低溶解性化合物の吸収特性の評価法
本発明は、少なくとも一つの所定のｐＨ値において、低溶解性化合物と賦形剤との組み合わせに対する流束関数の変化を評価するステップを有する、低溶解性化合物の予測される吸収特性に対する、賦形剤、ｐＨおよびそれらの組み合わせの効果を評価する方法に関係する。当該方法は、薬剤分子（即ち低溶解性化合物）の吸収を最適化することができる賦形剤の、高速、正確、かつ経済的な評価を可能にする。さらにそのような評価においては、動物実験を排除することができ、かつ化合物の使用を減らすことができる。即ち、当該方法は高速で、化合物を節約し、コスト効率がよく、かつある程度正確である為、薬剤候補の将来的な製剤化の有効性（溶解度および透過率に対するｐＨおよび賦形剤の効果）についての正当なスクリーニングを行うことができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、独立請求項１のプリアンブルに従えば、低溶解性化合物（low solubility compounds）の予測される吸収特性に対する、賦形剤、ｐＨおよびそれらの組み合わせの効果を評価する方法に関し、とりわけ、独立請求項２０に従えば、当該方法を行うために設定（arranged）されているコンピュータープログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
イオン性（ionizable）化合物のヒト腸管吸収（human intestinal absorption;ＨＩＡ）は、溶解性、透過性、およびｐＫａという主要な三つの特性に同時に依存しうる(Avdeef A., “Absorption and Drug Development”, Wiley Interscience, NY, 2003)。この関連性は、アブソープション・ポテンシャル（the Absorption Potential）(Dressman JB et al., “J. Pharm. Sci.”, 1985, 74, 588)、バイオファーマシューティクス・クラシフィケーション・システム（the Biopharmaceutics Classification System）（Guidance for Industry, “Waiver of In Vivo Bioavailability and Bioequivalence Studies for Immediate Release Solid Oral Dosage Forms Based on a Biopharmaceutics Classification System”, FDA, Washington, D.C., USA, August 2000）、及びマキシマム・アブソーバブル・ドース（the Maximum Absorbable Dose）の関数（Curatolo W. “Pharm. Sci. Tech. Today”, 1998, 1, 387）に例証されている。簡潔に述べると、フィックの拡散法則が、これらのモデル全ての基礎となっている。
【０００３】
腸内では、水溶性の弱塩基がわずかにアルカリ性の部位（例、遠位回腸中）からよりよく吸収され、弱酸がわずかに酸性の部位（例、近位空腸）からよりよく吸収される。これはＢｒｏｄｉｅおよび共同研究者ら(Shore PA et al., “J. Pcol. Exp. Therap.”, 1957, 119, 361)によって理論的に説明されており、彼らは、イオン性薬剤の腸管吸収に対するｐＨの効果を説明するためにｐＨ分配仮説（pH Partition Hypothesis）を導入した。ラットの腸管を種々のｐＨの薬剤溶液によりインサイチュで灌流し、それと同時に薬剤を静脈注射した。正味の腸壁輸送がなくなるまで管腔灌流液中の薬剤濃度が調整されたが、それは、血液−管腔バリア率（blood-lumen barrier ratio）
【０００４】
【数１】
【０００５】
を定義することを可能とするためであった。
【０００６】
中性型の薬剤のみが透過するとすれば、式（１）は薬剤のｐＫａおよび腸管バリアの両側間のｐＨ勾配から予測できる（Shore PA et al., “J. Pcol. Exp. Therap.” 1957, 119, 361）：
【０００７】
【数２】
【０００８】
式（２）は、透過性のｐＨ依存性から導かれており、周知のＨｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ（ＨＨ）式に基づいている。インサイチュ腸管灌流での吸収率の直接測定によりｐＨ依存性が裏付けられ、これらの初期の実験において理論と観察とがよく整合していることをさらに支持していた。
【０００９】
ｐＨ分配仮説から、膜透過性は分子が最も荷電しないｐＨで最大になることが示唆される。しかし、これは分子が最も溶けないｐＨでもある。Ｂｒｏｄｉｅの研究ではテストされるすべての化合物が比較的高い水溶解性を有していることに留意することが特に重要である。吸収部位における、非荷電化学種の量と中性化学種がリン脂質膜バリアを横断する傾向との両方が、吸収を予測するための重要な判断材料である。固有透過係数（固有透過率、intrinsic permeability coefficient）Ｐ０は、非荷電化学種の膜輸送を特徴づける。非荷電化学種の濃度Ｃ０は、ＨＨ式によれば、分子の量、溶解度、ｐＫａ、および吸収部位のｐＨに依存する。
【００１０】
コンビナトリアル化学のプログラムは、溶解度が低いと予想される、分子量のより大きい分子を選択する傾向があった。リピンスキーの「ルールオブファイブ」（Lipinski’s ‘Rule of 5’）（Lipinski C., “Amer. Pharm. Rev.” 2002, 5, 82）のような「早期警告」ツールや、二次元構造から溶解度を予測するコンピュータープログラムは、発見計画の早期にそのような分子を除外することを試みている。それでもなお、溶解度を測定するために使用された初期の過度に単純化された方法や、発見測定に使用された有機溶媒（例、ジメチルスルホキシド）の遮蔽効果が原因で、溶解度について解決が難しい多くの分子は識別されないままであった。ネフェロメトリーに基づく動力学的溶解度測定は、高速ではあるが、インシリコでの予測法と同様に信頼できるものでないことは間違いない（Glomme A. et al. “J. Pharm. Sci.”, 2005, 94, 1）。
【００１１】
難溶性（sparingly soluble）分子（例、化合物または薬剤）の溶解度の測定は、数多くの理由から困難なものである。とりわけ、ＨＨ式は、溶液中にアグリゲートおよびミセル様構造物が多く存在することに主に起因して、難溶性分子のｐＨ依存性を不十分にしか予測していない（Bergstrom CAS et al., “Eur. J. Pharm. Sci”, 2004, 22, 387およびUS 6,569,686 B2）。そのようなアグリゲートは、（荷電化学種が存続するｐＨ溶液中において）著しく高い溶解度を有しており、温度に敏感に依存する。
【００１２】
透過性の測定もまた、結果がｐＨのアッセイ方法に特に依存するため、相当な不確実性を伴い、そのようなアッセイ（細胞膜と人工膜の両方の透過性アッセイ）においては、種々の研究室により、水境界層（aqueous boundary layer；ＡＢＬ）、および不完全なマスバランスにて処理されている（Avdeef A. et al., “Eur. J. Pharm. Sci”, 2005, 24, 333）。
【００１３】
故に、医薬の研究開発中の候補選択段階におけるより正確な（それにも関わらず高速な）溶解度法および透過法が、本当に問題となる分子をかなり早い時期に識別するのに特に役立つであろう（Bergstrom CAS et al., “Eur. J. Pharm. Sci”, 2004, 22, 387およびGlomme A. et al. “J. Pharm. Sci“, 2005, 94, 1）。
【００１４】
吸収過程、特にＨＩＡ過程におけるｐＨ、溶解性、透過性の上述した効果の他に、賦形剤の使用が、吸収過程、特に難溶性分子の吸収過程に、本質的に影響を及ぼし得る。上記効果の複雑さを考えると、吸収過程の最適化を可能にする好適な賦形剤を評価するのは非常に難しい課題である。今日、そのような評価は動物実験をすることで行われている。動物実験は通常、比較的時間を消費し、比較的多大な労力を要し、そして倫理的にも議論の余地がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、前記の吸収における賦形剤の効果を考えると、高速に、化合物を節約して、コスト効率よく、かつある程度正確に難溶性分子（即ち、低溶解性化合物または薬剤）の吸収特性を予測することを可能とする、倫理的にも受け入れることのできる方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の開示
本発明によればこのニーズは、独立請求項１の特徴によって規定される方法、および独立請求項２０の特徴によって規定されるコンピュータープログラムによって解決される。好ましい実施形態が、従属請求項の対象となっている。
【００１７】
本発明はとりわけ、低溶解性化合物の予測される吸収特性に対する、賦形剤、ｐＨおよびそれらの組み合わせの効果を評価する方法に関係しており、当該方法は、少なくとも一つの所定のｐＨ値において、低溶解性化合物と賦形剤との組み合わせに対する流束関数（flux function）の変化を評価するステップを有する。
【００１８】
以下で使用する「低溶解性」は、米国食品医薬品局によって生物学的利用能・生物学的同等性の規制ガイドラインとして採用されているバイオファーマシューティクス・クラシフィケーション・システム中の溶解度の定義に基づいている(“FDA guidance for industry waiver of in vivo bioavailability and bioequivalence studies for immediate release solid oral dosage forms containing certain active moieties/active ingredients based on a biopharmaceutics classification system”, CDERGUID/2062dft.wpd Draft, Jan. 1999)。詳細には、溶解度の大きさは、１から８のｐＨ範囲内の最も低い溶解度において、最大ドーズ量の強度を溶かすのに必要な水の量（例えば、ミリリットル（ｍＬ）単位）という面から定義されており、２５０ｍＬが高溶解性と低溶解性との境界線となっている。つまり低溶解性とは、１から８のｐＨ範囲内で、２５０ｍｌ中に最大ドーズ量が完全には溶解しないことを言う。
【００１９】
以下に使用する「流束関数」は、流束関数は単位面積および単位時間あたりのバリアを通過する粒子または質量に対応する、と定義しているAvdeef A., “Absorption and Drug Development”, Wiley Interscience, NY, 2003 の第２章に関係している。
【００２０】
より正確には、前記第２章には以下が記載されている：溶質の受動拡散は膜の内部の溶質の拡散性と濃度勾配との産物であることが膜に適用されたフィックの第一法則により示される。見かけの膜／水分配係数が、後者の内部勾配を、外部のバルク水の、膜によって分離された二つの溶液の間の濃度差と関連付ける。イオン性分子が受動拡散により最も効率的に透過するためには、該分子は膜表面において非荷電型である必要がある（ｐＨ分配仮説）。所与のｐＨにおいて存在する非荷電型の量（これは流束に直接的に寄与する）は、ｐＨ、元々あるキャリアー（タンパク質および胆汁酸）への結合、自己結合（アグリゲートまたはミセルの形成）、および溶解性（固体形態での自己結合）等の重要ないくつかの要素に依存する。低溶解性は、輸送の機会を低下させる条件としての熱力学的な「スピード・アテニュエーター（speed attenuator）」として、輸送についての考慮に入ってくる。このように、透過性と溶解性とは、膜を横断する輸送についての動力学的および熱力学的に関連がある要素である。
【００２１】
均質な脂質膜によって分離されている、二つのチャンバーに分けられた容器（vessel）を考える。左側はドナー（donor）区画であり、そこでサンプル分子がまず導入され；右側はアクセプター（acceptor）区画であり、当該区画は最初は試料分子を持たない。定常状態にある均質な膜に適用されたフィックの第一法則は、輸送方程式
【００２２】
【数３】
【００２３】
(式中、Ｊは流束（単位はｍｏｌ ｃｍ−２ ｓ−１）、Ｃｍ０およびＣｍｈは二つの水−膜境界における膜内の非荷電型の溶質の濃度（ｍｏｌ ｃｍ−３単位）、Ｄｍは膜内の溶質の拡散率（単位はｃｍ２ ｓ−１））
である。定常状態では、膜内の濃度勾配ｄＣｍ／ｄｘは線形である。厚さ１２５μｍの膜では、溶液が非常によく攪拌されると仮定すると、定常状態が確立されるためには約３分を要する。
【００２４】
膜の様々な部分で溶質の濃度を測定することは非常に不便であるというところに方程式（３）の限界がある。しかしながら、バルク水と膜との分配係数logＫd(ｐＨ依存的な見かけの分配係数）を見積もることができるかまたは場合によっては測定することができるため、方程式（３）はより利用しやすい形
【００２５】
【数４】
【００２６】
に変形することができ、Ｋdで置き換えたことで、ドナー区画のバルク水濃度およびアクセプター区画のバルク水濃度（それぞれＣＡおよびＣＤ）を使用することが可能となる。（イオン性分子では、ＣＡおよびＣＤは、全ての荷電状態型について合計した溶質の濃度を表す。）これらの濃度は、標準的な技術で容易に測定しうる。方程式（４）はＤｍおよびＫdを見積もる必要がある為、依然として十分に便利ではない。これらのパラメーターおよび膜の厚さを、「膜透過率（membrane permeability）」と呼ばれる複合パラメーターＰｍ
【００２７】
【数５】
【００２８】
でまとめるのがよく行われる方法である。
【００２９】
分子が単純な膜をどのくらい早く通過するかを予測する方程式（４）の溶解性への関連性は、濃度条件にある。ＣＡが実質的にゼロである「シンク」条件を考える。方程式（４）は、以下の流束方程式
【００３０】
【数６】
【００３１】
に帰着する。
【００３２】
流束は、溶質の有効透過率と、ドナーの膜表面について水側にある全ての荷電状態型について合計した溶質濃度とを掛け合わせた積に依存する。この濃度は、考慮しているｐＨにおける溶解限界をドーズ量が超えている場合（その場合、当該濃度は溶解度に等しい）でなければ、理想的には薬剤のドーズ量と等しいものでありうる。非荷電分子種は透過物質（permeant）であるため、方程式（６）は
【００３３】
【数７】
【００３４】
（式中、Ｐ０およびＣ０はそれぞれ、非荷電化学種の固有透過率（intrinsic permeability）および濃度である）
と言い換えることができる。固有透過率はｐＨに依存しないが、流束方程式におけるその補助係数ＣｏはｐＨに依存する。非荷電化学種の濃度は常に、同じくｐＨに依存しない化学種の固有溶解度Ｓｏに等しいかまたはそれよりも小さい。
【００３５】
非荷電化学種では、方程式（５）は
【００３６】
【数８】
【００３７】
（式中、Ｋｐ＝Ｃｍ（０）／ＣＤ０であり；また、Ｋｐ＝Ｃｍ（ｈ）／ＣＡ０である；ＣＤ０およびＣＡ０は、それぞれドナー側およびアクセプター側の非荷電化学種の水溶液濃度である）
という形をとることに注意されたい。
【００３８】
あるｐＨで飽和している（即ち、余分な固体が存在している）溶液においては、イオン性分子についてのlogＣ０対ｐＨのプロットは極めて単純な形であり、該プロットは、飽和状態と完全な溶解状態との間の境界を示している切れ目の地点でつなげられた直線セグメントの組み合わせである。これらの連結点のｐＨは、計算に使用されるドーズ量に依存し、logＣ０の最大値は、飽和溶液におけるlogＳ０に常に等しい。
【発明の効果】
【００３９】
本発明の方法は、分子（即ち、低溶解性化合物または薬剤）の吸収を最適化することができる賦形剤の、高速、正確、かつ経済的な評価を可能にする。さらにそのような評価においては、動物実験を排除することができ、かつ化合物の使用を減らすことができる。即ち、当該方法は高速で、化合物を節約し、コスト効率がよく、かつある程度正確である為、薬剤候補の将来的な製剤化の有効性（溶解性および透過性に対するｐＨおよび賦形剤の効果）についての正当なスクリーニングを行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
本発明の方法の第一の好ましい実施形態において、流束関数の変化を評価することは：該化合物を含む所定のｐＨ値にあるキャリブレーション・ドナー（calibration donor）溶液を作製するステップを有し；該化合物および該賦形剤を含む該所定のｐＨ値にあるドナー溶液を作製するステップを有し；該化合物および該賦形剤を含まない該所定のｐＨ値にあるレシーバ（receiver）溶液を作製するステップを有し；バリアによって第一レシーバチャンバーから分離されている第一ドナーチャンバー中へキャリブレーション・ドナー溶液を与え、バリアによって第二レシーバチャンバーから分離されている第二ドナーチャンバー中へドナー溶液を与え、かつ、第一レシーバチャンバーおよび第二レシーバチャンバー中へレシーバ溶液を与えるステップを有し；当該溶液を所定の時間インキュベートするステップを有し；かつ、第一レシーバチャンバーおよび第二レシーバチャンバーのレシーバ溶液における該化合物のレスポンス（response）を測定するステップを有する。以下で使用する用語「レスポンス」は、流束関数の変化、特に濃度の変化を評価するのに好適な次元を有する。このような方法により、化合物の吸収特性に対する賦形剤の効果の効率的な評価が可能となる。さらには、このような方法により、特に、例えばＵＳ ７０２２５２８ Ｂ２に記載されている装置のような好適な装置にて行われる場合に、高度に自動化された処理が可能となる。
【００４１】
流束関数の変化を評価することは、上述のステップを複数の所定のｐＨ値において繰り返し行うことを有することが好ましい。この文脈における繰り返しは、あるｐＨ値でのステップから次のｐＨ値でのステップへ順次処理することに限定されず、同時に複数のｐＨ値でのステップを並行処理することをも特に包含する。このような評価により、化合物の吸収特性についての効果を、ｐＨと関連する効果に拡張することが可能となり、また、賦形剤の効果を、ｐＨと関連する効果と組み合わせることが可能となる。その結果、評価の効率を実質的に損なうことなく評価の質を向上させることができるようにして上記全ての効果を賦形剤の評価についての考慮に入れることができる。約ｐＨ５から約ｐＨ７.５の範囲から複数のｐＨ値を選択することが有利でありえ、複数のｐＨ値は具体的には、例えばｐＨ５、ｐＨ６.２、ｐＨ７.５という値を有していてもよい。
【００４２】
流束関数の変化を評価することは、第一レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の化合物のレスポンス（例、濃度）の測定値と、第二レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の化合物のレスポンス（例、濃度）の測定値との比率を決定するステップをさらに有することが好ましい。このような比率により、複数の化合物、複数の賦形剤、および複数のｐＨ値に基づく複数の比率を簡便に表示し概観することができるようにして流束関数の簡便な表現が可能となる。
【００４３】
第一レシーバチャンバーおよび第二レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の化合物のレスポンス（例、濃度）を測定することは、レシーバ溶液の分光学的特性の測定を有することが好ましい。そのような分光学的特性の測定は、例えば液体クロマトグラフィー質量分析法、紫外／可視吸収分光法、赤外分光法、発光分光法、ラマン分光法などの当該技術分野において公知の種々の方法により行うことができる。このような方法を行う装置を好適に使用することにより、レシーバ溶液中の化合物のレスポンス（即ち、特に濃度）の高速かつ効率的な測定が可能となる。
【００４４】
バリアは、ヒト組織、動物組織、植物組織、培養細胞モデル、および人工膜から成る群より選択されることが好ましい。この文脈におけるバリアは、生物学的バリアの物理化学的特性を模倣する、能動拡散性または受動拡散性のバリアにとりわけ関係する。そのため、脂溶性のバリアがさらに好ましい。
【００４５】
流束関数の変化を評価することは、複数の化合物および複数の賦形剤に対して：該複数の化合物のそれぞれと該複数の賦形剤のそれぞれとの各組み合わせを含む、該所定のｐＨ値にある複数のドナー溶液を作製すること；バリアによって複数の第二レシーバチャンバーから分離されている複数の第二ドナーチャンバー中へ該複数のドナー溶液を与え、かつ、該複数の第二レシーバチャンバー中へレシーバ溶液を与えること；および、該複数の第二レシーバチャンバーの該レシーバ溶液中の該化合物のレスポンス（例、濃度）を測定することによって行われることが好ましい。このような並行処理によって、複数の化合物、複数の賦形剤、および複数のｐＨ値に対する流束関数の効率的かつ高速な評価が可能となる。上記並行処理は、例えばＵＳ ７０２２５２８ Ｂ２に記載されている方法および装置を使用することで行うことができる。
【００４６】
本発明の方法の第二の好ましい実施形態においては、流束関数の変化を評価することは：該化合物を含む所定のｐＨ値にあるキャリブレーション・ドナー溶液を作製するステップを有し；該化合物および該賦形剤を含む該所定のｐＨ値にあるドナー溶液を作製するステップを有し；キャリブレーション・ドナー溶液中の該化合物の溶解度およびドナー溶液中の該化合物の溶解度を測定するステップを有し；キャリブレーション・ドナー溶液の透過率およびドナー溶液の透過率を測定するステップを有し；かつ、透過率の測定結果および溶解度の測定結果を流束関数に組み込むステップを有する。このような方法により、化合物の吸収特性に対する賦形剤の効果の効率的な評価が可能となる。特に、このような方法は、透過率および溶解度を別個の実体として明示的に決定することなく、化合物の吸収ポテンシャルに対する賦形剤の効果をモニターするために透過率の変化と溶解度の変化の両方を組み合わせており、それが本発明の方法の第二の実施形態をとりわけ高速にしている。このような方法は、脂溶性のバリアによって分けられている二つのチャンバーの透過システムのレシーバチャンバーにおいて現れる化合物のレスポンスの変化（例、濃度の変化）を、ドナーチャンバー中の賦形剤成分（種類および／または濃度）を変化させながらモニターすることを有してもよい。バリアは、人工膜（例、脂溶性溶液に含浸させたフィルター（即ち、パラレル・アーティフィシャル・メンブレーン・パーミアビリティー・アッセイ（the parallel artificial membrane permeability assay）（ＰＡＭＰＡ）モデル））、培養内皮細胞（例、ＲＢＥ４）、またはその他の培養細胞モデル（例、Ｃａｃｏ−２、ＭＤＣＫ等）を構成して（constitute）もよい。生物学的に意義のある水境界層の厚さおよびｐＨを考慮に入れてもよい。本発明の方法のこの第二の実施形態は、調査している化合物の吸収特性および薬物動態学的特性に対する賦形剤の影響を早期に、高速に、かつコスト効率よく評価することを可能とする、ハイスループットのプレフォーミュレーション・スクリーニング技術に繋がる。
【００４７】
流束関数の変化を評価することは、複数の所定のｐＨ値において上述したステップを繰り返し行うことを有することが好ましい。「繰り返し」という表現に関しては、上述したものが以下においても適用される。このような評価により、化合物の吸収特性についての効果を、ｐＨと関連する効果に拡張することが可能となり、また、賦形剤の効果を、ｐＨと関連する効果と組み合わせることが可能となる。その結果、評価の効率を実質的に損なうことなく評価の質を向上させることができるようにして上記全ての効果を賦形剤の評価についての考慮に入れることができる。約ｐＨ５から約ｐＨ７.５の範囲から複数のｐＨ値を選択することが有利でありえ、複数のｐＨ値は具体的には、例えばｐＨ５、ｐＨ６.２、ｐＨ７.５という値を有していてもよい。
【００４８】
従って、好ましくは、キャリブレーション・ドナー溶液中の化合物およびドナー溶液中の化合物の溶解度の測定は：上記溶液を所定の時間インキュベートするステップを有し；上記溶液を濾過するステップを有し；かつ、濾過溶液中の化合物の量を測定するステップを有する。そのような測定は、当該技術分野において公知の種々のプロセスを行うことによって効率よく、高速に、そして正確にして行うことができ、ここでＵＳ ７０２２５２８ Ｂ２に記載されている方法および装置を使用することはとりわけ有利でありうる。
【００４９】
好ましくは、キャリブレーション・ドナー溶液の透過率およびドナー溶液の透過率の測定は：該化合物および該賦形剤を含まない該所定のｐＨ値にあるレシーバ溶液を作製するステップを有し；膜フィルターによって第一レシーバチャンバーから分離されている第一ドナーチャンバー中にキャリブレーション・ドナー溶液を与え、膜フィルターによって第二レシーバチャンバーから分離されている第二ドナーチャンバー中にドナー溶液を与え、かつ、第一レシーバチャンバー及び第二レシーバチャンバー中へレシーバ溶液を与えるステップを有し；当該溶液を所定の時間インキュベートするステップを有し；かつ、第一ドナーチャンバーおよび第二ドナーチャンバーのドナー溶液中の化合物の量ならびに第一レシーバチャンバーおよび第二レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の化合物の量を測定するステップを有する。ここでもまた、そのような測定は、当該技術分野において公知の種々のプロセスを行うことによって効率よく、高速に、そして正確にして行うことができ、ここでＵＳ ７０２２５２８ Ｂ２に記載されている方法および装置を使用することはとりわけ有利でありうる。
【００５０】
流束関数の変化を評価することは、第一レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の化合物の量の測定値と、第二レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の化合物の量の測定値との間の比率を決定するステップをさらに有することが好ましい。このような比率により、複数の化合物、複数の賦形剤、および複数のｐＨ値に基づく複数の比率を簡便に表示し概観することができるようにして流束関数の簡便な表現が可能となる。
【００５１】
流束関数の変化を評価することは、複数の化合物および複数の賦形剤に対して：該所定のｐＨ値にある、該複数の化合物のそれぞれと該複数の賦形剤のそれぞれとの各組み合わせの複数のドナー溶液を作製すること；該ドナー溶液のそれぞれにおける該化合物の溶解度を測定すること；および、該ドナー溶液のそれぞれの透過率を測定することによって行われることが好ましい。このような並行処理によって、複数の化合物、複数の賦形剤、および複数のｐＨ値に対する流束関数の効率的かつ高速な評価が可能となる。上記並行処理は、例えばＵＳ ７０２２５２８ Ｂ２に記載されている方法および装置を使用することで行うことができる。
【００５２】
上述した本発明の方法の全ての好ましい実施形態において、レシーバ溶液は、少なくとも一つの添加物を含むことが好ましい。そのような添加物により、流束関数の変化の評価を、好適な条件にまでもたらすことができる。例えば、添加物によって当該条件は、生体内の腸管環境をより近しく表すのに適したものになりうる。さらには、当該条件は、例えば改善された処理またはより簡単な処理を可能にするのに適したものになりうる。
【００５３】
添加物は、化合物への高い結合能、低い紫外線吸収性、高い水溶性、および低い蒸気圧の群より選択される少なくとも一つの特性を持つことが好ましい。
【００５４】
本発明の方法は、キャリブレーション・ドナー溶液およびドナー溶液を攪拌するステップを有することが好ましい。そのような攪拌によって、流束関数の変化の評価のための条件を最適化することができる。例えば、目的とする環境を表さないようなミクロの条件が流束関数の変化の評価の際にバリアの近くにもたらされることを防ぐことができる。このことは、例えば、天然バリアの両側が生体内の何らかの流れの下に横たわっている腸管環境が表される場合に、とりわけ興味深い。即ち、このような攪拌により、血液のシンク（ sink ）としての機能を促進することが可能であり、それにより、バリア周辺の拡散勾配を保つことができる。
【００５５】
好ましい実施形態において、当該方法は：賦形剤、化合物およびｐＨ値に関する比率を順位付けするステップを有し；かつ、順位付けされた比率を可視化するステップを有する。そのような順位付けおよび可視化により、複数のｐＨ値で複数の賦形剤と組み合わされた複数の化合物を効率的に概観し、効率的に評価することが可能となる。
【００５６】
好ましくは、比率の順位付けは：全ての化合物および全てのｐＨ値に対して、各賦形剤についての比率の合計値を計算するステップを有し；かつ、比率の合計値を順位付けするステップを有する。全ての賦形剤についてそのような合計値を作り（building）、該合計値を順位付けすることにより、複数のｐＨ値で複数の賦形剤と組み合わされた複数の化合物を、いっそうより効率的に概観し、いっそうより効率的に評価することが可能となる。
【００５７】
好ましくは、当該方法は：全ての賦形剤および全てのｐＨ値に対して、各化合物についての比率のさらなる合計値を計算するステップを有し；かつ、該比率のさらなる合計値を順位付けするステップをさらに有する。全ての化合物についてそのような合計値をさらに作り、該合計値を順位付けすることにより、複数のｐＨ値で複数の賦形剤と組み合わされた複数の化合物を、いっそうより効率的に概観し、いっそうより効率的に評価することが可能となる。
【００５８】
本発明の別の側面は、上述した方法の全てまたは一部のステップを行うために設定されているコンピュータープログラムに関係している。そのようなコンピュータープログラムを使用することにより、当該方法のかなりの部分を効率的に、高速に、かつ正確に行うことができるようにして自動化することが可能となる。とりわけ、流束関数の変化の評価結果を可視化する場合に、好適な賦形剤、薬物およびｐＨ値の評価を迅速に行うことができる。
【実施例】
【００５９】
本発明の方法および本発明のコンピュータープログラムを、例示的な実施形態により、添付の図面を参照して以下により詳細に説明する。
【００６０】
本発明の方法の第一の実施形態は、低溶解性化合物の予測される吸収特性に対する賦形剤、ｐＨおよびそれらの組み合わせの効果を評価するために、透過率の測定結果と溶解度の測定結果とを流束関数に組み込むことを有する。
【００６１】
透過性の適切な測定は、種々の方法で行うことができる。発見においては、Ｃａｃｏ−２やＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓などの単層培養細胞モデル（Ho N.F.H. et al., “Quantitative approaches to delineate passive transport mechanisms in cell culture monolayers”, 2000 in: Amidon G. L. et al., “Transport Processes in Pharmaceutical Systems”, Marcel Dekker, New York, pp. 219-316 and Avdeef A. et al., “Caco-2 permeability of weakly basic drugs predicted with the Double-Sink PAMPA pKa flux method”, Eur. J. Pharm. Sci., 2005, 24, 333-349A）がしばしば使用される。製薬産業では、選択された候補分子が開発フェーズに入るまでは通常、細胞でのそのような研究は賦形剤を選択するために使用されない。通常このステージでは、薬物動態学的な動物モデルが使用される。難溶性ではあるがそれ以外では有望である分子の場合、透過性に対する賦形剤の効果を測定するためのコスト効率のよい手段が利用可能であるならば、早期賦形剤スクリーニング（それは、早期前臨床開発の最初のステップであるかもしれない）は、優先順位をつけるのに有益であり、また、動物実験の回数を最小限に抑えるのに有益であるかもしれない。Ｌｉｕ等（Liu, H. et al., “In vitro permeability of poorly aqueous soluble compounds using different solubilizers in the PAMPA assay with liquid chromatography/mass spectrometry detection”, Pharm. Res., 2003, 20, 1820-1826）が、具体的にはＢｒｉｊ(登録商標)３５、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ、エタノールおよびＴｗｅｅｎ８０といった可溶化剤のスクリーニングのために低コストのパラレル・アーティフィシャル・メンブレーン・パーミアビリティー・アッセイ（ＰＡＭＰＡ）モデルを使用してまさにそれを行うことを提案した最初である。それまでは、ＰＡＭＰＡは有用な調査ではあったが、それは単に早期発見スクリーニングにおいてのみであった。それ以来、医薬品化学者にとって有用な機構的ツールとしてのＰＡＭＰＡの価値はいくつかの例において示されてはきたが、早期前臨床開発におけるＰＡＭＰＡの影響力は、Ｌｉｕ等による上記研究を除いては実証されてこなかった。
【００６２】
本発明の方法の第一の実施形態のための実施例として以下に記載する透過性測定においては、Ｌｉｕ等によって研究された主題を拡張することを提案する。透過性に対する賦形剤の効果を評価するために、６つの賦形剤およびイオン強度調整剤：タウロコール酸ナトリウム、２−ヒドロキシプロピル−ｂ−シクロデキストリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、１−メチル−２−ピロリドンおよびポリエチレングリコール４００の１５の組み合わせで測定した、以下の８つの難溶性薬剤：アステミゾール（astemizole）、ブタカイン（butacaine）、クロトリマゾール（clotrimazole）、ジピリダモール（dipyridamole）、グリセオフルビン（griseofulvin）、プロゲステロン（progesterone）、グリベンクラミド（glybenclamide）およびメフェナム酸（mefenemic acid）についての二重シンクＰＡＭＰＡ測定を報告する。
【００６３】
透過性測定の当該実施例は、二重シンクＰＡＭＰＡ、およびｐＩＯＮ社の二重シンクＰＡＭＰＡ用の脂質（ＰＮ １１００６６９）を用いて、以下の通りに行う。透過性測定のこの実施例において使用する化合物は、表１に挙げた化合物である。二重シンクＰＡＭＰＡ用の脂質は、使用しないときには−２０℃で保存する。アッセイされるドナー溶液のｐＨはｐＩＯＮ社のユニバーサル緩衝液（ＰＮ １００６２１、１１００１５１）で調整し、また、血清タンパク質をシミュレートするためにｐＩＯＮ社の化学捕捉剤緩衝液（chemical scavenger buffer）ＡＳＢ−７.４（ＰＮ １１０１３９）を含有するｐＨ７.４の緩衝溶液をレシーバ溶液として使用する。賦形剤は、ドナーウェルにのみ加える。
【００６４】
【表１】
【００６５】
賦形剤およびその濃度に関して、６つの賦形剤の量は、臨床的に意義のある条件にある胃腸液において想定される濃度と重なるように選択する。ＫＣｌについては、ＦＡＳＳＩＦ／ＦＥＳＳＩＦ培地における濃度（Dressman J. B., “Dissolution testing of immediate-release products and its application to forecasting in vivo performance”, in Dressman J.B.et al., “Oral Drug Absorption”, Marcel Dekker Inc., New York, 2000, pp. 155-181)に従い、二つのレベル：０.１モル（Ｍ）および０.２Ｍを選択する。タウロコール酸ナトリウム（ＮａＴＣ）溶液は、Ｄｒｅｓｓｍａｎ Ｊ. Ｂ.が記載しているような絶食時および摂食時の胃腸管（ＧＩＴ）の状態に対応して、３ミリモル（ｍＭ）および１５ｍＭで調製する。液体賦形剤について、最大のカプセル容量はＧＩＴの容積２５０ｍｌに対して０.６ミリリットル（ｍＬ）であると仮定し、算出される賦形剤の濃度は０.２４％ ｖ／ｖである。従って、１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、プロピレングリコール（ＰＧ）、およびポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）については、０.２４％ｖ／ｖ、１％ｖ／ｖ、５％ ｖ／ｖの賦形剤溶液を評価する。２−ヒドロキシプロピル−b−シクロデキストリン（ＨＰ‐ｂ‐ＣＤ）溶液は、０.２４％ ｗ／ｖおよび１％ ｗ／ｖという同様の濃度で評価する。賦形剤を含まない緩衝溶液も数に入れて全部で１５の異なる溶液を８種類の薬剤分子と共にＰＡＭＰＡにおける効果を評価する（結果として、１２０の薬剤−賦形剤の組み合わせである）。
【００６６】
