中皮腫診断剤および中皮腫診断キット
【課題】中皮腫とＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎとの関係を明らかにし、中皮腫の診断を行うことのできる診断剤等を提供すること。
【解決手段】配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する抗体を含有することを特徴とする中皮腫診断剤。
【解決手段】配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する抗体を含有することを特徴とする中皮腫診断剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中皮腫診断剤および中皮腫診断キットに関し、更に詳細には、中皮腫の早期診断に用いることができる診断剤およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、アスベストに暴露された経験をもつヒトが高頻度で中皮腫を発病することは社会問題にまで発展している。中皮腫は悪性のものと良性のものが存在するが、悪性中皮腫患者の多くは、アスベストへ暴露歴を有し、アスベスト曝露から３０−３５年という長期潜伏期間を経て悪性中皮腫を発症している。このため、今後中皮腫患者が増加する可能性は否定できない。
【０００３】
また、中皮腫は早期発見の難しい疾患であり、現在中皮腫はＭＲＩやＣＴ等を用いた方法により診断がされているが、これらの方法では早期診断が難しく、中皮腫と診断された時点で既に病気が進行していることが多いのが問題となっている。それだけに本疾患の早期診断が切に望まれているわけであるが、しかしながら現在では未だ有効な早期診断マーカーが見つけられていない。
【０００４】
現在まで中皮腫に関連するマーカーとしては、Ｅｒｃ、ＭＰＦおよびＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎと呼ばれるタンパク質が発見されている。その経緯は次のようなものである。
まず、１９９４年、ヤマグチ（Yamaguchi）らにより、ヒト膵臓癌細胞ＨＰＣ−Ｙ５上清から、ＭＰＦ (Megakaryocyte potentiating factor)と呼ばれるタンパク質が精製されたこと（文献１）、さらに１９９５年、コジマ（Kojima）らにより、ヒト膵臓癌細胞ＨＰＣ−Ｙ５のｃＤＮＡからＭＰＦがクローニングされたことが報告された（文献２）。
【０００５】
その後、チャン（Chang）らは、中皮細胞、卵巣癌および中皮腫の表面に発現する４０ｋＤａのエピトープに反応するモノクローナル抗体Ｋ１を作製し、該抗体を用いて、その抗原タンパク質をコードする遺伝子を探索したところ、６９ｋＤａのタンパク質をコードする１８８４ｂｐのオープンリーディングフレーム（open reading frame）を持つ遺伝子を単離した。そしてさらに、チャン（Chang）らは、当該６９ｋＤａタンパク質が前記４０ｋＤａタンパク質の前駆体であり、該６９ｋＤａタンパク質がホスファチジルイノシトール特異性ホスホリパーゼ（ＰＩ−ＰＬ）の作用により切断され、細胞表面に４０ＫＤａタンパク質が発現することを明らかにした。そしてチャン（Chang）らは、その６９ｋＤａタンパク質をＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎと名づけたが（文献３）、後に上述のＭＰＦとＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎは同一のタンパク質であることが明らかとなった。
【０００６】
一方、ショラー（Scholler）らは卵巣癌細胞を免疫して作製したモノクローナル抗体ＯＶ５６９が認識するタンパク質を検索した結果、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの膜結合領域と同じ配列を有する、分子量４２−４５ｋＤａのタンパク質であることを発見し、可溶性メソセリン（Soluble member of mesothelin）と呼んだ。このタンパク質は途中にフレームシフト変異を起しており、その結果、Ｃ末領域のＧＰＩアンカー部分が異なる配列になってしまうために可溶性になることが判明した。さらに、ＯＶ５６９と同じタンパク質を認識する別のモノクローナル抗体４Ｈ３を用いてサンドイッチＥＩＡ（Sandwich EIA）の測定系を構築し、患者血清を測定した結果、健常人に比べて、卵巣癌患者では高い値を示した（文献４）。さらにロビンソン（Robinson）らはこの測定系を用いて中皮腫患者の測定を行い、健常人に比べて高い値を示すことを報告している（文献５）。
【０００７】
本願発明者である樋野らは、長年にわたる疾患モデル動物の研究を通じて、腎癌発症モデルＥｋｅｒラットの原因遺伝子を探索してきた。その結果、正常腎組織に比べてＥｋｅｒラット腎癌由来細胞株において高発現を示す遺伝子を発見し、その中の１つをＥｒｃと命名した。さらに、ラットＥｒｃのヒトホモログを探索した結果、ヒトにおいてはＭＰＦ がラットＥｒｃに対して５６.１％の相同性を有することを明らかにした（文献６、７）。
【０００８】
以上の経緯等から、（１）ヒトＥｒｃ、ＭＰＦおよびＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎ（以下、これらを「Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ」という）は、全長６２２アミノ酸からなる糖タンパク質であり、２９０−２９５アミノ酸にＲＰＲＦＲＲ配列を有することから、フリン（Ｆｕｒｉｎ）様プロテアーゼでプロセッシングを受けて３１ｋＤａと４０ｋＤａフラグメントに開裂する、（２）４０ｋＤａフラグメントのＣ末側領域はそのＣ末端にＧＰＩアンカー領域を含むことから細胞膜に結合した形で残り、Ｎ末側の３１ｋＤａフラグメントは可溶性タンパク質として分泌される（以下、これを「３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ」という）、（３）また細胞膜上に結合した４０ｋＤａフラグメントのＣ末側もホスファチジルイノシトール−スペシフィックホスホリパーゼＣ（phosphatidiylinositol-specific phospholipase C：PI-PLC）処理によって細胞から放出されること、等が考えられている。
【０００９】
これらの異なるアプローチによって同定されたＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎは、正常の中皮細胞および中皮腫に強く発現しているのみならず、中皮腫患者血液中にも存在することが報告されている。
【００１０】
しかしながら、これらの知見は中皮腫においてどのようなタイプのＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎが分泌されているのかは明らかではなく、早期診断マーカーを示唆するものとは言い切れなかった。
【非特許文献１】Yamaguchi N, Hattori K, Oh-eda M, Kojima T, Imai N, Ochi N. A novelcytokine exhibiting megakaryocyte potentiating activity from a human pancreatictumor cell line HPC-Y5., J Biol Chem. 1994 Jan 14;269(2):805-8.PMID: 8288629
【非特許文献２】Kojima, T.; Oh-eda, M.; Hattori, K.; Taniguchi, Y.; Tamura, M.;Ochi, N.; Yamaguchi, N. : Molecular cloning and expression of megakaryocytepotentiating factor cDNA., J. Biol. Chem. 270: 21984-21990, 1995. PubMed ID :7665620
【非特許文献３】Chang, K.; Pastan, I. : Molecular cloning of mesothelin, adifferentiation antigen present on mesothelium, mesotheliomas, and ovariancancers., Proc. Nat. Acad. Sci. 93: 136-140, 1996. PubMed ID : 8552591
【非特許文献４】Scholler, N.; Fu, N.; Yang, Y.; Ye, Z.; Goodman, G. E.; Hellstrom,K. E.; Hellstrom, I. : Soluble member(s) of the mesothelin/megakaryocyte potentiatingfactor family are detectable in sera from patients with ovarian carcinoma.,Proc. Nat. Acad. Sci. 96: 11531-11536, 1999. PubMed ID : 10500211
【非特許文献５】Robinson BW, Creaney J, Lake R, Nowak A, Musk AW, de Klerk N,Winzell P, Hellstrom KE, Hellstrom I.Soluble mesothelin-related protein-A bloodtest for mesothelioma.Lung Cancer., 2005 Jul;49 Suppl 1:S109-11. PMID: 15950789
【非特許文献６】Hino O, Kobayashi E, Nishizawa M, Kubo Y, Kobayashi T, Hirayama Y,Takai S, Kikuchi Y, Tsuchiya H, Orimoto K, et al.Renal carcinogenesis in theEker rat., J Cancer Res Clin Oncol. 1995;121(9-10):602-5. PMID: 7559744
【非特許文献７】Yamashita Y, Yokoyama M, Kobayashi E, Takai S, Hino OMapping and determination of the cDNA sequence of theErc gene preferentially expressed in renal cell carcinoma in the Tsc2 genemutant (Eker) rat model., Biochem Biophys Res Commun. 2000 Aug18;275(1):134-40. PMID: 10944454
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明の目的は、中皮腫とＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎとの関係を明らかにし、中皮腫の診断を行うことのできる診断剤や診断キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎに注目し、鋭意研究した。その結果、培養細胞を用いた実験系では、通常の培養状態においても３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎは培養上清中に検出することが可能であり、この切断は体内においても恒常的に起こっていると解された。実際、後述するように、この３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを検出することのできる測定系を構築することによって、健常人血液中においてもこのものが一定量存在することを明らかにした。更に、本願発明者らはＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの分解が起こるときは、まずＮ末側で切断されることにより３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの血中への放出が起こり、その後何らかの刺激によって４０ｋＤａのＣ末側Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎが分泌されるという順序で起こると判断した。
【００１３】
従って、健常状態で一定量存在する３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを測定することで、より早期にＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの異常を検出すること、すなわち、中皮腫の進行状況をより早期に診断可能になることを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する抗体を含有することを特徴とする中皮腫診断剤である。
【００１５】
