光学イメージング
本発明は、血管新生に関連するレセプターに親和性を有するベクターを光学イメージング用レポーターに結合してなる造影剤を使用して湿性加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）のイメージングを行う方法に関する。本発明はさらに、ＡＭＤの治療効果を監視するためのかかる方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生に関連するレセプターに親和性を有するベクターを光学イメージング用レポーターに結合してなる造影剤を使用して湿性加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）のイメージングを行う方法に関する。本発明はさらに、ＡＭＤの治療効果を監視するためのかかる方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）は、中心視力の進行性喪失を引き起こす網膜の退行変性疾患である。ＡＭＤ発症のリスクは年齢と共に増加し、大抵は６０代及び７０代又はそれ以上の人々が罹患する。ＡＭＤは、６５歳を超える患者では先進世界における法定失明原因の１位であり、４５〜６５歳では糖尿病性網膜症に次いで２位である。
【０００３】
ＡＭＤによる中心視力の喪失は、黄斑部での光受容体の変性で引き起こされる。黄斑部は、微細な視覚的細部を知覚するために役立つ眼底及び網膜の中心部分であり、黄斑部は眼の最高光受容体密度を有している。眼底は眼の後方１／２〜１／３の部分であり、眼の残部と同じ３つの組織層（即ち、（前方から後方に向かって）網膜、脈絡膜及び強膜）を含んでいる。光受容体細胞として知られる網膜中の光感知細胞は、光を電気インパルスに変換し、次いで視神経を介してこれらのインパルスを脳に伝達する。
【０００４】
本文全体を通じて以下の略語が使用される。
ＡＭＤ 加齢黄斑変性症
ＣＣＤ 電荷結合素子
ＣＮＶ 脈絡膜血管新生
ＩＣＧ インドシアニングリーン
ＮＩＲ 近赤外
ＰＤＴ 光力学的療法
ＲＧＤ アルギニン−グリシン−アスパラギン酸
ＲＰＥ 網膜色素上皮
ＳＬＯ 走査レーザー検眼鏡検査
ＶＥＧＦ 血管内皮増殖因子
２つの型のＡＭＤ、即ち乾性及び湿性が存在する。乾性ＡＭＤは、萎縮性、非滲出性又はドルーゼノイド黄斑変性ともいわれる。乾性ＡＭＤでは、網膜廃棄物の蓄積の結果として、ドルーゼンといわれる黄白色の沈着物が網膜色素上皮（ＲＰＥ）とブルーフ膜との間に蓄積する。ドルーゼン沈着物は白色光又は蛍光眼底イメージングで見ることができ、診断のために造影剤は不要である。ドルーゼン沈着物は、ＲＰＥで適正に取り扱われない、光受容体細胞からの廃棄産物からなる。ＲＰＥ細胞は、通常は「門番」として作用し、ブルーフ膜を通して光受容体に栄養素を供給すると共に光受容体から廃棄産物を除去する。黄斑部の内部及び外部で生じるドルーゼン沈着物は、光受容体の正常な機能及び維持を妨げ、これらの細胞の進行変性を引き起こすと考えられる。しかし、ドルーゼン沈着物は視力喪失なしに多年にわたり網膜中に存在することもある。乾性ＡＭＤに原因する視力喪失は、長い年月の経過中に極めて徐々に起こる。
【０００５】
湿性ＡＭＤは脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）及び新血管膜の存在で特徴づけられるが、これはＣＮＶに加えて網膜下血管新生、滲出性変性又は円板状変性ともいわれる。湿性ＡＭＤでは、異常な新血管が脈絡膜から生じ、ブルーフ膜を貫通する。これらの新血管又は「新生」血管がＲＰＥの後方に位置する場合には、いわゆるＩ型又は「潜在型」のＡＭＤが形成される。新血管がＲＰＥの前方に位置する場合には、いわゆるＩＩ型又は「古典型」のＡＭＤが形成される。Ｉ型及びＩＩ型の組合せも生じる。これらの新血管及び増殖性ＲＰＥ応答が「新血管膜」を形成し、これが血液及び体液を網膜下細胞中に漏出させる。新血管膜が漏出を起こす理由は、新生血管の内皮ライニング間の開口が正常血管より広く、高分子物質（血漿及び血液）の溢出を許す。新血管形成過程並びに血液及び体液の漏出は、光受容体細胞を傷つけ、さらに光受容体のＲＰＥ支持を損なう。フルオレセイン及びインドシアニングリーン（ＩＣＧ）を用いる現行のＡＭＤ診断方法は、新生血管の漏出性に依存し、したがってこの形態学的／構造的異常に原因する蛍光の病巣蓄積に依存している。そのため、今日のＡＭＤ診断は、十分な新生血管膜が形成された比較的進んだ段階のＡＭＤについてのみ可能である。今日利用できる診断薬での診断時期が比較的遅いため、湿性ＡＭＤは急速に進行する傾向があり、著しい視力障害を生じる最高度のリスクを伴う。大部分の湿性ＡＭＤ患者では、特にＡＭＤの初期段階において潜在病変が存在している。
【０００６】
ＡＭＤの病理学に関する上記の知識にもかかわらず、ＣＮＶの多くの側面及び機構は十分に理解されていない。
【０００７】
米国では、今日、約１５００万人のＡＭＤ患者がいるが、９０％が乾性型を有しており、１０％が湿性型を有している。将来、米国では毎年２００万人の新患者が生じると推定されている。
【０００８】
一般に、新血管は２つの異なる機構、即ち脈管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）又は血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）で形成され得る。血管新生は既存の血管からの分枝による新血管の形成であり、胚発生及び健常状態での正常な現象として起こると共に、各種疾患過程の一部として起こる。このような過程をもたらす主な刺激は、組織中の細胞への栄養素及び酸素の不十分な供給（低酸素症）であり得る。細胞は多くの血管新生促進因子を分泌することで応答し得るが、しばしば言及されるその一例は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である。これらの因子は、基底膜のタンパク質を分解するタンパク分解酵素並びにこれらの場合によっては有害な酵素の作用を制限する阻害物質の分泌を開始させる。血管新生促進因子の他の顕著な効果は、内皮細胞の移動及び分裂を引き起こすことである。基底膜に付着した内皮細胞は有糸分裂を受けない。付着の喪失及び血管新生促進因子に対するレセプターからの信号の総合効果は、内皮細胞の移動、増殖及び再配列を引き起こし、最終的に新血管の周囲に基底膜を合成することである。
【０００９】
血管新生には、内皮細胞及び周囲の組織に特有のレセプターが関与する。これらの血管新生レセプターには、ＶＥＧＦのような増殖因子レセプター及びインテグリンレセプターがある。免疫組織化学的研究によれば、各種のインテグリン（おそらく最も重要なのはαｖクラス）が血管の先端表面に発現され［Ｃｏｎｆｏｒｔｉ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｌｏｏｄ，８０：３７−４４６］、循環リガンドによる標的化のために利用できる［Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：５４２−５４６］ことが実証された。
【００１０】
インテグリンαｖβ３及びαｖβ５は、血管新生に関連することが知られているレセプターである。αｖβ３インテグリンレセプターのアンタゴニストとリガンドとの相互作用がアポトーシスを誘起して血管増殖を抑制するので、刺激された内皮細胞はこれらのレセプターに頼って血管新生過程の臨界期に生き残るように思われる。
【００１１】
インテグリンは、α及びβサブユニットが細胞膜の脂質二重層を貫通しているヘテロ二量体分子である。αサブユニットはその細胞外連鎖上に４つのＣａ２＋結合ドメインを有し、βサブユニットは若干の細胞外富システインドメインを有している。
【００１２】
細胞接着に関与する多くのリガンド（例えば、フィブロネクチン）は、トリペプチド配列アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）を含んでいる。ＲＧＤ配列は、この配列を有するリガンドと細胞表面上のレセプターとの間の一次認識部位として作用するように思われる。一般に、リガンドとレセプターとの二次相互作用が相互作用の特異性を高めると考えられる。これらの二次相互作用は、リガンド及びレセプターのうちでＲＧＤ配列にすぐ隣接した部分の間又はＲＧＤ配列から遠く離れた部位で起こり得る。
【００１３】
ＲＧＤペプチドは一定範囲のインテグリンレセプターに結合することが知られており、臨床環境で意義のある応用性をもった若干の細胞現象を調整し得る可能性を有する。おそらく、ＲＧＤペプチド及びその模倣体の最も広く研究されている効果は、血小板インテグリンＧｐＩＩｂＩＩＩａを標的とする抗血栓薬としての使用に関するものである。
【００１４】
ＲＧＤ含有ペプチド系造影剤の例は、国際公開第０１／７７１４５号、同第０２／２６７７６号及び同第０３／００６４９１号中に見出される。
【００１５】
場合によっては、湿性ＡＭＤが早期に診断されれば、レーザー手術（光凝固術）で大規模な中心視力喪失を防止できる。この種の手術では、レーザービームが新血管膜の漏出性血管を焼灼する。レーザー手術が有効であるためには、大規模な視力喪失が起こる前に湿性ＡＭＤを診断することが重要である。
【００１６】
湿性ＡＭＤに対する別の治療法は、光力学的療法（ＰＤＴ）である。ＰＤＴは、レーザー治療と組み合わせて感光性薬物（例えば、Ｖｉｓｕｄｙｎｅ（商標）、リポソームＢＰＤ−ＭＡベルテポルフィン）を使用する。静脈内投与した場合、感光性薬物は不活性であり、望まない新血管膜中に蓄積する。所定量の低エネルギーレーザー光を標的ＣＮＶ組織に当てると、それは血管内に含まれる薬物を活性化する。感光性薬物と併用した場合、レーザー光は標的組織中に反応性の高い形態の酸素を生み出し、それが不必要な血管の閉鎖を引き起こす。ＰＤＴ療法は極めて選択的であると共に、低レベルの非熱レーザーエネルギーを用いるこで周囲の網膜組織への損傷を最小限に抑える。操作手順全体は約３０分で完了でき、外来ベースで実施される。通例、新血管は数週間又は数ヶ月間にわたって閉鎖状態に保たれるが、その後には再治療が必要なこともある。したがって、湿性ＡＭＤの診断方法及び該疾患の治療の監視方法に対するニーズが存在している。
【００１７】
既存の湿性ＡＭＤ検出方法は、フルオレセイン及び／又はＩＣＧの静脈内投与中に眼底カメラを用いて行う血管造影法である。両薬剤に関する診断原理は、新生血管からの漏出を引き起こす血管の形態学的／構造的変化の検出であり、ボーラス通過及び全身分布後の十分な組織濃度を得るための比較的高い投与量が要求される。静脈内投与後における短い動脈及び静脈ボーラス期の後、フルオレセインは比較的急速に細胞外体液空間に溢出して分布する。したがって、フルオレセインの投与から２０〜３０秒後には、脈絡膜血管系からの拡散性で支配的な蛍光信号が（解剖学的分解能なしに）認められる。かくして、新生血管は「過剰な」新血管膜によって識別され、局所的に増加した蛍光として存在する。古典型ＡＭＤでのフルオレセインの漏出は（ＲＰＥの前方に位置するので）診断が容易であり、過剰な蛍光及び均一な漏出を有する境界のはっきりした領域を示す。その名前で表されるように、潜在型ＡＭＤはフルオレセインによる診断が難しい。これは、ＲＰＥが励起光及び放出光の両方に対する極めて有効な光学バリヤーとして作用するからである。したがって、場合によっては初期に不規則な蛍光（「スティップリング」）及び後期に不均一な漏出が認められるものの、フルオレセインの使用は潜在型ＡＭＤに関しては信頼できない。フルオレセイン血管造影図の解析は、動静脈通過時間及び平均染料速度のような血流力学的情報を与えることができる。米国特許第６５９９８９１号は、フルオレセイン血管造影法を用いるＰＤＴ方法及びイメージング方法を開示する多くの例の１つである。
【００１８】
ＩＣＧはアルブミンに極めて強く結合し、したがって多少とも血液プールトレーサーのような挙動を示す。ＩＣＧの最大励起及び発光波長はそれぞれ８０６ｎｍ及び８３０ｎｍであり、ＲＰＥによる光の吸収が比較的少ない。ＲＰＥの光吸収は波長に依存し、近赤外域で最小となる。したがって、ＩＣＧは潜在型ＡＭＤの場合に重要な脈絡膜組織及びＲＰＥ層の後方の組織からの血管造影詳細情報を与える。しかし、フルオレセインの場合と同じく、血管の形態学的／構造的変化及び受動的な漏出がＩＣＧに関する診断原理であり、したがってＩＣＧの使用ではかなり進行した病巣新血管膜しか診断できない。米国特許出願公開第２００４／０１５６７８２号は、ＩＣＧを用いてＣＮＶの血管造影画像を得るための方法を開示している。
【００１９】
フルオレセイン血管造影法もＩＣＧ血管造影法も、実質的な量の新血管膜が形成されて視覚障害が始まる前の初期湿性ＡＭＤの検出方法を提供しない。
【００２０】
国際公開第２００４／０３４８８９号は、脈絡膜新血管系に関連する栄養補給血管の光力学的処置のための方法、装置及びシステムを開示しており、またかかる栄養補給血管の検出の必要性を記載している。この治療方法は、標的眼組織の特異的な表面成分に結合する結合リガンドに連結し得る光増感剤の使用を含んでいる。栄養補給血管を検出するためには、通常のフルオレセイン血管造影法及びＩＣＧ血管造影法の使用が示唆されている。
【００２１】
ＡＭＤ用、特に湿性ＡＭＤ及び潜在型脈絡膜血管新生用のさらに特異的な非侵襲的イメージング技術を開発することが臨床上から要望されている。既存の技術は背後にある病理学的変化を診断せず、新血管膜の形成及び量がかなり進行した場合に漏出性の新生血管によって形態学的／構造的変化を確認するのみである。湿性ＡＭＤの予後が比較的不良であるのは、特に現在利用できる方法で得られる診断が比較的遅いことに原因するから、小さくて初期の病変、好ましくは背後にある病理学的変化の性質を診断する能力をもった新しいイメージング方法は、初期段階でのＡＭＤの発症を診断し監視する上で臨床的に有益であろう。かかるイメージング方法はまた、新しい抗血管新生療法を評価する上で中心的な役割を演じるであろう。