ｐＫａの測定に関して、電位差滴定装置（instruments potentiomentric）Ｇｅｍｉｎｉ（ｐＩＯＮ社）、ＧＬｐＫａ（Ｓｉｒｉｕｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＵＫ社（Ｓｉｒｉｕｓ社））、ＵＶ−ｍｅｔｒｉｃ Ｄ−ＰＡＳ（Ｓｉｒｉｕｓ社）およびＳＧＡ（Ｓｉｒｉｕｓ社）を正確な電離定数を決定するために使用する。上述した難溶性分子については、実験上の問題を克服するために、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびメタノールを共溶媒として使用するなど、いくつかの対策を試みる。Ｇｅｍｉｎｉ装置では、水溶液または共溶媒のいずれにおいても、沈殿が一部の滴定の際に存在していたとしてもｐＫａを決定することが可能である。これは、当該装置が溶解度および電離定数を同一滴定中に同時に決定することができるためである。その上、Ｇｅｍｉｎｉ装置によって、ｐＨ電極のキャリブレーションを「インサイチュ」でｐＫａの決定と同時に行うことができる。これは、ｐＫａが４から９の範囲の外側にある場合、共溶媒溶液中での決定に関してとりわけ重要な特徴である。これは、Ａｖｄｅｅｆ−Ｂｕｃｈｅｒの４つのｐＨ電極パラメーターを決定するために最初に「ブランク（blank）」滴定を行う従来の方法（Avdeef, A. et al., “Accurate measurements of the concentration of hydrogen ions with a glass electrode: calibrations using the Prideaux and other universal buffer solutions and a computer-controlled automatic titrator”, Anal. Chem., 1978, 50, 2137-2142）と比べて大幅な改善でありうる。
【００６７】
本明細書に記載する透過率測定の実施例においては、アーティフィシャル・メンブレーン・パーミアビリティー・アッセイ（ＰＡＭＰＡ）法を用いる。そのために、ｐＩＯＮ社（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）のＰＡＭＰＡ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ装置を使用し、データを室温（２５±２℃）で集める。ＰＡＭＰＡの９６ウェルの「サンドイッチ」に９６個のｐＩＯＮ社のマグネチックスターラー（ＰＮ １１０２１２）をあらかじめ入れておく。典型的なサンプル濃度は、賦形剤含有緩衝溶液中、約５０μＭである。これらの溶液中の残留ＤＭＳＯは、０.５％ｖ／ｖである。各化合物についての有効透過率ＰｅをｐＨ３からｐＨ１０の領域で測定する。ドナー溶液はｐＨについて様々であるが（ＮａＯＨ処理したユニバーサル緩衝液）、レシーバ溶液は同一のｐＨ７.４を有する。最適化されたｐＨ勾配条件をｐＯＤの方法（Ruell J.A. et al., “PAMPA - a drug absorption in vitro model”, 5, “Unstirred water layer in iso-pH mapping assays and pKaflux-optimized design (pOD-PAMPA)”, Eur. J. Pharm. Sci., 2003, 20, 393-402）を用いて選択するが、それは、ｐＨ値が化合物のｐＫａｆｌｕｘ値（以下で定義する）の上となるのと下となるのとを確実にするためである。ｐＨの差異は、電離作用および吸収境界層（absorption boundary layer；ＡＢＬ）の作用に対して、有効透過率の値を補正するために必要である（Avdeef A., “Absorption and Drug Development”, Wiley-lnterscience, 2003, pp. 116-246; Avdeef A. et al., “S. Caco-2 permeability of weakly basic drugs predicted with the Double-Sink PAMPA pKaflux method”, Eur. J. Pharm. Sci., 2005, 24, 333-349;およびAvdeef A. et al., “PAMPA - a drug absorption in vitro model”, 11, “Matching the in vivo aqueous boundary layer by individual-well stirring in microtitre plates”, Eur J. Pharm. Chem., 2004, 22, 365-374）。レシーバ溶液は、薬剤結合タンパク質の機能の一部を模倣するために界面活性剤混合物（「脂溶性シンク」）を含有する（Avdeef A. et al., “High-throughput measurements of permeability profiles” in: van de Waterbeemd H. et al., “Drug Bioavailability. Estimation of Solubility, Permeability, Absorption and Bioavailability”, Wiley - VCH: Weinheim, 2002, pp. 46-71）。当該アッセイでは激しい撹拌が用いられ、撹拌速度は約４０μｍの厚さの水境界層（ＡＢＬ）を作り出すよう設定されるが、それは、測定される透過率についてのＡＢＬの寄与を、ＧＩＴにおいて想定されるそれと合致させるためである（Avdeef A. et al., “PAMPA - a drug absorption in vitro model”, 11, “Matching the in vivo aqueous boundary layer by individual- well stirring in microtitre plates”, Eur J. Pharm. Chem., 2004, 22, 365-374）。ＰＡＭＰＡサンドイッチを集め、高透過性分子については、例えば磁気撹拌機構が内蔵されているｐＩＯＮ社のＧｕｔ−Ｂｏｘ（商標）（ＰＮ １１０２０５）といった、環境制御されたチャンバー中で３０分間インキュベートしておく。次いでサンドイッチを分離し、ドナーウェルとレシーバウェルとの両者について、標準参照溶液から得られるＵＶスペクトル（２３０ｎｍから５００ｎｍ）と比較することで、存在する物質の量をアッセイする。膜フィルターに残っている物質の量（％Ｒ）およびマイクロタイタープレートのプラスチック壁に付着している物質の量を決定するためにマスバランスを使用する（Avdeef A., “Absorption and Drug Development”, Wiley-lnterscience, 2003, pp. 116-246）。
【００６８】
有効透過率Ｐｅは、使用可能なフィルター面積０.３ｃｍ２に見かけの空隙率０.７６を乗じることを除いて、以前に記載されたようにして計算する。この後者のステップは、異なる空隙率を有するフィルターを使用するＰＡＭＰＡアッセイで決定されたＡＢＬの厚さが絶対尺度にあることを確かにする（Nielsen P.E. et al., “PAMPA - a drug absorption in vitro model”, 8, “Apparent filter porosity and the aqueous boundary layer”, Eur. J. Pharm. Sci., 2004, 22, 33-41）。
【００６９】
ＧＩＴ上皮環境では、ＡＢＬの厚さは３０〜１００μｍであると想定され、一方、攪拌を行わないＰＡＭＰＡでは、ＡＢＬの厚さは４０００μｍもの高さになりうる（Avdeef A. et al., “S. Caco-2 permeability of weakly basic drugs predicted with the Double-Sink PAMPA pKaflux method”, Eur. J. Pharm. Sci., 2005, 24, 333-349; Avdeef A. et al., “PAMPA - a drug absorption in vitro model”, 11, “Matching the in vivo aqueous boundary layer by individual-well stirring in microtitre plates”, Eur J. Pharm. Chem., 2004, 22, 365-374）。あるｐＨ範囲に渡ってＰＡＭＰＡ（攪拌または非攪拌）のデータを取得し、以下に簡潔に説明するｐＫａｆｌｕｘの方法を用いることで、ＡＢＬの影響を、ＧＩＴに関して想定されるＡＢＬの影響と合致させることが可能である（Avdeef A., “Absorption and Drug Development”, Wiley-lnterscience, 2003, pp. 116-246;およびAvdeef A. et al., “S. Caco-2 permeability of weakly basic drugs predicted with the Double-Sink PAMPA pKafluxmethod”, Eur. J. Pharm. Sci., 2005, 24, 333 - 349）。
【００７０】
有効透過係数Ｐｅは、膜透過係数およびＡＢＬ透過係数（それぞれＰｍおよびＰＡＢＬ）と、
【００７１】
【数９】
【００７２】
のようにして関係する。
【００７３】
イオン性分子に関しては、膜透過率Ｐｍはバルク水溶液のｐＨに依存する。可能な最大のＰｍを、非荷電化学種の固有透過率Ｐ０と表す。弱い一塩基酸および弱い一酸塩基に関しては、ＰｍとＰ０との関係は、非荷電化学種の割合ｆ０の観点から、
【００７４】
【数１０】
【００７５】
のように記述することができ、ここで「＋」は酸に対して、「−」は塩基に対して使用されている。その他の場合については、他の場所に記載されている。式（９）と式（１０）とを組み合わせることにより、
【００７６】
【数１１】
【００７７】
が導かれる。
【００７８】
高透過性分子に関しては、
の場合に、ＡＢＬに限定された輸送がしばしば観察される。これは概して脂溶性薬剤で観察されるが、脂溶性薬剤では分子に関わらず同様のＰｅ（約３０ｘ１０−６ｃｍ／s）が測定され、このことは膜よりむしろ水の特性を示している。式（１１）は、対数の形に帰着する（Avdeef A. et al., “S. Caco-2 permeability of weakly basic drugs predicted with the Double-Sink PAMPA pKafluxmethod”, Eur. J. Pharm. Sci., 2005, 24, 333-349）。
【００７９】
【数１２】
【００８０】
可能な最大の有効透過率（測定値）Ｐｅｍａｘは、
【００８１】
【数１３】
【００８２】
と定義される。
【００８３】
Ｐｏ>>ＰＡＢＬ（高透過性分子）の場合、
であり、これは膜の拡散よりむしろ水の拡散を示している。「流束」の電離定数ｐＫａｆｌｕｘは、透過バリアを横切る輸送に対する抵抗が、５０％はＡＢＬによるものであり、５０％は膜によるものであるｐＨ値をいう。
【００８４】
本明細書に記載する例示的な透過率測定の結果およびその解釈に関して、図１は、種々の使用されている「当該技術分野の現状」の方法により決定された電離定数の比較を示している。当該化合物はすべて水にほんの少しだけ溶けるため、共溶媒を使用し、そしてＧＬｐＫａ装置およびＤ−ＰＡＳ装置の場合にはＹａｓｕｄａ−Ｓｈｅｄｌｏｖｓｋｙ（Avdeef A. et al., “pH-metric logP”, 3, “Glass electrode calibration in methanol-water, applied to pKa determination of water-insoluble substances”, Anal. Chem., 1993, 65, 42-49）の方法により水での値を外挿し、Ｇｅｍｉｎｉ装置の場合にはゼロｗｔ％の共溶媒にまで直線外挿することにより水での値を外挿する。商業的に作られているＳＧＡ装置は現在のところ、共溶媒についての機能を持たないため、ユニバーサル水性緩衝液のみを使用する。Ｄ−ＰＡＳ装置およびＳＧＡ装置はＵＶベースであるため、ｐＫａの決定において、より低い濃度の溶液を使用して低い水溶解度という問題の、全てではないが一部を回避することが可能である。最もよく使用されている二つの共溶媒：ＤＭＳＯおよびメタノールをこの例示的な透過率測定では用いる。ほとんど全ての場合において、ＤＭＳＯでの外挿したｐＫａ値は、メタノール−水混合液から外挿したｐＫａ値よりも体系的に低く、ｐＫａＤＭＳＯ＝０.６１＋０.８６ｐＫａＣＨ３ＯＨ（ｒ２＝０.９９、ｓ＝０.２７、ｎ＝８）という傾向に従っている。ブタカインおよびアステミゾールは二酸塩基であるため、共溶媒の非存在下において、低ｐＨのｐＫａを決定することが実際に可能である。両方の場合において、ＤＭＳＯでの外挿値はメタノールでの外挿値よりもバイアスされている。不一致は、ブタカインの低ｐＨのｐＫａ値の場合に特に顕著である。メタノールでの外挿値は概してより正確であるように思われ、これは、メタノールはｐＫａの決定で使用する共溶媒のうち「最も問題ないもの」と見なされていることによって支持される結論である。共溶媒の使用は利用可能な特徴ではなく、また、図１における相等線（identity line）からのずれが大きいため、この例示的な透過率測定においては、ＤＭＳＯでの結果を除いて、ＳＧＡでの値を信頼するべきではない。黒丸が相等線の最も近くにあることで示される通り、最良の一致は電位差滴定でのＧＬｐＫａの値とＧｅｍｉｎｉの値との間で見られることを図１は明らかにしている。
【００８５】
ＧＬｐＫａでの値およびＧｅｍｉｎｉでの値を、研究セットについて単純に平均化してもよいが、この例示的な透過率測定では以下の理由からそれを行わない：共溶媒−水の比率が沈殿を回避するために十分高く選ばれているという、うまく設計されているアッセイであるにも関わらず、最も低い共溶媒−水の比率において沈殿が起こらないことを確実にすることは不可能に近い。ＧＬｐＫａのサンプルチェンジャーの設計が原因で、滴定の最中に溶液を見るのには不都合がある。それに対してＧｅｍｉｎｉは、よく見えるガラスバイアルを有している。多くの場合に、当該低溶解性化合物について多少の沈殿がＧＬｐＫａ中で起こっていたのはほぼ間違いないことを視覚的観察は示していた。さらには、Ｇｅｍｉｎｉでの電極キャリブレーションの方法は、３未満のｐＫａ値を、共溶媒溶液においてより信頼できるものにしていた。
【００８６】
図２は、ＧｅｍｉｎｉでのｐＫａ測定の結果に関する。図２は、従来法で設計されているアッセイおよび、従来法での測定における通常の結果ではどうしてもうまくいかないことがありうるが、対照的にＧｅｍｉｎｉはそれらを回避して計算する（circumcalculated）ことを示している。１１〜４９ｗｔ％メタノール中でのクロトリマゾールのｐＫａの６つの測定を図２に示している。共溶媒ゼロに外挿したｐＫａは、６.０２±０.０５である。図２の挿入図は、１１ｗｔ％、２８ｗｔ％および３９ｗｔ％での滴定についてのビエルム（Bjerrum）のプロット（Avdeef A. “Absorption and Drug Development”, Wiley-lnterscience, 2003, pp. 116-246）である。挿入図中の破曲線は、沈殿が起こらないであろう無限に低いサンプル濃度の極限において期待される曲線に対応している。測定点を繋ぐ実曲線は、沈殿なしの破曲線からの有意なずれを示している。このずれは、３５ｗｔ％より低いメタノールでの滴定ではクロトリマトゾールが沈殿したために生じている。従来の精密化（refinement）プログラムは、このような沈殿を影響に入れず、共溶媒の比率が減少するにつれてｐＫａを体系的に低く見積もってしまい、１１ｗｔ％の場合には誤差は対数単位にまでなる（図２挿入図）。バイアスされた値が外挿の基礎であれば、ｐＫａは対数単位でずれて５に近くなってしまう（データ示さず）。
【００８７】
Ｇｅｍｉｎｉ装置の精密化プログラムの他とは異なる特徴は、溶解度とｐＫａ値とを同時に精密化するため、多少の沈殿の存在下でもバイアスされていないｐＫａ値を決定できることである。図２におけるフィットは、個々のセットの精密化で得られた誤差で重み付けされており、ここで当該精密化は、「過度の」沈殿がｐＫａ値の正確な決定を妨げる場合には、最も低い共溶媒のｗｔ％の点からの寄与の重みを低くするものである。
【００８８】
当該新規ｐＫａ技術は、最も溶けない化合物の電離定数を決定するのに最適である。以下の改善は明らかである：（ａ）より低い比率での沈殿を回避して計算するため、より広範な共溶媒の比率が実行可能であること、（ｂ）より精度の高い決定のために、より高いサンプル濃度を使用できること、（ｃ）「最善の」共溶媒の比率を選択することについての外挿プロセスに対する重要性がより低く、該方法をより「フォールト」トレラント（“fault” tolerant）にしていること、および（ｄ）インサイチュでのｐＨ電極のキャリブレーションにより、より広いｐＨ枠でのｐＫａの決定が共溶媒滴定において可能であること。
【００８９】
表１（上記参照）に、０．１５Ｍ（ＫＣｌ）のイオン強度においてＧｅｍｉｎｉで決定したｐＫａ値を示す。透過性緩衝液のほうが低イオン強度であるため、これらの値を０.０１Ｍのイオン強度レベルに換算し、その後の全てのＰＡＭＰＡ解析で使用するが、それは、緩衝性緩衝液はより低いイオン強度にあるためである。ＫＣｌが０．１Ｍおよび０．２Ｍの場合に、該定数への適切な（appriate）調整を行った（Avdeef A., “Absorption and Drug Development”, Wiley-lnterscience, 2003, pp. 116 - 246）。
【００９０】
図３は、賦形剤なしでのＰＡＭＰＡ測定に関する。図３は、上述の分子についての、賦形剤なしの透過率特性を示している。実線は、式（１２）に従うｐＨの関数として、有効透過率値logＰｅ（黒丸）の最良適合を示している。ｐＫａｆｌｕｘ値の実例を図３（ａ−ｃ、ｇ、ｈ）に示している。計算された水境界層（ＡＢＬ）の透過率の値（点横線）を有効透過率の値（式（９）および式（１０））についての要素から除外した場合に、破線の膜透過率曲線logＰｍ対ｐＨとなる。図３（（ｄ）および（ｅ）を除いた全て）における実線曲線は、その最大限度においても破線曲線の下にあることから、ＡＢＬに限定された輸送の実例である。塩基の場合、ｐＨ>>ｐＫａｆｌｕｘでは式（１２）は横線となり、ｐＨ<<ｐＫａｆｌｕｘでは式（１２）は＋１の勾配を持つ斜線となる。酸の場合、ｐＨ<<ｐＫａｆｌｕｘでは式（１２）は横線となり、ｐＨ>>ｐＫａｆｌｕｘでは式（１２）は−１の勾配を持つ斜線となる。
【００９１】
プロゲステロンを除いて全ての透過率データは、４０μｍのＡＢＬに設定したＧｕｔ−Ｂｏｘを用いて測定し、また、直接的なｐＫａｆｌｕｘの方法は非イオン性分子で使用できないため、プロゲステロンの場合には、該設定は２５μｍのＡＢＬである。それらの分子について、キャリブレーションの方法が知られている（Avdeef A. et al., “Caco-2 permeability of weakly basic drugs predicted with the Double-Sink PAMPA pKaflux method”, Eur. J. Pharrn. Sci., 2005, 24, 333 - 349;およびAvdeef A. et al., ,,PAMPA - a drug absorption in vitro model”, 11, “Matching the in vivo aqueous boundary layer by individual-well stirring in microtitre plates”, Eur J. Pharm. Chem., 2004, 22, 365-374）。精密化したＡＢＬの厚さ（式（１２））を図３に示すが、それらは２１〜９７μｍに及ぶ。７５μｍを超える３つの値は、ブタカイン、メフェナム酸およびグリベンクラミドが溶液中でアグリゲート化することを示している可能性がある。ＡＢＬの透過率は水溶液中に拡散している化学種の分子量に依存するため、モノマー分子量を計算に使用すると、ＡＢＬの見かけの厚さが増加する。
【００９２】
賦形剤ありでのＰＡＭＰＡ測定に関しては、１２００回を上回る二重シンクＰＡＭＰＡ測定を３〜１０のｐＨ範囲内で行う。固有透過率およびＡＢＬの透過率を計算するために、高精度のｐＫａ（High-precision pKas）（Ｇｅｍｉｎｉ）をｐＫａｆｌｕｘの方法に用いる。この例示的な透過率測定で決定した１２０のＰ０値を、最大膜残留率（maximum membrane retention）（％Ｒ）およびＡＢＬの見かけの厚さとともに、表２にまとめている。
【００９３】
【表２】
【００９４】
最も透過性の高い分子はアステミゾールであり、Ｐ０値は０.５ｃｍ／s（０.２４％ ｖ／ｖ ＰＥＧ４００および１５ｍＭ ＮａＴＣ）から３２ｃｍ／s（３ｍＭ ＮａＴＣ）に及んでいる。最も透過性の低い分子はグリセオフルビンであり、Ｐ０値は１.８ｘ１０−４ｃｍ／s（５％ ｖ／ｖ ＰＧ）から４.１ｘ１０−４ｃｍ／s（０.１Ｍ ＫＣｌ）に及んでいる。
【００９５】
膜残留はほとんどの分子でかなりのものであり、アステミゾールが最上位に位置しており、値は典型的に７９％〜９０％の範囲内である（しかし、１５ｍＭ ＮａＴＣの場合には、２４％まで低下している）。水相からこのように減少するにも関わらず、それでもなおＰＡＭＰＡ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ装置のソフトウェアによってアステミゾールの透過率にアクセスすることが可能である。表２に示すとおり、他の残留分子については賦形剤とともに順位が変化する。例えば１５ｍＭ ＮａＴＣの場合のように、そして特にクロトリマゾール（賦形剤なしでの値８０％と比較して、残留率が４％にまで低下している）についてのように、低い膜残留率は、賦形剤が化合物の保持についてＰＡＭＰＡ膜と効率的に競合することを示している。
【００９６】
表２に挙げたＡＢＬの厚さは、賦形剤−薬剤相互作用についても示唆している。理想的に、薬剤が賦形剤を含まない溶液中でアグリゲートを形成することもなく、また、賦形剤と結合した複合体を形成することもないとすれば、決定されるＡＢＬの厚さｈＡＢＬは約４０μｍ（あるいは、非常に攪拌されているプロゲステロン溶液の場合には２５μｍ）であったはずである。アステミゾールやクロトリマゾールについてなど多くの場合に、予測されるｈＡＢＬ＜５０μｍが決定されている。しかしながら全く対照的に、１５ｍＭ ＮａＴＣ溶液中での計算されたＡＢＬの厚さは、多くの場合に１０００μｍを上回っている。理論的に予測されるＰＡＢＬおよび実験的なＰＡＢＬを表２に挙げている。観察された最小値は、非常に大きい分子量を有する、結合した複合体の影響から生じていると解釈することができる。ＰＡＢＬとＭＷとの関係は当該技術分野において公知である。例えば、Avdeef A., “The Rise of PAMPA”, Expert Opin. Drug Metab. Toxicol., 2005, 1, 325-342の式４を見かけのＰＡＢＬに適用すれば、賦形剤を含まない溶液（０％ ＮａＴＣ、表３）は、アステミゾール、クロトリマゾールおよびジピリダモールの場合にはモノマーの水拡散を示すようであるが、それは、見かけの分子量ＭＷ＊（４０μｍのＡＢＬという仮定に基づく）の真の分子量に対する割合ＭＷ＊／ＭＷが１に近いためである。他の一部の低溶解性薬剤については、同様の緩衝溶液中で、アグリゲートまたは４〜７のオーダーを示すようである（Streng W.H. et al, “Determination of solution aggregation using solubility, conductivity, calorimetry, and pH measurements”, Int. J. Pharm., 1996, 135, 43-52）。３ｍＭのタウロコール酸ナトリウム溶液中では、ジピリダモールのみがモノマーとして振舞っているようであるが、他の分子は、３〜５のオーダーのアグリゲートとして現れている。これらのアグリゲートは、薬剤と賦形剤との結合でありうる。１５ｍＭのＮａＴＣ溶液ではＡＢＬ透過率が極端に減少し、単純化した分析によれば５６０００ものオーダーのアグリゲート化が示されたが、これは妥当であるとは思われない。１５ｍＭ ＮａＴＣ溶液はマイクロタイタープレート中で容易にバブルを形成するためロボット装置中で機能し難いことから、賦形剤との複合体形成が唯一の解釈であるとまさに確信することは困難である。１５ｍＭ ＮａＴＣ溶液がＰＡＭＰＡ膜の一部を溶かしている可能性も懸念されるが、その影響の目に見える証拠（溶液の混濁）は観察されていない。
【００９７】
賦形剤含有溶液でのlogＰ０と、賦形剤を含まない（基準レベル）溶液でのlogＰ０との差を、賦形剤の量の関数として図４にプロットしている。塩基性薬剤（bases）は酸性薬物（acids）および中性薬物（neutrals）とは異なる挙動であることが多くの場合に明らかである。ＫＣｌ溶液、ＮＭＰ溶液およびＰＥＧ４００溶液において、塩基性薬剤では、賦形剤存在下で固有透過率が低下するようであるが、酸性薬剤および中性薬剤では、透過率は上昇する。ＮａＴＣおよびＨＰ‐β‐ＣＤを含有する溶液では、最大の賦形剤レベルにおいて、全ての化合物で透過率が減少するようである。そのような賦形剤への薬剤の結合は十分に強く、そのため残りの遊離の部分の、結合していない薬剤濃度が著しく低下し、その結果、透過セルにおけるドナー区画とアクセプター区画との間の濃度勾配が減少し、透過率の減少に繋がっているようである。
【００９８】
本明細書に記載する例示的な透過率測定の結果の視覚化に関して、図４には賦形剤の効果が記載されてはいるが、図４を迅速に把握して賦形剤の使用に関する実際的な決定をするのは視覚的には困難である。それゆえ、ＰＡＭＰＡマッピング（PAMPA-Mapping）と呼ばれるマッピングスキームを図５、図６および図７に示しており、ＰＡＭＰＡマッピングは賦形剤の効果についての視覚的側面を改善している。示しているのはＰＡＭＰＡマッピングについての３つの成分のマップである：透過率（図５）、膜残留率（図６）およびＡＢＬ（図７）。縦軸に沿ってあるのは賦形剤組成物であり、それらは、固有透過率に対する増強効果によって順序付けされている。横軸に沿ってあるのは薬剤であり、透過率を最も増強するものから最も増強しないものの順番で並べている。全ての賦形財についての平均では、酸性薬剤および中性薬剤の固有透過率は増強されているが塩基性薬剤については低下している。赤や黄色などの暖色は、賦形剤の結果としてマップされた特性の増加を示しており、基準レベルは賦形剤なしでの結果として定義されている。青紫（blue violett）などの寒色は、その反対を示している。例えば、設計目標が透過率の増強である場合、透過率マップの左上隅が透過率増加について最も有望な分子と賦形剤との組み合わせを示しており、マップの右下隅が最も問題のあるであろう領域を表している。
【００９９】
図６の膜残留率のマップは、図５の透過率マップとある程度重複している。単純化されたフィックの拡散法則のみが輸送に関与しているのであれば、２つのマップは原理的には同一となるはずである。しかしながら、２つのマップの間にはわずかな（suble）違いがあることが分かる。残留率が著しく増加した場合、分析で検出される化合物があまりに少なくなるというのが、この効果を説明する一つの考えである。本明細書で考慮するケースでは、それが問題となるものはない。レシーバ区画においてＤｏｕｂｌｅ−Ｓｉｎｋ捕捉剤が存在しないことにより、膜残留率のマップがＰＡＭＰＡ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ装置で使用されるＵＶ検出法に対する解析上の克服出来ない問題を示しているように思われる。
【０１００】
図７のＡＢＬマップは、大まかには、図５および図６の他の二つのマップのミラーイメージである。ｈＡＢＬの比率の上昇は、水層におけるより遅い拡散と膜残留率の減少とに繋がる高い薬剤−賦形剤相互作用を意味するものと解釈されうる。ＡＢＬマップについての予想外の解釈としては、一部の薬剤は賦形剤を含まない溶液中でアグリゲートを形成するが（上記参照）、特定の賦形剤存在下では、該薬剤が自己結合する傾向は減少するということがありうる。これは、例えばマップ上で濃いブルーの領域で示されているように、ＫＣｌ、０.２４％ ｖ／ｖ ＰＧ、１％ ｖ／ｖ ＮＭＰおよび１％ ＰＥＧ中のグリベングラミド、ブタカインおよびジピリダモールについて事実でありうる。
【０１０１】
導入したカラーマップは新しく、その用途はますます発展していく。マップは、外見上システマティックに見えるが、それは一部には賦形剤と化合物とが最適な方法で順序付けされたためである。多くの分子、そしてもしかしたらより多くの条件および種類の賦形剤の場合には、マップがある種の同様のスキームにより「自己組織化」するインシリコのアルゴリズムが開発されうる。
【０１０２】
本発明の方法の第一の実施形態について適切な溶解度の測定はまた、種々の方法で行うことができる。多くの分子、特に発見プログラム由来の分子は、非常に低い溶解度を有しうるため、溶解度の測定は、迅速であることと化合物を節約することとの両方である必要がある。溶解度に対する賦形剤の効果のスクリーニングが、仕事をさらに厄介なものにしている。それにも関わらず、可溶化剤をシステマティックにスクリーニングする迅速な方法が出てきている。Ｃｈｅｎら（Chen, H. et al., “A high-throughput combinatorial approach for the discovery of a Cremophor EL-free paclitaxel formulation”, Pharm. Res., 2003, 20, 1302 - 1308）は、クレモフォアＥＬを含まない改善されたパクリタキセル（非常に確立された市販薬）製剤を発見するための多くの組み合わせのうち、１２の賦形剤（ＰＥＧ４００、ポリソルベート８０およびエタノールを含む）について約１００００の組み合わせをスクリーニングするための全実施要因ロボットアッセイを使用している。一部実施要因実験計画法（ＤＯＥ）を使用してそのような迅速法の効率と精度との両方を向上させる好機が明らかに存在している。ＤＯＥの方法をロボット制御に直接結びつける市販のソフトウェアが当該技術分野において存在している。また、起こりうるアグリゲート化の効果に対して溶解度のデータを適切に処理する計算法を自動化する好機も存在している。
【０１０３】
本明細書に記載する例示的な溶解度−賦形剤測定においては、ＰＡＭＰＡマッピングの方法が導入されるＤｏｕｂｌｅ−Ｓｉｎｋ ＰＡＭＰＡ賦形剤で研究される主題は、６つの賦形剤（タウロコール酸ナトリウム、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、１−メチル−２−ピロリドンおよびポリエチレングリコール４００）の１５の組み合わせで測定される８つの難溶性薬剤（アステミゾール、ブタカイン、クロトリマゾール、ジピリダモール、グリセオフルビン、プロゲステロン、グリベンクラミドおよびメフェナム酸（mefenemic acid））に基づいている。
【０１０４】
溶解度測定の上記実施例は、化合物アステミゾール、ブタカイン、クロトリマゾール、ジピリダモール、グリセオフルビン、プロゲステロン、グリベンクラミドおよびメフェナム酸を用いて行う。アッセイするドナー溶液のｐＨは、ｐＩＯＮ社のユニバーサル緩衝液（ＰＮ １００６２１、１１００１５１）で調整する。
【０１０５】
溶解度測定のこの実施例で使用する賦形剤は、臨床的に意義のある条件にある胃腸液で想定される濃度に重なるよう選択されている量の６つの賦形剤を含む。簡潔に述べれば、ＫＣｌは０．１Ｍおよび０．２Ｍに選択し；タウロコール酸ナトリウム（ＮａＴＣ）溶液は、絶食時および摂食時のＧＩＴの状態(３５)に対応して、３ｍＭおよび１５ｍＭにて調製する。液体賦形剤について、最大のカプセル容量はＧＩＴの容積２５０ｍｌ(３５)に対して０.６ｍＬであると仮定し、算出される賦形剤の濃度は０.２４％ ｖ／ｖである。従って、Ｎ−メチルピリリドン（N-methylpyrrilidone）（ＮＭＰ）、プロピレングリコール（ＰＧ）およびポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）については、０.２４％ ｖ／ｖ、１％ ｖ／ｖおよび５％ ｖ／ｖの賦形剤溶液を試験する。ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ‐β‐ＣＤ）（ＭＷ １３９６、溶解度４５０ｍｇ／ｍＬ）などのカプセル化される固体賦形剤については、２７０ｍｇを０．６ｍＬのカプセルに詰める（ＧＩＴ容積中、０．１％ w/v溶液に一致する）ことができるはずである。溶解度測定のこの実施例においては、わずかに高い値０．２４％ ｗ／ｖおよび１％ ｗ／ｖを用いる。賦形剤を含まない緩衝溶液も数に入れて全部で１５の異なる溶液を８種類の薬剤分子と共に溶解度に対する効果について試験する（結果として、１２０の薬剤−賦形剤の組み合わせである）。
【０１０６】
ｐＫａの測定に関して、高精度のｐＫａのデータを、ｐＩＯＮ社のＧｅｍｉｎｉ装置を使用する電位差滴定法により決定するが、該高精度のｐＫａのデータは、Ｇｅｍｉｎｉ装置が水溶液または共溶媒のいずれにおいても、沈殿が一部の滴定の際に存在していたとしてもｐＫａを決定することが可能であることを利用して、メタノール−水溶液中での外挿によって決定する。ｐＨ電極のキャリブレーションをｐＫａの決定と同時に、該装置によってインサイチュで行ったが、それは共溶媒溶液中でｐＫａ＜３またはｐＫａ＞１０である場合に特に重要な特性である。
【０１０７】
ｐＩＯＮ社（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）のμＳＯＬ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ装置に実装されている、高度に自動化された直接ＵＶの９６ウェルマイクロタイタープレートの平衡溶解度法をこの溶解度測定の実施例実施例においては使用し、データは室温（２５±２℃）で集める。サンプルは、典型的には１０〜３０ｍＭのＤＭＳＯ溶液として導入する。ロボット液体ハンドリングシステム（例、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｂｉｏｍｅｋ−ＦＸ ＡＤＭＥＴｏｘ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）でＤＭＳＯストック溶液の３〜１０μＬアリコートを取り出し、ユニバーサル緩衝水溶液に、賦形剤含有緩衝溶液中で最終（最大）サンプル濃度が５０〜２５０μＭになるように混ぜる。残留ＤＭＳＯ濃度を、最終緩衝液中で１.０％（ｖ／ｖ）に保つ。溶液のｐＨを様々に変える（ＮａＯＨ処理したユニバーサル緩衝液）。このことは、アグリゲーションの定数および固有溶解度定数（the aggregation and intrinsic solubility constants）を決定するために必要である（Avdeef A. et al., ”Dissolution - Solubility: pH, Buffer, Salt, Dual-Solid, and Aggregation Effects” in: Testa B. et al., “Comprehensive Medicinal Chemistry II, Vol. 5”, ADME-TOX Approaches: Elsevier: Oxford, UK, 2006）。各溶解度−ｐＨ測定を重複して行い、該装置のソフトウェアによりその結果を平均化する。アッセイに使用する緩衝液は、ロボットシステムにより自動的に調製される。緩衝液およびｐＨ電極のクオリティコントロールは、Ａｖｄｅｅｆ−Ｂｕｃｈｅｒ（Avdeef, A. et al., “Accurate measurements of the concentration of hydrogen ions with a glass electrode: calibrations using the Prideaux and other universal buffer solutions and a computer-controlled automatic titrator”, Anal. Chem., 1978, 50, 2137-2142）の方法を取り入れてアルカリ滴定により行う。１８±１時間後に、薬剤固体の懸濁を含有する緩衝溶液を濾過し（０.２μｍ孔マイクロフィルター）、参照標準で得られたＵＶスペクトル（２３０ｎｍから５００ｎｍ）との比較により、存在する物質の量について上澄み液をアッセイするが、それにはＥｖｏｌｕｔｉｏｎ装置に付随する特許された分光学的方法を用いる。
【０１０８】
