メンブランエンザイムイムノアッセイ法
【課題】 フロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ法を用いた検体の検査方法において、検出操作工程数を低減し、使い勝手のよい信頼性の高いアッセイ方法及びそのような方法において使用されるキットを提供すること。
【解決手段】 被検出物を捕捉するための捕捉抗体または抗原が結合したメンブランを備えたアッセイ装置を用いる、検体試料中の被検出物の簡易フロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ法であって、検体試料を濾過フィルター装置を用いて濾過後滴下し、被検出物をメンブラン上の捕捉抗体または抗原に捕捉させ、被検出物が捕捉された前記メンブラン上に被検出物と反応する物質を酵素で標識した酵素標識試薬を滴下し、前記検体試料中の被検出物の存在を洗浄工程なしに検出することを特徴とする方法、及び検体試料中の被検出物の存在を検査するためのキット。
【解決手段】 被検出物を捕捉するための捕捉抗体または抗原が結合したメンブランを備えたアッセイ装置を用いる、検体試料中の被検出物の簡易フロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ法であって、検体試料を濾過フィルター装置を用いて濾過後滴下し、被検出物をメンブラン上の捕捉抗体または抗原に捕捉させ、被検出物が捕捉された前記メンブラン上に被検出物と反応する物質を酵素で標識した酵素標識試薬を滴下し、前記検体試料中の被検出物の存在を洗浄工程なしに検出することを特徴とする方法、及び検体試料中の被検出物の存在を検査するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体試料中の被検出物を検出するための簡易フロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ法及びこの方法に使用されるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、抗原抗体反応や酵素反応を利用した、ウイルスや細菌等の病原体の感染の有無、妊娠の有無などの様々な検査を短時間のうちに行う簡易検査試薬やキットが開発されている。これらの試薬、キットにおいては、病原体構成成分、ヒト絨毛性ゴナドトロピン等が検出あるいは定量の対象である。簡易検査試薬の多くは、特別な設備を必要とせず操作も簡単で安価であるという特徴を有しており、例えば、妊娠診断のための簡易検査試薬は一般薬局で販売されている。また、病原体の感染を検査する簡易検査試薬は、他の検査試薬と異なり、大病院や医療検査センター以外にも一般の病院や診療所で広く使用されている。これらの施設は患者が最初に訪れる医療機関である場合が多く、患者から採取した検体についてその場で感染の有無が判明すれば、早い段階で治療措置を施すことができるため、簡易検査試薬の医療における重要性は益々高まってきている。
【０００３】
現在、簡易検査方法として、メンブランアッセイ法、特にニトロセルロース等の膜やフィルター等のメンブランを用いたアッセイ法が一般に知られており、フロースルー式アッセイ法とラテラルフロー式アッセイ法に大別される。前者は被検出物を含む溶液を膜に対して垂直方向に通過させるものであり、後者は水平方向に展開させるものである。
【０００４】
いずれの場合も被検出物に特異的に結合する捕捉物質、被検出物、被検出物に特異的に結合する標識物質の複合体をメンブラン上に形成させて、標識を検出あるいは定量することで、被検出物の検出あるいは定量を行うという点で共通している。
【０００５】
また、メンブランアッセイ法による簡易検査方法では、患者から実際に採取された検体の分析において、被検出物が検体中に存在しないにも係わらず陽性と判定してしまう、いわゆる偽陽性が生じることがある。病原体の感染を検査する際に偽陽性反応が発生すると、疾患に関して誤った情報を与えるため、原因の特定を遅らせるばかりでなく、不適切な措置を講じることになり病状がより重篤になる等の重大な結果をもたらすこともあり得る。従って、偽陽性を抑えることは簡易検査方法の主要な使用目的から見て、極めて重要な課題である。
【０００６】
従来、この問題を解決するために検体を高希釈したり、検体を希釈する溶液に界面活性剤、塩基性アミノ酸、無機塩などを含有する緩衝液を用いたり（特許文献１参照）、洗浄液として界面活性剤、塩基性アミノ酸、無機塩などを含有する緩衝液を用いたり（特許文献１参照）、また、試料を添加する際に濾過フィルターを通す（特許文献２参照）などの工夫がなされている。
【０００７】
標識に酵素を用いるフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ法は、高感度測定に向いた優れた方法であるが、上述のように検体を希釈したり洗浄液を使用したりする等検出操作工程数が多く、簡易アッセイ法としては問題である。
【０００８】
以下に、特許文献２中に記載されている酵素標識抗体を用いるフロースルー式アッセイ法（フロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ法）の操作手順の一例を示す。
（１）患者から採取した検体を緩衝液に浮遊させて検体試料を調製し、濾過フィルターを用いて濾過し、アッセイ装置に滴下する。
（２）酵素標識抗体を滴下する。
（３）洗浄液を滴下する。
（４）基質液を滴下し、発色反応させる。
（５）反応停止液を滴下する。
（６）メンブラン上の発色の有無により判定する。
【０００９】
このように、従来法は被検出物の検出までに多くの工程を必要とした。
【特許文献１】特開２００３−２７９５７７号公報
【特許文献２】特開２００４−２８８７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明は、フロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ法において、検体試料に含まれる被検出物を検出するための操作工程を低減させることを目的にする。更に本発明の目的は、検体試料中の被検出物を正確に且つ迅速に検出する方法、及びそのためのキットを提供することである。具体的には、本発明の洗浄工程を必要としない方法およびキットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願発明者は、鋭意研究の結果、洗浄液を用いることを止めて、洗浄工程を省くことにより上記目的を達成することができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本願発明者は、検体試料を濾過フィルター装置を用いて濾過することで非特異的反応を低減し、検体希釈液に界面活性剤および／またはウシ血清アルブミンを加えることで非特異的反応を低減し、基質液に界面活性剤を加えることで洗浄効果をもたせ、さらに濾過フィルター孔径を小さくし、メンブラン孔径を大きくすることにより、被検出物を捕捉するための捕捉抗体または抗原が結合したメンブランを備えたアッセイ装置上に被検出物を含む検体試料を濾過フィルター装置を用いて濾過後滴下し、被検出物をメンブラン上の捕捉抗体または抗原に捕捉させ、被検出物が捕捉された前記メンブラン上に被検出物と結合する物質を酵素で標識した酵素標識試薬を滴下し、捕捉抗体または抗原−被検出物−酵素標識試薬の免疫複合体を形成させ、続いて、前記酵素に対する基質を滴下する操作工程からなるフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ法において、洗浄工程を省くことができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
本発明の態様は、以下の通りである。
[１] 被検出物を捕捉するための捕捉抗体または捕捉抗原が結合したメンブランを備えたアッセイ装置のメンブラン上に、緩衝液で希釈した検体試料を濾過フィルター装置を用いて濾過した後に滴下し、被検出物を捕捉抗体または捕捉抗原に捕捉させ、被検出物が捕捉された前記メンブラン上に被検出物と結合する酵素標識試薬を滴下し、捕捉抗体又は捕捉抗原−被検出物−標識試薬の免疫複合体を形成させ、続いて、前記酵素に対する基質液を前記メンブラン上に滴下する工程からなり、洗浄液を用いて洗浄する工程を含まないフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ法、
[２] 検体を希釈する緩衝液に界面活性剤が終濃度０．２〜１０(w/v)％で含有されることを特徴とする[１]の方法、
[３] 検体を希釈する緩衝液に血清アルブミンが終濃度１〜５(w/v)％で含有されることを特徴とする[１]または[２]の方法、
[４] 濾過フィルターの孔径が０．１〜０．６μｍであることを特徴とする[１]〜[３]のいずれかの方法、
[５] メンブランの孔径が３〜１２μｍであることを特徴とする[１]〜[４]のいずれかの方法、
[６] 標識に用いる酵素がアルカリホスファターゼであることを特徴とする[１]〜[５]のいずれかの方法、
[７] 酵素の基質液に界面活性剤が０．０２〜１(w/v)％含有されることを特徴とする[１]〜[６]のいずれかの方法、
[８] 被検出物がインフルエンザウイルスであることを特徴とする[１]〜[７]のいずれかの方法、
[９] 検体が咽頭もしくは鼻腔拭い液、咽頭もしくは鼻腔洗浄液および鼻腔吸引液からなる群から選択される[１]〜[８]のいずれかの方法、ならびに