【特許文献１】国際公開第０１／７７１４５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／２６７７６号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０３／００６４９１号パンフレット
【特許文献４】米国特許第６５９９８９１号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００４／０１５６７８２号明細書
【特許文献６】国際公開第２００４／０３４８８９号パンフレット
【非特許文献１】Ｃｏｎｆｏｒｔｉ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｌｏｏｄ，８０：３７−４４６．
【非特許文献２】Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：５４２−５４６．
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、血管新生に関連するレセプターに親和性を有するベクターを光学イメージング用レポーターに結合してなる造影剤を使用して湿性ＡＭＤのイメージングを行う方法を提供する。新生血管膜形成の病理学的基礎である血管新生の検出は、既に確立されている病理学の間接的徴候（例えば、漏出）よりも早期の湿性ＡＭＤ診断指標であることが判明している。インビボで血管新生及び湿性ＡＭＤに関連するレセプターの効率的な標的化及びイメージングを行うためには、化学的に頑強で安定な選択的で高親和性のベクターが要求される。上述のような造影剤の使用は、血管新生に特異的に関係する初期病理学的発症についての細胞レセプター情報を提供するので、従来の血管造影法に比べて高い価値を有することが判明している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
第一の態様に従えば、本発明は、血管新生に関連するレセプターに親和性を有するベクターを光学イメージング用レポーターに結合してなる造影剤を使用してヒト又は動物の身体の湿性ＡＭＤのイメージングを行う方法を提供する。
【００２４】
本方法は、好ましくは、ヒト又は動物の身体に造影剤を投与し、眼又は眼の一部に光を照射し、前記造影剤が分布した眼又は眼の一部の画像を形成することを含む光学イメージングにより、ヒト又は動物の身体の眼又は眼の一部の画像を形成することを含んでなる。照射して画像を形成するための眼の好ましい部分は眼底である。かかるイメージング方法は、人間及び動物並びに（例えば、臨床前研究で使用されるような）動物モデルにおける湿性ＡＭＤの検出及び／又は診断に使用できる。
【００２５】
造影剤は、好ましくは静脈内注射でヒト又は動物の身体の血管系に投与される。投与量は、フルオレセイン及びインドシアニングリーン血管造影法のために使用する投与量より少ないと予想される。典型的な投与量は、好ましくは１〜１００ｎｍｏｌ／ｋｇである。
【００２６】
前記方法は、好ましくは、細胞レセプター（好ましくは内皮細胞レセプター、特にインテグリンレセプターαｖβ３及び／又はαｖβ５）による前記造影剤の蓄積を検出することを含んでいる。蓄積とは、造影剤が血管新生に関連するレセプターに結合し、それと会合し、又はそれに取り込まれることを意味する。
【００２７】
湿性ＡＭＤの画像を形成するためには、好ましくは４００〜１３００ｎｍ、さらに好ましくは６００〜８００ｎｍの波長を有する光を眼又は眼の一部に照射する。放出される蛍光の検出で蛍光画像が形成される。したがって、画像の形成はデータの収集を含む検査段階を構成する。造影剤は、好ましくは、ある波長範囲内の光を吸収してそれより長い波長範囲で蛍光を放出する高蛍光性物質である。簡便には、フィルターを用いて発光が励起光から分離され、放出される光の画像が形成される。
【００２８】
さらに別の実施形態では、本方法は、光学イメージングという用語の範囲内に含まれる、紫外線から近赤外線までの電磁スペクトル中の光との相互作用に基づいて画像を形成する光学イメージング技術の使用を含む。本方法で使用するための若干の造影剤は、スペクトルの可視域内で発光し、その場合には画像を形成するために通常の検眼装置が使用できる。一層敏感なタイプの眼底カメラであって定量的な血管造影法を可能にする共焦点走査レーザー検眼鏡（ＳＬＯ）を用いて蛍光画像を記録することもできる。さらに、インビボ共焦点顕微鏡検査も適用できる。最近開発された時間ドメイン及び周波数ドメインイメージング技術も使用でき、これはレポーターの追加特性（例えば、寿命）を利用するものである。好ましくは、造影剤投与後の蛍光の連続写真を捕える特殊眼底カメラが使用される。さらに好ましくは、パルス光源と共に適合した１対のエキサイターフィルター及びバリヤーフィルターを備え、好ましくは毎秒１フレームでの捕獲速度を可能にする鋭敏な光検出装置（カメラ）を備えた特殊眼底カメラが使用される。透過曲線のクロスオーバーを最小にしながらピーク波長の最大透過を可能にするため、狭帯域干渉フィルターを含めることが好ましい。バリヤーフィルターは励起光を効果的に遮断するが、放出される蛍光の固有色は遮断しない。血管造影法用に装備された眼底カメラは、好ましくは、検査の各フレーム上に血管造影連続写真を記録するタイマーを有している。鋭敏な電荷結合素子（ＣＣＤ）及びディジタルイメージング用の計算機システムにより、画像は電子的に捕えられる。
【００２９】
形成される蛍光系列の連続撮影は、最大の診断情報を得るために好ましい。好ましい実施形態では、造影剤の投与前に、カラー眼底写真及び励起光でのモノクロ画像が基線図として撮影される。問題領域の最適評価のためには、様々な時点で画像を撮影することが好ましい。画像形成の初期段階は網膜及び脈絡膜循環のインビボ検査を容易にする一方、画像形成の後期段階は造影剤蓄積の可視化をもたらす。後期段階又は排出段階は、網膜及び脈絡膜の血管系からの造影剤の漸進的な排出を実証する。後期高度蛍光領域の着色は、画像化すべき異常の存在を示唆する。
【００３０】
本方法は、ヒト又は動物の身体の眼における血管新生の画像を形成することによる湿性ＡＭＤの検出及び／又は診断を含んでいる。好ましくは、本方法は、湿性ＡＭＤの検出又は診断のためにヒト又は動物の身体の眼又は眼の一部における血管新生レベルを評価することを含む。形成された新血管（例えば、脈絡膜中の新血管及びブルーフ膜を貫通した新血管）の量又は存在は、本方法の使用で検出される。網膜色素上皮（ＲＰＥ）の前方に位置する新血管（即ち、古典型ＡＭＤ）及びＲＰＥの後方に位置する新血管（即ち、潜在型ＡＭＤ）の両方が検出できる。本発明に係る方法を潜在型ＣＮＶ（即ち、潜在型ＡＭＤ）の検出又は診断のために使用することは好ましい実施形態である。
【００３１】
さらに、本発明の方法を使用することで、病理学的過程に関連する分子レベルの情報を得ることができる。好ましい実施形態では、本イメージング方法は血管新生に特異的に関係する初期病理学的発症についての細胞レセプター情報を提供する。
【００３２】
本発明の方法は、小さな病変の検出を可能にすると共に、実質的な量の新血管膜が形成されて視覚障害が始まる前に、疾患の初期における湿性ＡＭＤの検出を可能にする。
【００３３】
一実施形態では、本発明の方法は疾患進展の追跡調査又は疾患治療の追跡調査を包含する。かくして、本発明は、湿性ＡＭＤを処置するための薬物によるヒト又は動物の身体の治療効果を監視する方法、例えば血管新生抑制剤に対する治療応答を監視する方法を提供する。投与及び検出は、好ましくは、例えば前記薬物による処置前、処置中及び処置後に繰り返して行われる。好ましい実施形態では、イメージング方法は光力学的治療と組み合わせて使用される。本方法は、ＡＭＤ用として可能性のある薬物の治療効果に関する代理終点として初期の非侵襲的イメージングツールを利用することを可能にし、後には臨床治験計画に際して関連する利益をもたらす。
【００３４】
本発明はさらに下記の態様を含むが、これらはいずれも第一の態様に関して開示したものと同じ実施形態を包含している。
【００３５】
本発明の好ましい態様は、血管新生に関連するレセプターに親和性を有するベクターを光学イメージング用レポーターに結合してなる、湿性ＡＭＤの光学イメージングで使用するための造影剤である。かかる使用は、人間及び動物並びに動物モデルにおける湿性ＡＭＤの検出又は診断を含み得ると共に、製薬学的研究の範囲内における新薬の治療効果の監視も可能にする。
【００３６】
さらに別の態様に従えば、本発明は、湿性ＡＭＤのイメージングで使用するためのコントラスト増強組成物の製造のための、血管新生に関連するレセプターに親和性を有するベクターを光学イメージング用レポーターに結合してなる造影剤の使用を提供する。かかるイメージングは、好ましくは、前記コントラスト増強組成物をヒト又は動物の身体に投与し、光学イメージングでヒト又は動物の身体の眼又は眼の一部の画像を形成することを含む。
【００３７】
さらに別の態様に従えば、本発明は、血管新生に関連するレセプターに親和性を有するベクターを光学イメージング用レポーターに結合してなる造影剤を予め投与しておいたヒト又は動物の身体の眼の湿性ＡＭＤの画像を光学イメージングによって形成する方法を提供する。
【００３８】
本発明はまた、光学イメージング用レポーター又はその塩に結合したベクターからなる造影剤の有効量（例えば、インビボイメージングでの画像コントラストを増強するのに有効な量）を１種以上の薬剤学的に許容し得る佐剤、賦形剤又は希釈剤と共に含んでなるコントラスト増強組成物を使用して湿性ＡＭＤのイメージングを行う方法及び使用も提供する。ベクターは、血管新生に関連するレセプターに親和性を有する。
【００３９】
本発明の方法で使用する造影剤又はその生理学的に許容し得る塩は、血管新生に関連するレセプターに親和性を有するベクターを１種以上の光学イメージング用レポーターに結合したものからなる。かかる造影剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプター（ＶＥＧＦＲ−１／Ｆｌｔ−１、ＶＥＧＦＲ−２／Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ−３／Ｆｌｔ−４のサブタイプが存在する）、胎盤増殖因子レセプター及び線維芽細胞増殖因子レセプター、血小板由来内皮細胞増殖因子、アンジオポエチン並びにインテグリンからなる群から選択されるレセプターに親和性を有する。上記のレセプタークラスのいずれかに親和性を有する関連ベクターは、光学イメージング用レポーターに結合した場合、本発明に関して有用であると考えられる。インテグリンに対して親和性を有するベクターを含む造影剤が好ましい。「結合」という用語は、レポーターとベクターとが化学結合によって直接に又はリンカーを介して互いに結合又は連結されていることを意味する。
【００４０】
好ましくは、造影剤のベクターはインテグリンレセプターαｖβ３及び／又はαｖβ５に対して親和性を有する。ベクターは好ましくはペプチドベクターであり、アミノ酸配列Ｘ３−Ｇ−Ｄを含む。その結果、造影剤は、前記ペプチドベクターを好ましくは共有結合で光イメージング用レポーターに連結したものからなることが好ましい。Ｘ３はアルギニン、Ｎ−メチルアルギニン又はアルギニン模倣体を表し、Ｇはグリシンを表し、Ｄはアスパラギン酸を表す。ペプチドベクターは、αｖβ３レセプターのようなインテグリンレセプターに親和性を有する。造影剤は、好ましくは追加のアミノ酸及び任意には他の部分を含むが、Ｘ３−Ｇ−Ｄ配列は、血管新生及びＡＭＤに関連するインテグリン型レセプターへのベクター結合部位として機能するペプチドベクターの結合座である。
【００４１】
血管新生過程を抑制することが証明され、本発明の造影剤用のベクターとして十分な特異性を有すると見なされる他の関連ベクターには、アンジオスタチン、エンドスタチン、バソスタチン、並びに血小板第４因子及び抗トロンビンＩＩＩの開裂生成物のようなペプチドがある。
【００４２】
また、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）トリペプチド配列の小分子非ペプチド模倣体、好ましくはイソキサゾリン、インダゾール、２−ベンズアゼピンＲＧＤ模倣体及び非ペプチドアザカルバ誘導体から導かれるベクターも有用と考えられる。その他の関連ベクターは国際公開第９８／４７５４１号に開示されている。
【００４３】
ＲＧＤの小分子非ペプチド模倣体から導かれるかかるベクターの例を下記に示す。
【００４４】
アザカルバ：
【００４５】
【化１】
キナロン：
【００４６】
【化２】
インダゾール：
【００４７】
【化３】
式中、Ｌは、好ましくは正又は負の電荷を有する１種以上のアミノ酸（例えば、リシン又はシステイン酸）のようなリンカーであるか、或いは複数のエチレングリコール単位からなるスペーサーであるか、或いは共有結合であり、Ｚは光学イメージング用レポーターである。
【００４８】
以下、光学イメージング用レポーターは文字Ｚで表される。Ｚは好ましくは蛍光染料である。レポーターは一定の波長で蛍光を生じると共に、大規模な共役電子系を有する。可視及び近赤外（ＮＩＲ）スペクトル中に放射を生じるレポーターが好ましく、ＮＩＲ発光レポーターが最も好ましい。光学イメージング用レポーターは、好ましくはＲＰＥの光吸収による影響をほとんど受けない。レポーターＺは、好ましくは、シアニン類、メロシアニン類、インドシアニン類、フタロシアニン類、ナフタロシアニン類、トリフェニルメチン類、ポルフィリン類、ピリリウム染料、チアピリリウム染料、スクアリリウム染料、クロコニウム染料、アズレニウム染料、インドアニリン類、ベンゾフェノキサジニウム染料、ベンゾチアフェノチアジニウム染料、アントラキノン類、ナフトキノン類、インダスレン類、フタロイルアクリドン類、トリスフェノキノン類、アゾ染料、分子内及び分子間電荷移動染料及び染料錯体、トロポン類、テトラジン類、ビス（ジチオレン）錯体、ビス（ベンゼンジチオレート）錯体、ヨードアニリン染料並びにビス（Ｓ，Ｏ−ジチオレン）錯体からなる群から選択される。さらに好ましくは、Ｚはフルオレセイン又はフルオレセイン誘導体或いはシアニン染料であり、最も好ましくは、Ｚはシアニン染料である。別のレポーター群は量子ドットである。