図８のケース１ａ、１ｂ、２ａおよび２ｂに関して、化合物が水溶液中でダイマーまたはより高次のオリゴマーを形成する場合には、溶解度特性−ｐＨプロファイルは、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ式（図８の実曲線参照）によっては予測されない形をとり、また、希釈水溶液または希釈共溶媒溶液中での電位差滴定で決定された場合、真のｐＫａ（例、図８のケース１ａおよび１ｂ）とは異なる見かけのｐＫａをしばしば示すと述べることができる（２９）。アグリゲーションによって引き起こされたlogＳ−ｐＨ曲線の歪曲の６種類のケースを図８は示している。ケース１ａ、１ｂ、２ａおよび２bの導き出し方（derivation）は文献に記載されており、また、根底にある固有溶解度の値を取り出す方法は当該技術分野において公知である。ケース３ａおよび３ａｘの処理は新しく、それらの導き出し方は以下に簡潔に記載されている。溶解度解析におけるこのようなｐＫａシフトに基づいて、フェナゾピリジン（図８のケース２b）、インドメタシン（図８のケース２ａ）、２‐ナフトエ酸（図８のケース２ａ）およびピロキシカム（図８のケース１ａ）について、１.７ｘ１０＋３Ｍ−１から１.８ｘ１０＋５Ｍ−１に及ぶ二量化定数（dimerization constants）を提案する（Avdeef A. et al., “Dissolution - Solubility: pH, Buffer, Salt, Dual-Solid, and Aggregation Effects” in: Testa B. et al., “Comprehensive Medicinal Chemistry II, Vol. 5 ADME-TOX Approaches”, Elsevier: Oxford, UK, 2006）。
【０１０９】
溶解度測定についてのこの実施例の根底にありかつそれを集約している式は、ｐＨ−溶解度の関係性を数学的に記述しており、また、データの内挿、外挿、平滑化および圧縮（compaction）といった現実的な目的のために使用することができる。さらには、ｐＫａシフトの方法は、迅速な警告ツールとして使用することができる。暗に示されているように、該方法が機能するためには、分子は、利用されうるｐＨ範囲内で電離基を持たなければならない。logＳ対ｐＨのプロットが調べられ、また、真のｐＫａが独自に知られている場合には、アグリゲートが存在するかどうかについて、および、これらの「異常な」効果が中性型または荷電型の薬剤に起因しているのかどうかについて、迅速に推定することができる。その上、固有溶解度は、ｐＫａシフトの大きさまたは方向から計算することができる。これらが、シフトの方法の最良の使いみちである。しかしながら、測定データを機械的に拡大解釈しないよう注意が必要である。非荷電分子が何らかのスペシエーションの異常（アグリゲート化、ＤＭＳＯの結合、フィルター残留など）を被る場合には、弱酸は真のｐＫａよりも高い見かけのｐＫａを示し（図８のケース１ａ）、弱塩基は真のｐＫａよりも低い見かけのｐＫａを示すであろう（図８のケース１ｂ）。観察されるシフトが上述したものと逆の場合には、（中性化学種よりむしろ）荷電化学種が異常に関与している（図８のケース２ａおよび２ｂ）。異常の正確なメカニズムはあらゆるケースで明らかでないかもしれないが、シフトを見かけの溶解度と組み合わせることにより、固有の（シフトしていない）溶解度Ｓ０がしばしば明らかになる。賦形剤を伴う場合、これには実用的なさらなる重要性がある：賦形剤の存在下で溶解度を測定し、そしてそれと同時に、あたかも加えた賦形剤が異常の原因であったかのようにして、加えた賦形剤の非存在下では明白であったであろう溶解度を評価することが多くの場合に可能である。
【０１１０】
賦形剤存在下における６つのタイプのアグリゲート、（ＨＡ）ｎ、Ｂｎ、Ａｎｎ−、（ＢＨ＋)ｎ、（ＡＨ.Ａ）ｎｎ−および（ＡＨ.Ａ）ｎｎ−を考える。それらの導き出し方は、文献で報告されている流れに従う。これについては、新たな二つの状況に関して以下に簡潔にまとめている。
【０１１１】
第一の状況では、混合の荷電弱酸のアグリゲート（ＡＨ・Ａ）ｎｎ-について考える（図８のケース３ａ）。ケース２ａおよびケース２ｂにおいては、アグリゲート化のオーダーは、１より大きいlogＳ−ｐＨプロットにおける勾配によって明らかとなる（Avdeef A. et al., “Dissolution - Solubility: pH, Buffer, Salt, Dual-Solid, and Aggregation Effects” in: Testa B. et al. “Comprehensive Medicinal Chemistry II”, Vol. 5 ADME-TOX Approaches, Elsevier: Oxford, UK, 2006）。溶解度測定についてのこの実施例では、たとえある種のアグリゲート化が明らかに起こっていても、１に近い勾配がいくつかの場合で決定されている。この事実を説明するもっともらしいモデルが存在する。１：１の比率のＨＡおよびＡ−を含有する、オリゴマー混合の荷電弱酸化学種（ＡＨ・Ａ）ｎｎ−が生じるということを仮定することができる。マスバランスの問題を完全に定義するために必要な平衡の式および関連する濃度の商は、
【０１１２】
【数１４】
【０１１３】
【数１５】
【０１１４】
【数１６】
【０１１５】
である。
【０１１６】
溶解度は、
【０１１７】
【数１７】
【０１１８】
で定義される。
【０１１９】
式（１７）の[Ａ−]および[（ＡＨ・Ａ）ｎｎ−]成分は、[ＨＡ]、ｐＨおよび種々の平衡定数の観点から：
【０１２０】
【数１８】
【０１２１】
と拡張することができる。
対数で表した一般形は、
【０１２２】
【数１９】
【０１２３】
である。
【０１２４】
式（１９）の限定的な２つの形は、
【０１２５】
【数２０】
【０１２６】
【数２１】
【０１２７】
として示すことができる。
【０１２８】
混合の荷電アグリゲートの形成により、低ｐＨの溶液における固有溶解度の値は不明瞭にならないことを式（２０）は示している（図８のケース３ａ）。飽和溶液中での見かけのｐＫａが真のｐＫａよりも小さい弱酸についてであれば、ｐＨ>>ｐＫａに対してlogＳ対ｐＨのプロットの勾配が＋１であることは、ダイマー化学種ＡＨ・Ａ−の形成と矛盾しない。しかしながら、＋２の勾配は、ケース２ａのダイマーまたはケース３ａのテトラマーを示しているということもありうるが、それを見分けるのは困難でありうる。
【０１２９】
第二の状況では、賦形剤存在下での混合の荷電アグリゲート（ＡＨ・Ａ）ｎｎ−について考える（図８のケース３ａｘ）。ケース３ａにおいては、logＳ−ｐＨプロットの勾配は、１より小さくはなりえない。勾配が１より小さいことが観察された場合には、計算モデルに対するさらなる修正が必要であった。弱酸ＨＡの中性型のみに結合する賦形剤Ｘの存在下では、オリゴマー混合の荷電弱酸化学種（ＡＨ・Ａ）ｎｎ−が生じると仮定することができる。式１および式２に加えて、
【０１３０】
【数２２】
【０１３１】
が必要である。
【０１３２】
平衡定数
には、式（２２）の反応の平衡定数と、実際的には一定である（即ち、[ＨＡ]tｏtａl<<[Ｘ]tｏtａl）と仮定される賦形剤の濃度Ｘとの積が組み込まれている。
【０１３３】
溶解度は、
【０１３４】
【数２３】
【０１３５】
で定義される。
【０１３６】
先と同様に、式（２３）における非[ＨＡ]成分は、[ＨＡ]および種々の平衡定数の観点から拡張することができ、一般的な形の式（式（１９））となる：
【０１３７】
【数２４】
【０１３８】
図８におけるケース３ａｘの例は、図中に示す平衡定数に基づいている。前記式の限定的な形を引き出すのは一般には不可能であり、式（２４）におけるｐＨのｎ依存性のため、極端なｐＨでの勾配がなお
でなければならないことを示唆することができるだけである。図８のケース３ａｘの例が示しているように、測定データが高いｐＨにおける曲線の屈曲からのみ得られているならば、勾配は１より小さくなりうるが、より高いｐＨでのデータを利用できるのであれば、当該モデルは＋１の勾配を予測するであろう。
【０１３９】
記載したアグリゲート化のパラメーターの精密化に関しては、μＳＯＬ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ装置で測定された溶解度−ｐＨのデータを、搭載されているソフトウェアで処理し、ｐＩＯＮ社のＥＬＭ（商標） Ｄａtａ Ｍａｎａgｅrに保存する。ＥＬＭに蓄えられた幾つかの異なるアッセイからのデータを、該ソフトウェアによってアグリゲートの存在についてさらにテストする。前記式の一つをＥｖｏｌｕｔｉｏｎソフトウェアは自動的に選択し、それに対してlogＳ−ｐＨのデータを加重非線形回帰法によってフィットさせるが、当該加重非線形回帰法においては、以下の残差関数（residual function）が最小化される：
【０１４０】
【数２５】
【０１４１】
（式中、Ｎは当該モデルにおける溶解度値の測定数であり、logＳicalcは計算されたlogの溶解度であり、ここでlogＳicalcは、精密化されるパラメーター：ｐＫａＡＰＰ（見かけの電離定数）、logＳ０ＡＰＰ（見かけの固有溶解度）、logＳ０（真の固有溶解度 −図８のケース１ａおよび１ｂのみ）、logＫｎ（アグリゲート化の定数）およびｎ（アグリゲート化のオーダー）の関数である）。観察されたlogＳの推定標準偏差σｉは、０.０５（対数単位）と推定した。全体での精密化のクオリティは、「適合度（goodness-of-fit）」
【０１４２】
【数２６】
【０１４３】
（式中、Ｎｐは精密化されるパラメーターの個数である）
によって評価した。
【０１４４】
この溶解度測定の実施例についての全ての精密化された結果を表３にまとめている。ロボット装置により迅速に集められた約１２００の個々のｐＨ−溶解度測定結果が精密化された値の基となっている。
【０１４５】
【表３−１】
【０１４６】
【表３−２】
【０１４７】
【表３−３】
【０１４８】
【表３−４】
【０１４９】
賦形剤なしの条件下でのlogＳ−ｐＨ溶解度プロットを図９に示す。破曲線は、（真のｐＫａを用いた）Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ式から予測される曲線に対応しており、溶解度−ｐＨ依存性をより正確に表している曲線との比較として示されている。点横線は見かけの固有溶解度を示している。実曲線は実際のデータ（黒丸）の最良適合に対応している。今回研究した塩基性薬剤は、カチオン性のアグリゲートを形成する傾向があったが（ケース２ｂ）、ブタカインとジピリダモールは例外であり、それらは、明らかに中性のアグリゲートを形成していた（図８のケース１ｂ）。研究した二つの酸性薬剤は、ほとんどはアニオン性のアグリゲートを形成する（図８のケース２ａまたはケース３ａ）。非イオン性化合物に対して「ｐＫａシフト」の方法を適用するのが不可能であったため、アグリゲートが形成されうる程度についてはこの研究からは分からない。
【０１５０】
図９ｅにおけるグリベンクラミドは、賦形剤なしの結果におけるケース３ａの例であるが、それは、見かけのｐＫａにおける１．６対数単位の負のシフトと、高ｐＨのデータにおける単位勾配とによってアグリゲートが示唆されるためである。即ち、該データは、負に荷電したダイマーＡＨ.Ａ−の形成と一致している。クロトリマゾール（図９ｃ）は、ｎ＝１.４という勾配値によって示唆されるように、Ｂ.ＢＨ＋化学種と(ＢＨ＋)２化学種との組み合わせから成るようである。アステミゾール（図９ａ）は、ダイマー（ｎ＝１．８）の(ＢＨ＋)２化学種から成るようであり、一方メフェナム酸（図９ｆ）は、この型のダイマーおよびトリマーの両者を有する（ｎ＝２.６）。ジピリダモールおよびブタカインはケース１ｂの挙動を示しており、非荷電性のアグリゲートが形成されていることが憶測されるが、該非荷電性のアグリゲートは、ＨＨ式から予測されるであろう値（破曲線）のような、アグリゲートが形成されない場合に予測される値の上に見かけの溶解度を上昇させる。これらの二つの分子はまた、検討したイオン性分子の中で最も溶けやすい。他の場所で指摘されているように（例、Avdeef A. et al., “Dissolution - Solubility: pH, Buffer, Salt, Dual-Solid, and Aggregation Effects”, in: Testa, B. et al., “Comprehensive Medicinal Chemistry II”, Vol. 5, ADME-TOX Approaches, Elsevier: Oxford, UK, 2006）、ケース１ａまたはケース１ｂの依存性が示されている場合には、logＳ−ｐＨのデータからアグリゲート化の程度（ｎ）を評価することは不可能である。
【０１５１】
ここで論じる全ての化合物は、賦形剤を含まない緩衝液には難溶性であることが明らかであり（表３における「なし」の横列）、メフェナム酸がもっとも溶けにくく、２１±５ｎｇ／ｍＬである。ハイスループットのマイクロタイターの方法でこのような低い値を得ることができるというのはかなり驚くべきことかもしれない。１８時間のインキュベーション時間を用いているのは決して「ハイスループット」ではないということすら言われるかもしれない。しかし、該装置の２４時間の負荷サイクルの間に、４個から１０個の９６ウェルプレートを処理することができるということに留意すべきである。方法を全体として非常に高速にしているのは、ロボット測定のこの並列的な特性である。１８時間というインキュベート時間によって、濁度検出の使用に基づく他の高速な方法での動的な値ではなく、薬剤の最も安定な多形での真の平衡溶解度の値を測定結果が示す可能性が増している。
【０１５２】
アステミゾール、クロトリマゾールおよびグリベングラミドの固有溶解度は、０.３〜０.４μｇ／ｍＬと測定されている（表３）。ジピリダモールの固有溶解度は、６.２±１.１μｇ／ｍＬであった。非イオン性化合物グリセオフルビンおよびプロゲステロンは、その他の化合物と比較するとやや溶け、１４〜１７μｇ／ｍＬであった。研究した化合物で最も溶けやすいのはブタカインであり、固有溶解度は４０±６μｇ／ｍＬである。μＳＯＬ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎの方法の感度は低ナノグラムの領域まで達していることがこれらおよびその他の測定（下記）から明らかであり、これは部分的には、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ装置における高度に開発された分光学的データ処理ソフトウェアによって可能となっている。
【０１５３】
図９に対応する図であって、一つの賦形剤濃度（１％、１５ｍＭまたは０.２Ｍ）における、研究したイオン性分子についてlogＳ−ｐＨ曲線の一部を示している図を同様に与えることができる。検討したその他の賦形剤濃度の結果を表２にまとめている。そのような図は、賦形剤なしのプロットでの曲線（図９）に加えて、さらなる「破−点−点」曲線を有しており、該「破−点−点」曲線は、賦形剤なしの場合の実曲線を表している。この基準曲線により、特定の化合物に対する賦形剤の影響の迅速な視覚的評価が可能となる。
【０１５４】
塩化カリウムに関しては、大まかなパターンは、賦形剤なしの場合のパターンに似ている（図９）。ブタカインおよびクロトリマゾールにおいてのみ、見かけの固有溶解度が０.２Ｍ ＫＣｌによって有意に上昇する。アステミゾールは中性ｐＨの溶液中で、より大きなｐＨ依存性を示しているようであり、より高いオーダーのアグリゲートの形成からそれが起こっていると推測される。クロトリマゾールは反対の効果を示すようであり、高塩濃度の存在により、賦形剤なしの溶液で見られるアグリゲートを壊しているようである。クロトリマゾールの０.２Ｍ ＫＣｌにおける挙動は、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ式によってうまく予測される。また、その固有溶解度も、０.３９μｇ／ｍＬから３.３μｇ／ｍＬに上がる。ジピリダモール、グリベングラミドおよびメフェナム酸に対する０.２Ｍ ＫＣｌの効果は最小限であるように思われる。メフェナム酸でのｐＨ＞６．５についての曲線からの点のずれは、塩の形成に起因しているのかもしれない。
【０１５５】
プロピレングリコールに関しては、その効果は、０.２Ｍ ＫＣｌに起因する効果と似ている（図３）。アステミゾールは、固有溶解度のわずかな減少とともに、さらにより高いオーダーのアグリゲート（ｎ＝３.６）を示すようである。アステミゾールでは、固有溶解度は低いｐＨの溶液においてのみ増加するようである。クロトリマゾールの固有溶解度は、０.３９μｇ／ｍＬから２.０μｇ／ｍＬに増大する。
【０１５６】
１−メチル−２−ピロリドンに関しては、先に論じた二つの賦形剤に比べて、アグリゲート化のオーダーがアステミゾールおよびグリベングラミドで減少する。その他の効果は、比較的程度が低い。クロトリマゾールは、ＫＣｌおよびＰＧについてと同様、ＮＭＰで溶解度が高まるようである。メフェナム酸はＮＭＰに対して、固有溶解度のわずかな増加という反応を示す。
【０１５７】
プロピレングリコール４００に関しては、論じた最初の３つの賦形剤が弱い効果を伴っていたのに対し、ＰＥＧ４００では中等度の影響を有している。アステミゾールおよびクロトリマゾールにおけるアグリゲート化の結合定数（アグリゲート化のオーダーではない）は、実曲線がより高いｐＨ値に対して劇的にシフトしていることで示されるように、大きく増大する。メフェナム酸でのアグリゲート化は無くなっているようであり、曲線は古典的なＨＨの挙動を有している。より溶けやすい薬剤ジピリダモールおよびブタカインの見かけの固有溶解度は、先のより弱く作用する３つの賦形剤で示された値をほぼ２倍上回る。
【０１５８】
タウロコール酸ナトリウムに関しては、検討した各薬剤に対する効果のパターンは劇的であり、全てについて溶解度が上昇しているが、特にメフェナム酸の場合においてそうであった（表２）。アステミゾールは、グリベングラミドを除く他の全ての分子同様、古典的なＨＨに従う分子として挙動する。後者の分子は＋０．５のｐＨ依存性を示すが、それは、ケース３ａｘの挙動で最もよく表現されうる。残念なことに、アグリゲート化のモデルをさらに検証するための十分なデータをアルカリ性ｐＨにおいて集めなかった。アグリゲート化しがちな大抵の分子は、どうやらそのｐＨ依存性がＨＨ式により説明されうる非荷電性のモノマーとして、ＮａＴＣミセルに強く結合する。見かけの結合強度の解析は、ケース１ａまたは１ｂの式により説明できる。
【０１５９】
２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンに関して、１％ ＨＰ‐β‐ＣＤは、胆汁酸塩と同様に、アグリゲートを破壊する傾向がある。溶解反応はアグリゲート化のモデルにより表されるが、その結合は複合体形成のものである。アグリゲート化のモデルは、この賦形剤の作用を同様のモデルを伴う他の賦形剤の作用と比較するための、溶解度への効果の分類においてそれでもやはり好都合である。胆汁酸塩とシクロデキストリンの両方とも、研究した薬剤の溶解度の上昇において有意な効果を持つ。両賦形剤ともに、アグリゲートの形成を減少させるようである。グリベングラミドはそれでもなお、溶解度−ｐＨプロットにおいて独特の半ｐＨ勾配（half-pH slope）を有している。
【０１６０】
アステミゾールに関して、表２は、全ての賦形剤の特定の薬剤に対する効果を比較するのに便利な参考資料である。アステミゾールの場合、溶解度は、１％ ＨＰ−β−ＣＤ（賦形剤なしでの値０.２９μｇ／ｍＬが１２μｇ／ｍＬに上昇）によって、そしてまた１５ｍＭ ＮａＴＣによって大いに増大される。アグリゲート化の強度（logＫｎ／ｎ）は、０.２４％および５％のＰＥＧ４００によって最も著しく賦形剤なしの溶液での値を上回って上昇する。１％ ＰＥＧ４００および１％ ＮＭＰでは、それよりわずかに小さい上昇を示す。
【０１６１】
ブタカインに関して、ブタカインは荷電性アグリゲートを形成しないらしいと述べることができる。今回検討した分子の中で最も溶けやすい分子の溶解度は、両濃度のＨＰ‐β‐ＣＤ（表２）だけでなく、０.１Ｍ ＫＣｌ、全濃度のＰＥＧ４００（賦形剤なしの値４０μｇ／ｍＬが１５２μｇ／ｍＬに上昇）、および１５ｍＭ ＮａＴＣによっても最もたやすく上昇する。
【０１６２】
クロトリマゾールに関しては、アステミゾールと同様、クロトリマゾールを伴うアグリゲートは、種々の賦形剤により広い範囲にわたる影響を受ける。アグリゲート化の強度（logＫｎ／ｎ）は、０.２４％および５％のＰＥＧ４００によって著しく上昇する。１５ｍＭ ＮａＴＣおよび１％ ＨＰ−β−ＣＤ（賦形剤なしでの値０.３９μｇ／ｍＬが８５μｇ／ｍＬに上昇）を使用することで、溶解度の最も大きな増加となる。
【０１６３】
ジピリダモールに関しては、ＰＥＧ４００のアグリゲート化強化効果は、ジピリダモールでは、低い賦形剤濃度で見られる。溶解度は、１５ｍＭ ＮａＴＣにより、賦形剤なしでの値６.２μｇ／ｍＬから１５ｍＭ ＮａＴＣで１１０μｇ／ｍＬに上昇する。他の賦形剤は溶解度に対して有意な効果を有する（表２）。
【０１６４】
グリセオフルビンに関しては、グリセオフルビンとプロゲステロンとの両者は非イオン性であるため、「ｐＫａシフト」の方法によりアグリゲート化現象を示すことはできない。溶解度の上昇は、「強い」賦形剤で生じ、賦形剤なしでの値１４μｇ／ｍＬが、１５ｍＭ ＮａＴＣにより５４μｇ／ｍＬに上昇する。グリセオフルビンの溶解度に対する賦形剤の影響は、研究したより溶けにくい他の薬剤の溶解度に対する賦形剤の影響よりも比較的劇的でない。
【０１６５】
プロゲステロンに関して、プロゲステロンは、グリセオフルビンとは対照的に、シクロデキストリンに強く影響される。グリセオフルビンと同様、溶解度の上昇は「強い」賦形剤で起こるが、プロゲステロンでは、賦形剤なしでの値１７μｇ／ｍＬが、１％ ＨＰ−β−ＣＤで１８７μｇ／ｍＬに上昇する。
【０１６６】
グリベングラミドに関しては、グリベングラミドを伴うアグリゲート化の強度は、賦形剤によって、特に１５ｍＭ ＮａＴＣによって増加するのみである。これは「塩析」現象である可能性があり、ＰＥＧ４００で最も頻繁に見られる。これは新たで予想外の観察結果であり、さらなる研究が必要であろう。
【０１６７】
測定した一連の薬剤の中で群を抜いて最も溶けにくいメフェナム酸に関して、溶解度の最も大きな増大は、ＮａＴＣおよびＨＰ−β−ＣＤによってもたらされるが、得られる最大の固有溶解度はそれでもなお比較的低く、３μｇ／ｍＬ未満である。ＮＭＰおよびＰＥＧは、アグリゲート化の強度（logＫｎ／ｎ）を増加させるようである。
【０１６８】
この溶解度測定の実施例の上述した結果をまとめると、示したように賦形剤が難溶性分子の溶解度を上昇させるというのは怪しげなことではないはずである。そのような効果の程度および性質が使用されるロボット装置によって非常に迅速かつ高い信頼性で評価されうるということが、もしかしたら十分理解されていないかもしれない。当該結果を、ＤＭＳＯを含まない振とうフラスコでの方法で得られる結果と比較すると、本研究における全ての溶液中に１％ ＤＭＳＯが存在しているにも関わらず、値は、容認できる正確さであるようである。特定の賦形剤の効果を考慮すると、ＰＥＧ４００が（そしてより少ない程度でＮＭＰが）多くの薬剤のアグリゲート化の強度（logＫｎ／ｎ）を増加させているようであることは、新たな観察結果であるかもしれない。相互作用の性質が完全に分かっているわけではないが、可能性がある以下の効果について考えることは有用であるかもしれない。中等度の強度のＰＥＧ４００は、シクロデキストリンおよびタウロコール酸ナトリウムと比較すると、薬剤を引き付ける十分に競合的な疎水性環境を与えないかもしれない。しかしながら、全溶液中に存在する１％ ＤＭＳＯ、および溶媒和の水の一部が、ＰＥＧ４００分子に引き付けられ、緩衝溶液中の賦形剤に乏しい部分を、薬剤のアグリゲートにより集中させ、薬剤のアグリゲートのより強い自己会合を導く可能性がある。もちろん、「塩析」効果の類推を用いている。
【０１６９】
上記の例示的な透過率測定の結果について対応的に示したように、Ｓ−マッピングと呼ばれるマッピングスキームを図１０に示すが、これは、溶解度に対する賦形剤の効果の視覚的側面を改善し、正確でシステマティックな評価を可能とする。該マップは、この溶解度測定において使用した溶解度の装置に付随しているソフトウェアによって自動的に作成することができる。見かけの固有ｌｏｇ溶解度比率（賦形剤の溶解度を賦形剤なしの基準値で割っている）を図１０にプロットしている。このような「勾配」マップでは溶解度を正規化して、賦形剤なしのベースラインを基準にしてパターンをシフトさせている。１％ ＤＭＳＯが全溶液中に存在するため、勾配マップではＤＭＳＯの影響の一部を取り除くことが望ましい。図１０においては、緑色の値が基準となる（影響されていない）値を表している。暖色（黄色から深い橙色）は溶解度の増大を表しており、寒色（濃い青色）は値の低下を意味している。縦軸には賦形剤の組成があり、平均的な固有溶解度の増大が減っていくようにして順序付けされている。横軸には薬物があり、賦形剤によって有益さが減少していく順番に並んでいる。左上隅は、賦形剤と化合物との「最良」の組み合わせを表している。右下隅は、「最悪」の組み合わせを表している。この溶解度−賦形剤分類勾配マップ（Solubility-Excipient Classification Gradient Map）、あるいは省略してＳ−マッピングを用いれば、最も有望な分子−賦形剤の組み合わせを認識し、次いで優先順位をつけることが非常に効率良くなり、そしてこのようなＳ−マッピングのスキームは、製薬会社が発見最適化計画において直面するような、非常に多くの分子に対して迅速に作成することができる。
【０１７０】
この溶解度測定の実施例において最も有用な三つの賦形剤は、１％ ＨＰ−β−ＣＤ、１５ｍＭ ＮａＴＣ、および０.２４％ ＨＰ−β−ＣＤであると思われる。最も効果がない賦形剤は、０.２４％ ＰＥＧ４００、０.１Ｍ ＫＣｌ、および０.２４％ ＰＧである。図１０からは、クロトリマゾールが、該マップにおいて比較的「暖かい」色の縦方向の軌道を有していることから、全体的に上位にあることが視覚的に明らかである。溶解度は、１％ ＨＰ−β−ＣＤのような強い賦形剤によって増大されるだけでなく、０.２Ｍ ＫＣｌのような中等度および比較的弱い賦形剤によっても上昇する。Ｓ−マッピングに視覚的に示されているように、プロゲステロンおよびグリセオフルビンの溶解度の増大は弱くて似ており、これら二つの分子は、マップの右側に分類されている。プロゲステロンは、マップの最上部においてのみ、いくらかの暖色の効果を示して、グリセオフルビンとわずかに違いを出している。
【０１７１】
本発明の方法の第一の実施形態の、透過率の測定結果および溶解度の測定結果を流束関数に組み込むステップにおいて、上述したようなＰＡＭＰＡ賦形剤測定値と上述したような溶解度−賦形剤測定値とを、新規の順序付けされているバイオファーマシューティクス・クラシフィケーション・グラディエント・マップ（Biopharmaceutics Classification Gradient Map）によりグラフで表されているpＨ依存性の流束関数に論理的に組み込むことを提案する。それにあたって、本発明によるスクリーニングの方法論を示す土台として、８つの難溶性薬剤（アステミゾール、ブタカイン、クロトリマゾール、ジピリダモール、グリセオフルビン、プロゲステロン、グリベンクラミドおよびメフェナム酸（mefenemic acid））を用い、６つの賦形剤（タウロコール酸ナトリウム、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、１−メチル−２−ピロリドンおよびポリエチレングリコール４００）の１５の組み合わせで測定する。さらなる三つの分子（アルベンダゾール（albendazole）、アミオダロン(amiodarone)およびナプロキセン(naproxen)）を２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）を用いて同様に特徴付ける。ＨＰ−β−ＣＤの結果の一部を、利用できるインビボのデータと比較する。また、低溶解度かつ高透過率の薬剤を考えた場合、ｐＨの効果が現実的に反転し（即ち、薬剤がより帯電するｐＨでは、薬剤がより中性であるｐＨでよりも、より大きい吸収流束（absorptive flux）となる）、現在医薬研究において広く受け入れられている古典的なＢｒｏｏｄｉｅのｐＨ分配仮説は破綻しうることが示されている。この現象はｐＨ分配のアンチテーゼ効果（pH Partition Antithesis effect）と呼ばれている。
【０１７２】
透過率測定の結果と溶解度測定の結果とを流束関数に組み込む上記ステップの基礎として、フィックの第一法則における溶解度および透過率に関して、定常状態（即ち、膜内の透過物質の空間的濃度勾配が線形である）のシンク条件（即ち、膜バリアのアクセプター側において、透過物質の濃度がゼロである）では、均質な膜に適用したフィックの第一法則は、
【０１７３】
【数２７】
【０１７４】
（式中、Ｊは透過分子の流束（ｍｏl ｃｍ−２s−１）、Ｄｍは透過物質の膜相での拡散率（ｃｍ２ s−１）、ＰＣＡＰＰは透過物質の、水溶液と膜との間の見かけの（ｐＨ依存的な）分配係数、ＣＤ（ｍｏl ｃｍ−３）は膜のドナー側での透過分子の濃度、ｈ（ｃｍ）は膜の厚さ、Ｐｅ（ｃｍ s−１）は「有効」透過率であって式（３）の三つの輸送パラメーターの積である）と記述できる。ＣＤは、薬剤のドーズ量が溶解度限界を超えている場合（その場合にはＣＤは溶解度に等しい（「飽和」溶液））を除いて、該ドーズ量に等しい。水境界層（ＡＢＬ）の抵抗、アグリゲートの形成、およびその他のそのような厄介な問題などの効果を無視すれば、飽和溶液に適用されたＨＨ式は、
【０１７５】
【数２８】
【０１７６】
（酸性物質に対しては「＋」を用い、塩基性物質に対しては「−」を用いる）となる。Ｐ０およびＳ０は、それぞれｐＨ非依存性の固有透過率および固有溶解度である。薬剤の濃度ＣＤは、溶解度Ｓより小さいか又は等しい。同様に、非荷電化学種の濃度Ｃ０は常に、該化学種の固有溶解度Ｓ０と等しいかまたはそれより小さい。式（２８）によれば、飽和溶液における流束はｐＨ非依存性である。それゆえ、ｐＨ分配仮説が飽和溶液では成り立たないのはもっともなことである。しかしながら、以下に示すように、飽和溶液における流束はｐＨに依存しうるが、必ずしもｐＨ分配仮説によって予測されるものではない。
【０１７７】
図１１には、流束のこの関係を難溶性薬剤であるメフェナム酸について示しているが、それには文献での固有透過率および固有溶解度の値を用いており、また、理想的なＨｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ式が成り立つ（即ち、溶質のダイマーまたはトリマーが形成されない、ＡＢＬの抵抗が起こらない、膜残留がない、など）と仮定している。固有透過率はｐＨに依存しないが（図１１の点線）、流束の式における補助係数Ｃ０はｐＨに依存する（破線）。部分的に飽和している溶液（臨床用量２５０ｍｇでｐＨ＜９）では、イオン性分子についてのlogＣ０対ｐＨのプロットは単純に、飽和状態と完全な溶解状態との間の境界を示している切れ目の地点でつなげられた直線セグメントの組み合わせである。この連結点のｐＨは、計算に使用されるドーズ量に依存し、Ｃ０の最大値は、飽和溶液におけるlogＳ０に等しい（式（２８））。
【０１７８】
logＣ０（破線）は、飽和溶液（logＣ０＝logＳ０）においては横線であり、溶質が完全に溶解するｐＨ領域では−１の勾配で減少することを図１１は示している。臨床ドーズレベルでは、屈曲はｐＨ９にあると計算され、より小さいドーズ量では、屈曲点は、より低いｐＨにおいてである（例、１ｍgのドーズ量に対して、臨界ｐＨは６.５に下がる）。メフェナム酸について５.３μｇ／２５０ｍｌを下回るドーズ量に対してのみ、logＣ０曲線は完全にドーズ量−溶解度限界の下となり、双曲線型となる。図１１には、log流束−ｐＨ曲線を実線で示しており、それはlogＰ０曲線とlogＣ０曲線の合計である。ｐＨ分配仮説が全てのｐＨ範囲で成り立つのは、ドーズ量が＜５.３μｇの場合においてのみ（固体が形成されないため）であることに留意すべきである。ｐＨ分配仮説はより大きなドーズレベルにおいても有効ではあるが、それは、固体が完全に溶解するｐＨを上回る、斜線で規定されている領域（２５０ｍｇのドーズ量ではｐＨ＞９）においてのみである。
【０１７９】
固有の（instrinsic）データの、腸内のｐＨ５.０、ｐｈ６.２およびｐＨ７.４の条件への変換には、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ式よりも複雑な式を用い、上述した透過率測定の結果と上述した溶解度測定の結果とを腸内で意義のある条件に変換するための定数を用いた。溶解度に関して、アグリゲート化によって引き起こされるlogＳ−ｐＨ曲線の歪曲について６種類のケースを上述した。さらに二つの式が導かれるが、表１に全ての溶解度の式をまとめている。これらの式を、ｐＨ５.０、６.２および７.４でのＳを計算するために用いる。
【０１８０】
【表４】
【０１８１】
透過率に関して、有効透過率のｐＨ依存性は、
【０１８２】
【数２９】
【０１８３】
（酸性物質には「＋」を用い、塩基性物質には「−」を用いる）
（式中、ＰＡＢＬは水境界層の透過率である）
と表される。ＡＢＬの厚さｈ（腸内で約４０μｍ）に対して、ＡＢＬの透過率は、
【０１８４】
【数３０】
【０１８５】
（式中、Ｄａｑは溶液中での薬剤の拡散率（ｃｍ２ s−１）であり、Ｄａｑは２５℃では、分子量に基づいた式logＤａｑ＝−４.１５−０.４４８logＭＷ（Avdeef A. et al. “Permeability of Weakly Basic Drugs Predicted with the Double-Sink PAMPA pKafluxMethod. Layer”, Eur. J. Pharm. Sci., 2005, 24, 333-349）で近似できる）から予測することができる。式（２９）および式（３０）は、ｈ＝４０μｍと仮定して、固有透過率をｐＨ５.０、６.２および７.４において有効な値に変換するために用いる。
【０１８６】
透過率測定の結果と溶解度測定の結果とを流束関数に組み込むこの実施例での精密化の結果を、１％ ＨＰ−β−ＣＤのありとなしとで表２にまとめている。使用している残りのデータは、上述した透過率測定の実施例および上述した溶解度測定の実施例から取られている。２４００より多い個々のｐＨ溶解度測定値およびｐＨ透過率測定値が、精密化した固有の値の基礎となっている。表５の例は、シクロデキストリンが、透過率を下げ、溶解度を上げているが、該二つの効果の大きさは等しくはないことを示している。
【０１８７】
【表５】
【０１８８】
ｐＨ５.０、ｐＨ６.２およびｐＨ７.４での透過率測定における賦形剤の勾配に関しては、薬剤と賦形剤との全ての組み合わせに対して、式（３０）を用いて約４０μｍ厚さの層に対応するＡＢＬの透過率を計算に織り込んで、式（２９）を用いて上記固有の値から計算している。ベースラインの透過率の値は、ｐＨ６.２、ＡＢＬの厚さ４０μｍ、賦形剤なし(Ｘ＝０)の条件：Ｐｅ，６.２，４０ｘ＝０で定義した。他の全ての透過率の値を該基準値で割り、比率(Ｐｅ,ｐＨ,４０ｘ／Ｐｅ，６.２，４０ｘ＝０)を得た。特定の賦形剤またはｐＨが透過率を増大させている場合には、計算される該比率は１よりも大きい。賦形剤／ｐＨの組み合わせが透過率を低下させている場合には、計算される該ファクターは１よりも小さい。
【０１８９】
図１２ａに示すＰＡＭＰＡ−賦形剤−ｐＨ分類勾配マップ（PAMPA-Excipient-pH Classification Gradient Map）は、log(Ｐｅ,ｐＨ,４０ｘ／Ｐｅ，６.２，４０ｘ＝０)値の序列化された等高線プロットである。図２ａには、３６０の勾配がプロットされている。ゼロを上回る勾配は透過率の増大を示しており、暖色（橙色、赤色）で表されている。該マップにおけるゼロを下回る勾配は賦形剤／ｐＨでの透過率の低下を示しており、寒色（暗緑色、濃青色）で表されている。このマップにおいては、黄色は、勾配がゼロであるベースラインのレベルを示している。プロットは以下に記載する流束勾配（flux gradient）に基づいて序列化されている。
【０１９０】
図１２ａのＰＡＭＰＡ−賦形剤−ｐＨ分類勾配マップから、ある種の傾向がただちに認識できる。濃青色の「寒い」領域（透過率の低下）は、主に１５ｍＭ ＮａＴＣと関係しており、ｐＨ５のブタカインおよびジピリダモールではほとんどの賦形剤に対してである。「熱い」ゾーン（透過率の増大）は、グリベングラミドおよびメフェナム酸の二つの酸に対しては低ｐＨ溶液について、そしてｐＨ７．４のブタカインに対してである。また、プロゲステロン、グリセオフルビンおよびｐＨ７.４のアステミゾールは、多くの賦形剤に対して「暖かい」。
【０１９１】
ｐＨ５.０、ｐＨ６.２およびｐＨ７.４における微小溶解度測定での勾配に関しては、薬剤と賦形剤との全ての組み合わせについて、表４の式を用いて固有溶解度およびアグリゲート化の定数から計算している。ベースライン値の溶解度は、ｐＨ６.２、賦形剤なし（Ｘ＝０）の条件：Ｓ６.２ｘ＝０で定義した。他の全ての溶解度の値を該基準値で割り、比率(ＳｐＨＸ／Ｓ６.２ｘ＝０)を得る。特定の賦形剤または６．２以外のｐＨが溶解度を増大させている場合には、計算される該比率は１よりも大きい。賦形剤／ｐＨの組み合わせが溶解度を低下させている場合には、計算される該ファクターは１よりも小さい。
【０１９２】
図１２ｂに示す溶解度−賦形剤−ｐＨ分類勾配マップ（Solubility-Excipient-pH Classification Gradient Map）は、log（ＳpHX／Ｓ6.2X=0）値の序列化された等高線プロットである。図１２ｂには、３６０の勾配がプロットされている。ゼロを上回る勾配は溶解度の増大を示しており、暖色（橙色、赤色）で表されている。該マップにおけるゼロを下回る勾配は賦形剤／ｐＨでの溶解度の低下を示しており、寒色（暗緑色、濃青色）で表されている。このマップにおいては、薄緑色は、勾配がゼロに近いベースラインのレベルを示している。プロットは以下に記載する流束勾配に基づいて序列化されている。
【０１９３】
図１２ｂの溶解度−賦形剤−ｐＨ分類勾配マップから、ある種の傾向がただちに認識できる。濃青色の「寒い」帯（溶解度の低下）は、主に低ｐＨのグリベンクラミドおよびメフェナム酸ならびにｐＨ７．４のブタカインおよびアステミゾールと関係している。「熱い」ゾーン（溶解度の増大）は、低ｐＨのクロトリマゾールおよびジピリダモールならびにｐＨ７．４のグリベンクラミドの溶液と関係している。グリセオフルビン、プロゲステロン、ｐＨ７．４のメフェナム酸、ｐＨ５のブタカインおよびアステミゾールは全て、賦形剤で動かされない溶解度の値を示している。１％ ＤＭＳＯが全ての溶液中に存在するため、勾配マップはＤＭＳＯの影響の一部を取り除くことが望ましい。