[１０] 以下を含む、検体試料中の被検出物の存在を洗浄液を使用することなく検出するためのフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイキット；
（１）孔径が０．１〜０．６μｍの濾過フィルター、
（２）被検出物を捕捉するための捕捉抗体または抗原が結合したメンブランであって、孔径が３〜１２μｍのメンブランを備えたアッセイ装置、
（３）検体希釈後の終濃度が０．２〜１０(w/v)％になるような濃度の界面活性剤および／または検体希釈後の終濃度が１〜５(w/v)％になるような濃度の血清アルブミンを含む検体希釈用緩衝液、
（４）酵素標識抗体または抗原、ならびに
（５）０．０２〜１(w/v)％の界面活性剤を含む基質液。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法及びキットにより、検出操作工程を低減することができ、使い勝手のよい信頼性の高いアッセイ法を確立することができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に本発明を詳しく説明する。
フロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ方法
本発明の方法は、被検出物を捕捉するための捕捉抗体または抗原が結合したメンブランを備えたアッセイ装置を用いる、検体試料中の被検出物の簡易アッセイ方法であって、検体試料を濾過フィルターを用いて濾過した後に前記メンブラン上に滴下し、被検出物をメンブラン上の捕捉抗体または抗原に捕捉させ、被検出物が捕捉された前記メンブラン上に被検出物と反応する酵素標識試薬を滴下し、捕捉抗体または抗原−被検出物−酵素標識試薬の免疫複合体を形成させ、続いて、免疫複合体が形成された前記メンブラン上に前記酵素に対する基質を滴下する操作工程からなるフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ法において、洗浄工程を省いたことを特徴とする。
【００１６】
以下に、本発明の方法についてより具体的な手順の一例を示し、本発明を説明する。
（１）患者から採取した検体を緩衝液で希釈して検体試料を調製し、濾過フィルターを用いて濾過し、アッセイ装置に滴下する。
（２）酵素標識試薬を滴下する。
（３）基質液を滴下し、発色反応させる。
（４）メンブラン上の発色の有無により判定する。
【００１７】
また、発色の有無を判定する際には、必要に応じて反応停止液を用いてもよい。
所定の反応時間で、判定を行う場合、反応停止液を滴下する操作は必要ないが、所定の反応時間で、反応停止液を滴下して反応を止めておいて、後で判定する場合に反応停止液を用いればよい。
【００１８】
本明細書にいうメンブランを備えたアッセイ装置（メンブランアッセイ装置ともいう）とは、被検出物に特異的に結合する捕捉抗体が固相化されたメンブランを含む装置である。このようなアッセイ装置としては、フロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ法を利用するアッセイ装置であることが好ましい。
【００１９】
フロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ装置は、例えば図１及び２に示されるような装置である。
【００２０】
図１は装置の平面図であり、図２は、図１のＩ−Ｉ’切断断面図である。図１及び２において、ａは、調製した検体試料を滴下する開口部を有し、底面部に試料が通過するための穴（Ａホール及びＢホール）を備えたアダプターである。ｂは被検出物に特異的に結合する捕捉抗体が結合したメンブランであり、ｃは液体を吸収する部材である。
【００２１】
メンブランアッセイ装置中のメンブランの材質としては、不織布、紙、ニトロセルロース、ガラス繊維、シリカ繊維、セルロースエステル、ナイロン６、６及びセルロースエステルとニトロセルロースの混合物からなる群から選択されるものが挙げられ、特に好ましくはニトロセルロースから作られた微多孔質物質があげられる。また、前記セルロースエステルとニトロセルロースの混合物も好適に用いることができる。上記メンブランの孔径あるいは保留粒子径は濾過フィルターの孔径または保留粒子径以上であり、かつ３〜１２μｍであることが好ましく、３〜５μｍが特に好ましい。また、メンブランの厚さは特に限定されないが、通常、１００〜２００μｍ程度である。
【００２２】
メンブランアッセイ装置のメンブラン表面には、被検出物と抗原抗体反応により特異的に結合し抗原抗体複合体を形成することにより被検出物を捕捉する抗体または抗原が固相化される。従って、被検出物により使用する捕捉抗体が異なることは当然であるが、被検出物が細菌、ウイルス、ホルモン、その他臨床マーカー等の場合には、これらに対し特異的に反応して結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等が挙げられる。抗原は、精製した天然の抗原またはリコンビナント抗原等が挙げられる。
【００２３】
このような捕捉抗体を上述したメンブランに結合させる方法としては、物理的吸着であってもよく、または化学的な結合によるものであってもよい。捕捉抗体が結合したメンブランの調製は、例えば、捕捉抗体を緩衝液等で希釈した溶液をメンブランに塗布して、その後乾燥することにより行われる。
【００２４】
本発明のメンブランアッセイ装置は、その他メンブランを通過した液体を吸収する液体吸収部材等を含んでいてもよい。
【００２５】
患者から採取した検体は、緩衝液で希釈して検体試料とし、濾過フィルターを用いて濾過される。濾過フィルターの孔径（直径）または保留粒子径は、０．１〜０．６μｍである。
【００２６】
濾過フィルターの孔径あるいは保留粒子径は、上記した洗浄工程を省くうえで極めて重要である。孔径あるいは保留粒子径が大きすぎるとメンブラン上で非特異的結合が起こって偽陽性を示す場合がある。逆に小さすぎると検体試料中に存在する粘性物や凝集物のためにフィルター自身が詰まってしまい濾過が不可能であるか、あるいはフィルター面積をかなり広くしなければならず、簡易検査方法に用いるという目的からみて不適切である。
【００２７】
濾過フィルターの材質は、特に限定されないが、好ましくはガラス繊維又はニトロセルロースである。
【００２８】
上記濾過フィルターは、上記アッセイ装置の検体を滴下する開口部に設けられていてもよいが、本発明の簡易アッセイ法またはキットにおいて、検体試料濾過用デバイスに取り付けて使用されることが好ましい。検体試料濾過デバイスは、濾過フィルターを備えた容器状のデバイスであり、例えばチューブ状のデバイスである（検体試料用濾過チューブ）。例えば、濾過チューブの先端に濾過フィルターを取り付け、濾過チューブ中に緩衝液で希釈した検体をいれて、先端に取り付けた濾過フィルターを通して濾過し、濾液をアッセイ装置中のメンブランに滴下する方法が簡便であり、好ましい。
【００２９】
この濾過チューブの一実施態様の模式図を図３及び図４に示す。濾過チューブは例えば図３に記載されるように先端部ｄと本体部ｅからなる形状であり、先端部の内部に図４に示されるように濾過フィルターｆが備えつけられている。本体部ｅに緩衝液で希釈した検体試料を入れ、本体部ｅに濾過フィルターｆを備えた先端部ｄを取り付ける。濾過フィルターｆを通して検体試料を濾過し、濾液をアッセイ装置のメンブレンに滴下する。本体部ｅがポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等のフレキシブルな材質からなると、濾過フィルターを取り付けた状態で、手などにより内部に圧力を加えることで、容易に検体試料を濾過することができるため、好ましい。
【００３０】
本明細書にいう被検出物は、何ら限定されず、それに対応する抗体を作製することができるあらゆる抗原物質であってもよい。例として、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、ＨＡＶ、ＨＢs、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ノーウォーク様ウイルス等のウイルス抗原、クラミジア・トラコマティス、溶連菌、百日咳菌、ヘリコバクター・ピロリ、レプトスピラ、トレポネーマ・パリダム、トキソプラズマ・ゴンディ、ボレリア、レジオネラ属菌、炭疽菌、MRSA等の細菌抗原、細菌等が産生する毒素、マイコプラズマ脂質抗原、ヒト絨毛製ゴナドトロピン等のペプチドホルモン、ステロイドホルモン等のステロイド、エピネフリンやモルヒネ等の生理活性アミン類、ビタミンＢ類等のビタミン類、プロスタグランジン類、テトラサイクリン等の抗生物質、各種腫瘍マーカー、農薬、環境ホルモン等をあげることができるが、これらに限定されない。
【００３１】
また、本明細書にいう被検出物は抗体であってもよく、例えばインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、ＨＡＶ、ＨＢs、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ノーウォーク様ウイルス等のウイルス抗原、クラミジア・トラコマティス、溶連菌、百日咳菌、ヘリコバクター・ピロリ、レプトスピラ、トレポネーマ・パリダム、トキソプラズマ・ゴンディ、ボレリア、レジオネラ属菌、炭疽菌、MRSA等の細菌抗原、細菌等が産生する毒素、マイコプラズマ脂質抗原に対する抗体をあげることができる。
【００３２】
