１℃、２０分間のオートクレーブ処理で滅菌した。
（培地）
水にグルコース（５０ｇ）、酒石酸アンモニウム（０．５５ｇ）、６×トレースエレメンツ（６３．３７５ｍｌ）、リン酸二水素カリウム（５ｇ）、硫酸マグネシウム七水和物（１．２５ｇ）、塩化カルシウム二水和物（０．２５ｇ）、チアミン塩酸塩（２．５ｍｇ）、酢酸（３ｇ）、水酸化ナトリウム（１ｇ）、ツイ−ン８０（２．５ｇ）を溶解し、塩酸でｐＨ４．５に調整後、更に水を加えて２．５ｋｇとした。
【００４１】
（培養）
前記発酵槽にファネロケーテ クリソスポリウム ＢＫＭ−Ｆ−１７６７ （ＡＴＣＣ２４７２５）を植菌し、３５℃、空気供給０．５ｖｖｍ、フルゾーン翼（神鋼パンテック株式会社製）１５０ｒｐｍの条件で撹拌培養を開始した。培養中、培養液のｐＨは４．５を維持するよう、硫酸及び水酸化ナトリウムを用いて制御した。
３日後、ｐ−メトキシフェノールを最終濃度が０．５ｍＭとなるように１５５．２ｍｇ添加し、空気の供給を停止すると共に、３０ｍｌ／ｍｉｎで酸素供給を開始した。更にこのとき、培養温度を３５℃から２８℃にシフトさせた。培養を継続し、経時的に培養液を採取した。採取したサンプルの酵素活性を測定し、ＭｎＰ濃度を算出した結果、表４に示すように２５ｍｇ／Ｌ以上の生産性が認められた。
【００４２】
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、安価なマンガンペルオキシダーゼの供給に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】実施例１における、培地中の硫酸マンガン濃度とマンガンペルオキシダーゼの生産性との関係を示したグラフである。
【図２】実施例２における、培地中のグルコース濃度とマンガンペルオキシダーゼの生産性との関係を示したグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンガン塩を含有する培地で担子菌を培養し、マンガンペルオキシダーゼを製造する方法であって、
該培地中のマンガン塩濃度が２５０〜９００μｍｏｌ／Ｌであり、
該培地は、さらにリグニンの酸分解物あるいは下記一般式（１）で表される化合物又はその塩を含有することを特徴とするマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【化１】
（式中、Ｒは水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であり；Ｘは水素原子又は水酸基であり；ｌ及びｎは０又は１であり；ｍは１〜３の整数であり；ｍが２又は３である場合には複数の−［（ＣＨ２）ｌ−ＯＲ］は互いに同一でも異なっていても良い。）
【請求項２】
前記一般式（１）で表される化合物が、下記式（１１）〜（１７）で表される化合物のいずれか一種以上である請求項１に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【化２】
【請求項３】
前記培地中のマンガン塩濃度が３００〜８００μｍｏｌ／Ｌである請求項１又は２に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項４】
前記培地がグルコースを含有し、該培地中のグルコース濃度が１．５〜３．０質量％である請求項１〜３のいずれか一項に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項５】
前記担子菌がファネロケーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属に属する菌である請求項１〜４のいずれか一項に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項６】
前記ファネロケーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属に属する菌が、ファネロケーテ クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）種に属する菌である請求項５に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項７】
マンガンペルオキシダーゼの生産性が、２５ｍｇ／Ｌ以上及びバニラルアセトンを基質とした活性評価法による活性値として２４２０ｎｍｏｌ／ｍｉｎ，ｍｌ以上である請求項１〜６のいずれか一項に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項８】
前記培養が振とう培養又は撹拌培養である請求項１〜７のいずれか一項に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項１】
マンガン塩を含有する培地で担子菌を培養し、マンガンペルオキシダーゼを製造する方法であって、
該培地中のマンガン塩濃度が２５０〜９００μｍｏｌ／Ｌであり、
該培地は、さらにリグニンの酸分解物あるいは下記一般式（１）で表される化合物又はその塩を含有することを特徴とするマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【化１】
（式中、Ｒは水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であり；Ｘは水素原子又は水酸基であり；ｌ及びｎは０又は１であり；ｍは１〜３の整数であり；ｍが２又は３である場合には複数の−［（ＣＨ２）ｌ−ＯＲ］は互いに同一でも異なっていても良い。）
【請求項２】
前記一般式（１）で表される化合物が、下記式（１１）〜（１７）で表される化合物のいずれか一種以上である請求項１に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【化２】
【請求項３】
前記培地中のマンガン塩濃度が３００〜８００μｍｏｌ／Ｌである請求項１又は２に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項４】
前記培地がグルコースを含有し、該培地中のグルコース濃度が１．５〜３．０質量％である請求項１〜３のいずれか一項に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項５】
前記担子菌がファネロケーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属に属する菌である請求項１〜４のいずれか一項に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項６】
前記ファネロケーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属に属する菌が、ファネロケーテ クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）種に属する菌である請求項５に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項７】
マンガンペルオキシダーゼの生産性が、２５ｍｇ／Ｌ以上及びバニラルアセトンを基質とした活性評価法による活性値として２４２０ｎｍｏｌ／ｍｉｎ，ｍｌ以上である請求項１〜６のいずれか一項に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項８】
前記培養が振とう培養又は撹拌培養である請求項１〜７のいずれか一項に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−１００６８１（Ｐ２００９−１００６８１Ａ）
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２７５６９０（Ｐ２００７−２７５６９０）
【出願日】平成１９年１０月２３日（２００７．１０．２３）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（０００００２８８６）ＤＩＣ株式会社 (2,597)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月２３日（２００７．１０．２３）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（０００００２８８６）ＤＩＣ株式会社 (2,597)
【Ｆターム（参考）】
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