【０１９４】
さらに、選択した薬剤が非常に低い固有溶解度の値を有するときには（メフェナム酸は２１ｎｇ／ｍＬの固有の値を示す）塩効果が考慮される。しかしながら、分子のｐＫａが５〜７．４の生理的範囲から遠く離れている場合は、表４での式により説明されるｐＨ依存性により、中性ｐＨ領域において溶解度は高い値に上昇しうる（例、表５のアミオダロンおよびナプロキセン）。荷電性のアグリゲートの形成により、ｐＨ依存性はさらに激しくなる。荷電性化学種が現れるとともに溶解度は上昇するが、永続的ではない。いくつかの高い見かけの溶解度値においては、荷電薬剤と溶液中に存在する対イオンの一つとの間で形成される塩の溶解度積を上回り、塩形態の荷電薬剤が沈殿する。使用した最大濃度（１００−２００μＭ）は、上述したように、ｐＨ＞７でのメフェナム酸を例外として、概して塩沈殿のレベルより下である。塩沈殿の開始は、賦形剤なしの場合に見られる固有溶解度値を３桁上回っているという合理的な仮定がなされる。これは「ｓｄｉｆｆ３−４」近似と呼ばれている（Avdeef A., “Absorption and Drug Development - Permeability, Solubility, Charge State, Wiley-Interscience, 2003, pp. 116-246）。これは確実な近似ではないが、溶解性を弱めるであろう塩形成を完全に無視するよりは、これを利用したほうがまだよいというのが実際的な前提にある。
【０１９５】
例えば、ナプロキセンの固有溶解度は、本研究では１８μｇ／ｍＬと測定された。「ｓｄｉｆｆ３−４」近似によれば、計算された溶解度（表１の式）が１８ｍｇ／ｍＬを上回るならば、高ｐＨの溶液において塩沈殿の形成が見られると予測するべきである。ＨＨ式を用いると、ｐＨ７.４における賦形剤なしの溶解度の計算値は２０.９ｍｇ／ｍＬである。表２では、予測される１８ｍｇ／ｍＬの塩限界を上回っていることを示すために、ナプロキセンのｐＨ７.４での値にアスタリスクで印をしている。
【０１９６】
この「ｓｄｉｆｆ３−４」近似を用いると、本研究でのイオン性薬剤の塩限界は、アステミゾールで２８８μｇ／ｍＬ、ブタカインで３９.８ｍｇ／ｍＬ、クロトリマゾールで３８９μｇ／ｍＬ、グリベングラミドで３４７μｇ／ｍＬ、そしてメフェナム酸で２１μｇ／ｍＬである。これらの限界を用いて、アステミゾールは、全ての賦形剤に対してｐＨ５および６.２で、そしてＰＥＧ４００に対してｐＨ７.４で塩沈殿することが予測された。ブタカインは、ｐＨ５で塩沈殿することが予測された。クロトリマゾールは、０.２４％および１．０％のＰＥＧ４００を用いるとｐＨ５で塩析することが予測された。グリベングラミドおよびメフェナム酸は、いくつかの賦形剤に対してｐＨ７.４で塩析することが予測された。また、メフェナム酸は、０.１Ｍ ＫＣｌおよび１％ ＨＰ−β−ＣＤ中、ｐＨ６．２で塩として沈殿することが予測される。
【０１９７】
塩限界を図１２ｂの溶解度−賦形剤−ｐＨ分類勾配マップに組み込んだ。
【０１９８】
図１２ａおよび１２bに見られるように、先行する二つの分類マップは、概して互いに反対になっている。一方で暖色の領域は、他方で寒色の領域と一致する。大まかにいえば、単純なＨＨ式（式（２８））によれば透過率と溶解度のｐＨ依存性は逆の関係であるため、これは予想できることである。図１１の飽和溶液の部分（ｐＨ＜９）では、単純化されたＨＨ式を用いれば、一方の特性での増加は他方の特性での減少により完全に相殺されるため流束はｐＨ非依存性となる。流束に関係する特性である薬剤吸収において最適化をするためには、いずれかの特性を使用するのでは不十分である。透過率および溶解度は、組み合わされた場合に、最適化のニーズに役立ちうるが、これは製薬業界の日常的な実践ではまだほとんど行われていない。（細胞の）透過率の測定は、生物学者によって頻繁に行われている。溶解度の測定は、物理化学者によって頻繁に行われている。二つのグループは別の建物にあることが多く、また、二つの測定は、時として非常に異なる時期に行われる。二組の測定をコヒーレントに統合することは、時として困難な課題である。二つの性質を論理的に統合することに注目した早期試みにより、ＡＰ（Dressman J.B. et al., “Absorption potential: estimating the fraction absorbed for orally administered compounds”, J. Pharm. Sci., 1985, 74, 588-589）関数およびＭＡＤ（Johnson K. et al., “Guidance in the setting of drug particle size specifications to minimize variability in absorption”, Pharm. Res. 1996, 13, 1795-1798; Curatolo W., “Physical chemical properties of oral drug candidates in the discovery and exploratory development settings”, Pharm. Sci. Tech. Today, 1998, 1, 387-393;およびAvdeef A. et al., “HT Solubility and Permeability: MAD-PAMPA Analysis” in: Kramer S.D. et al., “Physicochemical and Biological Profiling in Drug Research”, Wiley-VCH: Weinheim, 2006）関数、ならびにBＣＳ（Amidon G.L. et al., “A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification: the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability”, Pharm. Res., 1995, 12, 413-420;および“Guidance for Industry, Waiver of In Vivo Bioavailability and Bioequivalence Studies for Immediate Release Solid Oral Dosage Forms Based on a Biopharmaceutics Classification System”, FDA, Washington, D.C, USA, August 2000）がもたらされた。吸収の最適化を考慮するための統合関数を本明細書において提案し、それをＢＣＧマッピングと呼ぶ。我々が透過率−賦形剤測定および溶解度−賦形剤測定について提案したように、図１２ｃに示すマッピングスキームを提案するが、それには図１２ｃに示しているもののようなバイオファーマシューティクス・クラシフィケーション・グラディエント・マップを用いている。これらは、流束関数における賦形剤および他のあらゆる効果（ＡＢＬの抵抗、膜残留、アグリゲート化、複合体形成、ｐＨ、およびその他多くのＨＨ緩和効果）の視覚的な側面を改善して、正確で体系的な評価を可能にするよう設計されている。該マップは、上記で使用しているＰＡＭＰＡおよび溶解度装置に付随するｐＩＯＮ社のＥＬＭソフトウェアによって自動的に作成することができる。図１２ｃにプロットしているのは、先行する二つのマップ（式（２９）ならびに図１２ａおよび図１２ｂ）の和である：log(Ｐｅ,ｐＨ,４０ｘ／Ｐｅ，６.２，４０ｘ＝０)＋log(ＳｐＨＸ／Ｓ６.２ｘ＝０)。このような「勾配」マップは、流束の値を正規化して、賦形剤なしの、ｐＨ６．２のベースラインを基準にしてパターンをシフトさせている。図１２ｃにおいて、緑色の値は、基準（ゼロ）の残存（residual）を表している。暖色（黄色から濃い橙色）は流束の増大を表しており、寒色（濃青色）は値の低下を意味している。縦軸には賦形剤成分があり、該三つのｐＨ値での目下の全ての薬剤について考慮して平均的な流束の増大が減っていくようにして順序付けされている。横軸には薬剤があり、賦形剤によって、該三つのｐＨ条件の平均で有益性が減少していく順番に並んでいる。左上隅は、賦形剤と化合物との「最も有益な」組み合わせを表している。右下隅は、「最も有益でない」組み合わせを表している。このＢＣＧマッピングを用いれば、最も有望な分子−賦形剤の組み合わせを認識し、次いで優先順位をつけることが非常に効率良くなり、そしてこのようなマッピングスキームは、製薬会社が発見最適化計画において使用する、非常に多くの分子に対して迅速に得ることができる。直接的な比較をより用意に行えるよう、流束のマップに基づく順序付けは、他の二つのマップに対して適用される。
【０１９９】
本発明の方法の第一の実施形態における最も有用な三つの賦形剤は、０.２４％および１％のＨＰ−β−ＣＤ、ならびに３ｍＭ ＮａＴＣであると思われる。驚くべきことに、１５ｍＭ ＮａＴＣは、透過性を弱める強くて全体的な傾向があり（図１２ａ）、それが溶解度の増加（図１２ｂ）で完全には相殺されないため、最下位である。最も有効でないその他の賦形剤は、０.２４％および１％のＰＥＧ４００、０.１Ｍ ＫＣｌ、ならびに１％ ＰＧである。これらの賦形剤は、図１２ｃにおいて、賦形剤なしの位置（「なし」）よりも下にある。
【０２００】
図１２ｃから、クロトリマゾールは、わずかに酸性の溶液において該マップで比較的「暖かい」色の縦方向の軌道を有しており、全体的に最も高い順位であることが視覚的に明らかである。溶解度は、１％ ＨＰ−β−ＣＤのような強い賦形剤によって増大するだけでなく、０.２Ｍ ＫＣｌのような中等度および比較的弱い賦形剤によっても上昇する。また、賦形剤のうちのいくつかは、透過率の値も上昇させている（図１２ａ）。ＢＣＧマッピングが視覚的に示しているように、グリベングラミド、メフェナム酸、ブタカインおよびアステミゾールでの流束の増大はいくつかのｐＨ条件においては弱く、低い溶解性（図１２ｂの濃青色）が、透過率の増大（図１２ａの橙色）により、完全にではないが部分的に相殺されていることを示している。しかしながら、例えば多くの賦形剤に対するｐＨ７.４でのグリベングラミド、０.２４％ ＰＥＧ４００に対するｐＨ７.４でのメフェナム酸、０.１Ｍ ＫＣｌに対するｐＨ６.２でのメフェナム酸など、多くの暖色の島が存在している。
【０２０１】
ＨＰ−β−ＣＤの効果に関して、シクロデキストリンは、当該セットにおける難溶性薬剤に対して全体的に最も利益をもたらした。本発明の方法の第一の実施形態における三つのさらなる化合物でのＨＰ−β−ＣＤのデータを作成する。図１３に、１１の化合物に対する１％ ＨＰ−β−ＣＤによる正味の流束効果を示している。概して、透過率は賦形剤によって減少し、溶解度は賦形剤によって増加する。しかしながら、二つの効果のバランスは微妙であり、正味の効果をいずれの方向に傾けることもありうる。図１３は、正味の増加および正味の減少についての種々の例を示している。アルベンダゾール（図１３ａ）では賦形剤の結果として目下の三つのｐＨ値において一律に増加しているが、それは主に、溶解度の増加が透過率の減少により完全には相殺されなかったためである。ブタカイン（図１３ｂ）では全てのｐＨ値において減少しているが、それは、１％ ＨＰ−β−ＣＤは生理的ｐＨにおいては溶解度を有意な程度では少しも改善しないために、透過率の減少が補われないからである。同様のことがナプロキセンに対しても明らかである（図１３ｊ）。メフェナム酸は交差的なｐＨ効果の例である。酸性溶液においては、流束は１％ ＨＰ−β−ＣＤにより促進されるが、中性溶液においては、該賦形剤の存在により正味の減少となる。ジピリダモール（図１３ｆ）は、正確に打ち消しあう増加と減少とを示し、流束は該賦形剤によって影響を受けずにとどまる。経口吸収の予想が溶解度のみに基づいていたら、不適切な擬陽性の分類がなされたであろう。あるいは、透過率のみを決定に用いていれば、分類は擬陰性だったであろう。
【０２０２】
アミオダロンの場合は、本研究において、正確な数値を出すのが難しい。固有溶解度は非常に低く、「ｓｄｉｆｆ３−４」近似は、溶解度曲線において比較的低い塩の「上限」を見積もっているが、それは、賦形剤なしのｐＨ７.４を除く全ての条件について同様である（図１３ｂ）。賦形剤による透過率の予測される損失は、正味の流束において十分補われておらず、正味の流束はｐＨの関数として交差のパターンを有している。
【０２０３】
ｐＨ分配アンチテーゼに関して、ｐＨ分配仮説（Shore P.A. et al., “The gastric secretion of drugs: a pH Partition Hypothesis”, J. Pcol. Exp. Therap.” 1957, 119, 361-369）は、メフェナム酸およびグリベングラミドは、酸性ｐＨは該分子が最も帯電しないｐＨであるため、酸性ｐＨにおいて最も良く吸収されるはずであることを示唆している。それとは反対に、クロトリマゾール、ジピリダモール、ブタカインおよびアステミゾールはわずかにアルカリ性の溶液において最も良く吸収されるはずであるが、それは、弱塩基はそのような条件下で最も帯電しないためである。しかしながら、これらの分子について正確に反対の傾向が見られることが図１２を検討すれば即座に示される。これはとりわけ、賦形剤についての競争の勝者であるクロトリマゾールで非常に明白である。臨床用量以下のメフェナム酸に基づく図１４の一連の枠は、本研究の驚くべきそして刺激的な成果に対して新たな光をいくぶん投げかけようとするであろう。
【０２０４】
図１４ａは理想的な状況を表しており、該状況では、伝統的なＨｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ式を適用できるよう、透過率に対するＡＢＬの抵抗、膜による化合物の残留、アグリゲートまたは複合体の形成、ミセル様構造物の形成、塩の沈殿などのような「異常」がないものと想定されている。図１４ａには、２５０ｍｇの臨床用量のメフェナム酸（mefenamic）が示されている。透過率のｐＨ依存性は溶解度のｐＨ依存性の鏡写しとなっており、二つの成分の積である流束において、互いが打ち消しあう。従って、最も単純に見れば、吸収はｐＨに依存しないはずであり、ｐＫａが分かっていることは吸収の予測においてそれほど重要ではないという瑣末ではあるが魅力的な考えに繋がる。流束においてはｐＨ依存性がないため、ｐＨ仮説が破られていることに注目されたい。
【０２０５】
図１４ｂは、同様に非常に理想化された計算を示しているが、これは、１ｍｇのドーズ量という亜臨床レベルでの計算である。先行する場合との相違は、６.５を上回るｐＨで該化合物は完全に溶解しており、溶液中の薬剤濃度が１ｍｇ／２５０ｍＬ（１７μｇ／ｍＬ）の定数となっているということである。沈殿がない場合には、流束の関数はｐＨ依存性となる（図１４ｂ）。ｐＨ＞６.５の領域では、古典的なｐＨ分配仮説が成り立っている。
【０２０６】
図１４ｃおよび１４ｄは、先行する二つの場合と似ているが、一つだけ「異常性」がある：水境界層の抵抗を透過率モデルに加えている。図１４ｃ，ｄにおいて見ることができるように、透過率曲線の頂上は、ＡＢＬ（そのおおよその厚さは、胃腸管で想定される厚さに倣って４０μｍである（Avdeef A. , “Absorption and Drug Development - Permeability, Solubility, Charge State, Wiley-lnterscience, 2003, pp. 116-246））による抵抗度によって押し下げられている。図１４ｃでは、ＡＢＬの効果を加えたことにより、流束の関数は純粋なシグモイド型となっている。ｐＨ依存性がＢｒｏｄｉｅの仮説から予想されるものと反対となっていることは注目に値する。亜臨床用量では（図１４ｄ）、ｐＨ＞６.５に対してはｐＨ分配仮説が成り立つが、このｐＨを下回ると該仮説は転倒する。この効果を本明細書ではｐＨ分配アンチテーゼと呼ぶ。
【０２０７】
図１４ｅおよび図１４ｆでは、アグリゲート化というさらなる「異常性」を持ち込んでいるが、アグリゲート化はメフェナム酸について観察されており、メフェナム酸では、アニオン性のダイマーおよびトリマーが溶解度−ｐＨ曲線を説明するために提案されている（上記参照）。帯電したアグリゲートの効果は、古典的なＢｒｏｄｉｅの仮説を実質的に転倒させる。溶解度はメフェナム酸（mefenamic）が（アニオン性アグリゲートの形成により）帯電する領域で増加するため、ｐＨ＞７の領域では、２５０ｍｇの臨床ドーズレベル未満であっても、ｐＨ分配仮説が順守されている。亜臨床用量の使用（図１４ｆ）はＢｒｏｄｉｅのパターンを、ｐＨ６より下にまで少しだけシフトさせる。
【０２０８】
図１４ｇおよび図１４ｈは、図１４ｅおよび図１４ｆの場合に対して賦形剤（１％ ＨＰ−β−ＣＤ）の効果を加えている。シクロデキストリンはアグリゲートを破壊すると思われるため、アンチＢｒｏｄｉｅ効果は無効化されているようである（図１４ｅおよび図１４ｇ）。亜臨床用量では、古典的なｐＨ分配仮説が、本実施例において初めて完全に現れる。
【０２０９】
イヌで試験され、シクロデキストリンの複合体形成によって有意に増加することが見出されているグリベンクラミドの生物学的利用能、ならびに、ＨＰ−β−ＣＤのありとなしとでマウスで試験され、ＣｍａｘおよびＡＵＣ０−∞は、賦形剤なしの薬剤の懸濁液を伴うよりもシクロデキストリンありで有意に高いことが見出されているアルベンダゾールの経口生物学的利用能が、本発明の方法の第一の実施形態の結果をインビボの生物学的利用能のデータと比較する基準の基礎にある（underly）。二つの薬物動態学的（ＰＫ）研究からのパラメーターを表３にまとめている。
【０２１０】
【表６】
【０２１１】
図１３ａおよび図１３ｇは、アルベンダゾールおよびグリベングラミドについてのｐＨ５‐７.４での流束関数を示している。これらの図は、１％ ＨＰ−β−ＣＤはlog流束値を増加させるが、その効果のｐＨパターンは異なり、グリベングラミドは実質的により複雑なパターンを示すことを示している。アルベンダゾールでは、流束は、ｐＨ５.０、６.２および７.４に対してそれぞれ３.０、３.１および３.１の率で増加しており、増加の平均は３.１の率であることを示している。グリベングラミドでは、対応する流束は、ｐＨ５.０では２０.１、ｐＨ６.２では４.３の率で増加するが、ｐＨ７.４では３の率で減少しており、全体の平均として３.１の増加をもたらしている。表４は、アルベンダゾールおよびグリベングラミドについてのＣｍａｘの増加率が、それぞれ４.３および７.３であることを示している。報告した流束勾配とＰＫ研究で見出された流束勾配とは、好ましく類似しているように思われる。
【０２１２】
本発明の方法の第二の実施形態では、透過率および溶解度を別個の実体として明示的に決定することなく、化合物の吸収ポテンシャルに対する賦形剤の効果をモニターするために透過率の変化と溶解度の変化の両方を組み合わせている。これにより、本発明の方法の第二の実施形態はとりわけ高速になる。当該実施形態は、脂溶性のバリアによって分けられている二つのチャンバーの透過システムのレシーバチャンバーにおいて現れる調査化合物の濃度変化を、ドナーチャンバー中の賦形剤成分（種類および／または濃度）を変化させながらモニターすることを有する。バリアは、人工膜（例、脂溶性溶液に含浸させたフィルター（即ち、ＰＡＭＰＡモデル））、培養内皮細胞（例、ＲＢＥ４）、またはその他の培養細胞モデル（例、Ｃａｃｏ−２、ＭＤＣＫ等）を構成（constitute）しうる。生物学的に意義のある水境界層の厚さおよびｐＨも考慮に入れる。
【０２１３】
本発明の方法の第二の実施形態の図解を図１に示す。化合物を、約１０ｍＭの濃度のＤＭＳＯ溶液として与える。該溶液を、ユニバーサル緩衝水溶液中にさらに希釈し、０.５Ｍ ＮａＯＨでｐＨ５.０、６.２および７.４に調整する。該水溶液中でのバックグラウンドのＤＭＳＯの量は、０.５％ ｖ／ｖである。ほとんどの化合物は水に溶けず、水中では、沈殿が存在する飽和溶液を形成する。計算される緩衝液中の化合物の濃度は約５０μＭであるが、沈殿のため、水媒体中での実際の濃度はそれより低いはずであり、未知である。（濾過していない）飽和溶液を、マグネチックスターラーをあらかじめ入れておいたＰＡＭＰＡサンドイッチのドナー区画に移す。ＰＡＭＰＡフィルタープレート（ＰＡＭＰＡサンドイッチのアクセプター区画）のフィルターをＧＩＴの脂質で覆い、アクセプター・シンク緩衝液（acceptor sink buffer）（ＡＳＢ）で満たす。ＡＳＢは、血流中のタンパク質の結合特性を模倣する界面活性剤混合物（化学シンク）（Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｉｎｋ（商標） ＰＡＭＰＡ）を加えたｐＨ７.４の緩衝水溶液を構成する（constitutes）当該アッセイでは激しい撹拌が用いられ、撹拌速度は約４０μｍの厚さの水境界層（ＡＢＬ）を作り出すよう設定されるが、それは、ＧＩＴにおけるＡＢＬの条件と合致させるためである。ＰＡＭＰＡサンドイッチを集め、磁気撹拌機構が内蔵されている環境制御されたチャンバー中で３０分間インキュベートしておく。次いでサンドイッチを分離し、レシーバウェルをアッセイし、ＵＶ分光光度計でＵＶスペクトルを集める（２３０ｎｍから５００ｎｍ）。このプロセスを図１５の左に図式的に示している。
【０２１４】
次いで、該段取り（setup）を、ドナー溶液が化合物に加えて賦形剤を含有していることのみの相違で繰り返す。図１５の右手側にこれを図式的に示している。
【０２１５】
本発明の方法の第二の実施形態の段取りにおいては、攪拌が重要な役割を果たしていることに留意すべきである。攪拌を行わないと、低溶解性化合物の透過率におけるいかなる変化も、ＡＢＬの抵抗に圧倒されてしまい、そのために検出できない。
【０２１６】
アッセイの最後に、ドナーウェルに賦形剤を含有するＰＡＭＰＡサンドイッチのレシーバ区画由来のＵＶスペクトルの曲線下面積（ＡＵＣ）を、賦形剤なしのＰＡＭＰＡサンドイッチ由来の対応するＡＵＣで割る。得られる比率（賦形剤の効果）は、ドナー区画に加えた賦形剤が吸収特性の改善に役立ったかどうかを示す。
【０２１７】
当該方法は、透過システムとしてＰＡＭＰＡを用いて行われるが、細胞透過モデル（例、Ｃａｃｏ−２、ＭＤＣＫなど）に対して用いることが容易にできる。事実、このアッセイは、インビトロのハイスループットＰＫプレフォーミュレーションの研究に対する初めてのアプローチと考えることができる。実際、インビボのＰＫでは、薬剤の処方を変えて血流中で濃度対時間のプロファイルをモニターすることから、研究者は、最終的な効果に対する溶解度または透過率の個別の影響を直接的には知らず、問題とするのは血流中の活性成分濃度の増加または減少である。
【０２１８】
使用した薬剤および化学物質に関しては、使用した化合物は、アステミゾール、ブタカイン、クロトリマゾール、ジピリダモール、プロゲステロン、グリベンクラミドおよびメフェナム酸（mefenemic acid）である。ｐＩＯＮ社のＤｏｕｂｌｅ−Ｓｉｎｋ（商標）ＰＡＭＰＡ用の脂質（ＰＮ １１００６６９）は、使用しないときには−２０℃で保存する。アッセイされるドナー溶液のｐＨはｐＩＯＮ社のユニバーサル緩衝液（ＰＮ １００６２１、１１００１５１）で調整し、また、血清タンパク質シミュレートするために化学捕捉剤を含有するｐＨ７.４の緩衝溶液をレシーバ溶液として使用する。賦形剤は、ドナーウェルにのみ加える。
【０２１９】
賦形剤の濃度に関しては、デモンストレーションの目的のために、上述した本発明の方法の第一の実施形態からの賦形剤の部分集合を、同じく扱う。４つの賦形剤の量は、臨床的に意義のある条件での胃腸液において想定される濃度と重なるように選択する。ＫＣｌについては、ＦＡＳＳＩＦ／ＦＥＳＳＩＦ培地での濃度に従い、０.２Ｍの濃度を選択する。プロピレングリコール（ＰＧ）、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）およびポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）については、１％ ｖ／ｖの濃度の賦形剤溶液を当該方法のデモンストレーションのために選択する。
【０２２０】
提示した本発明の方法の第二の実施形態の結果として出てくる別々の三つのケースがある。
【０２２１】
ケース１−賦形剤の効果〜１、即ちlog（賦形剤の効果）〜０：この結果は、ドナー区画に賦形剤Ｘが存在するか否かに関わらずレシーバでの濃度が同一であることを意味している。これは、難溶解性化合物にとっては、賦形剤が溶解度を改善しないか、または、化合物の透過率の減少が溶解度の増加を相殺するかのいずれかを意味している。
【０２２２】
ケース２−賦形剤の効果＜１、即ちlog（賦形剤の効果）＜０：この状況は、賦形剤Ｘの存在による溶解度の増加が透過率の損失よりも小さいか、あるいは、化合物が賦形剤ありまたはなしで十分に溶解し、透過率の減少が支配的な効果であるかのいずれかを意味しているかもしれない。ｐＨ５.０のブタカインでの結果がこの状況を示している。ｐＨ５.０の緩衝水溶液でのブタカインの溶解度は５０μｍよりもはるかに大きいことが本発明の方法の第一の実施形態から分かる。それゆえ、ｐＨ５.０でのこの化合物の吸収挙動が透過率に支配されていること、および、ドナー区画における賦形剤の存在によりブタカインの透過率が減少することは、驚くべきことではない。本発明の方法の第二の実施形態により、溶解度定数および透過定数を別個に測定することなく、レシーバ区画での化合物濃度の単純比較（ＵＶ吸収）により、この挙動の検出が可能となる。
【０２２３】
ケース３−賦形剤の効果＞１、即ちlog（賦形剤の効果）＞０：この結果は、最も有望な薬物−賦形剤の組み合わせ結果を示している。この比率が大きければ大きいほど、賦形剤Ｘは研究化合物の吸収特性の改善により効果的である。
【０２２４】
本発明の方法の第二の実施形態は一つの時間点に基づいているが、当業者は、インビボの薬物動態学的研究を模倣していくつかの時間点に対して賦形剤の効果を計算するよう、当該実施形態を容易に調整することができる。
【０２２５】
本発明の方法を上記の例示的な実施形態とともに記載しているとはいえ、本発明の方法の他の代替的実施形態を考えることができる。
【図面の簡単な説明】
【０２２６】
【図１】本発明の方法の第一の実施形態の透過率測定の例のために、ｐＫａ決定方法の比較を示している。
【図２】図１の方法についての種々のメタノール−水混合液において決定した見かけのｐＫａの直線外挿を示している。
【図３】図１の方法の透過率測定の実施例で測定した８つの化合物についての、透過率の対数対ｐＨのプロットを示している。
【図４】賦形剤存在下での固有透過率の対数と、賦形剤非存在下での固有透過率の対数との差異のプロットであって、図１の方法の透過率測定の実施例についての賦形剤の量の関数としての前記プロットについて示している。
【図５】図１の方法の透過率測定の実施例に対する、固有透過率の対数に基づくＰＡＭＰＡマッピングスキームを示している。
【図６】図１の方法の透過率測定の実施例に対する、膜残留率の対数に基づくＰＡＭＰＡマッピングスキームを示している。
【図７】図１の方法の透過率測定の実施例に対する、水境界層の対数に基づくＰＡＭＰＡマッピングスキームを示している。
【図８】図１の方法の溶解度測定の例のために、アグリゲート化反応の６つのケースを示している。
【図９】図１の方法の溶解度測定の実施例において検討された化合物に対する、賦形剤なしでのlogＳ対ｐＨのプロファイルを示している。
【図１０】図１の方法の溶解度測定の実施例の化合物と賦形剤との組み合わせに対する、序列化された溶解度賦形剤分類勾配マップを示している。
【図１１】２５０ｍｇの臨床用量でのメフェナム酸についてのlogＰ０、logＣ０、およびlogＰ０Ｃ０(流束)のｐＨに対するプロットを示しており、図１の方法における、固有濃度に基づくフィックの法則を示している。
【図１２】（ａ）図１の方法でのＰＡＭＰＡ−賦形剤−ｐＨ分類勾配マップ；（ｂ）図１の方法での溶解度−賦形剤−ｐＨ分類勾配マップ；および、（ｃ）図１の方法の化合物と賦形剤との組み合わせについての序列化された生物薬剤学的分類勾配マップを示している。
【図１３】図１の方法について、賦形剤なし（白抜き記号）および１％ ｗ／ｖ ＨＰ−β−ＣＤの存在（塗り潰し記号）の下での、ｐＨ５.０、６.２および７.４における透過率（丸）、溶解度（三角）および流束（四角）のプロットを示している。
【図１４】シミュレートしたメフェナム酸の有効透過率（点曲線）、溶解度（破曲線）および流束（実線）の、ｐＨに対する曲線を示している。
【図１５】本発明の方法の第二の実施形態の実験的段取りの概略図を示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、独立請求項１のプリアンブルに従えば、低溶解性化合物（low solubility compounds）の予測される吸収特性に対する、賦形剤、ｐＨおよびそれらの組み合わせの効果を評価する方法に関し、とりわけ、独立請求項２０に従えば、当該方法を行うために設定（arranged）されているコンピュータープログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
イオン性（ionizable）化合物のヒト腸管吸収（human intestinal absorption;ＨＩＡ）は、溶解性、透過性、およびｐＫａという主要な三つの特性に同時に依存しうる(Avdeef A., “Absorption and Drug Development”, Wiley Interscience, NY, 2003)。この関連性は、アブソープション・ポテンシャル（the Absorption Potential）(Dressman JB et al., “J. Pharm. Sci.”, 1985, 74, 588)、バイオファーマシューティクス・クラシフィケーション・システム（the Biopharmaceutics Classification System）（Guidance for Industry, “Waiver of In Vivo Bioavailability and Bioequivalence Studies for Immediate Release Solid Oral Dosage Forms Based on a Biopharmaceutics Classification System”, FDA, Washington, D.C., USA, August 2000）、及びマキシマム・アブソーバブル・ドース（the Maximum Absorbable Dose）の関数（Curatolo W. “Pharm. Sci. Tech. Today”, 1998, 1, 387）に例証されている。簡潔に述べると、フィックの拡散法則が、これらのモデル全ての基礎となっている。
【０００３】
腸内では、水溶性の弱塩基がわずかにアルカリ性の部位（例、遠位回腸中）からよりよく吸収され、弱酸がわずかに酸性の部位（例、近位空腸）からよりよく吸収される。これはＢｒｏｄｉｅおよび共同研究者ら(Shore PA et al., “J. Pcol. Exp. Therap.”, 1957, 119, 361)によって理論的に説明されており、彼らは、イオン性薬剤の腸管吸収に対するｐＨの効果を説明するためにｐＨ分配仮説（pH Partition Hypothesis）を導入した。ラットの腸管を種々のｐＨの薬剤溶液によりインサイチュで灌流し、それと同時に薬剤を静脈注射した。正味の腸壁輸送がなくなるまで管腔灌流液中の薬剤濃度が調整されたが、それは、血液−管腔バリア率（blood-lumen barrier ratio）
【０００４】
【数１】
【０００５】
を定義することを可能とするためであった。
【０００６】
中性型の薬剤のみが透過するとすれば、式（１）は薬剤のｐＫａおよび腸管バリアの両側間のｐＨ勾配から予測できる（Shore PA et al., “J. Pcol. Exp. Therap.” 1957, 119, 361）：
【０００７】
【数２】
【０００８】
式（２）は、透過性のｐＨ依存性から導かれており、周知のＨｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ（ＨＨ）式に基づいている。インサイチュ腸管灌流での吸収率の直接測定によりｐＨ依存性が裏付けられ、これらの初期の実験において理論と観察とがよく整合していることをさらに支持していた。
【０００９】
ｐＨ分配仮説から、膜透過性は分子が最も荷電しないｐＨで最大になることが示唆される。しかし、これは分子が最も溶けないｐＨでもある。Ｂｒｏｄｉｅの研究ではテストされるすべての化合物が比較的高い水溶解性を有していることに留意することが特に重要である。吸収部位における、非荷電化学種の量と中性化学種がリン脂質膜バリアを横断する傾向との両方が、吸収を予測するための重要な判断材料である。固有透過係数（固有透過率、intrinsic permeability coefficient）Ｐ０は、非荷電化学種の膜輸送を特徴づける。非荷電化学種の濃度Ｃ０は、ＨＨ式によれば、分子の量、溶解度、ｐＫａ、および吸収部位のｐＨに依存する。
【００１０】
コンビナトリアル化学のプログラムは、溶解度が低いと予想される、分子量のより大きい分子を選択する傾向があった。リピンスキーの「ルールオブファイブ」（Lipinski’s ‘Rule of 5’）（Lipinski C., “Amer. Pharm. Rev.” 2002, 5, 82）のような「早期警告」ツールや、二次元構造から溶解度を予測するコンピュータープログラムは、発見計画の早期にそのような分子を除外することを試みている。それでもなお、溶解度を測定するために使用された初期の過度に単純化された方法や、発見測定に使用された有機溶媒（例、ジメチルスルホキシド）の遮蔽効果が原因で、溶解度について解決が難しい多くの分子は識別されないままであった。ネフェロメトリーに基づく動力学的溶解度測定は、高速ではあるが、インシリコでの予測法と同様に信頼できるものでないことは間違いない（Glomme A. et al. “J. Pharm. Sci.”, 2005, 94, 1）。
【００１１】
難溶性（sparingly soluble）分子（例、化合物または薬剤）の溶解度の測定は、数多くの理由から困難なものである。とりわけ、ＨＨ式は、溶液中にアグリゲートおよびミセル様構造物が多く存在することに主に起因して、難溶性分子のｐＨ依存性を不十分にしか予測していない（Bergstrom CAS et al., “Eur. J. Pharm. Sci”, 2004, 22, 387およびUS 6,569,686 B2）。そのようなアグリゲートは、（荷電化学種が存続するｐＨ溶液中において）著しく高い溶解度を有しており、温度に敏感に依存する。
【００１２】
透過性の測定もまた、結果がｐＨのアッセイ方法に特に依存するため、相当な不確実性を伴い、そのようなアッセイ（細胞膜と人工膜の両方の透過性アッセイ）においては、種々の研究室により、水境界層（aqueous boundary layer；ＡＢＬ）、および不完全なマスバランスにて処理されている（Avdeef A. et al., “Eur. J. Pharm. Sci”, 2005, 24, 333）。
【００１３】
故に、医薬の研究開発中の候補選択段階におけるより正確な（それにも関わらず高速な）溶解度法および透過法が、本当に問題となる分子をかなり早い時期に識別するのに特に役立つであろう（Bergstrom CAS et al., “Eur. J. Pharm. Sci”, 2004, 22, 387およびGlomme A. et al. “J. Pharm. Sci“, 2005, 94, 1）。
【００１４】
吸収過程、特にＨＩＡ過程におけるｐＨ、溶解性、透過性の上述した効果の他に、賦形剤の使用が、吸収過程、特に難溶性分子の吸収過程に、本質的に影響を及ぼし得る。上記効果の複雑さを考えると、吸収過程の最適化を可能にする好適な賦形剤を評価するのは非常に難しい課題である。今日、そのような評価は動物実験をすることで行われている。動物実験は通常、比較的時間を消費し、比較的多大な労力を要し、そして倫理的にも議論の余地がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、前記の吸収における賦形剤の効果を考えると、高速に、化合物を節約して、コスト効率よく、かつある程度正確に難溶性分子（即ち、低溶解性化合物または薬剤）の吸収特性を予測することを可能とする、倫理的にも受け入れることのできる方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の開示
本発明によればこのニーズは、独立請求項１の特徴によって規定される方法、および独立請求項２０の特徴によって規定されるコンピュータープログラムによって解決される。好ましい実施形態が、従属請求項の対象となっている。
【００１７】
本発明はとりわけ、低溶解性化合物の予測される吸収特性に対する、賦形剤、ｐＨおよびそれらの組み合わせの効果を評価する方法に関係しており、当該方法は、少なくとも一つの所定のｐＨ値において、低溶解性化合物と賦形剤との組み合わせに対する流束関数（flux function）の変化を評価するステップを有する。
【００１８】