また、本発明は配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する第１の抗体を含有する第１の試薬と、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する抗体であって、第１の抗体と異なるエピトープを認識する第２の抗体を含有する第２の試薬とを組み合わせてなることを特徴とする中皮腫診断キットである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の中皮腫診断剤および中皮腫診断キットは、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを測定することができるので、中皮腫の進行状況をより早期に診断することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の中皮腫診断剤（以下、「本発明診断剤」という）に含有される３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する抗体（以下、「抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体」という）は、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを特異的に認識する抗体であれば特に限定されず、その起源について特に制約はなく、ヒト由来のものでなくても良い。また、抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体としてはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもよい。
【００１８】
抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体は、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎあるいはそのフラグメントペプチドを抗原として使用し、公知の方法、例えば「続生化学実験講座、免疫生化学研究法」（日本生化学会編）等に記載の方法に従って調製することができる。
【００１９】
この抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体の製造において、抗原として使用される３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎあるいはそのフラグメントペプチドとしては、ヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのアミノ酸配列（Accession No. AAV87530）の１〜２９５番目（配列番号１）、好ましくは３５〜２９５番目の全部あるいは一部と一致するポリペプチドを合成機で合成したもの、あるいは前記アミノ酸配列の全部あるいは一部をコードするｃＤＮＡ（Accession No. AY743922）を常法によりベクターに組み込み、このベクターを用いて大腸菌等の宿主微生物もしくは培養細胞を形質転換し、形質転換した大腸菌等の宿主微生物・培養細胞を培養して産生させて得られるリコンビナントタンパク質やポリペプチドを、アフィニティーカラムやニッケルカラム等で精製したもの等が挙げられる。
【００２０】
また、前記アミノ酸配列の全部あるいは一部をコードするｃＤＮＡに一致するポリヌクレオチドはラットＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ｃＤＮＡ等のほ乳類由来のＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ｃＤＮＡをプローブとしてヒト腫瘍細胞株等のｃＤＮＡライブラリーからクローニングすることによっても得られる。
【００２１】
具体的に、抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体を、調製する手順を示せば次の通りである。すなわち、ポリクローナル抗体として抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体を調製するには、まず、ヒト３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのｃＤＮＡ配列（Accession No. AY743922）をコードするポリヌクレオチドをＰＣＲ法により作製する。次いで、これをｐＧＥＸ等のベクターに組み込み、このベクターを大腸菌等の宿主微生物に導入し、ＬＢ培地等で培養してポリペプチドのリコンビナントタンパク質を産生させる。次いで、得られたリコンビナントタンパク質を抗原とし、これをリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ）に溶解し、更にこれらとフロイント完全アジュバントまたは不完全アジュバントあるいはミョウバン等の補助剤と結合した後、これを免疫原として哺乳動物などを免疫する。
【００２２】
免疫される動物としては当該分野で常用されたもの、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ等のいずれをも使用することができる。また、免疫の際の免疫原の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は１回または適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の間隔で複数回行うことができる。
【００２３】
最後に、常法に従い、免疫した動物から血液を採取し、この血液から血清を分離し、この血清中から３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識するポリクローナル抗体を得ることができる。
【００２４】
また、モノクローナル抗体として３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する抗体を調製するには、モノクローナル抗体調製の常法に従い、上記リコンビナントタンパク質で動物を免疫して得た免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取することによって得ることができる。
【００２５】
かくして得られた抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体は、必要により標識ないし固相化して、本発明の本発明診断剤に適した形にすることができる。このうち標識は、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下、「ＨＲＰ」という）、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、３２Ｐ、１２５Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などの標識物質を結合することにより行われる。また、固相化は、適切な固相に抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体を結合させることにより行われる。固相としては、免疫化学的測定法において慣用される固相のいずれをも使用することができ、例えば、ポリスチレン製の９６穴マイクロタイタープレート、アミノ基結合型のマイクロタイタープレート等のプレートや、各種のピーズ類が挙げられる。抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体を固相化させるには、例えば、抗体を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーションすればよい。
【００２６】
また、本発明の中皮腫診断キット（以下、「本発明キット」という）は、必要により標識ないし固相化した抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体を使用して常法に従って作製すればよい。具体的に、抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体を２種使用して本発明キットを作製する場合には、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃを認識する第１の抗体を含有する第１の試薬（例えば、固相化抗体）と、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃを認識する抗体であって、第１の抗体と異なるエピトープを認識する第２の抗体を含有する第２の試薬（例えば、標識抗体）を組み合わせて使用すればよい。
【００２７】
上記のように作成された本発明診断剤および本発明キットは、これに含まれる抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体により、中皮腫患者血清中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの存在やその量を検出することができるものである。
【００２８】
本発明診断剤および本発明キットを用いた具体的な３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの存在や量の測定方法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（E. Engvall et al., (1980): Methods in Enzymol., 70, 419-439）、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）、イムノクロマト法等の、一般の免疫化学的測定法において使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプランニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）が挙げられる。
【００２９】
これらの測定方法は種々の観点から適宜選択することができるが、感度、簡便性等の点
からはＥＬＩＳＡ法が好ましい。より具体的な、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの測定について、ＥＬＩＳＡ法の一つであるサンドイッチ法を例にとってその手順を説明すれば次の通りである。
【００３０】
まず、工程（Ａ）として、本発明の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する抗体を担体に固相化し、次いで、工程（Ｂ）として、抗体が固相化されていない担体表面を抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体と無関係な、例えばタンパク質により、ブロッキングする。更に、工程（Ｃ）として、これに各種濃度の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを含む検体を加え、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎと抗体との複合体を生成させた後、工程（Ｄ）として、標識した３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体を加え、これに３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎと抗体との複合体を結合させ、最後に工程（Ｅ）として、標識量を測定することにより、予め作成した検量線から検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの量を決定することができる。なお、工程（Ａ）と工程（Ｄ）に用いる抗体は逆の場合でも測定が可能である。
【００３１】
具体的に工程（Ａ）において、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する抗体を固相化するために用いられる担体としては、特別な制限はなく、免疫化学的測定法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン製の９６穴マイクロタイタープレートあるいは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートが挙げられる。また、上記抗体を固相化させるには、例えば、上記抗体を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば１０ｍＭのＰＢＳを挙げることができる。緩衝液中の上記抗体の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０.０１〜１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０.１〜２０μｇ／ｍｌである。また、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で２０〜１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩のインキュベーションが適している。
