リポプロテイン（ａ）の免疫比濁測定法およびその試薬
免疫学的測定法において、多様な表現型（フェノタイプ）を有する抗原を正確に定量測定するための方法の提供。 フェノタイプが存在する抗原の抗原抗体反応を利用した免疫比濁測定法を用いた検出において、測定系に添加する該抗原に対する抗体量を調節し、かつ測定系に塩基性アミノ酸を添加することにより、各フェノタイプの種類による測定値の変動を回避し、生体試料中の抗原を分子単位で測定した場合の測定値と高い相関を有する測定値を得られる、抗原抗体反応を利用した免疫比濁測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、免疫学的測定法において、多様な表現型（フェノタイプ）を有する抗原を正確に定量測定するための方法に関する。
【背景技術】
免疫学的測定法において、多様な表現型（フェノタイプ）を有し、各表現型の分子量が異なる抗原を分子単位で定量するためには、異なる抗原部位を認識する複数のモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が必要とされていた。例えば、血液中の蛋白であるリポプロテイン（ａ）は、アポ蛋白であるａｐｏ（ａ）がＬＤＬに結合した構造を有している。ａｐｏ（ａ）はプラスミノーゲンのｋｒｉｎｇｌｅ４と相同性の高いドメインの繰り返し構造を有しており、この繰り返し数が個体によって一定ではないため、ａｐｏ（ａ）の分子量に多様性が生じ、Ｌｐ（ａ）に種々のフェノタイプが存在している。例えばＵｔｅｒｍａｎｎ，Ｇらは６種類のフェノタイプに大別できることを報告している（Ｕｔｅｒｍａｎｎ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９８７；８０：４５８−４６５）。このため、各表現型の分子量の違いから、通常免疫学的測定で用いられる重量単位での測定を行なう場合、ある分子量の表現型の分子を標準物質として用いて分子量の異なる他の表現型の分子を測定した場合、分子単位による測定値から乖離した値が得られる。また、このとき表現型が異なれば、ある抗体に対する反応性が異なってくるという問題もある。表現型の違いに拘らず総ての表現型の分子を正確に定量的に測定するためには、血清中の蛋白測定で一般的に用いられる重量濃度の単位ではなく、モル濃度による分子単位での測定が理想的とされる。理論上、免疫学的測定法を用いて分子単位での測定を行なうためには、抗原に対して１対１で反応するモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定法が望ましく、さらに多様な表現型に対応するためには複数のモノクローナル抗体を使用する必要がある（Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９５；４１：２４５−２５５）。一方で、リポプロテイン（ａ）の測定にはポリクローナル抗体を用いた免疫比濁測定法も広く用いられており、一般的に重量濃度での測定を目的としている。このため、酵素免疫測定法と比較した場合、抗原の表現型の違いによって測定値に乖離が認められることが問題であった（Ｃｕｒｒ Ｃａｒｄｉｏｌ Ｒｅｐ １９９９；１：１０５−１１１）。
リポプロテイン（ａ）は動脈硬化、虚血性心疾患等と関係があり、血中のリポプロテイン（ａ）濃度は、これらの疾患の罹患リスクの評価にも用い得る。このような状況下で、迅速かつ簡便に正確なリポプロテイン濃度を測定し得る方法が望まれていた。
【非特許文献１】 Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９５；４１：２４６−２５５
【非特許文献２】 Ｃｕｒｒ Ｃａｒｄｉｏｌ Ｒｅｐ １９９９；１：１０５−１１１
【発明の開示】
本発明は、免疫比濁測定法において、酵素免疫測定法と比較した場合に抗原の表現型の違いにより生じる測定値乖離の問題を解決することを目的とする。具体的には、試薬成分の調整により、酵素免疫測定法と測定値を一致させる方法を提供することである。
本発明者らは、複数の表現型を有する抗原の測定を行なうための免疫比濁測定法において、試薬成分の調整によって測定値の制御が可能となることを見出した。すなわち、試薬成分中に抗体量を多く添加し、さらにアルギニン等の塩基性アミノ酸を一定量添加することで、表現型の違いによる測定値のばらつきという影響を回避し、分子単位での測定が可能な酵素免疫測定法による測定値と高い相関を有する測定値が得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は以下の通りである。
［１］ 複数のフェノタイプが存在するリポプロテイン（ａ）の抗原抗体反応を利用したラテックス免疫比濁測定法を用いた検出において、測定系に添加するリポプロテイン（ａ）に対する抗体量を調節し、かつ測定系に塩基性アミノ酸を添加することにより、各フェノタイプの種類による測定値の変動を回避し、生体試料中のリポプロテイン（ａ）を分子単位で測定した場合の測定値と高い相関を有する測定値を得られる、抗原抗体反応を利用したラテックス免疫比濁測定法、
［２］ 添加する抗体量が抗原抗体反応時の反応溶液中において０．１６ｍｇ／ｍＬ以上である［１］の方法、
［３］ 添加する抗体量が抗原抗体反応時の反応溶液中において０．１６ｍｇ／ｍＬ以上０．２３ｍｇ／ｍＬ以下である［２］の方法、
［４］ 添加する塩基性アミノ酸量が抗原抗体反応時の反応溶液において１５重量％以上である［１］から［３］のいずれかの方法、
［５］ 塩基性アミノ酸の添加量が抗原抗体反応時の反応溶液において１５重量％以上１７重量％以下である［４］の方法、
［６］ 塩基性アミノ酸がアルギニンである［１］から［５］のいずれかの方法、
［７］ フェノタイプが存在するリポプロテイン（ａ）の抗原抗体反応を利用したラテックス免疫比濁測定法を用いた検出試薬であって、試薬中に抗原抗体反応時の反応溶液中の抗体量が０．１６ｍｇ／ｍＬ以上となる分だけのリポプロテイン（ａ）に対する抗体、および試薬中に抗原抗体反応時の反応溶液中の塩基性アミノ酸量が１５重量％以上となる分だけの塩基性アミノ酸を含む、各フェノタイプの種類による測定値の変動を回避し、生体試料中のリポプロテイン（ａ）を分子単位で測定した場合の測定値と高い相関を有する測定値を得られる、抗原抗体反応を利用したラテックス免疫比濁測定用検出試薬、
［８］ 添加する抗体量が抗原抗体反応時の反応溶液中において０．１６ｍｇ／ｍＬ以上０．２３ｍｇ／ｍＬ以下である［７］のラテックス免疫比濁測定用検出試薬、
［９］ 添加する塩基性アミノ酸量が抗原抗体反応時の反応溶液において１５重量％以上１７重量％以下である［７］または［８］のラテックス免疫比濁測定用検出試薬、および
［１０］ 塩基性アミノ酸がアルギニンである［７］から［９］のいずれかのラテックス免疫比濁測定用検出試薬。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願特願２００３−０９４０５９号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、各抗体濃度における対照測定法における測定値と、ラテックス凝集法における測定値の相関を示す図である。
図２は、各抗体濃度における各表現型の検体の回帰直線からの乖離を示す図である。
図３は、各アルギニン濃度における対照測定法における測定値と、ラテックス凝集法における測定値の相関を示す図である。
図４は、各アルギニン濃度における各表現型の検体の回帰直線からの乖離を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、免疫比濁測定法を用いた多様な表現型を有する抗原の検出において、抗原の表現型の違いに起因する測定値の変動を回避する方法である。検出の対象とする抗原は複数の表現型を有するタンパク質ならば限定されないが、表現型の違いにより分子量が異なるタンパク質が好ましく、特にリポプロテイン（ａ）が好ましい。リポプロテイン（ａ）には、Ｆ、Ｂ、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４の６つの表現型が存在することが知られている（日本臨床 ５７巻、１９９９年増刊号、ｐ４２−４４）。これらの表現型はＵｔｅｒｍａｎらの方法（Ｕｔｅｒｍａｎｎ，Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ，ＵＳＡ１９８９；８６：４１７１−４１７４）によって決定できる。即ち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い移動度をａｐｏ−Ｂを基準とし、それより早い移動度を示す分子量の小さいものをＦ、ａｐｏ−Ｂと同じ移動度のものをＢ、遅い移動度のものを順にＳ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４と分類する。