【００４９】
シアニン染料（ＣｙＤｙｅ（商標））は、単結合及び多重（好ましくは二重）炭素−炭素結合で交互に結合された奇数の炭素原子を含むと共に、両端にアミノ基を有していてその一方が第四級化されているポリエン連鎖で定義される化合物である。シアニン及び類似のアリール−リンカー−アリール発色団は、任意にはペンダント置換基又は縮合環置換基を有する。シアニン染料及びその合成に関する一般的記載は、米国特許第６０４８９８２号及び同第５２６８４８６号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）中に見出される。シアニン染料は、広範囲の分光特性及び構造変化が利用できるので特に有用である。一定範囲のシアニン染料が公知であって試験されているが、これらは低い毒性を有し、商業的に入手できる（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（旧Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社））。シアニン染料は、良好な水溶性を有する単一の高強度染料群である。これらは、ｐＨ３〜１０の範囲でｐＨ不感性を有し、低い非特異的結合を示し、フルオレセインより高い光安定性を有する。
【００５０】
シアニン染料は、好ましくは、下記の一般式で示されるカルバシアニン類、オキサシアニン類、チアシアニン類及びアザシアニン類からなる群から選択される。
【００５１】
【化４】
これらの構造中では、Ｒ１基は同一の又は異なる基であって、置換又は非置換アルキル基（好ましくはＣ１〜Ｃ６アルキル）であり、エーテル基又は−Ｎ−ＣＯ−Ｎ−基を含み得る。アルキル基は、任意にはカルボキシ基、スルホン酸基、アミン基、アンモニウム基又はエステル基で置換される。Ｒ１基は、例えば−Ｎ−ＣＯ−Ｎ−基又はエーテル基により、ポリエン連鎖の炭素原子のいずれかと架橋を形成し得る。Ｒ２基も同一の又は異なる基であって、置換又は非置換アルキル基である。アルキル基は任意にはカルボキシ基又はスルホン酸基で置換されるが、好ましくは、Ｒ２基はＣ１〜Ｃ６アルキルのような低級アルキル基であり、最も好ましくはメチル基である。任意の芳香族基は点線で示されていて、縮合ベンゾ環及び縮合ナフト環を含む構造の両方を包括している。これらの環は置換又は非置換のものである。これらの環は、スルホン酸基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルキル（スルホアルキル）アミノ基、ビス（スルホアルキル）アミノ基、スルホアルコキシ基、スルホアルキルスルホニル基、アルキル基又は置換アルキル基、或いはスルホアルキルアミノ基で置換され得る。アルキル基は、好ましくは（例えば炭素原子数１〜６の）低級アルキルである。Ｙは水素、ハライド基、アミン基又はスルホニル基から選択され、好ましくは水素である。シアニン染料のポリエン連鎖も、例えば、（スクアレイン染料の場合のように）連鎖中の２つの炭素原子間に−ＣＯ−基を含むことで、或いはアルキル架橋を含むことで、ポリエン連鎖中の２以上の炭素原子間に架橋を形成する１以上の環状化学基を含み得る。これらの架橋は、染料の化学的安定性及び光安定性を高めるために役立ち得る。
【００５２】
式Ｉ〜ＩＶ中で、Ｉは１、２、３又は４の正整数であって、トリメチン、ペンタメチン、ヘプタメチン又はノナメチンシアニン染料を与える。好ましくは、シアニン染料はそれぞれ炭素原子数５〜７の炭素架橋を有するペンタメチン又はヘプタメチン染料である。
【００５３】
式Ｉ〜ＩＶについていえば、好ましい染料では、インドール環又はベンゾインドール環に結合したスルホン酸部分の数は全体として２、１又は０である。少ない数のスルホン酸部分を有する染料は、ＲＧＤペプチドのようなペプチドに結合した場合、低い血漿結合性及びバックグラウンド組織に対する非特異的結合の減少を示す。
【００５４】
好ましい染料は、カルバシアニン類の群から選択される。なお一層好ましいのは、インドール型のカルバシアニン染料である。この種の好ましい染料は下記の式Ｖで例示される。
【００５５】
【化５】
式中、Ｘはスルホン酸部分であるか、或いは存在しない。Ｒ１基は同一の又は異なる基であって、置換又は非置換低級アルキル基（例えば、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル基）である。アルキル基は、例えば、カルボキシ基、スルホン酸基、アミン基、アンモニウム基又は（複素環式エステル基（例えば、ＮＨＳエステル基）のような）エステル基で置換される。Ｒ２基は、例えばカルボキシ基又はスルホン酸基で任意に置換される低級アルキル基（例えばＣ１〜Ｃ６アルキル基、好ましくはメチル基）である。Ｉは１〜３の整数である。
【００５６】
Ｒ１基、Ｒ２基及びＸ基は、シアニン染料をベクターに結合するための可能な結合部位であり、Ｒ１基及びＸ基が好ましい結合部位である。好ましい態様では、一方のＲ１基がベクターに結合されるのに対し、他方のＲ１基は遊離低級アルキル基である。
【００５７】
本発明の方法で使用するための造影剤を製造するために最も好ましい染料は、下記に示すＣｙ５モノＮＨＳエステルビスＳＯ３及びＣＹ７モノＮＨＳエステルビスＳＯ３であり、いずれもベクターと反応し得るＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルで置換されたアルキル基からなるＲ１基を含んでいる。
【００５８】
【化６】
好適なシアニン染料は、好ましくは５００〜９００ｎｍの範囲内、さらに好ましくは６５０〜８５０ｎｍの範囲内の可視又は近赤外域に発光スペクトルを有する。
【００５９】
別法として、レポーターＺはフルオレセイン染料（即ち、フルオレセイン又はフルオレセイン誘導体）からなる。フルオレセインは、可視光中で発光する黄色染料である。フルオレセインは、通例はアルゴンレーザーの４８８ｎｍ線で励起され、発光は５３０ｎｍで捕集される。フルオレセイン及びその誘導体は、比較的高い吸光率、優れた蛍光量子収量及び良好な水溶性を有する。従来の広汎な使用の結果、これらは極めてよく特性決定されており、入手可能性も非常によく、しかも低コストである。
【００６０】
下記の式（ＶＩ）はフルオレセインを示していて、炭素原子の様々な位置に番号が付けられている。
【００６１】
【化７】
フルオレセインの好適な誘導体は、例えば、下記の式ＶＩＩで示される５−カルボキシフルオレセイン及び６−カルボキシフルオレセインである。
【００６２】
【化８】
別の好適なフルオレセイン誘導体は、下記の式ＶＩＩＩのフルオレセインイソチオシアネートである。
【００６３】
【化９】
さらに好ましいのは、本発明の方法で使用するための造影剤の製造に際し、下記の式ＩＸで示されるＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル（フルオレセインＮＨＳエステルという）のようなフルオレセインの活性化カルボキシレート誘導体を使用することである。スクシンイミドエステルは、アミド生成物が非常に安定であるので優れた反応剤である。
【００６４】
【化１０】
好ましくは、フルオレセインは、ベクターの適当なアミノ基とのアミド結合形成でベクターに連結される。式（ＩＸ）のＮＨＳエステルのようなフルオレセインの活性エステルは商業的に入手可能であり（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ製品番号４６１００）、造影剤を合成する場合に特に有用であると考えられる。フルオレセインの好ましい結合部位は５位及び６位である。
【００６５】
ベクターがアミノ酸配列Ｘ３−Ｇ−Ｄを含むペプチドベクターである好ましい態様に関しては、造影剤は、例えばペプチドベクター部分中に１以上の環化架橋を形成することで拘束できる。アミノ酸間にジスルフィド結合又はチオエーテル結合を形成することで単環式ペプチド造影剤が得られる。１つの環化架橋を含むペプチド系造影剤は、αｖβ３に対する特異性が高く、線状ペプチドより好ましい。本発明の造影剤は、好ましくは、造影剤の異なるアミノ酸間に２つの環化架橋を含むベクターを有する。「環化架橋」という用語は、アミノ酸又はアミノ酸及び−(ＣＨ２)ｎ−又は−(ＣＨ２)ｎ−Ｃ６Ｈ４−基と、架橋の導入を可能にする官能基との任意の組合せをいう。ｎは１〜１０の正整数を表す。若干の好ましい例は、ジスルフィド、−(ＣＨ２)４−カルバ架橋のようなジスルフィド模倣体、チオアセタール架橋、チオエーテル架橋（シスタチオン又はランチオニン）、及びエステルやエーテルを含む架橋である。好ましくは、１つの架橋はジスルフィド結合を形成し、第二の架橋はチオエーテル（スルフィド）結合からなる。ペプチドの合成及び環化架橋の導入は、国際公開第０１／７７１４５号及び同第０２／２６７７６号に記載されているようにして実施できる。
【００６６】
さらに別の実施形態では、本方法は下記の式（Ｘａ）で定義される造影剤の使用を含む。
Ａ−Ｚ
（Ｘａ）
式中、Ａは下記の式（Ｘｂ）で定義され、Ｚは任意にはスペーサー基を介してＡのＸ１、Ｘ６又はＸ７の１以上に結合した１以上の光学イメージング用レポーターを表す。かかる造影剤は、さらに２つの環化架橋を含む。
Ｒａ−Ｃ(＝Ｏ)−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｄ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７
（Ｘｂ）
式中、Ｘ３、Ｇ及びＤは前記に定義した通りである。
【００６７】
Ｒａは、Ｘ２、Ｘ４又はＸ６に結合する架橋の一部をなす−(ＣＨ２)ｎ−又は−(ＣＨ２)ｎ−Ｃ６Ｈ４−基（式中、ｎは１〜１０の正整数を表す。）を表す。
【００６８】
Ｘ１は結合或いは１、２、３、４又は５のアミノ酸残基を表していて、１つのアミノ酸残基はスペーサー部分で任意に官能化されており、好ましくは前記アミノ酸残基は酸基又はアミン基のような官能性側鎖を有し、好ましくはアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、ホモリシン、ジアミノアルシル酸及びジアミノプロピオン酸から選択される。
【００６９】
Ｘ２及びＸ４は独立に、ジスルフィド又はチオエーテル結合を形成するシステイン又はホモシステイン残基のような環化架橋を形成し得るアミノ酸残基、或いは環化架橋を形成し得る他のアミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸及びリシン）を表す。好ましくはＸ２及びＸ４はシステイン又はホモシステインの残基を表し、好ましくはＸ２及びＸ４は両者間に或いはＲａ又はＸ６と共に環化架橋を形成する。
【００７０】
Ｘ５は疎水性アミノ酸又はその誘導体を表し、好ましくはチロシン、フェニルアラニン、３−ヨードチロシン又はナフチルアラニン残基、さらに好ましくはフェニルアラニン又は３−ヨードチロシンを表す。
【００７１】
Ｘ６は、環化架橋を形成し得るアミノ酸残基、好ましくはチオール含有アミノ酸残基（好ましくはシステイン又はホモシステイン）を表し、好ましくはＸ６はＲａ、Ｘ２又はＸ４と共に環化架橋を形成する。
【００７２】
Ｘ７はスペーサー又はバイオモディファイアー部分を表すか、或いは存在しない。好ましくは、Ｘ７は単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成ブロックからなり、前記構成ブロックの１〜１０単位を含む。前記バイオモディファイアーは、前記造影剤の薬物動態及び血中クリアランス速度を調整する機能を有する。加えてＸ７は、好ましくはグリシン、リシン、アスパラギン酸又はセリンからなる１〜１０のアミノ酸残基を表し得る。Ｘ７はまた、アミノ酸残基及びＰＥＧ様構造の両方を含むスペーサー又はバイオモディファイアー（好ましくはビスアミノエチルエチレングリコール−グリシンの組合せ）を表し得る。好ましい実施形態では、Ｘ７は、単分散ＰＥＧ様構造からなる単位、即ち下記式（ＸＩ）の１７−アミノ−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸を表す。
【００７３】
【化１１】
式中、ｍは１〜１０の整数であり、Ｃ末端はアミド部分又は酸部分である。バイオモディファイアーＸ７は、造影剤の薬物動態及び血中クリアランス速度を調整することが判明している。バイオモディファイアーは組織（即ち、筋肉、肝臓など）中への造影剤の取込みを減少させることで、バックグラウンド妨害を少なくして一層良好な診断画像を与える。排出は主に腎臓を通して行われるが、これはバイオモディファイアーのさらなる利点を表している。
【００７４】
かくして、本発明の方法で使用するための造影剤は、好ましくは式ＸｂのＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｇ、Ｄ、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６で形成されるアミノ酸配列で定義されるペプチドベクターを含み、このペプチドは血管新生及び湿性ＡＭＤに関連するインテグリンレセプターに親和性を有するベクターをなす。
【００７５】
環化架橋の配置状態に応じ、造影剤は「離散型」、「入れ子型」又は「からみ合い型」の構造を有する。好ましくは、各造影剤中の２つの架橋は、ＲａとＸ６との間及びＸ２とＸ４との間に位置（して入れ子型構造を形成）するか、ＲａとＸ２との間及びＸ４とＸ６との間に位置（して離散型構造を形成）するか、ＲａとＸ４との間及びＸ２とＸ６との間に位置（してからみ合い型構造を形成）する。
【００７６】
好ましい実施形態では、本発明の方法で使用する造影剤は、チオエーテル結合をなす第一の架橋及びジスルフィド結合をなす第二の架橋を含んでいる。
【００７７】
さらに別の実施形態では、本発明の造影剤は下記の式のいずれかで同定される。式ＸＩＩの造影剤の製法は国際公開第０１／７７１４５号に記載されており、式ＸＩＩＩの造影剤の製法は国際公開第０２／２６７７６号に記載されている。
