ロッド状金微粒子構造体とその製造方法および用途
【課題】保持物質がリンカーを介して金ナノロッドに結合しており、保持物質として色素や薬剤を用い、保持物質の離脱によって、色素による蛍光発光方法や特定部位に薬剤を放出するドラッグデリバリーシステム（DDS）に利用でき、保持物質としてＰＥＧを用い、ＰＥＧの離脱によって金ナノロッドを凝集させ、凝集部位を検出する方法などに利用できる金微粒子構造体とその製造方法を提供する。
【解決手段】保持物質、リンカー、ロッド状の金微粒子によって構成され、保持物質がリンカーを介して金微粒子に結合しており、保護物質とリンカーの結合部位がDiels-Alder反応生成物質によって形成されており、該反応生成物質は近赤外光の熱変換の発熱によって切断される性質を有し、該結合部位の切断によって保持物質と金微粒子が脱離することを特徴とするロッド状金微粒子構造体とその製造方法および用途。
【解決手段】保持物質、リンカー、ロッド状の金微粒子によって構成され、保持物質がリンカーを介して金微粒子に結合しており、保護物質とリンカーの結合部位がDiels-Alder反応生成物質によって形成されており、該反応生成物質は近赤外光の熱変換の発熱によって切断される性質を有し、該結合部位の切断によって保持物質と金微粒子が脱離することを特徴とするロッド状金微粒子構造体とその製造方法および用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、保持物質、リンカー、ロッド状の金微粒子によって構成され、保持物質がリンカーを介して金微粒子に結合しており、金微粒子が近赤外光を熱に変換し、この発熱によってリンカーと保持物質の結合部位が切断され、保持物質と金微粒子が脱離するロッド状金微粒子構造体と、その製造方法および用途に関する。
【０００２】
本発明は、より具体的には、金ナノロッドの光熱変換反応による発生熱で起こる逆Diels-Alder反応によって、金ナノロッドと保持物質を結合するリンカー部位が開裂し、金ナノロッドから保持物質を分離することが可能な金微粒子構造体とその製造方法である。
【０００３】
本発明の金微粒子構造体によれば、保持物質が蛍光体（色素）である場合、金ナノロッドから蛍光体が脱離することによって、金ナノロッドにクエンチされていた状態から解かれるため、蛍光を発することができる状態となり、蛍光を検出信号とする検出方法やバイオイメージングとして有用である。また、保持物質が薬剤の場合、特定の部位に薬剤を放出するドラッグデリバリーシステムとして有用である。さらに、保持物質がポリエチレングリコールの場合、特定の部位でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を放出させ、分散安定性が低下した金微粒子を凝集させることができるため、金微粒子の集積によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルで金微粒子の存在する部位を検出する検出方法やバイオイメージングとして有用である。
【背景技術】
【０００４】
溶媒中に分散した金属微粒子に光を照射すると局在表面プラズモン共鳴（Localized Surface Plasmon resonance：LSPR）と呼ばれる共鳴吸収現象が生じる。この吸収現象は金属の種類と形状、そして金属微粒子周囲における媒体の屈折率によって吸収波長が決定される。例えば、球状の金微粒子が水に分散した場合は５３０nm付近に吸収域を持ち、金微粒子の形状を短軸１０nm程度のロッド状（金ナノロッド）にすると、ロッドの短軸に起因する５３０nm付近の吸収の他に、ロッドの長軸に起因する長波長側の吸収を有することが知られている（非特許文献１）。このように、金ナノロッドについて長軸長さ、短軸長さの数値に基づいた吸収波長の理論計算が可能である。また、非特許文献２に記載されているように、金ナノロッドは表面には異なる結晶面が存在しており、単純な円柱ではなく多面体構造である。なお、本発明において、ロッド状とは、非特許文献１に記載されているように、形状が円柱状ないし棒状であって、長さが短い方向を短軸と云い、長い方向を長軸と云う。
【０００５】
これらの金属微粒子分散液は、低分子化合物や高分子化合物を保護剤として金属微粒子表面に吸着ないし結合させることによって、金属微粒子が凝集することなく安定に溶媒に分散させることができる。特に金ナノロッドは、形状の変化や凝集状態の変化、金ナノロッド周辺の環境によって分光特性が変化する特異な金微粒子であり（非特許文献３、４、５、６）、近赤外光をプローブとして用いる新しい分光分析の材料として可能性がある。
【０００６】
金ナノロッドはアスペクト比（長軸長さ／短軸長さ）が１より大きいロッド状のナノサイズ（例えば、長軸５〜１００nm、短軸３〜３０nm）の金微粒子であり、例えば、カチオン性界面活性剤である第４級アンモニウム塩のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）に溶解した水中で合成され、ＣＴＡＢ水溶液中の金イオンを化学還元、電気還元、光還元などによって合成することが可能であり、合成した金ナノロッドはＣＴＡＢの保護作用によって水中で安定に分散している（特許文献１、２、３、４、非特許文献７、８）。
【０００７】
金ナノロッドの表面処理方法としては、近赤外域にプラズモン吸収のピークトップを有する金ナノロッドについて、金ナノロッド水分散液中の過剰なＣＴＡＢを除去しておき、α−メトキシ−ω−メルカプトポリエチレングリコール（ｍ-ＰＥＧ-ＳＨ）を表面修飾して生体内での分散安定性を高める技術（非特許文献９）や、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨを表面修飾した金ナノロッドをシリカ処理することによって、シリカが金ナノロッドに表面処理された金ナノロッド／シリカ（コア／シェル）粒子を得る技術が報告されている（非特許文献１０）。また、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨを表面処理した金ナノロッドをＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）で埋包した粒子について、ＮＩＰＡＭの感温性と金ナノロッドの光熱変換特性を利用することによって、金ナノロッドを埋包しているＮＩＰＡＭに親水性と疎水性を発現させる技術が報告されている(非特許文献１１)。
【０００８】
金コロイドの表面処理方法としては、非特許文献１２には、球状の金コロイド、またはシリカ粒子表面に金膜を形成したシリカ／金（コア／シェル）粒子に7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideをリンカーとしてフルオレセイン色素を導入しておき、逆Diels-Alder反応によってリンカー部位を開裂することによって、フルオレセイン色素を結合している粒子から分離する技術が報告されている。
【０００９】
また、非特許文献１３には、金微粒子表面の近傍に化学的結合されている色素の蛍光はクエンチされて、蛍光強度が弱く観察されることが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００４−２９２６２７号公報
【特許文献２】特開２００５−９７７１８号公報
【特許文献３】特開２００６−１６９５４４号公報
【特許文献４】特開２００６−１１８０３６号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】S. Link, M. B. Mohamed, M. A. El-Sayed, J. Phys. Chem. B, 103, p3073（1999）
【非特許文献２】Z. L. Wang, M. B. Mohamed, S. Link, M. A. El-Sayed, Surface Science, 440, L809(1999)
【非特許文献３】K. Honda, Y. Niidome, N. Nakashima, H. Kawazumi, S. Yamada, Chem. Lett., 35, p854（2006）
【非特許文献４】Y. Niidome, H. Takahashi, S. Urakawa, K. Nishioka, S. Yamada, Chem. Lett., 33, p454（2004）
【非特許文献５】S. Link, M. A. El-Sayed, J. Phys. Chem. B, 109, p10531（2005）
【非特許文献６】P. K. Jain, S. Eustis, M. A. El-Sayed, J. Phys. Chem. B, 110, p18243 (2006)
【非特許文献７】Y. Niidome, H. Kawasaki, S. Yamada, S. Chem. Commun, 18, p2376 (2003)
【非特許文献８】H. Takahashi, Y. Niidome, T. Niidome, K. Kaneko, H. Kawasaki, S.Yamada, Langmuir, 22, p2 (2006)
【非特許文献９】T. Niidome, M. Yamagata, Y. Okamoto, Y. Akiyama, H. Takahashi, T. Kawano, Y. Katayama, Y. Niidome, J. Control. Release, 114, p343 (2006)
【非特許文献１０】T. Kawano, Y. Niidome, T. Mori, Y. Katayama, T. Niidome, Bioconjugate Chem., 20, p209 (2009)
【非特許文献１１】A. Shiotani, T. Mori, T. Niidome, Y. Niidome, Y. Katayama, Langmuir, 23, p4012 (2007)
【非特許文献１２】A. B. S. Bakhtiari, D. Hsiao, G. Jin, B. D. Gates, N. R. Branda, Angew. Chem. Int. Ed., 48, p1 (2009)
【非特許文献１３】E. Duikeith, A. C. Morteani, T. Niedereichholz, T. A. Klar, J.Feldmann, Phys. Review Lett., 89, p203002 (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
金ナノロッドの表面に色素や薬剤などの機能性素子を修飾し、かつ特定の部位でそれらの機能性素子を分離することによって、生体内におけるバイオマーカーとして利用することや、ドラッグデリバリーシステム（DDS）の構築が可能となる。しかし、特許文献１〜４などに示されるように、金ナノロッドは一般にＣＴＡＢが表面に吸着しており、色素や薬剤、あるいは分散剤となるＰＥＧをそのまま吸着させた場合、任意のタイミングで分離操作を行うことはできない。また、ＣＴＡＢの毒性のために生体内への適用はできないという問題があった。
【００１３】
非特許文献１２の方法では、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideをリンカーとして球状金コロイド表面に色素を修飾しているが、表面にＣＴＡＢのない状態の球状金コロイド、またはシリカ／金（コア／シェル）粒子を対象としており、ＣＴＡＢが吸着している金ナノロッドの場合には適用できない。また、球状の金コロイドのプラズモン吸収は５２０nm付近であり、逆Diels-Alder反応を起こすエネルギーとして近赤外光を利用する場合には、吸収域が異なるため光熱変換に利用できないという問題がある。さらに、近赤外域にプラズモン吸収を有するシリカ／金（コア／シェル）粒子は、粒子径が２００nm以上と大きいため沈降しやすく、プラズモン吸収はシャープではなくブロードな吸収特性となるために光熱変換の効率が低いという問題がある。
【００１４】
本発明は、従来の上記技術では知られていない金ナノロッドを利用した新規な金微粒子構造体と、その製造方法および用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明によれば以下の構成を有するロッド状金微粒子構造体が提供される。
〔１〕保持物質、リンカー、ロッド状の金微粒子によって構成され、保持物質がリンカーを介して金微粒子に結合しており、保護物質とリンカーの結合部位がDiels-Alder反応生成物質によって形成されており、該反応生成物質は近赤外光の熱変換の発熱によって切断される性質を有し、該結合部位の切断によって保持物質と金微粒子が脱離することを特徴とするロッド状金微粒子構造体。
〔２〕ロッド状の金微粒子表面に吸着している次式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩がリンカーによって置換され、該リンカーを介して保持物質が金微粒子表面に結合されている上記[１]に記載するロッド状金微粒子構造体。
ＣＨ3(ＣＨ2)nＮ+(ＣＨ3)3Ｂｒ- （ｎは１〜１５の整数） …[Ｉ]
〔３〕保護物質とリンカーの結合部位がDiels-Alder反応によって生じる7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideによって形成されている上記[１]または上記[２]に記載するロッド状金微粒子構造体。
〔４〕Diels-Alder反応に関わるジエンとジエノフィルがそれぞれフランとマレイミドであり、保持物質がフランに修飾されており、リンカーがマレイミドとチオール基を含み、保持物質とリンカーの結合部位がフランとマレイミドのDiels-Alder反応によって形成されており、一方、リンカーと金微粒子がチオール基によって結合している上記[１]〜上記[３]の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
〔５〕リンカーが、片末端がチオール基であるポリエチレングリコールを含有するシリカ層／ポリエチレンイミン層／マレイミドによって構成されており、金微粒子と該ポリエチレングリコールはチオール基で結合しており、該ポリエチレングリコールを含有するシリカ層とポリエチレンイミン層は静電相互作用で吸着しており、該ポリエチレンイミン層とマレイミドはアミド結合しており、該マレイミドは保持物質に修飾しているフランと結合している上記[４]に記載するロッド状金微粒子構造体。
〔６〕保持物質が金微粒子の吸収波長以外の波長域に発光を生じる色素である上記[１]〜上記[５]の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
〔７〕色素がローダミンＢである上記[６]に記載するロッド状金微粒子構造体。
〔８〕保持物質が薬剤である上記[１]〜上記[５]の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
〔９〕Diels-Alder反応に関わるジエンとジエノフィルがそれぞれフランとマレイミドであり、保持物質がマレイミドに修飾されており、リンカーがチオール基を含むフランであり、保持物質とリンカーの結合部位がフランとマレイミドのDiels-Alder反応によって形成されており、一方、リンカーと金微粒子がフランのチオール基によって結合している上記[１]〜上記[３]の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
〔１０〕保持物質が重合平均分子量１０００以上のポリエチレングリコールである上記[１]〜上記[３]、または上記[９]の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
〔１１〕ロッド状金微粒子の長軸長さが５〜１００nm、短軸長さが３〜３０nmであり、アスペクト比２〜２０、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００nmの範囲である上記[１]〜上記[１０]の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