検体は、例えば患者の咽頭あるいは鼻腔等から滅菌綿棒等の検体採取器具を使用して採取した咽頭あるいは鼻腔拭い液、咽頭あるいは鼻腔洗浄液、鼻腔吸引液、唾液、血清、便懸濁液、尿、培養液等を用いることができるが、このようにして得られた検体は、緩衝液に希釈してアッセイを行う。検体の希釈に用いる緩衝液としては、エンザイムイムノアッセイ，免疫凝集法等の免疫学的手法による抗原検出または定量において通常使用される緩衝液等を使用することができる。より具体的には、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
また、検体が患者の咽頭あるいは鼻腔等から滅菌綿棒等の検体採取器具を使用して採取した咽頭あるいは鼻腔拭い液、咽頭あるいは鼻腔洗浄液等の粘性を有する場合、検体を希釈する緩衝液中に検体が浮遊する。この場合、該緩衝液を検体浮遊緩衝液という。
【００３４】
検体を希釈する緩衝液には、検体を加えた際の終濃度で、界面活性剤０．２〜１０(w/v)％、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の動物由来血清アルブミン１〜５(w/v)％、または適当な濃度の無機塩等を含有させることができ、これらの緩衝液を使用して希釈することにより、検体中に含まれる被検出物以外の成分の、メンブラン自体への結合やメンブラン上の捕捉抗体への非特異的な結合を低減させることができ好ましい。
【００３５】
界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名）：ポリエチレングリコールモノ−р−イソオクチルフェニルエーテル、Ｔｗｅｅｎ ２０：ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Ｔｗｅｅｎ ８０：ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０：ノニデット Ｐ−４０、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ ３−１４：ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネ−ト、ＣＨＡＰＳ：３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕プロパンスルホン酸、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等あるいはこれらを２種類以上混合したものを用いることができるが、これらに限定されない。
【００３６】
酵素標識試薬は、被検出物に特異的に結合する物質を酵素で標識した酵素標識試薬である。被検出物に特異的に結合する物質は、限定されないが被検出物と特異的に結合する抗原または抗体が望ましい。例えば、被検出物がウイルス、細菌の抗原物質である場合には、そのウイルス抗原、細菌抗原に対する抗体であって、酵素で標識化されたものである。また、被検出物が抗体の場合は、該抗体が結合する抗原または該抗体に対する抗体であって、酵素で標識化されたものである。前記同様に被検出物に対し特異的に反応して結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等が使用される。
【００３７】
このような酵素標識試薬は、該酵素により触媒される反応により、比色法、蛍光法により検出可能な物質を生成する該酵素の基質液を添加することにより、複合体の検出を行うことができる。
【００３８】
酵素標識に使用される酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼがあげられる。酵素による物質の標識は公知の方法で行うことができる。
【００３９】
基質液は、酵素標識試薬の標識として用いた酵素に対する基質であって、該酵素により触媒される反応により、比色法、蛍光法により検出可能な物質を生成するものが使用される。具体例としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸／ニトロテトラゾリウムブルー、テトラメチルベンチジンがあげられる。
【００４０】
基質液は、メンブラン上に滴下したとき、基質液の大部分は短時間の内にメンブランを通過し液体吸収部材に吸収され、メンブランに残った基質液が標識酵素により発色反応する。従って、メンブランを通過する基質液は、洗浄作用を発揮していることになるので、一般的にエンザイムイムノアッセイに使用される界面活性剤を基質液に加えて、更に洗浄作用を上げて非特異的結合を低減することができる。
【００４１】
界面活性剤の濃度は０．０２〜１(w/v)％であることが好ましい。
本発明は、上記方法を行うためのアッセイキットをも包含する。
【００４２】
本発明のアッセイキットは、少なくとも以下の１〜５を含み、それぞれ上記の特性を備えていることが望ましい。
１ 濾過フィルター、
２ 被検出物を捕捉するための捕捉抗体または抗原が結合したメンブランを備えたアッセイ装置、
３ 検体希釈（浮遊）用緩衝液、
４ 酵素標識試薬、
５ 基質液
【００４３】
上記濾過フィルターは、さらに上述した検体試料用濾過チューブ等の検体試料濾過用デバイスに取り付けられていることが好ましい。
【００４４】
また，必要に応じて、キットの活性を検査するための緩衝液からなる陰性コントロール、被検出物を含む緩衝液からなる陽性コントロール、反応停止液を含むことができる。さらに、咽頭あるいは鼻腔拭い液等を採取するために用いる滅菌綿棒等の検体採取器具を含んでいてもよい。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４６】
実施例１
１．抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体の作製
（１）抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体
Ａ型インフルエンザウイルス抗原をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３×６３）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、３７℃インキュベーター中で維持し、Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原を固相したプレートを用いたＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。取得した該細胞２株をそれぞれプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。
【００４７】
得られた腹水からプロティンＡカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー法により、それぞれＩｇＧを精製し、２種類の精製抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体を得た。
【００４８】
（２）抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体
Ｂ型インフルエンザウイルス抗原を用い、（１）と同様の方法で、２種類の精製抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体を得た。
【００４９】
２．酵素標識抗インフルエンザウイルス抗体の作製
（１）酵素標識抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体の作製
精製抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体のうち１種類について４５ｍｇを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）で透析後、ペプシン１０ｍｇを添加し、３７℃で１時間、Ｆａｂ’消化処理を行った。処理液をウルトロゲルＡｃＡ３４カラムで分画して抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２精製画分を得た。前記画分を約１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮後、０．１Ｍメルカプトエチルアミンと１０：１の体積比で混合し、３７℃で９０分間還元処理を行った。処理液をウルトロゲルＡｃＡ３４カラムで分画して抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ’精製画分を得た後、約１ｍＬにまで濃縮した。
【００５０】
１０ｍｇ／ｍＬのアルカリホスファターゼ１．５ｍＬを１ｍＭ塩化マグネシウムならびに０．１ｍＭ塩化亜鉛を含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７．６）に透析後、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド０．７ｍｇを添加し、３０℃で１時間処理した。処理後の溶液をセファデックスＧ−２５カラムで分画し、最初のピークを回収してマレイミド−アルカリホスファターゼを得た後、約１ｍＬにまで濃縮した。
【００５１】