免疫比濁法とは、測定試薬中に抗体を含有させておき、生体試料中の抗原により抗原抗体反応を起こさせ、凝集塊を形成させ凝集塊の形成を吸光度により測定し、生体試料中の抗原を定性または定量する方法であり、例えば、抗体を不溶性担体に感作（結合）させて使用する。用いる担体は限定されず、例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子を使用する免疫比濁法をラテックス免疫比濁法といい、ラテックス免疫比濁法は抗体を感作（結合）させたラテックス粒子を測定しようとする生体試料中の抗原と混合しラテックス粒子の凝集を形成させ、該凝集の程度を吸光度により測定し、抗原を定性または定量する。本発明で用いる生体試料は限定されないが、血液、血清、血漿が好適に用いることができる。
ラテックス粒子としては、例えば、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体及び／又は共重合体ポリスチレンラテックス粒子、スチレン−ブタジエン共重合体メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等が挙げられる。なかでも、各種タンパク質、又は、ポリペプチド類等の吸着性に優れており、かつ生物学的活性を長期間安定に保持できる点で、ポリスチレン系のラテックス粒子が好ましい。上記ラテックス粒子の粒径は、好ましくは０．０１〜１μｍであり、さらに好ましくは０．１〜１μｍである。粒径が０．０１μｍ未満であると、微凝集が多発し、見かけの粒径が不均一となり、同時再現性等に悪影響が及ぶことがあり、また、抗体の数に対して充分な凝集が得られないことがある。粒径が１μｍを超えると、自己凝集が進み、分散性が低下する。
ラテックス粒子の感作に使用する抗体はウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ等のポリクローナル抗体が望ましい。該ポリクローナル抗体は精製したリポプロテイン（ａ）を免疫原として動物を免疫し、抗血清を得て抗血清から硫安塩析法、ＤＥＡＥセルロース等の陰イオン交換体を利用するイオン交換クロマトグラフィー、分子量や構造によってふるいわける分子ふるいクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより精製することにより得ることができる。この際、免疫に用いるリポプロテイン（ａ）の表現型は限定されない。リポプロテイン（ａ）は、例えば正常ヒト血清より超遠心により比重１．０６３〜１．１５の画分を分取し、それらをＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ等のカラムを用いたクロマトグラフィーにより精製することができる。
ラテックス粒子への抗体の感作方法は、特に限定されない。例えば、抗体を担体に物理的に吸着させてもよいし、化学的に結合させてもよい。より具体的には、例えば、抗体と担体とを混和した後、３０〜３７℃で１〜２時間加温振盪することにより、抗体を担体に感作させることができる。担体に感作する抗体の量は、使用する担体の粒径に応じて適宜設定することができる。抗体を担体に感作した後、担体表面上の未感作部分をウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、卵白アルブミン等でブロッキングするのが好ましい。ポリクローナル抗体を感作した担体は、生体試料と反応させる時まで媒体分散液として保持しておくのが好ましい。この際、媒体としては、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液等を使用することができる。ポリクローナル抗体に感作した担体の含有量は、通常、媒体分散液に対して０．０５〜０．５重量％とすることができるが、０．１〜０．３重量％とするのが好ましい。媒体中には、必要に応じてウシ血清アルブミン、ゼラチン、アラビアゴム等を添加してもよい。
抗体感作ラテックス粒子と生体試料を適当な緩衝液中で混合することによりラテックス免疫比濁法を行なうことができる。本発明においては、抗体感作ラテックス粒子と生体試料を混合して凝集させるときの反応系に存在する抗体量を多くし、さらに塩基性アミノ酸を存在させる。通常ラテックス免疫比濁法において、反応系に添加する最終抗体濃度は０．０５〜０．１ｍｇ／ｍＬであるのに対して、本発明においては少なくとも、０．１５ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは０．１６ｍｇ以上の濃度で添加する。上限は、表現型による測定値の変動を抑えるという効果の点では限定されないが、ラテックス免疫比濁法を行い、良好な凝集像を得るという観点から、１ｍｇ／ｍＬ以下が好ましく、さらに０．３ｍｇ／ｍＬ以下が好ましく、０．２３ｍｇ／ｍＬ以下で添加するのが特に好ましい。添加する抗体量は、反応系に添加する抗体で感作したラテックスの添加量を多くしてもよいし、ラテックス粒子を抗体で感作するときの単位ラテックス粒子当たりの感作量を多くしてもよい。上述のように、抗体で感作したラテックス粒子は、媒体分散液に対して０．０５〜０．５重量％の濃度で感作ラテックス粒子として調製されるが、この時の濃度を高くしておいてもよい。
塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギンまたはシトルリンが例示できるが、この中でもアルギニンが望ましい。塩基性アミノ酸の添加量は、抗体感作ラテックス粒子と生体試料を混合して凝集させるときの反応系の最終濃度は、１２％以上、好ましくは１５％以上である。塩基性アミノ酸の濃度の上限は表現型による測定値の変動を抑えるという効果の点では限定されず、例えば、アルギニンを用いる場合、４０％程度の濃度で用いることもできるが、良好な凝集像を得るという観点からは、２５％以下が好ましく、２０％以下がさらに好ましく、１７％以下が特に好ましい。
本発明によるラテックス凝集法は、典型的には生体試料１容、緩衝液を含む第１試薬４０容および感作ラテックス粒子溶液２０容を混合して行なわれる。但し、この混合比率には限定されず、生体試料中の抗原および感作ラテックス粒子の存在比が適切で、良好な凝集像が得られる比率ならばどのような比率でもよい。また、第１試薬と第２試薬を一緒にしてもよい。反応系に加える感作ラテックス粒子溶液の反応系全容量に対する容量比に応じて感作ラテックス粒子溶液中の粒子濃度を適宜調節すればよい。第１試薬を構成する緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液ｐＨ７、グリシン緩衝液ｐＨ７が用いられる。また、塩基性アミノ酸は上記第１試薬に添加しても、第２試薬に添加しても、両方に添加しても、最終濃度が前記濃度になればよい。前記典型例において、感作ラテックス粒子溶液中の好ましい濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬ以上０．７ｍｇ／ｍＬ以下である。また、例えば塩基性アミノ酸を第１試薬および第２試薬の両方に添加する場合第１試薬に７〜１０％添加し、第２試薬に３０％添加すればよい。これらの試薬中の抗体または塩基性アミノ酸の好ましい濃度は、上記の最終反応系における最終濃度およびそれぞれの試薬の容量比から容易に換算することができる。