【００７８】
【化１２】
式中、Ｒａ、Ｘ３、Ｇ、Ｄ、Ｘ５及びＸ７は式Ｘｂに関して定義した通りである。
【００７９】
Ｘ'１は酸基又はアミン基のような官能性側鎖を有するアミノ酸残基からなる。かかるアミノ酸は、好ましくはアスパラギン酸、グルタミン酸、ホモリシン、及びリシン又はジアミノプロピオン酸のようなジアミノアルシル酸から選択され、さらに好ましくはアスパラギン酸又はリシンである。
【００８０】
Ｘ'２、Ｘ'４及びＸ'６は、システイン又はホモシステインのような、ジスルフィド又はチオエーテル結合を形成し得るアミノ酸残基を表し、かかるジスルフィド及びチオエーテル結合が示されている。
【００８１】
Ｗ１はスペーサー部分であるか、或いは存在しない。好ましくは、Ｗ１はグルタル酸及び／又はコハク酸及び／又はレポーターをペプチドに結合するポリエチレングリコール系単位から導かれる。他の代表的なスペーサー（Ｗ１）要素には、構造型多糖、貯蔵型多糖、ポリアミノ酸及びそのメチルエステルやエチルエステル、並びにポリペプチド、オリゴ糖及びオリゴヌクレオチドがあり、これらは酵素開裂部位を含んでいてもよいし、含まなくてもよい。スペーサー部分Ｗ１の役割は、かなり巨大なレポーターをペプチド成分のレセプター結合ドメインから遠ざけることにある。
【００８２】
ｈは１又は２の正整数である。
【００８３】
存在するＺ基の１以上は光学イメージング用レポーターを表す。
【００８４】
造影剤は、好ましくはただ１つのＺ基を含む。
【００８５】
Ｚで表されるレポーターは、アミド結合の形成によってＸ'１は、Ｗ１、Ｘ６又はＸ７に結合できる。ＮＨＳエステルのようなレポーターの活性エステルは、造影剤を合成する場合に特に有用であると考えられる。
【００８６】
好ましい態様では、式ＸＩＩ〜ＸＩＶの造影剤又はその生理学的に許容し得る塩は下記の特性を有する。
【００８７】
Ｒａは−(ＣＨ２)−を表す。
【００８８】
さらに、Ｘ'１は酸基又はアミン基のような官能性側鎖を有するアミノ酸残基からなる。かかるアミノ酸は、好ましくはアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、ホモリシン、ジアミノアルシル酸及びジアミノプロピオン酸から選択され、さらに好ましくはアスパラギン酸又はリシンである。
【００８９】
Ｘ'２、Ｘ'４及びＸ'６は、好ましくは、独立にシステイン又はホモシステイン残基を表す。
【００９０】
Ｘ３は、好ましくはアルギニンを表す。
【００９１】
Ｘ５は、好ましくはチロシン、フェニルアラニン、３−ヨードチロシン又はナフチルアラニン、さらに好ましくはフェニルアラニン又は３−ヨードチロシンを表す。
【００９２】
Ｘ７及びＷ１は式ＸＩに関して定義した通りである。好ましくは、Ｘ７は単分散ＰＥＧ構成ブロックの１〜１０単位からなるか、或いは存在せず、Ｗ１は好ましくは存在しない。
【００９３】
Ｚは、造影剤が１以上の光学イメージング用レポーターを含むことを条件にして、光学イメージング用レポーターを表すか、或いは存在しない。
【００９４】
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法で使用する造影剤は式ＸＩＩ（入れ子型）のもの又はその生理学的に許容し得る塩であって、上記の特性を有する。
【００９５】
式Ｘａで定義されるアミノ酸残基のいずれもが、好ましくは天然に存在するアミノ酸を表す。大抵の場合、ペプチドベクター中のアミノ酸はすべてＬ形であることが好ましい。しかし、本発明の若干の実施形態では、ペプチド中のアミノ酸の１つ、２つ、３つ又はそれ以上が好ましくはＤ形である。かかるＤ形アミノ酸の含有は、造影剤の血清に対して顕著な効果を及ぼし得る。
【００９６】
本発明の方法で使用される若干の造影剤は、高親和性ＲＧＤ型ベクターを含んでいる。本明細書中で使用する「高親和性ＲＧＤ型ベクター」という用語は、αｖβ３インテグリンに関する競合的結合測定法で＜１０ｎＭ好ましくは＜５ｎＭのＫｉを有する造影剤をいう。この場合、Ｋｉ値は公知の高親和性リガンドであるエキスタチンとの競合で測定した。かかる競合測定を実施するための方法は当技術分野で公知である。
【００９７】
本発明の方法で使用するための式Ｘａの造影剤の若干の例を下記に示す。
【００９８】
造影剤Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれ１、２又は４のスルホン酸基を有するペンタメチンカルバシアニンをＲＧＤ含有ペプチド（Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ）に結合したものからなる。造影剤Ａ及びＢはＣｙ５染料を含む一方、造影剤ＣはＣｙ５．５染料を含んでいる。
【００９９】
造影剤Ａ：
【０１００】
【化１３】
造影剤Ｂ：
【０１０１】
【化１４】
造影剤Ｃ：
【０１０２】
【化１５】
造影剤Ｄ：
下記に示すようなＡｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−ＣｙｓペプチドからなるペプチドベクターＤは、アスパラギン酸（Ｘ１）をアミノ官能化シアニン染料に結合するか、或いはシアニン染料のＮＨＳエステルをＸ７に位置するアミノ−ＰＥＧと反応させることで、シアニン染料（例えば、Ｃｙ７）のような光学イメージング用レポーターに結合できる。
【０１０３】
【化１６】
造影剤Ｅ：
造影剤Ｅは、ＲＧＤ型ペプチド（Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ）を２つのシアニン染料基（Ｃｙ５．５）に結合したものからなる。
【０１０４】
【化１７】
造影剤Ｆ：
造影剤Ｆは、ＲＧＤ型ペプチド（Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）をＣｙ５に結合したものからなる。
【０１０５】
【化１８】
造影剤Ｇ：単環式ＲＧＤ型ペプチドｃ［−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｃｙ５．５）−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−］
【０１０６】
【化１９】
造影剤Ｈ及びＩは、ＲＧＤ型ペプチド（Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ）を異なる部位でフルオレセインに結合したものからなる。
【０１０７】
造影剤Ｈ：
【０１０８】
【化２０】
造影剤Ｉ：
【０１０９】
【化２１】
造影剤Ｊ：
造影剤Ｊは、ＲＧＤペプチド（Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）をフルオレセインに結合したものからなり、「離散型」構造をなしている。
【０１１０】
【化２２】
造影剤Ｋ：
造影剤Ｋは、ＲＧＤペプチド（Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ）を異なる部位でフルオレセインに結合したものからなり、「からみ合い型」構造をなしている。
【０１１１】
【化２３】
上記造影剤のベクターはすべての公知化学合成方法を用いて合成できるが、特に有用なのは自動ペプチド合成機を用いるＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法である（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６４））。
【０１１２】
ベクターへのレポーター（例えば、染料の活性エステル）の連結も自動的に実施してペプチドとレポーターとの間にアミド結合を生み出すことができ、或いは実施例１及び２に記載するようにしてレポーターをペプチドベクターに結合することができる。ペプチドベクター及びペプチド造影剤は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製でき、イン・ビトロスクリーンでの試験前に質量分析法及び分析ＨＰＬＣで特性決定することができる。
【実施例】
【０１１３】
次に、以下の非限定的な実施例によって本発明をさらに例証する。
【０１１４】
図１及び２は実施例３に関するものであって、誘発ＣＮＶを有するＬｏｎｇ Ｅｖａｎｓラットの眼の画像を示す。図１は造影剤Ｈを注射したラットの眼の画像であり、図２は陰性対照化合物を注射した眼の画像である。
【０１１５】
略語：
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
Ｆｍｏｃ Ｎ−α−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）
ＨＡＴＵ ２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３− テトラメチルウロニウム
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＬＣ＿ＭＳ 液体クロマトグラフィー質量分析法
ＮＭＭ Ｎ−メチルモルホリン
ｔＢｕ ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
実施例１：Ｃｙｓ２−６：ｃ［ＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ(Ｃｙ５ビス−ＳＯ３)−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−(ＰＥＧ)ｎ−ＮＨ２（ｎ＝１）（造影剤Ｂ）の合成
【０１１６】
【化２４】
標準的な固相ペプチド合成方法を用いて上記のペプチドを組み立てた。クロロアセチル化ペプチドを固体担体から分離し、溶液中で環化することで、まずチオエーテル架橋を形成し、次いでジスルフィド架橋を形成した。ＤＭＦ（２ｍｌ）中におけるＣｙ５モノＮＨＳエステルビス−ＳＯ３（７．５ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）の溶液に二環式ペプチド（２４ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を固体として添加し、次いでＮＭＭ（０．０１ｍｌ、０．０９ｍｍｏｌ）を添加した。光を避けながら、反応を１晩進行させた。ＤＭＦを減圧下で蒸発させ、粗生成物を逆相分取用クロマトグラフィー（Ｖｙｄａｃ Ｃ１８カラム，２１８ＴＰ１０２２；溶媒，Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ；勾配，６０分間で１０〜３０％Ｂ；流量，１０ｍｌ／分；２５４ｎｍで検出）で精製することで、６．６ｍｇの純生成物（分析用ＨＰＬＣ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８カラム，００Ｇ−４２５２−Ｅ０；溶媒，Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ；勾配，２０分間で１５〜３５％Ｂ；流量，１．０ｍｌ／分；保持時間，１９．５分；２１４ｎｍ及び２５４ｎｍで検出）を得た。質量分析法を用いて追加の特性決定を行うことで、９４９．１［ＭＨ２＋］のｍ／ｚ値を得た。
【０１１７】
実施例２：ジスルフィド［Ｃｙｓ２−６］チオエーテルシクロ［ＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ(フルオレセイン)−Ｃｙｓ２−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−ＰＥＧ−ＮＨ２（ｎ＝１）（造影剤Ｈ）の合成
２ａ）１７−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸の合成
【０１１８】
【化２５】
Ｆｍｏｃ化学を用いてこの構成ブロックを固相に結合した。この構成ブロックの結合形を簡単にＰＥＧという。
【０１１９】
１，１１−ジアジド−３，６，９−トリオキサウンデカン
乾燥ＴＨＦ（１００ｍｌ）中における乾燥テトラエチレングリコール（１９．４ｇ、０．１００ｍｏｌ）及びメタンスルホニルクロリド（２５．２ｇ、０．２２０ｍｏｌ）の溶液をアルゴン下に保ち、氷／水浴中で０℃に冷却した。フラスコに、乾燥ＴＨＦ（２５ｍｌ）中におけるトリエチルアミン（２２．６ｇ、０．２２０ｍｏｌ）の溶液を４５分かけて滴下した。１時間後、冷却浴を取り除き、撹拌を４時間続けた。水（６０ｍｌ）を添加した。混合物に炭酸水素ナトリウム（６ｇ、ｐＨ８）及びアジ化ナトリウム（１４．３ｇ、０．２２０ｍｏｌ）をこの順序で添加した。ＴＨＦを留去し、水溶液を２４時間還流した（２つの層が生じた）。混合物を冷却し、エーテル（１００ｍｌ）を添加した。水性相を塩化ナトリウムで飽和させた。両相を分離し、水性相をエーテル（４×５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相をブライン（２×５０ｍｌ）で洗い、乾燥した（ＭｇＳＯ４）。濾過及び濃縮により、２２．１ｇ（９１％）の黄色油を得た。それ以上の精製なしに生成物を次の段階で使用した。
【０１２０】
１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカナミン
塩酸（２００ｍｌ）中における１，１１−ジアジド−３，６，９−トリオキサウンデカン（２０．８ｇ、０．０８５ｍｏｌ）の懸濁液を機械的に激しく撹拌しながら、エーテル（１５０ｍｌ）中におけるトリフェニルホスフィン（１９．９ｇ、０．０７３ｍｏｌ）の溶液を室温で３時間かけて添加した。反応混合物をさらに２４時間撹拌した。両相を分離し、水性相をジクロロメタン（３×４０ｍｌ）で抽出した。水性相を氷／水浴中で冷却し、ｐＨをＫＯＨの添加で約１２に調整した。生成物をジクロロメタン（５×５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相を乾燥した（ＭｇＳＯ４）。濾過及び蒸発により、１４．０ｇ（８８％）の黄色油を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（マトリックス：α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）による分析の結果、予想通り２１９にＭ＋Ｈピークが得られた。１Ｈ（５００ＭＨｚ）及び１３Ｃ（１２５ＭＨｚ）ＮＭＲ分光法を用いた追加の特性決定により、構造が確認された。