【００１６】
また、本発明によれば以下の構成を有するロッド状金微粒子構造体の製造方法が提供される。
〔１２〕上記式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩が吸着したロッド状の金微粒子に、重量平均分子量１０００以上のα−メトキシ−ω−メルカプトポリエチレングリコールを表面修飾し、さらにオルト珪酸テトラエチルを反応させて該金微粒子表面にシリカ層を形成し、次いで該シリカ層にポリエチレンイミン層を積層し、該ポリエチレンイミンにマレイミドをアミド結合させることによって、金微粒子表面がシリカ層／ポリエチレンイミン層／マレイミドからなるリンカーによって被覆された金微粒子(Ｂ)を調製し、フランに色素を結合した保持物質(Ａ)と上記金微粒子(Ｂ)とを混合し、上記フランと上記マレイミドとのDiels-Alder反応によって、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成することにより、色素を金微粒子表面に結合させるロッド状金微粒子構造体の製造方法。
〔１３〕上記[１２]の製造方法において、色素に代えて薬剤を用いることによって、薬剤を金微粒子に結合させるロッド状金微粒子構造体の製造方法。
〔１４〕リンカーであるチオール基を有するフランと、マレイミドに修飾された重量平均分子量１０００以上のα−［3-（3-マレイミド-1-オキソプロピル）アミノ］プロピル-ω-メトキシポリエチレングリコールとをDiels-Alder反応させて、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成することによって、リンカーが結合した保持物質(Ａ)を調製し、次いで、該保持物質(Ａ)と上記式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩が吸着したロッド状の金微粒子(Ｂ)とを混合してリンカーのチオール基によって保持物質(Ａ)を金属微粒子表面に結合させることによって、ポリエチレングリコールを金微粒子表面に結合させるロッド状金微粒子構造体の製造方法。
【００１７】
さらに、本発明によれば上記金微粒子構造体を用いた以下の用途が提供される。
〔１５〕上記[６]または上記[７]に記載するロッド状金微粒子構造体を用い、近傍の金微粒子によって発光がクエンチされている色素を金微粒子から脱離させることによって蛍光を発生させる蛍光発光方法。
〔１６〕上記[１０]に記載するロッド状金微粒子構造体を用い、ポリエチレングリコールを金微粒子から脱離させることによって、金微粒子の分散安定性を失わせて金微粒子を凝集させる金微粒子の集積方法。
〔１７〕上記[１６]に記載する金微粒子の集積によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルの変化で金微粒子の存在する部位を検出する方法。
〔１８〕上記[１５]に記載する蛍光発光検出、または上記[１７]に記載する吸収スペクトル検出を情報とするバイオイメージング。
〔１９〕上記[８]に記載するロッド状金微粒子構造体を用い、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、薬剤を金微粒子から脱離させることによって、特定の部位に薬剤を放出するドラッグデリバリーシステム（DDS）。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の金微粒子構造体は、保持物質、リンカー、金ナノロッドによって構成されており、保持物質がリンカーを介して金ナノロッドに結合しており、金ナノロッドが近赤外光を熱に変換し、リンカーと保持物質を結合する部位が発生した熱によって切断できるため、目的の部位やタイミングで近赤外光を照射することによって、保持物質と金ナノロッドを脱離させることができる。また、金ナノロッド表面に吸着しているＣＴＡＢはリンカーによって置換することによって除去し、またはシリカ層を形成してこれに埋包することも可能であるため、ＣＴＡＢの毒性が問題にならず、生体内への適用が可能である。
【００１９】
具体的には、本発明の金微粒子構造体およびその製造方法の一例では、ＣＴＡＢが吸着した金ナノロッド表面にｍ-ＰＥＧ-ＳＨを表面修飾することによって大部分のＣＴＡＢを置換し、さらに金微粒子表面にシリカ層を形成することによって、金ナノロッド表面にＣＴＡＢが僅かに残留している場合に、このＣＴＡＢをシリカ層によって埋包するので、ＣＴＡＢの毒性の問題を解消することができる。
【００２０】
さらに、本発明の金微粒子構造体の一例では、色素や薬剤をあらかじめフランに結合しておき、金ナノロッドに修飾したマレイミドと上記フランとのDiels-Alder付加環化反応（Diels-Alder反応と云う）によって色素や薬剤を金ナノロッドに結合させるため、金ナノロッドに修飾する色素や薬剤の量をあらかじめ任意に調整することが可能である。また、フランに結合させる色素や薬剤などの機能性素子を適宜選択することによって、金ナノロッドに導入する機能性素子を選択しやすい利点がある。
【００２１】
また、本発明に係る金微粒子構造体およびその製造方法の他例では、保持物質のＰＥＧに導入したマレイミドとチオール基を有するフランとをDiels-Alder反応させて結合し、次いでフランのチオール基によって金ナノロッド表面に結合するので、金ナノロッド表面に修飾しているＣＴＡＢは該チオール基の結合によって大部分が置換されるので、ＣＴＡＢの毒性の問題を低下させることができる。また、この金微粒子構造体では、ＰＥＧはあらかじめフランに結合しているので、ＰＥＧの量や鎖長をあらかじめ任意に調整することが可能である。
【００２２】
さらに、本発明の金微粒子構造体は上記何れの場合でも、金ナノロッドは光熱変換機能を有するので、金ナノロッド固有のLSPRに相当する波長の光（近赤外光）を照射すると熱に変換され、保持物質と金ナノロッドとの結合部位（7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide）に変換した熱を与えて逆Diels-Alder反応を起し、フランとマレイミドに開裂させることができるので、フランに結合している色素や薬剤を金ナノロッドから容易に分離することが可能であり、あるいはマレイミドに結合するＰＥＧ鎖を金ナノロッドから容易に分離することが可能である。
【００２３】
本発明の金微粒子構造体に用いられる金ナノロッドは、LSPRの最大吸収波長が７００〜２０００nmの範囲であり、特に波長７５０〜１１００nmの近赤外光は水の吸収による影響が少なく（Water Window）、生体にも安全な波長域であり、生体内に投与された場合、金ナノロッドをバイオマーカーとしてLSPRの分光変化を確認することで、近赤外光を用いたバイオイメージングが可能であり、近赤外分析システムを構築するのに適している。さらに、金ナノロッドに光照射して色素や薬剤、更にはＰＥＧ鎖を分離することによって標的部位周辺組織に対するフォトサーマル治療のみならず、色素を用いたバイオイメージングを行うことができ、さらに、薬剤放出によるドラックデリバリーシステムの構築や金微粒子の集積によって生じるLSPRの吸収スペクトルによって金微粒子の存在する部位のイメージングが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例１のNRsへの保持物質導入の概念図
【図２】実施例１のローダミンBとフルフリルアミン縮合体の合成図
【図３】DA-NRsの吸収スペクトル図
【図４】実施例１の逆Deils-Alder反応により放出した保持物質ローダミンBの蛍光スペクトル図
【図５】実施例２のNRsへの保持物質ＰＥＧ導入の概念図
【図６】実施例２のＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨの合成図
【図７】PEG-DA-NRsの吸収スペクトル図
【図８】図１に示したＣＴＡＢ、ＰＥＧ、ＰＥＩ、クロスリンカー、ローダミンＢの説明図
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明を実施形態に基づいて具体的に説明する。なお、濃度の％は特に示さない限り質量％である。
【００２６】
本発明の金微粒子構造体は、保持物質、リンカー、ロッド状の金微粒子によって構成され、保持物質がリンカーを介して金微粒子に結合しており、保護物質とリンカーの結合部位がDiels-Alder反応生成物質によって形成されており、該反応生成物質は近赤外光の熱変換の発熱によって切断される性質を有し、該結合部位の切断によって保持物質と金微粒子が脱離することを特徴とするロッド状金微粒子構造体である。
【００２７】
本発明の金微粒子構造体において、Diels-Alder反応に関わるジエンとジエノフィルはそれぞれフランとマレイミドであり、これらの結合について以下の態様を含む。
（イ）保持物質の色素や薬剤がフランに修飾されており、このフランとリンカーの一部であるマレイミドとのDiels-Alder反応によって7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成し、これを結合部位として保持物質と金ナノロッドが結合されている態様。
（ロ）保持物質のＰＥＧにマレイミドが導入されており、リンカーがチオール基を含む該フランであり、このフランとＰＥＧのマレイミドとのDiels-Alder反応によって7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成し、これを結合部位としてＰＥＧがリンカーに結合し、該リンカーのチオール基で金ナノロッド結合されている態様。
【００２８】
〔金ナノロッド〕
本発明の金微粒子構造体にはロッド状の金微粒子（金ナノロッド）が用いられる。この金ナノロッドは、長軸長さ５〜１００nm、短軸長さ３〜３０nmであって、アスペクト比２〜１２であり、LSPRの最大吸収波長が７００〜２００００nmの範囲にある。さらに、この金ナノロッドは、長軸長さ２０〜８０nm、短軸長さ４〜１０nmの粒子径であるものが分散安定性の面からより好ましい。長軸長さが１００nmより長いと、金ナノロッドが自重で沈降しやすくなる傾向があるため、分散媒中での分散安定性が失われる。また、金ナノロッドのアスペクト比は、生体内に投与した場合でも、光照射や検出が可能な近赤外域にLSPRの最大吸収波長を有するものが好ましく、従って上記アスペクト比の範囲が適当である。
【００２９】
上記金ナノロッドは次式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩が溶解した水溶液中で金イオンを還元することによって合成することができる。例えば、n＝１５のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を使用することによって、ＣＴＡＢが表面に吸着した金ナノロッドを得ることができる。合成した段階での金ナノロッドはＣＴＡＢが吸着した状態で水中に安定に分散している。
ＣＨ3(ＣＨ2)nＮ+(ＣＨ3)3Ｂｒ- （ｎは１〜１５の整数） …[Ｉ]
【００３０】
金ナノロッド水分散液は、上記式[Ｉ]に示される水中に存在する余剰の界面活性剤を除去してから表面処理するとよい。具体的には、金ナノロッド水分散液を遠心分離して金ナノロッドを遠沈管の底に沈降させ、界面活性剤を含む上澄みを除去する。沈降した金ナノロッドは水を添加して再分散させる。この操作を１〜３回繰り返すことによって余剰な界面活性剤を除去することができる。なお、界面活性剤を過剰に除去すると金ナノロッドが凝集して水に再分散しなくなる。
【００３１】
〔リンカー〕
本発明の金微粒子構造体において、金ナノロッドに吸着しているリンカーは、例えば、片末端がチオール基であるＰＥＧを含有するシリカ層／ポリエチレンイミン層／マレイミドによって構成される。片末端がチオール基であるＰＥＧと金ナノロッドは、チオール基で結合している。ＰＥＧはシリカ層に含有されており、シリカ層とポリエチレンイミン層は静電相互作用で吸着している。このポリエチレンイミン層とマレイミドはアミド結合しており、このマレイミドは保持物質に修飾しているフランと結合している
いる。
【００３２】
本発明の金微粒子構造体において、リンカーの他の例は、チオール基を有するフランによって構成されている。チオール基を有するフランと金ナノロッドはこのチオール基で結合している。
【００３３】
〔保持物質（色素、薬剤の場合）〕
保持物質が色素や薬剤の場合、あらかじめ色素や薬剤をフランに結合しておき、このフランとリンカーのマレイミドとのDiels-Alder反応によって、色素や薬剤をリンカーに結合し、このリンカーを介して金ナノロッドに結合することができる。
【００３４】
色素は金ナノロッドのLSPR吸収と重ならないような波長域に吸収を有するものが好ましい。金ナノロッドと色素の吸収が重なると、色素単体の吸収波長を確認することが困難になる傾向がある。色素としては、具体的には、例えば、ローダミンＢ、フルオレセイン、Cyシリーズ（Cy３, Cy５）、Alexa Fluorシリーズ(Alexa Fluor 488,Alexa Fluor750)などの商品名で市販されているものが挙げられる。これらは特に問題なく使用することができる。薬剤は特定の病巣で投与され改善が得られるような薬剤を選択すれば良い。薬剤としては、例えば、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、パクリタキセルなどの商品名で市販されているものが挙げられる。これらは特に問題なく使用することができる。
【００３５】
〔保持物質（ＰＥＧの場合）〕
保持物質がＰＥＧの場合、あらかじめＰＥＧにマレイミドを導入しておき、リンカーとしてチオール基を含むフランを用い、ＰＥＧのマレイミドとリンカーのフランとのDiels-Alder反応によって、ＰＥＧをリンカーに結合し、このリンカーのチオール基によって金ナノロッドに結合することができる。ＰＥＧとしては生体中で金ナノロッドが安定に分散できるようなものを選択すればよく、特に重量平均分子量１０００以上のＰＥＧを使用した場合、生体内において金ナノロッドの高い分散安定性が得られる。
【００３６】
〔表面処理方法（保持物質が色素、薬剤の場合）〕
次式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩（界面活性剤：ＣＴＡＢなど）が吸着した金ナノロッド表面にＰＥＧを修飾し、これに珪酸化合物（ＴＥＯＳなど）を反応させて金ナノロッド表面にＰＥＧ含有シリカ層を形成し、このシリカ層にポリエチレンイミン層を静電相互作用によって積層し、このポリエチレンイミンのアミノ基とマレイミドをアミド結合させることによって、ＰＥＧ含有シリカ層／ポリエチレンイミン層／マレイミドからなるリンカーによって被覆された金ナノロッド(Ｂ)を調製する。一方、フランに色素を結合した保持物質(Ａ)を調製する。この保持物質(Ａ)と金ナノロッド(Ｂ)とを混合し、上記フランと上記マレイミドとのDiels-Alder反応によって、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成することにより、色素が金ナノロッド表面に結合されたロッド状金微粒子構造体を製造することができる。
ＣＨ3(ＣＨ2)nＮ+(ＣＨ3)3Ｂｒ- （ｎは１〜１５の整数） …[Ｉ]
【００３７】