反応は、生体試料、第１試薬および第２試薬を混合することにより行なわれる。混合の順番は限定されないが、最初に生体試料と第１試薬を混合し、数分間、好ましくは１〜５分間、さらに好ましくは５分間攪拌混合し、次いで第２試薬を混合しさらに攪拌混合すればよい。凝集反応は１〜４分行ない、凝集の程度を調べる。この際の温度は限定されないが、３７℃で行なうのが望ましい。プラスチックセル若しくはガラスセル内で行なうこともできる。この場合、セル外部より可視光から近赤外域の光、例えば、通常４００〜２４００ｎｍ、好ましくは５５０〜８００ｎｍの波長の光を照射し、吸光度変化又は散乱光の強度変化を検出して担体粒子の凝集の程度を測定する。この場合、予め作成した検量線を用いれば、試料内のリポプロテイン（ａ）量（濃度）が算出できる。このとき検量線の作成に用いるリポプロテイン（ａ）の表現型は限定されない。凝集の測定は、例えば三菱化学株式会社のＬＰＩＡ−Ｓ５００ラテックス凝集全自動測定器、（株）東芝のＴＢＡ−２００ＦＲ自動分析装置及び日立製作所の日立７１７０形自動分析装置等を用いて行なうことができる。
凝集反応は、生理的食塩水、ｐＨ５．０〜１０の適当な緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液等の溶液中で行なわせればよい。
本発明の方法により、各フェノタイプの種類による測定値の変動を回避し、生体試料中のリポプロテイン（ａ）を分子単位で測定した場合の測定値と高い相関を有する測定値を得られる。ここで、生体試料中のリポプロテイン（ａ）を分子単位で測定した場合の測定値とは、例えば特定の条件下で行なう酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定した値を指す。
ＥＬＩＳＡ（エンザイム・リンクト・イムノ−ソルベント・アッセイ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法は、抗体を酵素で標識し、該抗体と結合する物質（抗原）を検出する方法であり、特に抗原蛋白質の検出方法として、抗原抗体反応を利用して検体中の抗原蛋白質或いは逆に特定の抗原蛋白質に結合する抗体を検出する分析方法として広く用いられている。ＥＬＩＳＡ法は、測定対象とする抗原と反応する抗体を、予めペルオキシダーゼやガラクトシダーゼ等の酵素を化学的に結合させた第２の抗体で検出方法であり、反応系内に酵素反応によって発色する基質を加えて、その発色度合から目的とする抗原の有無や量を検出する方法である。
ＥＬＩＳＡ法では、一般的にポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体同士、或いはポリクローナル抗体とモノクローナル抗体とを組み合わせ抗原を固相化抗体および標識化抗体ではさむサンドイッチ抗体法による目的蛋白質の検出が現在主流となっている〔「生化学実験法１１エンザイムイムノアッセイ」、１９８９年１１月１５日東京化学同人発行〕。
ＥＬＩＳＡ法においては、通常１分子の固相化抗体−１分子の抗原−１分子の標識抗体という結合が成立し、標識抗体の認識するエピトープ（抗原決定基）が一つの抗原分子上に複数存在しない限り多彩な表現型が存在する抗原であってもいずれの表現型の抗原に対しても上述の結合が成立するので、分子単位での測定が可能となる。すなわち、標準物質としてどの表現型の分子を用いても、他の表現型の分子が分子単位で正確に測定できる。
例えば、リポプロテイン（ａ）の場合、構成蛋白のひとつであるａｐｏ（ａ）分子中にｋｒｉｎｇｌｅ４と呼ばれる繰り返し構造が存在し、ｔｙｐｅ１からｔｙｐｅ１０までの１０の異なるタイプに分類されている。このうち、ｋｒｉｎｇｌｅ４ ｔｙｐｅ １およびｔｙｐｅ３からｔｙｐｅ１０は、総てのａｐｏ（ａ）において一つだけ存在するのに対して、ｋｒｉｎｇｌｅ４ ｔｙｐｅ２はａｐｏ（ａ）分子ごとに複数が繰り返し存在し、その数は３から４０であると言われている。すなわち、リポプロテインの表現型の違いによる分子量の違いは専らｋｒｉｎｇｌｅ４ ｔｙｐｅ２の繰り返し数に起因している。この各ｋｒｉｎｇｌｅ４の各タイプの繰り返し数から、ＥＬＩＳＡを用いてリポプロテイン（ａ）を測定する場合、ｋｒｉｎｇｌｅ ４ ｔｙｐｅ ２に対する抗体が固相抗体および標識抗体の双方に含まれると正確に分子単位での測定ができないことを示す（Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９５；４１：２４５−２５５）。また、異なるタイプのドメイン上に、同一のまたは類似したエピトープも存在する。このことは逆に固相化抗体と標識抗体としてｋｒｉｎｇｌｅ４ ｔｙｐｅ１およびｋｒｉｎｇｌｅ４ ｔｙｐｅ３から１０のいずれかと結合し得る抗体であって、異なるタイプに共通して存在しないエピトープを認識する抗体の中から選択し、固相化抗体と標識抗体が結合するタイプを別のものにすれば、必ず１分子の固相化抗体−１分子の抗原−１分子の標識抗体という結合が成立するので、分子単位での測定が可能になる。また、ｋｒｉｎｇｌｅ４以外のドメインに存在するエピトープであっても、ａｐｏ（ａ）中に、複数存在しないエピトープを認識する抗体を少なくとも標識抗体として、好ましくは標識抗体と固相化抗体の両方に用いてもよい。本発明において、リポプロテイン（ａ）を分子単位で測定した場合の測定値とは、このように１分子の固相化抗体−１分子の抗原−１分子の標識抗体という結合が成立する条件で行われるＥＬＩＳＡを指す。このようなＥＬＩＳＡとして例えば、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９５；４１：２４６−２５５に記載のＥＬＩＳＡが挙げられる。このようなＥＬＩＳＡ法による測定値と本発明の方法による測定値の相関をとった場合、相関係数（Ｒ２）は、０．９７以上、好ましくは０．９８以上、さらに好ましくは０．９９以上である。
また、本発明の各フェノタイプの種類による測定値の変動を回避し、生体試料中のリポプロテイン（ａ）を分子単位で測定した場合の測定値と高い相関を有する測定値を得られる免疫比濁法とは、ＩＦＣＣ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｄｅｉｃｉｎｅ，Ｖｉａ Ｃａｒｌｏ Ｆａｒｉｎｉ ８１，２０１５９ Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ）により認証されたリポプロテイン（ａ）の標準物質（ＰＲＭ；ＩＦＣＣ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍａｔｅｒｉａｌ）を試料として生理的塩類溶液により段階的に希釈したものを前記免疫比濁法により測定した場合、理論濃度と吸光度変化量として表される測定値の関係をグラフで示すことにより作成される検量線に対して、いかなる表現型のリポプロテイン（ａ）を試料として同様な測定を行った場合に作成される検量線とも実質的に平行性を示す免疫比濁法である。
また、本発明の方法によれば各フェノタイプの種類による測定値の変動を回避し、生体試料中のリポプロテイン（ａ）を分子単位で測定した場合の測定値と高い相関を有する測定値を得られるが、これは標準物質として用いる表現型の分子を変えても、常にほぼ同一の測定値が得られることを意味する。従って、本発明の方法は、標準物質として用いる分子の表現型にかかわらず一定の測定値が得られる方法である。
以下、本発明の実施例に基づき具体的に説明する。もっとも本発明は下記実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕 ラテックス濃度（抗体量）を変えた試薬での測定値の変化（対照法（ＥＬＩＳＡ）との相関）
ウサギ抗ヒトリポプロテイン（ａ）ポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社より入手）をラテックス粒子（積水工業株式会社から入手）に混和し、室温にて６０分間、その後６０℃の恒温槽中で５０分間加温を行った後、冷水中で２０分間冷却することにより感作した。感作量は、ラテックス粒子１ｍｇ当たりポリクローナル抗体０．１４ｍｇであった。感作ラテックス粒子を０．１７Ｍグリシン緩衝液ｐＨ７に０．５重量％の濃度で分散し抗ヒトリポプロテイン（ａ）ウサギポリクローナル抗体分散液とした。
抗ヒトリポプロテイン（ａ）ウサギポリクローナル抗体を感作したラテックス粒子の分散浮遊液において、第２試薬中の抗体の終濃度がそれぞれ約０．３、０．４、０．５、０．７ｍｇ／ｍＬとなるように調製し、第２試薬とした。第１試薬として０．１ＭのＮａＣｌおよび０．０５ＭのＥＤＴＡ、１％のＢＳＡ、非特異反応の回避を目的として正常ウサギグロブリンを２５ｍｇ／ｍＬを加えたグリシン緩衝液を用いた。塩基性アミノ酸としてアルギニンを第１試薬に１０％、第２試薬に３０％添加した。反応液中の終濃度としては１６．７％であった。
