二本鎖ＲＮＡ発現ベクターの導入によるノックダウン動物の作製
本発明は、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡの形成により内在性の目的遺伝子のｍＲＮＡが破壊されている、目的遺伝子ノックダウン動物及び疾患モデル動物、並びに該動物の作出方法に関する。また本発明は、該作出方法において用いる二本鎖ＲＮＡ発現ベクター、及び該ベクターを導入した動物細胞に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡの形成により内在性の目的遺伝子のｍＲＮＡが破壊されている、目的遺伝子ノックダウン動物及び疾患モデル動物、並びに該動物の作出方法に関する。また本発明は、該作出方法において用いる二本鎖ＲＮＡ発現ベクター、及び該ベクターを導入した動物細胞に関する。
【背景技術】
特異的な遺伝子の変異マウスは発生学などの基礎科学分野ばかりでなく、疾患モデルマウスとして応用科学分野においても重要な価値を持つ。種々の疾患の診断方法や治療薬の開発には疾患モデルマウスは大変有用である。現在一般的に用いられているＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製方法はＣａｐｅｃｃｈｉらの基礎的な研究によって開発された（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，ＭＲ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ），１９８９年，第２４４巻，ｐ．１２８８−１２９２（ｒｅｖｉｅｗ））。この方法では以下のような手順に従って、変異マウスが作製される。１）まず目的遺伝子のゲノムクローンを分離し、機能に必須なエキソン領域をネオマイシンなどの薬剤耐性遺伝子に置換したターゲティングベクターを作製する。２）このターゲティングベクターをＥＳ細胞にエレクトロポレーション法などにより導入し、相同組み換えによりＥＳ細胞の持つ遺伝子がターゲティングベクターによって置換された組換え細胞を分離する。３）この組み換え細胞を８細胞期胚に導入し、キメラマウスを作製する。４）キメラマウスのうちＥＳ細胞由来の生殖細胞が形成されているマウスを選別し、交配によってホモ変異マウスを得る。このように現在一般的に用いられている変異マウス作製方法は多くのステップを含むため、通常は１年程度の時間と多大な労力を必要とする。
最近ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）という現象が注目を浴びている。これはもともと線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、ショウジョウバエ、植物などで見出された現象で、特異的なｍＲＮＡの配列に対応する二本鎖ＲＮＡを細胞に導入すると、その細胞において転写されたｍＲＮＡが速やかに壊れる現象である（Ｈａｎｎｏｎ，ＧＪ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２年，第４１８巻，ｐ．２４４−２５１（ｒｅｖｉｅｗ）；特表２００２−５１６０６２号公報（ＷＯ９９／３２６１９号）；特表平８−５０６７３４号公報；特表２００２−５０７４１６号公報（ＷＯ９９／４９０２９号）；特表２００３−５１６１２４号公報（ＷＯ０１／２９０５８号）参照）。最近このＲＮＡ干渉は動物の培養細胞やマウス個体でも起きることが示されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ＳＭ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１年，第４１１巻，ｐ．４９４−４９８；ＭｃＣａｆｆｒｅｙ，ＡＰ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２年，第４１８巻，ｐ．３８−３９；特表２００２−５０２０１２号公報（ＷＯ００／４４８９５号）；特表２００３−５１４５３３号公報（ＷＯ０１／３６６４６号）参照）。これまでの一連の解析により、培養細胞などに導入した二本鎖ＲＮＡは約２２ヌクレオチドの小さなＲＮＡに分解され、これがｍＲＮＡにハイブリダイズすることによって、ｍＲＮＡの分解を誘導することが示されている（Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２００２年，第２０巻，ｐ．４４６−４４８；特表２００３−５２９３７４号公報（ＷＯ０１／７５１６４号）；ＷＯ０２／４４３２１号参照）。ショウジョウバエや線虫では長い二本鎖ＲＮＡによってｍＲＮＡの分解が誘導されることは多くの実験によって確認されている。一方、動物細胞においては、２０〜３０ヌクレオチドの短い二本鎖ＲＮＡによってｍＲＮＡの分解が誘導されることは確認されているが、長い二本鎖ＲＮＡは配列非特異的に多くのｍＲＮＡを壊すことも示唆されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ＳＭ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１年，第４１１巻，ｐ．４９４−４９８；国際特許出願ＷＯ００／１７５１６４号パンフレット）。
動物細胞におけるＲＮＡｉを実現させるため、ポリメラーゼＩＩＩ系を用いたｓｉＲＮＡ発現システムが多数報告されている（例えば、Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００２年，第２０巻，ｐ．４９７−５００；Ｈａｓｕｗａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２００２年，第５３２巻，ｐ．２２７−２３０）が、ＳｉＲＮＡを利用するＲＮＡｉは、発現を抑制させようとする標的部位の選択が難しく、現在その効果的な予測方法はない。また、ポリメラーゼＩＩＩ系プロモーターは全ての組織において機能を有するため、組織特異的にＲＮＡｉを達成することは不可能である。
一方、動物細胞におけるポリメラーゼＩＩ系を用いたＲＮＡｉでは、ウイルス感染などによってキナーゼが二本鎖ＲＮＡによって活性化され、インターフェロンシグナル伝達経路が活性化されることが指摘されている（Ｋａｕｆｍａｎ，ＲＪ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９９年，第９６巻，ｐ．１１６９３−１１６９５）。実際に上述したようなトランスジェニック動物を作製する過程において、特に長い二本鎖ＲＮＡを動物細胞において発現させた場合には、配列非特異的にタンパク質の合成が阻害され、またインターフェロンを誘導する経路が活性化されることも報告されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１年，第４１１巻，ｐ．４９４−４９８）。
従って、上述したような問題点を克服し、動物細胞におけるＲＮＡｉを効率的に達成することが現在の課題である。
【発明の開示】
本発明は、目的遺伝子がノックダウンされた動物を簡便かつ迅速に作出する方法及びそのツールを提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを特異的な組織で発現するトランスジェニック動物を作製することができれば、目的遺伝子のノックダウン動物を簡便かつ迅速に作製できると考えた。そこで本発明者は、目的遺伝子として転写因子Ｓｋｉを選択し、このＳｋｉ遺伝子のｍＲＮＡ配列に対応する５４０ｂｐの二本鎖ＲＮＡを発現するベクターを作製し、この発現ベクターを導入したトランスジェニックマウスを作製したところ、このトランスジェニックマウスが従来のＳｋｉ変異マウスと同様に、発生途中において形態形成異常や出血などの異常を示すことを確認した。そのような結果から、本発明者は、上記のように構築した発現ベクターを用いたＲＮＡ干渉を利用することによって、短時間で特異的に目的遺伝子ノックダウンマウスの作製が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）以下の（ａ−１）又は（ａ−２）の塩基配列：
（ａ−１）目的遺伝子の全部若しくは一部をコードする塩基配列、又は
（ａ−２）（ａ−１）の塩基配列に対し相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡをコードする塩基配列；
（ｂ）（ａ）の塩基配列に対し相補的であり、かつ逆配向の塩基配列；及び
（ｃ）ループ領域をコードし、上記（ａ）の塩基配列と（ｂ）の塩基配列とを連結する配列；
を含み、それらがＲＮＡに転写された際に、ステム・ループ構造を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓ−ＲＮＡ）が形成されることを特徴とする、二本鎖ＲＮＡ発現ベクターである。
上記二本鎖ＲＮＡ発現ベクターは、さらにポリメラーゼＩＩ系プロモーター又は発生過程特異的プロモーターを含むことが好ましく、かかるプロモーターとしては、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期遺伝子プロモーターが挙げられる。
また上記二本鎖ＲＮＡ発現ベクターは、さらに（ａ）〜（ｃ）の塩基配列の上流に自己触媒的にＲＮＡを切断する配列、例えば限定するものではないが、リボザイム部位を含むことが好ましい。
上記二本鎖ＲＮＡ発現ベクターはまた、さらに（ａ）〜（ｃ）の塩基配列の下流にＲＮＡポリメラーゼを停止させる配列、例えば限定するものではないが、ＭＡＺドメイン配列を含むことが好ましい。
上記二本鎖ＲＮＡ発現ベクターにおいて、（ｃ）の塩基配列としては、例えば、配列番号２、５又は６に示す配列が挙げられる。
上記二本鎖ＲＮＡ発現ベクターにおいて、目的遺伝子としては、例えば疾患関連遺伝子、より具体的にはＳｋｉ遺伝子が挙げられる。また目的遺伝子の一部としては、Ｓｋｉ遺伝子の５’側５４０ｂｐの部分とすることができる。
また本発明は、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを発現することを特徴とする目的遺伝子ノックダウン動物である。上記目的遺伝子ノックダウン動物は、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを組織特異的に発現することが好ましい。
また上記目的遺伝子ノックダウン動物は、例えば上記の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが導入された、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを発現するトランスジェニック動物又はその子孫である。
例えば、目的遺伝子が疾患関連遺伝子である場合には、目的遺伝子ノックダウン動物は疾患モデル動物となりうる。ここで、目的遺伝子としてＳｋｉ遺伝子を選択した場合には、該目的遺伝子ノックダウン動物は、神経管閉塞異常、虹彩形成異常、及び頭部での出血からなる群より選択される疾患を呈する疾患モデル動物となりうる。
上記目的遺伝子ノックアウト動物の動物としては、限定されるものではないが、マウスが挙げられる。
さらに本発明は、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを発現する二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入し、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを形成させることを特徴とする、目的遺伝子ノックダウン動物の作出方法である。
上記作出方法においては、上記いずれかの二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを使用することが好ましい。
また、目的遺伝子として疾患関連遺伝子を選択した場合には、目的遺伝子ノックダウン動物として疾患モデル動物が作出されうる。例えば、目的遺伝子としてＳｋｉ遺伝子を選択した場合には、神経管閉塞異常、虹彩形成異常、及び頭部での出血からなる群より選択される疾患を呈する疾患モデル動物が作出されうる。
上記作出方法においては、動物が、限定されるものではないが、マウスであることが好ましい。
またさらに本発明は、上記いずれかの二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが導入されている動物細胞である。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ及びＢは、Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクターの構造（図１Ａ）、及びＳｋｉ二本鎖ＲＮＡをコードする領域（図１Ｂ）を模式的に示す図である。
図２は、構築した種々のプラスミドから転写されるＲＮＡの推定二次構造を示す図である。
図３Ａ及びＢは、Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入した培養細胞内におけるＳｋｉタンパク質レベルの低下を示すウエスタンブロット解析の結果を示す写真である。
図４は、種々の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞における、核及び細胞質内に存在するＲＮＡレベルを示すノーザンブロットの結果を示す写真である。
図５は、核における長鎖ｄｓ−ＲＮＡの発現がｅＩＦ２αのリン酸化には影響を及ぼさないことを示す写真である。
図６Ａは、Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクターによるＳｋｉ ｍＲＮＡの分解を示すＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真である。
図６Ｂは、Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクターによるＳｋｉ ｍＲＮＡの分解を経時的に分析したＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
図７Ａ〜Ｃは、二本鎖ＲＮＡ発現ベクターから発現された長鎖二本鎖ＲＮＡがルシフェラーゼ活性に及ぼす影響を示す図である。図７Ａは、ホタルルシフェラーゼ（Ｐｐ−ｌｕｃ）活性を任意発光単位（ａ．ｕ．）でプロットした図である。図７Ｂは、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｒ−ｌｕｃ）活性を任意発光単位でプロットした図である。図７Ｃは、正規化した標的対対照ルシフェラーゼ比を示す図である。
図８Ａは、Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが導入されたトランスジェニックマウス胚における導入遺伝子の存在を示すサザンブロット分析の結果を示す写真である。
図８Ｂは、Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが導入されたトランスジェニックマウス胚におけるｓｉＲＮＡの存在を示すノーザンブロット分析の結果を示す写真である。
図９は、Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが導入されたトランスジェニックマウスにおける神経管閉塞異常を示す写真である。
図１０は、Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが導入されたトランスジェニックマウスにおける眼の虹彩形成異常を示す写真である。
図１１は、Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが導入されたトランスジェニックマウスにおける頭部の出血を示す写真である。
図１２Ａ〜Ｇは、Ｓｋｉ ｍＲＮＡの欠損により引き起こされるＳｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクター導入トランスジェニックマウスの異常を示す写真である。
図１２Ａは、頭部切片のヘマトキシリン−エオジン染色を示す。
図１２Ｂ及びＣは、ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検出された中脳及び間葉組織におけるＳｋｉ ｍＲＮＡ発現（図１２Ｂ）及びＯｄｃ ｍＲＮＡ発現（図１２Ｃ）を示す。
図１２Ｄは、中脳及び間葉組織の神経上皮を用いたＴＵＮＥＬアッセイにより評価したアポトーシス細胞を示す。
図１２Ｅは、眼のヘマトキシリン−エオジン染色を示す。
図１２Ｆは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検出した眼におけるＳｋｉ ｍＲＮＡ発現を示す。
図１２Ｇは、眼を用いたＴＵＮＥＬアッセイの結果を示す。
図１２Ａ〜Ｇにおいて、ａは野生型マウス、ｂはｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌを導入したトランスジェニックマウス、ｃはｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉを導入したトランスジェニックマウス、ｄはＳｋｉ欠損マウス（Ｓｋｉ−／−）を示す。また、また、図１２Ａ及びＥにおける「ＭＢ」は中脳、「ＩＩ」は第二脳室、「ＩＩＩ」は第三脳室、「Ｏ」は眼杯、「Ｌ」は水晶体胞を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００２年１０月２９日に出願された日本国特許出願第２００２−３１４７６４号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
本発明は、ＲＮＡ干渉を利用して目的遺伝子をノックダウンしたトランスジェニック動物に関し、そのトランスジェニック動物を簡便かつ迅速に作出するためのツール（二本鎖ＲＮＡ発現ベクター）及び方法を提供するものである。
本発明者は、ＲＮＡ干渉を利用してトランスジェニック動物を作出するにあたり、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを特異的な組織で発現させるために、適切な二本鎖ＲＮＡの長さ、適切なプロモーターなどを選択することが重要であると考えた。このため、変異マウスの表現型が詳細に解析されている転写因子Ｓｋｉを選択して実験を行い、トランスジェニック動物における二本鎖ＲＮＡの発現を確認した。またＳｋｉの変異は胎仔の段階で種々の形態異常を示すことが知られているため、二本鎖ＲＮＡの発現及び形成により目的遺伝子がノックダウンされているか否かを発生初期の段階で解析することができた。
以下に本発明に係る目的遺伝子ノックダウン動物及び疾患モデル動物、並びにその作出方法などについて記載する。
１．ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）
ＲＮＡ干渉とは、二本鎖を形成しているＲＮＡ（以下、「二本鎖ＲＮＡ」又は「ｄｓ−ＲＮＡ」ともいう）が細胞内に存在する場合に、そのＲＮＡの塩基配列に相同的な内在性のｍＲＮＡが分解されて、結果としてその細胞での遺伝子発現が特異的に抑制される現象であり、ＲＮＡインターフェアランス、ＲＮＡｉとも称される。このＲＮＡ干渉は、最初に線虫で報告され、その後ショウジョウバエ、植物、哺乳動物細胞などにおいても確認されている。例えばショウジョウバエにおいては、ヘアピン型の二本鎖ＲＮＡを作製し、これが細胞内で二本鎖ＲＮＡとして認識されて、内在性のｍＲＮＡが分解・破壊されるという手法が知られている。このヘアピン型の二本鎖ＲＮＡによりコードされる遺伝子を任意のものに設定することによって、任意の遺伝子をノックダウンすることができる。しかしながら哺乳動物個体におけるＲＮＡ干渉の機構に関してはまだ未知の部分が多く、現在は試行錯誤によるものであって一般的な手法としては確立されていない。また哺乳動物個体において二本鎖ＲＮＡを発現させようとする場合、位置効果などにより必ずしもＲＮＡ干渉が達成されるものではなかった。さらに特に長い二本鎖ＲＮＡを動物細胞で発現させた場合には、配列非特異的にタンパク質の合成が阻害されたり、インターフェロンを誘導する経路が活性化されたりすることが報告されている。
２．二本鎖ＲＮＡ発現ベクターの構築
本発明に係る二本鎖ＲＮＡ発現ベクター（以下、「本ベクター」ともいう）は、上記ＲＮＡ干渉を行うために必要な、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡが発現・形成されるように動物細胞及び個体に導入することができる。本発明において「発現」とは、例えば二本鎖ＲＮＡを例として説明した場合、二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡが、二本鎖ＲＮＡを形成するようなｍＲＮＡに転写されることを指す。また一般的には「発現」とは、遺伝子をコードするＤＮＡがｍＲＮＡに転写されて、さらにｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されることを指し、本発明においては上記両者を意味するものとする。さらに「目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡ」とは、目的遺伝子に対してＲＮＡ干渉を引き起こす二本鎖ＲＮＡを指し、具体的には、目的遺伝子に対し相同的な配列を有する二本鎖ＲＮＡのことをいう。この目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡは、本ベクター上において以下の（ａ）〜（ｃ）の塩基配列：