濃縮した抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ’とマレイミド−アルカリホスファターゼを１：２．３の蛋白比で混合し、４℃で２０時間穏やかに撹拌して反応させ、アルカリホスファターゼ標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ’を得た。更に、反応液をウルトロゲルＡｃＡ３４カラムで分画し、未反応物を除去して精製アルカリホスファターゼ標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ’を得た。精製アルカリホスファターゼ標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ’は、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、４％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１５ｍＭ塩化亜鉛、１％（Ｗ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．０９％アジ化ナトリウムを含む２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）の組成からなる標識抗体希釈液で希釈した後、０．２２μｍ孔径の濾過フィルターで濾過し、酵素標識抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体を得た。
【００５２】
（２）酵素標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体の作製
精製抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体のうち１種類について、（１）と同様の方法で、酵素標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体を得た。
【００５３】
インフルエンザウイルス検出用アッセイ装置の作製
インフルエンザウイルス検出用アッセイ装置は、図１及び図２に示すものと同様の構成のものを用いた。メンブランは、孔径３μｍを有するニトロセルロースメンブラン（サイズ２×３ｃｍ、厚さ１２５μｍ）を用いた。メンブランへの捕捉抗体の固相は、２種の抗体溶液をニトロセルロースメンブランへスポットして行った。装置のＡホールには精製抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体のうち標識に用いなかったものを１ｍｇ／ｍＬに含まれるように精製水を用いて希釈して０．２２μｍ孔径の濾過フィルターで濾過したものを１２μＬ、Ｂホールには精製抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体のうち標識に用いなかったものを１ｍｇ／ｍＬが含まれるように精製水を用いて希釈して０．２２μｍ孔径の濾過フイルターで濾過したものを１２μＬ、それぞれスポットした。スポット後、４５℃の乾燥庫で４０分間乾燥を行い、インフルエンザウイルス検出用アッセイ装置を作製した。
【００５４】
インフルエンザウイルスの検出
検体としてふ化鶏卵内で培養したＡ型インフルエンザウイルス並びにＢ型インフルエンザウイルスをそれぞれ用いた。
【００５５】
インフルエンザウイルスを検体浮遊用緩衝液（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １(w/v)％、ウシ血清アルブミン ４(w/v)％、塩化ナトリウム ０．１５Ｍ、アジ化ナトリウム ０．０９(w/v)％を含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０）を用いて検体試料用濾過チューブ内で１０倍階段希釈し、検体試料とした。
【００５６】
調製した検体試料をアッセイ装置のＡホールとＢホールにそれぞれ１５０μＬ滴下し、ニトロセルロースメンブランの下部に備えられた液体吸収部材に試料が完全に吸収されるまで静置した。
【００５７】
次にＡホールには酵素標識抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体を、Ｂホールには酵素標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体を、それぞれ１８０μＬずつ滴下し、液体吸収部材に酵素標識抗体が完全に吸収されるまで静置した。
【００５８】
次にアダプターを除去し、基質液（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸 ０．１５ｍｇ／ｍＬ、ニトロテトラゾリウムブルー ０．３ ｍｇ／ｍＬ、塩化マグネシウム ５ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．１(w/v)％、アジ化ナトリウム ０．０９(w/v)％に含む０．１Ｍ トリス緩衝液、ｐＨ９．５）をＡホールとＢホールにそれぞれ２５０μＬずつ滴下し、発色反応を開始させた。
【００５９】
１０分後にＡホールとＢホールを鉛直上方から観察し、Ａホールにのみ発色が認められた場合にはＡ型インフルエンザウイルス陽性、Ｂホールにのみ発色が認められた場合にはＢ型インフルエンザウイルス陽性、Ａ、Ｂ両ホールとも発色が認められない場合には陰性と判定した。
【００６０】
比較検討
同時に、洗浄液を用いた従来の検出操作手順による比較法による試験を行い比較した。
【００６１】
結果
検体としてＡ型インフルエンザウイルスを用いた時、ＡホールはＡ型インフルエンザウイルス濃度１０５（pfu/mL）まで陽性となり、Ｂホールは全て陰性となり、特異的にＡ型インフルエンザウイルスを検出できることが確かめられた。
【００６２】
また、検体としてＢ型インフルエンザウイルスを用いた時、ＢホールはＢ型インフルエンザウイルス濃度１０５（pfu/mL）まで陽性となり、Ａホールは全て陰性となり、特異的にＢ型インフルエンザウイルスを検出できることが確かめられた。
【００６３】
本発明法と比較法の成績は一致した成績が得られた。
得られた結果を表１及び表２に示す。
【００６４】
【表１】
【００６５】
【表２】
【００６６】
表１及び２に示すように、インフルエンザウイルスを特異的に高感度で検出できることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明の一実施態様であるフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ装置の平面図である。
【図２】図１のＩ−Ｉ’の切断断面図である。
【図３】本発明において使用される検体試料用濾過チューブの一実施態様を示す図である。
【図４】図３の検体試料用濾過チューブ先端部の透視図である。
【符号の説明】
【００６８】
Ａ：穴
Ｂ：穴
ａ：アダプター
ｂ：メンブラン
ｃ：液体吸収部材
ｄ：濾過チューブ先端部
ｅ：濾過チューブ本体部
ｆ：濾過フィルター
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体試料中の被検出物を検出するための簡易フロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ法及びこの方法に使用されるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、抗原抗体反応や酵素反応を利用した、ウイルスや細菌等の病原体の感染の有無、妊娠の有無などの様々な検査を短時間のうちに行う簡易検査試薬やキットが開発されている。これらの試薬、キットにおいては、病原体構成成分、ヒト絨毛性ゴナドトロピン等が検出あるいは定量の対象である。簡易検査試薬の多くは、特別な設備を必要とせず操作も簡単で安価であるという特徴を有しており、例えば、妊娠診断のための簡易検査試薬は一般薬局で販売されている。また、病原体の感染を検査する簡易検査試薬は、他の検査試薬と異なり、大病院や医療検査センター以外にも一般の病院や診療所で広く使用されている。これらの施設は患者が最初に訪れる医療機関である場合が多く、患者から採取した検体についてその場で感染の有無が判明すれば、早い段階で治療措置を施すことができるため、簡易検査試薬の医療における重要性は益々高まってきている。
【０００３】
現在、簡易検査方法として、メンブランアッセイ法、特にニトロセルロース等の膜やフィルター等のメンブランを用いたアッセイ法が一般に知られており、フロースルー式アッセイ法とラテラルフロー式アッセイ法に大別される。前者は被検出物を含む溶液を膜に対して垂直方向に通過させるものであり、後者は水平方向に展開させるものである。
【０００４】
いずれの場合も被検出物に特異的に結合する捕捉物質、被検出物、被検出物に特異的に結合する標識物質の複合体をメンブラン上に形成させて、標識を検出あるいは定量することで、被検出物の検出あるいは定量を行うという点で共通している。
【０００５】
また、メンブランアッセイ法による簡易検査方法では、患者から実際に採取された検体の分析において、被検出物が検体中に存在しないにも係わらず陽性と判定してしまう、いわゆる偽陽性が生じることがある。病原体の感染を検査する際に偽陽性反応が発生すると、疾患に関して誤った情報を与えるため、原因の特定を遅らせるばかりでなく、不適切な措置を講じることになり病状がより重篤になる等の重大な結果をもたらすこともあり得る。従って、偽陽性を抑えることは簡易検査方法の主要な使用目的から見て、極めて重要な課題である。
【０００６】