【００３２】
また、工程（Ｂ）のブロッキングは、工程（Ａ）で抗体を固相化した担体において、後に添加する検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎが抗原抗体反応とは無関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤としては、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液や、ブロックエース（Ｂｌｏｃｋ−Ａｃｅ：大日本製薬製（コードＮｏ.ＵＫ−２５Ｂ））等の市販のブロッキング剤を使用することができる。具体的なブロッキングは、限定されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロックエースを適量加え、約４℃で、一晩のインキュベーションをした後、緩衝液で洗浄することにより行われる。
【００３３】
更に、工程（Ｃ）において、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを含む検体を固相化した抗体と接触させ、この固相化した抗体で３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを捕捉し、固相化した抗体と３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎとの複合体を生成させる。この複合体を生成させるための条件は限定されるわけではないが、４℃〜３７℃程度で約１時間〜１晩の反応を行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７.２）および０.０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０の組成のものが好ましい。
【００３４】
また更に、工程（Ｄ）において、固相化した抗体に捕捉された３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの別のエピトープを認識する標識抗体を加え、固相化した抗体−３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−標識抗体の複合体を形成させる。この反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、前記したものが使用される。この工程（Ｄ）において使用される標識抗体の量は、固相化した抗体に対して約５,０００〜１０,０００倍、好ましくは最終吸光度が１.５〜２.０となるように希釈された量である。希釈には緩衝液を用いることができ、反応条件は特に限定されるわけではないが、４℃〜３７℃程度で約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄することが好ましい。以上の反応により、固相化した抗体−３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−標識抗体の複合体を結合することができる。
【００３５】
最後に工程（Ｅ）において、固相化した抗体−３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−標識抗体の複合体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線から３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの量を算出することができる。
【００３６】
上記標識抗体の標識物として、酵素であるペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と３,３',５,５'−テトラメチルベンジン（以下「ＴＭＢ」という）を含む発色基質溶液を使用することができる。発色反応は、限定されるわけではないが、発色基質溶液を加え約２５℃で約３０分間反応させた後、１〜２Ｎの硫酸を加えて酵素反応を停止させことにより行うことができる。ＴＭＢを使用する場合、発色は４５０ｎｍの吸光度により測定する。一方、標識物として、酵素であるアルカリホスファターゼを使用する場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。なお、既知の濃度の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを添加した反応液の吸光度により予め作成しておいた検量線を用いて、検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの濃度を算出できる。
【００３７】
上記で説明した３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの測定方法を実施するには、本発明の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体を含む第１の試薬と、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する他の抗体を含む第２の試薬とを含有する３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの測定キット（以下、「本発明キット」という）を利用することが好ましい。
【００３８】
なお、本発明キットは常法により作製することができる。具体的には、本発明の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体と、他に、希釈用緩衝液、標準物質、基質用緩衝液、停止液、洗浄液等を組み合わせればよい。
【００３９】
一方、具体的に本発明キットによる中皮腫の診断に用いられる検体は、特に制限はなく、例えば全血、血清、血漿、尿、リンパ液等の体液を挙げることができる。この検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ量を、本発明診断剤を用いたサンドイッチ法、ＲＩＡ法、ネフェロメトリー法、免疫比濁法等の免疫測定法における公知の手段により測定し、その量が健常者の平均値より有意に高いと判断される場合には中皮腫と診断することができる。検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ量を健常者の平均値より有意に高いと判断する指標の例としては、健常人血清群で得られた３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ量の平均値＋３ｘ標準偏差の値、好ましくは健常人血清群で得られた３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ量の平均値＋５ｘ標準偏差の値を統計学的なカットオフ値として用いることが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例をあげて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約を受けるものではない。
【００４１】
実 施 例 １
３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ断片に対するモノクロー
ナル抗体の作製：
（１）免疫用抗原の作製
配列番号２で表される全長のヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ｃＤＮＡ（Accession No. AY743922）を鋳型として、配列番号１で表される３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのアミノ酸配列の３５番から２９５番目までのＮ末側領域を、以下に示したプライマーＮｏ.５’−３およびＮｏ.３’−３を用いた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により増幅させた。次に上記で得られたオリゴヌクレオチドのＮ末側領域にＧＳＴ（Glutathione S-transferase）タグをコードする配列を、またＣ末側領域にヒスチジン（Histidine）タグをコードする配列を付加して、これらＧＳＴ−３１ｋＤａ分泌型ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−Ｈｉｓ領域を、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１（Amershambiosciences社製）に挿入し、発現ベクターとし、これを大腸菌に組み込んで融合タンパク質として発現させた。
プライマーＮｏ.５’−３（配列番号３）：
５’−ＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＣＣＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡ−３’
プライマーＮｏ.３’−３（配列番号４）：
５’−ＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＣＧＣＣＧＧＡＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＡ−３’
【００４２】
この大腸菌を５ｍＬのアンピシリンを加えたＬＢ培地で３７℃一晩振盪培養した。これをさらに１,０００ｍＬのＬＢ培地に加えて３７℃４時間振盪培養し、５００Ｍのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（IPTG）を１ｍＬ加え３時間振盪培養した。このようにして得た培養液を４℃で６,０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、沈殿をリン酸緩衝塩化ナトリウム液（PBS）で２回洗浄した。その後、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えた２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.４）２０ｍｌを加え、−２０℃で一晩放置した。そして、この液に対し３０秒間の超音波処理を４回行って菌体を破壊し、目的のタンパク質を抽出した後、４℃で１０,０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、上清を得た。この上清からグルタチオン−セファロースビーズ（Glutathion-sepharose beads：Amershambiosciences社製）を用いてＧＳＴ−３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−Ｈｉｓタンパク質を精製した後、プレシジョンプロテアーゼ（PreScission Protease：Amershambiosciences社製）処理によりＧＳＴ部分を切断、除去した３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−Ｈｉｓを抗原とした。
【００４３】
（２）モノクローナル抗体の作製
免疫用抗原として、上記（１）において得られたタンパク質を用い、１週間、または２週間おきに５０μｌ（５０μｇ）を投与し、マウスを免疫した。抗原は初回免疫のみにフロイント完全アジュバントと混和し、二回目からはフロイント不完全アジュバントと混和した。免疫化されたマウスの脾単球細胞と融合パートナー、Ｘ６３−Ａｇ８−６５３をポリエチレングリコール仲介細胞融合に付し、文献（J. Immunol. 146:3721-3728）に述べた方法によりハイブリドーマを選択した。選択は、固定化された３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎに反応する細胞を選択することにより行った。
【００４４】
上記のようにして選択した細胞を無血清培地のＧＩＴ培地（和光純薬）で細胞の８０％が死滅するまで抗体を産生させた。次いでこの培地から遠心（１,０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）により細胞を取り除いた後、硫酸アンモニウムを５０％飽和状態にして４℃で一晩静置し、沈殿を遠心（１,０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）により回収した。更にこの沈殿を２倍に希釈したバインディングバッファー（binding buffer:Protein AMAPS IIkit製）に溶解させた後、プロテインＡカラム（Pharmacia-Amersham製）にＩｇＧを吸着させた。その後、ＰＢＳ透析を一晩行って抗体を精製し、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する抗体を得た。そしてこの抗体を７Ｅ７と名付けた。