（ａ）以下の（ａ−１）又は（ａ−２）の塩基配列：
（ａ−１）目的遺伝子の全部若しくは一部をコードする塩基配列、又は
（ａ−２）（ａ−１）の塩基配列に対し相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡをコードする塩基配列；
（ｂ）（ａ）の塩基配列に対し相補的であり、かつ逆配向の塩基配列；及び
（ｃ）ループ領域をコードし、上記（ａ）の塩基配列と（ｂ）の塩基配列とを連結する配列；
によりコードされ、それらがＲＮＡに転写された際に、ステム・ループ構造を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓ−ＲＮＡ）が形成される。本発明において「ステム・ループ構造」とは、相補性により二本鎖を形成しているステム領域と、その二本鎖を連結しているが一本鎖のループ状の形態をとるループ領域とからなる構造であり、この構造は分子生物学においては周知である。
上記（ａ）の塩基配列は、ノックダウン対象の目的遺伝子の全部若しくは一部をコードする塩基配列である（ａ−１）。目的遺伝子とは、ＲＮＡ干渉を利用してノックダウンさせようとする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、疾患に関連すると推測される遺伝子、その他の機能に関連すると推測される遺伝子、その他の研究対象の遺伝子などのあらゆるものを目的遺伝子として取り上げることができる。具体的な目的遺伝子の例としては、限定するものではないが、Ｓｋｉ遺伝子、その他の転写因子、癌関連遺伝子などが挙げられる。
Ｓｋｉ遺伝子は、最初に発癌遺伝子として同定され、最近になって転写コリプレッサーとして機能することが明らかにされている（Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３：４１２−４２３，１９９９）。転写コリプレッサーは種々のリプレッサーに結合して転写抑制を引き起こす因子である。その１種であるＳｋｉは、様々な発生段階において重要な役割を果たしている。Ｓｋｉ遺伝子は、ヒト、マウス、カエル、ハエなどから単離され、その塩基配列は公知となっており、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている（登録番号：ヒト（Ｘ１５２１８）、マウス（ＡＦ４３５８５２）、カエル（Ｘ６８６８３）、ハエ（ＮＴ＿０３３７７８））。
本発明においては、そのような登録されている塩基配列情報に基づいて（ａ）の配列を設計することができる。あるいは、二本鎖ＲＮＡ発現ベクターに導入することが可能であれば、全ての配列が知られている必要はなく、当業者であれば公知の手法に基づいて（ａ）の配列を有するＤＮＡを調製することができる。目的遺伝子の「一部」とは、ＲＮＡ干渉を利用して当該遺伝子をノックダウンできる程度の長さの配列を指し、例えば、５００〜１０００ｂｐ、好ましくは５００〜７００ｂｐのものである。ここでＳｋｉ遺伝子を用いる場合には、例えばＳｋｉタンパク質のＮ末端領域に相当する約５００〜１０００ｂｐの配列が好ましい。特に本発明においては、（ａ）の塩基配列として、Ｓｋｉ遺伝子の５’側５４０ｂｐの配列（配列番号１）を用いることが好ましい。配列番号１は、マウスＳｋｉ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ４３５８５２）に基づくものであり、その塩基配列１〜５４０番に相当する。本ベクターでは、約５００〜１０００ｂｐという長鎖の二本鎖ＲＮＡを発現させ、ＲＮＡ干渉を引き起こすことが可能である。従って、従来のｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ）を利用する場合のように、特異的に内在性ＲＮＡを分解するための領域（約２０〜３０ｂｐ）を選択する必要はなく、簡便かつ容易に二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを構築することが可能となる。
また（ａ）の塩基配列としては、目的遺伝子の全部若しくは一部をコードする塩基配列に対し相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列も含まれる（ａ−２）。このような塩基配列であっても、目的遺伝子に対してある程度の相同性を有するものであればＲＮＡ干渉を行うことは可能である。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性（相同性が６０％以上、好ましくは８０％以上）を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、ナトリウム濃度が１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭであり、温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃での条件をいう。
（ｂ）の塩基配列は、上述した（ａ）の塩基配列に対し相補的であり、かつ逆配向の塩基配列である。ここで「相補的」とは、厳密な相補性を指すものではなく、（ａ）の塩基配列と相補性により二本鎖を形成できる程度であればよい。また「逆配向」とは、ベクターに挿入されている配列の向きに関するものであり、例えば（ａ）の塩基配列がＡＴＣＧＡＧＴＣで挿入されている場合には、（ｂ）の塩基配列はＧＡＣＴＣＧＡＴで挿入されることとなる。
（ｃ）の塩基配列は、ループ領域をコードするものであり、また上記（ａ）の塩基配列と（ｂ）の塩基配列とを連結する。「ループ領域」とは、その領域の塩基配列が相補性などにより自己会合せずに一本鎖のループのような状態となる塩基配列部分を指し、このようなループ領域をコードする塩基配列の設計手法は当技術分野で周知である。ループ領域の長さは、約６〜１５ｂｐ、好ましくは約１２ｂｐである。本発明において好ましい（ｃ）の塩基配列を配列番号２、５及び６に示す。しかし、本発明において利用可能な配列はこれに限定されるものではない。
上記（ａ）〜（ｃ）の塩基配列は、図１Ｂに示すように（ｃ）の塩基配列を中心として連結されている。従って、これらの配列は、ＲＮＡに転写された際に、（ａ）及び（ｂ）の塩基配列が相補性により自己会合することによって、ステム・ループ構造を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓ−ＲＮＡ）を形成することになる。この二本鎖ＲＮＡが目的遺伝子に対しＲＮＡ干渉を引き起こす。
また本ベクターには、上記二本鎖ＲＮＡの領域の配列が転写されて二本鎖ＲＮＡが形成されるように、プロモーター及び／又はその他の制御配列を機能しうる形で連結して挿入してもよい。「機能しうる形で連結して挿入する」とは、本ベクターが導入される細胞又はトランスジェニック動物において、プロモーター及び／又はその他の制御配列の制御下に上記目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡが発現・形成されて内在性の目的遺伝子のｍＲＮＡが破壊・分解されるように、プロモーター及び／又はその他の制御配列を連結してベクターに組み込むことを意味する。本ベクターに組み込むことが可能なプロモーター及び／又は制御配列は特に限定されるものではなく、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、時期特異的プロモーター、その他の調節エレメントなど、当技術分野で公知のプロモーター及び／又は制御配列を、ノックダウン対象の動物、ノックダウン対象の目的遺伝子の性質などの複数の条件に応じて適宜選択することができる。本発明においては、ポリメラーゼＩＩ系のプロモーターを使用することが好ましい。ポリメラーゼＩＩ系プロモーターは、組織特異的発現を誘導するため、個体における組織特異的な二本鎖ＲＮＡの発現を達成することができるためである。
例えばＳｋｉ遺伝子をノックダウンさせた疾患モデル動物を作出する場合、Ｓｋｉ遺伝子に関連する疾患は発生過程において発症することが知られているため、本ベクターに組み込むプロモーターとしては、例えば発生過程特異的プロモーターを用いることが好ましい。
発生過程特異的プロモーターとは、本発明においては発生過程において特異的に発現することが示されたプロモーターを指す。このようなプロモーターは当技術分野で周知であり、例えば限定するものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期遺伝子プロモーター、インスリン遺伝子プロモーター、Ｌｃｋ遺伝子プロモーター、ＣＤ１９遺伝子プロモーター、Ｎｅｓｔｉｎ遺伝子プロモーターなどが挙げられる。上記例示したプロモーターは、当技術分野で公知であり、当業者であればその配列情報などを容易に入手できる。
さらに、動物細胞においては二本鎖ＲＮＡが核から細胞質に運搬される際に種々のｍＲＮＡの翻訳を阻害したり、二本鎖ＲＮＡ依存的なキナーゼを活性化する可能性がある。このような問題を防ぐために、本ベクターには、自己触媒的にＲＮＡを切断する配列及び／又はＲＮＡポリメラーゼを停止させる配列を連結してもよい。自己触媒的にＲＮＡを切断する配列とは、その配列部位において自己触媒的に切断されうる配列を意味し、より具体的にはリボザイム機能によって自己切断される配列である（Ｈｕａｎｇ．Ｙ．，Ｍｏ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６：１５３４−１５４２，１９９６）。自己触媒的にＲＮＡを切断する配列の塩基配列は、当業者であれば容易に設計することができ、例えば限定するものではないが、任意のリボザイム配列、例えば配列番号３に示す配列が挙げられる。ｍＲＮＡの細胞質への移行には５’末端のキャップ構造が重要であるため（ＭｃＫｅｎｄｒｉｃｋ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２１：３６３２−３６４１，２００１）、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡの転写開始点のすぐ下流に自己触媒的にＲＮＡを切断する配列を挿入し、転写によって合成された二本鎖ＲＮＡからキャップ構造を取り除くことによって上記問題を回避することができる。自己触媒的にＲＮＡを切断する配列の存在により、転写された二本鎖ＲＮＡは自己触媒的にこの配列の部位で切断され、キャップ構造が除去される。
またＲＮＡポリメラーゼを停止させる配列とは、ＲＮＡポリメラーゼを鋳型ＤＮＡ上で停止させて転写を停止させる配列を意味し、具体的には転写因子が結合する配列である（Ｙｏｎａｈａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ３：５９３−６００，１９９９；Ｙｏｎａｈａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９：３７７０−３７７７，２０００）。このＲＮＡポリメラーゼを停止させる配列もまた当業者であれば容易に設計することができ、例えば限定するものではないが、転写因子ＭＡＺドメイン配列が挙げられる。このＭＡＺドメインの配列の一例を配列番号４に示すが、これに限定されるものではない。ｍＲＮＡの細胞質への移行には３’末端のポリ（Ａ）鎖が重要であり（Ｈｕａｎｇ．Ｙ．，前掲）、ポリ（Ａ）の存在によりｍＲＮＡは細胞質へ移行する。しかし本発明においては、転写されて形成された二本鎖ＲＮＡを核内に保持させ、ＲＮＡ干渉を引き起こす必要がある。そこでポリ（Ａ）を除去すればこの問題は解決するが、一般的にポリ（Ａ）付加シグナルは転写の終結に必要である。従って本発明者は、ベクター上のポリ（Ａ）付加シグナルを除き、代わりに、転写を停止させる配列（ＭＡＺドメイン配列など）を挿入することによって上記問題を回避することができると考えた。ＲＮＡポリメラーゼを停止させる配列の存在により、二本鎖ＲＮＡの転写は該配列の部位で停止し、合成される二本鎖ＲＮＡにはポリ（Ａ）鎖は付加されない。
適当なベクターに上記構成要素を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等が採用される。上記構成要素のＤＮＡは、当技術分野で公知の手法により合成し、精製することができる。
本ベクターとして利用しうるベクターとしては、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、酵母人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ、Ｐ１ファージ由来人工染色体（ＰＡＣ）ＤＮＡなどが挙げられるが、特に長さが短いｐＵＣ系プラスミド（例えば１〜３ｋｂｐ程度）が好ましい。
このようにして作製されたベクターは、細胞、組織及び／又は個体に導入することにより目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡの発現及び形成を導くものであり、これが内在性の目的遺伝子のｍＲＮＡを破壊・分解する。本明細書においては、本ベクターを、ｐＤＥＣＡＰベクター（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｐ ｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｌｙ（Ａ））と称する。
本二本鎖ＲＮＡ発現ベクターによって、特定の内在性遺伝子によりコードさせる遺伝子産物の発現を、好ましくは組織特異的に抑制することができる。従って、本二本鎖ＲＮＡ発現ベクターは、遺伝子の機能解析、遺伝子治療などの種々の用途において有用である。
３．二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが導入された細胞
本発明においては、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを発現する二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを細胞に導入することができ、それにより目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを該細胞において発現させることができる。目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡの形成により内在性の目的遺伝子のｍＲＮＡが破壊されることとなるため、目的遺伝子の発現を抑制することが可能である。
二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入する細胞は、特に限定されるものではないが、動物細胞が好ましく、例えば、ヒト、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、ラット等が挙げられる。
細胞への二本鎖ＲＮＡ発現ベクターの導入方法は、特に限定されるものではなく、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
以上のように作製された細胞は、目的遺伝子の発現を抑制するものであるため、遺伝子機能の解析、ｅｘ ｖｉｖｏでの目的遺伝子の発現抑制に有用である。
４．トランスジェニック動物（目的遺伝子ノックダウン動物）の作出
本発明に係る目的遺伝子ノックダウン動物（トランスジェニック動物）は、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを有することを特徴とするものであり、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡの形成により内在性の目的遺伝子のｍＲＮＡが破壊されているものである。このトランスジェニック動物は、上記構築された二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを動物細胞に導入し、該動物細胞を成長させることにより作出することができる。このようにして作出されたトランスジェニック動物は、二本鎖ＲＮＡの存在によって内在性目的遺伝子のｍＲＮＡが破壊・分解されることにより目的遺伝子がノックダウンされている。本発明において「内在性」とは、本ベクターの導入対象となる細胞及び／又は個体において天然であるもの、並びに本ベクター導入以前から存在することを指す。また本発明において「ノックダウン」とは、遺伝子産物（例えばタンパク質）の発現を欠損させることを指す。本二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入する対象となる動物は、哺乳動物であれば特に限定されず、例えば、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、ラット等が挙げられる。本発明においては、疾患モデル動物として扱いやすいマウス、ラット等が好ましい。
本ベクターを動物細胞に導入するには、上記対象動物の受精卵に注入することが好ましい。その結果、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡをコードする配列とその制御配列が受精卵の細胞に組み込まれ、その後の受精卵の分裂に伴って、全身の細胞に二本鎖ＲＮＡをコードする配列とその制御配列がコピーされる。
動物細胞への遺伝子の導入方法としては、受精卵へのマイクロインジェクション法の他に、ＥＳ細胞へ導入する方法、培養細胞へ導入した細胞核を核移植により受精卵に導入する方法などが挙げられる。本ベクターのＤＮＡを、エレクトロポレーション、リポフェクション法等によりＥＳ細胞又は他の培養細胞に導入し、ネオマイシン、プロマイシン等でポジティブ選別した後、目的の導入細胞を得る。ＥＳ細胞は、胚胎盤胞又は８細胞期胚に毛細管等を用いて注入する。核移植は、ＤＮＡが導入された細胞を核を取り除いた受精卵に注入し、電気刺激で細胞融合することにより行われる。
その後、胚胎盤胞又は８細胞期胚を直接仮親の卵管に移植するか、一日培養して胚盤胞まで発生したものを仮親の子宮に移植する。仮親を飼育出産させて、目的の二本鎖ＲＮＡが導入された子であるトランスジェニック動物（キメラ動物）を得る。当該動物中における所望の二本鎖ＲＮＡの発現を確認するには、当該動物の体の一部（例えば尾部先端）を切断し、体細胞中のＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法やサザンブロット法などにより導入した配列の存在を確認する。導入した配列の存在が確認された個体を初代とすれば、二本鎖ＲＮＡはその子（Ｆ１）の５０％に伝達される。すなわち、このトランスジェニック動物と正常動物との交配により、ヘテロ接合体動物（Ｆ１）が得られ、ヘテロ接合体同士の交配によりホモ接合体動物（Ｆ２）を得ることができる。さらに、同種の動物との交配を繰り返すことにより、目的遺伝子ノックダウン動物の子孫を得ることもできる。
このようにして特定の目的遺伝子がノックダウンされたトランスジェニック動物は、以下に記載するように疾患モデル動物、遺伝子解析用の動物などとして有用である。
５．疾患モデル動物
上述のようにして作出されたトランスジェニック動物は、目的遺伝子のノックダウン（変異）により、いくつかの疾患を示すモデル動物（疾患モデル動物）として利用できる可能性がある。例えばＳｋｉ遺伝子をノックダウンさせたトランスジェニック動物は、神経管の閉塞異常（Ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ ｃｌｏｓｕｒｅ ｄｅｆｅｃｔ）、眼の虹彩形成異常、及び頭部での出血を呈する。頭部における出血は、本発明者により初めて見出されたものである。従って、本疾患モデル動物は、そのような疾患の研究、疾患の治療開発などにおいて有用である。
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓ−ＲＮＡ）発現ベクターの作製
ヘアピン型ＲＮＡ（すなわち、自己相補性ステムループを有するＲＮＡ）を発現するプラスミドは、図１Ａに示すように、プラスミドｐＤＥＣＡＰ（下記参照）に、Ｓｋｉ遺伝子のコード領域の５’側５４０ｂｐ（配列番号１）を挿入し、その下流に下記の配列番号２に示す１２ｂｐのスペーサー（ループ領域）を挟んで、上記５４０ｂｐの配列に対し相補的な配列を逆向きに挿入することにより構築し、ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉとした。
スペーサーの配列：
ｐＤＥＣＡＰは、ＣＭＶプロモーターを有するｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に、自己触媒的にＲＮＡを切断する配列として転写されたＲＮＡの５’末端におけるキャップ構造を除去するリボザイムカセット（配列番号３；Ｈｕａｎｇ，Ｙ．ａｎｄ Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，ＧＣ，１９９６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６：１５３４−１５４２）、及びＲＮＡポリメラーゼＩＩの転写を停止させる配列としてＭＡＺドメイン（配列番号４；Ｙｏｎａｈａ，Ｍ．ａｎｄ Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，ＮＪ，１９９９，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ３：５９３−６００）を含有するものである。またこの構築物上にポリ（Ａ）付加シグナルはない。