金ナノロッドに表面処理するＰＥＧとしては、片方の末端がメトキシ基であり、もう一方の末端がチオール基を有する重量平均分子量１０００〜４００００のポリエチレングリコール（ｍ-ＰＥＧ-ＳＨ）を使用すればよく、好ましくは重量平均分子量２０００〜２００００のｍ-ＰＥＧ-ＳＨがよい。余剰のＣＴＡＢを除去した金ナノロッド水分散液にｍ-ＰＥＧ-ＳＨを添加して攪拌すると、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨは末端のチオール基で金ナノロッド表面と結合し、金ナノロッド表面のＣＴＡＢは大部分がｍ-ＰＥＧ-ＳＨによって置換され、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨで表面修飾された金ナノロッドが得られる。金ナノロッドに結合しない余剰のｍ-ＰＥＧ-ＳＨは遠心操作で除去するとよい。ｍ-ＰＥＧ-ＳＨで表面処理した金ナノロッドは、アルコール（エタノールなど）に分散することができる。このとき、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨの重量平均分子量が１０００より小さいとアルコール中の分散安定性が悪くなり、一方、重合平均分子量が２００００より大きいと分散安定性に変化はなく、コスト的に不利である。
【００３８】
ｍ-ＰＥＧ-ＳＨの添加量は、分散液中で、金濃度１mMに対して、０.０１〜１０mMになる濃度範囲がよく、好ましくは０.１〜１mMの範囲が良い。ｍ-ＰＥＧ-ＳＨの濃度が０.０１mMより低いと、アルコール中での分散が不安定となり、アルコール中に安定分散させることができない。一方、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨの濃度が１０mMより高いと金ナノロッドに吸着しない余剰分が発生し、コスト的に不利である。なお、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨによって表面修飾しない金ナノロッドを用いてエタノール分散液を調製した場合、金ナノロッド表面に修飾していつ分散剤のＣＴＡＢがエタノールに溶解するため、金ナノロッドが凝集する。
【００３９】
ｍ-ＰＥＧ-ＳＨで表面修飾した金ナノロッドの水分散液に、オルト珪酸テトラエチル(ＴＥＯＳ)などの珪酸化合物を溶解したエタノールを添加し、攪拌すると、金ナノロッド表面にシリカ層が形成され、金ナノロッドをコアとし、シリカ層をシェルとするコア／シェル微粒子を得ることができる。このとき、金ナノロッド表面に吸着しているｍ-ＰＥＧ-ＳＨはシリカ層に埋包された状態になる。従って、金ナノロッド表面にＣＴＡＢが僅かに残留している場合でも、このＣＴＡＢはシリカ層に埋包されるので、ＣＴＡＢの毒性の問題を解消することができる。
【００４０】
ＴＥＯＳの添加量は、金濃度１mMに対して、０.５〜１００mMの濃度範囲がよく、好ましくは１〜５０mMの範囲がよい。ＴＥＯＳの濃度が０.５mMより低いと金ナノロッドを十分にシリカ被覆することができない。一方、ＴＥＯＳの濃度が１００mMより高いとシリカの金ナノロッド被覆量が多くなり、粒子径が大きくなって分散安定性が低下し、沈降物を生じるので好ましくない。またコスト的にも不利である。シリカ処置の際、アンモニアを触媒として５％程度添加するとよい。
【００４１】
金ナノロッドの表面に負の電荷であるシリカ層のシェルを形成することで、正の電荷であるポリエチレンイミンを静電相互作用によって吸着させることができる。余剰のＴＥＯＳを除去した金ナノロッド／シリカのコア／シェル粒子の９０％エタノール分散液（１０％は水）に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を溶解した９０％エタノールを添加し、攪拌すると、静電相互作用によってシリカ層の表面にＰＥＩ層が形成され、金ナノロッド／ｍ-ＰＥＧ-ＳＨ含有シリカ層／ＰＥＩ層から形成される微粒子を得ることができる。
【００４２】
金ナノロッドに表面処理するＰＥＩとしては、重量平均分子量１０００〜１０００００のＰＥＩを使用すればよく、好ましくは重量平均分子量１８００〜６００００のＰＥＩがよい。ＰＥＩの重量平均分子量が１０００より小さいとアルコール中の分散安定性が低下し、一方、重合平均分子量が１０００００より大きいと粒子の沈殿が認められる。
【００４３】
ＰＥＩの添加量は、金濃度１mMに対して、０.１３〜１２.５mMの濃度範囲がよく、好ましくは、０.２１〜６.９４mMの範囲がよい。ＰＥＩの濃度が０.１３mMより低いとシリカ層を十分にＰＥＩで被覆することができない。一方、PEIの濃度が１２.５mMより高いとシリカ層上のＰＥＩ被覆量が多くなり、粒子径が大きくなって分散安定性が低下し、沈降物を生じるので好ましくない。
【００４４】
金ナノロッド表面のシリカ層とＰＥＩ層の膜厚が厚くなると、後の工程で修飾する色素などの蛍光物質の蛍光発光がクエンチされなくなる。具体的には、例えばシリカ層とＰＥＩ層の膜厚の合計が３０nmを超えると蛍光発光のクエンチが起こらなくなるため、これより薄い膜厚がよい。
【００４５】
金ナノロッド表面に形成したｍ-ＰＥＧ-ＳＨ含有シリカ層／ＰＥＩ層の表面に、Diels-Alder反応に関わるジエノフィルであるマレイミド基を導入する。マレイミド基の導入は、ＰＥＩ中のアミノ基と反応する官能基を末端に有し、もう片方の末端にはマレイミド基を有する化合物（クロスリンカー）を用いればよく、アミノ基との反応基としては、カルボキシル基、カルボン酸無水物、スクシンイミジル基などが挙げられる。
【００４６】
金ナノロッド表面にｍ-ＰＥＧ-ＳＨ含有シリカ層／ＰＥＩ層を有する金ナノロッド水分散液にクロスリンカーを溶解した水溶液を添加し、攪拌すると、ＰＥＩ層のアミノ基とクロスリンカー中の反応基が反応して結合し、金ナノロッド／ｍ-ＰＥＧ-ＳＨ含有シリカ層／ＰＥＩ層／マレイミドから形成される表面処理層を有する金ナノロッド（Ma-NRs）の分散液を得ることができる。
【００４７】
クロスリンカーの添加量は、金濃度１mMに対して、０.１〜２０mMの濃度範囲がよく、好ましくは１〜１０mMの範囲がよい。クロスリンカーの濃度が０.１mMより低いとマレイミド基を十分に導入することができないため、Diels-Alder反応で保持物質を十分に結合させることができない。一方、クロスリンカーの濃度が２０mMより高いとＰＥＩのアミノ基よりも過剰となるため未反応のクロスリンカーが発生する。
【００４８】
Ma-NRs表面のマレイミドとのDiels-Alder反応に関わるジエンとしてはフランを用いればよい。フランとしては保持物質である色素や薬剤を結合するための反応基を有していることが好ましく、例えば、フルフリルアミン（Furfurylamine）などが挙げられる。例えば、アミノ基を有するフランであるフルフリルアミンと、カルボキシ基を有する色素であるローダミンＢを反応させると、保持物質である色素とフランの縮合体（Fu-RoB）が得られる。
【００４９】
Ma-NRｓと色素や薬剤を結合したフランとのDiels-Alder反応によって、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成して、金ナノロッドに保持物質を結合することができる。例えば、Ma-NRsとFu-RoBのDiels-Alder反応によって、金ナノロッドに保持物質として色素ローダミンBを結合することができる。
【００５０】
〔表面処理方法（保持物質がＰＥＧの場合）〕
マレイミドを導入した保持物質のＰＥＧとして、例えば、重量平均分子量１０００以上のマレイミド（α-［3-（3マレイミド-1-オキソプロピル）アミノ］プロピル-ω-メトキシポリエチレングリコール）を用い、一方、チオール基を有するフランをリンカーとして用い、ＰＥＧのマレイミドとフランとをDiels-Alder反応させて、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成し（ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨ）、ＰＥＧにフランを結合し、このフランのチオール基によって、次式［Ｉ］で示される界面活性剤が吸着した金ナノロッド表面に結合させることによって、保持物質のＰＥＧが結合した金ナノロッド（PEG-DA-NRs）を得ることができる。
ＣＨ3(ＣＨ2)nＮ+(ＣＨ3)3Ｂｒ- （ｎは１〜１５の整数） …［Ｉ］
【００５１】
ＰＥＧはあらかじめフランにDiels-Alder反応で結合しておくので、金ナノロッドに修飾するＰＥＧの量や鎖長を容易に調整することができる。
【００５２】
〔PEG-DA-NRの作製方法〕
フランは金微粒子と吸着するためのチオール基を有するものであればよい。また、マレイミドは、重量平均分子量１０００以上のＰＥＧが導入されたものであればよく、ＰＥＧの片方の末端がメトキシ基であり、もう一方の末端がマレイミド基である。ＰＥＧの重量平均分子量が１０００より小さいと生体内での金ナノロッドの分散安定性が悪くなり、一方、重合平均分子量が２００００より大きいと分散安定性に変化はなく、コスト的に不利である。
【００５３】
チオール基を有するフランと、ＰＥＧを有するマレイミドとをDiels-Alder反応させて、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成して得られた化合物（ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨ）は、チオール基を有しているため、金ナノロッドに吸着させることが可能である。特に上記式[Ｉ]の界面活性剤が吸着した金ナノロッドに対しても、硫黄の吸着力が強いため、PEG-DA-SHを添加するだけで、金ナノロッド表面に修飾している界面活性剤はPEG-DA-SHによって置換され、ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨを金ナノロッドに表面修飾することができ、保持物質のＰＥＧをリンカーを介して金ナノロッドに結合することができる。
【００５４】
ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨの添加量は、分散液中で、金濃度１mMに対して、０.０１〜１０mMになる濃度範囲がよく、好ましくは０.１〜１mMの範囲が良い。ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨの濃度が０.０１mMより低いと水中での分散が不安定となり、安定に分散させることができない。一方、ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨの濃度が１０mMより高いと金ナノロッドに吸着しない余剰分が発生し、コスト的に不利である。
【００５５】
なお、ＣＴＡＢによって表面修飾されている金ナノロッドの水分散液について、液中の余剰のＣＴＡＢを透析して除去する場合、金ナノロッド表面のＣＴＡＢも透析によって排除されるので金ナノロッドが凝集する。一方、ＣＴＡＢに代えてＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨによって表面修飾された金ナノロッドはＰＥＧが分散剤として機能するので、このような凝集を生じない。
【００５６】
〔保持物質の脱離方法〕
本発明に使用する金ナノロッドは、７００〜２０００nmにLSPRの吸収ピークを有しており、金ナノロッドにLSPR吸収ピークの光を照射すると、光熱変換で熱が発生し、発生した熱によって、金ナノロッドと保持物質の結合部位を形成している7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideが逆Diels-Alder反応を起こすため、金ナノロッドから保持物質が脱離する。
【００５７】
特に波長８００〜１２００nmの近赤外光は水の吸収による影響が少なく（Near Infrared Window）、生体にも安全な波長域であり、生体外部から近赤外光を照射することによって、生体内に投与した金ナノロッドの光熱変換を起こすことが可能である。
【００５８】
〔検出方法・治療方法等〕
本発明の金微粒子構造体は、金ナノロッドが、照射された近赤外光を熱に変換し、この熱によってリンカーと保持物質の結合部位（7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide）が逆Diels-Alder反応を起こして分離し、保持物質と金ナノロッドが脱離することを利用して、光照射による検出方法、バイオイメージング、ドラッグデリバリーシステムなどを構築することができる。近赤外光としては、近赤外線を発する近赤外線レーザー（CW、半導体レーザー）などを利用すればよい。また、保持物質を脱離するための逆Diels-Alder反応が起こる熱が加えられればよく、金ナノロッドの光熱変換機能による熱発生に限らず、本発明の金微粒子構造体が分散している系を加熱する方法でもよい。
【００５９】
保持物質が色素の場合、金ナノロッドから色素が脱離することによって、クエンチされた状態から解かれて、色素固有の蛍光発光を発するようになり、その蛍光を検出することが可能である。特に、生体内へ近赤外光を照射して色素の脱離を起こし、その蛍光を測定して画像化することにより、バイオイメージングが可能となる。
【００６０】
保持物質が薬剤の場合、特定部位にある金ナノロッドに近赤外光照射し光熱変換機能で熱を発生させ、この熱で逆Diels-Alder反応を起こして結合部位（7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide）を開裂させ、薬剤を脱離させることによって、薬物を効率よく放出するドラッグデリバリーシステム（DDS）を構築することができる。特に、金は生体に安全な材料であり、キャリアーとして有用である。
【００６１】
ＰＥＧを保持物質として利用した場合は、ＰＥＧ鎖が分散剤として機能するため生体内における金ナノロッドの分散安定性が得られるばかりでなく、近赤外光照射した場合、金ナノロッドの光熱変換機能で発生した熱で逆Diels-Alder反応が起こり、結合部位が開裂してマレイミド部位のＰＥＧが金ナノロッドから脱離するため、分散安定性が失われて金ナノロッドが凝集し、あるいは、周辺組織に吸着させることができ、この金ナノロッドの集積によって生じるLSPRの吸収スペクトルによって金ナノロッドが凝集する部位のイメージングが可能である。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明を実施例によって具体的に示す。また、比較例を示す。なお、以下の実施例において、金ナノロッドはＣＴＡＢを保護剤として塩化金酸を水中で還元して合成された長軸４０nm、短軸１０nm、アスペクト比４のロッド形状の金微粒子であり（特許文献３参照）、主に９００nm付近の波長域におけるLSPRの吸収波長シフトが測定されているが、金ナノロッドのアスペクト比を変更することによって７００〜２００００nmまでの波長域についても同様の吸収波長のシフトを測定することができる。また分光特性は日本分光株式会社製品（製品名V-570）を用いて測定した。
【００６３】
〔実施例１〕
以下の手順で、保持物質を結合した金微粒子を得た。製造工程の概念図を図１に示す。
【００６４】
〔金ナノロッド水分散液〕
CTABで表面修飾された金ナノロッドの水分散液を次の手順で準備した。
４００mMのＣＴＡＢ水溶液中で合成された金ナノロッド水分散液を遠沈管に入れ、１４０００(×g)の相対遠心加速度（遠心加速度を地球の重力加速度で除したもの）で１０分間遠心分離して金ナノロッドを遠沈管の底に沈降させた。上澄み液を別の遠沈管に入れ、沈降した金ナノロッドを水で再分散させた。別の遠沈管に入れた上澄み液は、再び１４０００(×g)で１０分間遠心分離して金ナノロッドを沈降させ、この上澄み液を除去することによって余剰のＣＴＡＢを除去した。沈降した金ナノロッドを水で再分散させ、前の再分散液と合わせて、金ナノロッド水分散液（CTAB-NRs、金含有量：１.６mM）を得た。吸光度から金ナノロッド水分散液中の金原子濃度を求めた。
【００６５】
〔ローダミンＢとフルフリルアミン縮合体の合成〕