【００４５】
（３）ウエスタンブロッティングによる７Ｅ７抗体の特異性の確認：
次に、（２）で得られた７Ｅ７抗体が３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識することを確認するために、７Ｅ７抗体を用いてＣＯＳ−１細胞に強制発現させたＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎタンパク質等について、常法（例えば、「分子生物学基礎実験法」、南江堂）に従いウエスタンブロッティングを行った。
【００４６】
ウエスタンブロッティングの結果を図１に示した。サンプル１はヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ全長のｃＤＮＡを導入したＣＯＳ−１細胞の溶解液、サンプル２はヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ全長のｃＤＮＡを導入したＣＯＳ−１細胞の培養上清、サンプル３はベクターのみ導入したＣＯＳ−１細胞の培養上清、そしてサンプル４、５、６はそれぞれ、ＨｅＬａ細胞、ＭＫＮ−２８細胞、ＮＲＣ−１２細胞の培養上清をサンプルとしたもので、それぞれのサンプルは２−メルカプトエタノール（２Ｍｅ）を加えて還元状態とした（図１中、ヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎは「ｈＥＲＣ」と表記）。そして、さらにサンプル４、５、６についてはｈＥＲＣおよびβアクチンのＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲ法により確認した。
【００４７】
この図１によると本抗体がＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを強制発現させたサンプルについて、７１ｋＤａ全長型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎおよび３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの発現部位にバンドを有することが確認され、本抗体がＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎに対し反応性を有することが確認された。
【００４８】
実 施 例 ２
３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ断片に対するポリクロー
ナル抗体の作製：
（１）免疫用抗原の作製
ヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの内部配列に相当する下記のアミノ酸配列（配列番号１の２８２〜２９５）を有するペプチドは、ＨＰＬＣクロマトグラフィー精製した状態の品をシンペップ（Synpep Corporation）社より購入した。なお、当該ペプチドはＣ末側にシスティン（Ｃ）を付けたペプチドである。このペプチドをポリクローナル抗体作製のための抗原とした。
ＣＲＱＰＥＲＴＩＬＲＰＲＦＲＲ
【００４９】
（２）ポリクローナル抗体の作製
（１）で作製したペプチド１００μｇとフロイント完全アジュバントを等量混合してエマルジョンを作製し、これをウサギに免疫した。免疫１週間後に、抗原１００μｇとフロイント不完全アジュバントを等量混合してエマルジョンを作製し、ウサギに追加免疫し、以後同様の操作を各週の間隔で３回行った。その後、免疫原に対する力価上昇を、抗原ペプチドを固相化したＥＬＩＳＡ法で確認した後、全採血を行い１,５００ｒｐｍで１５分間の遠心により抗血清を分離し、抗原ペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いて抗原特異精製を行い、ポリクローナル抗体を得た。そしてこの抗体を４−２抗体と名づけた。
【００５０】
（３）ウエスタンブロッティングによる７Ｅ７抗体の特異性の確認
次に、（２）で得られた４−２抗体が３１ｋＤａ-分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識することを確認するために、４−２抗体を用いてＣＯＳ−１細胞に強制発現させたＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎタンパク質等について、前述のように常法に従いウエスタンブロッティングを行った。ウエスタンブロッティングの結果を図２に示した。サンプルは上記７Ｅ７抗体の試験で用いたものと同じである。この図によると本抗体がＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを強制発現させたサンプルに対して反応性を有することが確認された。
【００５１】
実 施 例 ３
ＥＬＩＳＡ測定系の作製：
（１）標準物質の作製
上述した抗体作製時に用いた抗原タンパク質（３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−Ｈｉｓ）を基準にして、ＣＯＳ−１細胞で発現させた３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの濃度を測定し、ＥＬＩＳＡ測定系の標準物質とした。
【００５２】
（２）ポリクローナル４−２抗体とＨＲＰとの結合物の作製
実施例２で得られた４−２抗体とＨＲＰとの結合物は以下のように作製した。必要量のＨＲＰを蒸留水に溶かし、ＮａＩＯ４で酸化させた後、ｐＨ４.４の１ｍＭ酢酸緩衝液に一晩透析した。また、４−２抗体の１−１０ｍｇもｐＨ９.５の０.１Ｍ炭酸緩衝液に一晩透析した。これらの透析した４−２抗体とＨＲＰを抗体１ｍｇに対してＨＲＰが０.４ｍｇになるように混合し、室温で２時間反応させた。次いで、これにＮａＢＨ４を加え氷中で２時間反応させた後ＰＢＳに一晩透析した。更に、この反応物をゲル濾過し、４−２抗体とＨＲＰとの結合物を作製した。
【００５３】
（３）ＥＬＩＳＡ測定系の作製
上記実施例で得られた抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の構築は以下のようにして行った。まず、１０μｇ／ｍｌの７Ｅ７抗体を１００μｌずつ９６ｗｅｌｌのＥＬＩＳＡ用プレートに加えた。次いで、これを４℃で一晩反応させた後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＮａＮ３溶液にてブロッキングを行い、サンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートとした。また、上記（２）で作成した４−２抗体とＨＲＰとの結合物を標識抗体とした。
【００５４】
適当に希釈した標準物質および検体を各ウェルに添加し３７℃で１時間反応（１次反応）、洗浄後、ＨＲＰ（horseradish peroxidase）標識した４−２抗体を加え４℃、３０分間反応（２次反応）、洗浄後、テトラメチルベンジジン（Tetra Methyl Benzidine (TMB)）を含む基質液を加え室温３０分間放置、反応停止液（１ＮのＨ２ＳＯ４）を加え反応停止後、波長４５０ｎｍでの吸光度を測定し、標準物質から作成した検量線を用いて検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度を算出した。
【００５５】
図３に代表的な検量線の作成例を示した。また、図４に本測定系を用いて測定した培養細胞の培養上清中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度を示した。更に、図５に健常人血清中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度を示した。健常人血清中の健常人血清の平均値は７.６６ｎｇ／ｍｌ、ヘパリン添加血漿１０.６０ｎｇ／ｍｌ、ＥＤＴＡ添加血漿１１.７７ｎｇ／ｍｌであった。
【００５６】
実 施 例 ４
ＥＬＩＳＡ測定系の作製：
実施例３で作製したＥＬＩＳＡ測定系を用いて、中皮腫患者血清３例（検体Ｎｏ.１〜３）および健常人血清１３例（検体Ｎｏ.４〜１６）中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの濃度を次のようにして測定した。
【００５７】
血清サンプルは採取後すぐにＰＢＳで１６倍に希釈し、そして実施例３に記載の方法に従って測定を行った。そして希釈サンプルの吸光度から３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度を求め、更に、その濃度から原液濃度（１６倍）へ換算した。この測定結果を表１に示した。
【００５８】
この結果、健常人においては３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度は３.０２〜２９.２２ｎｇ／ｍＬの範囲を示し、平均値は７.８０ｎｇ／ｍＬであったのに対して、中皮腫患者血清中には、健常人（検体数１３、平均値７.８０ｎｇ／ｍＬ）と比較して３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの濃度が高値であることが判った。
【００５９】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の診断剤および診断キットは、３１ｋＤａの分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを測定することができるので、中皮腫の診断に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、モノクローナル抗体７Ｅ７のウエスタンブロッティングによる特異性試験の結果を示す（ここでレーン１はヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ全長のｃＤＮＡを導入したＣＯＳ−１細胞の溶解液、レーン２はヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ 全長のＣＤＮＡを導入したＣＯＳ−１細胞の培養上清、レーン３はベクターのみ導入したＣＯＳ−１細胞の培養上清、レーン４、５、６はそれぞれ、ＨＥＬＡ細胞、ＭＫＮ−２８細胞、ＮＲＣ−１２細胞の培養上清をサンプルとした結果を表す）。
【図２】図２は、ポリクローナル抗体４−２のウエスタンブロッティングによる特異性試験の結果を示す（ここでレーン１はヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ全長のｃＤＮＡを導入したＣＯＳ−１細胞の溶解液、レーン２はヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ 全長のｃＤＮＡを導入したＣＯＳ−１細胞の培養上清、レーン３はベクターのみ導入したＣＯＳ−１細胞の培養上清、レーン４、５、６はそれぞれ、ＨＥＬＡ細胞、ＭＫＮ−２８細胞、ＮＲＣ−１２細胞の培養上清をサンプルとした結果を表す）。
【図３】図３は、実施例３で作製したＥＬＩＳＡキットによる検量線（STD Curve）を示す。
【図４】図４は、実施例３で作製したＥＬＩＳＡキットによる各種細胞株培養上清の測定例を示す（ここで、Ｏ−１２８は胃癌由来、Ｏ−３は胃癌由来、ＣＯＳ−１はサル腎臓癌化由来、ＨＴ−２９は大腸癌由来、ＨｅｌａＳ３は子宮頚癌由来、ＳＭＯＶ−１は卵巣癌由来、ＨＰＣ−Ｙ９は膵癌由来、ＰＣ−９は肺癌由来、ＫａｔｏIIIは胃癌由来、ＭＫＮ−１は胃癌由来、ＭＫＮ−２８は胃癌由来、ＭＫＮ−４５は胃癌由来、ＭＫＮ−７４は胃癌由来、ＯＫＡＪＩＭＡは胃癌由来）。
【図５】図５は、実施例３で作製したＥＬＩＳＡキットによる健常人血清（Ｓｅｒｕｍ）、ヘパリン添加血漿（Ｈｅｐａｒｉｎ−ｐ）、ＥＤＴＡ添加血漿（ＥＤＴＡ−ｐ）の測定例を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中皮腫診断剤および中皮腫診断キットに関し、更に詳細には、中皮腫の早期診断に用いることができる診断剤およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、アスベストに暴露された経験をもつヒトが高頻度で中皮腫を発病することは社会問題にまで発展している。中皮腫は悪性のものと良性のものが存在するが、悪性中皮腫患者の多くは、アスベストへ暴露歴を有し、アスベスト曝露から３０−３５年という長期潜伏期間を経て悪性中皮腫を発症している。このため、今後中皮腫患者が増加する可能性は否定できない。
【０００３】
また、中皮腫は早期発見の難しい疾患であり、現在中皮腫はＭＲＩやＣＴ等を用いた方法により診断がされているが、これらの方法では早期診断が難しく、中皮腫と診断された時点で既に病気が進行していることが多いのが問題となっている。それだけに本疾患の早期診断が切に望まれているわけであるが、しかしながら現在では未だ有効な早期診断マーカーが見つけられていない。
【０００４】