この発現ベクターから転写されるｍＲＮＡは、１２ｂｐのスペーサー部分がループとなったステム・ループ構造を形成し、Ｓｋｉ ｍＲＮＡの配列をもつｄｓ−ＲＮＡとなる。
また、上記と同様にして、ホタルルシフェラーゼ遺伝子のコード領域の最初の５１８ｂｐの配列、又はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基４４３〜９４４の配列と、１２ｂｐのスペーサー（それぞれ配列番号５又は６）を挟んで、上記配列に対し相補的な配列を逆向きに挿入することにより、それぞれホタルルシフェラーゼを標的とするｄｓ−ＲＮＡ発現ベクター（ｐＤＥＣＡＰ−Ｌｕｃ）及びβ−ガラクトシダーゼを標的とするｄｓ−ＲＮＡ発現ベクター（ｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌ）を構築した。
上記のように構築した、逆向き反復配列を含むｐＤＥＣＡＰプラスミドは、逆向き反復配列を含むＤＮＡを正確に複製するために大腸菌Ｓｕｒｅ２株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において増幅させ、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。
また、ホタルルシフェラーゼのセンスＲＮＡを発現するよう構築されたプラスミド（ｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｃＳ）及びホタルルシフェラーゼのアンチセンスＲＮＡを発現するよう構築されたプラスミド（ｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｃＡＳ）、５’キャップ構造及びポリ（Ａ）テイルを含むホタルルシフェラーゼのＲＮＡを発現するよう構築された通常のプラスミド（ｐＣＭＶ−ＬｕｃＳ）、並びに、５’キャップ構造及びポリ（Ａ）テイルを含み、かつβ−ガラクトシダーゼの二本鎖ＲＮＡを発現するように構築されたプラスミド（ｐＣＭＶ−ｇａｌｉ）を調製した。
上述のようにして構築したプラスミドから転写されるＲＮＡの推定二次構造を図２に示す。ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉ、ｐＤＥＣＡＰ−Ｌｕｃ、及びｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌは、５’キャップ構造とポリ（Ａ）テイルを欠損する、Ｓｋｉ、ホタルルシフェラーゼ、及びβ−ガラクトシダーゼの５４０〜５０２ｂｐのヘアピンｄｓ−ＲＮＡをそれぞれコードする。ｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｃＳ及びｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｃＡＳからの転写産物は、それぞれルシフェラーゼ遺伝子のセンス及びアンチセンス一本鎖ＲＮＡである。ｐＣＭＶ−ｇａｌｉは、ｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌと同じヘアピンｄｓ−ＲＮＡをコードするが、５’キャップ構造、スプライシングイントロン及びポリ（Ａ）テイルを含む。
〔実施例２〕Ｓｋｉ ｄｓ−ＲＮＡ発現ベクターによるＳｋｉ発現量の低下
本実施例においては、Ｓｋｉ ｄｓ−ＲＮＡ発現ベクターが培養細胞におけるＳｋｉタンパク質レベルに及ぼす影響を調べた。
（１）サザンブロッティング
ヒト腎由来の２９３Ｔ細胞は、１０％ＦＢＳ及び抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で培養した。上記実施例１において作製したｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉプラスミド及び内部対照として０．０５μｇのＴＫ−Ｌｕｃ（ホタルルシフェラーゼ発現ベクターＰｒｏｍｅｇａ社製）を用いてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）により２９３Ｔ細胞（４×１０５）をトランスフェクトした。４２時間経過後、細胞をＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）に溶解し、細胞抽出物のアリコートをルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に使用して、トランスフェクション効率を評価した。
残りの細胞ペレットをＲＩＰＡ溶解バッファー（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １％，デオキシコール酸ナトリウム １％，ＳＤＳ ０．１％，ＮａＣｌ ０．１５Ｍ，リン酸ナトリウム ｐＨ７．２ ０．０１Ｍ，トラジロール １％）に再懸濁し、ルシフェラーゼアッセイの結果に従って調整した。抗Ｓｋｉモノクローナル抗体１−１、９−１、１１−１及び１６−１（Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，前掲）の混合物を用いて、イムノブロット（ウェスタンブロッティング）をＳｈｉｎａｇａｗａら（Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ｔ，ｅｔ ａｌ．，２０００，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９：２２８０−２２９１）に記載されているように実施した。
ウェスタンブロッティングにより約９０ｋＤのＳｋｉタンパク質のバンドが検出される。マウスＳｋｉ発現ベクター（ｐａｃｔ−ｓｋｉ；Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３：４１２−４２３，１９９９）と共に種々の量のＳｋｉ ｄｓ−ＲＮＡ発現ベクター（ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉ）を導入して、同様にウェスタンブロッティングを行うと、Ｓｋｉタンパク質の量はｄｓ−ＲＮＡの量に依存して、低下した（図３Ａ）。
一方、ネガティブコントロールとして、実施例１において作製したｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌプラスミドを同様に、マウスＳｋｉ発現ベクター（ｐａｃｔ−ｓｋｉ）と共に２９３Ｔ細胞に導入し、Ｓｋｉ発現レベルを解析した。この場合にはＳｋｉタンパク質レベルの低下は見られなかった（図３Ａ）。以上の結果から、Ｓｋｉ ｄｓ−ＲＮＡは、動物の培養細胞内において、特異的にＳｋｉ発現レベルを低下させることが示された。
また、２９３Ｔ細胞に、ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉプラスミド及びｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌプラスミドをトランスフェクトし、内在性Ｓｋｉ及びＳｎｏタンパク質をイムノブロッティングにより検出した。ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉベクターを単独で２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした場合にも、内在性Ｓｋｉタンパク質レベルは低減した（図３Ｂ）。ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉの標的配列と約６０％の相同性を有するＳｎｏタンパク質の内在性レベルには変化が観察されなかった。
（２）ノーザンブロッティング
図２に示す種々の発現ベクター（ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉ、ｐＤＥＣＡＰ−Ｌｕｃ、ｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌ、ｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｃＳ、ｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｃＡＳ、ｐＣＭＶ−ＬｕｃＳ、ｐＣＭＶ−ｇａｌｉ）０．８μｇを用いてトランスフェクトした２９３Ｔ細胞から、その４８時間後に細胞質及び核ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの細胞小器官分布を、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＬｕｃＳ ＤＮＡプローブを用いたノーザンブロッティングにより分析した。
結果を図４に示す。図４の上の写真はノーザンブロッティングの結果を示し、下の写真はＲＮＡの量が各レーンにおいて同等であることを示すためのコントロールである。ｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｃＳから転写されたルシフェラーゼセンスＲＮＡの大部分は核内に存在したのに対し、ｐＣＭＶ−ＬｕｃＳから転写されたルシフェラーゼセンスＲＮＡは細胞質内に存在した。ｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｃＳからのルシフェラーゼ転写産物のサイズはプラスミドに挿入されたものと一致するため、長鎖ＲＮＡはポリ（Ａ）付加シグナルの欠損のためにリードスルー（ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈ）機構によって転写されたことが示唆される。ｐＤＥＣＡＰ−Ｌｕｃから転写された長鎖ＲＮＡは、ノーザンブロッティングにより細胞質でも核でも検出されなかったため、ｐＤＥＣＡＰ−Ｌｕｃから転写された長鎖ｄｓ−ＲＮＡは、すぐに消化切断されて短鎖ＲＮＡとなったことが示唆される。
（３）インターフェロン応答
ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉから発現されたＳｋｉ ｍＲＮＡがインターフェロン応答を誘導するかどうかを調べるために、ｄｓ−ＲＮＡにより活性化されるＰＫＲタンパク質キナーゼの基質であるｅＩＦ２αのリン酸化状態を試験した。２９３Ｔ細胞を、ｐＤＥＣＡＰ空プラスミド又はｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉプラスミド（０．６μｇ）と内部対照としてｐＣＭＶ−β−ｇａｌプラスミド（０．３μｇ）を用いて共トランスフェクトした。その４８時間後に細胞を回収し、Ｓｅｒ５１でリン酸化されたｅＩＦ２α（ｅＩＦ２α−Ｐ）に対するホスホ−特異的抗体を用いてイムノブロット分析を行った。同じ膜を、総ｅＩＦ２α及びβ−ガラクトシダーゼに対する抗体を用いて再度検出を行った。ポリ（Ｉ）・ポリ（Ｃ）（１００μｇ／ｍＬ）を用いて２４時間処理した２９３Ｔ細胞の溶解物を陽性対照として使用した。
結果を図５に示す。リン酸化ｅＩＦ２αのレベルはｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉを用いた２９３Ｔ細胞のトランスフェクションにより増強されなかったが、ｅＩＦ２αのリン酸化は、ポリ（Ｉ）・ポリ（Ｃ）で処理した対照細胞においては刺激された（図５）。従って、ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉを導入した細胞では、インターフェロン応答が誘導されなかったことが示された。
（４）ＲＴ−ＰＣＲ分析
内在性Ｓｋｉ ｍＲＮＡのレベルを調べるために、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。具体的には、ｐＤＥＣＡＰ空プラスミド、ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉプラスミド、及びｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌプラスミド（各１．５μｇ）を、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）発現プラスミド（ｐＭＳＣＶ−ｉｒ−ＥＧＦＰ）と共に２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＥＧＦＰ陽性細胞をセルソーティングにより回収し、アクチノマイシンＤで処理した。総ＲＮＡを種々の時点で単離し、Ｓｋｉ ｍＲＮＡ量をＲＴ−ＰＣＲにより分析した。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲルで分離し、エチジウムブロミド染色により可視化した。
その結果を図６Ａ及びＢに示す。図６Ａは、Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクターによるＳｋｉ ｍＲＮＡの分解を示すＲＴ−ＰＣＲの結果を示し、図６Ｂは、Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクターによるＳｋｉ ｍＲＮＡの分解を経時的に分析したＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。
ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉでのトランスフェクションにより、内在性Ｓｋｉ ｍＲＮＡのレベルが低減した（図６Ｂ）。このＳｋｉ ｍＲＮＡレベルの低減がＳｋｉ ｍＲＮＡの分解によるものであることを確認するため、転写阻害剤であるアクチノマイシンＤによるトランスフェクト細胞の処理後、種々の時点でＳｋｉ ｍＲＮＡレベルを測定した（図６Ｂ）。ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉプラスミドでトランスフェクトした細胞においては、内在性Ｓｋｉ ｍＲＮＡの半減期は０．９時間であり、β−ガラクトシダーゼｄｓ−ＲＮＡを発現するｐＤＥＣＡＰプラスミド（ｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌ）又は空のプラスミドでトランスフェクトした細胞においてはそれぞれ２．７時間及び３．１時間であった。従って、ｐＤＥＣＡＰベクターから発現されたＳｋｉ ｄｓ−ＲＮＡは、Ｓｋｉ ｍＲＮＡの分解を刺激することがわかった。
〔実施例３〕マウス胚性繊維芽細胞におけるルシフェラーゼアッセイ
マウス胚性繊維芽細胞を、１０％仔ウシ血清（ＦＢＳ）及び抗生物質を含むＤＭＥＭ中で培養した。０．５×１０５個の細胞を１２ウエルプレートに移し（１ｍＬ／ウエル）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用してホタルルシフェラーゼ（Ｐｐ−ｌｕｃ）発現プラスミド（ＴＫ−βＲＥｘ２−Ｌｕｃ；チミジンキナーゼプロモーターとβ−レチノイン酸受容体結合部位を含む）０．１μｇ、実施例１において構築したプラスミド（ｐＤＥＣＡＰ−ｓｋｉ、ｐＤＥＣＡＰ−Ｌｕｃ及びｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌ、ｐＣＭＶ−ｇａｌｉ、並びにｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｃＳ及びｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｃＡＳ）０．４μｇ、並びにウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｒ−ｌｕｃ）発現プラスミド（ｐＲＬ−ＣＭＶ、０．０２μｇ）をそれぞれトランスフェクトした。２４時間後、１μＭのａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸を添加してホタルルシフェラーゼ（Ｐｐ−ｌｕｃ）遺伝子の発現を誘導し、細胞をさらに３６時間培養した。続いて、二重ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼ発現をモニターした。
結果を図７Ａ〜Ｃに示す。図７Ａは、ホタルルシフェラーゼ（Ｐｐ−ｌｕｃ）活性を任意発光単位（ａ．ｕ．）でプロットした図を示す。図７Ｂは、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｒ−ｌｕｃ）活性を任意発光単位でプロットした図を示す。また図７Ｃは、正規化した標的対対照ルシフェラーゼ比を示す。
ホタルルシフェラーゼ（Ｐｐ−ｌｕｃ）レベルは、ホタルルシフェラーゼｄｓ−ＲＮＡを発現するｐＤＥＣＡＰプラスミド（ｐＤＥＣＡＰ−Ｌｕｃ）と共に共トランスフェクトした場合に約５分の１に低減した（図７Ａ）。一方、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｒ−ｌｕｃ）活性は影響を受けなかった（図７Ｂ）。また、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の同じ領域のセンスＲＮＡを発現するｐＤＥＣＡＰプラスミド（ｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｃＳ）と共トランスフェクトした場合にはホタルルシフェラーゼ活性に影響を及ぼさなかったが、同じ領域のアンチセンスＲＮＡを発現するｐＤＥＣＡＰプラスミド（ｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｓＡＳ）と共トランスフェクトした場合にはわずかな影響が観察された（約２５％の低減）。従って、この結果は、ｄｓ−ＲＮＡの構造がホタルルシフェラーゼ活性の効率的な阻害に重要であることを示している。さらに、ｐＤＥＣＡＰプラスミドからのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の５０２ｂｐ ｄｓ−ＲＮＡの共発現は、ホタル又はウミシイタケのルシフェラーゼ活性には影響を及ぼさなかったが、別のプラスミド（ｐＣＭＶ−ｇａｌｉ；ＣＭＶプロモーターを含むが、リボザイム及びＭＡＺドメインを含まない）からの５’キャップ構造、スプライシング部位及びポリ（Ａ）テイルを含むβ−ガラクトシダーゼのｄｓ−ＲＮＡの共発現では、両方のルシフェラーゼ活性の低減が観察された。この結果は、キャップ構造とポリ（Ａ）の除去が翻訳の非特異的阻害を抑制するために必要であることを示している。
〔実施例４〕Ｓｋｉ ｄｓ−ＲＮＡ発現ベクターを導入したトランスジェニックマウスの作出
（１）サザンブロッティング
ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉ又はｐＤＥＣＡＰ−ｇａｌｉにおける２．２ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をバックグラウンド配列から切り出し、精製して、マウス受精卵に注入した。マウス受精卵は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ雄マウスとＣ５７ＢＬ／６Ｎ又は（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×ＤＢＡ）Ｆ１雌マウス（いずれもクレア社より入手）との交配により得られたものである。導入遺伝子の存在とコピー数を分析するために、Ｓｋｉコード領域の最初の５４０ｂｐをプローブとして用いたサザンブロット分析により胚を分析した。サザンブロット分析に用いたゲノムＤＮＡは、胚体外組織から抽出した。結果を図８Ａに示す。図８Ａにおいて左側のレーンはｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉ導入トランスジェニックマウス、右側のレーンは野生型マウス（ＷＴ）の結果を示す。図８Ａより、トランスジェニックマウスは確かにＳｋｉのｄｓ−ＲＮＡ発現ベクターを有することがわかった。また、この導入遺伝子のコピー数は２〜１２コピーと推定された。
（２）ノーザンブロッティング
短鎖ＲＮＡがトランスジェニックマウス胚において生成されているか否かを調べるために、Ｓｋｉセンス鎖プローブを用いてノーザンブロッティングを行った。
トランスジェニックマウス胚の頭部から核ＲＮＡ（５μｇ）を抽出し、それをノーザンブロッティングにより分析した。膜は、標的配列に対応するＤＩＧ標識センスＳｋｉプローブを用いて検出した。膜上のメチレンブルーで染色されて可視化された５Ｓ ｒＲＮＡを図８Ｂ（下側）に示す。この結果は、ｐＤＥＣＡＰ−ｓｋｉを導入したトランスジェニックマウス胚においては約２１〜２２塩基の短鎖ＲＮＡが検出されたが、野生型マウス胚においては検出されなかったことを示す（図８Ｂ）。
（３）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