【０１２１】
１７−アジド−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸
ジクロロメタン（１００ｍｌ）中における１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカナミン（１０．９ｇ、５０．０ｍｍｏｌ）の溶液に、無水ジグリコール酸（６．３８ｇ、５５．０ｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１晩撹拌した。ＨＰＬＣ分析（カラム，Ｖｙｄａｃ ２１８ＴＰ５４、溶媒，Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ；勾配，２０分間で４〜１６％Ｂ；流量，１．０ｍｌ／分；２１４ｎｍ及び２８４ｎｍでＵＶ検出）は、出発原料が１８．３分の保持時間を有する生成物に完全に転化したことを示した。溶液を濃縮することで定量的収量の黄色シロップを得た。ＬＣ＿ＭＳ（ＥＳイオン化）で生成物を分析したところ、予想通り３３５に[ＭＨ]＋が得られた。１Ｈ（５００ＭＨｚ）及び１３Ｃ（１２５ＭＨｚ）ＮＭＲ分光法の結果は構造に一致していた。それ以上の精製なしに生成物を次の段階で使用した。
【０１２２】
１７−アミノ−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸
Ｈ２（ｇ）−Ｐｄ／Ｃ（１０％）を用いて、水（１００ｍｌ）中における１７−アジド−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸（８．３６ｇ、２５．０ｍｍｏｌ）の溶液を還元した。反応は、ＬＣ−ＭＳ分析が出発原料の完全な転化を示すまで行った（カラム，Ｖｙｄａｃ ２１８ＴＰ５４；溶媒，Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ；勾配，２０分間で４〜１６％Ｂ；流量，１．０ｍｌ／分；２１４ｎｍ及び２８４ｎｍでＵＶ検出；ＥＳイオン化は出発原料について３３５及び生成物について３０９にＭ＋Ｈを与えた）。溶液を濾過し、次の段階ので直接使用した。
【０１２３】
１７−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸
（２５．０ｍｍｏｌのアミノ酸に相当する）上記１７−アミノ−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸の水溶液に、重炭酸ナトリウム（５．０４ｇ、６０．０ｍｍｏｌ）及びジオキサン（４０ｍｌ）を添加した。ジオキサン中におけるＦｍｏｃクロリド（７．１１ｇ、０．２７５ｍｏｌ）の溶液を滴下した。反応混合物を１晩撹拌した。ジオキサンを蒸発させて除去し（ｒｏｔａｖａｐｏｒ）、水性相を酢酸エチレンで抽出した。水性相を塩酸の添加で酸性化し、沈殿した物質をクロロホルムで抽出した。有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮することで、１１．３ｇ（８５％）の黄色シロップを得た。ＬＣ−ＭＳ分析（カラム，Ｖｙｄａｃ ２１８ＴＰ５４；溶媒，Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ；勾配，２０分間で４０〜６０％Ｂ；流量，１．０ｍｌ／分；２１４ｎｍ及び２８４ｎｍでＵＶ検出；ＥＳイオン化は５．８分の生成物ピークについて予想通り５３１にＭ＋Ｈを与えた）で構造を確認した。分析結果は極めて低い副生物含有量を示し、それ以上の精製なしにこの物質を使用した。
【０１２４】
２ｂ）ＣｌＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ−ＮＨ２の合成
【０１２５】
【化２６】
０．２５ｍｍｏｌスケールで開始し、ＨＡＴＵ活性化を介して、Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＡＭ樹脂にＰＥＧ単位を手作業で結合した。残りのペプチドは、１ｍｍｏｌアミノ酸カートリッジを用いてＡＢＩ ４３３Ａ自動ペプチド合成機上で組み立てた。結合前に、ＨＢＴＵを用いてアミノ酸を予備活性化した。ＤＭＦ中のクロロ酢酸無水物溶液を用いて、Ｎ末端アミン基を３０分間クロロアセチル化した。樹脂からのペプチド及び側鎖保護基（ｔＢｕを除く）の同時除去を、ＴＩＳ（５％）、Ｈ２Ｏ（５％）及びフェノール（２．５％）を含むＴＦＡ中で２時間実施した。処理後、３２２ｍｇの粗ペプチドを得た（分析用ＨＰＬＣ：勾配，１０分間で５〜５０％Ｂ（ここで、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）；カラム，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２）５０×４．６ｍｍ；流量，２ｍＬ／分；検出，ＵＶ２１４ｎｍ；生成物の保持時間，６．３７分）。質量分析法を用いてさらに生成物の特性決定を行ったところ、Ｍ＋Ｈの予想値は１４０９、実測値は１４１５であった。
【０１２６】
２ｃ）チオエーテルシクロ［ＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−ＰＥＧ−ＮＨ２の合成
【０１２７】
【化２７】
３２２ｍｇのＣｌＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−(ＰＥＧ)ｎ−ＮＨ２を水／アセトニトリルに溶解した。混合物をアンモニア溶液でｐＨ８に調整し、１６時間撹拌した。処理後、粗ペプチドを得た（分析用ＨＰＬＣ：勾配，１０分間で５〜５０％Ｂ（ここで、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）；カラム，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２）５０×４．６ｍｍ；流量，２ｍＬ／分；検出，ＵＶ２１４ｎｍ；生成物の保持時間，６．２２分）。質量分析法を用いてさらに生成物の特性決定を行ったところ、Ｍ＋Ｈの予想値は１３７３、実測値は１３７８であった。
【０１２８】
２ｄ）ジスルフィド［Ｃｙｓ２−６］チオエーテルシクロ［ＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ２−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−ＰＥＧ−ＮＨ２の合成
【０１２９】
【化２８】
チオエーテルシクロ［ＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−(ＰＥＧ)ｎ−ＮＨ２を、アニソール（２００μＬ）、ＤＭＳＯ（２ｍＬ）及びＴＦＡ（１００ｍＬ）の溶液で６０分間処理した。次いで、ＴＦＡを真空中で除去し、ジエチルエーテルの添加でペプチドを沈殿させた。分取用ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２）２５０×２１．２０ｍｍカラム）により、４０分間で０〜３０％Ｂ（ここで、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）の勾配及び１０ｍＬ／分の流量を用いて７０ｍｇの粗物質の精製を行った。凍結乾燥後、４６ｍｇの純物質を得た（分析用ＨＰＬＣ：勾配，１０分間で０〜３０％Ｂ（ここで、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）；カラム，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２）５０×４．６ｍｍ；流量，２ｍＬ／分；検出，ＵＶ２１４ｎｍ；生成物の保持時間，６．８０分）。質量分析法を用いてさらに生成物の特性決定を行ったところ、Ｍ＋Ｈの予想値は１２５８．５、実測値は１２５８．８であった。
【０１３０】
２ｅ）ジスルフィド［Ｃｙｓ２−６］チオエーテルシクロ［ＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ（フルオレセイン）−Ｃｙｓ２−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−ＰＥＧ−ＮＨ２の合成
【０１３１】
【化２９】
３０ｍｇの［Ｃｙｓ２−６］シクロ［ＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−ＰＥＧ−ＮＨ２、１６．２ｍｇのフルオレセインＮＨＳエステル、及び４μＬのＮ−メチルモルホリンをＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解した。混合物を遮光し、１晩撹拌した。分取用ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ ２１８ＴＰ１０２２ Ｃ１８カラム）により、４０分間で２０〜３０％Ｂ（ここで、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）の勾配及び１０ｍＬ／分の流量を用いて反応混合物の精製を行った。凍結乾燥後、２１．６ｍｇの純物質を得た（分析用ＨＰＬＣ：勾配，１０分間で１０〜４０％Ｂ（ここで、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）；カラム，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２）５０×４．６ｍｍ；流量，２ｍＬ／分；検出，ＵＶ２１４ｎｍ；生成物の保持時間，７．０分）。質量分析法を用いてさらに生成物の特性決定を行ったところ、Ｍ＋Ｈの予想値は１６１６．５、実測値は１６１６．３であった。
【０１３２】
実施例３：ＣＮＶのイメージング
実施例２の造影剤（造影剤Ｈ）を光学イメージング用造影剤として用いて、ラットにおける脈絡膜血管新生のイメージングを行った。
【０１３３】
本研究には、体重３５０〜４００ｇのＬｏｎｇ−Ｅｖａｎｓ色素沈着ラットを使用した。ラットをケタミン（１００μｌ／１００ｇ）の筋肉内注射で麻酔し、１％トロピカミド点眼薬及び０．１％フェニレフリン点眼薬を用いて散瞳した後、光凝固術及びペプチド血管造影検査を行った。ダイオードレーザー間接検眼鏡送達系を用いて、下記の条件下でラットの右眼に眼底の光凝固を施した。出力は９０ｍＷ、波長は８１０ｎｍ、持続時間は０．１秒、スポットサイズは７５μｍであった。各眼の視神経頭部の周囲に１６回のレーザー焼灼を施した。レーザー（ＩＲＩＳ Ｍｅｄｉｃａｌ社、ＯｃｕＬｉｇｈｔ（商標）、Ｓ／Ｎ２５７４５）を用いて、ブルーフ膜及び脈絡膜中に１０の病変を作った。各病変は半径方向パターンで視神経頭部から約１ｍｍの位置にあった。
【０１３４】
無菌水中の０．９％塩化ナトリウム溶液をビヒクルとして用いて投与溶液を調製した。適当量の造影剤を容器内に直接秤取し、適当な体積に合わせ、必要に応じて振り回すことで造影剤を溶解させた。かかる処方薬は室温で保存し、遮光し、振ってから投与し、毎日調製した。
【０１３５】
陰性対照：下記の化合物を陰性対照として使用した。陰性対照は造影剤Ｈと同じ分子量を有するが、ＲＧＤ配列を含まないのでインテグリンに対する親和性をもたない。陰性対照化合物は、血管新生に関連するレセプターに親和性をもたない。
【０１３６】
【化３０】
陰性対照：［Ｃｙｓ２−６］チオエーテルシクロ［ＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ（フルオレセイン）−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ］−ＰＥＧ−ＮＨ２
造影剤溶液を静脈内注射（２００μｇ／ｋｇ）することで、レーザー処置後０日目から１４日目まで造影剤を用いた分子血管造影検査を行った。
【０１３７】
動物：
Ｈａｒｌａｎ社から供給されるＬｏｎｇ Ｅｖａｎｓ（系統）ラットを投与前に最低１週間環境順化させた。本研究のためには、全部で２７頭の雄及び０頭の雌を入手した。飼育のためには、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ固体底型ポリスルホンケージを個別に使用した。
【０１３８】
結果：
ＣＮＶ誘発後１時間目（レーザー処置後０日目）に、造影剤溶液（造影剤Ｈ又は陰性対照）を２０μｇ／ｋｇの投与量でラットに注射した。投与直後に画像を撮影した。
【０１３９】
画像は、陰性対照（図２）に比べて、造影剤Ｈ（図１）を注射したラットの眼の誘発病変に関する信号強度が増加していることを示している。イメージングシステムのパラメーターは、図１及び２に示す画像について同一であった。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】造影剤Ｈを注射したラットの眼の画像である。
【図２】陰性対照化合物を注射した眼の画像である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生に関連するレセプターに親和性を有するベクターを光学イメージング用レポーターに結合してなる造影剤を使用して湿性加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）のイメージングを行う方法に関する。本発明はさらに、ＡＭＤの治療効果を監視するためのかかる方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）は、中心視力の進行性喪失を引き起こす網膜の退行変性疾患である。ＡＭＤ発症のリスクは年齢と共に増加し、大抵は６０代及び７０代又はそれ以上の人々が罹患する。ＡＭＤは、６５歳を超える患者では先進世界における法定失明原因の１位であり、４５〜６５歳では糖尿病性網膜症に次いで２位である。