現在まで中皮腫に関連するマーカーとしては、Ｅｒｃ、ＭＰＦおよびＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎと呼ばれるタンパク質が発見されている。その経緯は次のようなものである。
まず、１９９４年、ヤマグチ（Yamaguchi）らにより、ヒト膵臓癌細胞ＨＰＣ−Ｙ５上清から、ＭＰＦ (Megakaryocyte potentiating factor)と呼ばれるタンパク質が精製されたこと（文献１）、さらに１９９５年、コジマ（Kojima）らにより、ヒト膵臓癌細胞ＨＰＣ−Ｙ５のｃＤＮＡからＭＰＦがクローニングされたことが報告された（文献２）。
【０００５】
その後、チャン（Chang）らは、中皮細胞、卵巣癌および中皮腫の表面に発現する４０ｋＤａのエピトープに反応するモノクローナル抗体Ｋ１を作製し、該抗体を用いて、その抗原タンパク質をコードする遺伝子を探索したところ、６９ｋＤａのタンパク質をコードする１８８４ｂｐのオープンリーディングフレーム（open reading frame）を持つ遺伝子を単離した。そしてさらに、チャン（Chang）らは、当該６９ｋＤａタンパク質が前記４０ｋＤａタンパク質の前駆体であり、該６９ｋＤａタンパク質がホスファチジルイノシトール特異性ホスホリパーゼ（ＰＩ−ＰＬ）の作用により切断され、細胞表面に４０ＫＤａタンパク質が発現することを明らかにした。そしてチャン（Chang）らは、その６９ｋＤａタンパク質をＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎと名づけたが（文献３）、後に上述のＭＰＦとＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎは同一のタンパク質であることが明らかとなった。
【０００６】
一方、ショラー（Scholler）らは卵巣癌細胞を免疫して作製したモノクローナル抗体ＯＶ５６９が認識するタンパク質を検索した結果、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの膜結合領域と同じ配列を有する、分子量４２−４５ｋＤａのタンパク質であることを発見し、可溶性メソセリン（Soluble member of mesothelin）と呼んだ。このタンパク質は途中にフレームシフト変異を起しており、その結果、Ｃ末領域のＧＰＩアンカー部分が異なる配列になってしまうために可溶性になることが判明した。さらに、ＯＶ５６９と同じタンパク質を認識する別のモノクローナル抗体４Ｈ３を用いてサンドイッチＥＩＡ（Sandwich EIA）の測定系を構築し、患者血清を測定した結果、健常人に比べて、卵巣癌患者では高い値を示した（文献４）。さらにロビンソン（Robinson）らはこの測定系を用いて中皮腫患者の測定を行い、健常人に比べて高い値を示すことを報告している（文献５）。
【０００７】
本願発明者である樋野らは、長年にわたる疾患モデル動物の研究を通じて、腎癌発症モデルＥｋｅｒラットの原因遺伝子を探索してきた。その結果、正常腎組織に比べてＥｋｅｒラット腎癌由来細胞株において高発現を示す遺伝子を発見し、その中の１つをＥｒｃと命名した。さらに、ラットＥｒｃのヒトホモログを探索した結果、ヒトにおいてはＭＰＦ がラットＥｒｃに対して５６.１％の相同性を有することを明らかにした（文献６、７）。
【０００８】
以上の経緯等から、（１）ヒトＥｒｃ、ＭＰＦおよびＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎ（以下、これらを「Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ」という）は、全長６２２アミノ酸からなる糖タンパク質であり、２９０−２９５アミノ酸にＲＰＲＦＲＲ配列を有することから、フリン（Ｆｕｒｉｎ）様プロテアーゼでプロセッシングを受けて３１ｋＤａと４０ｋＤａフラグメントに開裂する、（２）４０ｋＤａフラグメントのＣ末側領域はそのＣ末端にＧＰＩアンカー領域を含むことから細胞膜に結合した形で残り、Ｎ末側の３１ｋＤａフラグメントは可溶性タンパク質として分泌される（以下、これを「３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ」という）、（３）また細胞膜上に結合した４０ｋＤａフラグメントのＣ末側もホスファチジルイノシトール−スペシフィックホスホリパーゼＣ（phosphatidiylinositol-specific phospholipase C：PI-PLC）処理によって細胞から放出されること、等が考えられている。
【０００９】
これらの異なるアプローチによって同定されたＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎは、正常の中皮細胞および中皮腫に強く発現しているのみならず、中皮腫患者血液中にも存在することが報告されている。
【００１０】
しかしながら、これらの知見は中皮腫においてどのようなタイプのＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎが分泌されているのかは明らかではなく、早期診断マーカーを示唆するものとは言い切れなかった。
【非特許文献１】Yamaguchi N, Hattori K, Oh-eda M, Kojima T, Imai N, Ochi N. A novelcytokine exhibiting megakaryocyte potentiating activity from a human pancreatictumor cell line HPC-Y5., J Biol Chem. 1994 Jan 14;269(2):805-8.PMID: 8288629
【非特許文献２】Kojima, T.; Oh-eda, M.; Hattori, K.; Taniguchi, Y.; Tamura, M.;Ochi, N.; Yamaguchi, N. : Molecular cloning and expression of megakaryocytepotentiating factor cDNA., J. Biol. Chem. 270: 21984-21990, 1995. PubMed ID :7665620
【非特許文献３】Chang, K.; Pastan, I. : Molecular cloning of mesothelin, adifferentiation antigen present on mesothelium, mesotheliomas, and ovariancancers., Proc. Nat. Acad. Sci. 93: 136-140, 1996. PubMed ID : 8552591
【非特許文献４】Scholler, N.; Fu, N.; Yang, Y.; Ye, Z.; Goodman, G. E.; Hellstrom,K. E.; Hellstrom, I. : Soluble member(s) of the mesothelin/megakaryocyte potentiatingfactor family are detectable in sera from patients with ovarian carcinoma.,Proc. Nat. Acad. Sci. 96: 11531-11536, 1999. PubMed ID : 10500211
【非特許文献５】Robinson BW, Creaney J, Lake R, Nowak A, Musk AW, de Klerk N,Winzell P, Hellstrom KE, Hellstrom I.Soluble mesothelin-related protein-A bloodtest for mesothelioma.Lung Cancer., 2005 Jul;49 Suppl 1:S109-11. PMID: 15950789
【非特許文献６】Hino O, Kobayashi E, Nishizawa M, Kubo Y, Kobayashi T, Hirayama Y,Takai S, Kikuchi Y, Tsuchiya H, Orimoto K, et al.Renal carcinogenesis in theEker rat., J Cancer Res Clin Oncol. 1995;121(9-10):602-5. PMID: 7559744
【非特許文献７】Yamashita Y, Yokoyama M, Kobayashi E, Takai S, Hino OMapping and determination of the cDNA sequence of theErc gene preferentially expressed in renal cell carcinoma in the Tsc2 genemutant (Eker) rat model., Biochem Biophys Res Commun. 2000 Aug18;275(1):134-40. PMID: 10944454
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明の目的は、中皮腫とＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎとの関係を明らかにし、中皮腫の診断を行うことのできる診断剤や診断キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎに注目し、鋭意研究した。その結果、培養細胞を用いた実験系では、通常の培養状態においても３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎは培養上清中に検出することが可能であり、この切断は体内においても恒常的に起こっていると解された。実際、後述するように、この３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを検出することのできる測定系を構築することによって、健常人血液中においてもこのものが一定量存在することを明らかにした。更に、本願発明者らはＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの分解が起こるときは、まずＮ末側で切断されることにより３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの血中への放出が起こり、その後何らかの刺激によって４０ｋＤａのＣ末側Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎが分泌されるという順序で起こると判断した。
【００１３】
従って、健常状態で一定量存在する３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを測定することで、より早期にＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの異常を検出すること、すなわち、中皮腫の進行状況をより早期に診断可能になることを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する抗体を含有することを特徴とする中皮腫診断剤である。
【００１５】
また、本発明は配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する第１の抗体を含有する第１の試薬と、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する抗体であって、第１の抗体と異なるエピトープを認識する第２の抗体を含有する第２の試薬とを組み合わせてなることを特徴とする中皮腫診断キットである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の中皮腫診断剤および中皮腫診断キットは、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを測定することができるので、中皮腫の進行状況をより早期に診断することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の中皮腫診断剤（以下、「本発明診断剤」という）に含有される３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する抗体（以下、「抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体」という）は、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを特異的に認識する抗体であれば特に限定されず、その起源について特に制約はなく、ヒト由来のものでなくても良い。また、抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体としてはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもよい。
【００１８】
抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体は、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎあるいはそのフラグメントペプチドを抗原として使用し、公知の方法、例えば「続生化学実験講座、免疫生化学研究法」（日本生化学会編）等に記載の方法に従って調製することができる。
【００１９】
この抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体の製造において、抗原として使用される３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎあるいはそのフラグメントペプチドとしては、ヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのアミノ酸配列（Accession No. AAV87530）の１〜２９５番目（配列番号１）、好ましくは３５〜２９５番目の全部あるいは一部と一致するポリペプチドを合成機で合成したもの、あるいは前記アミノ酸配列の全部あるいは一部をコードするｃＤＮＡ（Accession No. AY743922）を常法によりベクターに組み込み、このベクターを用いて大腸菌等の宿主微生物もしくは培養細胞を形質転換し、形質転換した大腸菌等の宿主微生物・培養細胞を培養して産生させて得られるリコンビナントタンパク質やポリペプチドを、アフィニティーカラムやニッケルカラム等で精製したもの等が挙げられる。
【００２０】
また、前記アミノ酸配列の全部あるいは一部をコードするｃＤＮＡに一致するポリヌクレオチドはラットＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ｃＤＮＡ等のほ乳類由来のＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ｃＤＮＡをプローブとしてヒト腫瘍細胞株等のｃＤＮＡライブラリーからクローニングすることによっても得られる。
【００２１】
具体的に、抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体を、調製する手順を示せば次の通りである。すなわち、ポリクローナル抗体として抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体を調製するには、まず、ヒト３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのｃＤＮＡ配列（Accession No. AY743922）をコードするポリヌクレオチドをＰＣＲ法により作製する。次いで、これをｐＧＥＸ等のベクターに組み込み、このベクターを大腸菌等の宿主微生物に導入し、ＬＢ培地等で培養してポリペプチドのリコンビナントタンパク質を産生させる。次いで、得られたリコンビナントタンパク質を抗原とし、これをリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ）に溶解し、更にこれらとフロイント完全アジュバントまたは不完全アジュバントあるいはミョウバン等の補助剤と結合した後、これを免疫原として哺乳動物などを免疫する。
【００２２】
免疫される動物としては当該分野で常用されたもの、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ等のいずれをも使用することができる。また、免疫の際の免疫原の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は１回または適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の間隔で複数回行うことができる。
【００２３】
最後に、常法に従い、免疫した動物から血液を採取し、この血液から血清を分離し、この血清中から３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識するポリクローナル抗体を得ることができる。
【００２４】
また、モノクローナル抗体として３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する抗体を調製するには、モノクローナル抗体調製の常法に従い、上記リコンビナントタンパク質で動物を免疫して得た免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取することによって得ることができる。
【００２５】
かくして得られた抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体は、必要により標識ないし固相化して、本発明の本発明診断剤に適した形にすることができる。このうち標識は、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下、「ＨＲＰ」という）、アルカリフォスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、３２Ｐ、１２５Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などの標識物質を結合することにより行われる。また、固相化は、適切な固相に抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体を結合させることにより行われる。固相としては、免疫化学的測定法において慣用される固相のいずれをも使用することができ、例えば、ポリスチレン製の９６穴マイクロタイタープレート、アミノ基結合型のマイクロタイタープレート等のプレートや、各種のピーズ類が挙げられる。抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体を固相化させるには、例えば、抗体を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーションすればよい。
【００２６】
また、本発明の中皮腫診断キット（以下、「本発明キット」という）は、必要により標識ないし固相化した抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体を使用して常法に従って作製すればよい。具体的に、抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体を２種使用して本発明キットを作製する場合には、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃを認識する第１の抗体を含有する第１の試薬（例えば、固相化抗体）と、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃを認識する抗体であって、第１の抗体と異なるエピトープを認識する第２の抗体を含有する第２の試薬（例えば、標識抗体）を組み合わせて使用すればよい。
【００２７】
上記のように作成された本発明診断剤および本発明キットは、これに含まれる抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体により、中皮腫患者血清中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの存在やその量を検出することができるものである。
【００２８】
本発明診断剤および本発明キットを用いた具体的な３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの存在や量の測定方法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（E. Engvall et al., (1980): Methods in Enzymol., 70, 419-439）、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）、イムノクロマト法等の、一般の免疫化学的測定法において使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプランニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）が挙げられる。
【００２９】
これらの測定方法は種々の観点から適宜選択することができるが、感度、簡便性等の点
からはＥＬＩＳＡ法が好ましい。より具体的な、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの測定について、ＥＬＩＳＡ法の一つであるサンドイッチ法を例にとってその手順を説明すれば次の通りである。
【００３０】
まず、工程（Ａ）として、本発明の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する抗体を担体に固相化し、次いで、工程（Ｂ）として、抗体が固相化されていない担体表面を抗３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体と無関係な、例えばタンパク質により、ブロッキングする。更に、工程（Ｃ）として、これに各種濃度の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを含む検体を加え、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎと抗体との複合体を生成させた後、工程（Ｄ）として、標識した３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体を加え、これに３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎと抗体との複合体を結合させ、最後に工程（Ｅ）として、標識量を測定することにより、予め作成した検量線から検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの量を決定することができる。なお、工程（Ａ）と工程（Ｄ）に用いる抗体は逆の場合でも測定が可能である。
【００３１】
具体的に工程（Ａ）において、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する抗体を固相化するために用いられる担体としては、特別な制限はなく、免疫化学的測定法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン製の９６穴マイクロタイタープレートあるいは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートが挙げられる。また、上記抗体を固相化させるには、例えば、上記抗体を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば１０ｍＭのＰＢＳを挙げることができる。緩衝液中の上記抗体の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０.０１〜１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０.１〜２０μｇ／ｍｌである。また、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で２０〜１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩のインキュベーションが適している。
【００３２】
また、工程（Ｂ）のブロッキングは、工程（Ａ）で抗体を固相化した担体において、後に添加する検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎが抗原抗体反応とは無関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤としては、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液や、ブロックエース（Ｂｌｏｃｋ−Ａｃｅ：大日本製薬製（コードＮｏ.ＵＫ−２５Ｂ））等の市販のブロッキング剤を使用することができる。具体的なブロッキングは、限定されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロックエースを適量加え、約４℃で、一晩のインキュベーションをした後、緩衝液で洗浄することにより行われる。
【００３３】
更に、工程（Ｃ）において、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを含む検体を固相化した抗体と接触させ、この固相化した抗体で３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを捕捉し、固相化した抗体と３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎとの複合体を生成させる。この複合体を生成させるための条件は限定されるわけではないが、４℃〜３７℃程度で約１時間〜１晩の反応を行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７.２）および０.０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０の組成のものが好ましい。