また、マウス胚について分析するために、Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン）を用いて胚の肢芽よりＲＮＡを単離した。導入遺伝子の発現は、以下に示すプライマー対、及び以下の配列を有するリボザイムカセットの３’末端における二重蛍光プローブを用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより調べた。
（プライマー対）
（プローブ）
このＲＴ−ＰＣＲの結果を下記表１に示す。表１中、導入遺伝子の発現量は、胚Ｎｏ．２５７を１．００とした場合の相対値として表す。
〔実施例５〕疾患モデルマウス
（１）神経管形成の異常
Ｓｋｉ変異マウスは神経管の閉塞異常（Ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ ｃｌｏｓｕｒｅ ｄｅｆｅｃｔ）が見られることがすでに報告されている（Ｂｅｒｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１１：２０２９−２０３９，１９９７）。本発明者は、Ｓｋｉ ｄｓ−ＲＮＡを発現するトランスジェニックマウスをＥ１０．５の時期に解析し、同様の神経管閉塞異常を呈することを観察した（図９）。図９の矢印で示すように、トランスジェニックマウス（ＴＧ）においては神経管が閉じていないことがわかる。１３匹のトランスジェニック胎仔のうち、５匹（３８．５％）が神経管閉塞異常を示した（上記表１も参照されたい）。ネガティブコントロールとして作製したβガラクトシダーゼｄｓ−ＲＮＡを発現するトランスジェニックマウス（９匹）では、神経管閉塞異常は観察されなかった。
（２）眼の形成異常
Ｓｋｉ変異マウスは眼の虹彩形成異常が見られることがすでに報告されている（Ｃｏｌｍｅｎａｒｅｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３０：１０６−１０９，２００２）。本発明者は、Ｓｋｉ ｄｓ−ＲＮＡを発現するトランスジェニックマウスをＥ１０．５の時期に解析し、同様の眼の虹彩形成異常が起きることを観察した（図１０）。図１０の矢印で示すように、トランスジェニックマウス（ＴＧ）においては眼の虹彩が部分的に欠損していることがわかる。２匹のトランスジェニック胎仔のうち、２匹（１００％）共が眼の虹彩形成異常を示した。ネガティブコントロールとして作製したβガラクトシダーゼｄｓ−ＲＮＡを発現するトランスジェニックマウス（９匹）では、眼の虹彩形成異常は観察されなかった。
（３）頭部での出血
本発明者は、Ｓｋｉ ｄｓ−ＲＮＡを発現するトランスジェニックマウスが頭部での出血を起こすことを観察した（図１１）。図１１において、トランスジェニックマウス（ＴＧ）及びｓｋｉ遺伝子変異マウス（ｓｋｉ−／−）は頭部出血を示している。従って、ｓｋｉ遺伝子変異マウスは、頭部出血のモデルマウスとして使用可能であることがわかる。
以上の（１）〜（３）の結果から、Ｓｋｉ ｄｓ−ＲＮＡ発現ベクターを導入したトランスジェニックマウスは、Ｓｋｉ変異マウスと同様の異常及び頭部出血を呈することが示された。通常トランスジェニックマウスの系においては、導入された遺伝子を持つ個体のうちの２０〜８０％の個体において、導入遺伝子効果が観察されると言われている。これは導入遺伝子が組み込まれた位置によっては、その遺伝子が発現されない場合があるからである（位置効果）。本発明者が作製したＳｋｉ ｄｓ−ＲＮＡ発現ベクターのトランスジェニックマウスでは、３８．５％の個体において、神経管閉塞異常が観察された。これは従来のトランスジェニックマウスの報告例から見て、妥当な割合といえる。
〔実施例６〕二本鎖ＲＮＡの導入と表現型発現の頻度
ＣＭＶプロモーターがマウス胚の種々の領域において活性を示すかどうかを確認するため、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるβ−ガラクトシダーゼ発現ベクター（ｐＣＭＶ−β−ｇａｌ）を含むトランスジェニックマウスを作製した。
その結果、ｐＣＭＶ−β−ｇａｌを含むトランスジェニックマウス胚６つのうち２つにおいては、Ｅ９〜Ｅ１２の時期においてそのほぼ全ての組織（神経上皮細胞を含む）でβ−ガラクトシダーゼの発現が確認された。この頻度（３３．３％、２／６）は、異常を示すｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉトランスジェニックマウス（実施例５）の場合と同様であり、注入ＤＮＡにより引き起こされる特定の表現型をしめすトランスジェニックマウスの平均頻度の範囲内（１０〜４０％）である。Ｅ１４〜Ｅ１６時期において眼異常を示すｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉトランスジェニックマウス胚において高頻度であった結果と一致して、β−ガラクトシダーゼ発現は、Ｅ１５時期におけるｐＣＭＶ−β−ｇａｌトランスジェニックマウス胚の種々の組織（眼を含む）において高頻度に観察された。
対照実験として、ｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌから調製した５０２塩基のβ−ガラクトシダーゼｄｓ−ＲＮＡの発現ユニットを含む断片を注入することにより、トランスジェニックマウスを作出した。このマウス胚９つを分析したところ、全てにおいて異常は観察されなかった（下記表２参照）。この結果は、ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉトランスジェニックマウスにおいて観察された異常が、Ｓｋｉ ｄｓ−ＲＮＡにより特異的に引き起こされたものであり、長鎖ｄｓ−ＲＮＡによる非特異的には引き起こされなかったことを示す。Ｓｋｉ欠損マウスの典型的な異常、すなわち神経管異常及び眼異常がｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉトランスジェニックマウスにおいてみられたが、Ｓｋｉ欠損マウスの軸後指過剰症などの他の異常は観察されなかった。これは、ＣＭＶプロモーターがある組織においては十分に活性を有しないことに起因する可能性がある。
〔実施例７〕トランスジェニックマウスにおける組織学的分析
トランスジェニックマウスにおける内因性Ｓｋｉ遺伝子の発現及びＲＮＡｉによる影響を調べるために、以下のように組織のヘマトキシリン−エオジン染色、ＲＮＡを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、及びＴＵＮＥＬ法を実施した。
ヘマトキシリン−エオジン染色は、サンプルを載せたスライドグラスを以下の手順で各溶液に浸し、処理した：
１）ヘマトキシリン溶液 室温３分
２）流水水洗
３）１％エオジン 室温７分
４）５０％エタノール 室温２秒７回
５）７０％エタノール 室温２秒７回
６）９０％エタノール 室温２秒７回
７）９５％エタノール 室温２秒７回
８）１００％エタノール 室温１５分
９）１００％エタノール 室温１５分
１０）１００％エタノール 室温１５分
１１）キシレン 室温１５分
１２）キシレン 室温１５分
１３）キシレン 室温１５分
１４）キシレンを蒸発乾燥後、スライドグラスに封入剤をのせ、カバーグラスをかぶせた。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、Ｂｕｔｌｅｒ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１年，第２３巻，ｐ．３０３−３１２）に記載の方法に従って行った。Ｓｋｉ ｍＲＮＡの検出には、Ｓｋｉ遺伝子の３’側半分をプローブとして使用した。具体的には、使用するｃ−Ｓｋｉ ３’プローブを調製するために、マウスｃ−Ｓｋｉ ｃＤＮＡの塩基７５４−２２２３の範囲のプラスミドをＢａｍＨＩを用いて線状化し、これをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて翻訳した。Ｏｄｃ遺伝子検出用のＯＤＣプローブは、既にＮｏｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．，１９９９年，第１３巻，ｐ．４１２−４２３）に記載されている。
また、ＴＵＮＥＬ法は、アポトーシスを研究するために、市販のアポトーシスキット（ｉｎ ｓｉｔｕ細胞死検出キット、Ｒｏｃｈｅ）を製造業者の指示に従って使用して実施した。
以上の実験結果を図１２Ａ〜Ｇに示す。図１２Ａ〜Ｇにおいて、ａは野生型マウス、ｂはｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌを導入したトランスジェニックマウス、ｃはｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉを導入したトランスジェニックマウス、ｄはＳｋｉ欠損マウス（Ｓｋｉ−／−）を示す。また、図１２Ａは、頭部切片のヘマトキシリン−エオジン染色を示す。図１２Ｂ及びＣは、ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検出された中脳及び間葉組織におけるＳｋｉ ｍＲＮＡ発現（図１２Ｂ）及びＯｄｃ ｍＲＮＡ発現（図１２Ｃ）を示す。図１２Ｄは、中脳及び間葉組織の神経上皮を用いたＴＵＮＥＬアッセイにより評価したアポトーシス細胞を示す。図１２Ｅは、眼のヘマトキシリン−エオジン染色を示す。図１２Ｆは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検出した眼におけるＳｋｉ ｍＲＮＡ発現を示す。図１２Ｇは、眼を用いたＴＵＮＥＬアッセイの結果を示す。また、図１２Ａ及びＥにおける「ＭＢ」は中脳、「ＩＩ」は第二脳室、「ＩＩＩ」は第三脳室、「Ｏ」は眼杯、「Ｌ」は水晶体胞を示す。
ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉ導入トランスジェニックマウス及びＳｋｉ欠損マウス（ＥＳ細胞における相同組換えにより作出したもの）の神経上皮細胞においては、Ｓｋｉ ｍＲＮＡが検出されなかった（図１２Ｂのｃ及びｄ）。対照的に、β−ｇａｌのｄｓ−ＲＮＡを導入したトランスジェニックマウス及び野生型マウスの神経上皮細胞においては、Ｓｋｉ ｍＲＮＡが発現されていた（図１２Ｂのａ及びｂ）。この結果は、ＲＴ−ＰＣＲでも確認した（データは示さない）。
Ｓｋｉ欠損マウスにおける神経管の閉塞異常は、オルニチンデカルボキシラーゼ（Ｏｄｃ）遺伝子の異所性発現と、その後の神経上皮細胞におけるアポトーシスによって起こる。その理由は、ＳｋｉがＯｄｃ遺伝子のＭａｄ媒介転写抑制に必要であることによる（Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．，１９９９年，第１３巻，ｐ．４１２−４２３）。同様のＯｄｃ遺伝子の異所性発現が、ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉ導入トランスジェニックマウス胚の神経上皮細胞においても観察された（図１２Ｃのｃ）。さらに、Ｏｄｃ発現レベルの高い領域においては、異所性アポトーシスが観察された（図１２Ｄのｃ及びｄ）。これらの結果によって、ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉ導入トランスジェニックマウスにおいて観察された神経管閉塞の異常が、ＥＳ細胞における相同組換えにより作出されたＳｋｉ欠損マウスにおける機構と同じ機構により引き起こされたことが示された。
眼の発達過程においては、所定の時間的順序で種々の網膜細胞型（網膜神経節細胞、錐体光受容細胞、無軸索細胞、杆体光受容細胞など）が網膜前駆体細胞から発生する（Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ｗ．，Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．，１９８５年，第２１２巻，ｐ．１９９−２０５）。野生型マウスの胚においては、Ｅ１０．５の時期で水晶体胞、眼杯、及び胚上皮においてＳｋｉ ｍＲＮＡが検出された（図１２Ｆのａ）。ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉ導入トランスジェニックマウス及びＳｋｉ欠損マウスの胚においては、上記領域におけるＳｋｉ ｍＲＮＡレベルは顕著に減少していた（図１２Ｆのｃ及びｄ）。この観察結果と一致して、ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉ導入トランスジェニックマウス及びＳｋｉ欠損マウスの水晶体胞及び胚上皮においては異所性アポトーシスが観察されたが（図１２Ｇのｃ及びｄ）、野生型マウスの胚においては観察されなかった（図１２Ｇのａ）。また、Ｓｋｉ欠損マウス胚においては眼杯の異所性アポトーシスが観察されたが、ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉ導入トランスジェニックマウス胚においては外観上観察されなかった。このことは、この領域においてはＳｋｉ ｍＲＮＡが低レベルで残存していることを示唆している。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、その全文を参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
本発明により、目的遺伝子がノックダウンされたトランスジェニック動物及びそのための二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが提供される。本トランスジェニック動物は、ＲＮＡ干渉を引き起こす二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを用いることにより、簡便かつ迅速に作出することができる。また例えばＳｋｉ遺伝子をノックダウンさせた本トランスジェニック動物は、いくつかの疾患を呈するためモデル動物として用いることが可能である。さらに本二本鎖ＲＮＡ発現ベクターは、ＲＮＡ干渉を効率的に行えるよう構築されており、位置効果をうけることなく目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを発現させ、目的遺伝子の発現を抑制することができるものである。
【配列表フリーテキスト】
配列番号２〜９：合成オリゴヌクレオチド
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【技術分野】
本発明は、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡの形成により内在性の目的遺伝子のｍＲＮＡが破壊されている、目的遺伝子ノックダウン動物及び疾患モデル動物、並びに該動物の作出方法に関する。また本発明は、該作出方法において用いる二本鎖ＲＮＡ発現ベクター、及び該ベクターを導入した動物細胞に関する。
【背景技術】
特異的な遺伝子の変異マウスは発生学などの基礎科学分野ばかりでなく、疾患モデルマウスとして応用科学分野においても重要な価値を持つ。種々の疾患の診断方法や治療薬の開発には疾患モデルマウスは大変有用である。現在一般的に用いられているＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製方法はＣａｐｅｃｃｈｉらの基礎的な研究によって開発された（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，ＭＲ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ），１９８９年，第２４４巻，ｐ．１２８８−１２９２（ｒｅｖｉｅｗ））。この方法では以下のような手順に従って、変異マウスが作製される。１）まず目的遺伝子のゲノムクローンを分離し、機能に必須なエキソン領域をネオマイシンなどの薬剤耐性遺伝子に置換したターゲティングベクターを作製する。２）このターゲティングベクターをＥＳ細胞にエレクトロポレーション法などにより導入し、相同組み換えによりＥＳ細胞の持つ遺伝子がターゲティングベクターによって置換された組換え細胞を分離する。３）この組み換え細胞を８細胞期胚に導入し、キメラマウスを作製する。４）キメラマウスのうちＥＳ細胞由来の生殖細胞が形成されているマウスを選別し、交配によってホモ変異マウスを得る。このように現在一般的に用いられている変異マウス作製方法は多くのステップを含むため、通常は１年程度の時間と多大な労力を必要とする。
最近ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）という現象が注目を浴びている。これはもともと線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、ショウジョウバエ、植物などで見出された現象で、特異的なｍＲＮＡの配列に対応する二本鎖ＲＮＡを細胞に導入すると、その細胞において転写されたｍＲＮＡが速やかに壊れる現象である（Ｈａｎｎｏｎ，ＧＪ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２年，第４１８巻，ｐ．２４４−２５１（ｒｅｖｉｅｗ）；特表２００２−５１６０６２号公報（ＷＯ９９／３２６１９号）；特表平８−５０６７３４号公報；特表２００２−５０７４１６号公報（ＷＯ９９／４９０２９号）；特表２００３−５１６１２４号公報（ＷＯ０１／２９０５８号）参照）。最近このＲＮＡ干渉は動物の培養細胞やマウス個体でも起きることが示されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ＳＭ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１年，第４１１巻，ｐ．４９４−４９８；ＭｃＣａｆｆｒｅｙ，ＡＰ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２年，第４１８巻，ｐ．３８−３９；特表２００２−５０２０１２号公報（ＷＯ００／４４８９５号）；特表２００３−５１４５３３号公報（ＷＯ０１／３６６４６号）参照）。これまでの一連の解析により、培養細胞などに導入した二本鎖ＲＮＡは約２２ヌクレオチドの小さなＲＮＡに分解され、これがｍＲＮＡにハイブリダイズすることによって、ｍＲＮＡの分解を誘導することが示されている（Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２００２年，第２０巻，ｐ．４４６−４４８；特表２００３−５２９３７４号公報（ＷＯ０１／７５１６４号）；ＷＯ０２／４４３２１号参照）。ショウジョウバエや線虫では長い二本鎖ＲＮＡによってｍＲＮＡの分解が誘導されることは多くの実験によって確認されている。一方、動物細胞においては、２０〜３０ヌクレオチドの短い二本鎖ＲＮＡによってｍＲＮＡの分解が誘導されることは確認されているが、長い二本鎖ＲＮＡは配列非特異的に多くのｍＲＮＡを壊すことも示唆されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ＳＭ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１年，第４１１巻，ｐ．４９４−４９８；国際特許出願ＷＯ００／１７５１６４号パンフレット）。
動物細胞におけるＲＮＡｉを実現させるため、ポリメラーゼＩＩＩ系を用いたｓｉＲＮＡ発現システムが多数報告されている（例えば、Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００２年，第２０巻，ｐ．４９７−５００；Ｈａｓｕｗａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２００２年，第５３２巻，ｐ．２２７−２３０）が、ＳｉＲＮＡを利用するＲＮＡｉは、発現を抑制させようとする標的部位の選択が難しく、現在その効果的な予測方法はない。また、ポリメラーゼＩＩＩ系プロモーターは全ての組織において機能を有するため、組織特異的にＲＮＡｉを達成することは不可能である。
一方、動物細胞におけるポリメラーゼＩＩ系を用いたＲＮＡｉでは、ウイルス感染などによってキナーゼが二本鎖ＲＮＡによって活性化され、インターフェロンシグナル伝達経路が活性化されることが指摘されている（Ｋａｕｆｍａｎ，ＲＪ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９９年，第９６巻，ｐ．１１６９３−１１６９５）。実際に上述したようなトランスジェニック動物を作製する過程において、特に長い二本鎖ＲＮＡを動物細胞において発現させた場合には、配列非特異的にタンパク質の合成が阻害され、またインターフェロンを誘導する経路が活性化されることも報告されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１年，第４１１巻，ｐ．４９４−４９８）。
従って、上述したような問題点を克服し、動物細胞におけるＲＮＡｉを効率的に達成することが現在の課題である。
【発明の開示】