保持物質として色素ローダミンＢを準備した。Diels-Alder反応に関わるジエンとしてフランを準備した。ローダミンＢに存在するカルボキシル基とフルフリルアミンに存在するアミノ基との縮合反応を行い、色素をフランに結合した（Fu-RoB、図２）。具体的には、５０mlナスフラスコに、０.５mmolのローダミンＢ、０.６mmolのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（N-hydroxysuccinimide；ＮＨＳ）、０.６mmolの１-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)を入れ、１０mlのＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)に溶解した。この溶液にトリエチルアミン１４μlを氷冷下条件で添加し、０.５mmolのフルフリルアミンを５mlのＤＭＦで溶解した溶液を同様に氷冷下で滴下した。滴下終了から１時間後、室温にて２３時間攪拌反応させた（図２）。
【００６６】
〔金微粒子表面へのリンカー導入〕
（イ）CTAB-NRs水分散液とｍ-ＰＥＧ-ＳＨ（重量平均分子量２００００）をモル比でNRs（金原子）：ｍ-ＰＥＧ-ＳＨ＝1：1になるように添加し、２４時間攪拌して、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨが片末端のチオール基でNRs表面に結合した微粒子（PEG-NRs）の水分散液を得た。この水分散液を、ＭＷＣＯ＝１００００の透析膜にて透析して、過剰のＣＴＡＢを取り除いた。透析後の水分散液を１４０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心分離してNRsに結合していない余剰のｍ-ＰＥＧ-ＳＨを除去し、遠沈管の底に沈降させたNRsを水で再分散後、１０mM（金原子）PEG-NRs水分散液を調整した。
（ロ）このPEG-NRs水分散液に、エタノール、１％ＴＥＯＳ、５％アンモニアを添加し、２４時間攪拌してシリカ層を形成し、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨの吸着したNRsがシリカで埋包された微粒子（Si-NRs）のエタノール分散液を得た。調製したSi-NRsエタノール分散液を５０００(×g)の相対遠心加速度で10分間遠心分離してSi-NRsを遠沈管の底に沈降させ、９０％エタノールで再分散させてSi-NRsエタノール分散液を調製した。
（ハ）このSi-NRsエタノール分散液に、ＰＥＩを溶解した９０％エタノールを添加し、モル比でNRs（金原子）：ＰＥＩ＝１０：１になるように調整して２４時間攪拌し、Si-NRs表面にＰＥＩが静電相互作用により吸着した粒子（PEI-NRs）エタノール分散液を得た。
調製したPEI-NRsエタノール分散液を５０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心し、PEI-NRsを遠沈管の底に沈降させた後、上澄みを除去し、０.２Mリン酸バッファー（pH8.0）に再分散した。
（ニ）再分散したPEI-NRsエタノール分散液にクロスリンカー（Linker、succinimidyl-[(N-maleimidopropionamido)-dodecaethyleneglycol]ester：NHS-PEO12-mal）を加え、モル比でNRs（金原子）：クロスリンカー＝１：６になるように調整して９０分攪拌し、その後、５０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心分離して上澄みを除去し、ＤＭＦで再分散させて、マレイミド部位を有するクロスリンカーが修飾されたNRs（Ma-NRs）のＤＭＦ分散液を得た。
【００６７】
〔保持物質ローダミンＢの導入〕
上記Ma-NRsのＤＭＦ分散液と、図２の縮合体(Fu-RoB)のＤＭＦ分散液を混合し、NRｓ（金原子）：Fu-RoB＝１：９になるように調整し、６０℃で24時間攪拌し、Diels-Alder反応によって、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成し、金ナノロッドにローダミンＢを結合させた（RoB-NRs、図１）。調製したRoB-NRsのＤＭＦ分散液を５０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心分離し、RoB-NRsを遠沈管底に沈降させた後、上澄みを除去し、未反応のローダミンBを取り除くために、ＭＷＣＯ＝１００００の透析膜で透析した。透析後、５０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心し、上澄みを除去した後、水で再分散させて金濃度０.５mMに調整し、ローダミンＢが7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを介して金ナノロッドに結合した微粒子（DA-NRs）の水分散液を得た。このDA-NRの分光特性を図３に示す。
【００６８】
〔保持物質(ローダミンＢ)の放出〕
上記Da-NRの水分散液１００μlをガラス製チューブに入れ、近赤外線レーザー（CW、半導体レーザー、８０７nm）を５００mWで１分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間照射した。この結果、逆Diels-Alder反応によって、色素ローダミンＢが金ナノロッドより放出され、クエンチされていたローダミンＢの蛍光スペクトルが５８０nm付近に観察された。この蛍光スペクトルを図４に示す。
【００６９】
〔参考例１〕
上記DA-NRの水分散液１００μlをガラス製チューブに入れ、９０℃で３時間加熱した。この結果、逆Diels-Alder反応によって、ローダミンＢが金ナノロッドより放出され、クエンチされていたローダミンＢの蛍光スペクトルが５８０nm付近に観察された。この蛍光スペクトルを図４に示す。
【００７０】
〔実施例２〕
以下の手順で、保持物質を結合した金微粒子を得た。製造工程の概念図を図５に示す。
【００７１】
〔ＰＥＧ修飾マレイミドとフランの反応〕
保持物質としてα−［3-（3-マレイミド-1-オキソプロピル）アミノ］プロピル-ω-メトキシポリエチレングリコールを準備した。Diels-Alder反応に関わるジエンとしてフランを準備した。１０ml遠沈管に０．０１mmolのα−［3-（3マレイミド-1-オキソプロピル）アミノ］プロピル-ω-メトキシポリエチレングリコール（重量平均分子量５０００）、０.２mmolのフルフリルジスルフィドを入れ、５mlのDMFに溶解した。この溶液を６０℃、７２時間攪拌反応させた。反応後、室温に戻し、１mmolのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、２４時間攪拌反応させ、スルフィド部位を開裂してチオール基とした。反応後、ＤＭＦをローターリーエバポレーターで留去し、ＭＷＣＯ＝３５００の透析膜にて、未反応のフランと残留ＤＴＴを取り除き、凍結乾燥にて目的物（ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨ）を得た（図６）。
【００７２】
〔金微粒子表面へのリンカーと保持物質の導入〕
ＣＴＡＢを除去していないNRs水分散液と、上記ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨ（重量平均分子量５０００）をモル比で、NRｓ(金原子)：ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨ＝１：０.２になるように添加し、２４時間攪拌して、ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨが片末端のチオール基でNRs表面に結合した微粒子（PEG-DA-NRs）水分散液を得た（図５）。この水分散液を、ＭＷＣＯ＝１００００の透析膜にて透析して、過剰のＣＴＡＢを取り除いた。透析後の水分散液を１４０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心分離してNRsに結合していない余剰のＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨを除去し、遠沈管の底に沈降させたNRsを水で再分散させ、金濃度０.５mMに調整し、ＰＥＧが7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを介してNRsに結合した金微粒子（PEG-DA-NRs）の水分散液を得た。このPEG-DA-NRsの分光特性を図７に示す。
【００７３】
〔保持物質(ＰＥＧ)の放出〕
上記PEG-DA-NRsの水分散液１００μlをガラス製チューブに入れ、近赤外線レーザー（CW、半導体レーザー、８０７nm）を５００mWで１０分間照射した。この結果、逆Diels-Alder反応によってＰＥＧがNRsより放出された。このＰＥＧについてバリウムーヨウ素法によって濁度として５３５nmの吸収波長を分光時計にて測定した。この結果を表１に示す。
【００７４】
〔参考例２〕
上記PEG-DA-NRsの水分散液１００μlをガラス製チューブに入れ、９０℃で２時間加熱した。この結果、逆Diels-Alder反応によってＰＥＧがNRsより放出された。このＰＥＧについてバリウムーヨウ素法によって濁度として５３５nmの吸収波長を分光時計にて測定した。この結果を表１に示す。
【００７５】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、保持物質、リンカー、ロッド状の金微粒子によって構成され、保持物質がリンカーを介して金微粒子に結合しており、金微粒子が近赤外光を熱に変換し、この発熱によってリンカーと保持物質の結合部位が切断され、保持物質と金微粒子が脱離するロッド状金微粒子構造体と、その製造方法および用途に関する。
【０００２】
本発明は、より具体的には、金ナノロッドの光熱変換反応による発生熱で起こる逆Diels-Alder反応によって、金ナノロッドと保持物質を結合するリンカー部位が開裂し、金ナノロッドから保持物質を分離することが可能な金微粒子構造体とその製造方法である。
【０００３】
本発明の金微粒子構造体によれば、保持物質が蛍光体（色素）である場合、金ナノロッドから蛍光体が脱離することによって、金ナノロッドにクエンチされていた状態から解かれるため、蛍光を発することができる状態となり、蛍光を検出信号とする検出方法やバイオイメージングとして有用である。また、保持物質が薬剤の場合、特定の部位に薬剤を放出するドラッグデリバリーシステムとして有用である。さらに、保持物質がポリエチレングリコールの場合、特定の部位でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を放出させ、分散安定性が低下した金微粒子を凝集させることができるため、金微粒子の集積によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルで金微粒子の存在する部位を検出する検出方法やバイオイメージングとして有用である。
【背景技術】
【０００４】
溶媒中に分散した金属微粒子に光を照射すると局在表面プラズモン共鳴（Localized Surface Plasmon resonance：LSPR）と呼ばれる共鳴吸収現象が生じる。この吸収現象は金属の種類と形状、そして金属微粒子周囲における媒体の屈折率によって吸収波長が決定される。例えば、球状の金微粒子が水に分散した場合は５３０nm付近に吸収域を持ち、金微粒子の形状を短軸１０nm程度のロッド状（金ナノロッド）にすると、ロッドの短軸に起因する５３０nm付近の吸収の他に、ロッドの長軸に起因する長波長側の吸収を有することが知られている（非特許文献１）。このように、金ナノロッドについて長軸長さ、短軸長さの数値に基づいた吸収波長の理論計算が可能である。また、非特許文献２に記載されているように、金ナノロッドは表面には異なる結晶面が存在しており、単純な円柱ではなく多面体構造である。なお、本発明において、ロッド状とは、非特許文献１に記載されているように、形状が円柱状ないし棒状であって、長さが短い方向を短軸と云い、長い方向を長軸と云う。
【０００５】
これらの金属微粒子分散液は、低分子化合物や高分子化合物を保護剤として金属微粒子表面に吸着ないし結合させることによって、金属微粒子が凝集することなく安定に溶媒に分散させることができる。特に金ナノロッドは、形状の変化や凝集状態の変化、金ナノロッド周辺の環境によって分光特性が変化する特異な金微粒子であり（非特許文献３、４、５、６）、近赤外光をプローブとして用いる新しい分光分析の材料として可能性がある。
【０００６】
金ナノロッドはアスペクト比（長軸長さ／短軸長さ）が１より大きいロッド状のナノサイズ（例えば、長軸５〜１００nm、短軸３〜３０nm）の金微粒子であり、例えば、カチオン性界面活性剤である第４級アンモニウム塩のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）に溶解した水中で合成され、ＣＴＡＢ水溶液中の金イオンを化学還元、電気還元、光還元などによって合成することが可能であり、合成した金ナノロッドはＣＴＡＢの保護作用によって水中で安定に分散している（特許文献１、２、３、４、非特許文献７、８）。
【０００７】
金ナノロッドの表面処理方法としては、近赤外域にプラズモン吸収のピークトップを有する金ナノロッドについて、金ナノロッド水分散液中の過剰なＣＴＡＢを除去しておき、α−メトキシ−ω−メルカプトポリエチレングリコール（ｍ-ＰＥＧ-ＳＨ）を表面修飾して生体内での分散安定性を高める技術（非特許文献９）や、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨを表面修飾した金ナノロッドをシリカ処理することによって、シリカが金ナノロッドに表面処理された金ナノロッド／シリカ（コア／シェル）粒子を得る技術が報告されている（非特許文献１０）。また、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨを表面処理した金ナノロッドをＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）で埋包した粒子について、ＮＩＰＡＭの感温性と金ナノロッドの光熱変換特性を利用することによって、金ナノロッドを埋包しているＮＩＰＡＭに親水性と疎水性を発現させる技術が報告されている(非特許文献１１)。
【０００８】
金コロイドの表面処理方法としては、非特許文献１２には、球状の金コロイド、またはシリカ粒子表面に金膜を形成したシリカ／金（コア／シェル）粒子に7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideをリンカーとしてフルオレセイン色素を導入しておき、逆Diels-Alder反応によってリンカー部位を開裂することによって、フルオレセイン色素を結合している粒子から分離する技術が報告されている。
【０００９】
また、非特許文献１３には、金微粒子表面の近傍に化学的結合されている色素の蛍光はクエンチされて、蛍光強度が弱く観察されることが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００４−２９２６２７号公報
【特許文献２】特開２００５−９７７１８号公報
【特許文献３】特開２００６−１６９５４４号公報
【特許文献４】特開２００６−１１８０３６号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】S. Link, M. B. Mohamed, M. A. El-Sayed, J. Phys. Chem. B, 103, p3073（1999）
【非特許文献２】Z. L. Wang, M. B. Mohamed, S. Link, M. A. El-Sayed, Surface Science, 440, L809(1999)
【非特許文献３】K. Honda, Y. Niidome, N. Nakashima, H. Kawazumi, S. Yamada, Chem. Lett., 35, p854（2006）
【非特許文献４】Y. Niidome, H. Takahashi, S. Urakawa, K. Nishioka, S. Yamada, Chem. Lett., 33, p454（2004）