測定する試料として、それぞれ表現型の異なるリポプロテイン（ａ）を含むヒト血清を２０検体用いた。２０検体中、表現型がＢ、Ｓ１、Ｓ３、Ｓ４およびＳ５のものをそれぞれ４検体ずつ用いた（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ社より入手）。
反応は試料となる血清４μＬに対して第１試薬１６０μＬを加え攪拌し、５分後に第２試薬８０μＬを添加攪拌し、凝集反応を行なった。測定は日立７１７０形自動分析装置を使用し、この際約１分後から４分間の３７℃における凝集反応を波長５７０ｎｍの吸光度変化量として測定するよう設定した。吸光度変化量から濃度を算出するために、あらかじめ既知濃度の標準（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ社より入手）を試料として同条件で測定し、濃度と吸光度変化量の関係を表す検量線を作成しておいた。
また、上記２０検体を対照法として以下のように酵素免疫測定法で測定した。用いるモノクローナル抗体はＣｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９５；４１：２４６−２５５に記載の方法により入手することができる。Ｎｕｎｃ社製の９６ウェルマイクロタイタープレートに、抗ヒトリポプロテイン（ａ）モノクローナル抗体（ｋｒｉｎｇｌｅ４ ｔｙｐｅ２に結合するが、ｋｒｉｎｇｌｅ ｔｙｐｅ１およびｔｙｐｅ３から１０には結合しないモノクローナル抗体）を０．５μｇ／ｗｅｌｌで固相化した（０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．６中５μｇ／ｍＬの抗体溶液を１００μＬウェルに入れ１時間室温で攪拌した後一夜４℃でインキュベート）。ＰＢＳ ｐＨ７．４を用いてウェルを３回洗浄し、３０ｇ／ＬのＢＳＡを含むＰＢＳ３００μＬをウェルに入れ１時間室温でインキュベートしブロッキングを行った。ブロッキング後、ＰＢＳ ｐＨ７．４を用いてウェルを３回洗浄し該ウェル中に前記検体を１００μＬ添加し、１時間２８℃で攪拌した。この際、検体は１ｇ／Ｌ ＢＳＡ、０．５ｍＬ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳを用いて適宜希釈した。ＰＢＳ ｐＨ７．４を用いてウェルを３回洗浄し、ＨＲＰで標識した抗ヒトリポプロテイン（ａ）モノクローナル抗体（ｋｒｉｎｇｌｅ４ ｔｙｐｅ２以外のｋｒｉｎｇｌｅ４ドメインに結合する）溶液を１００μＬ添加し、１時間２８℃で攪拌した。その後、ＯＰＤおよびＨ２Ｏ２を添加し、発色反応を行い、１５分後に１ｍｏｌ／Ｌ硫酸１００μＬを添加し反応を停止した。反応停止後反応液の４９５ｎｍにおける吸光度を測定した。この際、吸光度から濃度を算出するために、あらかじめ既知濃度の標準を試料として同条件で測定し、濃度と吸光度の関係を表す検量線を作成しておいた。
結果、第２試薬中の抗体濃度が０．３ｍｇ／ｍＬおよび０．４ｍｇ／ｍＬの試薬による測定では、酵素免疫測定法との相関性より求めた回帰直線から乖離する検体が認められるが、抗体濃度０．５ｍｇ／ｍＬおよび０．６ｍｇ／ｍＬの試薬による測定では、酵素免疫測定法との相関性より求めた回帰直線から乖離する検体は見られなかった。図１に各抗体濃度における対照測定法における測定値と、ラテックス凝集法における測定値の相関を示す。また図２には、各表現型の検体の回帰直線からの乖離を示す。
試薬中の抗体濃度を調整することにより、対照となる酵素免疫測定法と測定値が一致させることが可能であることを確認した。
〔実施例２〕 アルギニン濃度を変えた試薬での測定値の変化（対照法（ＥＬＩＳＡ）との相関）
抗ヒトリポプロテイン（ａ）ウサギポリクローナル抗体を感作したラテックス粒子の分散浮遊液は、実施例１と同様にして作製した。
抗ヒトリポプロテイン（ａ）ウサギポリクローナル抗体を感作したラテックス粒子の分散浮遊液において、第２試薬中の抗体の終濃度が約０．７ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。また、塩基性アミノ酸としてアルギニンを反応液中の終濃度としてそれぞれ１０、１５、１７％となるように第１試薬中に添加した（第２試薬中濃度は３０％）。
測定条件および測定する試料は実施例１と同様であった。
結果、反応液中のアルギニン濃度が１０％の場合、酵素免疫測定法との相関性より求めた回帰直線から乖離する検体が認められるが、１５％および１７％の場合、酵素免疫測定法との相関性より求めた回帰直線から乖離する検体は見られなかった。図１に各アルギニン濃度における対照測定法における測定値と、ラテックス凝集法における測定値の相関を示す。また図２には、各表現型の検体の回帰直線からの乖離を示す。
試薬中のアルギニン濃度を調整することにより、酵素免疫測定法と測定値を一致させることが可能であることを確認した。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
実施例に示すように、ラテックス免疫比濁法において、反応系に添加する抗体量を多くし、さらに反応系に一定濃度の塩基性アミノ酸を添加することにより、多彩な表現型が存在するヒトリポプロテイン（ａ）の表現型の違いによる測定値の変動を回避することができる。
本発明により、多様な表現型を有する抗原を測定する場合に、酵素免疫測定法と測定値の相関性に優れ、かつ自動分析装置で迅速・簡便に測定することが可能となる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【技術分野】
本発明は、免疫学的測定法において、多様な表現型（フェノタイプ）を有する抗原を正確に定量測定するための方法に関する。
【背景技術】
免疫学的測定法において、多様な表現型（フェノタイプ）を有し、各表現型の分子量が異なる抗原を分子単位で定量するためには、異なる抗原部位を認識する複数のモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が必要とされていた。例えば、血液中の蛋白であるリポプロテイン（ａ）は、アポ蛋白であるａｐｏ（ａ）がＬＤＬに結合した構造を有している。ａｐｏ（ａ）はプラスミノーゲンのｋｒｉｎｇｌｅ４と相同性の高いドメインの繰り返し構造を有しており、この繰り返し数が個体によって一定ではないため、ａｐｏ（ａ）の分子量に多様性が生じ、Ｌｐ（ａ）に種々のフェノタイプが存在している。例えばＵｔｅｒｍａｎｎ，Ｇらは６種類のフェノタイプに大別できることを報告している（Ｕｔｅｒｍａｎｎ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９８７；８０：４５８−４６５）。このため、各表現型の分子量の違いから、通常免疫学的測定で用いられる重量単位での測定を行なう場合、ある分子量の表現型の分子を標準物質として用いて分子量の異なる他の表現型の分子を測定した場合、分子単位による測定値から乖離した値が得られる。また、このとき表現型が異なれば、ある抗体に対する反応性が異なってくるという問題もある。表現型の違いに拘らず総ての表現型の分子を正確に定量的に測定するためには、血清中の蛋白測定で一般的に用いられる重量濃度の単位ではなく、モル濃度による分子単位での測定が理想的とされる。理論上、免疫学的測定法を用いて分子単位での測定を行なうためには、抗原に対して１対１で反応するモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定法が望ましく、さらに多様な表現型に対応するためには複数のモノクローナル抗体を使用する必要がある（Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９５；４１：２４５−２５５）。一方で、リポプロテイン（ａ）の測定にはポリクローナル抗体を用いた免疫比濁測定法も広く用いられており、一般的に重量濃度での測定を目的としている。このため、酵素免疫測定法と比較した場合、抗原の表現型の違いによって測定値に乖離が認められることが問題であった（Ｃｕｒｒ Ｃａｒｄｉｏｌ Ｒｅｐ １９９９；１：１０５−１１１）。
リポプロテイン（ａ）は動脈硬化、虚血性心疾患等と関係があり、血中のリポプロテイン（ａ）濃度は、これらの疾患の罹患リスクの評価にも用い得る。このような状況下で、迅速かつ簡便に正確なリポプロテイン濃度を測定し得る方法が望まれていた。