本発明は、目的遺伝子がノックダウンされた動物を簡便かつ迅速に作出する方法及びそのツールを提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを特異的な組織で発現するトランスジェニック動物を作製することができれば、目的遺伝子のノックダウン動物を簡便かつ迅速に作製できると考えた。そこで本発明者は、目的遺伝子として転写因子Ｓｋｉを選択し、このＳｋｉ遺伝子のｍＲＮＡ配列に対応する５４０ｂｐの二本鎖ＲＮＡを発現するベクターを作製し、この発現ベクターを導入したトランスジェニックマウスを作製したところ、このトランスジェニックマウスが従来のＳｋｉ変異マウスと同様に、発生途中において形態形成異常や出血などの異常を示すことを確認した。そのような結果から、本発明者は、上記のように構築した発現ベクターを用いたＲＮＡ干渉を利用することによって、短時間で特異的に目的遺伝子ノックダウンマウスの作製が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）以下の（ａ−１）又は（ａ−２）の塩基配列：
（ａ−１）目的遺伝子の全部若しくは一部をコードする塩基配列、又は
（ａ−２）（ａ−１）の塩基配列に対し相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡをコードする塩基配列；
（ｂ）（ａ）の塩基配列に対し相補的であり、かつ逆配向の塩基配列；及び
（ｃ）ループ領域をコードし、上記（ａ）の塩基配列と（ｂ）の塩基配列とを連結する配列；
を含み、それらがＲＮＡに転写された際に、ステム・ループ構造を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓ−ＲＮＡ）が形成されることを特徴とする、二本鎖ＲＮＡ発現ベクターである。
上記二本鎖ＲＮＡ発現ベクターは、さらにポリメラーゼＩＩ系プロモーター又は発生過程特異的プロモーターを含むことが好ましく、かかるプロモーターとしては、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期遺伝子プロモーターが挙げられる。
また上記二本鎖ＲＮＡ発現ベクターは、さらに（ａ）〜（ｃ）の塩基配列の上流に自己触媒的にＲＮＡを切断する配列、例えば限定するものではないが、リボザイム部位を含むことが好ましい。
上記二本鎖ＲＮＡ発現ベクターはまた、さらに（ａ）〜（ｃ）の塩基配列の下流にＲＮＡポリメラーゼを停止させる配列、例えば限定するものではないが、ＭＡＺドメイン配列を含むことが好ましい。
上記二本鎖ＲＮＡ発現ベクターにおいて、（ｃ）の塩基配列としては、例えば、配列番号２、５又は６に示す配列が挙げられる。
上記二本鎖ＲＮＡ発現ベクターにおいて、目的遺伝子としては、例えば疾患関連遺伝子、より具体的にはＳｋｉ遺伝子が挙げられる。また目的遺伝子の一部としては、Ｓｋｉ遺伝子の５’側５４０ｂｐの部分とすることができる。
また本発明は、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを発現することを特徴とする目的遺伝子ノックダウン動物である。上記目的遺伝子ノックダウン動物は、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを組織特異的に発現することが好ましい。
また上記目的遺伝子ノックダウン動物は、例えば上記の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが導入された、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを発現するトランスジェニック動物又はその子孫である。
例えば、目的遺伝子が疾患関連遺伝子である場合には、目的遺伝子ノックダウン動物は疾患モデル動物となりうる。ここで、目的遺伝子としてＳｋｉ遺伝子を選択した場合には、該目的遺伝子ノックダウン動物は、神経管閉塞異常、虹彩形成異常、及び頭部での出血からなる群より選択される疾患を呈する疾患モデル動物となりうる。
上記目的遺伝子ノックアウト動物の動物としては、限定されるものではないが、マウスが挙げられる。
さらに本発明は、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを発現する二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入し、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを形成させることを特徴とする、目的遺伝子ノックダウン動物の作出方法である。
上記作出方法においては、上記いずれかの二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを使用することが好ましい。
また、目的遺伝子として疾患関連遺伝子を選択した場合には、目的遺伝子ノックダウン動物として疾患モデル動物が作出されうる。例えば、目的遺伝子としてＳｋｉ遺伝子を選択した場合には、神経管閉塞異常、虹彩形成異常、及び頭部での出血からなる群より選択される疾患を呈する疾患モデル動物が作出されうる。
上記作出方法においては、動物が、限定されるものではないが、マウスであることが好ましい。
またさらに本発明は、上記いずれかの二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが導入されている動物細胞である。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ及びＢは、Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクターの構造（図１Ａ）、及びＳｋｉ二本鎖ＲＮＡをコードする領域（図１Ｂ）を模式的に示す図である。
図２は、構築した種々のプラスミドから転写されるＲＮＡの推定二次構造を示す図である。
図３Ａ及びＢは、Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入した培養細胞内におけるＳｋｉタンパク質レベルの低下を示すウエスタンブロット解析の結果を示す写真である。
図４は、種々の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞における、核及び細胞質内に存在するＲＮＡレベルを示すノーザンブロットの結果を示す写真である。
図５は、核における長鎖ｄｓ−ＲＮＡの発現がｅＩＦ２αのリン酸化には影響を及ぼさないことを示す写真である。
図６Ａは、Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクターによるＳｋｉ ｍＲＮＡの分解を示すＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真である。
図６Ｂは、Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクターによるＳｋｉ ｍＲＮＡの分解を経時的に分析したＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
図７Ａ〜Ｃは、二本鎖ＲＮＡ発現ベクターから発現された長鎖二本鎖ＲＮＡがルシフェラーゼ活性に及ぼす影響を示す図である。図７Ａは、ホタルルシフェラーゼ（Ｐｐ−ｌｕｃ）活性を任意発光単位（ａ．ｕ．）でプロットした図である。図７Ｂは、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｒ−ｌｕｃ）活性を任意発光単位でプロットした図である。図７Ｃは、正規化した標的対対照ルシフェラーゼ比を示す図である。
図８Ａは、Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが導入されたトランスジェニックマウス胚における導入遺伝子の存在を示すサザンブロット分析の結果を示す写真である。
図８Ｂは、Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが導入されたトランスジェニックマウス胚におけるｓｉＲＮＡの存在を示すノーザンブロット分析の結果を示す写真である。
図９は、Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが導入されたトランスジェニックマウスにおける神経管閉塞異常を示す写真である。
図１０は、Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが導入されたトランスジェニックマウスにおける眼の虹彩形成異常を示す写真である。
図１１は、Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが導入されたトランスジェニックマウスにおける頭部の出血を示す写真である。
図１２Ａ〜Ｇは、Ｓｋｉ ｍＲＮＡの欠損により引き起こされるＳｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクター導入トランスジェニックマウスの異常を示す写真である。
図１２Ａは、頭部切片のヘマトキシリン−エオジン染色を示す。
図１２Ｂ及びＣは、ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検出された中脳及び間葉組織におけるＳｋｉ ｍＲＮＡ発現（図１２Ｂ）及びＯｄｃ ｍＲＮＡ発現（図１２Ｃ）を示す。
図１２Ｄは、中脳及び間葉組織の神経上皮を用いたＴＵＮＥＬアッセイにより評価したアポトーシス細胞を示す。
図１２Ｅは、眼のヘマトキシリン−エオジン染色を示す。
図１２Ｆは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検出した眼におけるＳｋｉ ｍＲＮＡ発現を示す。
図１２Ｇは、眼を用いたＴＵＮＥＬアッセイの結果を示す。
図１２Ａ〜Ｇにおいて、ａは野生型マウス、ｂはｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌを導入したトランスジェニックマウス、ｃはｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉを導入したトランスジェニックマウス、ｄはＳｋｉ欠損マウス（Ｓｋｉ−／−）を示す。また、また、図１２Ａ及びＥにおける「ＭＢ」は中脳、「ＩＩ」は第二脳室、「ＩＩＩ」は第三脳室、「Ｏ」は眼杯、「Ｌ」は水晶体胞を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００２年１０月２９日に出願された日本国特許出願第２００２−３１４７６４号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
本発明は、ＲＮＡ干渉を利用して目的遺伝子をノックダウンしたトランスジェニック動物に関し、そのトランスジェニック動物を簡便かつ迅速に作出するためのツール（二本鎖ＲＮＡ発現ベクター）及び方法を提供するものである。
本発明者は、ＲＮＡ干渉を利用してトランスジェニック動物を作出するにあたり、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを特異的な組織で発現させるために、適切な二本鎖ＲＮＡの長さ、適切なプロモーターなどを選択することが重要であると考えた。このため、変異マウスの表現型が詳細に解析されている転写因子Ｓｋｉを選択して実験を行い、トランスジェニック動物における二本鎖ＲＮＡの発現を確認した。またＳｋｉの変異は胎仔の段階で種々の形態異常を示すことが知られているため、二本鎖ＲＮＡの発現及び形成により目的遺伝子がノックダウンされているか否かを発生初期の段階で解析することができた。
以下に本発明に係る目的遺伝子ノックダウン動物及び疾患モデル動物、並びにその作出方法などについて記載する。
１．ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）
ＲＮＡ干渉とは、二本鎖を形成しているＲＮＡ（以下、「二本鎖ＲＮＡ」又は「ｄｓ−ＲＮＡ」ともいう）が細胞内に存在する場合に、そのＲＮＡの塩基配列に相同的な内在性のｍＲＮＡが分解されて、結果としてその細胞での遺伝子発現が特異的に抑制される現象であり、ＲＮＡインターフェアランス、ＲＮＡｉとも称される。このＲＮＡ干渉は、最初に線虫で報告され、その後ショウジョウバエ、植物、哺乳動物細胞などにおいても確認されている。例えばショウジョウバエにおいては、ヘアピン型の二本鎖ＲＮＡを作製し、これが細胞内で二本鎖ＲＮＡとして認識されて、内在性のｍＲＮＡが分解・破壊されるという手法が知られている。このヘアピン型の二本鎖ＲＮＡによりコードされる遺伝子を任意のものに設定することによって、任意の遺伝子をノックダウンすることができる。しかしながら哺乳動物個体におけるＲＮＡ干渉の機構に関してはまだ未知の部分が多く、現在は試行錯誤によるものであって一般的な手法としては確立されていない。また哺乳動物個体において二本鎖ＲＮＡを発現させようとする場合、位置効果などにより必ずしもＲＮＡ干渉が達成されるものではなかった。さらに特に長い二本鎖ＲＮＡを動物細胞で発現させた場合には、配列非特異的にタンパク質の合成が阻害されたり、インターフェロンを誘導する経路が活性化されたりすることが報告されている。
２．二本鎖ＲＮＡ発現ベクターの構築
本発明に係る二本鎖ＲＮＡ発現ベクター（以下、「本ベクター」ともいう）は、上記ＲＮＡ干渉を行うために必要な、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡが発現・形成されるように動物細胞及び個体に導入することができる。本発明において「発現」とは、例えば二本鎖ＲＮＡを例として説明した場合、二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡが、二本鎖ＲＮＡを形成するようなｍＲＮＡに転写されることを指す。また一般的には「発現」とは、遺伝子をコードするＤＮＡがｍＲＮＡに転写されて、さらにｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されることを指し、本発明においては上記両者を意味するものとする。さらに「目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡ」とは、目的遺伝子に対してＲＮＡ干渉を引き起こす二本鎖ＲＮＡを指し、具体的には、目的遺伝子に対し相同的な配列を有する二本鎖ＲＮＡのことをいう。この目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡは、本ベクター上において以下の（ａ）〜（ｃ）の塩基配列：
（ａ）以下の（ａ−１）又は（ａ−２）の塩基配列：
（ａ−１）目的遺伝子の全部若しくは一部をコードする塩基配列、又は
（ａ−２）（ａ−１）の塩基配列に対し相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡをコードする塩基配列；
（ｂ）（ａ）の塩基配列に対し相補的であり、かつ逆配向の塩基配列；及び
（ｃ）ループ領域をコードし、上記（ａ）の塩基配列と（ｂ）の塩基配列とを連結する配列；
によりコードされ、それらがＲＮＡに転写された際に、ステム・ループ構造を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓ−ＲＮＡ）が形成される。本発明において「ステム・ループ構造」とは、相補性により二本鎖を形成しているステム領域と、その二本鎖を連結しているが一本鎖のループ状の形態をとるループ領域とからなる構造であり、この構造は分子生物学においては周知である。
上記（ａ）の塩基配列は、ノックダウン対象の目的遺伝子の全部若しくは一部をコードする塩基配列である（ａ−１）。目的遺伝子とは、ＲＮＡ干渉を利用してノックダウンさせようとする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、疾患に関連すると推測される遺伝子、その他の機能に関連すると推測される遺伝子、その他の研究対象の遺伝子などのあらゆるものを目的遺伝子として取り上げることができる。具体的な目的遺伝子の例としては、限定するものではないが、Ｓｋｉ遺伝子、その他の転写因子、癌関連遺伝子などが挙げられる。
Ｓｋｉ遺伝子は、最初に発癌遺伝子として同定され、最近になって転写コリプレッサーとして機能することが明らかにされている（Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３：４１２−４２３，１９９９）。転写コリプレッサーは種々のリプレッサーに結合して転写抑制を引き起こす因子である。その１種であるＳｋｉは、様々な発生段階において重要な役割を果たしている。Ｓｋｉ遺伝子は、ヒト、マウス、カエル、ハエなどから単離され、その塩基配列は公知となっており、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている（登録番号：ヒト（Ｘ１５２１８）、マウス（ＡＦ４３５８５２）、カエル（Ｘ６８６８３）、ハエ（ＮＴ＿０３３７７８））。
本発明においては、そのような登録されている塩基配列情報に基づいて（ａ）の配列を設計することができる。あるいは、二本鎖ＲＮＡ発現ベクターに導入することが可能であれば、全ての配列が知られている必要はなく、当業者であれば公知の手法に基づいて（ａ）の配列を有するＤＮＡを調製することができる。目的遺伝子の「一部」とは、ＲＮＡ干渉を利用して当該遺伝子をノックダウンできる程度の長さの配列を指し、例えば、５００〜１０００ｂｐ、好ましくは５００〜７００ｂｐのものである。ここでＳｋｉ遺伝子を用いる場合には、例えばＳｋｉタンパク質のＮ末端領域に相当する約５００〜１０００ｂｐの配列が好ましい。特に本発明においては、（ａ）の塩基配列として、Ｓｋｉ遺伝子の５’側５４０ｂｐの配列（配列番号１）を用いることが好ましい。配列番号１は、マウスＳｋｉ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ４３５８５２）に基づくものであり、その塩基配列１〜５４０番に相当する。本ベクターでは、約５００〜１０００ｂｐという長鎖の二本鎖ＲＮＡを発現させ、ＲＮＡ干渉を引き起こすことが可能である。従って、従来のｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ）を利用する場合のように、特異的に内在性ＲＮＡを分解するための領域（約２０〜３０ｂｐ）を選択する必要はなく、簡便かつ容易に二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを構築することが可能となる。
また（ａ）の塩基配列としては、目的遺伝子の全部若しくは一部をコードする塩基配列に対し相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列も含まれる（ａ−２）。このような塩基配列であっても、目的遺伝子に対してある程度の相同性を有するものであればＲＮＡ干渉を行うことは可能である。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性（相同性が６０％以上、好ましくは８０％以上）を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、ナトリウム濃度が１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭであり、温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃での条件をいう。
（ｂ）の塩基配列は、上述した（ａ）の塩基配列に対し相補的であり、かつ逆配向の塩基配列である。ここで「相補的」とは、厳密な相補性を指すものではなく、（ａ）の塩基配列と相補性により二本鎖を形成できる程度であればよい。また「逆配向」とは、ベクターに挿入されている配列の向きに関するものであり、例えば（ａ）の塩基配列がＡＴＣＧＡＧＴＣで挿入されている場合には、（ｂ）の塩基配列はＧＡＣＴＣＧＡＴで挿入されることとなる。
（ｃ）の塩基配列は、ループ領域をコードするものであり、また上記（ａ）の塩基配列と（ｂ）の塩基配列とを連結する。「ループ領域」とは、その領域の塩基配列が相補性などにより自己会合せずに一本鎖のループのような状態となる塩基配列部分を指し、このようなループ領域をコードする塩基配列の設計手法は当技術分野で周知である。ループ領域の長さは、約６〜１５ｂｐ、好ましくは約１２ｂｐである。本発明において好ましい（ｃ）の塩基配列を配列番号２、５及び６に示す。しかし、本発明において利用可能な配列はこれに限定されるものではない。
上記（ａ）〜（ｃ）の塩基配列は、図１Ｂに示すように（ｃ）の塩基配列を中心として連結されている。従って、これらの配列は、ＲＮＡに転写された際に、（ａ）及び（ｂ）の塩基配列が相補性により自己会合することによって、ステム・ループ構造を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓ−ＲＮＡ）を形成することになる。この二本鎖ＲＮＡが目的遺伝子に対しＲＮＡ干渉を引き起こす。