【非特許文献５】S. Link, M. A. El-Sayed, J. Phys. Chem. B, 109, p10531（2005）
【非特許文献６】P. K. Jain, S. Eustis, M. A. El-Sayed, J. Phys. Chem. B, 110, p18243 (2006)
【非特許文献７】Y. Niidome, H. Kawasaki, S. Yamada, S. Chem. Commun, 18, p2376 (2003)
【非特許文献８】H. Takahashi, Y. Niidome, T. Niidome, K. Kaneko, H. Kawasaki, S.Yamada, Langmuir, 22, p2 (2006)
【非特許文献９】T. Niidome, M. Yamagata, Y. Okamoto, Y. Akiyama, H. Takahashi, T. Kawano, Y. Katayama, Y. Niidome, J. Control. Release, 114, p343 (2006)
【非特許文献１０】T. Kawano, Y. Niidome, T. Mori, Y. Katayama, T. Niidome, Bioconjugate Chem., 20, p209 (2009)
【非特許文献１１】A. Shiotani, T. Mori, T. Niidome, Y. Niidome, Y. Katayama, Langmuir, 23, p4012 (2007)
【非特許文献１２】A. B. S. Bakhtiari, D. Hsiao, G. Jin, B. D. Gates, N. R. Branda, Angew. Chem. Int. Ed., 48, p1 (2009)
【非特許文献１３】E. Duikeith, A. C. Morteani, T. Niedereichholz, T. A. Klar, J.Feldmann, Phys. Review Lett., 89, p203002 (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
金ナノロッドの表面に色素や薬剤などの機能性素子を修飾し、かつ特定の部位でそれらの機能性素子を分離することによって、生体内におけるバイオマーカーとして利用することや、ドラッグデリバリーシステム（DDS）の構築が可能となる。しかし、特許文献１〜４などに示されるように、金ナノロッドは一般にＣＴＡＢが表面に吸着しており、色素や薬剤、あるいは分散剤となるＰＥＧをそのまま吸着させた場合、任意のタイミングで分離操作を行うことはできない。また、ＣＴＡＢの毒性のために生体内への適用はできないという問題があった。
【００１３】
非特許文献１２の方法では、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideをリンカーとして球状金コロイド表面に色素を修飾しているが、表面にＣＴＡＢのない状態の球状金コロイド、またはシリカ／金（コア／シェル）粒子を対象としており、ＣＴＡＢが吸着している金ナノロッドの場合には適用できない。また、球状の金コロイドのプラズモン吸収は５２０nm付近であり、逆Diels-Alder反応を起こすエネルギーとして近赤外光を利用する場合には、吸収域が異なるため光熱変換に利用できないという問題がある。さらに、近赤外域にプラズモン吸収を有するシリカ／金（コア／シェル）粒子は、粒子径が２００nm以上と大きいため沈降しやすく、プラズモン吸収はシャープではなくブロードな吸収特性となるために光熱変換の効率が低いという問題がある。
【００１４】
本発明は、従来の上記技術では知られていない金ナノロッドを利用した新規な金微粒子構造体と、その製造方法および用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明によれば以下の構成を有するロッド状金微粒子構造体が提供される。
〔１〕保持物質、リンカー、ロッド状の金微粒子によって構成され、保持物質がリンカーを介して金微粒子に結合しており、保護物質とリンカーの結合部位がDiels-Alder反応生成物質によって形成されており、該反応生成物質は近赤外光の熱変換の発熱によって切断される性質を有し、該結合部位の切断によって保持物質と金微粒子が脱離することを特徴とするロッド状金微粒子構造体。
〔２〕ロッド状の金微粒子表面に吸着している次式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩がリンカーによって置換され、該リンカーを介して保持物質が金微粒子表面に結合されている上記[１]に記載するロッド状金微粒子構造体。
ＣＨ3(ＣＨ2)nＮ+(ＣＨ3)3Ｂｒ- （ｎは１〜１５の整数） …[Ｉ]
〔３〕保護物質とリンカーの結合部位がDiels-Alder反応によって生じる7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideによって形成されている上記[１]または上記[２]に記載するロッド状金微粒子構造体。
〔４〕Diels-Alder反応に関わるジエンとジエノフィルがそれぞれフランとマレイミドであり、保持物質がフランに修飾されており、リンカーがマレイミドとチオール基を含み、保持物質とリンカーの結合部位がフランとマレイミドのDiels-Alder反応によって形成されており、一方、リンカーと金微粒子がチオール基によって結合している上記[１]〜上記[３]の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
〔５〕リンカーが、片末端がチオール基であるポリエチレングリコールを含有するシリカ層／ポリエチレンイミン層／マレイミドによって構成されており、金微粒子と該ポリエチレングリコールはチオール基で結合しており、該ポリエチレングリコールを含有するシリカ層とポリエチレンイミン層は静電相互作用で吸着しており、該ポリエチレンイミン層とマレイミドはアミド結合しており、該マレイミドは保持物質に修飾しているフランと結合している上記[４]に記載するロッド状金微粒子構造体。
〔６〕保持物質が金微粒子の吸収波長以外の波長域に発光を生じる色素である上記[１]〜上記[５]の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
〔７〕色素がローダミンＢである上記[６]に記載するロッド状金微粒子構造体。
〔８〕保持物質が薬剤である上記[１]〜上記[５]の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
〔９〕Diels-Alder反応に関わるジエンとジエノフィルがそれぞれフランとマレイミドであり、保持物質がマレイミドに修飾されており、リンカーがチオール基を含むフランであり、保持物質とリンカーの結合部位がフランとマレイミドのDiels-Alder反応によって形成されており、一方、リンカーと金微粒子がフランのチオール基によって結合している上記[１]〜上記[３]の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
〔１０〕保持物質が重合平均分子量１０００以上のポリエチレングリコールである上記[１]〜上記[３]、または上記[９]の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
〔１１〕ロッド状金微粒子の長軸長さが５〜１００nm、短軸長さが３〜３０nmであり、アスペクト比２〜２０、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００nmの範囲である上記[１]〜上記[１０]の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
【００１６】
また、本発明によれば以下の構成を有するロッド状金微粒子構造体の製造方法が提供される。
〔１２〕上記式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩が吸着したロッド状の金微粒子に、重量平均分子量１０００以上のα−メトキシ−ω−メルカプトポリエチレングリコールを表面修飾し、さらにオルト珪酸テトラエチルを反応させて該金微粒子表面にシリカ層を形成し、次いで該シリカ層にポリエチレンイミン層を積層し、該ポリエチレンイミンにマレイミドをアミド結合させることによって、金微粒子表面がシリカ層／ポリエチレンイミン層／マレイミドからなるリンカーによって被覆された金微粒子(Ｂ)を調製し、フランに色素を結合した保持物質(Ａ)と上記金微粒子(Ｂ)とを混合し、上記フランと上記マレイミドとのDiels-Alder反応によって、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成することにより、色素を金微粒子表面に結合させるロッド状金微粒子構造体の製造方法。
〔１３〕上記[１２]の製造方法において、色素に代えて薬剤を用いることによって、薬剤を金微粒子に結合させるロッド状金微粒子構造体の製造方法。
〔１４〕リンカーであるチオール基を有するフランと、マレイミドに修飾された重量平均分子量１０００以上のα−［3-（3-マレイミド-1-オキソプロピル）アミノ］プロピル-ω-メトキシポリエチレングリコールとをDiels-Alder反応させて、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成することによって、リンカーが結合した保持物質(Ａ)を調製し、次いで、該保持物質(Ａ)と上記式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩が吸着したロッド状の金微粒子(Ｂ)とを混合してリンカーのチオール基によって保持物質(Ａ)を金属微粒子表面に結合させることによって、ポリエチレングリコールを金微粒子表面に結合させるロッド状金微粒子構造体の製造方法。
【００１７】
さらに、本発明によれば上記金微粒子構造体を用いた以下の用途が提供される。
〔１５〕上記[６]または上記[７]に記載するロッド状金微粒子構造体を用い、近傍の金微粒子によって発光がクエンチされている色素を金微粒子から脱離させることによって蛍光を発生させる蛍光発光方法。
〔１６〕上記[１０]に記載するロッド状金微粒子構造体を用い、ポリエチレングリコールを金微粒子から脱離させることによって、金微粒子の分散安定性を失わせて金微粒子を凝集させる金微粒子の集積方法。
〔１７〕上記[１６]に記載する金微粒子の集積によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルの変化で金微粒子の存在する部位を検出する方法。
〔１８〕上記[１５]に記載する蛍光発光検出、または上記[１７]に記載する吸収スペクトル検出を情報とするバイオイメージング。
〔１９〕上記[８]に記載するロッド状金微粒子構造体を用い、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、薬剤を金微粒子から脱離させることによって、特定の部位に薬剤を放出するドラッグデリバリーシステム（DDS）。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の金微粒子構造体は、保持物質、リンカー、金ナノロッドによって構成されており、保持物質がリンカーを介して金ナノロッドに結合しており、金ナノロッドが近赤外光を熱に変換し、リンカーと保持物質を結合する部位が発生した熱によって切断できるため、目的の部位やタイミングで近赤外光を照射することによって、保持物質と金ナノロッドを脱離させることができる。また、金ナノロッド表面に吸着しているＣＴＡＢはリンカーによって置換することによって除去し、またはシリカ層を形成してこれに埋包することも可能であるため、ＣＴＡＢの毒性が問題にならず、生体内への適用が可能である。
【００１９】
具体的には、本発明の金微粒子構造体およびその製造方法の一例では、ＣＴＡＢが吸着した金ナノロッド表面にｍ-ＰＥＧ-ＳＨを表面修飾することによって大部分のＣＴＡＢを置換し、さらに金微粒子表面にシリカ層を形成することによって、金ナノロッド表面にＣＴＡＢが僅かに残留している場合に、このＣＴＡＢをシリカ層によって埋包するので、ＣＴＡＢの毒性の問題を解消することができる。
【００２０】
さらに、本発明の金微粒子構造体の一例では、色素や薬剤をあらかじめフランに結合しておき、金ナノロッドに修飾したマレイミドと上記フランとのDiels-Alder付加環化反応（Diels-Alder反応と云う）によって色素や薬剤を金ナノロッドに結合させるため、金ナノロッドに修飾する色素や薬剤の量をあらかじめ任意に調整することが可能である。また、フランに結合させる色素や薬剤などの機能性素子を適宜選択することによって、金ナノロッドに導入する機能性素子を選択しやすい利点がある。
【００２１】
また、本発明に係る金微粒子構造体およびその製造方法の他例では、保持物質のＰＥＧに導入したマレイミドとチオール基を有するフランとをDiels-Alder反応させて結合し、次いでフランのチオール基によって金ナノロッド表面に結合するので、金ナノロッド表面に修飾しているＣＴＡＢは該チオール基の結合によって大部分が置換されるので、ＣＴＡＢの毒性の問題を低下させることができる。また、この金微粒子構造体では、ＰＥＧはあらかじめフランに結合しているので、ＰＥＧの量や鎖長をあらかじめ任意に調整することが可能である。
【００２２】
さらに、本発明の金微粒子構造体は上記何れの場合でも、金ナノロッドは光熱変換機能を有するので、金ナノロッド固有のLSPRに相当する波長の光（近赤外光）を照射すると熱に変換され、保持物質と金ナノロッドとの結合部位（7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide）に変換した熱を与えて逆Diels-Alder反応を起し、フランとマレイミドに開裂させることができるので、フランに結合している色素や薬剤を金ナノロッドから容易に分離することが可能であり、あるいはマレイミドに結合するＰＥＧ鎖を金ナノロッドから容易に分離することが可能である。
【００２３】
本発明の金微粒子構造体に用いられる金ナノロッドは、LSPRの最大吸収波長が７００〜２０００nmの範囲であり、特に波長７５０〜１１００nmの近赤外光は水の吸収による影響が少なく（Water Window）、生体にも安全な波長域であり、生体内に投与された場合、金ナノロッドをバイオマーカーとしてLSPRの分光変化を確認することで、近赤外光を用いたバイオイメージングが可能であり、近赤外分析システムを構築するのに適している。さらに、金ナノロッドに光照射して色素や薬剤、更にはＰＥＧ鎖を分離することによって標的部位周辺組織に対するフォトサーマル治療のみならず、色素を用いたバイオイメージングを行うことができ、さらに、薬剤放出によるドラックデリバリーシステムの構築や金微粒子の集積によって生じるLSPRの吸収スペクトルによって金微粒子の存在する部位のイメージングが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例１のNRsへの保持物質導入の概念図
【図２】実施例１のローダミンBとフルフリルアミン縮合体の合成図
【図３】DA-NRsの吸収スペクトル図
【図４】実施例１の逆Deils-Alder反応により放出した保持物質ローダミンBの蛍光スペクトル図
【図５】実施例２のNRsへの保持物質ＰＥＧ導入の概念図
【図６】実施例２のＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨの合成図
【図７】PEG-DA-NRsの吸収スペクトル図
【図８】図１に示したＣＴＡＢ、ＰＥＧ、ＰＥＩ、クロスリンカー、ローダミンＢの説明図
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明を実施形態に基づいて具体的に説明する。なお、濃度の％は特に示さない限り質量％である。