【０００３】
ＡＭＤによる中心視力の喪失は、黄斑部での光受容体の変性で引き起こされる。黄斑部は、微細な視覚的細部を知覚するために役立つ眼底及び網膜の中心部分であり、黄斑部は眼の最高光受容体密度を有している。眼底は眼の後方１／２〜１／３の部分であり、眼の残部と同じ３つの組織層（即ち、（前方から後方に向かって）網膜、脈絡膜及び強膜）を含んでいる。光受容体細胞として知られる網膜中の光感知細胞は、光を電気インパルスに変換し、次いで視神経を介してこれらのインパルスを脳に伝達する。
【０００４】
本文全体を通じて以下の略語が使用される。
ＡＭＤ 加齢黄斑変性症
ＣＣＤ 電荷結合素子
ＣＮＶ 脈絡膜血管新生
ＩＣＧ インドシアニングリーン
ＮＩＲ 近赤外
ＰＤＴ 光力学的療法
ＲＧＤ アルギニン−グリシン−アスパラギン酸
ＲＰＥ 網膜色素上皮
ＳＬＯ 走査レーザー検眼鏡検査
ＶＥＧＦ 血管内皮増殖因子
２つの型のＡＭＤ、即ち乾性及び湿性が存在する。乾性ＡＭＤは、萎縮性、非滲出性又はドルーゼノイド黄斑変性ともいわれる。乾性ＡＭＤでは、網膜廃棄物の蓄積の結果として、ドルーゼンといわれる黄白色の沈着物が網膜色素上皮（ＲＰＥ）とブルーフ膜との間に蓄積する。ドルーゼン沈着物は白色光又は蛍光眼底イメージングで見ることができ、診断のために造影剤は不要である。ドルーゼン沈着物は、ＲＰＥで適正に取り扱われない、光受容体細胞からの廃棄産物からなる。ＲＰＥ細胞は、通常は「門番」として作用し、ブルーフ膜を通して光受容体に栄養素を供給すると共に光受容体から廃棄産物を除去する。黄斑部の内部及び外部で生じるドルーゼン沈着物は、光受容体の正常な機能及び維持を妨げ、これらの細胞の進行変性を引き起こすと考えられる。しかし、ドルーゼン沈着物は視力喪失なしに多年にわたり網膜中に存在することもある。乾性ＡＭＤに原因する視力喪失は、長い年月の経過中に極めて徐々に起こる。
【０００５】
湿性ＡＭＤは脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）及び新血管膜の存在で特徴づけられるが、これはＣＮＶに加えて網膜下血管新生、滲出性変性又は円板状変性ともいわれる。湿性ＡＭＤでは、異常な新血管が脈絡膜から生じ、ブルーフ膜を貫通する。これらの新血管又は「新生」血管がＲＰＥの後方に位置する場合には、いわゆるＩ型又は「潜在型」のＡＭＤが形成される。新血管がＲＰＥの前方に位置する場合には、いわゆるＩＩ型又は「古典型」のＡＭＤが形成される。Ｉ型及びＩＩ型の組合せも生じる。これらの新血管及び増殖性ＲＰＥ応答が「新血管膜」を形成し、これが血液及び体液を網膜下細胞中に漏出させる。新血管膜が漏出を起こす理由は、新生血管の内皮ライニング間の開口が正常血管より広く、高分子物質（血漿及び血液）の溢出を許す。新血管形成過程並びに血液及び体液の漏出は、光受容体細胞を傷つけ、さらに光受容体のＲＰＥ支持を損なう。フルオレセイン及びインドシアニングリーン（ＩＣＧ）を用いる現行のＡＭＤ診断方法は、新生血管の漏出性に依存し、したがってこの形態学的／構造的異常に原因する蛍光の病巣蓄積に依存している。そのため、今日のＡＭＤ診断は、十分な新生血管膜が形成された比較的進んだ段階のＡＭＤについてのみ可能である。今日利用できる診断薬での診断時期が比較的遅いため、湿性ＡＭＤは急速に進行する傾向があり、著しい視力障害を生じる最高度のリスクを伴う。大部分の湿性ＡＭＤ患者では、特にＡＭＤの初期段階において潜在病変が存在している。
【０００６】
ＡＭＤの病理学に関する上記の知識にもかかわらず、ＣＮＶの多くの側面及び機構は十分に理解されていない。
【０００７】
米国では、今日、約１５００万人のＡＭＤ患者がいるが、９０％が乾性型を有しており、１０％が湿性型を有している。将来、米国では毎年２００万人の新患者が生じると推定されている。
【０００８】
一般に、新血管は２つの異なる機構、即ち脈管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）又は血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）で形成され得る。血管新生は既存の血管からの分枝による新血管の形成であり、胚発生及び健常状態での正常な現象として起こると共に、各種疾患過程の一部として起こる。このような過程をもたらす主な刺激は、組織中の細胞への栄養素及び酸素の不十分な供給（低酸素症）であり得る。細胞は多くの血管新生促進因子を分泌することで応答し得るが、しばしば言及されるその一例は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である。これらの因子は、基底膜のタンパク質を分解するタンパク分解酵素並びにこれらの場合によっては有害な酵素の作用を制限する阻害物質の分泌を開始させる。血管新生促進因子の他の顕著な効果は、内皮細胞の移動及び分裂を引き起こすことである。基底膜に付着した内皮細胞は有糸分裂を受けない。付着の喪失及び血管新生促進因子に対するレセプターからの信号の総合効果は、内皮細胞の移動、増殖及び再配列を引き起こし、最終的に新血管の周囲に基底膜を合成することである。
【０００９】
血管新生には、内皮細胞及び周囲の組織に特有のレセプターが関与する。これらの血管新生レセプターには、ＶＥＧＦのような増殖因子レセプター及びインテグリンレセプターがある。免疫組織化学的研究によれば、各種のインテグリン（おそらく最も重要なのはαｖクラス）が血管の先端表面に発現され［Ｃｏｎｆｏｒｔｉ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｌｏｏｄ，８０：３７−４４６］、循環リガンドによる標的化のために利用できる［Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：５４２−５４６］ことが実証された。
【００１０】
インテグリンαｖβ３及びαｖβ５は、血管新生に関連することが知られているレセプターである。αｖβ３インテグリンレセプターのアンタゴニストとリガンドとの相互作用がアポトーシスを誘起して血管増殖を抑制するので、刺激された内皮細胞はこれらのレセプターに頼って血管新生過程の臨界期に生き残るように思われる。
【００１１】
インテグリンは、α及びβサブユニットが細胞膜の脂質二重層を貫通しているヘテロ二量体分子である。αサブユニットはその細胞外連鎖上に４つのＣａ２＋結合ドメインを有し、βサブユニットは若干の細胞外富システインドメインを有している。
【００１２】
細胞接着に関与する多くのリガンド（例えば、フィブロネクチン）は、トリペプチド配列アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）を含んでいる。ＲＧＤ配列は、この配列を有するリガンドと細胞表面上のレセプターとの間の一次認識部位として作用するように思われる。一般に、リガンドとレセプターとの二次相互作用が相互作用の特異性を高めると考えられる。これらの二次相互作用は、リガンド及びレセプターのうちでＲＧＤ配列にすぐ隣接した部分の間又はＲＧＤ配列から遠く離れた部位で起こり得る。
【００１３】
ＲＧＤペプチドは一定範囲のインテグリンレセプターに結合することが知られており、臨床環境で意義のある応用性をもった若干の細胞現象を調整し得る可能性を有する。おそらく、ＲＧＤペプチド及びその模倣体の最も広く研究されている効果は、血小板インテグリンＧｐＩＩｂＩＩＩａを標的とする抗血栓薬としての使用に関するものである。
【００１４】
ＲＧＤ含有ペプチド系造影剤の例は、国際公開第０１／７７１４５号、同第０２／２６７７６号及び同第０３／００６４９１号中に見出される。
【００１５】
場合によっては、湿性ＡＭＤが早期に診断されれば、レーザー手術（光凝固術）で大規模な中心視力喪失を防止できる。この種の手術では、レーザービームが新血管膜の漏出性血管を焼灼する。レーザー手術が有効であるためには、大規模な視力喪失が起こる前に湿性ＡＭＤを診断することが重要である。
【００１６】
湿性ＡＭＤに対する別の治療法は、光力学的療法（ＰＤＴ）である。ＰＤＴは、レーザー治療と組み合わせて感光性薬物（例えば、Ｖｉｓｕｄｙｎｅ（商標）、リポソームＢＰＤ−ＭＡベルテポルフィン）を使用する。静脈内投与した場合、感光性薬物は不活性であり、望まない新血管膜中に蓄積する。所定量の低エネルギーレーザー光を標的ＣＮＶ組織に当てると、それは血管内に含まれる薬物を活性化する。感光性薬物と併用した場合、レーザー光は標的組織中に反応性の高い形態の酸素を生み出し、それが不必要な血管の閉鎖を引き起こす。ＰＤＴ療法は極めて選択的であると共に、低レベルの非熱レーザーエネルギーを用いるこで周囲の網膜組織への損傷を最小限に抑える。操作手順全体は約３０分で完了でき、外来ベースで実施される。通例、新血管は数週間又は数ヶ月間にわたって閉鎖状態に保たれるが、その後には再治療が必要なこともある。したがって、湿性ＡＭＤの診断方法及び該疾患の治療の監視方法に対するニーズが存在している。
【００１７】
既存の湿性ＡＭＤ検出方法は、フルオレセイン及び／又はＩＣＧの静脈内投与中に眼底カメラを用いて行う血管造影法である。両薬剤に関する診断原理は、新生血管からの漏出を引き起こす血管の形態学的／構造的変化の検出であり、ボーラス通過及び全身分布後の十分な組織濃度を得るための比較的高い投与量が要求される。静脈内投与後における短い動脈及び静脈ボーラス期の後、フルオレセインは比較的急速に細胞外体液空間に溢出して分布する。したがって、フルオレセインの投与から２０〜３０秒後には、脈絡膜血管系からの拡散性で支配的な蛍光信号が（解剖学的分解能なしに）認められる。かくして、新生血管は「過剰な」新血管膜によって識別され、局所的に増加した蛍光として存在する。古典型ＡＭＤでのフルオレセインの漏出は（ＲＰＥの前方に位置するので）診断が容易であり、過剰な蛍光及び均一な漏出を有する境界のはっきりした領域を示す。その名前で表されるように、潜在型ＡＭＤはフルオレセインによる診断が難しい。これは、ＲＰＥが励起光及び放出光の両方に対する極めて有効な光学バリヤーとして作用するからである。したがって、場合によっては初期に不規則な蛍光（「スティップリング」）及び後期に不均一な漏出が認められるものの、フルオレセインの使用は潜在型ＡＭＤに関しては信頼できない。フルオレセイン血管造影図の解析は、動静脈通過時間及び平均染料速度のような血流力学的情報を与えることができる。米国特許第６５９９８９１号は、フルオレセイン血管造影法を用いるＰＤＴ方法及びイメージング方法を開示する多くの例の１つである。
【００１８】
ＩＣＧはアルブミンに極めて強く結合し、したがって多少とも血液プールトレーサーのような挙動を示す。ＩＣＧの最大励起及び発光波長はそれぞれ８０６ｎｍ及び８３０ｎｍであり、ＲＰＥによる光の吸収が比較的少ない。ＲＰＥの光吸収は波長に依存し、近赤外域で最小となる。したがって、ＩＣＧは潜在型ＡＭＤの場合に重要な脈絡膜組織及びＲＰＥ層の後方の組織からの血管造影詳細情報を与える。しかし、フルオレセインの場合と同じく、血管の形態学的／構造的変化及び受動的な漏出がＩＣＧに関する診断原理であり、したがってＩＣＧの使用ではかなり進行した病巣新血管膜しか診断できない。米国特許出願公開第２００４／０１５６７８２号は、ＩＣＧを用いてＣＮＶの血管造影画像を得るための方法を開示している。
【００１９】
フルオレセイン血管造影法もＩＣＧ血管造影法も、実質的な量の新血管膜が形成されて視覚障害が始まる前の初期湿性ＡＭＤの検出方法を提供しない。
【００２０】
国際公開第２００４／０３４８８９号は、脈絡膜新血管系に関連する栄養補給血管の光力学的処置のための方法、装置及びシステムを開示しており、またかかる栄養補給血管の検出の必要性を記載している。この治療方法は、標的眼組織の特異的な表面成分に結合する結合リガンドに連結し得る光増感剤の使用を含んでいる。栄養補給血管を検出するためには、通常のフルオレセイン血管造影法及びＩＣＧ血管造影法の使用が示唆されている。
【００２１】
ＡＭＤ用、特に湿性ＡＭＤ及び潜在型脈絡膜血管新生用のさらに特異的な非侵襲的イメージング技術を開発することが臨床上から要望されている。既存の技術は背後にある病理学的変化を診断せず、新血管膜の形成及び量がかなり進行した場合に漏出性の新生血管によって形態学的／構造的変化を確認するのみである。湿性ＡＭＤの予後が比較的不良であるのは、特に現在利用できる方法で得られる診断が比較的遅いことに原因するから、小さくて初期の病変、好ましくは背後にある病理学的変化の性質を診断する能力をもった新しいイメージング方法は、初期段階でのＡＭＤの発症を診断し監視する上で臨床的に有益であろう。かかるイメージング方法はまた、新しい抗血管新生療法を評価する上で中心的な役割を演じるであろう。
【特許文献１】国際公開第０１／７７１４５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／２６７７６号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０３／００６４９１号パンフレット
【特許文献４】米国特許第６５９９８９１号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００４／０１５６７８２号明細書
【特許文献６】国際公開第２００４／０３４８８９号パンフレット
【非特許文献１】Ｃｏｎｆｏｒｔｉ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｌｏｏｄ，８０：３７−４４６．
【非特許文献２】Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：５４２−５４６．