また本ベクターには、上記二本鎖ＲＮＡの領域の配列が転写されて二本鎖ＲＮＡが形成されるように、プロモーター及び／又はその他の制御配列を機能しうる形で連結して挿入してもよい。「機能しうる形で連結して挿入する」とは、本ベクターが導入される細胞又はトランスジェニック動物において、プロモーター及び／又はその他の制御配列の制御下に上記目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡが発現・形成されて内在性の目的遺伝子のｍＲＮＡが破壊・分解されるように、プロモーター及び／又はその他の制御配列を連結してベクターに組み込むことを意味する。本ベクターに組み込むことが可能なプロモーター及び／又は制御配列は特に限定されるものではなく、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、時期特異的プロモーター、その他の調節エレメントなど、当技術分野で公知のプロモーター及び／又は制御配列を、ノックダウン対象の動物、ノックダウン対象の目的遺伝子の性質などの複数の条件に応じて適宜選択することができる。本発明においては、ポリメラーゼＩＩ系のプロモーターを使用することが好ましい。ポリメラーゼＩＩ系プロモーターは、組織特異的発現を誘導するため、個体における組織特異的な二本鎖ＲＮＡの発現を達成することができるためである。
例えばＳｋｉ遺伝子をノックダウンさせた疾患モデル動物を作出する場合、Ｓｋｉ遺伝子に関連する疾患は発生過程において発症することが知られているため、本ベクターに組み込むプロモーターとしては、例えば発生過程特異的プロモーターを用いることが好ましい。
発生過程特異的プロモーターとは、本発明においては発生過程において特異的に発現することが示されたプロモーターを指す。このようなプロモーターは当技術分野で周知であり、例えば限定するものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期遺伝子プロモーター、インスリン遺伝子プロモーター、Ｌｃｋ遺伝子プロモーター、ＣＤ１９遺伝子プロモーター、Ｎｅｓｔｉｎ遺伝子プロモーターなどが挙げられる。上記例示したプロモーターは、当技術分野で公知であり、当業者であればその配列情報などを容易に入手できる。
さらに、動物細胞においては二本鎖ＲＮＡが核から細胞質に運搬される際に種々のｍＲＮＡの翻訳を阻害したり、二本鎖ＲＮＡ依存的なキナーゼを活性化する可能性がある。このような問題を防ぐために、本ベクターには、自己触媒的にＲＮＡを切断する配列及び／又はＲＮＡポリメラーゼを停止させる配列を連結してもよい。自己触媒的にＲＮＡを切断する配列とは、その配列部位において自己触媒的に切断されうる配列を意味し、より具体的にはリボザイム機能によって自己切断される配列である（Ｈｕａｎｇ．Ｙ．，Ｍｏ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６：１５３４−１５４２，１９９６）。自己触媒的にＲＮＡを切断する配列の塩基配列は、当業者であれば容易に設計することができ、例えば限定するものではないが、任意のリボザイム配列、例えば配列番号３に示す配列が挙げられる。ｍＲＮＡの細胞質への移行には５’末端のキャップ構造が重要であるため（ＭｃＫｅｎｄｒｉｃｋ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２１：３６３２−３６４１，２００１）、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡの転写開始点のすぐ下流に自己触媒的にＲＮＡを切断する配列を挿入し、転写によって合成された二本鎖ＲＮＡからキャップ構造を取り除くことによって上記問題を回避することができる。自己触媒的にＲＮＡを切断する配列の存在により、転写された二本鎖ＲＮＡは自己触媒的にこの配列の部位で切断され、キャップ構造が除去される。
またＲＮＡポリメラーゼを停止させる配列とは、ＲＮＡポリメラーゼを鋳型ＤＮＡ上で停止させて転写を停止させる配列を意味し、具体的には転写因子が結合する配列である（Ｙｏｎａｈａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ３：５９３−６００，１９９９；Ｙｏｎａｈａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９：３７７０−３７７７，２０００）。このＲＮＡポリメラーゼを停止させる配列もまた当業者であれば容易に設計することができ、例えば限定するものではないが、転写因子ＭＡＺドメイン配列が挙げられる。このＭＡＺドメインの配列の一例を配列番号４に示すが、これに限定されるものではない。ｍＲＮＡの細胞質への移行には３’末端のポリ（Ａ）鎖が重要であり（Ｈｕａｎｇ．Ｙ．，前掲）、ポリ（Ａ）の存在によりｍＲＮＡは細胞質へ移行する。しかし本発明においては、転写されて形成された二本鎖ＲＮＡを核内に保持させ、ＲＮＡ干渉を引き起こす必要がある。そこでポリ（Ａ）を除去すればこの問題は解決するが、一般的にポリ（Ａ）付加シグナルは転写の終結に必要である。従って本発明者は、ベクター上のポリ（Ａ）付加シグナルを除き、代わりに、転写を停止させる配列（ＭＡＺドメイン配列など）を挿入することによって上記問題を回避することができると考えた。ＲＮＡポリメラーゼを停止させる配列の存在により、二本鎖ＲＮＡの転写は該配列の部位で停止し、合成される二本鎖ＲＮＡにはポリ（Ａ）鎖は付加されない。
適当なベクターに上記構成要素を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等が採用される。上記構成要素のＤＮＡは、当技術分野で公知の手法により合成し、精製することができる。
本ベクターとして利用しうるベクターとしては、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、酵母人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ、Ｐ１ファージ由来人工染色体（ＰＡＣ）ＤＮＡなどが挙げられるが、特に長さが短いｐＵＣ系プラスミド（例えば１〜３ｋｂｐ程度）が好ましい。
このようにして作製されたベクターは、細胞、組織及び／又は個体に導入することにより目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡの発現及び形成を導くものであり、これが内在性の目的遺伝子のｍＲＮＡを破壊・分解する。本明細書においては、本ベクターを、ｐＤＥＣＡＰベクター（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｐ ｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｌｙ（Ａ））と称する。
本二本鎖ＲＮＡ発現ベクターによって、特定の内在性遺伝子によりコードさせる遺伝子産物の発現を、好ましくは組織特異的に抑制することができる。従って、本二本鎖ＲＮＡ発現ベクターは、遺伝子の機能解析、遺伝子治療などの種々の用途において有用である。
３．二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが導入された細胞
本発明においては、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを発現する二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを細胞に導入することができ、それにより目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを該細胞において発現させることができる。目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡの形成により内在性の目的遺伝子のｍＲＮＡが破壊されることとなるため、目的遺伝子の発現を抑制することが可能である。
二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入する細胞は、特に限定されるものではないが、動物細胞が好ましく、例えば、ヒト、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、ラット等が挙げられる。
細胞への二本鎖ＲＮＡ発現ベクターの導入方法は、特に限定されるものではなく、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
以上のように作製された細胞は、目的遺伝子の発現を抑制するものであるため、遺伝子機能の解析、ｅｘ ｖｉｖｏでの目的遺伝子の発現抑制に有用である。
４．トランスジェニック動物（目的遺伝子ノックダウン動物）の作出
本発明に係る目的遺伝子ノックダウン動物（トランスジェニック動物）は、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを有することを特徴とするものであり、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡの形成により内在性の目的遺伝子のｍＲＮＡが破壊されているものである。このトランスジェニック動物は、上記構築された二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを動物細胞に導入し、該動物細胞を成長させることにより作出することができる。このようにして作出されたトランスジェニック動物は、二本鎖ＲＮＡの存在によって内在性目的遺伝子のｍＲＮＡが破壊・分解されることにより目的遺伝子がノックダウンされている。本発明において「内在性」とは、本ベクターの導入対象となる細胞及び／又は個体において天然であるもの、並びに本ベクター導入以前から存在することを指す。また本発明において「ノックダウン」とは、遺伝子産物（例えばタンパク質）の発現を欠損させることを指す。本二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入する対象となる動物は、哺乳動物であれば特に限定されず、例えば、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、ラット等が挙げられる。本発明においては、疾患モデル動物として扱いやすいマウス、ラット等が好ましい。
本ベクターを動物細胞に導入するには、上記対象動物の受精卵に注入することが好ましい。その結果、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡをコードする配列とその制御配列が受精卵の細胞に組み込まれ、その後の受精卵の分裂に伴って、全身の細胞に二本鎖ＲＮＡをコードする配列とその制御配列がコピーされる。
動物細胞への遺伝子の導入方法としては、受精卵へのマイクロインジェクション法の他に、ＥＳ細胞へ導入する方法、培養細胞へ導入した細胞核を核移植により受精卵に導入する方法などが挙げられる。本ベクターのＤＮＡを、エレクトロポレーション、リポフェクション法等によりＥＳ細胞又は他の培養細胞に導入し、ネオマイシン、プロマイシン等でポジティブ選別した後、目的の導入細胞を得る。ＥＳ細胞は、胚胎盤胞又は８細胞期胚に毛細管等を用いて注入する。核移植は、ＤＮＡが導入された細胞を核を取り除いた受精卵に注入し、電気刺激で細胞融合することにより行われる。
その後、胚胎盤胞又は８細胞期胚を直接仮親の卵管に移植するか、一日培養して胚盤胞まで発生したものを仮親の子宮に移植する。仮親を飼育出産させて、目的の二本鎖ＲＮＡが導入された子であるトランスジェニック動物（キメラ動物）を得る。当該動物中における所望の二本鎖ＲＮＡの発現を確認するには、当該動物の体の一部（例えば尾部先端）を切断し、体細胞中のＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法やサザンブロット法などにより導入した配列の存在を確認する。導入した配列の存在が確認された個体を初代とすれば、二本鎖ＲＮＡはその子（Ｆ１）の５０％に伝達される。すなわち、このトランスジェニック動物と正常動物との交配により、ヘテロ接合体動物（Ｆ１）が得られ、ヘテロ接合体同士の交配によりホモ接合体動物（Ｆ２）を得ることができる。さらに、同種の動物との交配を繰り返すことにより、目的遺伝子ノックダウン動物の子孫を得ることもできる。
このようにして特定の目的遺伝子がノックダウンされたトランスジェニック動物は、以下に記載するように疾患モデル動物、遺伝子解析用の動物などとして有用である。
５．疾患モデル動物
上述のようにして作出されたトランスジェニック動物は、目的遺伝子のノックダウン（変異）により、いくつかの疾患を示すモデル動物（疾患モデル動物）として利用できる可能性がある。例えばＳｋｉ遺伝子をノックダウンさせたトランスジェニック動物は、神経管の閉塞異常（Ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ ｃｌｏｓｕｒｅ ｄｅｆｅｃｔ）、眼の虹彩形成異常、及び頭部での出血を呈する。頭部における出血は、本発明者により初めて見出されたものである。従って、本疾患モデル動物は、そのような疾患の研究、疾患の治療開発などにおいて有用である。
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓ−ＲＮＡ）発現ベクターの作製
ヘアピン型ＲＮＡ（すなわち、自己相補性ステムループを有するＲＮＡ）を発現するプラスミドは、図１Ａに示すように、プラスミドｐＤＥＣＡＰ（下記参照）に、Ｓｋｉ遺伝子のコード領域の５’側５４０ｂｐ（配列番号１）を挿入し、その下流に下記の配列番号２に示す１２ｂｐのスペーサー（ループ領域）を挟んで、上記５４０ｂｐの配列に対し相補的な配列を逆向きに挿入することにより構築し、ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉとした。
スペーサーの配列：
ｐＤＥＣＡＰは、ＣＭＶプロモーターを有するｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に、自己触媒的にＲＮＡを切断する配列として転写されたＲＮＡの５’末端におけるキャップ構造を除去するリボザイムカセット（配列番号３；Ｈｕａｎｇ，Ｙ．ａｎｄ Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，ＧＣ，１９９６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６：１５３４−１５４２）、及びＲＮＡポリメラーゼＩＩの転写を停止させる配列としてＭＡＺドメイン（配列番号４；Ｙｏｎａｈａ，Ｍ．ａｎｄ Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，ＮＪ，１９９９，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ３：５９３−６００）を含有するものである。またこの構築物上にポリ（Ａ）付加シグナルはない。
この発現ベクターから転写されるｍＲＮＡは、１２ｂｐのスペーサー部分がループとなったステム・ループ構造を形成し、Ｓｋｉ ｍＲＮＡの配列をもつｄｓ−ＲＮＡとなる。
また、上記と同様にして、ホタルルシフェラーゼ遺伝子のコード領域の最初の５１８ｂｐの配列、又はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の塩基４４３〜９４４の配列と、１２ｂｐのスペーサー（それぞれ配列番号５又は６）を挟んで、上記配列に対し相補的な配列を逆向きに挿入することにより、それぞれホタルルシフェラーゼを標的とするｄｓ−ＲＮＡ発現ベクター（ｐＤＥＣＡＰ−Ｌｕｃ）及びβ−ガラクトシダーゼを標的とするｄｓ−ＲＮＡ発現ベクター（ｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌ）を構築した。
上記のように構築した、逆向き反復配列を含むｐＤＥＣＡＰプラスミドは、逆向き反復配列を含むＤＮＡを正確に複製するために大腸菌Ｓｕｒｅ２株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において増幅させ、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。
また、ホタルルシフェラーゼのセンスＲＮＡを発現するよう構築されたプラスミド（ｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｃＳ）及びホタルルシフェラーゼのアンチセンスＲＮＡを発現するよう構築されたプラスミド（ｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｃＡＳ）、５’キャップ構造及びポリ（Ａ）テイルを含むホタルルシフェラーゼのＲＮＡを発現するよう構築された通常のプラスミド（ｐＣＭＶ−ＬｕｃＳ）、並びに、５’キャップ構造及びポリ（Ａ）テイルを含み、かつβ−ガラクトシダーゼの二本鎖ＲＮＡを発現するように構築されたプラスミド（ｐＣＭＶ−ｇａｌｉ）を調製した。
上述のようにして構築したプラスミドから転写されるＲＮＡの推定二次構造を図２に示す。ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉ、ｐＤＥＣＡＰ−Ｌｕｃ、及びｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌは、５’キャップ構造とポリ（Ａ）テイルを欠損する、Ｓｋｉ、ホタルルシフェラーゼ、及びβ−ガラクトシダーゼの５４０〜５０２ｂｐのヘアピンｄｓ−ＲＮＡをそれぞれコードする。ｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｃＳ及びｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｃＡＳからの転写産物は、それぞれルシフェラーゼ遺伝子のセンス及びアンチセンス一本鎖ＲＮＡである。ｐＣＭＶ−ｇａｌｉは、ｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌと同じヘアピンｄｓ−ＲＮＡをコードするが、５’キャップ構造、スプライシングイントロン及びポリ（Ａ）テイルを含む。
〔実施例２〕Ｓｋｉ ｄｓ−ＲＮＡ発現ベクターによるＳｋｉ発現量の低下
本実施例においては、Ｓｋｉ ｄｓ−ＲＮＡ発現ベクターが培養細胞におけるＳｋｉタンパク質レベルに及ぼす影響を調べた。
（１）サザンブロッティング
ヒト腎由来の２９３Ｔ細胞は、１０％ＦＢＳ及び抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で培養した。上記実施例１において作製したｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉプラスミド及び内部対照として０．０５μｇのＴＫ−Ｌｕｃ（ホタルルシフェラーゼ発現ベクターＰｒｏｍｅｇａ社製）を用いてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）により２９３Ｔ細胞（４×１０５）をトランスフェクトした。４２時間経過後、細胞をＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）に溶解し、細胞抽出物のアリコートをルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に使用して、トランスフェクション効率を評価した。
残りの細胞ペレットをＲＩＰＡ溶解バッファー（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １％，デオキシコール酸ナトリウム １％，ＳＤＳ ０．１％，ＮａＣｌ ０．１５Ｍ，リン酸ナトリウム ｐＨ７．２ ０．０１Ｍ，トラジロール １％）に再懸濁し、ルシフェラーゼアッセイの結果に従って調整した。抗Ｓｋｉモノクローナル抗体１−１、９−１、１１−１及び１６−１（Ｎｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，前掲）の混合物を用いて、イムノブロット（ウェスタンブロッティング）をＳｈｉｎａｇａｗａら（Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ｔ，ｅｔ ａｌ．，２０００，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９：２２８０−２２９１）に記載されているように実施した。
ウェスタンブロッティングにより約９０ｋＤのＳｋｉタンパク質のバンドが検出される。マウスＳｋｉ発現ベクター（ｐａｃｔ−ｓｋｉ；Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３：４１２−４２３，１９９９）と共に種々の量のＳｋｉ ｄｓ−ＲＮＡ発現ベクター（ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉ）を導入して、同様にウェスタンブロッティングを行うと、Ｓｋｉタンパク質の量はｄｓ−ＲＮＡの量に依存して、低下した（図３Ａ）。
一方、ネガティブコントロールとして、実施例１において作製したｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌプラスミドを同様に、マウスＳｋｉ発現ベクター（ｐａｃｔ−ｓｋｉ）と共に２９３Ｔ細胞に導入し、Ｓｋｉ発現レベルを解析した。この場合にはＳｋｉタンパク質レベルの低下は見られなかった（図３Ａ）。以上の結果から、Ｓｋｉ ｄｓ−ＲＮＡは、動物の培養細胞内において、特異的にＳｋｉ発現レベルを低下させることが示された。