【００２６】
本発明の金微粒子構造体は、保持物質、リンカー、ロッド状の金微粒子によって構成され、保持物質がリンカーを介して金微粒子に結合しており、保護物質とリンカーの結合部位がDiels-Alder反応生成物質によって形成されており、該反応生成物質は近赤外光の熱変換の発熱によって切断される性質を有し、該結合部位の切断によって保持物質と金微粒子が脱離することを特徴とするロッド状金微粒子構造体である。
【００２７】
本発明の金微粒子構造体において、Diels-Alder反応に関わるジエンとジエノフィルはそれぞれフランとマレイミドであり、これらの結合について以下の態様を含む。
（イ）保持物質の色素や薬剤がフランに修飾されており、このフランとリンカーの一部であるマレイミドとのDiels-Alder反応によって7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成し、これを結合部位として保持物質と金ナノロッドが結合されている態様。
（ロ）保持物質のＰＥＧにマレイミドが導入されており、リンカーがチオール基を含む該フランであり、このフランとＰＥＧのマレイミドとのDiels-Alder反応によって7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成し、これを結合部位としてＰＥＧがリンカーに結合し、該リンカーのチオール基で金ナノロッド結合されている態様。
【００２８】
〔金ナノロッド〕
本発明の金微粒子構造体にはロッド状の金微粒子（金ナノロッド）が用いられる。この金ナノロッドは、長軸長さ５〜１００nm、短軸長さ３〜３０nmであって、アスペクト比２〜１２であり、LSPRの最大吸収波長が７００〜２００００nmの範囲にある。さらに、この金ナノロッドは、長軸長さ２０〜８０nm、短軸長さ４〜１０nmの粒子径であるものが分散安定性の面からより好ましい。長軸長さが１００nmより長いと、金ナノロッドが自重で沈降しやすくなる傾向があるため、分散媒中での分散安定性が失われる。また、金ナノロッドのアスペクト比は、生体内に投与した場合でも、光照射や検出が可能な近赤外域にLSPRの最大吸収波長を有するものが好ましく、従って上記アスペクト比の範囲が適当である。
【００２９】
上記金ナノロッドは次式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩が溶解した水溶液中で金イオンを還元することによって合成することができる。例えば、n＝１５のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を使用することによって、ＣＴＡＢが表面に吸着した金ナノロッドを得ることができる。合成した段階での金ナノロッドはＣＴＡＢが吸着した状態で水中に安定に分散している。
ＣＨ3(ＣＨ2)nＮ+(ＣＨ3)3Ｂｒ- （ｎは１〜１５の整数） …[Ｉ]
【００３０】
金ナノロッド水分散液は、上記式[Ｉ]に示される水中に存在する余剰の界面活性剤を除去してから表面処理するとよい。具体的には、金ナノロッド水分散液を遠心分離して金ナノロッドを遠沈管の底に沈降させ、界面活性剤を含む上澄みを除去する。沈降した金ナノロッドは水を添加して再分散させる。この操作を１〜３回繰り返すことによって余剰な界面活性剤を除去することができる。なお、界面活性剤を過剰に除去すると金ナノロッドが凝集して水に再分散しなくなる。
【００３１】
〔リンカー〕
本発明の金微粒子構造体において、金ナノロッドに吸着しているリンカーは、例えば、片末端がチオール基であるＰＥＧを含有するシリカ層／ポリエチレンイミン層／マレイミドによって構成される。片末端がチオール基であるＰＥＧと金ナノロッドは、チオール基で結合している。ＰＥＧはシリカ層に含有されており、シリカ層とポリエチレンイミン層は静電相互作用で吸着している。このポリエチレンイミン層とマレイミドはアミド結合しており、このマレイミドは保持物質に修飾しているフランと結合している
いる。
【００３２】
本発明の金微粒子構造体において、リンカーの他の例は、チオール基を有するフランによって構成されている。チオール基を有するフランと金ナノロッドはこのチオール基で結合している。
【００３３】
〔保持物質（色素、薬剤の場合）〕
保持物質が色素や薬剤の場合、あらかじめ色素や薬剤をフランに結合しておき、このフランとリンカーのマレイミドとのDiels-Alder反応によって、色素や薬剤をリンカーに結合し、このリンカーを介して金ナノロッドに結合することができる。
【００３４】
色素は金ナノロッドのLSPR吸収と重ならないような波長域に吸収を有するものが好ましい。金ナノロッドと色素の吸収が重なると、色素単体の吸収波長を確認することが困難になる傾向がある。色素としては、具体的には、例えば、ローダミンＢ、フルオレセイン、Cyシリーズ（Cy３, Cy５）、Alexa Fluorシリーズ(Alexa Fluor 488,Alexa Fluor750)などの商品名で市販されているものが挙げられる。これらは特に問題なく使用することができる。薬剤は特定の病巣で投与され改善が得られるような薬剤を選択すれば良い。薬剤としては、例えば、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、パクリタキセルなどの商品名で市販されているものが挙げられる。これらは特に問題なく使用することができる。
【００３５】
〔保持物質（ＰＥＧの場合）〕
保持物質がＰＥＧの場合、あらかじめＰＥＧにマレイミドを導入しておき、リンカーとしてチオール基を含むフランを用い、ＰＥＧのマレイミドとリンカーのフランとのDiels-Alder反応によって、ＰＥＧをリンカーに結合し、このリンカーのチオール基によって金ナノロッドに結合することができる。ＰＥＧとしては生体中で金ナノロッドが安定に分散できるようなものを選択すればよく、特に重量平均分子量１０００以上のＰＥＧを使用した場合、生体内において金ナノロッドの高い分散安定性が得られる。
【００３６】
〔表面処理方法（保持物質が色素、薬剤の場合）〕
次式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩（界面活性剤：ＣＴＡＢなど）が吸着した金ナノロッド表面にＰＥＧを修飾し、これに珪酸化合物（ＴＥＯＳなど）を反応させて金ナノロッド表面にＰＥＧ含有シリカ層を形成し、このシリカ層にポリエチレンイミン層を静電相互作用によって積層し、このポリエチレンイミンのアミノ基とマレイミドをアミド結合させることによって、ＰＥＧ含有シリカ層／ポリエチレンイミン層／マレイミドからなるリンカーによって被覆された金ナノロッド(Ｂ)を調製する。一方、フランに色素を結合した保持物質(Ａ)を調製する。この保持物質(Ａ)と金ナノロッド(Ｂ)とを混合し、上記フランと上記マレイミドとのDiels-Alder反応によって、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成することにより、色素が金ナノロッド表面に結合されたロッド状金微粒子構造体を製造することができる。
ＣＨ3(ＣＨ2)nＮ+(ＣＨ3)3Ｂｒ- （ｎは１〜１５の整数） …[Ｉ]
【００３７】
金ナノロッドに表面処理するＰＥＧとしては、片方の末端がメトキシ基であり、もう一方の末端がチオール基を有する重量平均分子量１０００〜４００００のポリエチレングリコール（ｍ-ＰＥＧ-ＳＨ）を使用すればよく、好ましくは重量平均分子量２０００〜２００００のｍ-ＰＥＧ-ＳＨがよい。余剰のＣＴＡＢを除去した金ナノロッド水分散液にｍ-ＰＥＧ-ＳＨを添加して攪拌すると、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨは末端のチオール基で金ナノロッド表面と結合し、金ナノロッド表面のＣＴＡＢは大部分がｍ-ＰＥＧ-ＳＨによって置換され、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨで表面修飾された金ナノロッドが得られる。金ナノロッドに結合しない余剰のｍ-ＰＥＧ-ＳＨは遠心操作で除去するとよい。ｍ-ＰＥＧ-ＳＨで表面処理した金ナノロッドは、アルコール（エタノールなど）に分散することができる。このとき、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨの重量平均分子量が１０００より小さいとアルコール中の分散安定性が悪くなり、一方、重合平均分子量が２００００より大きいと分散安定性に変化はなく、コスト的に不利である。
【００３８】
ｍ-ＰＥＧ-ＳＨの添加量は、分散液中で、金濃度１mMに対して、０.０１〜１０mMになる濃度範囲がよく、好ましくは０.１〜１mMの範囲が良い。ｍ-ＰＥＧ-ＳＨの濃度が０.０１mMより低いと、アルコール中での分散が不安定となり、アルコール中に安定分散させることができない。一方、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨの濃度が１０mMより高いと金ナノロッドに吸着しない余剰分が発生し、コスト的に不利である。なお、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨによって表面修飾しない金ナノロッドを用いてエタノール分散液を調製した場合、金ナノロッド表面に修飾していつ分散剤のＣＴＡＢがエタノールに溶解するため、金ナノロッドが凝集する。
【００３９】
ｍ-ＰＥＧ-ＳＨで表面修飾した金ナノロッドの水分散液に、オルト珪酸テトラエチル(ＴＥＯＳ)などの珪酸化合物を溶解したエタノールを添加し、攪拌すると、金ナノロッド表面にシリカ層が形成され、金ナノロッドをコアとし、シリカ層をシェルとするコア／シェル微粒子を得ることができる。このとき、金ナノロッド表面に吸着しているｍ-ＰＥＧ-ＳＨはシリカ層に埋包された状態になる。従って、金ナノロッド表面にＣＴＡＢが僅かに残留している場合でも、このＣＴＡＢはシリカ層に埋包されるので、ＣＴＡＢの毒性の問題を解消することができる。
【００４０】
ＴＥＯＳの添加量は、金濃度１mMに対して、０.５〜１００mMの濃度範囲がよく、好ましくは１〜５０mMの範囲がよい。ＴＥＯＳの濃度が０.５mMより低いと金ナノロッドを十分にシリカ被覆することができない。一方、ＴＥＯＳの濃度が１００mMより高いとシリカの金ナノロッド被覆量が多くなり、粒子径が大きくなって分散安定性が低下し、沈降物を生じるので好ましくない。またコスト的にも不利である。シリカ処置の際、アンモニアを触媒として５％程度添加するとよい。
【００４１】
金ナノロッドの表面に負の電荷であるシリカ層のシェルを形成することで、正の電荷であるポリエチレンイミンを静電相互作用によって吸着させることができる。余剰のＴＥＯＳを除去した金ナノロッド／シリカのコア／シェル粒子の９０％エタノール分散液（１０％は水）に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を溶解した９０％エタノールを添加し、攪拌すると、静電相互作用によってシリカ層の表面にＰＥＩ層が形成され、金ナノロッド／ｍ-ＰＥＧ-ＳＨ含有シリカ層／ＰＥＩ層から形成される微粒子を得ることができる。
【００４２】
金ナノロッドに表面処理するＰＥＩとしては、重量平均分子量１０００〜１０００００のＰＥＩを使用すればよく、好ましくは重量平均分子量１８００〜６００００のＰＥＩがよい。ＰＥＩの重量平均分子量が１０００より小さいとアルコール中の分散安定性が低下し、一方、重合平均分子量が１０００００より大きいと粒子の沈殿が認められる。
【００４３】
ＰＥＩの添加量は、金濃度１mMに対して、０.１３〜１２.５mMの濃度範囲がよく、好ましくは、０.２１〜６.９４mMの範囲がよい。ＰＥＩの濃度が０.１３mMより低いとシリカ層を十分にＰＥＩで被覆することができない。一方、PEIの濃度が１２.５mMより高いとシリカ層上のＰＥＩ被覆量が多くなり、粒子径が大きくなって分散安定性が低下し、沈降物を生じるので好ましくない。
【００４４】
金ナノロッド表面のシリカ層とＰＥＩ層の膜厚が厚くなると、後の工程で修飾する色素などの蛍光物質の蛍光発光がクエンチされなくなる。具体的には、例えばシリカ層とＰＥＩ層の膜厚の合計が３０nmを超えると蛍光発光のクエンチが起こらなくなるため、これより薄い膜厚がよい。
【００４５】
金ナノロッド表面に形成したｍ-ＰＥＧ-ＳＨ含有シリカ層／ＰＥＩ層の表面に、Diels-Alder反応に関わるジエノフィルであるマレイミド基を導入する。マレイミド基の導入は、ＰＥＩ中のアミノ基と反応する官能基を末端に有し、もう片方の末端にはマレイミド基を有する化合物（クロスリンカー）を用いればよく、アミノ基との反応基としては、カルボキシル基、カルボン酸無水物、スクシンイミジル基などが挙げられる。
【００４６】
金ナノロッド表面にｍ-ＰＥＧ-ＳＨ含有シリカ層／ＰＥＩ層を有する金ナノロッド水分散液にクロスリンカーを溶解した水溶液を添加し、攪拌すると、ＰＥＩ層のアミノ基とクロスリンカー中の反応基が反応して結合し、金ナノロッド／ｍ-ＰＥＧ-ＳＨ含有シリカ層／ＰＥＩ層／マレイミドから形成される表面処理層を有する金ナノロッド（Ma-NRs）の分散液を得ることができる。
【００４７】
クロスリンカーの添加量は、金濃度１mMに対して、０.１〜２０mMの濃度範囲がよく、好ましくは１〜１０mMの範囲がよい。クロスリンカーの濃度が０.１mMより低いとマレイミド基を十分に導入することができないため、Diels-Alder反応で保持物質を十分に結合させることができない。一方、クロスリンカーの濃度が２０mMより高いとＰＥＩのアミノ基よりも過剰となるため未反応のクロスリンカーが発生する。
【００４８】
Ma-NRs表面のマレイミドとのDiels-Alder反応に関わるジエンとしてはフランを用いればよい。フランとしては保持物質である色素や薬剤を結合するための反応基を有していることが好ましく、例えば、フルフリルアミン（Furfurylamine）などが挙げられる。例えば、アミノ基を有するフランであるフルフリルアミンと、カルボキシ基を有する色素であるローダミンＢを反応させると、保持物質である色素とフランの縮合体（Fu-RoB）が得られる。
【００４９】
Ma-NRｓと色素や薬剤を結合したフランとのDiels-Alder反応によって、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成して、金ナノロッドに保持物質を結合することができる。例えば、Ma-NRsとFu-RoBのDiels-Alder反応によって、金ナノロッドに保持物質として色素ローダミンBを結合することができる。
【００５０】
〔表面処理方法（保持物質がＰＥＧの場合）〕
マレイミドを導入した保持物質のＰＥＧとして、例えば、重量平均分子量１０００以上のマレイミド（α-［3-（3マレイミド-1-オキソプロピル）アミノ］プロピル-ω-メトキシポリエチレングリコール）を用い、一方、チオール基を有するフランをリンカーとして用い、ＰＥＧのマレイミドとフランとをDiels-Alder反応させて、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成し（ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨ）、ＰＥＧにフランを結合し、このフランのチオール基によって、次式［Ｉ］で示される界面活性剤が吸着した金ナノロッド表面に結合させることによって、保持物質のＰＥＧが結合した金ナノロッド（PEG-DA-NRs）を得ることができる。
ＣＨ3(ＣＨ2)nＮ+(ＣＨ3)3Ｂｒ- （ｎは１〜１５の整数） …［Ｉ］
【００５１】
ＰＥＧはあらかじめフランにDiels-Alder反応で結合しておくので、金ナノロッドに修飾するＰＥＧの量や鎖長を容易に調整することができる。
【００５２】
〔PEG-DA-NRの作製方法〕
フランは金微粒子と吸着するためのチオール基を有するものであればよい。また、マレイミドは、重量平均分子量１０００以上のＰＥＧが導入されたものであればよく、ＰＥＧの片方の末端がメトキシ基であり、もう一方の末端がマレイミド基である。ＰＥＧの重量平均分子量が１０００より小さいと生体内での金ナノロッドの分散安定性が悪くなり、一方、重合平均分子量が２００００より大きいと分散安定性に変化はなく、コスト的に不利である。