以下で使用する「低溶解性」は、米国食品医薬品局によって生物学的利用能・生物学的同等性の規制ガイドラインとして採用されているバイオファーマシューティクス・クラシフィケーション・システム中の溶解度の定義に基づいている(“FDA guidance for industry waiver of in vivo bioavailability and bioequivalence studies for immediate release solid oral dosage forms containing certain active moieties/active ingredients based on a biopharmaceutics classification system”, CDERGUID/2062dft.wpd Draft, Jan. 1999)。詳細には、溶解度の大きさは、１から８のｐＨ範囲内の最も低い溶解度において、最大ドーズ量の強度を溶かすのに必要な水の量（例えば、ミリリットル（ｍＬ）単位）という面から定義されており、２５０ｍＬが高溶解性と低溶解性との境界線となっている。つまり低溶解性とは、１から８のｐＨ範囲内で、２５０ｍｌ中に最大ドーズ量が完全には溶解しないことを言う。
【００１９】
以下に使用する「流束関数」は、流束関数は単位面積および単位時間あたりのバリアを通過する粒子または質量に対応する、と定義しているAvdeef A., “Absorption and Drug Development”, Wiley Interscience, NY, 2003 の第２章に関係している。
【００２０】
より正確には、前記第２章には以下が記載されている：溶質の受動拡散は膜の内部の溶質の拡散性と濃度勾配との産物であることが膜に適用されたフィックの第一法則により示される。見かけの膜／水分配係数が、後者の内部勾配を、外部のバルク水の、膜によって分離された二つの溶液の間の濃度差と関連付ける。イオン性分子が受動拡散により最も効率的に透過するためには、該分子は膜表面において非荷電型である必要がある（ｐＨ分配仮説）。所与のｐＨにおいて存在する非荷電型の量（これは流束に直接的に寄与する）は、ｐＨ、元々あるキャリアー（タンパク質および胆汁酸）への結合、自己結合（アグリゲートまたはミセルの形成）、および溶解性（固体形態での自己結合）等の重要ないくつかの要素に依存する。低溶解性は、輸送の機会を低下させる条件としての熱力学的な「スピード・アテニュエーター（speed attenuator）」として、輸送についての考慮に入ってくる。このように、透過性と溶解性とは、膜を横断する輸送についての動力学的および熱力学的に関連がある要素である。
【００２１】
均質な脂質膜によって分離されている、二つのチャンバーに分けられた容器（vessel）を考える。左側はドナー（donor）区画であり、そこでサンプル分子がまず導入され；右側はアクセプター（acceptor）区画であり、当該区画は最初は試料分子を持たない。定常状態にある均質な膜に適用されたフィックの第一法則は、輸送方程式
【００２２】
【数３】
【００２３】
(式中、Ｊは流束（単位はｍｏｌ ｃｍ−２ ｓ−１）、Ｃｍ０およびＣｍｈは二つの水−膜境界における膜内の非荷電型の溶質の濃度（ｍｏｌ ｃｍ−３単位）、Ｄｍは膜内の溶質の拡散率（単位はｃｍ２ ｓ−１））
である。定常状態では、膜内の濃度勾配ｄＣｍ／ｄｘは線形である。厚さ１２５μｍの膜では、溶液が非常によく攪拌されると仮定すると、定常状態が確立されるためには約３分を要する。
【００２４】
膜の様々な部分で溶質の濃度を測定することは非常に不便であるというところに方程式（３）の限界がある。しかしながら、バルク水と膜との分配係数logＫd(ｐＨ依存的な見かけの分配係数）を見積もることができるかまたは場合によっては測定することができるため、方程式（３）はより利用しやすい形
【００２５】
【数４】
【００２６】
に変形することができ、Ｋdで置き換えたことで、ドナー区画のバルク水濃度およびアクセプター区画のバルク水濃度（それぞれＣＡおよびＣＤ）を使用することが可能となる。（イオン性分子では、ＣＡおよびＣＤは、全ての荷電状態型について合計した溶質の濃度を表す。）これらの濃度は、標準的な技術で容易に測定しうる。方程式（４）はＤｍおよびＫdを見積もる必要がある為、依然として十分に便利ではない。これらのパラメーターおよび膜の厚さを、「膜透過率（membrane permeability）」と呼ばれる複合パラメーターＰｍ
【００２７】
【数５】
【００２８】
でまとめるのがよく行われる方法である。
【００２９】
分子が単純な膜をどのくらい早く通過するかを予測する方程式（４）の溶解性への関連性は、濃度条件にある。ＣＡが実質的にゼロである「シンク」条件を考える。方程式（４）は、以下の流束方程式
【００３０】
【数６】
【００３１】
に帰着する。
【００３２】
流束は、溶質の有効透過率と、ドナーの膜表面について水側にある全ての荷電状態型について合計した溶質濃度とを掛け合わせた積に依存する。この濃度は、考慮しているｐＨにおける溶解限界をドーズ量が超えている場合（その場合、当該濃度は溶解度に等しい）でなければ、理想的には薬剤のドーズ量と等しいものでありうる。非荷電分子種は透過物質（permeant）であるため、方程式（６）は
【００３３】
【数７】
【００３４】
（式中、Ｐ０およびＣ０はそれぞれ、非荷電化学種の固有透過率（intrinsic permeability）および濃度である）
と言い換えることができる。固有透過率はｐＨに依存しないが、流束方程式におけるその補助係数ＣｏはｐＨに依存する。非荷電化学種の濃度は常に、同じくｐＨに依存しない化学種の固有溶解度Ｓｏに等しいかまたはそれよりも小さい。
【００３５】
非荷電化学種では、方程式（５）は
【００３６】
【数８】
【００３７】
（式中、Ｋｐ＝Ｃｍ（０）／ＣＤ０であり；また、Ｋｐ＝Ｃｍ（ｈ）／ＣＡ０である；ＣＤ０およびＣＡ０は、それぞれドナー側およびアクセプター側の非荷電化学種の水溶液濃度である）
という形をとることに注意されたい。
【００３８】
あるｐＨで飽和している（即ち、余分な固体が存在している）溶液においては、イオン性分子についてのlogＣ０対ｐＨのプロットは極めて単純な形であり、該プロットは、飽和状態と完全な溶解状態との間の境界を示している切れ目の地点でつなげられた直線セグメントの組み合わせである。これらの連結点のｐＨは、計算に使用されるドーズ量に依存し、logＣ０の最大値は、飽和溶液におけるlogＳ０に常に等しい。
【発明の効果】
【００３９】
本発明の方法は、分子（即ち、低溶解性化合物または薬剤）の吸収を最適化することができる賦形剤の、高速、正確、かつ経済的な評価を可能にする。さらにそのような評価においては、動物実験を排除することができ、かつ化合物の使用を減らすことができる。即ち、当該方法は高速で、化合物を節約し、コスト効率がよく、かつある程度正確である為、薬剤候補の将来的な製剤化の有効性（溶解性および透過性に対するｐＨおよび賦形剤の効果）についての正当なスクリーニングを行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
本発明の方法の第一の好ましい実施形態において、流束関数の変化を評価することは：該化合物を含む所定のｐＨ値にあるキャリブレーション・ドナー（calibration donor）溶液を作製するステップを有し；該化合物および該賦形剤を含む該所定のｐＨ値にあるドナー溶液を作製するステップを有し；該化合物および該賦形剤を含まない該所定のｐＨ値にあるレシーバ（receiver）溶液を作製するステップを有し；バリアによって第一レシーバチャンバーから分離されている第一ドナーチャンバー中へキャリブレーション・ドナー溶液を与え、バリアによって第二レシーバチャンバーから分離されている第二ドナーチャンバー中へドナー溶液を与え、かつ、第一レシーバチャンバーおよび第二レシーバチャンバー中へレシーバ溶液を与えるステップを有し；当該溶液を所定の時間インキュベートするステップを有し；かつ、第一レシーバチャンバーおよび第二レシーバチャンバーのレシーバ溶液における該化合物のレスポンス（response）を測定するステップを有する。以下で使用する用語「レスポンス」は、流束関数の変化、特に濃度の変化を評価するのに好適な次元を有する。このような方法により、化合物の吸収特性に対する賦形剤の効果の効率的な評価が可能となる。さらには、このような方法により、特に、例えばＵＳ ７０２２５２８ Ｂ２に記載されている装置のような好適な装置にて行われる場合に、高度に自動化された処理が可能となる。
【００４１】
流束関数の変化を評価することは、上述のステップを複数の所定のｐＨ値において繰り返し行うことを有することが好ましい。この文脈における繰り返しは、あるｐＨ値でのステップから次のｐＨ値でのステップへ順次処理することに限定されず、同時に複数のｐＨ値でのステップを並行処理することをも特に包含する。このような評価により、化合物の吸収特性についての効果を、ｐＨと関連する効果に拡張することが可能となり、また、賦形剤の効果を、ｐＨと関連する効果と組み合わせることが可能となる。その結果、評価の効率を実質的に損なうことなく評価の質を向上させることができるようにして上記全ての効果を賦形剤の評価についての考慮に入れることができる。約ｐＨ５から約ｐＨ７.５の範囲から複数のｐＨ値を選択することが有利でありえ、複数のｐＨ値は具体的には、例えばｐＨ５、ｐＨ６.２、ｐＨ７.５という値を有していてもよい。
【００４２】
流束関数の変化を評価することは、第一レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の化合物のレスポンス（例、濃度）の測定値と、第二レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の化合物のレスポンス（例、濃度）の測定値との比率を決定するステップをさらに有することが好ましい。このような比率により、複数の化合物、複数の賦形剤、および複数のｐＨ値に基づく複数の比率を簡便に表示し概観することができるようにして流束関数の簡便な表現が可能となる。
【００４３】
第一レシーバチャンバーおよび第二レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の化合物のレスポンス（例、濃度）を測定することは、レシーバ溶液の分光学的特性の測定を有することが好ましい。そのような分光学的特性の測定は、例えば液体クロマトグラフィー質量分析法、紫外／可視吸収分光法、赤外分光法、発光分光法、ラマン分光法などの当該技術分野において公知の種々の方法により行うことができる。このような方法を行う装置を好適に使用することにより、レシーバ溶液中の化合物のレスポンス（即ち、特に濃度）の高速かつ効率的な測定が可能となる。
【００４４】
バリアは、ヒト組織、動物組織、植物組織、培養細胞モデル、および人工膜から成る群より選択されることが好ましい。この文脈におけるバリアは、生物学的バリアの物理化学的特性を模倣する、能動拡散性または受動拡散性のバリアにとりわけ関係する。そのため、脂溶性のバリアがさらに好ましい。
【００４５】
流束関数の変化を評価することは、複数の化合物および複数の賦形剤に対して：該複数の化合物のそれぞれと該複数の賦形剤のそれぞれとの各組み合わせを含む、該所定のｐＨ値にある複数のドナー溶液を作製すること；バリアによって複数の第二レシーバチャンバーから分離されている複数の第二ドナーチャンバー中へ該複数のドナー溶液を与え、かつ、該複数の第二レシーバチャンバー中へレシーバ溶液を与えること；および、該複数の第二レシーバチャンバーの該レシーバ溶液中の該化合物のレスポンス（例、濃度）を測定することによって行われることが好ましい。このような並行処理によって、複数の化合物、複数の賦形剤、および複数のｐＨ値に対する流束関数の効率的かつ高速な評価が可能となる。上記並行処理は、例えばＵＳ ７０２２５２８ Ｂ２に記載されている方法および装置を使用することで行うことができる。
【００４６】
本発明の方法の第二の好ましい実施形態においては、流束関数の変化を評価することは：該化合物を含む所定のｐＨ値にあるキャリブレーション・ドナー溶液を作製するステップを有し；該化合物および該賦形剤を含む該所定のｐＨ値にあるドナー溶液を作製するステップを有し；キャリブレーション・ドナー溶液中の該化合物の溶解度およびドナー溶液中の該化合物の溶解度を測定するステップを有し；キャリブレーション・ドナー溶液の透過率およびドナー溶液の透過率を測定するステップを有し；かつ、透過率の測定結果および溶解度の測定結果を流束関数に組み込むステップを有する。このような方法により、化合物の吸収特性に対する賦形剤の効果の効率的な評価が可能となる。特に、このような方法は、透過率および溶解度を別個の実体として明示的に決定することなく、化合物の吸収ポテンシャルに対する賦形剤の効果をモニターするために透過率の変化と溶解度の変化の両方を組み合わせており、それが本発明の方法の第二の実施形態をとりわけ高速にしている。このような方法は、脂溶性のバリアによって分けられている二つのチャンバーの透過システムのレシーバチャンバーにおいて現れる化合物のレスポンスの変化（例、濃度の変化）を、ドナーチャンバー中の賦形剤成分（種類および／または濃度）を変化させながらモニターすることを有してもよい。バリアは、人工膜（例、脂溶性溶液に含浸させたフィルター（即ち、パラレル・アーティフィシャル・メンブレーン・パーミアビリティー・アッセイ（the parallel artificial membrane permeability assay）（ＰＡＭＰＡ）モデル））、培養内皮細胞（例、ＲＢＥ４）、またはその他の培養細胞モデル（例、Ｃａｃｏ−２、ＭＤＣＫ等）を構成して（constitute）もよい。生物学的に意義のある水境界層の厚さおよびｐＨを考慮に入れてもよい。本発明の方法のこの第二の実施形態は、調査している化合物の吸収特性および薬物動態学的特性に対する賦形剤の影響を早期に、高速に、かつコスト効率よく評価することを可能とする、ハイスループットのプレフォーミュレーション・スクリーニング技術に繋がる。
【００４７】
流束関数の変化を評価することは、複数の所定のｐＨ値において上述したステップを繰り返し行うことを有することが好ましい。「繰り返し」という表現に関しては、上述したものが以下においても適用される。このような評価により、化合物の吸収特性についての効果を、ｐＨと関連する効果に拡張することが可能となり、また、賦形剤の効果を、ｐＨと関連する効果と組み合わせることが可能となる。その結果、評価の効率を実質的に損なうことなく評価の質を向上させることができるようにして上記全ての効果を賦形剤の評価についての考慮に入れることができる。約ｐＨ５から約ｐＨ７.５の範囲から複数のｐＨ値を選択することが有利でありえ、複数のｐＨ値は具体的には、例えばｐＨ５、ｐＨ６.２、ｐＨ７.５という値を有していてもよい。
【００４８】
従って、好ましくは、キャリブレーション・ドナー溶液中の化合物およびドナー溶液中の化合物の溶解度の測定は：上記溶液を所定の時間インキュベートするステップを有し；上記溶液を濾過するステップを有し；かつ、濾過溶液中の化合物の量を測定するステップを有する。そのような測定は、当該技術分野において公知の種々のプロセスを行うことによって効率よく、高速に、そして正確にして行うことができ、ここでＵＳ ７０２２５２８ Ｂ２に記載されている方法および装置を使用することはとりわけ有利でありうる。
【００４９】
好ましくは、キャリブレーション・ドナー溶液の透過率およびドナー溶液の透過率の測定は：該化合物および該賦形剤を含まない該所定のｐＨ値にあるレシーバ溶液を作製するステップを有し；膜フィルターによって第一レシーバチャンバーから分離されている第一ドナーチャンバー中にキャリブレーション・ドナー溶液を与え、膜フィルターによって第二レシーバチャンバーから分離されている第二ドナーチャンバー中にドナー溶液を与え、かつ、第一レシーバチャンバー及び第二レシーバチャンバー中へレシーバ溶液を与えるステップを有し；当該溶液を所定の時間インキュベートするステップを有し；かつ、第一ドナーチャンバーおよび第二ドナーチャンバーのドナー溶液中の化合物の量ならびに第一レシーバチャンバーおよび第二レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の化合物の量を測定するステップを有する。ここでもまた、そのような測定は、当該技術分野において公知の種々のプロセスを行うことによって効率よく、高速に、そして正確にして行うことができ、ここでＵＳ ７０２２５２８ Ｂ２に記載されている方法および装置を使用することはとりわけ有利でありうる。
【００５０】
流束関数の変化を評価することは、第一レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の化合物の量の測定値と、第二レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の化合物の量の測定値との間の比率を決定するステップをさらに有することが好ましい。このような比率により、複数の化合物、複数の賦形剤、および複数のｐＨ値に基づく複数の比率を簡便に表示し概観することができるようにして流束関数の簡便な表現が可能となる。
【００５１】
流束関数の変化を評価することは、複数の化合物および複数の賦形剤に対して：該所定のｐＨ値にある、該複数の化合物のそれぞれと該複数の賦形剤のそれぞれとの各組み合わせの複数のドナー溶液を作製すること；該ドナー溶液のそれぞれにおける該化合物の溶解度を測定すること；および、該ドナー溶液のそれぞれの透過率を測定することによって行われることが好ましい。このような並行処理によって、複数の化合物、複数の賦形剤、および複数のｐＨ値に対する流束関数の効率的かつ高速な評価が可能となる。上記並行処理は、例えばＵＳ ７０２２５２８ Ｂ２に記載されている方法および装置を使用することで行うことができる。
【００５２】
上述した本発明の方法の全ての好ましい実施形態において、レシーバ溶液は、少なくとも一つの添加物を含むことが好ましい。そのような添加物により、流束関数の変化の評価を、好適な条件にまでもたらすことができる。例えば、添加物によって当該条件は、生体内の腸管環境をより近しく表すのに適したものになりうる。さらには、当該条件は、例えば改善された処理またはより簡単な処理を可能にするのに適したものになりうる。
【００５３】
添加物は、化合物への高い結合能、低い紫外線吸収性、高い水溶性、および低い蒸気圧の群より選択される少なくとも一つの特性を持つことが好ましい。
【００５４】
本発明の方法は、キャリブレーション・ドナー溶液およびドナー溶液を攪拌するステップを有することが好ましい。そのような攪拌によって、流束関数の変化の評価のための条件を最適化することができる。例えば、目的とする環境を表さないようなミクロの条件が流束関数の変化の評価の際にバリアの近くにもたらされることを防ぐことができる。このことは、例えば、天然バリアの両側が生体内の何らかの流れの下に横たわっている腸管環境が表される場合に、とりわけ興味深い。即ち、このような攪拌により、血液のシンク（ sink ）としての機能を促進することが可能であり、それにより、バリア周辺の拡散勾配を保つことができる。
【００５５】
好ましい実施形態において、当該方法は：賦形剤、化合物およびｐＨ値に関する比率を順位付けするステップを有し；かつ、順位付けされた比率を可視化するステップを有する。そのような順位付けおよび可視化により、複数のｐＨ値で複数の賦形剤と組み合わされた複数の化合物を効率的に概観し、効率的に評価することが可能となる。
【００５６】
好ましくは、比率の順位付けは：全ての化合物および全てのｐＨ値に対して、各賦形剤についての比率の合計値を計算するステップを有し；かつ、比率の合計値を順位付けするステップを有する。全ての賦形剤についてそのような合計値を作り（building）、該合計値を順位付けすることにより、複数のｐＨ値で複数の賦形剤と組み合わされた複数の化合物を、いっそうより効率的に概観し、いっそうより効率的に評価することが可能となる。
【００５７】
好ましくは、当該方法は：全ての賦形剤および全てのｐＨ値に対して、各化合物についての比率のさらなる合計値を計算するステップを有し；かつ、該比率のさらなる合計値を順位付けするステップをさらに有する。全ての化合物についてそのような合計値をさらに作り、該合計値を順位付けすることにより、複数のｐＨ値で複数の賦形剤と組み合わされた複数の化合物を、いっそうより効率的に概観し、いっそうより効率的に評価することが可能となる。
【００５８】
本発明の別の側面は、上述した方法の全てまたは一部のステップを行うために設定されているコンピュータープログラムに関係している。そのようなコンピュータープログラムを使用することにより、当該方法のかなりの部分を効率的に、高速に、かつ正確に行うことができるようにして自動化することが可能となる。とりわけ、流束関数の変化の評価結果を可視化する場合に、好適な賦形剤、薬物およびｐＨ値の評価を迅速に行うことができる。
【実施例】
【００５９】
本発明の方法および本発明のコンピュータープログラムを、例示的な実施形態により、添付の図面を参照して以下により詳細に説明する。
【００６０】
本発明の方法の第一の実施形態は、低溶解性化合物の予測される吸収特性に対する賦形剤、ｐＨおよびそれらの組み合わせの効果を評価するために、透過率の測定結果と溶解度の測定結果とを流束関数に組み込むことを有する。
【００６１】
透過性の適切な測定は、種々の方法で行うことができる。発見においては、Ｃａｃｏ−２やＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓などの単層培養細胞モデル（Ho N.F.H. et al., “Quantitative approaches to delineate passive transport mechanisms in cell culture monolayers”, 2000 in: Amidon G. L. et al., “Transport Processes in Pharmaceutical Systems”, Marcel Dekker, New York, pp. 219-316 and Avdeef A. et al., “Caco-2 permeability of weakly basic drugs predicted with the Double-Sink PAMPA pKa flux method”, Eur. J. Pharm. Sci., 2005, 24, 333-349A）がしばしば使用される。製薬産業では、選択された候補分子が開発フェーズに入るまでは通常、細胞でのそのような研究は賦形剤を選択するために使用されない。通常このステージでは、薬物動態学的な動物モデルが使用される。難溶性ではあるがそれ以外では有望である分子の場合、透過性に対する賦形剤の効果を測定するためのコスト効率のよい手段が利用可能であるならば、早期賦形剤スクリーニング（それは、早期前臨床開発の最初のステップであるかもしれない）は、優先順位をつけるのに有益であり、また、動物実験の回数を最小限に抑えるのに有益であるかもしれない。Ｌｉｕ等（Liu, H. et al., “In vitro permeability of poorly aqueous soluble compounds using different solubilizers in the PAMPA assay with liquid chromatography/mass spectrometry detection”, Pharm. Res., 2003, 20, 1820-1826）が、具体的にはＢｒｉｊ(登録商標)３５、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ、エタノールおよびＴｗｅｅｎ８０といった可溶化剤のスクリーニングのために低コストのパラレル・アーティフィシャル・メンブレーン・パーミアビリティー・アッセイ（ＰＡＭＰＡ）モデルを使用してまさにそれを行うことを提案した最初である。それまでは、ＰＡＭＰＡは有用な調査ではあったが、それは単に早期発見スクリーニングにおいてのみであった。それ以来、医薬品化学者にとって有用な機構的ツールとしてのＰＡＭＰＡの価値はいくつかの例において示されてはきたが、早期前臨床開発におけるＰＡＭＰＡの影響力は、Ｌｉｕ等による上記研究を除いては実証されてこなかった。
【００６２】
本発明の方法の第一の実施形態のための実施例として以下に記載する透過性測定においては、Ｌｉｕ等によって研究された主題を拡張することを提案する。透過性に対する賦形剤の効果を評価するために、６つの賦形剤およびイオン強度調整剤：タウロコール酸ナトリウム、２−ヒドロキシプロピル−ｂ−シクロデキストリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、１−メチル−２−ピロリドンおよびポリエチレングリコール４００の１５の組み合わせで測定した、以下の８つの難溶性薬剤：アステミゾール（astemizole）、ブタカイン（butacaine）、クロトリマゾール（clotrimazole）、ジピリダモール（dipyridamole）、グリセオフルビン（griseofulvin）、プロゲステロン（progesterone）、グリベンクラミド（glybenclamide）およびメフェナム酸（mefenemic acid）についての二重シンクＰＡＭＰＡ測定を報告する。
【００６３】
透過性測定の当該実施例は、二重シンクＰＡＭＰＡ、およびｐＩＯＮ社の二重シンクＰＡＭＰＡ用の脂質（ＰＮ １１００６６９）を用いて、以下の通りに行う。透過性測定のこの実施例において使用する化合物は、表１に挙げた化合物である。二重シンクＰＡＭＰＡ用の脂質は、使用しないときには−２０℃で保存する。アッセイされるドナー溶液のｐＨはｐＩＯＮ社のユニバーサル緩衝液（ＰＮ １００６２１、１１００１５１）で調整し、また、血清タンパク質をシミュレートするためにｐＩＯＮ社の化学捕捉剤緩衝液（chemical scavenger buffer）ＡＳＢ−７.４（ＰＮ １１０１３９）を含有するｐＨ７.４の緩衝溶液をレシーバ溶液として使用する。賦形剤は、ドナーウェルにのみ加える。
【００６４】
【表１】
【００６５】
賦形剤およびその濃度に関して、６つの賦形剤の量は、臨床的に意義のある条件にある胃腸液において想定される濃度と重なるように選択する。ＫＣｌについては、ＦＡＳＳＩＦ／ＦＥＳＳＩＦ培地における濃度（Dressman J. B., “Dissolution testing of immediate-release products and its application to forecasting in vivo performance”, in Dressman J.B.et al., “Oral Drug Absorption”, Marcel Dekker Inc., New York, 2000, pp. 155-181)に従い、二つのレベル：０.１モル（Ｍ）および０.２Ｍを選択する。タウロコール酸ナトリウム（ＮａＴＣ）溶液は、Ｄｒｅｓｓｍａｎ Ｊ. Ｂ.が記載しているような絶食時および摂食時の胃腸管（ＧＩＴ）の状態に対応して、３ミリモル（ｍＭ）および１５ｍＭで調製する。液体賦形剤について、最大のカプセル容量はＧＩＴの容積２５０ｍｌに対して０.６ミリリットル（ｍＬ）であると仮定し、算出される賦形剤の濃度は０.２４％ ｖ／ｖである。従って、１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、プロピレングリコール（ＰＧ）、およびポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）については、０.２４％ｖ／ｖ、１％ｖ／ｖ、５％ ｖ／ｖの賦形剤溶液を評価する。２−ヒドロキシプロピル−b−シクロデキストリン（ＨＰ‐ｂ‐ＣＤ）溶液は、０.２４％ ｗ／ｖおよび１％ ｗ／ｖという同様の濃度で評価する。賦形剤を含まない緩衝溶液も数に入れて全部で１５の異なる溶液を８種類の薬剤分子と共にＰＡＭＰＡにおける効果を評価する（結果として、１２０の薬剤−賦形剤の組み合わせである）。
【００６６】
ｐＫａの測定に関して、電位差滴定装置（instruments potentiomentric）Ｇｅｍｉｎｉ（ｐＩＯＮ社）、ＧＬｐＫａ（Ｓｉｒｉｕｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＵＫ社（Ｓｉｒｉｕｓ社））、ＵＶ−ｍｅｔｒｉｃ Ｄ−ＰＡＳ（Ｓｉｒｉｕｓ社）およびＳＧＡ（Ｓｉｒｉｕｓ社）を正確な電離定数を決定するために使用する。上述した難溶性分子については、実験上の問題を克服するために、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびメタノールを共溶媒として使用するなど、いくつかの対策を試みる。Ｇｅｍｉｎｉ装置では、水溶液または共溶媒のいずれにおいても、沈殿が一部の滴定の際に存在していたとしてもｐＫａを決定することが可能である。これは、当該装置が溶解度および電離定数を同一滴定中に同時に決定することができるためである。その上、Ｇｅｍｉｎｉ装置によって、ｐＨ電極のキャリブレーションを「インサイチュ」でｐＫａの決定と同時に行うことができる。これは、ｐＫａが４から９の範囲の外側にある場合、共溶媒溶液中での決定に関してとりわけ重要な特徴である。これは、Ａｖｄｅｅｆ−Ｂｕｃｈｅｒの４つのｐＨ電極パラメーターを決定するために最初に「ブランク（blank）」滴定を行う従来の方法（Avdeef, A. et al., “Accurate measurements of the concentration of hydrogen ions with a glass electrode: calibrations using the Prideaux and other universal buffer solutions and a computer-controlled automatic titrator”, Anal. Chem., 1978, 50, 2137-2142）と比べて大幅な改善でありうる。
【００６７】
本明細書に記載する透過率測定の実施例においては、アーティフィシャル・メンブレーン・パーミアビリティー・アッセイ（ＰＡＭＰＡ）法を用いる。そのために、ｐＩＯＮ社（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）のＰＡＭＰＡ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ装置を使用し、データを室温（２５±２℃）で集める。ＰＡＭＰＡの９６ウェルの「サンドイッチ」に９６個のｐＩＯＮ社のマグネチックスターラー（ＰＮ １１０２１２）をあらかじめ入れておく。典型的なサンプル濃度は、賦形剤含有緩衝溶液中、約５０μＭである。これらの溶液中の残留ＤＭＳＯは、０.５％ｖ／ｖである。各化合物についての有効透過率ＰｅをｐＨ３からｐＨ１０の領域で測定する。ドナー溶液はｐＨについて様々であるが（ＮａＯＨ処理したユニバーサル緩衝液）、レシーバ溶液は同一のｐＨ７.４を有する。最適化されたｐＨ勾配条件をｐＯＤの方法（Ruell J.A. et al., “PAMPA - a drug absorption in vitro model”, 5, “Unstirred water layer in iso-pH mapping assays and pKaflux-optimized design (pOD-PAMPA)”, Eur. J. Pharm. Sci., 2003, 20, 393-402）を用いて選択するが、それは、ｐＨ値が化合物のｐＫａｆｌｕｘ値（以下で定義する）の上となるのと下となるのとを確実にするためである。ｐＨの差異は、電離作用および吸収境界層（absorption boundary layer；ＡＢＬ）の作用に対して、有効透過率の値を補正するために必要である（Avdeef A., “Absorption and Drug Development”, Wiley-lnterscience, 2003, pp. 116-246; Avdeef A. et al., “S. Caco-2 permeability of weakly basic drugs predicted with the Double-Sink PAMPA pKaflux method”, Eur. J. Pharm. Sci., 2005, 24, 333-349;およびAvdeef A. et al., “PAMPA - a drug absorption in vitro model”, 11, “Matching the in vivo aqueous boundary layer by individual-well stirring in microtitre plates”, Eur J. Pharm. Chem., 2004, 22, 365-374）。レシーバ溶液は、薬剤結合タンパク質の機能の一部を模倣するために界面活性剤混合物（「脂溶性シンク」）を含有する（Avdeef A. et al., “High-throughput measurements of permeability profiles” in: van de Waterbeemd H. et al., “Drug Bioavailability. Estimation of Solubility, Permeability, Absorption and Bioavailability”, Wiley - VCH: Weinheim, 2002, pp. 46-71）。当該アッセイでは激しい撹拌が用いられ、撹拌速度は約４０μｍの厚さの水境界層（ＡＢＬ）を作り出すよう設定されるが、それは、測定される透過率についてのＡＢＬの寄与を、ＧＩＴにおいて想定されるそれと合致させるためである（Avdeef A. et al., “PAMPA - a drug absorption in vitro model”, 11, “Matching the in vivo aqueous boundary layer by individual- well stirring in microtitre plates”, Eur J. Pharm. Chem., 2004, 22, 365-374）。ＰＡＭＰＡサンドイッチを集め、高透過性分子については、例えば磁気撹拌機構が内蔵されているｐＩＯＮ社のＧｕｔ−Ｂｏｘ（商標）（ＰＮ １１０２０５）といった、環境制御されたチャンバー中で３０分間インキュベートしておく。次いでサンドイッチを分離し、ドナーウェルとレシーバウェルとの両者について、標準参照溶液から得られるＵＶスペクトル（２３０ｎｍから５００ｎｍ）と比較することで、存在する物質の量をアッセイする。膜フィルターに残っている物質の量（％Ｒ）およびマイクロタイタープレートのプラスチック壁に付着している物質の量を決定するためにマスバランスを使用する（Avdeef A., “Absorption and Drug Development”, Wiley-lnterscience, 2003, pp. 116-246）。
【００６８】
有効透過率Ｐｅは、使用可能なフィルター面積０.３ｃｍ２に見かけの空隙率０.７６を乗じることを除いて、以前に記載されたようにして計算する。この後者のステップは、異なる空隙率を有するフィルターを使用するＰＡＭＰＡアッセイで決定されたＡＢＬの厚さが絶対尺度にあることを確かにする（Nielsen P.E. et al., “PAMPA - a drug absorption in vitro model”, 8, “Apparent filter porosity and the aqueous boundary layer”, Eur. J. Pharm. Sci., 2004, 22, 33-41）。
【００６９】
ＧＩＴ上皮環境では、ＡＢＬの厚さは３０〜１００μｍであると想定され、一方、攪拌を行わないＰＡＭＰＡでは、ＡＢＬの厚さは４０００μｍもの高さになりうる（Avdeef A. et al., “S. Caco-2 permeability of weakly basic drugs predicted with the Double-Sink PAMPA pKaflux method”, Eur. J. Pharm. Sci., 2005, 24, 333-349; Avdeef A. et al., “PAMPA - a drug absorption in vitro model”, 11, “Matching the in vivo aqueous boundary layer by individual-well stirring in microtitre plates”, Eur J. Pharm. Chem., 2004, 22, 365-374）。あるｐＨ範囲に渡ってＰＡＭＰＡ（攪拌または非攪拌）のデータを取得し、以下に簡潔に説明するｐＫａｆｌｕｘの方法を用いることで、ＡＢＬの影響を、ＧＩＴに関して想定されるＡＢＬの影響と合致させることが可能である（Avdeef A., “Absorption and Drug Development”, Wiley-lnterscience, 2003, pp. 116-246;およびAvdeef A. et al., “S. Caco-2 permeability of weakly basic drugs predicted with the Double-Sink PAMPA pKafluxmethod”, Eur. J. Pharm. Sci., 2005, 24, 333 - 349）。
【００７０】
有効透過係数Ｐｅは、膜透過係数およびＡＢＬ透過係数（それぞれＰｍおよびＰＡＢＬ）と、
【００７１】
【数９】
【００７２】
のようにして関係する。
【００７３】
イオン性分子に関しては、膜透過率Ｐｍはバルク水溶液のｐＨに依存する。可能な最大のＰｍを、非荷電化学種の固有透過率Ｐ０と表す。弱い一塩基酸および弱い一酸塩基に関しては、ＰｍとＰ０との関係は、非荷電化学種の割合ｆ０の観点から、
【００７４】