また、２９３Ｔ細胞に、ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉプラスミド及びｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌプラスミドをトランスフェクトし、内在性Ｓｋｉ及びＳｎｏタンパク質をイムノブロッティングにより検出した。ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉベクターを単独で２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした場合にも、内在性Ｓｋｉタンパク質レベルは低減した（図３Ｂ）。ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉの標的配列と約６０％の相同性を有するＳｎｏタンパク質の内在性レベルには変化が観察されなかった。
（２）ノーザンブロッティング
図２に示す種々の発現ベクター（ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉ、ｐＤＥＣＡＰ−Ｌｕｃ、ｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌ、ｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｃＳ、ｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｃＡＳ、ｐＣＭＶ−ＬｕｃＳ、ｐＣＭＶ−ｇａｌｉ）０．８μｇを用いてトランスフェクトした２９３Ｔ細胞から、その４８時間後に細胞質及び核ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの細胞小器官分布を、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＬｕｃＳ ＤＮＡプローブを用いたノーザンブロッティングにより分析した。
結果を図４に示す。図４の上の写真はノーザンブロッティングの結果を示し、下の写真はＲＮＡの量が各レーンにおいて同等であることを示すためのコントロールである。ｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｃＳから転写されたルシフェラーゼセンスＲＮＡの大部分は核内に存在したのに対し、ｐＣＭＶ−ＬｕｃＳから転写されたルシフェラーゼセンスＲＮＡは細胞質内に存在した。ｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｃＳからのルシフェラーゼ転写産物のサイズはプラスミドに挿入されたものと一致するため、長鎖ＲＮＡはポリ（Ａ）付加シグナルの欠損のためにリードスルー（ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈ）機構によって転写されたことが示唆される。ｐＤＥＣＡＰ−Ｌｕｃから転写された長鎖ＲＮＡは、ノーザンブロッティングにより細胞質でも核でも検出されなかったため、ｐＤＥＣＡＰ−Ｌｕｃから転写された長鎖ｄｓ−ＲＮＡは、すぐに消化切断されて短鎖ＲＮＡとなったことが示唆される。
（３）インターフェロン応答
ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉから発現されたＳｋｉ ｍＲＮＡがインターフェロン応答を誘導するかどうかを調べるために、ｄｓ−ＲＮＡにより活性化されるＰＫＲタンパク質キナーゼの基質であるｅＩＦ２αのリン酸化状態を試験した。２９３Ｔ細胞を、ｐＤＥＣＡＰ空プラスミド又はｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉプラスミド（０．６μｇ）と内部対照としてｐＣＭＶ−β−ｇａｌプラスミド（０．３μｇ）を用いて共トランスフェクトした。その４８時間後に細胞を回収し、Ｓｅｒ５１でリン酸化されたｅＩＦ２α（ｅＩＦ２α−Ｐ）に対するホスホ−特異的抗体を用いてイムノブロット分析を行った。同じ膜を、総ｅＩＦ２α及びβ−ガラクトシダーゼに対する抗体を用いて再度検出を行った。ポリ（Ｉ）・ポリ（Ｃ）（１００μｇ／ｍＬ）を用いて２４時間処理した２９３Ｔ細胞の溶解物を陽性対照として使用した。
結果を図５に示す。リン酸化ｅＩＦ２αのレベルはｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉを用いた２９３Ｔ細胞のトランスフェクションにより増強されなかったが、ｅＩＦ２αのリン酸化は、ポリ（Ｉ）・ポリ（Ｃ）で処理した対照細胞においては刺激された（図５）。従って、ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉを導入した細胞では、インターフェロン応答が誘導されなかったことが示された。
（４）ＲＴ−ＰＣＲ分析
内在性Ｓｋｉ ｍＲＮＡのレベルを調べるために、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。具体的には、ｐＤＥＣＡＰ空プラスミド、ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉプラスミド、及びｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌプラスミド（各１．５μｇ）を、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）発現プラスミド（ｐＭＳＣＶ−ｉｒ−ＥＧＦＰ）と共に２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＥＧＦＰ陽性細胞をセルソーティングにより回収し、アクチノマイシンＤで処理した。総ＲＮＡを種々の時点で単離し、Ｓｋｉ ｍＲＮＡ量をＲＴ−ＰＣＲにより分析した。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲルで分離し、エチジウムブロミド染色により可視化した。
その結果を図６Ａ及びＢに示す。図６Ａは、Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクターによるＳｋｉ ｍＲＮＡの分解を示すＲＴ−ＰＣＲの結果を示し、図６Ｂは、Ｓｋｉ二本鎖ＲＮＡ発現ベクターによるＳｋｉ ｍＲＮＡの分解を経時的に分析したＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。
ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉでのトランスフェクションにより、内在性Ｓｋｉ ｍＲＮＡのレベルが低減した（図６Ｂ）。このＳｋｉ ｍＲＮＡレベルの低減がＳｋｉ ｍＲＮＡの分解によるものであることを確認するため、転写阻害剤であるアクチノマイシンＤによるトランスフェクト細胞の処理後、種々の時点でＳｋｉ ｍＲＮＡレベルを測定した（図６Ｂ）。ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉプラスミドでトランスフェクトした細胞においては、内在性Ｓｋｉ ｍＲＮＡの半減期は０．９時間であり、β−ガラクトシダーゼｄｓ−ＲＮＡを発現するｐＤＥＣＡＰプラスミド（ｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌ）又は空のプラスミドでトランスフェクトした細胞においてはそれぞれ２．７時間及び３．１時間であった。従って、ｐＤＥＣＡＰベクターから発現されたＳｋｉ ｄｓ−ＲＮＡは、Ｓｋｉ ｍＲＮＡの分解を刺激することがわかった。
〔実施例３〕マウス胚性繊維芽細胞におけるルシフェラーゼアッセイ
マウス胚性繊維芽細胞を、１０％仔ウシ血清（ＦＢＳ）及び抗生物質を含むＤＭＥＭ中で培養した。０．５×１０５個の細胞を１２ウエルプレートに移し（１ｍＬ／ウエル）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用してホタルルシフェラーゼ（Ｐｐ−ｌｕｃ）発現プラスミド（ＴＫ−βＲＥｘ２−Ｌｕｃ；チミジンキナーゼプロモーターとβ−レチノイン酸受容体結合部位を含む）０．１μｇ、実施例１において構築したプラスミド（ｐＤＥＣＡＰ−ｓｋｉ、ｐＤＥＣＡＰ−Ｌｕｃ及びｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌ、ｐＣＭＶ−ｇａｌｉ、並びにｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｃＳ及びｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｃＡＳ）０．４μｇ、並びにウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｒ−ｌｕｃ）発現プラスミド（ｐＲＬ−ＣＭＶ、０．０２μｇ）をそれぞれトランスフェクトした。２４時間後、１μＭのａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸を添加してホタルルシフェラーゼ（Ｐｐ−ｌｕｃ）遺伝子の発現を誘導し、細胞をさらに３６時間培養した。続いて、二重ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼ発現をモニターした。
結果を図７Ａ〜Ｃに示す。図７Ａは、ホタルルシフェラーゼ（Ｐｐ−ｌｕｃ）活性を任意発光単位（ａ．ｕ．）でプロットした図を示す。図７Ｂは、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｒ−ｌｕｃ）活性を任意発光単位でプロットした図を示す。また図７Ｃは、正規化した標的対対照ルシフェラーゼ比を示す。
ホタルルシフェラーゼ（Ｐｐ−ｌｕｃ）レベルは、ホタルルシフェラーゼｄｓ−ＲＮＡを発現するｐＤＥＣＡＰプラスミド（ｐＤＥＣＡＰ−Ｌｕｃ）と共に共トランスフェクトした場合に約５分の１に低減した（図７Ａ）。一方、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｒ−ｌｕｃ）活性は影響を受けなかった（図７Ｂ）。また、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の同じ領域のセンスＲＮＡを発現するｐＤＥＣＡＰプラスミド（ｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｃＳ）と共トランスフェクトした場合にはホタルルシフェラーゼ活性に影響を及ぼさなかったが、同じ領域のアンチセンスＲＮＡを発現するｐＤＥＣＡＰプラスミド（ｐＤＥＣＡＰ−ＬｕｓＡＳ）と共トランスフェクトした場合にはわずかな影響が観察された（約２５％の低減）。従って、この結果は、ｄｓ−ＲＮＡの構造がホタルルシフェラーゼ活性の効率的な阻害に重要であることを示している。さらに、ｐＤＥＣＡＰプラスミドからのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の５０２ｂｐ ｄｓ−ＲＮＡの共発現は、ホタル又はウミシイタケのルシフェラーゼ活性には影響を及ぼさなかったが、別のプラスミド（ｐＣＭＶ−ｇａｌｉ；ＣＭＶプロモーターを含むが、リボザイム及びＭＡＺドメインを含まない）からの５’キャップ構造、スプライシング部位及びポリ（Ａ）テイルを含むβ−ガラクトシダーゼのｄｓ−ＲＮＡの共発現では、両方のルシフェラーゼ活性の低減が観察された。この結果は、キャップ構造とポリ（Ａ）の除去が翻訳の非特異的阻害を抑制するために必要であることを示している。
〔実施例４〕Ｓｋｉ ｄｓ−ＲＮＡ発現ベクターを導入したトランスジェニックマウスの作出
（１）サザンブロッティング
ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉ又はｐＤＥＣＡＰ−ｇａｌｉにおける２．２ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をバックグラウンド配列から切り出し、精製して、マウス受精卵に注入した。マウス受精卵は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ雄マウスとＣ５７ＢＬ／６Ｎ又は（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×ＤＢＡ）Ｆ１雌マウス（いずれもクレア社より入手）との交配により得られたものである。導入遺伝子の存在とコピー数を分析するために、Ｓｋｉコード領域の最初の５４０ｂｐをプローブとして用いたサザンブロット分析により胚を分析した。サザンブロット分析に用いたゲノムＤＮＡは、胚体外組織から抽出した。結果を図８Ａに示す。図８Ａにおいて左側のレーンはｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉ導入トランスジェニックマウス、右側のレーンは野生型マウス（ＷＴ）の結果を示す。図８Ａより、トランスジェニックマウスは確かにＳｋｉのｄｓ−ＲＮＡ発現ベクターを有することがわかった。また、この導入遺伝子のコピー数は２〜１２コピーと推定された。
（２）ノーザンブロッティング
短鎖ＲＮＡがトランスジェニックマウス胚において生成されているか否かを調べるために、Ｓｋｉセンス鎖プローブを用いてノーザンブロッティングを行った。
トランスジェニックマウス胚の頭部から核ＲＮＡ（５μｇ）を抽出し、それをノーザンブロッティングにより分析した。膜は、標的配列に対応するＤＩＧ標識センスＳｋｉプローブを用いて検出した。膜上のメチレンブルーで染色されて可視化された５Ｓ ｒＲＮＡを図８Ｂ（下側）に示す。この結果は、ｐＤＥＣＡＰ−ｓｋｉを導入したトランスジェニックマウス胚においては約２１〜２２塩基の短鎖ＲＮＡが検出されたが、野生型マウス胚においては検出されなかったことを示す（図８Ｂ）。
（３）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
また、マウス胚について分析するために、Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン）を用いて胚の肢芽よりＲＮＡを単離した。導入遺伝子の発現は、以下に示すプライマー対、及び以下の配列を有するリボザイムカセットの３’末端における二重蛍光プローブを用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより調べた。
（プライマー対）
（プローブ）
このＲＴ−ＰＣＲの結果を下記表１に示す。表１中、導入遺伝子の発現量は、胚Ｎｏ．２５７を１．００とした場合の相対値として表す。
〔実施例５〕疾患モデルマウス
（１）神経管形成の異常
Ｓｋｉ変異マウスは神経管の閉塞異常（Ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ ｃｌｏｓｕｒｅ ｄｅｆｅｃｔ）が見られることがすでに報告されている（Ｂｅｒｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１１：２０２９−２０３９，１９９７）。本発明者は、Ｓｋｉ ｄｓ−ＲＮＡを発現するトランスジェニックマウスをＥ１０．５の時期に解析し、同様の神経管閉塞異常を呈することを観察した（図９）。図９の矢印で示すように、トランスジェニックマウス（ＴＧ）においては神経管が閉じていないことがわかる。１３匹のトランスジェニック胎仔のうち、５匹（３８．５％）が神経管閉塞異常を示した（上記表１も参照されたい）。ネガティブコントロールとして作製したβガラクトシダーゼｄｓ−ＲＮＡを発現するトランスジェニックマウス（９匹）では、神経管閉塞異常は観察されなかった。
（２）眼の形成異常
Ｓｋｉ変異マウスは眼の虹彩形成異常が見られることがすでに報告されている（Ｃｏｌｍｅｎａｒｅｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３０：１０６−１０９，２００２）。本発明者は、Ｓｋｉ ｄｓ−ＲＮＡを発現するトランスジェニックマウスをＥ１０．５の時期に解析し、同様の眼の虹彩形成異常が起きることを観察した（図１０）。図１０の矢印で示すように、トランスジェニックマウス（ＴＧ）においては眼の虹彩が部分的に欠損していることがわかる。２匹のトランスジェニック胎仔のうち、２匹（１００％）共が眼の虹彩形成異常を示した。ネガティブコントロールとして作製したβガラクトシダーゼｄｓ−ＲＮＡを発現するトランスジェニックマウス（９匹）では、眼の虹彩形成異常は観察されなかった。
（３）頭部での出血
本発明者は、Ｓｋｉ ｄｓ−ＲＮＡを発現するトランスジェニックマウスが頭部での出血を起こすことを観察した（図１１）。図１１において、トランスジェニックマウス（ＴＧ）及びｓｋｉ遺伝子変異マウス（ｓｋｉ−／−）は頭部出血を示している。従って、ｓｋｉ遺伝子変異マウスは、頭部出血のモデルマウスとして使用可能であることがわかる。
以上の（１）〜（３）の結果から、Ｓｋｉ ｄｓ−ＲＮＡ発現ベクターを導入したトランスジェニックマウスは、Ｓｋｉ変異マウスと同様の異常及び頭部出血を呈することが示された。通常トランスジェニックマウスの系においては、導入された遺伝子を持つ個体のうちの２０〜８０％の個体において、導入遺伝子効果が観察されると言われている。これは導入遺伝子が組み込まれた位置によっては、その遺伝子が発現されない場合があるからである（位置効果）。本発明者が作製したＳｋｉ ｄｓ−ＲＮＡ発現ベクターのトランスジェニックマウスでは、３８．５％の個体において、神経管閉塞異常が観察された。これは従来のトランスジェニックマウスの報告例から見て、妥当な割合といえる。
〔実施例６〕二本鎖ＲＮＡの導入と表現型発現の頻度
ＣＭＶプロモーターがマウス胚の種々の領域において活性を示すかどうかを確認するため、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるβ−ガラクトシダーゼ発現ベクター（ｐＣＭＶ−β−ｇａｌ）を含むトランスジェニックマウスを作製した。
その結果、ｐＣＭＶ−β−ｇａｌを含むトランスジェニックマウス胚６つのうち２つにおいては、Ｅ９〜Ｅ１２の時期においてそのほぼ全ての組織（神経上皮細胞を含む）でβ−ガラクトシダーゼの発現が確認された。この頻度（３３．３％、２／６）は、異常を示すｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉトランスジェニックマウス（実施例５）の場合と同様であり、注入ＤＮＡにより引き起こされる特定の表現型をしめすトランスジェニックマウスの平均頻度の範囲内（１０〜４０％）である。Ｅ１４〜Ｅ１６時期において眼異常を示すｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉトランスジェニックマウス胚において高頻度であった結果と一致して、β−ガラクトシダーゼ発現は、Ｅ１５時期におけるｐＣＭＶ−β−ｇａｌトランスジェニックマウス胚の種々の組織（眼を含む）において高頻度に観察された。
対照実験として、ｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌから調製した５０２塩基のβ−ガラクトシダーゼｄｓ−ＲＮＡの発現ユニットを含む断片を注入することにより、トランスジェニックマウスを作出した。このマウス胚９つを分析したところ、全てにおいて異常は観察されなかった（下記表２参照）。この結果は、ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉトランスジェニックマウスにおいて観察された異常が、Ｓｋｉ ｄｓ−ＲＮＡにより特異的に引き起こされたものであり、長鎖ｄｓ−ＲＮＡによる非特異的には引き起こされなかったことを示す。Ｓｋｉ欠損マウスの典型的な異常、すなわち神経管異常及び眼異常がｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉトランスジェニックマウスにおいてみられたが、Ｓｋｉ欠損マウスの軸後指過剰症などの他の異常は観察されなかった。これは、ＣＭＶプロモーターがある組織においては十分に活性を有しないことに起因する可能性がある。
〔実施例７〕トランスジェニックマウスにおける組織学的分析
トランスジェニックマウスにおける内因性Ｓｋｉ遺伝子の発現及びＲＮＡｉによる影響を調べるために、以下のように組織のヘマトキシリン−エオジン染色、ＲＮＡを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、及びＴＵＮＥＬ法を実施した。
ヘマトキシリン−エオジン染色は、サンプルを載せたスライドグラスを以下の手順で各溶液に浸し、処理した：
１）ヘマトキシリン溶液 室温３分
２）流水水洗
３）１％エオジン 室温７分
４）５０％エタノール 室温２秒７回
５）７０％エタノール 室温２秒７回
６）９０％エタノール 室温２秒７回
７）９５％エタノール 室温２秒７回
８）１００％エタノール 室温１５分
９）１００％エタノール 室温１５分
１０）１００％エタノール 室温１５分
１１）キシレン 室温１５分
１２）キシレン 室温１５分
１３）キシレン 室温１５分