【非特許文献１】 Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９５；４１：２４６−２５５
【非特許文献２】 Ｃｕｒｒ Ｃａｒｄｉｏｌ Ｒｅｐ １９９９；１：１０５−１１１
【発明の開示】
本発明は、免疫比濁測定法において、酵素免疫測定法と比較した場合に抗原の表現型の違いにより生じる測定値乖離の問題を解決することを目的とする。具体的には、試薬成分の調整により、酵素免疫測定法と測定値を一致させる方法を提供することである。
本発明者らは、複数の表現型を有する抗原の測定を行なうための免疫比濁測定法において、試薬成分の調整によって測定値の制御が可能となることを見出した。すなわち、試薬成分中に抗体量を多く添加し、さらにアルギニン等の塩基性アミノ酸を一定量添加することで、表現型の違いによる測定値のばらつきという影響を回避し、分子単位での測定が可能な酵素免疫測定法による測定値と高い相関を有する測定値が得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は以下の通りである。
［１］ 複数のフェノタイプが存在するリポプロテイン（ａ）の抗原抗体反応を利用したラテックス免疫比濁測定法を用いた検出において、測定系に添加するリポプロテイン（ａ）に対する抗体量を調節し、かつ測定系に塩基性アミノ酸を添加することにより、各フェノタイプの種類による測定値の変動を回避し、生体試料中のリポプロテイン（ａ）を分子単位で測定した場合の測定値と高い相関を有する測定値を得られる、抗原抗体反応を利用したラテックス免疫比濁測定法、
［２］ 添加する抗体量が抗原抗体反応時の反応溶液中において０．１６ｍｇ／ｍＬ以上である［１］の方法、
［３］ 添加する抗体量が抗原抗体反応時の反応溶液中において０．１６ｍｇ／ｍＬ以上０．２３ｍｇ／ｍＬ以下である［２］の方法、
［４］ 添加する塩基性アミノ酸量が抗原抗体反応時の反応溶液において１５重量％以上である［１］から［３］のいずれかの方法、
［５］ 塩基性アミノ酸の添加量が抗原抗体反応時の反応溶液において１５重量％以上１７重量％以下である［４］の方法、
［６］ 塩基性アミノ酸がアルギニンである［１］から［５］のいずれかの方法、
［７］ フェノタイプが存在するリポプロテイン（ａ）の抗原抗体反応を利用したラテックス免疫比濁測定法を用いた検出試薬であって、試薬中に抗原抗体反応時の反応溶液中の抗体量が０．１６ｍｇ／ｍＬ以上となる分だけのリポプロテイン（ａ）に対する抗体、および試薬中に抗原抗体反応時の反応溶液中の塩基性アミノ酸量が１５重量％以上となる分だけの塩基性アミノ酸を含む、各フェノタイプの種類による測定値の変動を回避し、生体試料中のリポプロテイン（ａ）を分子単位で測定した場合の測定値と高い相関を有する測定値を得られる、抗原抗体反応を利用したラテックス免疫比濁測定用検出試薬、
［８］ 添加する抗体量が抗原抗体反応時の反応溶液中において０．１６ｍｇ／ｍＬ以上０．２３ｍｇ／ｍＬ以下である［７］のラテックス免疫比濁測定用検出試薬、
［９］ 添加する塩基性アミノ酸量が抗原抗体反応時の反応溶液において１５重量％以上１７重量％以下である［７］または［８］のラテックス免疫比濁測定用検出試薬、および
［１０］ 塩基性アミノ酸がアルギニンである［７］から［９］のいずれかのラテックス免疫比濁測定用検出試薬。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願特願２００３−０９４０５９号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、各抗体濃度における対照測定法における測定値と、ラテックス凝集法における測定値の相関を示す図である。
図２は、各抗体濃度における各表現型の検体の回帰直線からの乖離を示す図である。
図３は、各アルギニン濃度における対照測定法における測定値と、ラテックス凝集法における測定値の相関を示す図である。
図４は、各アルギニン濃度における各表現型の検体の回帰直線からの乖離を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、免疫比濁測定法を用いた多様な表現型を有する抗原の検出において、抗原の表現型の違いに起因する測定値の変動を回避する方法である。検出の対象とする抗原は複数の表現型を有するタンパク質ならば限定されないが、表現型の違いにより分子量が異なるタンパク質が好ましく、特にリポプロテイン（ａ）が好ましい。リポプロテイン（ａ）には、Ｆ、Ｂ、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４の６つの表現型が存在することが知られている（日本臨床 ５７巻、１９９９年増刊号、ｐ４２−４４）。これらの表現型はＵｔｅｒｍａｎらの方法（Ｕｔｅｒｍａｎｎ，Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ，ＵＳＡ１９８９；８６：４１７１−４１７４）によって決定できる。即ち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い移動度をａｐｏ−Ｂを基準とし、それより早い移動度を示す分子量の小さいものをＦ、ａｐｏ−Ｂと同じ移動度のものをＢ、遅い移動度のものを順にＳ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４と分類する。
免疫比濁法とは、測定試薬中に抗体を含有させておき、生体試料中の抗原により抗原抗体反応を起こさせ、凝集塊を形成させ凝集塊の形成を吸光度により測定し、生体試料中の抗原を定性または定量する方法であり、例えば、抗体を不溶性担体に感作（結合）させて使用する。用いる担体は限定されず、例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子を使用する免疫比濁法をラテックス免疫比濁法といい、ラテックス免疫比濁法は抗体を感作（結合）させたラテックス粒子を測定しようとする生体試料中の抗原と混合しラテックス粒子の凝集を形成させ、該凝集の程度を吸光度により測定し、抗原を定性または定量する。本発明で用いる生体試料は限定されないが、血液、血清、血漿が好適に用いることができる。
ラテックス粒子としては、例えば、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体及び／又は共重合体ポリスチレンラテックス粒子、スチレン−ブタジエン共重合体メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等が挙げられる。なかでも、各種タンパク質、又は、ポリペプチド類等の吸着性に優れており、かつ生物学的活性を長期間安定に保持できる点で、ポリスチレン系のラテックス粒子が好ましい。上記ラテックス粒子の粒径は、好ましくは０．０１〜１μｍであり、さらに好ましくは０．１〜１μｍである。粒径が０．０１μｍ未満であると、微凝集が多発し、見かけの粒径が不均一となり、同時再現性等に悪影響が及ぶことがあり、また、抗体の数に対して充分な凝集が得られないことがある。粒径が１μｍを超えると、自己凝集が進み、分散性が低下する。
ラテックス粒子の感作に使用する抗体はウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ等のポリクローナル抗体が望ましい。該ポリクローナル抗体は精製したリポプロテイン（ａ）を免疫原として動物を免疫し、抗血清を得て抗血清から硫安塩析法、ＤＥＡＥセルロース等の陰イオン交換体を利用するイオン交換クロマトグラフィー、分子量や構造によってふるいわける分子ふるいクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより精製することにより得ることができる。この際、免疫に用いるリポプロテイン（ａ）の表現型は限定されない。リポプロテイン（ａ）は、例えば正常ヒト血清より超遠心により比重１．０６３〜１．１５の画分を分取し、それらをＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ等のカラムを用いたクロマトグラフィーにより精製することができる。