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、血管新生に関連するレセプターに親和性を有するベクターを光学イメージング用レポーターに結合してなる造影剤を使用して湿性ＡＭＤのイメージングを行う方法を提供する。新生血管膜形成の病理学的基礎である血管新生の検出は、既に確立されている病理学の間接的徴候（例えば、漏出）よりも早期の湿性ＡＭＤ診断指標であることが判明している。インビボで血管新生及び湿性ＡＭＤに関連するレセプターの効率的な標的化及びイメージングを行うためには、化学的に頑強で安定な選択的で高親和性のベクターが要求される。上述のような造影剤の使用は、血管新生に特異的に関係する初期病理学的発症についての細胞レセプター情報を提供するので、従来の血管造影法に比べて高い価値を有することが判明している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
第一の態様に従えば、本発明は、血管新生に関連するレセプターに親和性を有するベクターを光学イメージング用レポーターに結合してなる造影剤を使用してヒト又は動物の身体の湿性ＡＭＤのイメージングを行う方法を提供する。
【００２４】
本方法は、好ましくは、ヒト又は動物の身体に造影剤を投与し、眼又は眼の一部に光を照射し、前記造影剤が分布した眼又は眼の一部の画像を形成することを含む光学イメージングにより、ヒト又は動物の身体の眼又は眼の一部の画像を形成することを含んでなる。照射して画像を形成するための眼の好ましい部分は眼底である。かかるイメージング方法は、人間及び動物並びに（例えば、臨床前研究で使用されるような）動物モデルにおける湿性ＡＭＤの検出及び／又は診断に使用できる。
【００２５】
造影剤は、好ましくは静脈内注射でヒト又は動物の身体の血管系に投与される。投与量は、フルオレセイン及びインドシアニングリーン血管造影法のために使用する投与量より少ないと予想される。典型的な投与量は、好ましくは１〜１００ｎｍｏｌ／ｋｇである。
【００２６】
前記方法は、好ましくは、細胞レセプター（好ましくは内皮細胞レセプター、特にインテグリンレセプターαｖβ３及び／又はαｖβ５）による前記造影剤の蓄積を検出することを含んでいる。蓄積とは、造影剤が血管新生に関連するレセプターに結合し、それと会合し、又はそれに取り込まれることを意味する。
【００２７】
湿性ＡＭＤの画像を形成するためには、好ましくは４００〜１３００ｎｍ、さらに好ましくは６００〜８００ｎｍの波長を有する光を眼又は眼の一部に照射する。放出される蛍光の検出で蛍光画像が形成される。したがって、画像の形成はデータの収集を含む検査段階を構成する。造影剤は、好ましくは、ある波長範囲内の光を吸収してそれより長い波長範囲で蛍光を放出する高蛍光性物質である。簡便には、フィルターを用いて発光が励起光から分離され、放出される光の画像が形成される。
【００２８】
さらに別の実施形態では、本方法は、光学イメージングという用語の範囲内に含まれる、紫外線から近赤外線までの電磁スペクトル中の光との相互作用に基づいて画像を形成する光学イメージング技術の使用を含む。本方法で使用するための若干の造影剤は、スペクトルの可視域内で発光し、その場合には画像を形成するために通常の検眼装置が使用できる。一層敏感なタイプの眼底カメラであって定量的な血管造影法を可能にする共焦点走査レーザー検眼鏡（ＳＬＯ）を用いて蛍光画像を記録することもできる。さらに、インビボ共焦点顕微鏡検査も適用できる。最近開発された時間ドメイン及び周波数ドメインイメージング技術も使用でき、これはレポーターの追加特性（例えば、寿命）を利用するものである。好ましくは、造影剤投与後の蛍光の連続写真を捕える特殊眼底カメラが使用される。さらに好ましくは、パルス光源と共に適合した１対のエキサイターフィルター及びバリヤーフィルターを備え、好ましくは毎秒１フレームでの捕獲速度を可能にする鋭敏な光検出装置（カメラ）を備えた特殊眼底カメラが使用される。透過曲線のクロスオーバーを最小にしながらピーク波長の最大透過を可能にするため、狭帯域干渉フィルターを含めることが好ましい。バリヤーフィルターは励起光を効果的に遮断するが、放出される蛍光の固有色は遮断しない。血管造影法用に装備された眼底カメラは、好ましくは、検査の各フレーム上に血管造影連続写真を記録するタイマーを有している。鋭敏な電荷結合素子（ＣＣＤ）及びディジタルイメージング用の計算機システムにより、画像は電子的に捕えられる。
【００２９】
形成される蛍光系列の連続撮影は、最大の診断情報を得るために好ましい。好ましい実施形態では、造影剤の投与前に、カラー眼底写真及び励起光でのモノクロ画像が基線図として撮影される。問題領域の最適評価のためには、様々な時点で画像を撮影することが好ましい。画像形成の初期段階は網膜及び脈絡膜循環のインビボ検査を容易にする一方、画像形成の後期段階は造影剤蓄積の可視化をもたらす。後期段階又は排出段階は、網膜及び脈絡膜の血管系からの造影剤の漸進的な排出を実証する。後期高度蛍光領域の着色は、画像化すべき異常の存在を示唆する。
【００３０】
本方法は、ヒト又は動物の身体の眼における血管新生の画像を形成することによる湿性ＡＭＤの検出及び／又は診断を含んでいる。好ましくは、本方法は、湿性ＡＭＤの検出又は診断のためにヒト又は動物の身体の眼又は眼の一部における血管新生レベルを評価することを含む。形成された新血管（例えば、脈絡膜中の新血管及びブルーフ膜を貫通した新血管）の量又は存在は、本方法の使用で検出される。網膜色素上皮（ＲＰＥ）の前方に位置する新血管（即ち、古典型ＡＭＤ）及びＲＰＥの後方に位置する新血管（即ち、潜在型ＡＭＤ）の両方が検出できる。本発明に係る方法を潜在型ＣＮＶ（即ち、潜在型ＡＭＤ）の検出又は診断のために使用することは好ましい実施形態である。
【００３１】
さらに、本発明の方法を使用することで、病理学的過程に関連する分子レベルの情報を得ることができる。好ましい実施形態では、本イメージング方法は血管新生に特異的に関係する初期病理学的発症についての細胞レセプター情報を提供する。
【００３２】
本発明の方法は、小さな病変の検出を可能にすると共に、実質的な量の新血管膜が形成されて視覚障害が始まる前に、疾患の初期における湿性ＡＭＤの検出を可能にする。
【００３３】
一実施形態では、本発明の方法は疾患進展の追跡調査又は疾患治療の追跡調査を包含する。かくして、本発明は、湿性ＡＭＤを処置するための薬物によるヒト又は動物の身体の治療効果を監視する方法、例えば血管新生抑制剤に対する治療応答を監視する方法を提供する。投与及び検出は、好ましくは、例えば前記薬物による処置前、処置中及び処置後に繰り返して行われる。好ましい実施形態では、イメージング方法は光力学的治療と組み合わせて使用される。本方法は、ＡＭＤ用として可能性のある薬物の治療効果に関する代理終点として初期の非侵襲的イメージングツールを利用することを可能にし、後には臨床治験計画に際して関連する利益をもたらす。
【００３４】
本発明はさらに下記の態様を含むが、これらはいずれも第一の態様に関して開示したものと同じ実施形態を包含している。
【００３５】
本発明の好ましい態様は、血管新生に関連するレセプターに親和性を有するベクターを光学イメージング用レポーターに結合してなる、湿性ＡＭＤの光学イメージングで使用するための造影剤である。かかる使用は、人間及び動物並びに動物モデルにおける湿性ＡＭＤの検出又は診断を含み得ると共に、製薬学的研究の範囲内における新薬の治療効果の監視も可能にする。
【００３６】
さらに別の態様に従えば、本発明は、湿性ＡＭＤのイメージングで使用するためのコントラスト増強組成物の製造のための、血管新生に関連するレセプターに親和性を有するベクターを光学イメージング用レポーターに結合してなる造影剤の使用を提供する。かかるイメージングは、好ましくは、前記コントラスト増強組成物をヒト又は動物の身体に投与し、光学イメージングでヒト又は動物の身体の眼又は眼の一部の画像を形成することを含む。
【００３７】
さらに別の態様に従えば、本発明は、血管新生に関連するレセプターに親和性を有するベクターを光学イメージング用レポーターに結合してなる造影剤を予め投与しておいたヒト又は動物の身体の眼の湿性ＡＭＤの画像を光学イメージングによって形成する方法を提供する。
【００３８】
本発明はまた、光学イメージング用レポーター又はその塩に結合したベクターからなる造影剤の有効量（例えば、インビボイメージングでの画像コントラストを増強するのに有効な量）を１種以上の薬剤学的に許容し得る佐剤、賦形剤又は希釈剤と共に含んでなるコントラスト増強組成物を使用して湿性ＡＭＤのイメージングを行う方法及び使用も提供する。ベクターは、血管新生に関連するレセプターに親和性を有する。
【００３９】
本発明の方法で使用する造影剤又はその生理学的に許容し得る塩は、血管新生に関連するレセプターに親和性を有するベクターを１種以上の光学イメージング用レポーターに結合したものからなる。かかる造影剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプター（ＶＥＧＦＲ−１／Ｆｌｔ−１、ＶＥＧＦＲ−２／Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ−３／Ｆｌｔ−４のサブタイプが存在する）、胎盤増殖因子レセプター及び線維芽細胞増殖因子レセプター、血小板由来内皮細胞増殖因子、アンジオポエチン並びにインテグリンからなる群から選択されるレセプターに親和性を有する。上記のレセプタークラスのいずれかに親和性を有する関連ベクターは、光学イメージング用レポーターに結合した場合、本発明に関して有用であると考えられる。インテグリンに対して親和性を有するベクターを含む造影剤が好ましい。「結合」という用語は、レポーターとベクターとが化学結合によって直接に又はリンカーを介して互いに結合又は連結されていることを意味する。
【００４０】
好ましくは、造影剤のベクターはインテグリンレセプターαｖβ３及び／又はαｖβ５に対して親和性を有する。ベクターは好ましくはペプチドベクターであり、アミノ酸配列Ｘ３−Ｇ−Ｄを含む。その結果、造影剤は、前記ペプチドベクターを好ましくは共有結合で光イメージング用レポーターに連結したものからなることが好ましい。Ｘ３はアルギニン、Ｎ−メチルアルギニン又はアルギニン模倣体を表し、Ｇはグリシンを表し、Ｄはアスパラギン酸を表す。ペプチドベクターは、αｖβ３レセプターのようなインテグリンレセプターに親和性を有する。造影剤は、好ましくは追加のアミノ酸及び任意には他の部分を含むが、Ｘ３−Ｇ−Ｄ配列は、血管新生及びＡＭＤに関連するインテグリン型レセプターへのベクター結合部位として機能するペプチドベクターの結合座である。
【００４１】
血管新生過程を抑制することが証明され、本発明の造影剤用のベクターとして十分な特異性を有すると見なされる他の関連ベクターには、アンジオスタチン、エンドスタチン、バソスタチン、並びに血小板第４因子及び抗トロンビンＩＩＩの開裂生成物のようなペプチドがある。
【００４２】
また、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）トリペプチド配列の小分子非ペプチド模倣体、好ましくはイソキサゾリン、インダゾール、２−ベンズアゼピンＲＧＤ模倣体及び非ペプチドアザカルバ誘導体から導かれるベクターも有用と考えられる。その他の関連ベクターは国際公開第９８／４７５４１号に開示されている。
【００４３】
ＲＧＤの小分子非ペプチド模倣体から導かれるかかるベクターの例を下記に示す。
【００４４】
アザカルバ：
【００４５】
【化１】
キナロン：
【００４６】
【化２】
インダゾール：
【００４７】
【化３】
式中、Ｌは、好ましくは正又は負の電荷を有する１種以上のアミノ酸（例えば、リシン又はシステイン酸）のようなリンカーであるか、或いは複数のエチレングリコール単位からなるスペーサーであるか、或いは共有結合であり、Ｚは光学イメージング用レポーターである。
【００４８】
以下、光学イメージング用レポーターは文字Ｚで表される。Ｚは好ましくは蛍光染料である。レポーターは一定の波長で蛍光を生じると共に、大規模な共役電子系を有する。可視及び近赤外（ＮＩＲ）スペクトル中に放射を生じるレポーターが好ましく、ＮＩＲ発光レポーターが最も好ましい。光学イメージング用レポーターは、好ましくはＲＰＥの光吸収による影響をほとんど受けない。レポーターＺは、好ましくは、シアニン類、メロシアニン類、インドシアニン類、フタロシアニン類、ナフタロシアニン類、トリフェニルメチン類、ポルフィリン類、ピリリウム染料、チアピリリウム染料、スクアリリウム染料、クロコニウム染料、アズレニウム染料、インドアニリン類、ベンゾフェノキサジニウム染料、ベンゾチアフェノチアジニウム染料、アントラキノン類、ナフトキノン類、インダスレン類、フタロイルアクリドン類、トリスフェノキノン類、アゾ染料、分子内及び分子間電荷移動染料及び染料錯体、トロポン類、テトラジン類、ビス（ジチオレン）錯体、ビス（ベンゼンジチオレート）錯体、ヨードアニリン染料並びにビス（Ｓ，Ｏ−ジチオレン）錯体からなる群から選択される。さらに好ましくは、Ｚはフルオレセイン又はフルオレセイン誘導体或いはシアニン染料であり、最も好ましくは、Ｚはシアニン染料である。別のレポーター群は量子ドットである。
【００４９】
シアニン染料（ＣｙＤｙｅ（商標））は、単結合及び多重（好ましくは二重）炭素−炭素結合で交互に結合された奇数の炭素原子を含むと共に、両端にアミノ基を有していてその一方が第四級化されているポリエン連鎖で定義される化合物である。シアニン及び類似のアリール−リンカー−アリール発色団は、任意にはペンダント置換基又は縮合環置換基を有する。シアニン染料及びその合成に関する一般的記載は、米国特許第６０４８９８２号及び同第５２６８４８６号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）中に見出される。シアニン染料は、広範囲の分光特性及び構造変化が利用できるので特に有用である。一定範囲のシアニン染料が公知であって試験されているが、これらは低い毒性を有し、商業的に入手できる（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（旧Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社））。シアニン染料は、良好な水溶性を有する単一の高強度染料群である。これらは、ｐＨ３〜１０の範囲でｐＨ不感性を有し、低い非特異的結合を示し、フルオレセインより高い光安定性を有する。