従来、この問題を解決するために検体を高希釈したり、検体を希釈する溶液に界面活性剤、塩基性アミノ酸、無機塩などを含有する緩衝液を用いたり（特許文献１参照）、洗浄液として界面活性剤、塩基性アミノ酸、無機塩などを含有する緩衝液を用いたり（特許文献１参照）、また、試料を添加する際に濾過フィルターを通す（特許文献２参照）などの工夫がなされている。
【０００７】
標識に酵素を用いるフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ法は、高感度測定に向いた優れた方法であるが、上述のように検体を希釈したり洗浄液を使用したりする等検出操作工程数が多く、簡易アッセイ法としては問題である。
【０００８】
以下に、特許文献２中に記載されている酵素標識抗体を用いるフロースルー式アッセイ法（フロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ法）の操作手順の一例を示す。
（１）患者から採取した検体を緩衝液に浮遊させて検体試料を調製し、濾過フィルターを用いて濾過し、アッセイ装置に滴下する。
（２）酵素標識抗体を滴下する。
（３）洗浄液を滴下する。
（４）基質液を滴下し、発色反応させる。
（５）反応停止液を滴下する。
（６）メンブラン上の発色の有無により判定する。
【０００９】
このように、従来法は被検出物の検出までに多くの工程を必要とした。
【特許文献１】特開２００３−２７９５７７号公報
【特許文献２】特開２００４−２８８７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明は、フロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ法において、検体試料に含まれる被検出物を検出するための操作工程を低減させることを目的にする。更に本発明の目的は、検体試料中の被検出物を正確に且つ迅速に検出する方法、及びそのためのキットを提供することである。具体的には、本発明の洗浄工程を必要としない方法およびキットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願発明者は、鋭意研究の結果、洗浄液を用いることを止めて、洗浄工程を省くことにより上記目的を達成することができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本願発明者は、検体試料を濾過フィルター装置を用いて濾過することで非特異的反応を低減し、検体希釈液に界面活性剤および／またはウシ血清アルブミンを加えることで非特異的反応を低減し、基質液に界面活性剤を加えることで洗浄効果をもたせ、さらに濾過フィルター孔径を小さくし、メンブラン孔径を大きくすることにより、被検出物を捕捉するための捕捉抗体または抗原が結合したメンブランを備えたアッセイ装置上に被検出物を含む検体試料を濾過フィルター装置を用いて濾過後滴下し、被検出物をメンブラン上の捕捉抗体または抗原に捕捉させ、被検出物が捕捉された前記メンブラン上に被検出物と結合する物質を酵素で標識した酵素標識試薬を滴下し、捕捉抗体または抗原−被検出物−酵素標識試薬の免疫複合体を形成させ、続いて、前記酵素に対する基質を滴下する操作工程からなるフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ法において、洗浄工程を省くことができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
本発明の態様は、以下の通りである。
[１] 被検出物を捕捉するための捕捉抗体または捕捉抗原が結合したメンブランを備えたアッセイ装置のメンブラン上に、緩衝液で希釈した検体試料を濾過フィルター装置を用いて濾過した後に滴下し、被検出物を捕捉抗体または捕捉抗原に捕捉させ、被検出物が捕捉された前記メンブラン上に被検出物と結合する酵素標識試薬を滴下し、捕捉抗体又は捕捉抗原−被検出物−標識試薬の免疫複合体を形成させ、続いて、前記酵素に対する基質液を前記メンブラン上に滴下する工程からなり、洗浄液を用いて洗浄する工程を含まないフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ法、
[２] 検体を希釈する緩衝液に界面活性剤が終濃度０．２〜１０(w/v)％で含有されることを特徴とする[１]の方法、
[３] 検体を希釈する緩衝液に血清アルブミンが終濃度１〜５(w/v)％で含有されることを特徴とする[１]または[２]の方法、
[４] 濾過フィルターの孔径が０．１〜０．６μｍであることを特徴とする[１]〜[３]のいずれかの方法、
[５] メンブランの孔径が３〜１２μｍであることを特徴とする[１]〜[４]のいずれかの方法、
[６] 標識に用いる酵素がアルカリホスファターゼであることを特徴とする[１]〜[５]のいずれかの方法、
[７] 酵素の基質液に界面活性剤が０．０２〜１(w/v)％含有されることを特徴とする[１]〜[６]のいずれかの方法、
[８] 被検出物がインフルエンザウイルスであることを特徴とする[１]〜[７]のいずれかの方法、
[９] 検体が咽頭もしくは鼻腔拭い液、咽頭もしくは鼻腔洗浄液および鼻腔吸引液からなる群から選択される[１]〜[８]のいずれかの方法、ならびに
[１０] 以下を含む、検体試料中の被検出物の存在を洗浄液を使用することなく検出するためのフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイキット；
（１）孔径が０．１〜０．６μｍの濾過フィルター、
（２）被検出物を捕捉するための捕捉抗体または抗原が結合したメンブランであって、孔径が３〜１２μｍのメンブランを備えたアッセイ装置、
（３）検体希釈後の終濃度が０．２〜１０(w/v)％になるような濃度の界面活性剤および／または検体希釈後の終濃度が１〜５(w/v)％になるような濃度の血清アルブミンを含む検体希釈用緩衝液、
（４）酵素標識抗体または抗原、ならびに
（５）０．０２〜１(w/v)％の界面活性剤を含む基質液。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法及びキットにより、検出操作工程を低減することができ、使い勝手のよい信頼性の高いアッセイ法を確立することができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に本発明を詳しく説明する。
フロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ方法
本発明の方法は、被検出物を捕捉するための捕捉抗体または抗原が結合したメンブランを備えたアッセイ装置を用いる、検体試料中の被検出物の簡易アッセイ方法であって、検体試料を濾過フィルターを用いて濾過した後に前記メンブラン上に滴下し、被検出物をメンブラン上の捕捉抗体または抗原に捕捉させ、被検出物が捕捉された前記メンブラン上に被検出物と反応する酵素標識試薬を滴下し、捕捉抗体または抗原−被検出物−酵素標識試薬の免疫複合体を形成させ、続いて、免疫複合体が形成された前記メンブラン上に前記酵素に対する基質を滴下する操作工程からなるフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ法において、洗浄工程を省いたことを特徴とする。
【００１６】
以下に、本発明の方法についてより具体的な手順の一例を示し、本発明を説明する。
（１）患者から採取した検体を緩衝液で希釈して検体試料を調製し、濾過フィルターを用いて濾過し、アッセイ装置に滴下する。
（２）酵素標識試薬を滴下する。
（３）基質液を滴下し、発色反応させる。
（４）メンブラン上の発色の有無により判定する。
【００１７】
また、発色の有無を判定する際には、必要に応じて反応停止液を用いてもよい。
所定の反応時間で、判定を行う場合、反応停止液を滴下する操作は必要ないが、所定の反応時間で、反応停止液を滴下して反応を止めておいて、後で判定する場合に反応停止液を用いればよい。
【００１８】
本明細書にいうメンブランを備えたアッセイ装置（メンブランアッセイ装置ともいう）とは、被検出物に特異的に結合する捕捉抗体が固相化されたメンブランを含む装置である。このようなアッセイ装置としては、フロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ法を利用するアッセイ装置であることが好ましい。
【００１９】
フロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ装置は、例えば図１及び２に示されるような装置である。
【００２０】
図１は装置の平面図であり、図２は、図１のＩ−Ｉ’切断断面図である。図１及び２において、ａは、調製した検体試料を滴下する開口部を有し、底面部に試料が通過するための穴（Ａホール及びＢホール）を備えたアダプターである。ｂは被検出物に特異的に結合する捕捉抗体が結合したメンブランであり、ｃは液体を吸収する部材である。
【００２１】
メンブランアッセイ装置中のメンブランの材質としては、不織布、紙、ニトロセルロース、ガラス繊維、シリカ繊維、セルロースエステル、ナイロン６、６及びセルロースエステルとニトロセルロースの混合物からなる群から選択されるものが挙げられ、特に好ましくはニトロセルロースから作られた微多孔質物質があげられる。また、前記セルロースエステルとニトロセルロースの混合物も好適に用いることができる。上記メンブランの孔径あるいは保留粒子径は濾過フィルターの孔径または保留粒子径以上であり、かつ３〜１２μｍであることが好ましく、３〜５μｍが特に好ましい。また、メンブランの厚さは特に限定されないが、通常、１００〜２００μｍ程度である。