ラテックス粒子への抗体の感作方法は、特に限定されない。例えば、抗体を担体に物理的に吸着させてもよいし、化学的に結合させてもよい。より具体的には、例えば、抗体と担体とを混和した後、３０〜３７℃で１〜２時間加温振盪することにより、抗体を担体に感作させることができる。担体に感作する抗体の量は、使用する担体の粒径に応じて適宜設定することができる。抗体を担体に感作した後、担体表面上の未感作部分をウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、卵白アルブミン等でブロッキングするのが好ましい。ポリクローナル抗体を感作した担体は、生体試料と反応させる時まで媒体分散液として保持しておくのが好ましい。この際、媒体としては、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液等を使用することができる。ポリクローナル抗体に感作した担体の含有量は、通常、媒体分散液に対して０．０５〜０．５重量％とすることができるが、０．１〜０．３重量％とするのが好ましい。媒体中には、必要に応じてウシ血清アルブミン、ゼラチン、アラビアゴム等を添加してもよい。
抗体感作ラテックス粒子と生体試料を適当な緩衝液中で混合することによりラテックス免疫比濁法を行なうことができる。本発明においては、抗体感作ラテックス粒子と生体試料を混合して凝集させるときの反応系に存在する抗体量を多くし、さらに塩基性アミノ酸を存在させる。通常ラテックス免疫比濁法において、反応系に添加する最終抗体濃度は０．０５〜０．１ｍｇ／ｍＬであるのに対して、本発明においては少なくとも、０．１５ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは０．１６ｍｇ以上の濃度で添加する。上限は、表現型による測定値の変動を抑えるという効果の点では限定されないが、ラテックス免疫比濁法を行い、良好な凝集像を得るという観点から、１ｍｇ／ｍＬ以下が好ましく、さらに０．３ｍｇ／ｍＬ以下が好ましく、０．２３ｍｇ／ｍＬ以下で添加するのが特に好ましい。添加する抗体量は、反応系に添加する抗体で感作したラテックスの添加量を多くしてもよいし、ラテックス粒子を抗体で感作するときの単位ラテックス粒子当たりの感作量を多くしてもよい。上述のように、抗体で感作したラテックス粒子は、媒体分散液に対して０．０５〜０．５重量％の濃度で感作ラテックス粒子として調製されるが、この時の濃度を高くしておいてもよい。
塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギンまたはシトルリンが例示できるが、この中でもアルギニンが望ましい。塩基性アミノ酸の添加量は、抗体感作ラテックス粒子と生体試料を混合して凝集させるときの反応系の最終濃度は、１２％以上、好ましくは１５％以上である。塩基性アミノ酸の濃度の上限は表現型による測定値の変動を抑えるという効果の点では限定されず、例えば、アルギニンを用いる場合、４０％程度の濃度で用いることもできるが、良好な凝集像を得るという観点からは、２５％以下が好ましく、２０％以下がさらに好ましく、１７％以下が特に好ましい。
本発明によるラテックス凝集法は、典型的には生体試料１容、緩衝液を含む第１試薬４０容および感作ラテックス粒子溶液２０容を混合して行なわれる。但し、この混合比率には限定されず、生体試料中の抗原および感作ラテックス粒子の存在比が適切で、良好な凝集像が得られる比率ならばどのような比率でもよい。また、第１試薬と第２試薬を一緒にしてもよい。反応系に加える感作ラテックス粒子溶液の反応系全容量に対する容量比に応じて感作ラテックス粒子溶液中の粒子濃度を適宜調節すればよい。第１試薬を構成する緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液ｐＨ７、グリシン緩衝液ｐＨ７が用いられる。また、塩基性アミノ酸は上記第１試薬に添加しても、第２試薬に添加しても、両方に添加しても、最終濃度が前記濃度になればよい。前記典型例において、感作ラテックス粒子溶液中の好ましい濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬ以上０．７ｍｇ／ｍＬ以下である。また、例えば塩基性アミノ酸を第１試薬および第２試薬の両方に添加する場合第１試薬に７〜１０％添加し、第２試薬に３０％添加すればよい。これらの試薬中の抗体または塩基性アミノ酸の好ましい濃度は、上記の最終反応系における最終濃度およびそれぞれの試薬の容量比から容易に換算することができる。
反応は、生体試料、第１試薬および第２試薬を混合することにより行なわれる。混合の順番は限定されないが、最初に生体試料と第１試薬を混合し、数分間、好ましくは１〜５分間、さらに好ましくは５分間攪拌混合し、次いで第２試薬を混合しさらに攪拌混合すればよい。凝集反応は１〜４分行ない、凝集の程度を調べる。この際の温度は限定されないが、３７℃で行なうのが望ましい。プラスチックセル若しくはガラスセル内で行なうこともできる。この場合、セル外部より可視光から近赤外域の光、例えば、通常４００〜２４００ｎｍ、好ましくは５５０〜８００ｎｍの波長の光を照射し、吸光度変化又は散乱光の強度変化を検出して担体粒子の凝集の程度を測定する。この場合、予め作成した検量線を用いれば、試料内のリポプロテイン（ａ）量（濃度）が算出できる。このとき検量線の作成に用いるリポプロテイン（ａ）の表現型は限定されない。凝集の測定は、例えば三菱化学株式会社のＬＰＩＡ−Ｓ５００ラテックス凝集全自動測定器、（株）東芝のＴＢＡ−２００ＦＲ自動分析装置及び日立製作所の日立７１７０形自動分析装置等を用いて行なうことができる。
凝集反応は、生理的食塩水、ｐＨ５．０〜１０の適当な緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液等の溶液中で行なわせればよい。
本発明の方法により、各フェノタイプの種類による測定値の変動を回避し、生体試料中のリポプロテイン（ａ）を分子単位で測定した場合の測定値と高い相関を有する測定値を得られる。ここで、生体試料中のリポプロテイン（ａ）を分子単位で測定した場合の測定値とは、例えば特定の条件下で行なう酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定した値を指す。
ＥＬＩＳＡ（エンザイム・リンクト・イムノ−ソルベント・アッセイ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法は、抗体を酵素で標識し、該抗体と結合する物質（抗原）を検出する方法であり、特に抗原蛋白質の検出方法として、抗原抗体反応を利用して検体中の抗原蛋白質或いは逆に特定の抗原蛋白質に結合する抗体を検出する分析方法として広く用いられている。ＥＬＩＳＡ法は、測定対象とする抗原と反応する抗体を、予めペルオキシダーゼやガラクトシダーゼ等の酵素を化学的に結合させた第２の抗体で検出方法であり、反応系内に酵素反応によって発色する基質を加えて、その発色度合から目的とする抗原の有無や量を検出する方法である。
ＥＬＩＳＡ法では、一般的にポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体同士、或いはポリクローナル抗体とモノクローナル抗体とを組み合わせ抗原を固相化抗体および標識化抗体ではさむサンドイッチ抗体法による目的蛋白質の検出が現在主流となっている〔「生化学実験法１１エンザイムイムノアッセイ」、１９８９年１１月１５日東京化学同人発行〕。
ＥＬＩＳＡ法においては、通常１分子の固相化抗体−１分子の抗原−１分子の標識抗体という結合が成立し、標識抗体の認識するエピトープ（抗原決定基）が一つの抗原分子上に複数存在しない限り多彩な表現型が存在する抗原であってもいずれの表現型の抗原に対しても上述の結合が成立するので、分子単位での測定が可能となる。すなわち、標準物質としてどの表現型の分子を用いても、他の表現型の分子が分子単位で正確に測定できる。