【００５３】
チオール基を有するフランと、ＰＥＧを有するマレイミドとをDiels-Alder反応させて、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成して得られた化合物（ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨ）は、チオール基を有しているため、金ナノロッドに吸着させることが可能である。特に上記式[Ｉ]の界面活性剤が吸着した金ナノロッドに対しても、硫黄の吸着力が強いため、PEG-DA-SHを添加するだけで、金ナノロッド表面に修飾している界面活性剤はPEG-DA-SHによって置換され、ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨを金ナノロッドに表面修飾することができ、保持物質のＰＥＧをリンカーを介して金ナノロッドに結合することができる。
【００５４】
ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨの添加量は、分散液中で、金濃度１mMに対して、０.０１〜１０mMになる濃度範囲がよく、好ましくは０.１〜１mMの範囲が良い。ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨの濃度が０.０１mMより低いと水中での分散が不安定となり、安定に分散させることができない。一方、ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨの濃度が１０mMより高いと金ナノロッドに吸着しない余剰分が発生し、コスト的に不利である。
【００５５】
なお、ＣＴＡＢによって表面修飾されている金ナノロッドの水分散液について、液中の余剰のＣＴＡＢを透析して除去する場合、金ナノロッド表面のＣＴＡＢも透析によって排除されるので金ナノロッドが凝集する。一方、ＣＴＡＢに代えてＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨによって表面修飾された金ナノロッドはＰＥＧが分散剤として機能するので、このような凝集を生じない。
【００５６】
〔保持物質の脱離方法〕
本発明に使用する金ナノロッドは、７００〜２０００nmにLSPRの吸収ピークを有しており、金ナノロッドにLSPR吸収ピークの光を照射すると、光熱変換で熱が発生し、発生した熱によって、金ナノロッドと保持物質の結合部位を形成している7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideが逆Diels-Alder反応を起こすため、金ナノロッドから保持物質が脱離する。
【００５７】
特に波長８００〜１２００nmの近赤外光は水の吸収による影響が少なく（Near Infrared Window）、生体にも安全な波長域であり、生体外部から近赤外光を照射することによって、生体内に投与した金ナノロッドの光熱変換を起こすことが可能である。
【００５８】
〔検出方法・治療方法等〕
本発明の金微粒子構造体は、金ナノロッドが、照射された近赤外光を熱に変換し、この熱によってリンカーと保持物質の結合部位（7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide）が逆Diels-Alder反応を起こして分離し、保持物質と金ナノロッドが脱離することを利用して、光照射による検出方法、バイオイメージング、ドラッグデリバリーシステムなどを構築することができる。近赤外光としては、近赤外線を発する近赤外線レーザー（CW、半導体レーザー）などを利用すればよい。また、保持物質を脱離するための逆Diels-Alder反応が起こる熱が加えられればよく、金ナノロッドの光熱変換機能による熱発生に限らず、本発明の金微粒子構造体が分散している系を加熱する方法でもよい。
【００５９】
保持物質が色素の場合、金ナノロッドから色素が脱離することによって、クエンチされた状態から解かれて、色素固有の蛍光発光を発するようになり、その蛍光を検出することが可能である。特に、生体内へ近赤外光を照射して色素の脱離を起こし、その蛍光を測定して画像化することにより、バイオイメージングが可能となる。
【００６０】
保持物質が薬剤の場合、特定部位にある金ナノロッドに近赤外光照射し光熱変換機能で熱を発生させ、この熱で逆Diels-Alder反応を起こして結合部位（7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imide）を開裂させ、薬剤を脱離させることによって、薬物を効率よく放出するドラッグデリバリーシステム（DDS）を構築することができる。特に、金は生体に安全な材料であり、キャリアーとして有用である。
【００６１】
ＰＥＧを保持物質として利用した場合は、ＰＥＧ鎖が分散剤として機能するため生体内における金ナノロッドの分散安定性が得られるばかりでなく、近赤外光照射した場合、金ナノロッドの光熱変換機能で発生した熱で逆Diels-Alder反応が起こり、結合部位が開裂してマレイミド部位のＰＥＧが金ナノロッドから脱離するため、分散安定性が失われて金ナノロッドが凝集し、あるいは、周辺組織に吸着させることができ、この金ナノロッドの集積によって生じるLSPRの吸収スペクトルによって金ナノロッドが凝集する部位のイメージングが可能である。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明を実施例によって具体的に示す。また、比較例を示す。なお、以下の実施例において、金ナノロッドはＣＴＡＢを保護剤として塩化金酸を水中で還元して合成された長軸４０nm、短軸１０nm、アスペクト比４のロッド形状の金微粒子であり（特許文献３参照）、主に９００nm付近の波長域におけるLSPRの吸収波長シフトが測定されているが、金ナノロッドのアスペクト比を変更することによって７００〜２００００nmまでの波長域についても同様の吸収波長のシフトを測定することができる。また分光特性は日本分光株式会社製品（製品名V-570）を用いて測定した。
【００６３】
〔実施例１〕
以下の手順で、保持物質を結合した金微粒子を得た。製造工程の概念図を図１に示す。
【００６４】
〔金ナノロッド水分散液〕
CTABで表面修飾された金ナノロッドの水分散液を次の手順で準備した。
４００mMのＣＴＡＢ水溶液中で合成された金ナノロッド水分散液を遠沈管に入れ、１４０００(×g)の相対遠心加速度（遠心加速度を地球の重力加速度で除したもの）で１０分間遠心分離して金ナノロッドを遠沈管の底に沈降させた。上澄み液を別の遠沈管に入れ、沈降した金ナノロッドを水で再分散させた。別の遠沈管に入れた上澄み液は、再び１４０００(×g)で１０分間遠心分離して金ナノロッドを沈降させ、この上澄み液を除去することによって余剰のＣＴＡＢを除去した。沈降した金ナノロッドを水で再分散させ、前の再分散液と合わせて、金ナノロッド水分散液（CTAB-NRs、金含有量：１.６mM）を得た。吸光度から金ナノロッド水分散液中の金原子濃度を求めた。
【００６５】
〔ローダミンＢとフルフリルアミン縮合体の合成〕
保持物質として色素ローダミンＢを準備した。Diels-Alder反応に関わるジエンとしてフランを準備した。ローダミンＢに存在するカルボキシル基とフルフリルアミンに存在するアミノ基との縮合反応を行い、色素をフランに結合した（Fu-RoB、図２）。具体的には、５０mlナスフラスコに、０.５mmolのローダミンＢ、０.６mmolのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（N-hydroxysuccinimide；ＮＨＳ）、０.６mmolの１-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)を入れ、１０mlのＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)に溶解した。この溶液にトリエチルアミン１４μlを氷冷下条件で添加し、０.５mmolのフルフリルアミンを５mlのＤＭＦで溶解した溶液を同様に氷冷下で滴下した。滴下終了から１時間後、室温にて２３時間攪拌反応させた（図２）。
【００６６】
〔金微粒子表面へのリンカー導入〕
（イ）CTAB-NRs水分散液とｍ-ＰＥＧ-ＳＨ（重量平均分子量２００００）をモル比でNRs（金原子）：ｍ-ＰＥＧ-ＳＨ＝1：1になるように添加し、２４時間攪拌して、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨが片末端のチオール基でNRs表面に結合した微粒子（PEG-NRs）の水分散液を得た。この水分散液を、ＭＷＣＯ＝１００００の透析膜にて透析して、過剰のＣＴＡＢを取り除いた。透析後の水分散液を１４０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心分離してNRsに結合していない余剰のｍ-ＰＥＧ-ＳＨを除去し、遠沈管の底に沈降させたNRsを水で再分散後、１０mM（金原子）PEG-NRs水分散液を調整した。
（ロ）このPEG-NRs水分散液に、エタノール、１％ＴＥＯＳ、５％アンモニアを添加し、２４時間攪拌してシリカ層を形成し、ｍ-ＰＥＧ-ＳＨの吸着したNRsがシリカで埋包された微粒子（Si-NRs）のエタノール分散液を得た。調製したSi-NRsエタノール分散液を５０００(×g)の相対遠心加速度で10分間遠心分離してSi-NRsを遠沈管の底に沈降させ、９０％エタノールで再分散させてSi-NRsエタノール分散液を調製した。
（ハ）このSi-NRsエタノール分散液に、ＰＥＩを溶解した９０％エタノールを添加し、モル比でNRs（金原子）：ＰＥＩ＝１０：１になるように調整して２４時間攪拌し、Si-NRs表面にＰＥＩが静電相互作用により吸着した粒子（PEI-NRs）エタノール分散液を得た。
調製したPEI-NRsエタノール分散液を５０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心し、PEI-NRsを遠沈管の底に沈降させた後、上澄みを除去し、０.２Mリン酸バッファー（pH8.0）に再分散した。
（ニ）再分散したPEI-NRsエタノール分散液にクロスリンカー（Linker、succinimidyl-[(N-maleimidopropionamido)-dodecaethyleneglycol]ester：NHS-PEO12-mal）を加え、モル比でNRs（金原子）：クロスリンカー＝１：６になるように調整して９０分攪拌し、その後、５０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心分離して上澄みを除去し、ＤＭＦで再分散させて、マレイミド部位を有するクロスリンカーが修飾されたNRs（Ma-NRs）のＤＭＦ分散液を得た。
【００６７】
〔保持物質ローダミンＢの導入〕
上記Ma-NRsのＤＭＦ分散液と、図２の縮合体(Fu-RoB)のＤＭＦ分散液を混合し、NRｓ（金原子）：Fu-RoB＝１：９になるように調整し、６０℃で24時間攪拌し、Diels-Alder反応によって、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成し、金ナノロッドにローダミンＢを結合させた（RoB-NRs、図１）。調製したRoB-NRsのＤＭＦ分散液を５０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心分離し、RoB-NRsを遠沈管底に沈降させた後、上澄みを除去し、未反応のローダミンBを取り除くために、ＭＷＣＯ＝１００００の透析膜で透析した。透析後、５０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心し、上澄みを除去した後、水で再分散させて金濃度０.５mMに調整し、ローダミンＢが7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを介して金ナノロッドに結合した微粒子（DA-NRs）の水分散液を得た。このDA-NRの分光特性を図３に示す。
【００６８】
〔保持物質(ローダミンＢ)の放出〕
上記Da-NRの水分散液１００μlをガラス製チューブに入れ、近赤外線レーザー（CW、半導体レーザー、８０７nm）を５００mWで１分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間照射した。この結果、逆Diels-Alder反応によって、色素ローダミンＢが金ナノロッドより放出され、クエンチされていたローダミンＢの蛍光スペクトルが５８０nm付近に観察された。この蛍光スペクトルを図４に示す。
【００６９】
〔参考例１〕
上記DA-NRの水分散液１００μlをガラス製チューブに入れ、９０℃で３時間加熱した。この結果、逆Diels-Alder反応によって、ローダミンＢが金ナノロッドより放出され、クエンチされていたローダミンＢの蛍光スペクトルが５８０nm付近に観察された。この蛍光スペクトルを図４に示す。
【００７０】
〔実施例２〕
以下の手順で、保持物質を結合した金微粒子を得た。製造工程の概念図を図５に示す。
【００７１】
〔ＰＥＧ修飾マレイミドとフランの反応〕
保持物質としてα−［3-（3-マレイミド-1-オキソプロピル）アミノ］プロピル-ω-メトキシポリエチレングリコールを準備した。Diels-Alder反応に関わるジエンとしてフランを準備した。１０ml遠沈管に０．０１mmolのα−［3-（3マレイミド-1-オキソプロピル）アミノ］プロピル-ω-メトキシポリエチレングリコール（重量平均分子量５０００）、０.２mmolのフルフリルジスルフィドを入れ、５mlのDMFに溶解した。この溶液を６０℃、７２時間攪拌反応させた。反応後、室温に戻し、１mmolのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、２４時間攪拌反応させ、スルフィド部位を開裂してチオール基とした。反応後、ＤＭＦをローターリーエバポレーターで留去し、ＭＷＣＯ＝３５００の透析膜にて、未反応のフランと残留ＤＴＴを取り除き、凍結乾燥にて目的物（ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨ）を得た（図６）。
【００７２】
〔金微粒子表面へのリンカーと保持物質の導入〕
ＣＴＡＢを除去していないNRs水分散液と、上記ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨ（重量平均分子量５０００）をモル比で、NRｓ(金原子)：ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨ＝１：０.２になるように添加し、２４時間攪拌して、ＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨが片末端のチオール基でNRs表面に結合した微粒子（PEG-DA-NRs）水分散液を得た（図５）。この水分散液を、ＭＷＣＯ＝１００００の透析膜にて透析して、過剰のＣＴＡＢを取り除いた。透析後の水分散液を１４０００(×g)の相対遠心加速度で１０分間遠心分離してNRsに結合していない余剰のＰＥＧ-ＤＡ-ＳＨを除去し、遠沈管の底に沈降させたNRsを水で再分散させ、金濃度０.５mMに調整し、ＰＥＧが7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを介してNRsに結合した金微粒子（PEG-DA-NRs）の水分散液を得た。このPEG-DA-NRsの分光特性を図７に示す。
【００７３】
〔保持物質(ＰＥＧ)の放出〕
上記PEG-DA-NRsの水分散液１００μlをガラス製チューブに入れ、近赤外線レーザー（CW、半導体レーザー、８０７nm）を５００mWで１０分間照射した。この結果、逆Diels-Alder反応によってＰＥＧがNRsより放出された。このＰＥＧについてバリウムーヨウ素法によって濁度として５３５nmの吸収波長を分光時計にて測定した。この結果を表１に示す。