【００２２】
メンブランアッセイ装置のメンブラン表面には、被検出物と抗原抗体反応により特異的に結合し抗原抗体複合体を形成することにより被検出物を捕捉する抗体または抗原が固相化される。従って、被検出物により使用する捕捉抗体が異なることは当然であるが、被検出物が細菌、ウイルス、ホルモン、その他臨床マーカー等の場合には、これらに対し特異的に反応して結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等が挙げられる。抗原は、精製した天然の抗原またはリコンビナント抗原等が挙げられる。
【００２３】
このような捕捉抗体を上述したメンブランに結合させる方法としては、物理的吸着であってもよく、または化学的な結合によるものであってもよい。捕捉抗体が結合したメンブランの調製は、例えば、捕捉抗体を緩衝液等で希釈した溶液をメンブランに塗布して、その後乾燥することにより行われる。
【００２４】
本発明のメンブランアッセイ装置は、その他メンブランを通過した液体を吸収する液体吸収部材等を含んでいてもよい。
【００２５】
患者から採取した検体は、緩衝液で希釈して検体試料とし、濾過フィルターを用いて濾過される。濾過フィルターの孔径（直径）または保留粒子径は、０．１〜０．６μｍである。
【００２６】
濾過フィルターの孔径あるいは保留粒子径は、上記した洗浄工程を省くうえで極めて重要である。孔径あるいは保留粒子径が大きすぎるとメンブラン上で非特異的結合が起こって偽陽性を示す場合がある。逆に小さすぎると検体試料中に存在する粘性物や凝集物のためにフィルター自身が詰まってしまい濾過が不可能であるか、あるいはフィルター面積をかなり広くしなければならず、簡易検査方法に用いるという目的からみて不適切である。
【００２７】
濾過フィルターの材質は、特に限定されないが、好ましくはガラス繊維又はニトロセルロースである。
【００２８】
上記濾過フィルターは、上記アッセイ装置の検体を滴下する開口部に設けられていてもよいが、本発明の簡易アッセイ法またはキットにおいて、検体試料濾過用デバイスに取り付けて使用されることが好ましい。検体試料濾過デバイスは、濾過フィルターを備えた容器状のデバイスであり、例えばチューブ状のデバイスである（検体試料用濾過チューブ）。例えば、濾過チューブの先端に濾過フィルターを取り付け、濾過チューブ中に緩衝液で希釈した検体をいれて、先端に取り付けた濾過フィルターを通して濾過し、濾液をアッセイ装置中のメンブランに滴下する方法が簡便であり、好ましい。
【００２９】
この濾過チューブの一実施態様の模式図を図３及び図４に示す。濾過チューブは例えば図３に記載されるように先端部ｄと本体部ｅからなる形状であり、先端部の内部に図４に示されるように濾過フィルターｆが備えつけられている。本体部ｅに緩衝液で希釈した検体試料を入れ、本体部ｅに濾過フィルターｆを備えた先端部ｄを取り付ける。濾過フィルターｆを通して検体試料を濾過し、濾液をアッセイ装置のメンブレンに滴下する。本体部ｅがポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等のフレキシブルな材質からなると、濾過フィルターを取り付けた状態で、手などにより内部に圧力を加えることで、容易に検体試料を濾過することができるため、好ましい。
【００３０】
本明細書にいう被検出物は、何ら限定されず、それに対応する抗体を作製することができるあらゆる抗原物質であってもよい。例として、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、ＨＡＶ、ＨＢs、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ノーウォーク様ウイルス等のウイルス抗原、クラミジア・トラコマティス、溶連菌、百日咳菌、ヘリコバクター・ピロリ、レプトスピラ、トレポネーマ・パリダム、トキソプラズマ・ゴンディ、ボレリア、レジオネラ属菌、炭疽菌、MRSA等の細菌抗原、細菌等が産生する毒素、マイコプラズマ脂質抗原、ヒト絨毛製ゴナドトロピン等のペプチドホルモン、ステロイドホルモン等のステロイド、エピネフリンやモルヒネ等の生理活性アミン類、ビタミンＢ類等のビタミン類、プロスタグランジン類、テトラサイクリン等の抗生物質、各種腫瘍マーカー、農薬、環境ホルモン等をあげることができるが、これらに限定されない。
【００３１】
また、本明細書にいう被検出物は抗体であってもよく、例えばインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、ＨＡＶ、ＨＢs、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ノーウォーク様ウイルス等のウイルス抗原、クラミジア・トラコマティス、溶連菌、百日咳菌、ヘリコバクター・ピロリ、レプトスピラ、トレポネーマ・パリダム、トキソプラズマ・ゴンディ、ボレリア、レジオネラ属菌、炭疽菌、MRSA等の細菌抗原、細菌等が産生する毒素、マイコプラズマ脂質抗原に対する抗体をあげることができる。
【００３２】
検体は、例えば患者の咽頭あるいは鼻腔等から滅菌綿棒等の検体採取器具を使用して採取した咽頭あるいは鼻腔拭い液、咽頭あるいは鼻腔洗浄液、鼻腔吸引液、唾液、血清、便懸濁液、尿、培養液等を用いることができるが、このようにして得られた検体は、緩衝液に希釈してアッセイを行う。検体の希釈に用いる緩衝液としては、エンザイムイムノアッセイ，免疫凝集法等の免疫学的手法による抗原検出または定量において通常使用される緩衝液等を使用することができる。より具体的には、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
また、検体が患者の咽頭あるいは鼻腔等から滅菌綿棒等の検体採取器具を使用して採取した咽頭あるいは鼻腔拭い液、咽頭あるいは鼻腔洗浄液等の粘性を有する場合、検体を希釈する緩衝液中に検体が浮遊する。この場合、該緩衝液を検体浮遊緩衝液という。
【００３４】
検体を希釈する緩衝液には、検体を加えた際の終濃度で、界面活性剤０．２〜１０(w/v)％、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の動物由来血清アルブミン１〜５(w/v)％、または適当な濃度の無機塩等を含有させることができ、これらの緩衝液を使用して希釈することにより、検体中に含まれる被検出物以外の成分の、メンブラン自体への結合やメンブラン上の捕捉抗体への非特異的な結合を低減させることができ好ましい。
【００３５】
界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名）：ポリエチレングリコールモノ−р−イソオクチルフェニルエーテル、Ｔｗｅｅｎ ２０：ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Ｔｗｅｅｎ ８０：ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０：ノニデット Ｐ−４０、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ ３−１４：ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネ−ト、ＣＨＡＰＳ：３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕プロパンスルホン酸、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等あるいはこれらを２種類以上混合したものを用いることができるが、これらに限定されない。
【００３６】
酵素標識試薬は、被検出物に特異的に結合する物質を酵素で標識した酵素標識試薬である。被検出物に特異的に結合する物質は、限定されないが被検出物と特異的に結合する抗原または抗体が望ましい。例えば、被検出物がウイルス、細菌の抗原物質である場合には、そのウイルス抗原、細菌抗原に対する抗体であって、酵素で標識化されたものである。また、被検出物が抗体の場合は、該抗体が結合する抗原または該抗体に対する抗体であって、酵素で標識化されたものである。前記同様に被検出物に対し特異的に反応して結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等が使用される。
【００３７】
このような酵素標識試薬は、該酵素により触媒される反応により、比色法、蛍光法により検出可能な物質を生成する該酵素の基質液を添加することにより、複合体の検出を行うことができる。
【００３８】
酵素標識に使用される酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼがあげられる。酵素による物質の標識は公知の方法で行うことができる。
【００３９】
基質液は、酵素標識試薬の標識として用いた酵素に対する基質であって、該酵素により触媒される反応により、比色法、蛍光法により検出可能な物質を生成するものが使用される。具体例としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸／ニトロテトラゾリウムブルー、テトラメチルベンチジンがあげられる。
【００４０】