例えば、リポプロテイン（ａ）の場合、構成蛋白のひとつであるａｐｏ（ａ）分子中にｋｒｉｎｇｌｅ４と呼ばれる繰り返し構造が存在し、ｔｙｐｅ１からｔｙｐｅ１０までの１０の異なるタイプに分類されている。このうち、ｋｒｉｎｇｌｅ４ ｔｙｐｅ １およびｔｙｐｅ３からｔｙｐｅ１０は、総てのａｐｏ（ａ）において一つだけ存在するのに対して、ｋｒｉｎｇｌｅ４ ｔｙｐｅ２はａｐｏ（ａ）分子ごとに複数が繰り返し存在し、その数は３から４０であると言われている。すなわち、リポプロテインの表現型の違いによる分子量の違いは専らｋｒｉｎｇｌｅ４ ｔｙｐｅ２の繰り返し数に起因している。この各ｋｒｉｎｇｌｅ４の各タイプの繰り返し数から、ＥＬＩＳＡを用いてリポプロテイン（ａ）を測定する場合、ｋｒｉｎｇｌｅ ４ ｔｙｐｅ ２に対する抗体が固相抗体および標識抗体の双方に含まれると正確に分子単位での測定ができないことを示す（Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９５；４１：２４５−２５５）。また、異なるタイプのドメイン上に、同一のまたは類似したエピトープも存在する。このことは逆に固相化抗体と標識抗体としてｋｒｉｎｇｌｅ４ ｔｙｐｅ１およびｋｒｉｎｇｌｅ４ ｔｙｐｅ３から１０のいずれかと結合し得る抗体であって、異なるタイプに共通して存在しないエピトープを認識する抗体の中から選択し、固相化抗体と標識抗体が結合するタイプを別のものにすれば、必ず１分子の固相化抗体−１分子の抗原−１分子の標識抗体という結合が成立するので、分子単位での測定が可能になる。また、ｋｒｉｎｇｌｅ４以外のドメインに存在するエピトープであっても、ａｐｏ（ａ）中に、複数存在しないエピトープを認識する抗体を少なくとも標識抗体として、好ましくは標識抗体と固相化抗体の両方に用いてもよい。本発明において、リポプロテイン（ａ）を分子単位で測定した場合の測定値とは、このように１分子の固相化抗体−１分子の抗原−１分子の標識抗体という結合が成立する条件で行われるＥＬＩＳＡを指す。このようなＥＬＩＳＡとして例えば、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９５；４１：２４６−２５５に記載のＥＬＩＳＡが挙げられる。このようなＥＬＩＳＡ法による測定値と本発明の方法による測定値の相関をとった場合、相関係数（Ｒ２）は、０．９７以上、好ましくは０．９８以上、さらに好ましくは０．９９以上である。
また、本発明の各フェノタイプの種類による測定値の変動を回避し、生体試料中のリポプロテイン（ａ）を分子単位で測定した場合の測定値と高い相関を有する測定値を得られる免疫比濁法とは、ＩＦＣＣ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｄｅｉｃｉｎｅ，Ｖｉａ Ｃａｒｌｏ Ｆａｒｉｎｉ ８１，２０１５９ Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ）により認証されたリポプロテイン（ａ）の標準物質（ＰＲＭ；ＩＦＣＣ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍａｔｅｒｉａｌ）を試料として生理的塩類溶液により段階的に希釈したものを前記免疫比濁法により測定した場合、理論濃度と吸光度変化量として表される測定値の関係をグラフで示すことにより作成される検量線に対して、いかなる表現型のリポプロテイン（ａ）を試料として同様な測定を行った場合に作成される検量線とも実質的に平行性を示す免疫比濁法である。
また、本発明の方法によれば各フェノタイプの種類による測定値の変動を回避し、生体試料中のリポプロテイン（ａ）を分子単位で測定した場合の測定値と高い相関を有する測定値を得られるが、これは標準物質として用いる表現型の分子を変えても、常にほぼ同一の測定値が得られることを意味する。従って、本発明の方法は、標準物質として用いる分子の表現型にかかわらず一定の測定値が得られる方法である。
以下、本発明の実施例に基づき具体的に説明する。もっとも本発明は下記実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕 ラテックス濃度（抗体量）を変えた試薬での測定値の変化（対照法（ＥＬＩＳＡ）との相関）
ウサギ抗ヒトリポプロテイン（ａ）ポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社より入手）をラテックス粒子（積水工業株式会社から入手）に混和し、室温にて６０分間、その後６０℃の恒温槽中で５０分間加温を行った後、冷水中で２０分間冷却することにより感作した。感作量は、ラテックス粒子１ｍｇ当たりポリクローナル抗体０．１４ｍｇであった。感作ラテックス粒子を０．１７Ｍグリシン緩衝液ｐＨ７に０．５重量％の濃度で分散し抗ヒトリポプロテイン（ａ）ウサギポリクローナル抗体分散液とした。
抗ヒトリポプロテイン（ａ）ウサギポリクローナル抗体を感作したラテックス粒子の分散浮遊液において、第２試薬中の抗体の終濃度がそれぞれ約０．３、０．４、０．５、０．７ｍｇ／ｍＬとなるように調製し、第２試薬とした。第１試薬として０．１ＭのＮａＣｌおよび０．０５ＭのＥＤＴＡ、１％のＢＳＡ、非特異反応の回避を目的として正常ウサギグロブリンを２５ｍｇ／ｍＬを加えたグリシン緩衝液を用いた。塩基性アミノ酸としてアルギニンを第１試薬に１０％、第２試薬に３０％添加した。反応液中の終濃度としては１６．７％であった。
測定する試料として、それぞれ表現型の異なるリポプロテイン（ａ）を含むヒト血清を２０検体用いた。２０検体中、表現型がＢ、Ｓ１、Ｓ３、Ｓ４およびＳ５のものをそれぞれ４検体ずつ用いた（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ社より入手）。
反応は試料となる血清４μＬに対して第１試薬１６０μＬを加え攪拌し、５分後に第２試薬８０μＬを添加攪拌し、凝集反応を行なった。測定は日立７１７０形自動分析装置を使用し、この際約１分後から４分間の３７℃における凝集反応を波長５７０ｎｍの吸光度変化量として測定するよう設定した。吸光度変化量から濃度を算出するために、あらかじめ既知濃度の標準（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ社より入手）を試料として同条件で測定し、濃度と吸光度変化量の関係を表す検量線を作成しておいた。
また、上記２０検体を対照法として以下のように酵素免疫測定法で測定した。用いるモノクローナル抗体はＣｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９５；４１：２４６−２５５に記載の方法により入手することができる。Ｎｕｎｃ社製の９６ウェルマイクロタイタープレートに、抗ヒトリポプロテイン（ａ）モノクローナル抗体（ｋｒｉｎｇｌｅ４ ｔｙｐｅ２に結合するが、ｋｒｉｎｇｌｅ ｔｙｐｅ１およびｔｙｐｅ３から１０には結合しないモノクローナル抗体）を０．５μｇ／ｗｅｌｌで固相化した（０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．６中５μｇ／ｍＬの抗体溶液を１００μＬウェルに入れ１時間室温で攪拌した後一夜４℃でインキュベート）。ＰＢＳ ｐＨ７．４を用いてウェルを３回洗浄し、３０ｇ／ＬのＢＳＡを含むＰＢＳ３００μＬをウェルに入れ１時間室温でインキュベートしブロッキングを行った。ブロッキング後、ＰＢＳ ｐＨ７．４を用いてウェルを３回洗浄し該ウェル中に前記検体を１００μＬ添加し、１時間２８℃で攪拌した。この際、検体は１ｇ／Ｌ ＢＳＡ、０．５ｍＬ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳを用いて適宜希釈した。ＰＢＳ ｐＨ７．４を用いてウェルを３回洗浄し、ＨＲＰで標識した抗ヒトリポプロテイン（ａ）モノクローナル抗体（ｋｒｉｎｇｌｅ４ ｔｙｐｅ２以外のｋｒｉｎｇｌｅ４ドメインに結合する）溶液を１００μＬ添加し、１時間２８℃で攪拌した。その後、ＯＰＤおよびＨ２Ｏ２を添加し、発色反応を行い、１５分後に１ｍｏｌ／Ｌ硫酸１００μＬを添加し反応を停止した。反応停止後反応液の４９５ｎｍにおける吸光度を測定した。この際、吸光度から濃度を算出するために、あらかじめ既知濃度の標準を試料として同条件で測定し、濃度と吸光度の関係を表す検量線を作成しておいた。
結果、第２試薬中の抗体濃度が０．３ｍｇ／ｍＬおよび０．４ｍｇ／ｍＬの試薬による測定では、酵素免疫測定法との相関性より求めた回帰直線から乖離する検体が認められるが、抗体濃度０．５ｍｇ／ｍＬおよび０．６ｍｇ／ｍＬの試薬による測定では、酵素免疫測定法との相関性より求めた回帰直線から乖離する検体は見られなかった。図１に各抗体濃度における対照測定法における測定値と、ラテックス凝集法における測定値の相関を示す。また図２には、各表現型の検体の回帰直線からの乖離を示す。