【数１０】
【００７５】
のように記述することができ、ここで「＋」は酸に対して、「−」は塩基に対して使用されている。その他の場合については、他の場所に記載されている。式（９）と式（１０）とを組み合わせることにより、
【００７６】
【数１１】
【００７７】
が導かれる。
【００７８】
高透過性分子に関しては、
の場合に、ＡＢＬに限定された輸送がしばしば観察される。これは概して脂溶性薬剤で観察されるが、脂溶性薬剤では分子に関わらず同様のＰｅ（約３０ｘ１０−６ｃｍ／s）が測定され、このことは膜よりむしろ水の特性を示している。式（１１）は、対数の形に帰着する（Avdeef A. et al., “S. Caco-2 permeability of weakly basic drugs predicted with the Double-Sink PAMPA pKafluxmethod”, Eur. J. Pharm. Sci., 2005, 24, 333-349）。
【００７９】
【数１２】
【００８０】
可能な最大の有効透過率（測定値）Ｐｅｍａｘは、
【００８１】
【数１３】
【００８２】
と定義される。
【００８３】
Ｐｏ>>ＰＡＢＬ（高透過性分子）の場合、
であり、これは膜の拡散よりむしろ水の拡散を示している。「流束」の電離定数ｐＫａｆｌｕｘは、透過バリアを横切る輸送に対する抵抗が、５０％はＡＢＬによるものであり、５０％は膜によるものであるｐＨ値をいう。
【００８４】
本明細書に記載する例示的な透過率測定の結果およびその解釈に関して、図１は、種々の使用されている「当該技術分野の現状」の方法により決定された電離定数の比較を示している。当該化合物はすべて水にほんの少しだけ溶けるため、共溶媒を使用し、そしてＧＬｐＫａ装置およびＤ−ＰＡＳ装置の場合にはＹａｓｕｄａ−Ｓｈｅｄｌｏｖｓｋｙ（Avdeef A. et al., “pH-metric logP”, 3, “Glass electrode calibration in methanol-water, applied to pKa determination of water-insoluble substances”, Anal. Chem., 1993, 65, 42-49）の方法により水での値を外挿し、Ｇｅｍｉｎｉ装置の場合にはゼロｗｔ％の共溶媒にまで直線外挿することにより水での値を外挿する。商業的に作られているＳＧＡ装置は現在のところ、共溶媒についての機能を持たないため、ユニバーサル水性緩衝液のみを使用する。Ｄ−ＰＡＳ装置およびＳＧＡ装置はＵＶベースであるため、ｐＫａの決定において、より低い濃度の溶液を使用して低い水溶解度という問題の、全てではないが一部を回避することが可能である。最もよく使用されている二つの共溶媒：ＤＭＳＯおよびメタノールをこの例示的な透過率測定では用いる。ほとんど全ての場合において、ＤＭＳＯでの外挿したｐＫａ値は、メタノール−水混合液から外挿したｐＫａ値よりも体系的に低く、ｐＫａＤＭＳＯ＝０.６１＋０.８６ｐＫａＣＨ３ＯＨ（ｒ２＝０.９９、ｓ＝０.２７、ｎ＝８）という傾向に従っている。ブタカインおよびアステミゾールは二酸塩基であるため、共溶媒の非存在下において、低ｐＨのｐＫａを決定することが実際に可能である。両方の場合において、ＤＭＳＯでの外挿値はメタノールでの外挿値よりもバイアスされている。不一致は、ブタカインの低ｐＨのｐＫａ値の場合に特に顕著である。メタノールでの外挿値は概してより正確であるように思われ、これは、メタノールはｐＫａの決定で使用する共溶媒のうち「最も問題ないもの」と見なされていることによって支持される結論である。共溶媒の使用は利用可能な特徴ではなく、また、図１における相等線（identity line）からのずれが大きいため、この例示的な透過率測定においては、ＤＭＳＯでの結果を除いて、ＳＧＡでの値を信頼するべきではない。黒丸が相等線の最も近くにあることで示される通り、最良の一致は電位差滴定でのＧＬｐＫａの値とＧｅｍｉｎｉの値との間で見られることを図１は明らかにしている。
【００８５】
ＧＬｐＫａでの値およびＧｅｍｉｎｉでの値を、研究セットについて単純に平均化してもよいが、この例示的な透過率測定では以下の理由からそれを行わない：共溶媒−水の比率が沈殿を回避するために十分高く選ばれているという、うまく設計されているアッセイであるにも関わらず、最も低い共溶媒−水の比率において沈殿が起こらないことを確実にすることは不可能に近い。ＧＬｐＫａのサンプルチェンジャーの設計が原因で、滴定の最中に溶液を見るのには不都合がある。それに対してＧｅｍｉｎｉは、よく見えるガラスバイアルを有している。多くの場合に、当該低溶解性化合物について多少の沈殿がＧＬｐＫａ中で起こっていたのはほぼ間違いないことを視覚的観察は示していた。さらには、Ｇｅｍｉｎｉでの電極キャリブレーションの方法は、３未満のｐＫａ値を、共溶媒溶液においてより信頼できるものにしていた。
【００８６】
図２は、ＧｅｍｉｎｉでのｐＫａ測定の結果に関する。図２は、従来法で設計されているアッセイおよび、従来法での測定における通常の結果ではどうしてもうまくいかないことがありうるが、対照的にＧｅｍｉｎｉはそれらを回避して計算する（circumcalculated）ことを示している。１１〜４９ｗｔ％メタノール中でのクロトリマゾールのｐＫａの６つの測定を図２に示している。共溶媒ゼロに外挿したｐＫａは、６.０２±０.０５である。図２の挿入図は、１１ｗｔ％、２８ｗｔ％および３９ｗｔ％での滴定についてのビエルム（Bjerrum）のプロット（Avdeef A. “Absorption and Drug Development”, Wiley-lnterscience, 2003, pp. 116-246）である。挿入図中の破曲線は、沈殿が起こらないであろう無限に低いサンプル濃度の極限において期待される曲線に対応している。測定点を繋ぐ実曲線は、沈殿なしの破曲線からの有意なずれを示している。このずれは、３５ｗｔ％より低いメタノールでの滴定ではクロトリマトゾールが沈殿したために生じている。従来の精密化（refinement）プログラムは、このような沈殿を影響に入れず、共溶媒の比率が減少するにつれてｐＫａを体系的に低く見積もってしまい、１１ｗｔ％の場合には誤差は対数単位にまでなる（図２挿入図）。バイアスされた値が外挿の基礎であれば、ｐＫａは対数単位でずれて５に近くなってしまう（データ示さず）。
【００８７】
Ｇｅｍｉｎｉ装置の精密化プログラムの他とは異なる特徴は、溶解度とｐＫａ値とを同時に精密化するため、多少の沈殿の存在下でもバイアスされていないｐＫａ値を決定できることである。図２におけるフィットは、個々のセットの精密化で得られた誤差で重み付けされており、ここで当該精密化は、「過度の」沈殿がｐＫａ値の正確な決定を妨げる場合には、最も低い共溶媒のｗｔ％の点からの寄与の重みを低くするものである。
【００８８】
当該新規ｐＫａ技術は、最も溶けない化合物の電離定数を決定するのに最適である。以下の改善は明らかである：（ａ）より低い比率での沈殿を回避して計算するため、より広範な共溶媒の比率が実行可能であること、（ｂ）より精度の高い決定のために、より高いサンプル濃度を使用できること、（ｃ）「最善の」共溶媒の比率を選択することについての外挿プロセスに対する重要性がより低く、該方法をより「フォールト」トレラント（“fault” tolerant）にしていること、および（ｄ）インサイチュでのｐＨ電極のキャリブレーションにより、より広いｐＨ枠でのｐＫａの決定が共溶媒滴定において可能であること。
【００８９】
表１（上記参照）に、０．１５Ｍ（ＫＣｌ）のイオン強度においてＧｅｍｉｎｉで決定したｐＫａ値を示す。透過性緩衝液のほうが低イオン強度であるため、これらの値を０.０１Ｍのイオン強度レベルに換算し、その後の全てのＰＡＭＰＡ解析で使用するが、それは、緩衝性緩衝液はより低いイオン強度にあるためである。ＫＣｌが０．１Ｍおよび０．２Ｍの場合に、該定数への適切な（appriate）調整を行った（Avdeef A., “Absorption and Drug Development”, Wiley-lnterscience, 2003, pp. 116 - 246）。
【００９０】
図３は、賦形剤なしでのＰＡＭＰＡ測定に関する。図３は、上述の分子についての、賦形剤なしの透過率特性を示している。実線は、式（１２）に従うｐＨの関数として、有効透過率値logＰｅ（黒丸）の最良適合を示している。ｐＫａｆｌｕｘ値の実例を図３（ａ−ｃ、ｇ、ｈ）に示している。計算された水境界層（ＡＢＬ）の透過率の値（点横線）を有効透過率の値（式（９）および式（１０））についての要素から除外した場合に、破線の膜透過率曲線logＰｍ対ｐＨとなる。図３（（ｄ）および（ｅ）を除いた全て）における実線曲線は、その最大限度においても破線曲線の下にあることから、ＡＢＬに限定された輸送の実例である。塩基の場合、ｐＨ>>ｐＫａｆｌｕｘでは式（１２）は横線となり、ｐＨ<<ｐＫａｆｌｕｘでは式（１２）は＋１の勾配を持つ斜線となる。酸の場合、ｐＨ<<ｐＫａｆｌｕｘでは式（１２）は横線となり、ｐＨ>>ｐＫａｆｌｕｘでは式（１２）は−１の勾配を持つ斜線となる。
【００９１】
プロゲステロンを除いて全ての透過率データは、４０μｍのＡＢＬに設定したＧｕｔ−Ｂｏｘを用いて測定し、また、直接的なｐＫａｆｌｕｘの方法は非イオン性分子で使用できないため、プロゲステロンの場合には、該設定は２５μｍのＡＢＬである。それらの分子について、キャリブレーションの方法が知られている（Avdeef A. et al., “Caco-2 permeability of weakly basic drugs predicted with the Double-Sink PAMPA pKaflux method”, Eur. J. Pharrn. Sci., 2005, 24, 333 - 349;およびAvdeef A. et al., ,,PAMPA - a drug absorption in vitro model”, 11, “Matching the in vivo aqueous boundary layer by individual-well stirring in microtitre plates”, Eur J. Pharm. Chem., 2004, 22, 365-374）。精密化したＡＢＬの厚さ（式（１２））を図３に示すが、それらは２１〜９７μｍに及ぶ。７５μｍを超える３つの値は、ブタカイン、メフェナム酸およびグリベンクラミドが溶液中でアグリゲート化することを示している可能性がある。ＡＢＬの透過率は水溶液中に拡散している化学種の分子量に依存するため、モノマー分子量を計算に使用すると、ＡＢＬの見かけの厚さが増加する。
【００９２】
賦形剤ありでのＰＡＭＰＡ測定に関しては、１２００回を上回る二重シンクＰＡＭＰＡ測定を３〜１０のｐＨ範囲内で行う。固有透過率およびＡＢＬの透過率を計算するために、高精度のｐＫａ（High-precision pKas）（Ｇｅｍｉｎｉ）をｐＫａｆｌｕｘの方法に用いる。この例示的な透過率測定で決定した１２０のＰ０値を、最大膜残留率（maximum membrane retention）（％Ｒ）およびＡＢＬの見かけの厚さとともに、表２にまとめている。
【００９３】
【表２】
【００９４】
最も透過性の高い分子はアステミゾールであり、Ｐ０値は０.５ｃｍ／s（０.２４％ ｖ／ｖ ＰＥＧ４００および１５ｍＭ ＮａＴＣ）から３２ｃｍ／s（３ｍＭ ＮａＴＣ）に及んでいる。最も透過性の低い分子はグリセオフルビンであり、Ｐ０値は１.８ｘ１０−４ｃｍ／s（５％ ｖ／ｖ ＰＧ）から４.１ｘ１０−４ｃｍ／s（０.１Ｍ ＫＣｌ）に及んでいる。
【００９５】
膜残留はほとんどの分子でかなりのものであり、アステミゾールが最上位に位置しており、値は典型的に７９％〜９０％の範囲内である（しかし、１５ｍＭ ＮａＴＣの場合には、２４％まで低下している）。水相からこのように減少するにも関わらず、それでもなおＰＡＭＰＡ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ装置のソフトウェアによってアステミゾールの透過率にアクセスすることが可能である。表２に示すとおり、他の残留分子については賦形剤とともに順位が変化する。例えば１５ｍＭ ＮａＴＣの場合のように、そして特にクロトリマゾール（賦形剤なしでの値８０％と比較して、残留率が４％にまで低下している）についてのように、低い膜残留率は、賦形剤が化合物の保持についてＰＡＭＰＡ膜と効率的に競合することを示している。
【００９６】
表２に挙げたＡＢＬの厚さは、賦形剤−薬剤相互作用についても示唆している。理想的に、薬剤が賦形剤を含まない溶液中でアグリゲートを形成することもなく、また、賦形剤と結合した複合体を形成することもないとすれば、決定されるＡＢＬの厚さｈＡＢＬは約４０μｍ（あるいは、非常に攪拌されているプロゲステロン溶液の場合には２５μｍ）であったはずである。アステミゾールやクロトリマゾールについてなど多くの場合に、予測されるｈＡＢＬ＜５０μｍが決定されている。しかしながら全く対照的に、１５ｍＭ ＮａＴＣ溶液中での計算されたＡＢＬの厚さは、多くの場合に１０００μｍを上回っている。理論的に予測されるＰＡＢＬおよび実験的なＰＡＢＬを表２に挙げている。観察された最小値は、非常に大きい分子量を有する、結合した複合体の影響から生じていると解釈することができる。ＰＡＢＬとＭＷとの関係は当該技術分野において公知である。例えば、Avdeef A., “The Rise of PAMPA”, Expert Opin. Drug Metab. Toxicol., 2005, 1, 325-342の式４を見かけのＰＡＢＬに適用すれば、賦形剤を含まない溶液（０％ ＮａＴＣ、表３）は、アステミゾール、クロトリマゾールおよびジピリダモールの場合にはモノマーの水拡散を示すようであるが、それは、見かけの分子量ＭＷ＊（４０μｍのＡＢＬという仮定に基づく）の真の分子量に対する割合ＭＷ＊／ＭＷが１に近いためである。他の一部の低溶解性薬剤については、同様の緩衝溶液中で、アグリゲートまたは４〜７のオーダーを示すようである（Streng W.H. et al, “Determination of solution aggregation using solubility, conductivity, calorimetry, and pH measurements”, Int. J. Pharm., 1996, 135, 43-52）。３ｍＭのタウロコール酸ナトリウム溶液中では、ジピリダモールのみがモノマーとして振舞っているようであるが、他の分子は、３〜５のオーダーのアグリゲートとして現れている。これらのアグリゲートは、薬剤と賦形剤との結合でありうる。１５ｍＭのＮａＴＣ溶液ではＡＢＬ透過率が極端に減少し、単純化した分析によれば５６０００ものオーダーのアグリゲート化が示されたが、これは妥当であるとは思われない。１５ｍＭ ＮａＴＣ溶液はマイクロタイタープレート中で容易にバブルを形成するためロボット装置中で機能し難いことから、賦形剤との複合体形成が唯一の解釈であるとまさに確信することは困難である。１５ｍＭ ＮａＴＣ溶液がＰＡＭＰＡ膜の一部を溶かしている可能性も懸念されるが、その影響の目に見える証拠（溶液の混濁）は観察されていない。
【００９７】
賦形剤含有溶液でのlogＰ０と、賦形剤を含まない（基準レベル）溶液でのlogＰ０との差を、賦形剤の量の関数として図４にプロットしている。塩基性薬剤（bases）は酸性薬物（acids）および中性薬物（neutrals）とは異なる挙動であることが多くの場合に明らかである。ＫＣｌ溶液、ＮＭＰ溶液およびＰＥＧ４００溶液において、塩基性薬剤では、賦形剤存在下で固有透過率が低下するようであるが、酸性薬剤および中性薬剤では、透過率は上昇する。ＮａＴＣおよびＨＰ‐β‐ＣＤを含有する溶液では、最大の賦形剤レベルにおいて、全ての化合物で透過率が減少するようである。そのような賦形剤への薬剤の結合は十分に強く、そのため残りの遊離の部分の、結合していない薬剤濃度が著しく低下し、その結果、透過セルにおけるドナー区画とアクセプター区画との間の濃度勾配が減少し、透過率の減少に繋がっているようである。
【００９８】
本明細書に記載する例示的な透過率測定の結果の視覚化に関して、図４には賦形剤の効果が記載されてはいるが、図４を迅速に把握して賦形剤の使用に関する実際的な決定をするのは視覚的には困難である。それゆえ、ＰＡＭＰＡマッピング（PAMPA-Mapping）と呼ばれるマッピングスキームを図５、図６および図７に示しており、ＰＡＭＰＡマッピングは賦形剤の効果についての視覚的側面を改善している。示しているのはＰＡＭＰＡマッピングについての３つの成分のマップである：透過率（図５）、膜残留率（図６）およびＡＢＬ（図７）。縦軸に沿ってあるのは賦形剤組成物であり、それらは、固有透過率に対する増強効果によって順序付けされている。横軸に沿ってあるのは薬剤であり、透過率を最も増強するものから最も増強しないものの順番で並べている。全ての賦形財についての平均では、酸性薬剤および中性薬剤の固有透過率は増強されているが塩基性薬剤については低下している。赤や黄色などの暖色は、賦形剤の結果としてマップされた特性の増加を示しており、基準レベルは賦形剤なしでの結果として定義されている。青紫（blue violett）などの寒色は、その反対を示している。例えば、設計目標が透過率の増強である場合、透過率マップの左上隅が透過率増加について最も有望な分子と賦形剤との組み合わせを示しており、マップの右下隅が最も問題のあるであろう領域を表している。
【００９９】
図６の膜残留率のマップは、図５の透過率マップとある程度重複している。単純化されたフィックの拡散法則のみが輸送に関与しているのであれば、２つのマップは原理的には同一となるはずである。しかしながら、２つのマップの間にはわずかな（suble）違いがあることが分かる。残留率が著しく増加した場合、分析で検出される化合物があまりに少なくなるというのが、この効果を説明する一つの考えである。本明細書で考慮するケースでは、それが問題となるものはない。レシーバ区画においてＤｏｕｂｌｅ−Ｓｉｎｋ捕捉剤が存在しないことにより、膜残留率のマップがＰＡＭＰＡ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ装置で使用されるＵＶ検出法に対する解析上の克服出来ない問題を示しているように思われる。
【０１００】
図７のＡＢＬマップは、大まかには、図５および図６の他の二つのマップのミラーイメージである。ｈＡＢＬの比率の上昇は、水層におけるより遅い拡散と膜残留率の減少とに繋がる高い薬剤−賦形剤相互作用を意味するものと解釈されうる。ＡＢＬマップについての予想外の解釈としては、一部の薬剤は賦形剤を含まない溶液中でアグリゲートを形成するが（上記参照）、特定の賦形剤存在下では、該薬剤が自己結合する傾向は減少するということがありうる。これは、例えばマップ上で濃いブルーの領域で示されているように、ＫＣｌ、０.２４％ ｖ／ｖ ＰＧ、１％ ｖ／ｖ ＮＭＰおよび１％ ＰＥＧ中のグリベングラミド、ブタカインおよびジピリダモールについて事実でありうる。
【０１０１】
導入したカラーマップは新しく、その用途はますます発展していく。マップは、外見上システマティックに見えるが、それは一部には賦形剤と化合物とが最適な方法で順序付けされたためである。多くの分子、そしてもしかしたらより多くの条件および種類の賦形剤の場合には、マップがある種の同様のスキームにより「自己組織化」するインシリコのアルゴリズムが開発されうる。
【０１０２】
本発明の方法の第一の実施形態について適切な溶解度の測定はまた、種々の方法で行うことができる。多くの分子、特に発見プログラム由来の分子は、非常に低い溶解度を有しうるため、溶解度の測定は、迅速であることと化合物を節約することとの両方である必要がある。溶解度に対する賦形剤の効果のスクリーニングが、仕事をさらに厄介なものにしている。それにも関わらず、可溶化剤をシステマティックにスクリーニングする迅速な方法が出てきている。Ｃｈｅｎら（Chen, H. et al., “A high-throughput combinatorial approach for the discovery of a Cremophor EL-free paclitaxel formulation”, Pharm. Res., 2003, 20, 1302 - 1308）は、クレモフォアＥＬを含まない改善されたパクリタキセル（非常に確立された市販薬）製剤を発見するための多くの組み合わせのうち、１２の賦形剤（ＰＥＧ４００、ポリソルベート８０およびエタノールを含む）について約１００００の組み合わせをスクリーニングするための全実施要因ロボットアッセイを使用している。一部実施要因実験計画法（ＤＯＥ）を使用してそのような迅速法の効率と精度との両方を向上させる好機が明らかに存在している。ＤＯＥの方法をロボット制御に直接結びつける市販のソフトウェアが当該技術分野において存在している。また、起こりうるアグリゲート化の効果に対して溶解度のデータを適切に処理する計算法を自動化する好機も存在している。
【０１０３】
本明細書に記載する例示的な溶解度−賦形剤測定においては、ＰＡＭＰＡマッピングの方法が導入されるＤｏｕｂｌｅ−Ｓｉｎｋ ＰＡＭＰＡ賦形剤で研究される主題は、６つの賦形剤（タウロコール酸ナトリウム、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、１−メチル−２−ピロリドンおよびポリエチレングリコール４００）の１５の組み合わせで測定される８つの難溶性薬剤（アステミゾール、ブタカイン、クロトリマゾール、ジピリダモール、グリセオフルビン、プロゲステロン、グリベンクラミドおよびメフェナム酸（mefenemic acid））に基づいている。
【０１０４】
溶解度測定の上記実施例は、化合物アステミゾール、ブタカイン、クロトリマゾール、ジピリダモール、グリセオフルビン、プロゲステロン、グリベンクラミドおよびメフェナム酸を用いて行う。アッセイするドナー溶液のｐＨは、ｐＩＯＮ社のユニバーサル緩衝液（ＰＮ １００６２１、１１００１５１）で調整する。
【０１０５】
溶解度測定のこの実施例で使用する賦形剤は、臨床的に意義のある条件にある胃腸液で想定される濃度に重なるよう選択されている量の６つの賦形剤を含む。簡潔に述べれば、ＫＣｌは０．１Ｍおよび０．２Ｍに選択し；タウロコール酸ナトリウム（ＮａＴＣ）溶液は、絶食時および摂食時のＧＩＴの状態(３５)に対応して、３ｍＭおよび１５ｍＭにて調製する。液体賦形剤について、最大のカプセル容量はＧＩＴの容積２５０ｍｌ(３５)に対して０.６ｍＬであると仮定し、算出される賦形剤の濃度は０.２４％ ｖ／ｖである。従って、Ｎ−メチルピリリドン（N-methylpyrrilidone）（ＮＭＰ）、プロピレングリコール（ＰＧ）およびポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）については、０.２４％ ｖ／ｖ、１％ ｖ／ｖおよび５％ ｖ／ｖの賦形剤溶液を試験する。ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ‐β‐ＣＤ）（ＭＷ １３９６、溶解度４５０ｍｇ／ｍＬ）などのカプセル化される固体賦形剤については、２７０ｍｇを０．６ｍＬのカプセルに詰める（ＧＩＴ容積中、０．１％ w/v溶液に一致する）ことができるはずである。溶解度測定のこの実施例においては、わずかに高い値０．２４％ ｗ／ｖおよび１％ ｗ／ｖを用いる。賦形剤を含まない緩衝溶液も数に入れて全部で１５の異なる溶液を８種類の薬剤分子と共に溶解度に対する効果について試験する（結果として、１２０の薬剤−賦形剤の組み合わせである）。
【０１０６】
ｐＫａの測定に関して、高精度のｐＫａのデータを、ｐＩＯＮ社のＧｅｍｉｎｉ装置を使用する電位差滴定法により決定するが、該高精度のｐＫａのデータは、Ｇｅｍｉｎｉ装置が水溶液または共溶媒のいずれにおいても、沈殿が一部の滴定の際に存在していたとしてもｐＫａを決定することが可能であることを利用して、メタノール−水溶液中での外挿によって決定する。ｐＨ電極のキャリブレーションをｐＫａの決定と同時に、該装置によってインサイチュで行ったが、それは共溶媒溶液中でｐＫａ＜３またはｐＫａ＞１０である場合に特に重要な特性である。
【０１０７】
ｐＩＯＮ社（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）のμＳＯＬ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ装置に実装されている、高度に自動化された直接ＵＶの９６ウェルマイクロタイタープレートの平衡溶解度法をこの溶解度測定の実施例実施例においては使用し、データは室温（２５±２℃）で集める。サンプルは、典型的には１０〜３０ｍＭのＤＭＳＯ溶液として導入する。ロボット液体ハンドリングシステム（例、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｂｉｏｍｅｋ−ＦＸ ＡＤＭＥＴｏｘ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）でＤＭＳＯストック溶液の３〜１０μＬアリコートを取り出し、ユニバーサル緩衝水溶液に、賦形剤含有緩衝溶液中で最終（最大）サンプル濃度が５０〜２５０μＭになるように混ぜる。残留ＤＭＳＯ濃度を、最終緩衝液中で１.０％（ｖ／ｖ）に保つ。溶液のｐＨを様々に変える（ＮａＯＨ処理したユニバーサル緩衝液）。このことは、アグリゲーションの定数および固有溶解度定数（the aggregation and intrinsic solubility constants）を決定するために必要である（Avdeef A. et al., ”Dissolution - Solubility: pH, Buffer, Salt, Dual-Solid, and Aggregation Effects” in: Testa B. et al., “Comprehensive Medicinal Chemistry II, Vol. 5”, ADME-TOX Approaches: Elsevier: Oxford, UK, 2006）。各溶解度−ｐＨ測定を重複して行い、該装置のソフトウェアによりその結果を平均化する。アッセイに使用する緩衝液は、ロボットシステムにより自動的に調製される。緩衝液およびｐＨ電極のクオリティコントロールは、Ａｖｄｅｅｆ−Ｂｕｃｈｅｒ（Avdeef, A. et al., “Accurate measurements of the concentration of hydrogen ions with a glass electrode: calibrations using the Prideaux and other universal buffer solutions and a computer-controlled automatic titrator”, Anal. Chem., 1978, 50, 2137-2142）の方法を取り入れてアルカリ滴定により行う。１８±１時間後に、薬剤固体の懸濁を含有する緩衝溶液を濾過し（０.２μｍ孔マイクロフィルター）、参照標準で得られたＵＶスペクトル（２３０ｎｍから５００ｎｍ）との比較により、存在する物質の量について上澄み液をアッセイするが、それにはＥｖｏｌｕｔｉｏｎ装置に付随する特許された分光学的方法を用いる。
【０１０８】
図８のケース１ａ、１ｂ、２ａおよび２ｂに関して、化合物が水溶液中でダイマーまたはより高次のオリゴマーを形成する場合には、溶解度特性−ｐＨプロファイルは、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ式（図８の実曲線参照）によっては予測されない形をとり、また、希釈水溶液または希釈共溶媒溶液中での電位差滴定で決定された場合、真のｐＫａ（例、図８のケース１ａおよび１ｂ）とは異なる見かけのｐＫａをしばしば示すと述べることができる（２９）。アグリゲーションによって引き起こされたlogＳ−ｐＨ曲線の歪曲の６種類のケースを図８は示している。ケース１ａ、１ｂ、２ａおよび２bの導き出し方（derivation）は文献に記載されており、また、根底にある固有溶解度の値を取り出す方法は当該技術分野において公知である。ケース３ａおよび３ａｘの処理は新しく、それらの導き出し方は以下に簡潔に記載されている。溶解度解析におけるこのようなｐＫａシフトに基づいて、フェナゾピリジン（図８のケース２b）、インドメタシン（図８のケース２ａ）、２‐ナフトエ酸（図８のケース２ａ）およびピロキシカム（図８のケース１ａ）について、１.７ｘ１０＋３Ｍ−１から１.８ｘ１０＋５Ｍ−１に及ぶ二量化定数（dimerization constants）を提案する（Avdeef A. et al., “Dissolution - Solubility: pH, Buffer, Salt, Dual-Solid, and Aggregation Effects” in: Testa B. et al., “Comprehensive Medicinal Chemistry II, Vol. 5 ADME-TOX Approaches”, Elsevier: Oxford, UK, 2006）。
【０１０９】
溶解度測定についてのこの実施例の根底にありかつそれを集約している式は、ｐＨ−溶解度の関係性を数学的に記述しており、また、データの内挿、外挿、平滑化および圧縮（compaction）といった現実的な目的のために使用することができる。さらには、ｐＫａシフトの方法は、迅速な警告ツールとして使用することができる。暗に示されているように、該方法が機能するためには、分子は、利用されうるｐＨ範囲内で電離基を持たなければならない。logＳ対ｐＨのプロットが調べられ、また、真のｐＫａが独自に知られている場合には、アグリゲートが存在するかどうかについて、および、これらの「異常な」効果が中性型または荷電型の薬剤に起因しているのかどうかについて、迅速に推定することができる。その上、固有溶解度は、ｐＫａシフトの大きさまたは方向から計算することができる。これらが、シフトの方法の最良の使いみちである。しかしながら、測定データを機械的に拡大解釈しないよう注意が必要である。非荷電分子が何らかのスペシエーションの異常（アグリゲート化、ＤＭＳＯの結合、フィルター残留など）を被る場合には、弱酸は真のｐＫａよりも高い見かけのｐＫａを示し（図８のケース１ａ）、弱塩基は真のｐＫａよりも低い見かけのｐＫａを示すであろう（図８のケース１ｂ）。観察されるシフトが上述したものと逆の場合には、（中性化学種よりむしろ）荷電化学種が異常に関与している（図８のケース２ａおよび２ｂ）。異常の正確なメカニズムはあらゆるケースで明らかでないかもしれないが、シフトを見かけの溶解度と組み合わせることにより、固有の（シフトしていない）溶解度Ｓ０がしばしば明らかになる。賦形剤を伴う場合、これには実用的なさらなる重要性がある：賦形剤の存在下で溶解度を測定し、そしてそれと同時に、あたかも加えた賦形剤が異常の原因であったかのようにして、加えた賦形剤の非存在下では明白であったであろう溶解度を評価することが多くの場合に可能である。
【０１１０】
賦形剤存在下における６つのタイプのアグリゲート、（ＨＡ）ｎ、Ｂｎ、Ａｎｎ−、（ＢＨ＋)ｎ、（ＡＨ.Ａ）ｎｎ−および（ＡＨ.Ａ）ｎｎ−を考える。それらの導き出し方は、文献で報告されている流れに従う。これについては、新たな二つの状況に関して以下に簡潔にまとめている。
【０１１１】
第一の状況では、混合の荷電弱酸のアグリゲート（ＡＨ・Ａ）ｎｎ-について考える（図８のケース３ａ）。ケース２ａおよびケース２ｂにおいては、アグリゲート化のオーダーは、１より大きいlogＳ−ｐＨプロットにおける勾配によって明らかとなる（Avdeef A. et al., “Dissolution - Solubility: pH, Buffer, Salt, Dual-Solid, and Aggregation Effects” in: Testa B. et al. “Comprehensive Medicinal Chemistry II”, Vol. 5 ADME-TOX Approaches, Elsevier: Oxford, UK, 2006）。溶解度測定についてのこの実施例では、たとえある種のアグリゲート化が明らかに起こっていても、１に近い勾配がいくつかの場合で決定されている。この事実を説明するもっともらしいモデルが存在する。１：１の比率のＨＡおよびＡ−を含有する、オリゴマー混合の荷電弱酸化学種（ＡＨ・Ａ）ｎｎ−が生じるということを仮定することができる。マスバランスの問題を完全に定義するために必要な平衡の式および関連する濃度の商は、
【０１１２】
【数１４】
【０１１３】
【数１５】
【０１１４】
【数１６】
【０１１５】
である。
【０１１６】
溶解度は、
【０１１７】
【数１７】
【０１１８】
で定義される。
【０１１９】
式（１７）の[Ａ−]および[（ＡＨ・Ａ）ｎｎ−]成分は、[ＨＡ]、ｐＨおよび種々の平衡定数の観点から：
【０１２０】
【数１８】
【０１２１】
と拡張することができる。
対数で表した一般形は、
【０１２２】
【数１９】
【０１２３】
である。
【０１２４】
式（１９）の限定的な２つの形は、
【０１２５】
【数２０】
【０１２６】
【数２１】
【０１２７】
として示すことができる。
【０１２８】
混合の荷電アグリゲートの形成により、低ｐＨの溶液における固有溶解度の値は不明瞭にならないことを式（２０）は示している（図８のケース３ａ）。飽和溶液中での見かけのｐＫａが真のｐＫａよりも小さい弱酸についてであれば、ｐＨ>>ｐＫａに対してlogＳ対ｐＨのプロットの勾配が＋１であることは、ダイマー化学種ＡＨ・Ａ−の形成と矛盾しない。しかしながら、＋２の勾配は、ケース２ａのダイマーまたはケース３ａのテトラマーを示しているということもありうるが、それを見分けるのは困難でありうる。
【０１２９】
第二の状況では、賦形剤存在下での混合の荷電アグリゲート（ＡＨ・Ａ）ｎｎ−について考える（図８のケース３ａｘ）。ケース３ａにおいては、logＳ−ｐＨプロットの勾配は、１より小さくはなりえない。勾配が１より小さいことが観察された場合には、計算モデルに対するさらなる修正が必要であった。弱酸ＨＡの中性型のみに結合する賦形剤Ｘの存在下では、オリゴマー混合の荷電弱酸化学種（ＡＨ・Ａ）ｎｎ−が生じると仮定することができる。式１および式２に加えて、
【０１３０】
【数２２】
【０１３１】
が必要である。
【０１３２】
平衡定数
には、式（２２）の反応の平衡定数と、実際的には一定である（即ち、[ＨＡ]tｏtａl<<[Ｘ]tｏtａl）と仮定される賦形剤の濃度Ｘとの積が組み込まれている。
【０１３３】
溶解度は、
【０１３４】
【数２３】
【０１３５】
で定義される。
【０１３６】
先と同様に、式（２３）における非[ＨＡ]成分は、[ＨＡ]および種々の平衡定数の観点から拡張することができ、一般的な形の式（式（１９））となる：
【０１３７】
【数２４】
【０１３８】
図８におけるケース３ａｘの例は、図中に示す平衡定数に基づいている。前記式の限定的な形を引き出すのは一般には不可能であり、式（２４）におけるｐＨのｎ依存性のため、極端なｐＨでの勾配がなお
でなければならないことを示唆することができるだけである。図８のケース３ａｘの例が示しているように、測定データが高いｐＨにおける曲線の屈曲からのみ得られているならば、勾配は１より小さくなりうるが、より高いｐＨでのデータを利用できるのであれば、当該モデルは＋１の勾配を予測するであろう。
【０１３９】
記載したアグリゲート化のパラメーターの精密化に関しては、μＳＯＬ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ装置で測定された溶解度−ｐＨのデータを、搭載されているソフトウェアで処理し、ｐＩＯＮ社のＥＬＭ（商標） Ｄａtａ Ｍａｎａgｅrに保存する。ＥＬＭに蓄えられた幾つかの異なるアッセイからのデータを、該ソフトウェアによってアグリゲートの存在についてさらにテストする。前記式の一つをＥｖｏｌｕｔｉｏｎソフトウェアは自動的に選択し、それに対してlogＳ−ｐＨのデータを加重非線形回帰法によってフィットさせるが、当該加重非線形回帰法においては、以下の残差関数（residual function）が最小化される：
【０１４０】
【数２５】
【０１４１】
（式中、Ｎは当該モデルにおける溶解度値の測定数であり、logＳicalcは計算されたlogの溶解度であり、ここでlogＳicalcは、精密化されるパラメーター：ｐＫａＡＰＰ（見かけの電離定数）、logＳ０ＡＰＰ（見かけの固有溶解度）、logＳ０（真の固有溶解度 −図８のケース１ａおよび１ｂのみ）、logＫｎ（アグリゲート化の定数）およびｎ（アグリゲート化のオーダー）の関数である）。観察されたlogＳの推定標準偏差σｉは、０.０５（対数単位）と推定した。全体での精密化のクオリティは、「適合度（goodness-of-fit）」
【０１４２】
【数２６】
【０１４３】
（式中、Ｎｐは精密化されるパラメーターの個数である）
によって評価した。
【０１４４】
この溶解度測定の実施例についての全ての精密化された結果を表３にまとめている。ロボット装置により迅速に集められた約１２００の個々のｐＨ−溶解度測定結果が精密化された値の基となっている。
【０１４５】
【表３−１】
【０１４６】
【表３−２】
【０１４７】
【表３−３】
【０１４８】
【表３−４】
【０１４９】
賦形剤なしの条件下でのlogＳ−ｐＨ溶解度プロットを図９に示す。破曲線は、（真のｐＫａを用いた）Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ式から予測される曲線に対応しており、溶解度−ｐＨ依存性をより正確に表している曲線との比較として示されている。点横線は見かけの固有溶解度を示している。実曲線は実際のデータ（黒丸）の最良適合に対応している。今回研究した塩基性薬剤は、カチオン性のアグリゲートを形成する傾向があったが（ケース２ｂ）、ブタカインとジピリダモールは例外であり、それらは、明らかに中性のアグリゲートを形成していた（図８のケース１ｂ）。研究した二つの酸性薬剤は、ほとんどはアニオン性のアグリゲートを形成する（図８のケース２ａまたはケース３ａ）。非イオン性化合物に対して「ｐＫａシフト」の方法を適用するのが不可能であったため、アグリゲートが形成されうる程度についてはこの研究からは分からない。