１４）キシレンを蒸発乾燥後、スライドグラスに封入剤をのせ、カバーグラスをかぶせた。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、Ｂｕｔｌｅｒ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１年，第２３巻，ｐ．３０３−３１２）に記載の方法に従って行った。Ｓｋｉ ｍＲＮＡの検出には、Ｓｋｉ遺伝子の３’側半分をプローブとして使用した。具体的には、使用するｃ−Ｓｋｉ ３’プローブを調製するために、マウスｃ−Ｓｋｉ ｃＤＮＡの塩基７５４−２２２３の範囲のプラスミドをＢａｍＨＩを用いて線状化し、これをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて翻訳した。Ｏｄｃ遺伝子検出用のＯＤＣプローブは、既にＮｏｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．，１９９９年，第１３巻，ｐ．４１２−４２３）に記載されている。
また、ＴＵＮＥＬ法は、アポトーシスを研究するために、市販のアポトーシスキット（ｉｎ ｓｉｔｕ細胞死検出キット、Ｒｏｃｈｅ）を製造業者の指示に従って使用して実施した。
以上の実験結果を図１２Ａ〜Ｇに示す。図１２Ａ〜Ｇにおいて、ａは野生型マウス、ｂはｐＤＥＣＡＰ−β−ｇａｌを導入したトランスジェニックマウス、ｃはｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉを導入したトランスジェニックマウス、ｄはＳｋｉ欠損マウス（Ｓｋｉ−／−）を示す。また、図１２Ａは、頭部切片のヘマトキシリン−エオジン染色を示す。図１２Ｂ及びＣは、ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検出された中脳及び間葉組織におけるＳｋｉ ｍＲＮＡ発現（図１２Ｂ）及びＯｄｃ ｍＲＮＡ発現（図１２Ｃ）を示す。図１２Ｄは、中脳及び間葉組織の神経上皮を用いたＴＵＮＥＬアッセイにより評価したアポトーシス細胞を示す。図１２Ｅは、眼のヘマトキシリン−エオジン染色を示す。図１２Ｆは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検出した眼におけるＳｋｉ ｍＲＮＡ発現を示す。図１２Ｇは、眼を用いたＴＵＮＥＬアッセイの結果を示す。また、図１２Ａ及びＥにおける「ＭＢ」は中脳、「ＩＩ」は第二脳室、「ＩＩＩ」は第三脳室、「Ｏ」は眼杯、「Ｌ」は水晶体胞を示す。
ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉ導入トランスジェニックマウス及びＳｋｉ欠損マウス（ＥＳ細胞における相同組換えにより作出したもの）の神経上皮細胞においては、Ｓｋｉ ｍＲＮＡが検出されなかった（図１２Ｂのｃ及びｄ）。対照的に、β−ｇａｌのｄｓ−ＲＮＡを導入したトランスジェニックマウス及び野生型マウスの神経上皮細胞においては、Ｓｋｉ ｍＲＮＡが発現されていた（図１２Ｂのａ及びｂ）。この結果は、ＲＴ−ＰＣＲでも確認した（データは示さない）。
Ｓｋｉ欠損マウスにおける神経管の閉塞異常は、オルニチンデカルボキシラーゼ（Ｏｄｃ）遺伝子の異所性発現と、その後の神経上皮細胞におけるアポトーシスによって起こる。その理由は、ＳｋｉがＯｄｃ遺伝子のＭａｄ媒介転写抑制に必要であることによる（Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．，１９９９年，第１３巻，ｐ．４１２−４２３）。同様のＯｄｃ遺伝子の異所性発現が、ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉ導入トランスジェニックマウス胚の神経上皮細胞においても観察された（図１２Ｃのｃ）。さらに、Ｏｄｃ発現レベルの高い領域においては、異所性アポトーシスが観察された（図１２Ｄのｃ及びｄ）。これらの結果によって、ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉ導入トランスジェニックマウスにおいて観察された神経管閉塞の異常が、ＥＳ細胞における相同組換えにより作出されたＳｋｉ欠損マウスにおける機構と同じ機構により引き起こされたことが示された。
眼の発達過程においては、所定の時間的順序で種々の網膜細胞型（網膜神経節細胞、錐体光受容細胞、無軸索細胞、杆体光受容細胞など）が網膜前駆体細胞から発生する（Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ｗ．，Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．，１９８５年，第２１２巻，ｐ．１９９−２０５）。野生型マウスの胚においては、Ｅ１０．５の時期で水晶体胞、眼杯、及び胚上皮においてＳｋｉ ｍＲＮＡが検出された（図１２Ｆのａ）。ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉ導入トランスジェニックマウス及びＳｋｉ欠損マウスの胚においては、上記領域におけるＳｋｉ ｍＲＮＡレベルは顕著に減少していた（図１２Ｆのｃ及びｄ）。この観察結果と一致して、ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉ導入トランスジェニックマウス及びＳｋｉ欠損マウスの水晶体胞及び胚上皮においては異所性アポトーシスが観察されたが（図１２Ｇのｃ及びｄ）、野生型マウスの胚においては観察されなかった（図１２Ｇのａ）。また、Ｓｋｉ欠損マウス胚においては眼杯の異所性アポトーシスが観察されたが、ｐＤＥＣＡＰ−Ｓｋｉ導入トランスジェニックマウス胚においては外観上観察されなかった。このことは、この領域においてはＳｋｉ ｍＲＮＡが低レベルで残存していることを示唆している。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、その全文を参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
本発明により、目的遺伝子がノックダウンされたトランスジェニック動物及びそのための二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが提供される。本トランスジェニック動物は、ＲＮＡ干渉を引き起こす二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを用いることにより、簡便かつ迅速に作出することができる。また例えばＳｋｉ遺伝子をノックダウンさせた本トランスジェニック動物は、いくつかの疾患を呈するためモデル動物として用いることが可能である。さらに本二本鎖ＲＮＡ発現ベクターは、ＲＮＡ干渉を効率的に行えるよう構築されており、位置効果をうけることなく目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを発現させ、目的遺伝子の発現を抑制することができるものである。
【配列表フリーテキスト】
配列番号２〜９：合成オリゴヌクレオチド
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）以下の（ａ−１）又は（ａ−２）の塩基配列：
（ａ−１）目的遺伝子の全部若しくは一部をコードする塩基配列、又は
（ａ−２）（ａ−１）の塩基配列に対し相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡをコードする塩基配列；
（ｂ）（ａ）の塩基配列に対し相補的であり、かつ逆配向の塩基配列；及び
（ｃ）ループ領域をコードし、上記（ａ）の塩基配列と（ｂ）の塩基配列とを連結する配列；
を含み、それらがＲＮＡに転写された際に、ステム・ループ構造を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓ−ＲＮＡ）が形成されることを特徴とする、二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項２】
さらにポリメラーゼＩＩ系プロモーターを含むものである、請求項１記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項３】
さらに発生過程特異的プロモーターを含むものである、請求項１記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項４】
ポリメラーゼＩＩ系プロモーター又は発生過程特異的プロモーターがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期遺伝子プロモーターである、請求項２又は３記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項５】
さらに（ａ）〜（ｃ）の塩基配列の上流に自己触媒的にＲＮＡを切断する配列を含むものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項６】
自己触媒的にＲＮＡを切断する配列がリボザイム部位である、請求項５記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項７】
さらに（ａ）〜（ｃ）の塩基配列の下流にＲＮＡポリメラーゼを停止させる配列を含むものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項８】
ＲＮＡポリメラーゼを停止させる配列がＭＡＺドメイン配列である、請求項７記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項９】
（ｃ）の塩基配列が配列番号２、５又は６に示すものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項１０】
目的遺伝子が疾患関連遺伝子である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項１１】
目的遺伝子がＳｋｉ遺伝子である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項１２】
目的遺伝子の一部がＳｋｉ遺伝子の５’側５４０ｂｐの部分である、請求項１１記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項１３】
目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを発現することを特徴とする目的遺伝子ノックダウン動物。
【請求項１４】
目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを組織特異的に発現する、請求項１３記載の目的遺伝子ノックダウン動物。
【請求項１５】
二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが導入された、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを発現するトランスジェニック動物又はその子孫である、請求項１３又は１４記載の目的遺伝子ノックダウン動物。
【請求項１６】
二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが請求項１〜１２のいずれか１項に示されるものである、請求項１５記載の目的遺伝子ノックダウン動物。
【請求項１７】
目的遺伝子が疾患関連遺伝子であり、目的遺伝子ノックダウン動物が疾患モデル動物である、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の目的遺伝子ノックダウン動物。
【請求項１８】
目的遺伝子がＳｋｉ遺伝子であり、疾患が、神経管閉塞異常、虹彩形成異常、及び頭部での出血からなる群より選択されるものである、請求項１７記載の目的遺伝子ノックダウン動物。
【請求項１９】
動物がマウスである、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の目的遺伝子ノックダウン動物。
【請求項２０】
目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを発現する二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入し、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを形成させることを特徴とする、目的遺伝子ノックダウン動物の作出方法。
【請求項２１】
二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが請求項１〜１２のいずれか１項に示されるものである、請求項２０記載の作出方法。
【請求項２２】
目的遺伝子が疾患関連遺伝子であり、目的遺伝子ノックダウン動物が疾患モデル動物である、請求項２０又は２１記載の作出方法。
【請求項２３】
目的遺伝子がＳｋｉ遺伝子であり、疾患が、神経管閉塞異常、虹彩形成異常、及び頭部での出血からなる群より選択されるものである、請求項２２記載の作出方法。
【請求項２４】
動物がマウスである、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の作出方法。
【請求項２５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが導入されていることを特徴とする動物細胞。
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）以下の（ａ−１）又は（ａ−２）の塩基配列：
（ａ−１）目的遺伝子の全部若しくは一部をコードする塩基配列、又は
（ａ−２）（ａ−１）の塩基配列に対し相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡをコードする塩基配列；
（ｂ）（ａ）の塩基配列に対し相補的であり、かつ逆配向の塩基配列；及び
（ｃ）ループ領域をコードし、上記（ａ）の塩基配列と（ｂ）の塩基配列とを連結する配列；
を含み、それらがＲＮＡに転写された際に、ステム・ループ構造を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓ−ＲＮＡ）が形成されることを特徴とする、二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項２】
さらにポリメラーゼＩＩ系プロモーターを含むものである、請求項１記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項３】
さらに発生過程特異的プロモーターを含むものである、請求項１記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項４】
ポリメラーゼＩＩ系プロモーター又は発生過程特異的プロモーターがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期遺伝子プロモーターである、請求項２又は３記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項５】
さらに（ａ）〜（ｃ）の塩基配列の上流に自己触媒的にＲＮＡを切断する配列を含むものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項６】
自己触媒的にＲＮＡを切断する配列がリボザイム部位である、請求項５記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項７】
さらに（ａ）〜（ｃ）の塩基配列の下流にＲＮＡポリメラーゼを停止させる配列を含むものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項８】
ＲＮＡポリメラーゼを停止させる配列がＭＡＺドメイン配列である、請求項７記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項９】
（ｃ）の塩基配列が配列番号２、５又は６に示すものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項１０】
目的遺伝子が疾患関連遺伝子である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項１１】
目的遺伝子がＳｋｉ遺伝子である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項１２】
目的遺伝子の一部がＳｋｉ遺伝子の５’側５４０ｂｐの部分である、請求項１１記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項１３】
目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを発現することを特徴とする目的遺伝子ノックダウン動物。
【請求項１４】
目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを組織特異的に発現する、請求項１３記載の目的遺伝子ノックダウン動物。
【請求項１５】
二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが導入された、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを発現するトランスジェニック動物又はその子孫である、請求項１３又は１４記載の目的遺伝子ノックダウン動物。
【請求項１６】
二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが請求項１〜１２のいずれか１項に示されるものである、請求項１５記載の目的遺伝子ノックダウン動物。
【請求項１７】
目的遺伝子が疾患関連遺伝子であり、目的遺伝子ノックダウン動物が疾患モデル動物である、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の目的遺伝子ノックダウン動物。
【請求項１８】
目的遺伝子がＳｋｉ遺伝子であり、疾患が、神経管閉塞異常、虹彩形成異常、及び頭部での出血からなる群より選択されるものである、請求項１７記載の目的遺伝子ノックダウン動物。
【請求項１９】
動物がマウスである、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の目的遺伝子ノックダウン動物。
【請求項２０】
目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを発現する二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを導入し、目的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを形成させることを特徴とする、目的遺伝子ノックダウン動物の作出方法。
【請求項２１】
二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが請求項１〜１２のいずれか１項に示されるものである、請求項２０記載の作出方法。
【請求項２２】
目的遺伝子が疾患関連遺伝子であり、目的遺伝子ノックダウン動物が疾患モデル動物である、請求項２０又は２１記載の作出方法。
【請求項２３】
目的遺伝子がＳｋｉ遺伝子であり、疾患が、神経管閉塞異常、虹彩形成異常、及び頭部での出血からなる群より選択されるものである、請求項２２記載の作出方法。
【請求項２４】
動物がマウスである、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の作出方法。
【請求項２５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターが導入されていることを特徴とする動物細胞。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３９９７３
【国際公開日】平成１６年５月１３日（２００４．５．１３）
【発行日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４８０７１（Ｐ２００４−５４８０７１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１３８５５
【国際出願日】平成１５年１０月２９日（２００３．１０．２９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（０００１０３８４０）オリエンタル酵母工業株式会社 (60)
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年５月１３日（２００４．５．１３）
【発行日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１３８５５
【国際出願日】平成１５年１０月２９日（２００３．１０．２９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（０００１０３８４０）オリエンタル酵母工業株式会社 (60)
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
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