試薬中の抗体濃度を調整することにより、対照となる酵素免疫測定法と測定値が一致させることが可能であることを確認した。
〔実施例２〕 アルギニン濃度を変えた試薬での測定値の変化（対照法（ＥＬＩＳＡ）との相関）
抗ヒトリポプロテイン（ａ）ウサギポリクローナル抗体を感作したラテックス粒子の分散浮遊液は、実施例１と同様にして作製した。
抗ヒトリポプロテイン（ａ）ウサギポリクローナル抗体を感作したラテックス粒子の分散浮遊液において、第２試薬中の抗体の終濃度が約０．７ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。また、塩基性アミノ酸としてアルギニンを反応液中の終濃度としてそれぞれ１０、１５、１７％となるように第１試薬中に添加した（第２試薬中濃度は３０％）。
測定条件および測定する試料は実施例１と同様であった。
結果、反応液中のアルギニン濃度が１０％の場合、酵素免疫測定法との相関性より求めた回帰直線から乖離する検体が認められるが、１５％および１７％の場合、酵素免疫測定法との相関性より求めた回帰直線から乖離する検体は見られなかった。図１に各アルギニン濃度における対照測定法における測定値と、ラテックス凝集法における測定値の相関を示す。また図２には、各表現型の検体の回帰直線からの乖離を示す。
試薬中のアルギニン濃度を調整することにより、酵素免疫測定法と測定値を一致させることが可能であることを確認した。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
実施例に示すように、ラテックス免疫比濁法において、反応系に添加する抗体量を多くし、さらに反応系に一定濃度の塩基性アミノ酸を添加することにより、多彩な表現型が存在するヒトリポプロテイン（ａ）の表現型の違いによる測定値の変動を回避することができる。
本発明により、多様な表現型を有する抗原を測定する場合に、酵素免疫測定法と測定値の相関性に優れ、かつ自動分析装置で迅速・簡便に測定することが可能となる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のフェノタイプが存在するリポプロテイン（ａ）の抗原抗体反応を利用したラテックス免疫比濁測定法を用いた検出において、測定系に添加するリポプロテイン（ａ）に対する抗体量を調節し、かつ測定系に塩基性アミノ酸を添加することにより、各フェノタイプの種類による測定値の変動を回避し、生体試料中のリポプロテイン（ａ）を分子単位で測定した場合の測定値と高い相関
を有する測定値を得られる、抗原抗体反応を利用したラテックス免疫比濁測定法。
【請求項２】
添加する抗体量が抗原抗体反応時の反応溶液中において０．１６ｍｇ／ｍＬ以上である請求項１記載の方法。
【請求項３】
添加する抗体量が抗原抗体反応時の反応溶液中において０．１６ｍｇ／ｍＬ以上０．２３ｍｇ／ｍＬ以下である請求項２記載の方法。
【請求項４】
添加する塩基性アミノ酸量が抗原抗体反応時の反応溶液において１５重量％以上である請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
塩基性アミノ酸の添加量が抗原抗体反応時の反応溶液において１５重量％以上１７重量％以下である請求項４記載の方法。
【請求項６】
塩基性アミノ酸がアルギニンである請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
フェノタイプが存在するリポプロテイン（ａ）の抗原抗体反応を利用したラテックス免疫比濁測定法を用いた検出試薬であって、試薬中に抗原抗体反応時の反応溶液中の抗体量が０．１６ｍｇ／ｍＬ以上となる分だけのリポプロテイン（ａ）に対する抗体、および試薬中に抗原抗体反応時の反応溶液中の塩基性アミノ酸量が１５重量％以上となる分だけの塩基性アミノ酸を含む、各フェノタイプの種類による測定値の変動を回避し、生体試料中のリポプロテイン（ａ）を分子単位で測定した場合の測定値と高い相関を有する測定値を得られる、抗原抗体反応を利用したラテックス免疫比濁測定用検出試薬。
【請求項８】
添加する抗体量が抗原抗体反応時の反応溶液中において０．１６ｍｇ／ｍＬ以上０．２３ｍｇ／ｍＬ以下である請求項７記載のラテックス免疫比濁測定用検出試薬。
【請求項９】
添加する塩基性アミノ酸量が抗原抗体反応時の反応溶液において１５重量％以上１７重量％以下である請求項７または８に記載のラテックス免疫比濁測定用検出試薬。
【請求項１０】
塩基性アミノ酸がアルギニンである請求項７から９のいずれか１項に記載のラテックス免疫比濁測定用検出試薬。
【請求項１】
複数のフェノタイプが存在するリポプロテイン（ａ）の抗原抗体反応を利用したラテックス免疫比濁測定法を用いた検出において、測定系に添加するリポプロテイン（ａ）に対する抗体量を調節し、かつ測定系に塩基性アミノ酸を添加することにより、各フェノタイプの種類による測定値の変動を回避し、生体試料中のリポプロテイン（ａ）を分子単位で測定した場合の測定値と高い相関
を有する測定値を得られる、抗原抗体反応を利用したラテックス免疫比濁測定法。
【請求項２】
添加する抗体量が抗原抗体反応時の反応溶液中において０．１６ｍｇ／ｍＬ以上である請求項１記載の方法。
【請求項３】
添加する抗体量が抗原抗体反応時の反応溶液中において０．１６ｍｇ／ｍＬ以上０．２３ｍｇ／ｍＬ以下である請求項２記載の方法。
【請求項４】
添加する塩基性アミノ酸量が抗原抗体反応時の反応溶液において１５重量％以上である請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
塩基性アミノ酸の添加量が抗原抗体反応時の反応溶液において１５重量％以上１７重量％以下である請求項４記載の方法。
【請求項６】
塩基性アミノ酸がアルギニンである請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
フェノタイプが存在するリポプロテイン（ａ）の抗原抗体反応を利用したラテックス免疫比濁測定法を用いた検出試薬であって、試薬中に抗原抗体反応時の反応溶液中の抗体量が０．１６ｍｇ／ｍＬ以上となる分だけのリポプロテイン（ａ）に対する抗体、および試薬中に抗原抗体反応時の反応溶液中の塩基性アミノ酸量が１５重量％以上となる分だけの塩基性アミノ酸を含む、各フェノタイプの種類による測定値の変動を回避し、生体試料中のリポプロテイン（ａ）を分子単位で測定した場合の測定値と高い相関を有する測定値を得られる、抗原抗体反応を利用したラテックス免疫比濁測定用検出試薬。
【請求項８】
添加する抗体量が抗原抗体反応時の反応溶液中において０．１６ｍｇ／ｍＬ以上０．２３ｍｇ／ｍＬ以下である請求項７記載のラテックス免疫比濁測定用検出試薬。
【請求項９】
添加する塩基性アミノ酸量が抗原抗体反応時の反応溶液において１５重量％以上１７重量％以下である請求項７または８に記載のラテックス免疫比濁測定用検出試薬。
【請求項１０】
塩基性アミノ酸がアルギニンである請求項７から９のいずれか１項に記載のラテックス免疫比濁測定用検出試薬。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８８３１７
【国際公開日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【発行日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０４２６１（Ｐ２００５−５０４２６１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４６０６
【国際出願日】平成１６年３月３１日（２００４．３．３１）
【出願人】（５９１１２５３７１）デンカ生研株式会社 (72)
【国際公開日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【発行日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４６０６
【国際出願日】平成１６年３月３１日（２００４．３．３１）
【出願人】（５９１１２５３７１）デンカ生研株式会社 (72)
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