【０１５０】
図９ｅにおけるグリベンクラミドは、賦形剤なしの結果におけるケース３ａの例であるが、それは、見かけのｐＫａにおける１．６対数単位の負のシフトと、高ｐＨのデータにおける単位勾配とによってアグリゲートが示唆されるためである。即ち、該データは、負に荷電したダイマーＡＨ.Ａ−の形成と一致している。クロトリマゾール（図９ｃ）は、ｎ＝１.４という勾配値によって示唆されるように、Ｂ.ＢＨ＋化学種と(ＢＨ＋)２化学種との組み合わせから成るようである。アステミゾール（図９ａ）は、ダイマー（ｎ＝１．８）の(ＢＨ＋)２化学種から成るようであり、一方メフェナム酸（図９ｆ）は、この型のダイマーおよびトリマーの両者を有する（ｎ＝２.６）。ジピリダモールおよびブタカインはケース１ｂの挙動を示しており、非荷電性のアグリゲートが形成されていることが憶測されるが、該非荷電性のアグリゲートは、ＨＨ式から予測されるであろう値（破曲線）のような、アグリゲートが形成されない場合に予測される値の上に見かけの溶解度を上昇させる。これらの二つの分子はまた、検討したイオン性分子の中で最も溶けやすい。他の場所で指摘されているように（例、Avdeef A. et al., “Dissolution - Solubility: pH, Buffer, Salt, Dual-Solid, and Aggregation Effects”, in: Testa, B. et al., “Comprehensive Medicinal Chemistry II”, Vol. 5, ADME-TOX Approaches, Elsevier: Oxford, UK, 2006）、ケース１ａまたはケース１ｂの依存性が示されている場合には、logＳ−ｐＨのデータからアグリゲート化の程度（ｎ）を評価することは不可能である。
【０１５１】
ここで論じる全ての化合物は、賦形剤を含まない緩衝液には難溶性であることが明らかであり（表３における「なし」の横列）、メフェナム酸がもっとも溶けにくく、２１±５ｎｇ／ｍＬである。ハイスループットのマイクロタイターの方法でこのような低い値を得ることができるというのはかなり驚くべきことかもしれない。１８時間のインキュベーション時間を用いているのは決して「ハイスループット」ではないということすら言われるかもしれない。しかし、該装置の２４時間の負荷サイクルの間に、４個から１０個の９６ウェルプレートを処理することができるということに留意すべきである。方法を全体として非常に高速にしているのは、ロボット測定のこの並列的な特性である。１８時間というインキュベート時間によって、濁度検出の使用に基づく他の高速な方法での動的な値ではなく、薬剤の最も安定な多形での真の平衡溶解度の値を測定結果が示す可能性が増している。
【０１５２】
アステミゾール、クロトリマゾールおよびグリベングラミドの固有溶解度は、０.３〜０.４μｇ／ｍＬと測定されている（表３）。ジピリダモールの固有溶解度は、６.２±１.１μｇ／ｍＬであった。非イオン性化合物グリセオフルビンおよびプロゲステロンは、その他の化合物と比較するとやや溶け、１４〜１７μｇ／ｍＬであった。研究した化合物で最も溶けやすいのはブタカインであり、固有溶解度は４０±６μｇ／ｍＬである。μＳＯＬ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎの方法の感度は低ナノグラムの領域まで達していることがこれらおよびその他の測定（下記）から明らかであり、これは部分的には、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ装置における高度に開発された分光学的データ処理ソフトウェアによって可能となっている。
【０１５３】
図９に対応する図であって、一つの賦形剤濃度（１％、１５ｍＭまたは０.２Ｍ）における、研究したイオン性分子についてlogＳ−ｐＨ曲線の一部を示している図を同様に与えることができる。検討したその他の賦形剤濃度の結果を表２にまとめている。そのような図は、賦形剤なしのプロットでの曲線（図９）に加えて、さらなる「破−点−点」曲線を有しており、該「破−点−点」曲線は、賦形剤なしの場合の実曲線を表している。この基準曲線により、特定の化合物に対する賦形剤の影響の迅速な視覚的評価が可能となる。
【０１５４】
塩化カリウムに関しては、大まかなパターンは、賦形剤なしの場合のパターンに似ている（図９）。ブタカインおよびクロトリマゾールにおいてのみ、見かけの固有溶解度が０.２Ｍ ＫＣｌによって有意に上昇する。アステミゾールは中性ｐＨの溶液中で、より大きなｐＨ依存性を示しているようであり、より高いオーダーのアグリゲートの形成からそれが起こっていると推測される。クロトリマゾールは反対の効果を示すようであり、高塩濃度の存在により、賦形剤なしの溶液で見られるアグリゲートを壊しているようである。クロトリマゾールの０.２Ｍ ＫＣｌにおける挙動は、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ式によってうまく予測される。また、その固有溶解度も、０.３９μｇ／ｍＬから３.３μｇ／ｍＬに上がる。ジピリダモール、グリベングラミドおよびメフェナム酸に対する０.２Ｍ ＫＣｌの効果は最小限であるように思われる。メフェナム酸でのｐＨ＞６．５についての曲線からの点のずれは、塩の形成に起因しているのかもしれない。
【０１５５】
プロピレングリコールに関しては、その効果は、０.２Ｍ ＫＣｌに起因する効果と似ている（図３）。アステミゾールは、固有溶解度のわずかな減少とともに、さらにより高いオーダーのアグリゲート（ｎ＝３.６）を示すようである。アステミゾールでは、固有溶解度は低いｐＨの溶液においてのみ増加するようである。クロトリマゾールの固有溶解度は、０.３９μｇ／ｍＬから２.０μｇ／ｍＬに増大する。
【０１５６】
１−メチル−２−ピロリドンに関しては、先に論じた二つの賦形剤に比べて、アグリゲート化のオーダーがアステミゾールおよびグリベングラミドで減少する。その他の効果は、比較的程度が低い。クロトリマゾールは、ＫＣｌおよびＰＧについてと同様、ＮＭＰで溶解度が高まるようである。メフェナム酸はＮＭＰに対して、固有溶解度のわずかな増加という反応を示す。
【０１５７】
プロピレングリコール４００に関しては、論じた最初の３つの賦形剤が弱い効果を伴っていたのに対し、ＰＥＧ４００では中等度の影響を有している。アステミゾールおよびクロトリマゾールにおけるアグリゲート化の結合定数（アグリゲート化のオーダーではない）は、実曲線がより高いｐＨ値に対して劇的にシフトしていることで示されるように、大きく増大する。メフェナム酸でのアグリゲート化は無くなっているようであり、曲線は古典的なＨＨの挙動を有している。より溶けやすい薬剤ジピリダモールおよびブタカインの見かけの固有溶解度は、先のより弱く作用する３つの賦形剤で示された値をほぼ２倍上回る。
【０１５８】
タウロコール酸ナトリウムに関しては、検討した各薬剤に対する効果のパターンは劇的であり、全てについて溶解度が上昇しているが、特にメフェナム酸の場合においてそうであった（表２）。アステミゾールは、グリベングラミドを除く他の全ての分子同様、古典的なＨＨに従う分子として挙動する。後者の分子は＋０．５のｐＨ依存性を示すが、それは、ケース３ａｘの挙動で最もよく表現されうる。残念なことに、アグリゲート化のモデルをさらに検証するための十分なデータをアルカリ性ｐＨにおいて集めなかった。アグリゲート化しがちな大抵の分子は、どうやらそのｐＨ依存性がＨＨ式により説明されうる非荷電性のモノマーとして、ＮａＴＣミセルに強く結合する。見かけの結合強度の解析は、ケース１ａまたは１ｂの式により説明できる。
【０１５９】
２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンに関して、１％ ＨＰ‐β‐ＣＤは、胆汁酸塩と同様に、アグリゲートを破壊する傾向がある。溶解反応はアグリゲート化のモデルにより表されるが、その結合は複合体形成のものである。アグリゲート化のモデルは、この賦形剤の作用を同様のモデルを伴う他の賦形剤の作用と比較するための、溶解度への効果の分類においてそれでもやはり好都合である。胆汁酸塩とシクロデキストリンの両方とも、研究した薬剤の溶解度の上昇において有意な効果を持つ。両賦形剤ともに、アグリゲートの形成を減少させるようである。グリベングラミドはそれでもなお、溶解度−ｐＨプロットにおいて独特の半ｐＨ勾配（half-pH slope）を有している。
【０１６０】
アステミゾールに関して、表２は、全ての賦形剤の特定の薬剤に対する効果を比較するのに便利な参考資料である。アステミゾールの場合、溶解度は、１％ ＨＰ−β−ＣＤ（賦形剤なしでの値０.２９μｇ／ｍＬが１２μｇ／ｍＬに上昇）によって、そしてまた１５ｍＭ ＮａＴＣによって大いに増大される。アグリゲート化の強度（logＫｎ／ｎ）は、０.２４％および５％のＰＥＧ４００によって最も著しく賦形剤なしの溶液での値を上回って上昇する。１％ ＰＥＧ４００および１％ ＮＭＰでは、それよりわずかに小さい上昇を示す。
【０１６１】
ブタカインに関して、ブタカインは荷電性アグリゲートを形成しないらしいと述べることができる。今回検討した分子の中で最も溶けやすい分子の溶解度は、両濃度のＨＰ‐β‐ＣＤ（表２）だけでなく、０.１Ｍ ＫＣｌ、全濃度のＰＥＧ４００（賦形剤なしの値４０μｇ／ｍＬが１５２μｇ／ｍＬに上昇）、および１５ｍＭ ＮａＴＣによっても最もたやすく上昇する。
【０１６２】
クロトリマゾールに関しては、アステミゾールと同様、クロトリマゾールを伴うアグリゲートは、種々の賦形剤により広い範囲にわたる影響を受ける。アグリゲート化の強度（logＫｎ／ｎ）は、０.２４％および５％のＰＥＧ４００によって著しく上昇する。１５ｍＭ ＮａＴＣおよび１％ ＨＰ−β−ＣＤ（賦形剤なしでの値０.３９μｇ／ｍＬが８５μｇ／ｍＬに上昇）を使用することで、溶解度の最も大きな増加となる。
【０１６３】
ジピリダモールに関しては、ＰＥＧ４００のアグリゲート化強化効果は、ジピリダモールでは、低い賦形剤濃度で見られる。溶解度は、１５ｍＭ ＮａＴＣにより、賦形剤なしでの値６.２μｇ／ｍＬから１５ｍＭ ＮａＴＣで１１０μｇ／ｍＬに上昇する。他の賦形剤は溶解度に対して有意な効果を有する（表２）。
【０１６４】
グリセオフルビンに関しては、グリセオフルビンとプロゲステロンとの両者は非イオン性であるため、「ｐＫａシフト」の方法によりアグリゲート化現象を示すことはできない。溶解度の上昇は、「強い」賦形剤で生じ、賦形剤なしでの値１４μｇ／ｍＬが、１５ｍＭ ＮａＴＣにより５４μｇ／ｍＬに上昇する。グリセオフルビンの溶解度に対する賦形剤の影響は、研究したより溶けにくい他の薬剤の溶解度に対する賦形剤の影響よりも比較的劇的でない。
【０１６５】
プロゲステロンに関して、プロゲステロンは、グリセオフルビンとは対照的に、シクロデキストリンに強く影響される。グリセオフルビンと同様、溶解度の上昇は「強い」賦形剤で起こるが、プロゲステロンでは、賦形剤なしでの値１７μｇ／ｍＬが、１％ ＨＰ−β−ＣＤで１８７μｇ／ｍＬに上昇する。
【０１６６】
グリベングラミドに関しては、グリベングラミドを伴うアグリゲート化の強度は、賦形剤によって、特に１５ｍＭ ＮａＴＣによって増加するのみである。これは「塩析」現象である可能性があり、ＰＥＧ４００で最も頻繁に見られる。これは新たで予想外の観察結果であり、さらなる研究が必要であろう。
【０１６７】
測定した一連の薬剤の中で群を抜いて最も溶けにくいメフェナム酸に関して、溶解度の最も大きな増大は、ＮａＴＣおよびＨＰ−β−ＣＤによってもたらされるが、得られる最大の固有溶解度はそれでもなお比較的低く、３μｇ／ｍＬ未満である。ＮＭＰおよびＰＥＧは、アグリゲート化の強度（logＫｎ／ｎ）を増加させるようである。
【０１６８】
この溶解度測定の実施例の上述した結果をまとめると、示したように賦形剤が難溶性分子の溶解度を上昇させるというのは怪しげなことではないはずである。そのような効果の程度および性質が使用されるロボット装置によって非常に迅速かつ高い信頼性で評価されうるということが、もしかしたら十分理解されていないかもしれない。当該結果を、ＤＭＳＯを含まない振とうフラスコでの方法で得られる結果と比較すると、本研究における全ての溶液中に１％ ＤＭＳＯが存在しているにも関わらず、値は、容認できる正確さであるようである。特定の賦形剤の効果を考慮すると、ＰＥＧ４００が（そしてより少ない程度でＮＭＰが）多くの薬剤のアグリゲート化の強度（logＫｎ／ｎ）を増加させているようであることは、新たな観察結果であるかもしれない。相互作用の性質が完全に分かっているわけではないが、可能性がある以下の効果について考えることは有用であるかもしれない。中等度の強度のＰＥＧ４００は、シクロデキストリンおよびタウロコール酸ナトリウムと比較すると、薬剤を引き付ける十分に競合的な疎水性環境を与えないかもしれない。しかしながら、全溶液中に存在する１％ ＤＭＳＯ、および溶媒和の水の一部が、ＰＥＧ４００分子に引き付けられ、緩衝溶液中の賦形剤に乏しい部分を、薬剤のアグリゲートにより集中させ、薬剤のアグリゲートのより強い自己会合を導く可能性がある。もちろん、「塩析」効果の類推を用いている。
【０１６９】
上記の例示的な透過率測定の結果について対応的に示したように、Ｓ−マッピングと呼ばれるマッピングスキームを図１０に示すが、これは、溶解度に対する賦形剤の効果の視覚的側面を改善し、正確でシステマティックな評価を可能とする。該マップは、この溶解度測定において使用した溶解度の装置に付随しているソフトウェアによって自動的に作成することができる。見かけの固有ｌｏｇ溶解度比率（賦形剤の溶解度を賦形剤なしの基準値で割っている）を図１０にプロットしている。このような「勾配」マップでは溶解度を正規化して、賦形剤なしのベースラインを基準にしてパターンをシフトさせている。１％ ＤＭＳＯが全溶液中に存在するため、勾配マップではＤＭＳＯの影響の一部を取り除くことが望ましい。図１０においては、緑色の値が基準となる（影響されていない）値を表している。暖色（黄色から深い橙色）は溶解度の増大を表しており、寒色（濃い青色）は値の低下を意味している。縦軸には賦形剤の組成があり、平均的な固有溶解度の増大が減っていくようにして順序付けされている。横軸には薬物があり、賦形剤によって有益さが減少していく順番に並んでいる。左上隅は、賦形剤と化合物との「最良」の組み合わせを表している。右下隅は、「最悪」の組み合わせを表している。この溶解度−賦形剤分類勾配マップ（Solubility-Excipient Classification Gradient Map）、あるいは省略してＳ−マッピングを用いれば、最も有望な分子−賦形剤の組み合わせを認識し、次いで優先順位をつけることが非常に効率良くなり、そしてこのようなＳ−マッピングのスキームは、製薬会社が発見最適化計画において直面するような、非常に多くの分子に対して迅速に作成することができる。
【０１７０】
この溶解度測定の実施例において最も有用な三つの賦形剤は、１％ ＨＰ−β−ＣＤ、１５ｍＭ ＮａＴＣ、および０.２４％ ＨＰ−β−ＣＤであると思われる。最も効果がない賦形剤は、０.２４％ ＰＥＧ４００、０.１Ｍ ＫＣｌ、および０.２４％ ＰＧである。図１０からは、クロトリマゾールが、該マップにおいて比較的「暖かい」色の縦方向の軌道を有していることから、全体的に上位にあることが視覚的に明らかである。溶解度は、１％ ＨＰ−β−ＣＤのような強い賦形剤によって増大されるだけでなく、０.２Ｍ ＫＣｌのような中等度および比較的弱い賦形剤によっても上昇する。Ｓ−マッピングに視覚的に示されているように、プロゲステロンおよびグリセオフルビンの溶解度の増大は弱くて似ており、これら二つの分子は、マップの右側に分類されている。プロゲステロンは、マップの最上部においてのみ、いくらかの暖色の効果を示して、グリセオフルビンとわずかに違いを出している。
【０１７１】
本発明の方法の第一の実施形態の、透過率の測定結果および溶解度の測定結果を流束関数に組み込むステップにおいて、上述したようなＰＡＭＰＡ賦形剤測定値と上述したような溶解度−賦形剤測定値とを、新規の順序付けされているバイオファーマシューティクス・クラシフィケーション・グラディエント・マップ（Biopharmaceutics Classification Gradient Map）によりグラフで表されているpＨ依存性の流束関数に論理的に組み込むことを提案する。それにあたって、本発明によるスクリーニングの方法論を示す土台として、８つの難溶性薬剤（アステミゾール、ブタカイン、クロトリマゾール、ジピリダモール、グリセオフルビン、プロゲステロン、グリベンクラミドおよびメフェナム酸（mefenemic acid））を用い、６つの賦形剤（タウロコール酸ナトリウム、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、１−メチル−２−ピロリドンおよびポリエチレングリコール４００）の１５の組み合わせで測定する。さらなる三つの分子（アルベンダゾール（albendazole）、アミオダロン(amiodarone)およびナプロキセン(naproxen)）を２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）を用いて同様に特徴付ける。ＨＰ−β−ＣＤの結果の一部を、利用できるインビボのデータと比較する。また、低溶解度かつ高透過率の薬剤を考えた場合、ｐＨの効果が現実的に反転し（即ち、薬剤がより帯電するｐＨでは、薬剤がより中性であるｐＨでよりも、より大きい吸収流束（absorptive flux）となる）、現在医薬研究において広く受け入れられている古典的なＢｒｏｏｄｉｅのｐＨ分配仮説は破綻しうることが示されている。この現象はｐＨ分配のアンチテーゼ効果（pH Partition Antithesis effect）と呼ばれている。
【０１７２】
透過率測定の結果と溶解度測定の結果とを流束関数に組み込む上記ステップの基礎として、フィックの第一法則における溶解度および透過率に関して、定常状態（即ち、膜内の透過物質の空間的濃度勾配が線形である）のシンク条件（即ち、膜バリアのアクセプター側において、透過物質の濃度がゼロである）では、均質な膜に適用したフィックの第一法則は、
【０１７３】
【数２７】
【０１７４】
（式中、Ｊは透過分子の流束（ｍｏl ｃｍ−２s−１）、Ｄｍは透過物質の膜相での拡散率（ｃｍ２ s−１）、ＰＣＡＰＰは透過物質の、水溶液と膜との間の見かけの（ｐＨ依存的な）分配係数、ＣＤ（ｍｏl ｃｍ−３）は膜のドナー側での透過分子の濃度、ｈ（ｃｍ）は膜の厚さ、Ｐｅ（ｃｍ s−１）は「有効」透過率であって式（３）の三つの輸送パラメーターの積である）と記述できる。ＣＤは、薬剤のドーズ量が溶解度限界を超えている場合（その場合にはＣＤは溶解度に等しい（「飽和」溶液））を除いて、該ドーズ量に等しい。水境界層（ＡＢＬ）の抵抗、アグリゲートの形成、およびその他のそのような厄介な問題などの効果を無視すれば、飽和溶液に適用されたＨＨ式は、
【０１７５】
【数２８】
【０１７６】
（酸性物質に対しては「＋」を用い、塩基性物質に対しては「−」を用いる）となる。Ｐ０およびＳ０は、それぞれｐＨ非依存性の固有透過率および固有溶解度である。薬剤の濃度ＣＤは、溶解度Ｓより小さいか又は等しい。同様に、非荷電化学種の濃度Ｃ０は常に、該化学種の固有溶解度Ｓ０と等しいかまたはそれより小さい。式（２８）によれば、飽和溶液における流束はｐＨ非依存性である。それゆえ、ｐＨ分配仮説が飽和溶液では成り立たないのはもっともなことである。しかしながら、以下に示すように、飽和溶液における流束はｐＨに依存しうるが、必ずしもｐＨ分配仮説によって予測されるものではない。
【０１７７】
図１１には、流束のこの関係を難溶性薬剤であるメフェナム酸について示しているが、それには文献での固有透過率および固有溶解度の値を用いており、また、理想的なＨｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ式が成り立つ（即ち、溶質のダイマーまたはトリマーが形成されない、ＡＢＬの抵抗が起こらない、膜残留がない、など）と仮定している。固有透過率はｐＨに依存しないが（図１１の点線）、流束の式における補助係数Ｃ０はｐＨに依存する（破線）。部分的に飽和している溶液（臨床用量２５０ｍｇでｐＨ＜９）では、イオン性分子についてのlogＣ０対ｐＨのプロットは単純に、飽和状態と完全な溶解状態との間の境界を示している切れ目の地点でつなげられた直線セグメントの組み合わせである。この連結点のｐＨは、計算に使用されるドーズ量に依存し、Ｃ０の最大値は、飽和溶液におけるlogＳ０に等しい（式（２８））。
【０１７８】
logＣ０（破線）は、飽和溶液（logＣ０＝logＳ０）においては横線であり、溶質が完全に溶解するｐＨ領域では−１の勾配で減少することを図１１は示している。臨床ドーズレベルでは、屈曲はｐＨ９にあると計算され、より小さいドーズ量では、屈曲点は、より低いｐＨにおいてである（例、１ｍgのドーズ量に対して、臨界ｐＨは６.５に下がる）。メフェナム酸について５.３μｇ／２５０ｍｌを下回るドーズ量に対してのみ、logＣ０曲線は完全にドーズ量−溶解度限界の下となり、双曲線型となる。図１１には、log流束−ｐＨ曲線を実線で示しており、それはlogＰ０曲線とlogＣ０曲線の合計である。ｐＨ分配仮説が全てのｐＨ範囲で成り立つのは、ドーズ量が＜５.３μｇの場合においてのみ（固体が形成されないため）であることに留意すべきである。ｐＨ分配仮説はより大きなドーズレベルにおいても有効ではあるが、それは、固体が完全に溶解するｐＨを上回る、斜線で規定されている領域（２５０ｍｇのドーズ量ではｐＨ＞９）においてのみである。
【０１７９】
固有の（instrinsic）データの、腸内のｐＨ５.０、ｐｈ６.２およびｐＨ７.４の条件への変換には、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ式よりも複雑な式を用い、上述した透過率測定の結果と上述した溶解度測定の結果とを腸内で意義のある条件に変換するための定数を用いた。溶解度に関して、アグリゲート化によって引き起こされるlogＳ−ｐＨ曲線の歪曲について６種類のケースを上述した。さらに二つの式が導かれるが、表１に全ての溶解度の式をまとめている。これらの式を、ｐＨ５.０、６.２および７.４でのＳを計算するために用いる。
【０１８０】
【表４】
【０１８１】
透過率に関して、有効透過率のｐＨ依存性は、
【０１８２】
【数２９】
【０１８３】
（酸性物質には「＋」を用い、塩基性物質には「−」を用いる）
（式中、ＰＡＢＬは水境界層の透過率である）
と表される。ＡＢＬの厚さｈ（腸内で約４０μｍ）に対して、ＡＢＬの透過率は、
【０１８４】
【数３０】
【０１８５】
（式中、Ｄａｑは溶液中での薬剤の拡散率（ｃｍ２ s−１）であり、Ｄａｑは２５℃では、分子量に基づいた式logＤａｑ＝−４.１５−０.４４８logＭＷ（Avdeef A. et al. “Permeability of Weakly Basic Drugs Predicted with the Double-Sink PAMPA pKafluxMethod. Layer”, Eur. J. Pharm. Sci., 2005, 24, 333-349）で近似できる）から予測することができる。式（２９）および式（３０）は、ｈ＝４０μｍと仮定して、固有透過率をｐＨ５.０、６.２および７.４において有効な値に変換するために用いる。
【０１８６】
透過率測定の結果と溶解度測定の結果とを流束関数に組み込むこの実施例での精密化の結果を、１％ ＨＰ−β−ＣＤのありとなしとで表２にまとめている。使用している残りのデータは、上述した透過率測定の実施例および上述した溶解度測定の実施例から取られている。２４００より多い個々のｐＨ溶解度測定値およびｐＨ透過率測定値が、精密化した固有の値の基礎となっている。表５の例は、シクロデキストリンが、透過率を下げ、溶解度を上げているが、該二つの効果の大きさは等しくはないことを示している。
【０１８７】
【表５】
【０１８８】
ｐＨ５.０、ｐＨ６.２およびｐＨ７.４での透過率測定における賦形剤の勾配に関しては、薬剤と賦形剤との全ての組み合わせに対して、式（３０）を用いて約４０μｍ厚さの層に対応するＡＢＬの透過率を計算に織り込んで、式（２９）を用いて上記固有の値から計算している。ベースラインの透過率の値は、ｐＨ６.２、ＡＢＬの厚さ４０μｍ、賦形剤なし(Ｘ＝０)の条件：Ｐｅ，６.２，４０ｘ＝０で定義した。他の全ての透過率の値を該基準値で割り、比率(Ｐｅ,ｐＨ,４０ｘ／Ｐｅ，６.２，４０ｘ＝０)を得た。特定の賦形剤またはｐＨが透過率を増大させている場合には、計算される該比率は１よりも大きい。賦形剤／ｐＨの組み合わせが透過率を低下させている場合には、計算される該ファクターは１よりも小さい。
【０１８９】
図１２ａに示すＰＡＭＰＡ−賦形剤−ｐＨ分類勾配マップ（PAMPA-Excipient-pH Classification Gradient Map）は、log(Ｐｅ,ｐＨ,４０ｘ／Ｐｅ，６.２，４０ｘ＝０)値の序列化された等高線プロットである。図２ａには、３６０の勾配がプロットされている。ゼロを上回る勾配は透過率の増大を示しており、暖色（橙色、赤色）で表されている。該マップにおけるゼロを下回る勾配は賦形剤／ｐＨでの透過率の低下を示しており、寒色（暗緑色、濃青色）で表されている。このマップにおいては、黄色は、勾配がゼロであるベースラインのレベルを示している。プロットは以下に記載する流束勾配（flux gradient）に基づいて序列化されている。
【０１９０】
図１２ａのＰＡＭＰＡ−賦形剤−ｐＨ分類勾配マップから、ある種の傾向がただちに認識できる。濃青色の「寒い」領域（透過率の低下）は、主に１５ｍＭ ＮａＴＣと関係しており、ｐＨ５のブタカインおよびジピリダモールではほとんどの賦形剤に対してである。「熱い」ゾーン（透過率の増大）は、グリベングラミドおよびメフェナム酸の二つの酸に対しては低ｐＨ溶液について、そしてｐＨ７．４のブタカインに対してである。また、プロゲステロン、グリセオフルビンおよびｐＨ７.４のアステミゾールは、多くの賦形剤に対して「暖かい」。
【０１９１】
ｐＨ５.０、ｐＨ６.２およびｐＨ７.４における微小溶解度測定での勾配に関しては、薬剤と賦形剤との全ての組み合わせについて、表４の式を用いて固有溶解度およびアグリゲート化の定数から計算している。ベースライン値の溶解度は、ｐＨ６.２、賦形剤なし（Ｘ＝０）の条件：Ｓ６.２ｘ＝０で定義した。他の全ての溶解度の値を該基準値で割り、比率(ＳｐＨＸ／Ｓ６.２ｘ＝０)を得る。特定の賦形剤または６．２以外のｐＨが溶解度を増大させている場合には、計算される該比率は１よりも大きい。賦形剤／ｐＨの組み合わせが溶解度を低下させている場合には、計算される該ファクターは１よりも小さい。
【０１９２】
図１２ｂに示す溶解度−賦形剤−ｐＨ分類勾配マップ（Solubility-Excipient-pH Classification Gradient Map）は、log（ＳpHX／Ｓ6.2X=0）値の序列化された等高線プロットである。図１２ｂには、３６０の勾配がプロットされている。ゼロを上回る勾配は溶解度の増大を示しており、暖色（橙色、赤色）で表されている。該マップにおけるゼロを下回る勾配は賦形剤／ｐＨでの溶解度の低下を示しており、寒色（暗緑色、濃青色）で表されている。このマップにおいては、薄緑色は、勾配がゼロに近いベースラインのレベルを示している。プロットは以下に記載する流束勾配に基づいて序列化されている。
【０１９３】
図１２ｂの溶解度−賦形剤−ｐＨ分類勾配マップから、ある種の傾向がただちに認識できる。濃青色の「寒い」帯（溶解度の低下）は、主に低ｐＨのグリベンクラミドおよびメフェナム酸ならびにｐＨ７．４のブタカインおよびアステミゾールと関係している。「熱い」ゾーン（溶解度の増大）は、低ｐＨのクロトリマゾールおよびジピリダモールならびにｐＨ７．４のグリベンクラミドの溶液と関係している。グリセオフルビン、プロゲステロン、ｐＨ７．４のメフェナム酸、ｐＨ５のブタカインおよびアステミゾールは全て、賦形剤で動かされない溶解度の値を示している。１％ ＤＭＳＯが全ての溶液中に存在するため、勾配マップはＤＭＳＯの影響の一部を取り除くことが望ましい。
【０１９４】
さらに、選択した薬剤が非常に低い固有溶解度の値を有するときには（メフェナム酸は２１ｎｇ／ｍＬの固有の値を示す）塩効果が考慮される。しかしながら、分子のｐＫａが５〜７．４の生理的範囲から遠く離れている場合は、表４での式により説明されるｐＨ依存性により、中性ｐＨ領域において溶解度は高い値に上昇しうる（例、表５のアミオダロンおよびナプロキセン）。荷電性のアグリゲートの形成により、ｐＨ依存性はさらに激しくなる。荷電性化学種が現れるとともに溶解度は上昇するが、永続的ではない。いくつかの高い見かけの溶解度値においては、荷電薬剤と溶液中に存在する対イオンの一つとの間で形成される塩の溶解度積を上回り、塩形態の荷電薬剤が沈殿する。使用した最大濃度（１００−２００μＭ）は、上述したように、ｐＨ＞７でのメフェナム酸を例外として、概して塩沈殿のレベルより下である。塩沈殿の開始は、賦形剤なしの場合に見られる固有溶解度値を３桁上回っているという合理的な仮定がなされる。これは「ｓｄｉｆｆ３−４」近似と呼ばれている（Avdeef A., “Absorption and Drug Development - Permeability, Solubility, Charge State, Wiley-Interscience, 2003, pp. 116-246）。これは確実な近似ではないが、溶解性を弱めるであろう塩形成を完全に無視するよりは、これを利用したほうがまだよいというのが実際的な前提にある。
【０１９５】
例えば、ナプロキセンの固有溶解度は、本研究では１８μｇ／ｍＬと測定された。「ｓｄｉｆｆ３−４」近似によれば、計算された溶解度（表１の式）が１８ｍｇ／ｍＬを上回るならば、高ｐＨの溶液において塩沈殿の形成が見られると予測するべきである。ＨＨ式を用いると、ｐＨ７.４における賦形剤なしの溶解度の計算値は２０.９ｍｇ／ｍＬである。表２では、予測される１８ｍｇ／ｍＬの塩限界を上回っていることを示すために、ナプロキセンのｐＨ７.４での値にアスタリスクで印をしている。
【０１９６】
この「ｓｄｉｆｆ３−４」近似を用いると、本研究でのイオン性薬剤の塩限界は、アステミゾールで２８８μｇ／ｍＬ、ブタカインで３９.８ｍｇ／ｍＬ、クロトリマゾールで３８９μｇ／ｍＬ、グリベングラミドで３４７μｇ／ｍＬ、そしてメフェナム酸で２１μｇ／ｍＬである。これらの限界を用いて、アステミゾールは、全ての賦形剤に対してｐＨ５および６.２で、そしてＰＥＧ４００に対してｐＨ７.４で塩沈殿することが予測された。ブタカインは、ｐＨ５で塩沈殿することが予測された。クロトリマゾールは、０.２４％および１．０％のＰＥＧ４００を用いるとｐＨ５で塩析することが予測された。グリベングラミドおよびメフェナム酸は、いくつかの賦形剤に対してｐＨ７.４で塩析することが予測された。また、メフェナム酸は、０.１Ｍ ＫＣｌおよび１％ ＨＰ−β−ＣＤ中、ｐＨ６．２で塩として沈殿することが予測される。
【０１９７】
塩限界を図１２ｂの溶解度−賦形剤−ｐＨ分類勾配マップに組み込んだ。
【０１９８】
図１２ａおよび１２bに見られるように、先行する二つの分類マップは、概して互いに反対になっている。一方で暖色の領域は、他方で寒色の領域と一致する。大まかにいえば、単純なＨＨ式（式（２８））によれば透過率と溶解度のｐＨ依存性は逆の関係であるため、これは予想できることである。図１１の飽和溶液の部分（ｐＨ＜９）では、単純化されたＨＨ式を用いれば、一方の特性での増加は他方の特性での減少により完全に相殺されるため流束はｐＨ非依存性となる。流束に関係する特性である薬剤吸収において最適化をするためには、いずれかの特性を使用するのでは不十分である。透過率および溶解度は、組み合わされた場合に、最適化のニーズに役立ちうるが、これは製薬業界の日常的な実践ではまだほとんど行われていない。（細胞の）透過率の測定は、生物学者によって頻繁に行われている。溶解度の測定は、物理化学者によって頻繁に行われている。二つのグループは別の建物にあることが多く、また、二つの測定は、時として非常に異なる時期に行われる。二組の測定をコヒーレントに統合することは、時として困難な課題である。二つの性質を論理的に統合することに注目した早期試みにより、ＡＰ（Dressman J.B. et al., “Absorption potential: estimating the fraction absorbed for orally administered compounds”, J. Pharm. Sci., 1985, 74, 588-589）関数およびＭＡＤ（Johnson K. et al., “Guidance in the setting of drug particle size specifications to minimize variability in absorption”, Pharm. Res. 1996, 13, 1795-1798; Curatolo W., “Physical chemical properties of oral drug candidates in the discovery and exploratory development settings”, Pharm. Sci. Tech. Today, 1998, 1, 387-393;およびAvdeef A. et al., “HT Solubility and Permeability: MAD-PAMPA Analysis” in: Kramer S.D. et al., “Physicochemical and Biological Profiling in Drug Research”, Wiley-VCH: Weinheim, 2006）関数、ならびにBＣＳ（Amidon G.L. et al., “A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification: the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability”, Pharm. Res., 1995, 12, 413-420;および“Guidance for Industry, Waiver of In Vivo Bioavailability and Bioequivalence Studies for Immediate Release Solid Oral Dosage Forms Based on a Biopharmaceutics Classification System”, FDA, Washington, D.C, USA, August 2000）がもたらされた。吸収の最適化を考慮するための統合関数を本明細書において提案し、それをＢＣＧマッピングと呼ぶ。我々が透過率−賦形剤測定および溶解度−賦形剤測定について提案したように、図１２ｃに示すマッピングスキームを提案するが、それには図１２ｃに示しているもののようなバイオファーマシューティクス・クラシフィケーション・グラディエント・マップを用いている。これらは、流束関数における賦形剤および他のあらゆる効果（ＡＢＬの抵抗、膜残留、アグリゲート化、複合体形成、ｐＨ、およびその他多くのＨＨ緩和効果）の視覚的な側面を改善して、正確で体系的な評価を可能にするよう設計されている。該マップは、上記で使用しているＰＡＭＰＡおよび溶解度装置に付随するｐＩＯＮ社のＥＬＭソフトウェアによって自動的に作成することができる。図１２ｃにプロットしているのは、先行する二つのマップ（式（２９）ならびに図１２ａおよび図１２ｂ）の和である：log(Ｐｅ,ｐＨ,４０ｘ／Ｐｅ，６.２，４０ｘ＝０)＋log(ＳｐＨＸ／Ｓ６.２ｘ＝０)。このような「勾配」マップは、流束の値を正規化して、賦形剤なしの、ｐＨ６．２のベースラインを基準にしてパターンをシフトさせている。図１２ｃにおいて、緑色の値は、基準（ゼロ）の残存（residual）を表している。暖色（黄色から濃い橙色）は流束の増大を表しており、寒色（濃青色）は値の低下を意味している。縦軸には賦形剤成分があり、該三つのｐＨ値での目下の全ての薬剤について考慮して平均的な流束の増大が減っていくようにして順序付けされている。横軸には薬剤があり、賦形剤によって、該三つのｐＨ条件の平均で有益性が減少していく順番に並んでいる。左上隅は、賦形剤と化合物との「最も有益な」組み合わせを表している。右下隅は、「最も有益でない」組み合わせを表している。このＢＣＧマッピングを用いれば、最も有望な分子−賦形剤の組み合わせを認識し、次いで優先順位をつけることが非常に効率良くなり、そしてこのようなマッピングスキームは、製薬会社が発見最適化計画において使用する、非常に多くの分子に対して迅速に得ることができる。直接的な比較をより用意に行えるよう、流束のマップに基づく順序付けは、他の二つのマップに対して適用される。
【０１９９】
本発明の方法の第一の実施形態における最も有用な三つの賦形剤は、０.２４％および１％のＨＰ−β−ＣＤ、ならびに３ｍＭ ＮａＴＣであると思われる。驚くべきことに、１５ｍＭ ＮａＴＣは、透過性を弱める強くて全体的な傾向があり（図１２ａ）、それが溶解度の増加（図１２ｂ）で完全には相殺されないため、最下位である。最も有効でないその他の賦形剤は、０.２４％および１％のＰＥＧ４００、０.１Ｍ ＫＣｌ、ならびに１％ ＰＧである。これらの賦形剤は、図１２ｃにおいて、賦形剤なしの位置（「なし」）よりも下にある。
【０２００】