【００３４】
また更に、工程（Ｄ）において、固相化した抗体に捕捉された３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの別のエピトープを認識する標識抗体を加え、固相化した抗体−３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−標識抗体の複合体を形成させる。この反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、前記したものが使用される。この工程（Ｄ）において使用される標識抗体の量は、固相化した抗体に対して約５,０００〜１０,０００倍、好ましくは最終吸光度が１.５〜２.０となるように希釈された量である。希釈には緩衝液を用いることができ、反応条件は特に限定されるわけではないが、４℃〜３７℃程度で約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄することが好ましい。以上の反応により、固相化した抗体−３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−標識抗体の複合体を結合することができる。
【００３５】
最後に工程（Ｅ）において、固相化した抗体−３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−標識抗体の複合体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線から３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの量を算出することができる。
【００３６】
上記標識抗体の標識物として、酵素であるペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と３,３',５,５'−テトラメチルベンジン（以下「ＴＭＢ」という）を含む発色基質溶液を使用することができる。発色反応は、限定されるわけではないが、発色基質溶液を加え約２５℃で約３０分間反応させた後、１〜２Ｎの硫酸を加えて酵素反応を停止させことにより行うことができる。ＴＭＢを使用する場合、発色は４５０ｎｍの吸光度により測定する。一方、標識物として、酵素であるアルカリホスファターゼを使用する場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。なお、既知の濃度の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを添加した反応液の吸光度により予め作成しておいた検量線を用いて、検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの濃度を算出できる。
【００３７】
上記で説明した３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの測定方法を実施するには、本発明の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体を含む第１の試薬と、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する他の抗体を含む第２の試薬とを含有する３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの測定キット（以下、「本発明キット」という）を利用することが好ましい。
【００３８】
なお、本発明キットは常法により作製することができる。具体的には、本発明の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体と、他に、希釈用緩衝液、標準物質、基質用緩衝液、停止液、洗浄液等を組み合わせればよい。
【００３９】
一方、具体的に本発明キットによる中皮腫の診断に用いられる検体は、特に制限はなく、例えば全血、血清、血漿、尿、リンパ液等の体液を挙げることができる。この検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ量を、本発明診断剤を用いたサンドイッチ法、ＲＩＡ法、ネフェロメトリー法、免疫比濁法等の免疫測定法における公知の手段により測定し、その量が健常者の平均値より有意に高いと判断される場合には中皮腫と診断することができる。検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ量を健常者の平均値より有意に高いと判断する指標の例としては、健常人血清群で得られた３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ量の平均値＋３ｘ標準偏差の値、好ましくは健常人血清群で得られた３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ量の平均値＋５ｘ標準偏差の値を統計学的なカットオフ値として用いることが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例をあげて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約を受けるものではない。
【００４１】
実 施 例 １
３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ断片に対するモノクロー
ナル抗体の作製：
（１）免疫用抗原の作製
配列番号２で表される全長のヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ｃＤＮＡ（Accession No. AY743922）を鋳型として、配列番号１で表される３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのアミノ酸配列の３５番から２９５番目までのＮ末側領域を、以下に示したプライマーＮｏ.５’−３およびＮｏ.３’−３を用いた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により増幅させた。次に上記で得られたオリゴヌクレオチドのＮ末側領域にＧＳＴ（Glutathione S-transferase）タグをコードする配列を、またＣ末側領域にヒスチジン（Histidine）タグをコードする配列を付加して、これらＧＳＴ−３１ｋＤａ分泌型ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−Ｈｉｓ領域を、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１（Amershambiosciences社製）に挿入し、発現ベクターとし、これを大腸菌に組み込んで融合タンパク質として発現させた。
プライマーＮｏ.５’−３（配列番号３）：
５’−ＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＣＣＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡ−３’
プライマーＮｏ.３’−３（配列番号４）：
５’−ＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＣＧＣＣＧＧＡＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＡ−３’
【００４２】
この大腸菌を５ｍＬのアンピシリンを加えたＬＢ培地で３７℃一晩振盪培養した。これをさらに１,０００ｍＬのＬＢ培地に加えて３７℃４時間振盪培養し、５００Ｍのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（IPTG）を１ｍＬ加え３時間振盪培養した。このようにして得た培養液を４℃で６,０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、沈殿をリン酸緩衝塩化ナトリウム液（PBS）で２回洗浄した。その後、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えた２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.４）２０ｍｌを加え、−２０℃で一晩放置した。そして、この液に対し３０秒間の超音波処理を４回行って菌体を破壊し、目的のタンパク質を抽出した後、４℃で１０,０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、上清を得た。この上清からグルタチオン−セファロースビーズ（Glutathion-sepharose beads：Amershambiosciences社製）を用いてＧＳＴ−３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−Ｈｉｓタンパク質を精製した後、プレシジョンプロテアーゼ（PreScission Protease：Amershambiosciences社製）処理によりＧＳＴ部分を切断、除去した３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−Ｈｉｓを抗原とした。
【００４３】
（２）モノクローナル抗体の作製
免疫用抗原として、上記（１）において得られたタンパク質を用い、１週間、または２週間おきに５０μｌ（５０μｇ）を投与し、マウスを免疫した。抗原は初回免疫のみにフロイント完全アジュバントと混和し、二回目からはフロイント不完全アジュバントと混和した。免疫化されたマウスの脾単球細胞と融合パートナー、Ｘ６３−Ａｇ８−６５３をポリエチレングリコール仲介細胞融合に付し、文献（J. Immunol. 146:3721-3728）に述べた方法によりハイブリドーマを選択した。選択は、固定化された３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎに反応する細胞を選択することにより行った。
【００４４】
上記のようにして選択した細胞を無血清培地のＧＩＴ培地（和光純薬）で細胞の８０％が死滅するまで抗体を産生させた。次いでこの培地から遠心（１,０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）により細胞を取り除いた後、硫酸アンモニウムを５０％飽和状態にして４℃で一晩静置し、沈殿を遠心（１,０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）により回収した。更にこの沈殿を２倍に希釈したバインディングバッファー（binding buffer:Protein AMAPS IIkit製）に溶解させた後、プロテインＡカラム（Pharmacia-Amersham製）にＩｇＧを吸着させた。その後、ＰＢＳ透析を一晩行って抗体を精製し、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する抗体を得た。そしてこの抗体を７Ｅ７と名付けた。
【００４５】
（３）ウエスタンブロッティングによる７Ｅ７抗体の特異性の確認：
次に、（２）で得られた７Ｅ７抗体が３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識することを確認するために、７Ｅ７抗体を用いてＣＯＳ−１細胞に強制発現させたＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎタンパク質等について、常法（例えば、「分子生物学基礎実験法」、南江堂）に従いウエスタンブロッティングを行った。
【００４６】
ウエスタンブロッティングの結果を図１に示した。サンプル１はヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ全長のｃＤＮＡを導入したＣＯＳ−１細胞の溶解液、サンプル２はヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ全長のｃＤＮＡを導入したＣＯＳ−１細胞の培養上清、サンプル３はベクターのみ導入したＣＯＳ−１細胞の培養上清、そしてサンプル４、５、６はそれぞれ、ＨｅＬａ細胞、ＭＫＮ−２８細胞、ＮＲＣ−１２細胞の培養上清をサンプルとしたもので、それぞれのサンプルは２−メルカプトエタノール（２Ｍｅ）を加えて還元状態とした（図１中、ヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎは「ｈＥＲＣ」と表記）。そして、さらにサンプル４、５、６についてはｈＥＲＣおよびβアクチンのＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲ法により確認した。
【００４７】