【００７４】
〔参考例２〕
上記PEG-DA-NRsの水分散液１００μlをガラス製チューブに入れ、９０℃で２時間加熱した。この結果、逆Diels-Alder反応によってＰＥＧがNRsより放出された。このＰＥＧについてバリウムーヨウ素法によって濁度として５３５nmの吸収波長を分光時計にて測定した。この結果を表１に示す。
【００７５】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
保持物質、リンカー、ロッド状の金微粒子によって構成され、保持物質がリンカーを介して金微粒子に結合しており、保護物質とリンカーの結合部位がDiels-Alder反応生成物質によって形成されており、該反応生成物質は近赤外光の熱変換の発熱によって切断される性質を有し、該結合部位の切断によって保持物質と金微粒子が脱離することを特徴とするロッド状金微粒子構造体。
【請求項２】
ロッド状の金微粒子表面に吸着している次式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩がリンカーによって置換され、該リンカーを介して保持物質が金微粒子表面に結合されている請求項１に記載するロッド状金微粒子構造体。
ＣＨ3(ＣＨ2)nＮ+(ＣＨ3)3Ｂｒ- （ｎは１〜１５の整数） …[Ｉ]
【請求項３】
保護物質とリンカーの結合部位がDiels-Alder反応によって生じる7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideによって形成されている請求項１または請求項２に記載するロッド状金微粒子構造体。
【請求項４】
Diels-Alder反応に関わるジエンとジエノフィルがそれぞれフランとマレイミドであり、保持物質がフランに修飾されており、リンカーがマレイミドとチオール基を含み、保持物質とリンカーの結合部位がフランとマレイミドのDiels-Alder反応によって形成されており、一方、リンカーと金微粒子がチオール基によって結合している請求項１〜請求項３の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
【請求項５】
リンカーが、片末端がチオール基であるポリエチレングリコールを含有するシリカ層／ポリエチレンイミン層／マレイミドによって構成されており、金微粒子と該ポリエチレングリコールはチオール基で結合しており、該ポリエチレングリコールを含有するシリカ層とポリエチレンイミン層は静電相互作用で吸着しており、該ポリエチレンイミン層とマレイミドはアミド結合しており、該マレイミドは保持物質に修飾しているフランと結合している請求項４に記載するロッド状金微粒子構造体。
【請求項６】
保持物質が金微粒子の吸収波長以外の波長域に発光を生じる色素である請求項１〜請求項５の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
【請求項７】
色素がローダミンBである請求項６に記載するロッド状金微粒子構造体。
【請求項８】
保持物質が薬剤である請求項１〜請求項５の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
【請求項９】
Diels-Alder反応に関わるジエンとジエノフィルがそれぞれフランとマレイミドであり、保持物質がマレイミドに修飾されており、リンカーがチオール基を含むフランであり、保持物質とリンカーの結合部位がフランとマレイミドのDiels-Alder反応によって形成されており、一方、リンカーと金微粒子がフランのチオール基によって結合している請求項１〜請求項３の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
【請求項１０】
保持物質が重合平均分子量１０００以上のポリエチレングリコールである請求項１〜請求項３、または請求項９の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
【請求項１１】
ロッド状金微粒子の長軸長さが５〜１００nm、短軸長さが３〜３０nmであり、アスペクト比２〜２０、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００nmの範囲である請求項１〜請求項１０の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
【請求項１２】
上記式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩が吸着したロッド状の金微粒子に、重量平均分子量１０００以上のα−メトキシ−ω−メルカプトポリエチレングリコールを表面修飾し、さらにオルト珪酸テトラエチルを反応させて該金微粒子表面にシリカ層を形成し、次いで該シリカ層にポリエチレンイミン層を積層し、該ポリエチレンイミンにマレイミドをアミド結合させることによって、金微粒子表面がシリカ層／ポリエチレンイミン層／マレイミドからなるリンカーによって被覆された金微粒子(Ｂ)を調製し、フランに色素を結合した保持物質(Ａ)と上記金微粒子(Ｂ)とを混合し、上記フランと上記マレイミドとのDiels-Alder反応によって、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成することにより、色素を金微粒子表面に結合させるロッド状金微粒子構造体の製造方法。
【請求項１３】
上記請求項１２の製造方法において、色素に代えて薬剤を用いることによって、薬剤を金微粒子に結合させるロッド状金微粒子構造体の製造方法。
【請求項１４】
リンカーであるチオール基を有するフランと、マレイミドに修飾された重量平均分子量１０００以上のα−［3-（3-マレイミド-1-オキソプロピル）アミノ］プロピル-ω-メトキシポリエチレングリコールとをDiels-Alder反応させて、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成することによって、リンカーが結合した保持物質(Ａ)を調製し、次いで、該保持物質(Ａ)と上記式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩が吸着したロッド状の金微粒子(Ｂ)とを混合してリンカーのチオール基によって保持物質(Ａ)を金属微粒子表面に結合させることによって、ポリエチレングリコールを金微粒子表面に結合させるロッド状金微粒子構造体の製造方法。
【請求項１５】
請求項６または請求項７に記載するロッド状金微粒子構造体を用い、近傍の金微粒子によって発光がクエンチされている色素を金微粒子から脱離させることによって蛍光を発生させる蛍光発光方法。
【請求項１６】
請求項１０に記載するロッド状金微粒子構造体を用い、ポリエチレングリコールを金微粒子から脱離させることによって、金微粒子の分散安定性を失わせて金微粒子を凝集させる金微粒子の集積方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載する金微粒子の集積によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルの変化で金微粒子の存在する部位を検出する方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載する蛍光発光検出、または請求項１７に記載する吸収スペクトル検出を情報とするバイオイメージング。
【請求項１９】
請求項８に記載するロッド状金微粒子構造体を用い、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、薬剤を金微粒子から脱離させることによって、特定の部位に薬剤を放出するドラッグデリバリーシステム（DDS）。
【請求項１】
保持物質、リンカー、ロッド状の金微粒子によって構成され、保持物質がリンカーを介して金微粒子に結合しており、保護物質とリンカーの結合部位がDiels-Alder反応生成物質によって形成されており、該反応生成物質は近赤外光の熱変換の発熱によって切断される性質を有し、該結合部位の切断によって保持物質と金微粒子が脱離することを特徴とするロッド状金微粒子構造体。
【請求項２】
ロッド状の金微粒子表面に吸着している次式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩がリンカーによって置換され、該リンカーを介して保持物質が金微粒子表面に結合されている請求項１に記載するロッド状金微粒子構造体。
ＣＨ3(ＣＨ2)nＮ+(ＣＨ3)3Ｂｒ- （ｎは１〜１５の整数） …[Ｉ]
【請求項３】
保護物質とリンカーの結合部位がDiels-Alder反応によって生じる7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideによって形成されている請求項１または請求項２に記載するロッド状金微粒子構造体。
【請求項４】
Diels-Alder反応に関わるジエンとジエノフィルがそれぞれフランとマレイミドであり、保持物質がフランに修飾されており、リンカーがマレイミドとチオール基を含み、保持物質とリンカーの結合部位がフランとマレイミドのDiels-Alder反応によって形成されており、一方、リンカーと金微粒子がチオール基によって結合している請求項１〜請求項３の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
【請求項５】
リンカーが、片末端がチオール基であるポリエチレングリコールを含有するシリカ層／ポリエチレンイミン層／マレイミドによって構成されており、金微粒子と該ポリエチレングリコールはチオール基で結合しており、該ポリエチレングリコールを含有するシリカ層とポリエチレンイミン層は静電相互作用で吸着しており、該ポリエチレンイミン層とマレイミドはアミド結合しており、該マレイミドは保持物質に修飾しているフランと結合している請求項４に記載するロッド状金微粒子構造体。
【請求項６】
保持物質が金微粒子の吸収波長以外の波長域に発光を生じる色素である請求項１〜請求項５の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
【請求項７】
色素がローダミンBである請求項６に記載するロッド状金微粒子構造体。
【請求項８】
保持物質が薬剤である請求項１〜請求項５の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
【請求項９】
Diels-Alder反応に関わるジエンとジエノフィルがそれぞれフランとマレイミドであり、保持物質がマレイミドに修飾されており、リンカーがチオール基を含むフランであり、保持物質とリンカーの結合部位がフランとマレイミドのDiels-Alder反応によって形成されており、一方、リンカーと金微粒子がフランのチオール基によって結合している請求項１〜請求項３の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
【請求項１０】
保持物質が重合平均分子量１０００以上のポリエチレングリコールである請求項１〜請求項３、または請求項９の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
【請求項１１】
ロッド状金微粒子の長軸長さが５〜１００nm、短軸長さが３〜３０nmであり、アスペクト比２〜２０、局在表面プラズモン共鳴の最大吸収波長が７００〜２０００nmの範囲である請求項１〜請求項１０の何れかに記載するロッド状金微粒子構造体。
【請求項１２】
上記式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩が吸着したロッド状の金微粒子に、重量平均分子量１０００以上のα−メトキシ−ω−メルカプトポリエチレングリコールを表面修飾し、さらにオルト珪酸テトラエチルを反応させて該金微粒子表面にシリカ層を形成し、次いで該シリカ層にポリエチレンイミン層を積層し、該ポリエチレンイミンにマレイミドをアミド結合させることによって、金微粒子表面がシリカ層／ポリエチレンイミン層／マレイミドからなるリンカーによって被覆された金微粒子(Ｂ)を調製し、フランに色素を結合した保持物質(Ａ)と上記金微粒子(Ｂ)とを混合し、上記フランと上記マレイミドとのDiels-Alder反応によって、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成することにより、色素を金微粒子表面に結合させるロッド状金微粒子構造体の製造方法。
【請求項１３】
上記請求項１２の製造方法において、色素に代えて薬剤を用いることによって、薬剤を金微粒子に結合させるロッド状金微粒子構造体の製造方法。
【請求項１４】
リンカーであるチオール基を有するフランと、マレイミドに修飾された重量平均分子量１０００以上のα−［3-（3-マレイミド-1-オキソプロピル）アミノ］プロピル-ω-メトキシポリエチレングリコールとをDiels-Alder反応させて、7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic imideを形成することによって、リンカーが結合した保持物質(Ａ)を調製し、次いで、該保持物質(Ａ)と上記式[Ｉ]で示される４級アンモニウム塩が吸着したロッド状の金微粒子(Ｂ)とを混合してリンカーのチオール基によって保持物質(Ａ)を金属微粒子表面に結合させることによって、ポリエチレングリコールを金微粒子表面に結合させるロッド状金微粒子構造体の製造方法。
【請求項１５】
請求項６または請求項７に記載するロッド状金微粒子構造体を用い、近傍の金微粒子によって発光がクエンチされている色素を金微粒子から脱離させることによって蛍光を発生させる蛍光発光方法。
【請求項１６】
請求項１０に記載するロッド状金微粒子構造体を用い、ポリエチレングリコールを金微粒子から脱離させることによって、金微粒子の分散安定性を失わせて金微粒子を凝集させる金微粒子の集積方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載する金微粒子の集積によって生じる局在表面プラズモン共鳴の吸収スペクトルの変化で金微粒子の存在する部位を検出する方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載する蛍光発光検出、または請求項１７に記載する吸収スペクトル検出を情報とするバイオイメージング。
【請求項１９】
請求項８に記載するロッド状金微粒子構造体を用い、７００〜２０００ｎｍの近赤外線を照射し、薬剤を金微粒子から脱離させることによって、特定の部位に薬剤を放出するドラッグデリバリーシステム（DDS）。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【公開番号】特開２０１１−４６６７６（Ｐ２０１１−４６６７６Ａ）
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９８９７４（Ｐ２００９−１９８９７４）
【出願日】平成２１年８月２８日（２００９．８．２８）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（０００００３３２２）大日本塗料株式会社 (275)
【出願人】（０００００６２６４）三菱マテリアル株式会社 (4,417)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２８日（２００９．８．２８）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（０００００３３２２）大日本塗料株式会社 (275)
【出願人】（０００００６２６４）三菱マテリアル株式会社 (4,417)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]