図１２ｃから、クロトリマゾールは、わずかに酸性の溶液において該マップで比較的「暖かい」色の縦方向の軌道を有しており、全体的に最も高い順位であることが視覚的に明らかである。溶解度は、１％ ＨＰ−β−ＣＤのような強い賦形剤によって増大するだけでなく、０.２Ｍ ＫＣｌのような中等度および比較的弱い賦形剤によっても上昇する。また、賦形剤のうちのいくつかは、透過率の値も上昇させている（図１２ａ）。ＢＣＧマッピングが視覚的に示しているように、グリベングラミド、メフェナム酸、ブタカインおよびアステミゾールでの流束の増大はいくつかのｐＨ条件においては弱く、低い溶解性（図１２ｂの濃青色）が、透過率の増大（図１２ａの橙色）により、完全にではないが部分的に相殺されていることを示している。しかしながら、例えば多くの賦形剤に対するｐＨ７.４でのグリベングラミド、０.２４％ ＰＥＧ４００に対するｐＨ７.４でのメフェナム酸、０.１Ｍ ＫＣｌに対するｐＨ６.２でのメフェナム酸など、多くの暖色の島が存在している。
【０２０１】
ＨＰ−β−ＣＤの効果に関して、シクロデキストリンは、当該セットにおける難溶性薬剤に対して全体的に最も利益をもたらした。本発明の方法の第一の実施形態における三つのさらなる化合物でのＨＰ−β−ＣＤのデータを作成する。図１３に、１１の化合物に対する１％ ＨＰ−β−ＣＤによる正味の流束効果を示している。概して、透過率は賦形剤によって減少し、溶解度は賦形剤によって増加する。しかしながら、二つの効果のバランスは微妙であり、正味の効果をいずれの方向に傾けることもありうる。図１３は、正味の増加および正味の減少についての種々の例を示している。アルベンダゾール（図１３ａ）では賦形剤の結果として目下の三つのｐＨ値において一律に増加しているが、それは主に、溶解度の増加が透過率の減少により完全には相殺されなかったためである。ブタカイン（図１３ｂ）では全てのｐＨ値において減少しているが、それは、１％ ＨＰ−β−ＣＤは生理的ｐＨにおいては溶解度を有意な程度では少しも改善しないために、透過率の減少が補われないからである。同様のことがナプロキセンに対しても明らかである（図１３ｊ）。メフェナム酸は交差的なｐＨ効果の例である。酸性溶液においては、流束は１％ ＨＰ−β−ＣＤにより促進されるが、中性溶液においては、該賦形剤の存在により正味の減少となる。ジピリダモール（図１３ｆ）は、正確に打ち消しあう増加と減少とを示し、流束は該賦形剤によって影響を受けずにとどまる。経口吸収の予想が溶解度のみに基づいていたら、不適切な擬陽性の分類がなされたであろう。あるいは、透過率のみを決定に用いていれば、分類は擬陰性だったであろう。
【０２０２】
アミオダロンの場合は、本研究において、正確な数値を出すのが難しい。固有溶解度は非常に低く、「ｓｄｉｆｆ３−４」近似は、溶解度曲線において比較的低い塩の「上限」を見積もっているが、それは、賦形剤なしのｐＨ７.４を除く全ての条件について同様である（図１３ｂ）。賦形剤による透過率の予測される損失は、正味の流束において十分補われておらず、正味の流束はｐＨの関数として交差のパターンを有している。
【０２０３】
ｐＨ分配アンチテーゼに関して、ｐＨ分配仮説（Shore P.A. et al., “The gastric secretion of drugs: a pH Partition Hypothesis”, J. Pcol. Exp. Therap.” 1957, 119, 361-369）は、メフェナム酸およびグリベングラミドは、酸性ｐＨは該分子が最も帯電しないｐＨであるため、酸性ｐＨにおいて最も良く吸収されるはずであることを示唆している。それとは反対に、クロトリマゾール、ジピリダモール、ブタカインおよびアステミゾールはわずかにアルカリ性の溶液において最も良く吸収されるはずであるが、それは、弱塩基はそのような条件下で最も帯電しないためである。しかしながら、これらの分子について正確に反対の傾向が見られることが図１２を検討すれば即座に示される。これはとりわけ、賦形剤についての競争の勝者であるクロトリマゾールで非常に明白である。臨床用量以下のメフェナム酸に基づく図１４の一連の枠は、本研究の驚くべきそして刺激的な成果に対して新たな光をいくぶん投げかけようとするであろう。
【０２０４】
図１４ａは理想的な状況を表しており、該状況では、伝統的なＨｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ式を適用できるよう、透過率に対するＡＢＬの抵抗、膜による化合物の残留、アグリゲートまたは複合体の形成、ミセル様構造物の形成、塩の沈殿などのような「異常」がないものと想定されている。図１４ａには、２５０ｍｇの臨床用量のメフェナム酸（mefenamic）が示されている。透過率のｐＨ依存性は溶解度のｐＨ依存性の鏡写しとなっており、二つの成分の積である流束において、互いが打ち消しあう。従って、最も単純に見れば、吸収はｐＨに依存しないはずであり、ｐＫａが分かっていることは吸収の予測においてそれほど重要ではないという瑣末ではあるが魅力的な考えに繋がる。流束においてはｐＨ依存性がないため、ｐＨ仮説が破られていることに注目されたい。
【０２０５】
図１４ｂは、同様に非常に理想化された計算を示しているが、これは、１ｍｇのドーズ量という亜臨床レベルでの計算である。先行する場合との相違は、６.５を上回るｐＨで該化合物は完全に溶解しており、溶液中の薬剤濃度が１ｍｇ／２５０ｍＬ（１７μｇ／ｍＬ）の定数となっているということである。沈殿がない場合には、流束の関数はｐＨ依存性となる（図１４ｂ）。ｐＨ＞６.５の領域では、古典的なｐＨ分配仮説が成り立っている。
【０２０６】
図１４ｃおよび１４ｄは、先行する二つの場合と似ているが、一つだけ「異常性」がある：水境界層の抵抗を透過率モデルに加えている。図１４ｃ，ｄにおいて見ることができるように、透過率曲線の頂上は、ＡＢＬ（そのおおよその厚さは、胃腸管で想定される厚さに倣って４０μｍである（Avdeef A. , “Absorption and Drug Development - Permeability, Solubility, Charge State, Wiley-lnterscience, 2003, pp. 116-246））による抵抗度によって押し下げられている。図１４ｃでは、ＡＢＬの効果を加えたことにより、流束の関数は純粋なシグモイド型となっている。ｐＨ依存性がＢｒｏｄｉｅの仮説から予想されるものと反対となっていることは注目に値する。亜臨床用量では（図１４ｄ）、ｐＨ＞６.５に対してはｐＨ分配仮説が成り立つが、このｐＨを下回ると該仮説は転倒する。この効果を本明細書ではｐＨ分配アンチテーゼと呼ぶ。
【０２０７】
図１４ｅおよび図１４ｆでは、アグリゲート化というさらなる「異常性」を持ち込んでいるが、アグリゲート化はメフェナム酸について観察されており、メフェナム酸では、アニオン性のダイマーおよびトリマーが溶解度−ｐＨ曲線を説明するために提案されている（上記参照）。帯電したアグリゲートの効果は、古典的なＢｒｏｄｉｅの仮説を実質的に転倒させる。溶解度はメフェナム酸（mefenamic）が（アニオン性アグリゲートの形成により）帯電する領域で増加するため、ｐＨ＞７の領域では、２５０ｍｇの臨床ドーズレベル未満であっても、ｐＨ分配仮説が順守されている。亜臨床用量の使用（図１４ｆ）はＢｒｏｄｉｅのパターンを、ｐＨ６より下にまで少しだけシフトさせる。
【０２０８】
図１４ｇおよび図１４ｈは、図１４ｅおよび図１４ｆの場合に対して賦形剤（１％ ＨＰ−β−ＣＤ）の効果を加えている。シクロデキストリンはアグリゲートを破壊すると思われるため、アンチＢｒｏｄｉｅ効果は無効化されているようである（図１４ｅおよび図１４ｇ）。亜臨床用量では、古典的なｐＨ分配仮説が、本実施例において初めて完全に現れる。
【０２０９】
イヌで試験され、シクロデキストリンの複合体形成によって有意に増加することが見出されているグリベンクラミドの生物学的利用能、ならびに、ＨＰ−β−ＣＤのありとなしとでマウスで試験され、ＣｍａｘおよびＡＵＣ０−∞は、賦形剤なしの薬剤の懸濁液を伴うよりもシクロデキストリンありで有意に高いことが見出されているアルベンダゾールの経口生物学的利用能が、本発明の方法の第一の実施形態の結果をインビボの生物学的利用能のデータと比較する基準の基礎にある（underly）。二つの薬物動態学的（ＰＫ）研究からのパラメーターを表３にまとめている。
【０２１０】
【表６】
【０２１１】
図１３ａおよび図１３ｇは、アルベンダゾールおよびグリベングラミドについてのｐＨ５‐７.４での流束関数を示している。これらの図は、１％ ＨＰ−β−ＣＤはlog流束値を増加させるが、その効果のｐＨパターンは異なり、グリベングラミドは実質的により複雑なパターンを示すことを示している。アルベンダゾールでは、流束は、ｐＨ５.０、６.２および７.４に対してそれぞれ３.０、３.１および３.１の率で増加しており、増加の平均は３.１の率であることを示している。グリベングラミドでは、対応する流束は、ｐＨ５.０では２０.１、ｐＨ６.２では４.３の率で増加するが、ｐＨ７.４では３の率で減少しており、全体の平均として３.１の増加をもたらしている。表４は、アルベンダゾールおよびグリベングラミドについてのＣｍａｘの増加率が、それぞれ４.３および７.３であることを示している。報告した流束勾配とＰＫ研究で見出された流束勾配とは、好ましく類似しているように思われる。
【０２１２】
本発明の方法の第二の実施形態では、透過率および溶解度を別個の実体として明示的に決定することなく、化合物の吸収ポテンシャルに対する賦形剤の効果をモニターするために透過率の変化と溶解度の変化の両方を組み合わせている。これにより、本発明の方法の第二の実施形態はとりわけ高速になる。当該実施形態は、脂溶性のバリアによって分けられている二つのチャンバーの透過システムのレシーバチャンバーにおいて現れる調査化合物の濃度変化を、ドナーチャンバー中の賦形剤成分（種類および／または濃度）を変化させながらモニターすることを有する。バリアは、人工膜（例、脂溶性溶液に含浸させたフィルター（即ち、ＰＡＭＰＡモデル））、培養内皮細胞（例、ＲＢＥ４）、またはその他の培養細胞モデル（例、Ｃａｃｏ−２、ＭＤＣＫ等）を構成（constitute）しうる。生物学的に意義のある水境界層の厚さおよびｐＨも考慮に入れる。
【０２１３】
本発明の方法の第二の実施形態の図解を図１に示す。化合物を、約１０ｍＭの濃度のＤＭＳＯ溶液として与える。該溶液を、ユニバーサル緩衝水溶液中にさらに希釈し、０.５Ｍ ＮａＯＨでｐＨ５.０、６.２および７.４に調整する。該水溶液中でのバックグラウンドのＤＭＳＯの量は、０.５％ ｖ／ｖである。ほとんどの化合物は水に溶けず、水中では、沈殿が存在する飽和溶液を形成する。計算される緩衝液中の化合物の濃度は約５０μＭであるが、沈殿のため、水媒体中での実際の濃度はそれより低いはずであり、未知である。（濾過していない）飽和溶液を、マグネチックスターラーをあらかじめ入れておいたＰＡＭＰＡサンドイッチのドナー区画に移す。ＰＡＭＰＡフィルタープレート（ＰＡＭＰＡサンドイッチのアクセプター区画）のフィルターをＧＩＴの脂質で覆い、アクセプター・シンク緩衝液（acceptor sink buffer）（ＡＳＢ）で満たす。ＡＳＢは、血流中のタンパク質の結合特性を模倣する界面活性剤混合物（化学シンク）（Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｉｎｋ（商標） ＰＡＭＰＡ）を加えたｐＨ７.４の緩衝水溶液を構成する（constitutes）当該アッセイでは激しい撹拌が用いられ、撹拌速度は約４０μｍの厚さの水境界層（ＡＢＬ）を作り出すよう設定されるが、それは、ＧＩＴにおけるＡＢＬの条件と合致させるためである。ＰＡＭＰＡサンドイッチを集め、磁気撹拌機構が内蔵されている環境制御されたチャンバー中で３０分間インキュベートしておく。次いでサンドイッチを分離し、レシーバウェルをアッセイし、ＵＶ分光光度計でＵＶスペクトルを集める（２３０ｎｍから５００ｎｍ）。このプロセスを図１５の左に図式的に示している。
【０２１４】
次いで、該段取り（setup）を、ドナー溶液が化合物に加えて賦形剤を含有していることのみの相違で繰り返す。図１５の右手側にこれを図式的に示している。
【０２１５】
本発明の方法の第二の実施形態の段取りにおいては、攪拌が重要な役割を果たしていることに留意すべきである。攪拌を行わないと、低溶解性化合物の透過率におけるいかなる変化も、ＡＢＬの抵抗に圧倒されてしまい、そのために検出できない。
【０２１６】
アッセイの最後に、ドナーウェルに賦形剤を含有するＰＡＭＰＡサンドイッチのレシーバ区画由来のＵＶスペクトルの曲線下面積（ＡＵＣ）を、賦形剤なしのＰＡＭＰＡサンドイッチ由来の対応するＡＵＣで割る。得られる比率（賦形剤の効果）は、ドナー区画に加えた賦形剤が吸収特性の改善に役立ったかどうかを示す。
【０２１７】
当該方法は、透過システムとしてＰＡＭＰＡを用いて行われるが、細胞透過モデル（例、Ｃａｃｏ−２、ＭＤＣＫなど）に対して用いることが容易にできる。事実、このアッセイは、インビトロのハイスループットＰＫプレフォーミュレーションの研究に対する初めてのアプローチと考えることができる。実際、インビボのＰＫでは、薬剤の処方を変えて血流中で濃度対時間のプロファイルをモニターすることから、研究者は、最終的な効果に対する溶解度または透過率の個別の影響を直接的には知らず、問題とするのは血流中の活性成分濃度の増加または減少である。
【０２１８】
使用した薬剤および化学物質に関しては、使用した化合物は、アステミゾール、ブタカイン、クロトリマゾール、ジピリダモール、プロゲステロン、グリベンクラミドおよびメフェナム酸（mefenemic acid）である。ｐＩＯＮ社のＤｏｕｂｌｅ−Ｓｉｎｋ（商標）ＰＡＭＰＡ用の脂質（ＰＮ １１００６６９）は、使用しないときには−２０℃で保存する。アッセイされるドナー溶液のｐＨはｐＩＯＮ社のユニバーサル緩衝液（ＰＮ １００６２１、１１００１５１）で調整し、また、血清タンパク質シミュレートするために化学捕捉剤を含有するｐＨ７.４の緩衝溶液をレシーバ溶液として使用する。賦形剤は、ドナーウェルにのみ加える。
【０２１９】
賦形剤の濃度に関しては、デモンストレーションの目的のために、上述した本発明の方法の第一の実施形態からの賦形剤の部分集合を、同じく扱う。４つの賦形剤の量は、臨床的に意義のある条件での胃腸液において想定される濃度と重なるように選択する。ＫＣｌについては、ＦＡＳＳＩＦ／ＦＥＳＳＩＦ培地での濃度に従い、０.２Ｍの濃度を選択する。プロピレングリコール（ＰＧ）、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）およびポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）については、１％ ｖ／ｖの濃度の賦形剤溶液を当該方法のデモンストレーションのために選択する。
【０２２０】
提示した本発明の方法の第二の実施形態の結果として出てくる別々の三つのケースがある。
【０２２１】
ケース１−賦形剤の効果〜１、即ちlog（賦形剤の効果）〜０：この結果は、ドナー区画に賦形剤Ｘが存在するか否かに関わらずレシーバでの濃度が同一であることを意味している。これは、難溶解性化合物にとっては、賦形剤が溶解度を改善しないか、または、化合物の透過率の減少が溶解度の増加を相殺するかのいずれかを意味している。
【０２２２】
ケース２−賦形剤の効果＜１、即ちlog（賦形剤の効果）＜０：この状況は、賦形剤Ｘの存在による溶解度の増加が透過率の損失よりも小さいか、あるいは、化合物が賦形剤ありまたはなしで十分に溶解し、透過率の減少が支配的な効果であるかのいずれかを意味しているかもしれない。ｐＨ５.０のブタカインでの結果がこの状況を示している。ｐＨ５.０の緩衝水溶液でのブタカインの溶解度は５０μｍよりもはるかに大きいことが本発明の方法の第一の実施形態から分かる。それゆえ、ｐＨ５.０でのこの化合物の吸収挙動が透過率に支配されていること、および、ドナー区画における賦形剤の存在によりブタカインの透過率が減少することは、驚くべきことではない。本発明の方法の第二の実施形態により、溶解度定数および透過定数を別個に測定することなく、レシーバ区画での化合物濃度の単純比較（ＵＶ吸収）により、この挙動の検出が可能となる。
【０２２３】
ケース３−賦形剤の効果＞１、即ちlog（賦形剤の効果）＞０：この結果は、最も有望な薬物−賦形剤の組み合わせ結果を示している。この比率が大きければ大きいほど、賦形剤Ｘは研究化合物の吸収特性の改善により効果的である。
【０２２４】
本発明の方法の第二の実施形態は一つの時間点に基づいているが、当業者は、インビボの薬物動態学的研究を模倣していくつかの時間点に対して賦形剤の効果を計算するよう、当該実施形態を容易に調整することができる。
【０２２５】
本発明の方法を上記の例示的な実施形態とともに記載しているとはいえ、本発明の方法の他の代替的実施形態を考えることができる。
【図面の簡単な説明】
【０２２６】
【図１】本発明の方法の第一の実施形態の透過率測定の例のために、ｐＫａ決定方法の比較を示している。
【図２】図１の方法についての種々のメタノール−水混合液において決定した見かけのｐＫａの直線外挿を示している。
【図３】図１の方法の透過率測定の実施例で測定した８つの化合物についての、透過率の対数対ｐＨのプロットを示している。
【図４】賦形剤存在下での固有透過率の対数と、賦形剤非存在下での固有透過率の対数との差異のプロットであって、図１の方法の透過率測定の実施例についての賦形剤の量の関数としての前記プロットについて示している。
【図５】図１の方法の透過率測定の実施例に対する、固有透過率の対数に基づくＰＡＭＰＡマッピングスキームを示している。
【図６】図１の方法の透過率測定の実施例に対する、膜残留率の対数に基づくＰＡＭＰＡマッピングスキームを示している。
【図７】図１の方法の透過率測定の実施例に対する、水境界層の対数に基づくＰＡＭＰＡマッピングスキームを示している。
【図８】図１の方法の溶解度測定の例のために、アグリゲート化反応の６つのケースを示している。
【図９】図１の方法の溶解度測定の実施例において検討された化合物に対する、賦形剤なしでのlogＳ対ｐＨのプロファイルを示している。
【図１０】図１の方法の溶解度測定の実施例の化合物と賦形剤との組み合わせに対する、序列化された溶解度賦形剤分類勾配マップを示している。
【図１１】２５０ｍｇの臨床用量でのメフェナム酸についてのlogＰ０、logＣ０、およびlogＰ０Ｃ０(流束)のｐＨに対するプロットを示しており、図１の方法における、固有濃度に基づくフィックの法則を示している。
【図１２】（ａ）図１の方法でのＰＡＭＰＡ−賦形剤−ｐＨ分類勾配マップ；（ｂ）図１の方法での溶解度−賦形剤−ｐＨ分類勾配マップ；および、（ｃ）図１の方法の化合物と賦形剤との組み合わせについての序列化された生物薬剤学的分類勾配マップを示している。
【図１３】図１の方法について、賦形剤なし（白抜き記号）および１％ ｗ／ｖ ＨＰ−β−ＣＤの存在（塗り潰し記号）の下での、ｐＨ５.０、６.２および７.４における透過率（丸）、溶解度（三角）および流束（四角）のプロットを示している。
【図１４】シミュレートしたメフェナム酸の有効透過率（点曲線）、溶解度（破曲線）および流束（実線）の、ｐＨに対する曲線を示している。
【図１５】本発明の方法の第二の実施形態の実験的段取りの概略図を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低溶解性化合物の予測される吸収特性に対する、賦形剤、ｐＨおよびそれらの組み合わせの効果を評価する方法であって、少なくとも一つの所定のｐＨ値において、低溶解性化合物と賦形剤との組み合わせに対する、流束関数の変化を評価するステップを特徴とする、方法。
【請求項２】
流束関数の変化を評価することが、以下のステップ：
該化合物を含む所定のｐＨ値にあるキャリブレーション・ドナー溶液を作製するステップ；
該化合物および該賦形剤を含む該所定のｐＨ値にあるドナー溶液を作製するステップ；
該化合物および該賦形剤を含まない該所定のｐＨ値にあるレシーバ溶液を作製するステップ；
バリアによって第一レシーバチャンバーから分離されている第一ドナーチャンバー中へキャリブレーション・ドナー溶液を与え、バリアによって第二レシーバチャンバーから分離されている第二ドナーチャンバー中へドナー溶液を与え、かつ、第一レシーバチャンバーおよび第二レシーバチャンバー中へレシーバ溶液を与えるステップ；
上記溶液を、所定の時間インキュベートするステップ；ならびに
第一レシーバチャンバーおよび第二レシーバチャンバーのレシーバ溶液における該化合物のレスポンスを測定するステップ
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
流束関数の変化を評価することが、複数の所定のｐＨ値において、請求項２のステップを繰り返し行うことを有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
流束関数の変化を評価することが、第一レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の該化合物のレスポンスの測定値と、第二レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の該化合物のレスポンスの測定値との比率を決定するステップをさらに有する、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
第一レシーバチャンバーおよび第二レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の該化合物のレスポンスの測定が、レシーバ溶液の分光学的特性の測定を有する、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
バリアが、ヒト組織、動物組織、植物組織、培養細胞モデル、および人工膜から成る群より選ばれる、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
流束関数の変化を評価することが、複数の化合物および複数の賦形剤に対して：
該複数の化合物のそれぞれと該複数の賦形剤のそれぞれとの各組み合わせを含む、該所定のｐＨ値にある複数のドナー溶液を作製すること；
バリアによって複数の第二レシーバチャンバーから分離されている複数の第二ドナーチャンバー中へ該複数のドナー溶液を与え、かつ、該複数の第二レシーバチャンバー中へレシーバ溶液を与えること；並びに、
該複数の第二レシーバチャンバーの該レシーバ溶液中の該化合物のレスポンスを測定すること
によって行われる、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
流束関数の変化を評価することが、以下のステップ：
該化合物を含む所定のｐＨ値にあるキャリブレーション・ドナー溶液を作製するステップ；
該化合物および該賦形剤を含む該所定のｐＨ値にあるドナー溶液を作製するステップ；
キャリブレーション・ドナー溶液中およびドナー溶液中の該化合物の溶解度を測定するステップ；
キャリブレーション・ドナー溶液の透過率およびドナー溶液の透過率を測定するステップ；ならびに、
透過率の測定結果および溶解度の測定結果を流束関数に組み込むステップ
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
流束関数の変化を評価することが、複数の所定のｐＨ値において、請求項８のステップを繰り返し行うことを有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
キャリブレーション・ドナー溶液中およびドナー溶液中の該化合物の溶解度を測定することが、以下のステップ：
上記溶液を所定の時間インキュベートするステップ；
上記溶液を濾過するステップ；および、
濾過溶液中の該化合物の量を測定するステップ
を有する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
キャリブレーション・ドナー溶液の透過率およびドナー溶液の透過率を測定することが、以下のステップ：
該化合物および該賦形剤を含まない該所定のｐＨ値にあるレシーバ溶液を作製するステップ；
膜フィルターによって第一レシーバチャンバーから分離されている第一ドナーチャンバー中にキャリブレーション・ドナー溶液を与え、膜フィルターによって第二レシーバチャンバーから分離されている第二ドナーチャンバー中にドナー溶液を与え、かつ、第一レシーバチャンバーおよび第二レシーバチャンバー中へレシーバ溶液を与えるステップ；
上記溶液を、所定の時間インキュベートするステップ；ならびに、
第一ドナーチャンバーおよび第二ドナーチャンバーのドナー溶液中の該化合物の量ならびに第一レシーバチャンバーおよび第二レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の該化合物の量を測定するステップ
を有する、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
流束関数の変化を評価することが、第一レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の該化合物の量の測定値と、第二レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の該化合物の量の測定値との間の比率を決定するステップをさらに有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
流束関数の変化を評価することが、複数の化合物および複数の賦形剤に対して：
該所定のｐＨ値にある、該複数の化合物のそれぞれと該複数の賦形剤のそれぞれとの各組み合わせの複数のドナー溶液を作製すること；
該ドナー溶液のそれぞれにおける該化合物の溶解度を測定すること；および、
該ドナー溶液のそれぞれの透過率を測定すること
によって行われる、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
レシーバ溶液が少なくとも一つの添加物を含む、請求項２〜７又は請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
添加物が、該化合物に対する高い結合能、低い紫外線吸収性、高い水溶性、および低い蒸気圧の群より選択される少なくとも一つの特性を持つ、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
キャリブレーション・ドナー溶液およびドナー溶液を攪拌するステップを有する、請求項２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
賦形剤、化合物およびｐＨ値に関する比率を順位付けするステップ；および、
順位付けされた比率を可視化するステップ
を有する、請求項４〜７又は１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
比率を順位付けすることが、以下のステップ：
全ての化合物および全てのｐＨ値に対して、各賦形剤についての比率の合計値を計算するステップ；ならびに
比率の合計値を順位付けするステップ
を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
全ての賦形剤および全てのｐＨ値に対して、各化合物についての比率のさらなる合計値を計算するステップ；ならびに
該比率のさらなる合計値を順位付けするステップ
をさらに有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか一項にて定義されたステップを行うために設定されているコンピュータープログラム。
【請求項１】
低溶解性化合物の予測される吸収特性に対する、賦形剤、ｐＨおよびそれらの組み合わせの効果を評価する方法であって、少なくとも一つの所定のｐＨ値において、低溶解性化合物と賦形剤との組み合わせに対する、流束関数の変化を評価するステップを特徴とする、方法。
【請求項２】
流束関数の変化を評価することが、以下のステップ：
該化合物を含む所定のｐＨ値にあるキャリブレーション・ドナー溶液を作製するステップ；
該化合物および該賦形剤を含む該所定のｐＨ値にあるドナー溶液を作製するステップ；
該化合物および該賦形剤を含まない該所定のｐＨ値にあるレシーバ溶液を作製するステップ；
バリアによって第一レシーバチャンバーから分離されている第一ドナーチャンバー中へキャリブレーション・ドナー溶液を与え、バリアによって第二レシーバチャンバーから分離されている第二ドナーチャンバー中へドナー溶液を与え、かつ、第一レシーバチャンバーおよび第二レシーバチャンバー中へレシーバ溶液を与えるステップ；
上記溶液を、所定の時間インキュベートするステップ；ならびに
第一レシーバチャンバーおよび第二レシーバチャンバーのレシーバ溶液における該化合物のレスポンスを測定するステップ
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
流束関数の変化を評価することが、複数の所定のｐＨ値において、請求項２のステップを繰り返し行うことを有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
流束関数の変化を評価することが、第一レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の該化合物のレスポンスの測定値と、第二レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の該化合物のレスポンスの測定値との比率を決定するステップをさらに有する、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
第一レシーバチャンバーおよび第二レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の該化合物のレスポンスの測定が、レシーバ溶液の分光学的特性の測定を有する、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
バリアが、ヒト組織、動物組織、植物組織、培養細胞モデル、および人工膜から成る群より選ばれる、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
流束関数の変化を評価することが、複数の化合物および複数の賦形剤に対して：
該複数の化合物のそれぞれと該複数の賦形剤のそれぞれとの各組み合わせを含む、該所定のｐＨ値にある複数のドナー溶液を作製すること；
バリアによって複数の第二レシーバチャンバーから分離されている複数の第二ドナーチャンバー中へ該複数のドナー溶液を与え、かつ、該複数の第二レシーバチャンバー中へレシーバ溶液を与えること；並びに、
該複数の第二レシーバチャンバーの該レシーバ溶液中の該化合物のレスポンスを測定すること
によって行われる、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
流束関数の変化を評価することが、以下のステップ：
該化合物を含む所定のｐＨ値にあるキャリブレーション・ドナー溶液を作製するステップ；
該化合物および該賦形剤を含む該所定のｐＨ値にあるドナー溶液を作製するステップ；
キャリブレーション・ドナー溶液中およびドナー溶液中の該化合物の溶解度を測定するステップ；
キャリブレーション・ドナー溶液の透過率およびドナー溶液の透過率を測定するステップ；ならびに、
透過率の測定結果および溶解度の測定結果を流束関数に組み込むステップ
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
流束関数の変化を評価することが、複数の所定のｐＨ値において、請求項８のステップを繰り返し行うことを有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
キャリブレーション・ドナー溶液中およびドナー溶液中の該化合物の溶解度を測定することが、以下のステップ：
上記溶液を所定の時間インキュベートするステップ；
上記溶液を濾過するステップ；および、
濾過溶液中の該化合物の量を測定するステップ
を有する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
キャリブレーション・ドナー溶液の透過率およびドナー溶液の透過率を測定することが、以下のステップ：
該化合物および該賦形剤を含まない該所定のｐＨ値にあるレシーバ溶液を作製するステップ；
膜フィルターによって第一レシーバチャンバーから分離されている第一ドナーチャンバー中にキャリブレーション・ドナー溶液を与え、膜フィルターによって第二レシーバチャンバーから分離されている第二ドナーチャンバー中にドナー溶液を与え、かつ、第一レシーバチャンバーおよび第二レシーバチャンバー中へレシーバ溶液を与えるステップ；
上記溶液を、所定の時間インキュベートするステップ；ならびに、
第一ドナーチャンバーおよび第二ドナーチャンバーのドナー溶液中の該化合物の量ならびに第一レシーバチャンバーおよび第二レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の該化合物の量を測定するステップ
を有する、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
流束関数の変化を評価することが、第一レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の該化合物の量の測定値と、第二レシーバチャンバーのレシーバ溶液中の該化合物の量の測定値との間の比率を決定するステップをさらに有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
流束関数の変化を評価することが、複数の化合物および複数の賦形剤に対して：
該所定のｐＨ値にある、該複数の化合物のそれぞれと該複数の賦形剤のそれぞれとの各組み合わせの複数のドナー溶液を作製すること；
該ドナー溶液のそれぞれにおける該化合物の溶解度を測定すること；および、
該ドナー溶液のそれぞれの透過率を測定すること
によって行われる、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
レシーバ溶液が少なくとも一つの添加物を含む、請求項２〜７又は請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
添加物が、該化合物に対する高い結合能、低い紫外線吸収性、高い水溶性、および低い蒸気圧の群より選択される少なくとも一つの特性を持つ、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
キャリブレーション・ドナー溶液およびドナー溶液を攪拌するステップを有する、請求項２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
賦形剤、化合物およびｐＨ値に関する比率を順位付けするステップ；および、
順位付けされた比率を可視化するステップ
を有する、請求項４〜７又は１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
比率を順位付けすることが、以下のステップ：
全ての化合物および全てのｐＨ値に対して、各賦形剤についての比率の合計値を計算するステップ；ならびに
比率の合計値を順位付けするステップ
を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
全ての賦形剤および全てのｐＨ値に対して、各化合物についての比率のさらなる合計値を計算するステップ；ならびに
該比率のさらなる合計値を順位付けするステップ
をさらに有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか一項にて定義されたステップを行うために設定されているコンピュータープログラム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１０】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１０】
【図１２】
【公表番号】特表２００９−５２８５１８（Ｐ２００９−５２８５１８Ａ）
【公表日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５６６２９（Ｐ２００８−５５６６２９）
【出願日】平成１９年２月２７日（２００７．２．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＨ２００７／００００９７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９８６２５
【国際公開日】平成１９年９月７日（２００７．９．７）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【出願人】（５０２２７４０８２）ピオン，インコーポレイテッド (2)
【公表日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２７日（２００７．２．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＨ２００７／００００９７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９８６２５
【国際公開日】平成１９年９月７日（２００７．９．７）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【出願人】（５０２２７４０８２）ピオン，インコーポレイテッド (2)
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