基質液は、メンブラン上に滴下したとき、基質液の大部分は短時間の内にメンブランを通過し液体吸収部材に吸収され、メンブランに残った基質液が標識酵素により発色反応する。従って、メンブランを通過する基質液は、洗浄作用を発揮していることになるので、一般的にエンザイムイムノアッセイに使用される界面活性剤を基質液に加えて、更に洗浄作用を上げて非特異的結合を低減することができる。
【００４１】
界面活性剤の濃度は０．０２〜１(w/v)％であることが好ましい。
本発明は、上記方法を行うためのアッセイキットをも包含する。
【００４２】
本発明のアッセイキットは、少なくとも以下の１〜５を含み、それぞれ上記の特性を備えていることが望ましい。
１ 濾過フィルター、
２ 被検出物を捕捉するための捕捉抗体または抗原が結合したメンブランを備えたアッセイ装置、
３ 検体希釈（浮遊）用緩衝液、
４ 酵素標識試薬、
５ 基質液
【００４３】
上記濾過フィルターは、さらに上述した検体試料用濾過チューブ等の検体試料濾過用デバイスに取り付けられていることが好ましい。
【００４４】
また，必要に応じて、キットの活性を検査するための緩衝液からなる陰性コントロール、被検出物を含む緩衝液からなる陽性コントロール、反応停止液を含むことができる。さらに、咽頭あるいは鼻腔拭い液等を採取するために用いる滅菌綿棒等の検体採取器具を含んでいてもよい。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４６】
実施例１
１．抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体の作製
（１）抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体
Ａ型インフルエンザウイルス抗原をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３×６３）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、３７℃インキュベーター中で維持し、Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原を固相したプレートを用いたＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。取得した該細胞２株をそれぞれプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。
【００４７】
得られた腹水からプロティンＡカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー法により、それぞれＩｇＧを精製し、２種類の精製抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体を得た。
【００４８】
（２）抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体
Ｂ型インフルエンザウイルス抗原を用い、（１）と同様の方法で、２種類の精製抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体を得た。
【００４９】
２．酵素標識抗インフルエンザウイルス抗体の作製
（１）酵素標識抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体の作製
精製抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体のうち１種類について４５ｍｇを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）で透析後、ペプシン１０ｍｇを添加し、３７℃で１時間、Ｆａｂ’消化処理を行った。処理液をウルトロゲルＡｃＡ３４カラムで分画して抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆ（ａｂ’）２精製画分を得た。前記画分を約１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮後、０．１Ｍメルカプトエチルアミンと１０：１の体積比で混合し、３７℃で９０分間還元処理を行った。処理液をウルトロゲルＡｃＡ３４カラムで分画して抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ’精製画分を得た後、約１ｍＬにまで濃縮した。
【００５０】
１０ｍｇ／ｍＬのアルカリホスファターゼ１．５ｍＬを１ｍＭ塩化マグネシウムならびに０．１ｍＭ塩化亜鉛を含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７．６）に透析後、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド０．７ｍｇを添加し、３０℃で１時間処理した。処理後の溶液をセファデックスＧ−２５カラムで分画し、最初のピークを回収してマレイミド−アルカリホスファターゼを得た後、約１ｍＬにまで濃縮した。
【００５１】
濃縮した抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ’とマレイミド−アルカリホスファターゼを１：２．３の蛋白比で混合し、４℃で２０時間穏やかに撹拌して反応させ、アルカリホスファターゼ標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ’を得た。更に、反応液をウルトロゲルＡｃＡ３４カラムで分画し、未反応物を除去して精製アルカリホスファターゼ標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ’を得た。精製アルカリホスファターゼ標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ’は、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、４％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１５ｍＭ塩化亜鉛、１％（Ｗ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．０９％アジ化ナトリウムを含む２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）の組成からなる標識抗体希釈液で希釈した後、０．２２μｍ孔径の濾過フィルターで濾過し、酵素標識抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体を得た。
【００５２】
（２）酵素標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体の作製
精製抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体のうち１種類について、（１）と同様の方法で、酵素標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体を得た。
【００５３】
インフルエンザウイルス検出用アッセイ装置の作製
インフルエンザウイルス検出用アッセイ装置は、図１及び図２に示すものと同様の構成のものを用いた。メンブランは、孔径３μｍを有するニトロセルロースメンブラン（サイズ２×３ｃｍ、厚さ１２５μｍ）を用いた。メンブランへの捕捉抗体の固相は、２種の抗体溶液をニトロセルロースメンブランへスポットして行った。装置のＡホールには精製抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体のうち標識に用いなかったものを１ｍｇ／ｍＬに含まれるように精製水を用いて希釈して０．２２μｍ孔径の濾過フィルターで濾過したものを１２μＬ、Ｂホールには精製抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体のうち標識に用いなかったものを１ｍｇ／ｍＬが含まれるように精製水を用いて希釈して０．２２μｍ孔径の濾過フイルターで濾過したものを１２μＬ、それぞれスポットした。スポット後、４５℃の乾燥庫で４０分間乾燥を行い、インフルエンザウイルス検出用アッセイ装置を作製した。
【００５４】
インフルエンザウイルスの検出
検体としてふ化鶏卵内で培養したＡ型インフルエンザウイルス並びにＢ型インフルエンザウイルスをそれぞれ用いた。
【００５５】
インフルエンザウイルスを検体浮遊用緩衝液（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １(w/v)％、ウシ血清アルブミン ４(w/v)％、塩化ナトリウム ０．１５Ｍ、アジ化ナトリウム ０．０９(w/v)％を含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０）を用いて検体試料用濾過チューブ内で１０倍階段希釈し、検体試料とした。
【００５６】
調製した検体試料をアッセイ装置のＡホールとＢホールにそれぞれ１５０μＬ滴下し、ニトロセルロースメンブランの下部に備えられた液体吸収部材に試料が完全に吸収されるまで静置した。
【００５７】