この図１によると本抗体がＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを強制発現させたサンプルについて、７１ｋＤａ全長型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎおよび３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの発現部位にバンドを有することが確認され、本抗体がＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎに対し反応性を有することが確認された。
【００４８】
実 施 例 ２
３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ断片に対するポリクロー
ナル抗体の作製：
（１）免疫用抗原の作製
ヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの内部配列に相当する下記のアミノ酸配列（配列番号１の２８２〜２９５）を有するペプチドは、ＨＰＬＣクロマトグラフィー精製した状態の品をシンペップ（Synpep Corporation）社より購入した。なお、当該ペプチドはＣ末側にシスティン（Ｃ）を付けたペプチドである。このペプチドをポリクローナル抗体作製のための抗原とした。
ＣＲＱＰＥＲＴＩＬＲＰＲＦＲＲ
【００４９】
（２）ポリクローナル抗体の作製
（１）で作製したペプチド１００μｇとフロイント完全アジュバントを等量混合してエマルジョンを作製し、これをウサギに免疫した。免疫１週間後に、抗原１００μｇとフロイント不完全アジュバントを等量混合してエマルジョンを作製し、ウサギに追加免疫し、以後同様の操作を各週の間隔で３回行った。その後、免疫原に対する力価上昇を、抗原ペプチドを固相化したＥＬＩＳＡ法で確認した後、全採血を行い１,５００ｒｐｍで１５分間の遠心により抗血清を分離し、抗原ペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いて抗原特異精製を行い、ポリクローナル抗体を得た。そしてこの抗体を４−２抗体と名づけた。
【００５０】
（３）ウエスタンブロッティングによる７Ｅ７抗体の特異性の確認
次に、（２）で得られた４−２抗体が３１ｋＤａ-分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識することを確認するために、４−２抗体を用いてＣＯＳ−１細胞に強制発現させたＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎタンパク質等について、前述のように常法に従いウエスタンブロッティングを行った。ウエスタンブロッティングの結果を図２に示した。サンプルは上記７Ｅ７抗体の試験で用いたものと同じである。この図によると本抗体がＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを強制発現させたサンプルに対して反応性を有することが確認された。
【００５１】
実 施 例 ３
ＥＬＩＳＡ測定系の作製：
（１）標準物質の作製
上述した抗体作製時に用いた抗原タンパク質（３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−Ｈｉｓ）を基準にして、ＣＯＳ−１細胞で発現させた３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの濃度を測定し、ＥＬＩＳＡ測定系の標準物質とした。
【００５２】
（２）ポリクローナル４−２抗体とＨＲＰとの結合物の作製
実施例２で得られた４−２抗体とＨＲＰとの結合物は以下のように作製した。必要量のＨＲＰを蒸留水に溶かし、ＮａＩＯ４で酸化させた後、ｐＨ４.４の１ｍＭ酢酸緩衝液に一晩透析した。また、４−２抗体の１−１０ｍｇもｐＨ９.５の０.１Ｍ炭酸緩衝液に一晩透析した。これらの透析した４−２抗体とＨＲＰを抗体１ｍｇに対してＨＲＰが０.４ｍｇになるように混合し、室温で２時間反応させた。次いで、これにＮａＢＨ４を加え氷中で２時間反応させた後ＰＢＳに一晩透析した。更に、この反応物をゲル濾過し、４−２抗体とＨＲＰとの結合物を作製した。
【００５３】
（３）ＥＬＩＳＡ測定系の作製
上記実施例で得られた抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の構築は以下のようにして行った。まず、１０μｇ／ｍｌの７Ｅ７抗体を１００μｌずつ９６ｗｅｌｌのＥＬＩＳＡ用プレートに加えた。次いで、これを４℃で一晩反応させた後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＮａＮ３溶液にてブロッキングを行い、サンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートとした。また、上記（２）で作成した４−２抗体とＨＲＰとの結合物を標識抗体とした。
【００５４】
適当に希釈した標準物質および検体を各ウェルに添加し３７℃で１時間反応（１次反応）、洗浄後、ＨＲＰ（horseradish peroxidase）標識した４−２抗体を加え４℃、３０分間反応（２次反応）、洗浄後、テトラメチルベンジジン（Tetra Methyl Benzidine (TMB)）を含む基質液を加え室温３０分間放置、反応停止液（１ＮのＨ２ＳＯ４）を加え反応停止後、波長４５０ｎｍでの吸光度を測定し、標準物質から作成した検量線を用いて検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度を算出した。
【００５５】
図３に代表的な検量線の作成例を示した。また、図４に本測定系を用いて測定した培養細胞の培養上清中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度を示した。更に、図５に健常人血清中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度を示した。健常人血清中の健常人血清の平均値は７.６６ｎｇ／ｍｌ、ヘパリン添加血漿１０.６０ｎｇ／ｍｌ、ＥＤＴＡ添加血漿１１.７７ｎｇ／ｍｌであった。
【００５６】
実 施 例 ４
ＥＬＩＳＡ測定系の作製：
実施例３で作製したＥＬＩＳＡ測定系を用いて、中皮腫患者血清３例（検体Ｎｏ.１〜３）および健常人血清１３例（検体Ｎｏ.４〜１６）中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの濃度を次のようにして測定した。
【００５７】
血清サンプルは採取後すぐにＰＢＳで１６倍に希釈し、そして実施例３に記載の方法に従って測定を行った。そして希釈サンプルの吸光度から３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度を求め、更に、その濃度から原液濃度（１６倍）へ換算した。この測定結果を表１に示した。
【００５８】
この結果、健常人においては３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度は３.０２〜２９.２２ｎｇ／ｍＬの範囲を示し、平均値は７.８０ｎｇ／ｍＬであったのに対して、中皮腫患者血清中には、健常人（検体数１３、平均値７.８０ｎｇ／ｍＬ）と比較して３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの濃度が高値であることが判った。
【００５９】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の診断剤および診断キットは、３１ｋＤａの分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを測定することができるので、中皮腫の診断に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、モノクローナル抗体７Ｅ７のウエスタンブロッティングによる特異性試験の結果を示す（ここでレーン１はヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ全長のｃＤＮＡを導入したＣＯＳ−１細胞の溶解液、レーン２はヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ 全長のＣＤＮＡを導入したＣＯＳ−１細胞の培養上清、レーン３はベクターのみ導入したＣＯＳ−１細胞の培養上清、レーン４、５、６はそれぞれ、ＨＥＬＡ細胞、ＭＫＮ−２８細胞、ＮＲＣ−１２細胞の培養上清をサンプルとした結果を表す）。
【図２】図２は、ポリクローナル抗体４−２のウエスタンブロッティングによる特異性試験の結果を示す（ここでレーン１はヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ全長のｃＤＮＡを導入したＣＯＳ−１細胞の溶解液、レーン２はヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ 全長のｃＤＮＡを導入したＣＯＳ−１細胞の培養上清、レーン３はベクターのみ導入したＣＯＳ−１細胞の培養上清、レーン４、５、６はそれぞれ、ＨＥＬＡ細胞、ＭＫＮ−２８細胞、ＮＲＣ−１２細胞の培養上清をサンプルとした結果を表す）。
【図３】図３は、実施例３で作製したＥＬＩＳＡキットによる検量線（STD Curve）を示す。
【図４】図４は、実施例３で作製したＥＬＩＳＡキットによる各種細胞株培養上清の測定例を示す（ここで、Ｏ−１２８は胃癌由来、Ｏ−３は胃癌由来、ＣＯＳ−１はサル腎臓癌化由来、ＨＴ−２９は大腸癌由来、ＨｅｌａＳ３は子宮頚癌由来、ＳＭＯＶ−１は卵巣癌由来、ＨＰＣ−Ｙ９は膵癌由来、ＰＣ−９は肺癌由来、ＫａｔｏIIIは胃癌由来、ＭＫＮ−１は胃癌由来、ＭＫＮ−２８は胃癌由来、ＭＫＮ−４５は胃癌由来、ＭＫＮ−７４は胃癌由来、ＯＫＡＪＩＭＡは胃癌由来）。
【図５】図５は、実施例３で作製したＥＬＩＳＡキットによる健常人血清（Ｓｅｒｕｍ）、ヘパリン添加血漿（Ｈｅｐａｒｉｎ−ｐ）、ＥＤＴＡ添加血漿（ＥＤＴＡ−ｐ）の測定例を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する抗体を含有することを特徴とする中皮腫診断剤。
【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する第１の抗体を含有する第１の試薬と、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する抗体であって、第１の抗体と異なるエピトープを認識する第２の抗体を含有する第２の試薬とを組み合わせてなることを特徴とする中皮腫診断キット。
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する抗体を含有することを特徴とする中皮腫診断剤。
【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する第１の抗体を含有する第１の試薬と、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する抗体であって、第１の抗体と異なるエピトープを認識する第２の抗体を含有する第２の試薬とを組み合わせてなることを特徴とする中皮腫診断キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００７−７１８４９（Ｐ２００７−７１８４９Ａ）
【公開日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２６５１５４（Ｐ２００５−２６５１５４）
【出願日】平成１７年９月１３日（２００５．９．１３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年（平成１７年）７月１５日 「日本経済新聞（夕刊）」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年８月１日 「日経バイオテク」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年８月１５日 日本癌学会発行の「第６４回 日本癌学会学術総会記事」に発表
【出願人】（３９９０３２２８２）株式会社 免疫生物研究所 (14)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月１３日（２００５．９．１３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年（平成１７年）７月１５日 「日本経済新聞（夕刊）」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年８月１日 「日経バイオテク」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年８月１５日 日本癌学会発行の「第６４回 日本癌学会学術総会記事」に発表
【出願人】（３９９０３２２８２）株式会社 免疫生物研究所 (14)
【Ｆターム（参考）】
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