次にＡホールには酵素標識抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体を、Ｂホールには酵素標識抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体を、それぞれ１８０μＬずつ滴下し、液体吸収部材に酵素標識抗体が完全に吸収されるまで静置した。
【００５８】
次にアダプターを除去し、基質液（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸 ０．１５ｍｇ／ｍＬ、ニトロテトラゾリウムブルー ０．３ ｍｇ／ｍＬ、塩化マグネシウム ５ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．１(w/v)％、アジ化ナトリウム ０．０９(w/v)％に含む０．１Ｍ トリス緩衝液、ｐＨ９．５）をＡホールとＢホールにそれぞれ２５０μＬずつ滴下し、発色反応を開始させた。
【００５９】
１０分後にＡホールとＢホールを鉛直上方から観察し、Ａホールにのみ発色が認められた場合にはＡ型インフルエンザウイルス陽性、Ｂホールにのみ発色が認められた場合にはＢ型インフルエンザウイルス陽性、Ａ、Ｂ両ホールとも発色が認められない場合には陰性と判定した。
【００６０】
比較検討
同時に、洗浄液を用いた従来の検出操作手順による比較法による試験を行い比較した。
【００６１】
結果
検体としてＡ型インフルエンザウイルスを用いた時、ＡホールはＡ型インフルエンザウイルス濃度１０５（pfu/mL）まで陽性となり、Ｂホールは全て陰性となり、特異的にＡ型インフルエンザウイルスを検出できることが確かめられた。
【００６２】
また、検体としてＢ型インフルエンザウイルスを用いた時、ＢホールはＢ型インフルエンザウイルス濃度１０５（pfu/mL）まで陽性となり、Ａホールは全て陰性となり、特異的にＢ型インフルエンザウイルスを検出できることが確かめられた。
【００６３】
本発明法と比較法の成績は一致した成績が得られた。
得られた結果を表１及び表２に示す。
【００６４】
【表１】
【００６５】
【表２】
【００６６】
表１及び２に示すように、インフルエンザウイルスを特異的に高感度で検出できることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明の一実施態様であるフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ装置の平面図である。
【図２】図１のＩ−Ｉ’の切断断面図である。
【図３】本発明において使用される検体試料用濾過チューブの一実施態様を示す図である。
【図４】図３の検体試料用濾過チューブ先端部の透視図である。
【符号の説明】
【００６８】
Ａ：穴
Ｂ：穴
ａ：アダプター
ｂ：メンブラン
ｃ：液体吸収部材
ｄ：濾過チューブ先端部
ｅ：濾過チューブ本体部
ｆ：濾過フィルター
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検出物を捕捉するための捕捉抗体または捕捉抗原が結合したメンブランを備えたアッセイ装置のメンブラン上に、緩衝液で希釈した検体試料を濾過フィルター装置を用いて濾過した後に滴下し、被検出物を捕捉抗体または捕捉抗原に捕捉させ、被検出物が捕捉された前記メンブラン上に被検出物と結合する酵素標識試薬を滴下し、捕捉抗体又は捕捉抗原−被検出物−標識試薬の免疫複合体を形成させ、続いて、前記酵素に対する基質液を前記メンブラン上に滴下する工程からなり、洗浄液を用いて洗浄する工程を含まないフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ法。
【請求項２】
検体を希釈する緩衝液に界面活性剤が終濃度０．２〜１０(w/v)％で含有されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検体を希釈する緩衝液に血清アルブミンが終濃度１〜５(w/v)％で含有されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
濾過フィルターの孔径が０．１〜０．６μｍであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
メンブランの孔径が３〜１２μｍであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
標識に用いる酵素がアルカリホスファターゼであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
酵素の基質液に界面活性剤が０．０２〜１(w/v)％含有されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
被検出物がインフルエンザウイルスであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
検体が咽頭もしくは鼻腔拭い液、咽頭もしくは鼻腔洗浄液および鼻腔吸引液からなる群から選択される請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
以下を含む、検体試料中の被検出物の存在を洗浄液を使用することなく検出するためのフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイキット；
（１）孔径が０．１〜０．６μｍの濾過フィルター、
（２）被検出物を捕捉するための捕捉抗体または抗原が結合したメンブランであって、孔径が３〜１２μｍのメンブランを備えたアッセイ装置、
（３）検体希釈後の終濃度が０．２〜１０(w/v)％になるような濃度の界面活性剤および／または検体希釈後の終濃度が１〜５(w/v)％になるような濃度の血清アルブミンを含む検体希釈用緩衝液、
（４）酵素標識抗体または抗原、ならびに
（５）０．０２〜１(w/v)％の界面活性剤を含む基質液。
【請求項１】
被検出物を捕捉するための捕捉抗体または捕捉抗原が結合したメンブランを備えたアッセイ装置のメンブラン上に、緩衝液で希釈した検体試料を濾過フィルター装置を用いて濾過した後に滴下し、被検出物を捕捉抗体または捕捉抗原に捕捉させ、被検出物が捕捉された前記メンブラン上に被検出物と結合する酵素標識試薬を滴下し、捕捉抗体又は捕捉抗原−被検出物−標識試薬の免疫複合体を形成させ、続いて、前記酵素に対する基質液を前記メンブラン上に滴下する工程からなり、洗浄液を用いて洗浄する工程を含まないフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイ法。
【請求項２】
検体を希釈する緩衝液に界面活性剤が終濃度０．２〜１０(w/v)％で含有されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検体を希釈する緩衝液に血清アルブミンが終濃度１〜５(w/v)％で含有されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
濾過フィルターの孔径が０．１〜０．６μｍであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
メンブランの孔径が３〜１２μｍであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
標識に用いる酵素がアルカリホスファターゼであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
酵素の基質液に界面活性剤が０．０２〜１(w/v)％含有されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
被検出物がインフルエンザウイルスであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
検体が咽頭もしくは鼻腔拭い液、咽頭もしくは鼻腔洗浄液および鼻腔吸引液からなる群から選択される請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
以下を含む、検体試料中の被検出物の存在を洗浄液を使用することなく検出するためのフロースルー式メンブランエンザイムイムノアッセイキット；
（１）孔径が０．１〜０．６μｍの濾過フィルター、
（２）被検出物を捕捉するための捕捉抗体または抗原が結合したメンブランであって、孔径が３〜１２μｍのメンブランを備えたアッセイ装置、
（３）検体希釈後の終濃度が０．２〜１０(w/v)％になるような濃度の界面活性剤および／または検体希釈後の終濃度が１〜５(w/v)％になるような濃度の血清アルブミンを含む検体希釈用緩衝液、
（４）酵素標識抗体または抗原、ならびに
（５）０．０２〜１(w/v)％の界面活性剤を含む基質液。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−１１８９３６（Ｐ２００６−１１８９３６Ａ）
【公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３０５８３６（Ｐ２００４−３０５８３６）
【出願日】平成１６年１０月２０日（２００４．１０．２０）
【出願人】（５９１１２５３７１）デンカ生研株式会社 (72)
【公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月２０日（２００４．１０．２０）
【出願人】（５９１１２５３７１）デンカ生研株式会社 (72)
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