【００５０】
シアニン染料は、好ましくは、下記の一般式で示されるカルバシアニン類、オキサシアニン類、チアシアニン類及びアザシアニン類からなる群から選択される。
【００５１】
【化４】
これらの構造中では、Ｒ１基は同一の又は異なる基であって、置換又は非置換アルキル基（好ましくはＣ１〜Ｃ６アルキル）であり、エーテル基又は−Ｎ−ＣＯ−Ｎ−基を含み得る。アルキル基は、任意にはカルボキシ基、スルホン酸基、アミン基、アンモニウム基又はエステル基で置換される。Ｒ１基は、例えば−Ｎ−ＣＯ−Ｎ−基又はエーテル基により、ポリエン連鎖の炭素原子のいずれかと架橋を形成し得る。Ｒ２基も同一の又は異なる基であって、置換又は非置換アルキル基である。アルキル基は任意にはカルボキシ基又はスルホン酸基で置換されるが、好ましくは、Ｒ２基はＣ１〜Ｃ６アルキルのような低級アルキル基であり、最も好ましくはメチル基である。任意の芳香族基は点線で示されていて、縮合ベンゾ環及び縮合ナフト環を含む構造の両方を包括している。これらの環は置換又は非置換のものである。これらの環は、スルホン酸基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルキル（スルホアルキル）アミノ基、ビス（スルホアルキル）アミノ基、スルホアルコキシ基、スルホアルキルスルホニル基、アルキル基又は置換アルキル基、或いはスルホアルキルアミノ基で置換され得る。アルキル基は、好ましくは（例えば炭素原子数１〜６の）低級アルキルである。Ｙは水素、ハライド基、アミン基又はスルホニル基から選択され、好ましくは水素である。シアニン染料のポリエン連鎖も、例えば、（スクアレイン染料の場合のように）連鎖中の２つの炭素原子間に−ＣＯ−基を含むことで、或いはアルキル架橋を含むことで、ポリエン連鎖中の２以上の炭素原子間に架橋を形成する１以上の環状化学基を含み得る。これらの架橋は、染料の化学的安定性及び光安定性を高めるために役立ち得る。
【００５２】
式Ｉ〜ＩＶ中で、Ｉは１、２、３又は４の正整数であって、トリメチン、ペンタメチン、ヘプタメチン又はノナメチンシアニン染料を与える。好ましくは、シアニン染料はそれぞれ炭素原子数５〜７の炭素架橋を有するペンタメチン又はヘプタメチン染料である。
【００５３】
式Ｉ〜ＩＶについていえば、好ましい染料では、インドール環又はベンゾインドール環に結合したスルホン酸部分の数は全体として２、１又は０である。少ない数のスルホン酸部分を有する染料は、ＲＧＤペプチドのようなペプチドに結合した場合、低い血漿結合性及びバックグラウンド組織に対する非特異的結合の減少を示す。
【００５４】
好ましい染料は、カルバシアニン類の群から選択される。なお一層好ましいのは、インドール型のカルバシアニン染料である。この種の好ましい染料は下記の式Ｖで例示される。
【００５５】
【化５】
式中、Ｘはスルホン酸部分であるか、或いは存在しない。Ｒ１基は同一の又は異なる基であって、置換又は非置換低級アルキル基（例えば、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル基）である。アルキル基は、例えば、カルボキシ基、スルホン酸基、アミン基、アンモニウム基又は（複素環式エステル基（例えば、ＮＨＳエステル基）のような）エステル基で置換される。Ｒ２基は、例えばカルボキシ基又はスルホン酸基で任意に置換される低級アルキル基（例えばＣ１〜Ｃ６アルキル基、好ましくはメチル基）である。Ｉは１〜３の整数である。
【００５６】
Ｒ１基、Ｒ２基及びＸ基は、シアニン染料をベクターに結合するための可能な結合部位であり、Ｒ１基及びＸ基が好ましい結合部位である。好ましい態様では、一方のＲ１基がベクターに結合されるのに対し、他方のＲ１基は遊離低級アルキル基である。
【００５７】
本発明の方法で使用するための造影剤を製造するために最も好ましい染料は、下記に示すＣｙ５モノＮＨＳエステルビスＳＯ３及びＣＹ７モノＮＨＳエステルビスＳＯ３であり、いずれもベクターと反応し得るＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルで置換されたアルキル基からなるＲ１基を含んでいる。
【００５８】
【化６】
好適なシアニン染料は、好ましくは５００〜９００ｎｍの範囲内、さらに好ましくは６５０〜８５０ｎｍの範囲内の可視又は近赤外域に発光スペクトルを有する。
【００５９】
別法として、レポーターＺはフルオレセイン染料（即ち、フルオレセイン又はフルオレセイン誘導体）からなる。フルオレセインは、可視光中で発光する黄色染料である。フルオレセインは、通例はアルゴンレーザーの４８８ｎｍ線で励起され、発光は５３０ｎｍで捕集される。フルオレセイン及びその誘導体は、比較的高い吸光率、優れた蛍光量子収量及び良好な水溶性を有する。従来の広汎な使用の結果、これらは極めてよく特性決定されており、入手可能性も非常によく、しかも低コストである。
【００６０】
下記の式（ＶＩ）はフルオレセインを示していて、炭素原子の様々な位置に番号が付けられている。
【００６１】
【化７】
フルオレセインの好適な誘導体は、例えば、下記の式ＶＩＩで示される５−カルボキシフルオレセイン及び６−カルボキシフルオレセインである。
【００６２】
【化８】
別の好適なフルオレセイン誘導体は、下記の式ＶＩＩＩのフルオレセインイソチオシアネートである。
【００６３】
【化９】
さらに好ましいのは、本発明の方法で使用するための造影剤の製造に際し、下記の式ＩＸで示されるＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル（フルオレセインＮＨＳエステルという）のようなフルオレセインの活性化カルボキシレート誘導体を使用することである。スクシンイミドエステルは、アミド生成物が非常に安定であるので優れた反応剤である。
【００６４】
【化１０】
好ましくは、フルオレセインは、ベクターの適当なアミノ基とのアミド結合形成でベクターに連結される。式（ＩＸ）のＮＨＳエステルのようなフルオレセインの活性エステルは商業的に入手可能であり（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ製品番号４６１００）、造影剤を合成する場合に特に有用であると考えられる。フルオレセインの好ましい結合部位は５位及び６位である。
【００６５】
ベクターがアミノ酸配列Ｘ３−Ｇ−Ｄを含むペプチドベクターである好ましい態様に関しては、造影剤は、例えばペプチドベクター部分中に１以上の環化架橋を形成することで拘束できる。アミノ酸間にジスルフィド結合又はチオエーテル結合を形成することで単環式ペプチド造影剤が得られる。１つの環化架橋を含むペプチド系造影剤は、αｖβ３に対する特異性が高く、線状ペプチドより好ましい。本発明の造影剤は、好ましくは、造影剤の異なるアミノ酸間に２つの環化架橋を含むベクターを有する。「環化架橋」という用語は、アミノ酸又はアミノ酸及び−(ＣＨ２)ｎ−又は−(ＣＨ２)ｎ−Ｃ６Ｈ４−基と、架橋の導入を可能にする官能基との任意の組合せをいう。ｎは１〜１０の正整数を表す。若干の好ましい例は、ジスルフィド、−(ＣＨ２)４−カルバ架橋のようなジスルフィド模倣体、チオアセタール架橋、チオエーテル架橋（シスタチオン又はランチオニン）、及びエステルやエーテルを含む架橋である。好ましくは、１つの架橋はジスルフィド結合を形成し、第二の架橋はチオエーテル（スルフィド）結合からなる。ペプチドの合成及び環化架橋の導入は、国際公開第０１／７７１４５号及び同第０２／２６７７６号に記載されているようにして実施できる。
【００６６】
さらに別の実施形態では、本方法は下記の式（Ｘａ）で定義される造影剤の使用を含む。
Ａ−Ｚ
（Ｘａ）
式中、Ａは下記の式（Ｘｂ）で定義され、Ｚは任意にはスペーサー基を介してＡのＸ１、Ｘ６又はＸ７の１以上に結合した１以上の光学イメージング用レポーターを表す。かかる造影剤は、さらに２つの環化架橋を含む。
Ｒａ−Ｃ(＝Ｏ)−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｄ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７
（Ｘｂ）
式中、Ｘ３、Ｇ及びＤは前記に定義した通りである。
【００６７】
Ｒａは、Ｘ２、Ｘ４又はＸ６に結合する架橋の一部をなす−(ＣＨ２)ｎ−又は−(ＣＨ２)ｎ−Ｃ６Ｈ４−基（式中、ｎは１〜１０の正整数を表す。）を表す。
【００６８】
Ｘ１は結合或いは１、２、３、４又は５のアミノ酸残基を表していて、１つのアミノ酸残基はスペーサー部分で任意に官能化されており、好ましくは前記アミノ酸残基は酸基又はアミン基のような官能性側鎖を有し、好ましくはアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、ホモリシン、ジアミノアルシル酸及びジアミノプロピオン酸から選択される。
【００６９】
Ｘ２及びＸ４は独立に、ジスルフィド又はチオエーテル結合を形成するシステイン又はホモシステイン残基のような環化架橋を形成し得るアミノ酸残基、或いは環化架橋を形成し得る他のアミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸及びリシン）を表す。好ましくはＸ２及びＸ４はシステイン又はホモシステインの残基を表し、好ましくはＸ２及びＸ４は両者間に或いはＲａ又はＸ６と共に環化架橋を形成する。
【００７０】
Ｘ５は疎水性アミノ酸又はその誘導体を表し、好ましくはチロシン、フェニルアラニン、３−ヨードチロシン又はナフチルアラニン残基、さらに好ましくはフェニルアラニン又は３−ヨードチロシンを表す。
【００７１】
Ｘ６は、環化架橋を形成し得るアミノ酸残基、好ましくはチオール含有アミノ酸残基（好ましくはシステイン又はホモシステイン）を表し、好ましくはＸ６はＲａ、Ｘ２又はＸ４と共に環化架橋を形成する。
【００７２】
Ｘ７はスペーサー又はバイオモディファイアー部分を表すか、或いは存在しない。好ましくは、Ｘ７は単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構成ブロックからなり、前記構成ブロックの１〜１０単位を含む。前記バイオモディファイアーは、前記造影剤の薬物動態及び血中クリアランス速度を調整する機能を有する。加えてＸ７は、好ましくはグリシン、リシン、アスパラギン酸又はセリンからなる１〜１０のアミノ酸残基を表し得る。Ｘ７はまた、アミノ酸残基及びＰＥＧ様構造の両方を含むスペーサー又はバイオモディファイアー（好ましくはビスアミノエチルエチレングリコール−グリシンの組合せ）を表し得る。好ましい実施形態では、Ｘ７は、単分散ＰＥＧ様構造からなる単位、即ち下記式（ＸＩ）の１７−アミノ−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸を表す。
【００７３】
【化１１】
式中、ｍは１〜１０の整数であり、Ｃ末端はアミド部分又は酸部分である。バイオモディファイアーＸ７は、造影剤の薬物動態及び血中クリアランス速度を調整することが判明している。バイオモディファイアーは組織（即ち、筋肉、肝臓など）中への造影剤の取込みを減少させることで、バックグラウンド妨害を少なくして一層良好な診断画像を与える。排出は主に腎臓を通して行われるが、これはバイオモディファイアーのさらなる利点を表している。
【００７４】
かくして、本発明の方法で使用するための造影剤は、好ましくは式ＸｂのＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｇ、Ｄ、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６で形成されるアミノ酸配列で定義されるペプチドベクターを含み、このペプチドは血管新生及び湿性ＡＭＤに関連するインテグリンレセプターに親和性を有するベクターをなす。
【００７５】
環化架橋の配置状態に応じ、造影剤は「離散型」、「入れ子型」又は「からみ合い型」の構造を有する。好ましくは、各造影剤中の２つの架橋は、ＲａとＸ６との間及びＸ２とＸ４との間に位置（して入れ子型構造を形成）するか、ＲａとＸ２との間及びＸ４とＸ６との間に位置（して離散型構造を形成）するか、ＲａとＸ４との間及びＸ２とＸ６との間に位置（してからみ合い型構造を形成）する。
【００７６】
好ましい実施形態では、本発明の方法で使用する造影剤は、チオエーテル結合をなす第一の架橋及びジスルフィド結合をなす第二の架橋を含んでいる。
【００７７】
さらに別の実施形態では、本発明の造影剤は下記の式のいずれかで同定される。式ＸＩＩの造影剤の製法は国際公開第０１／７７１４５号に記載されており、式ＸＩＩＩの造影剤の製法は国際公開第０２／２６７７６号に記載されている。
【００７８】
【化１２】
式中、Ｒａ、Ｘ３、Ｇ、Ｄ、Ｘ５及びＸ７は式Ｘｂに関して定義した通りである。
【００７９】
Ｘ'１は酸基又はアミン基のような官能性側鎖を有するアミノ酸残基からなる。かかるアミノ酸は、好ましくはアスパラギン酸、グルタミン酸、ホモリシン、及びリシン又はジアミノプロピオン酸のようなジアミノアルシル酸から選択され、さらに好ましくはアスパラギン酸又はリシンである。
【００８０】
Ｘ'２、Ｘ'４及びＸ'６は、システイン又はホモシステインのような、ジスルフィド又はチオエーテル結合を形成し得るアミノ酸残基を表し、かかるジスルフィド及びチオエーテル結合が示されている。
【００８１】
Ｗ１はスペーサー部分であるか、或いは存在しない。好ましくは、Ｗ１はグルタル酸及び／又はコハク酸及び／又はレポーターをペプチドに結合するポリエチレングリコール系単位から導かれる。他の代表的なスペーサー（Ｗ１）要素には、構造型多糖、貯蔵型多糖、ポリアミノ酸及びそのメチルエステルやエチルエステル、並びにポリペプチド、オリゴ糖及びオリゴヌクレオチドがあり、これらは酵素開裂部位を含んでいてもよいし、含まなくてもよい。スペーサー部分Ｗ１の役割は、かなり巨大なレポーターをペプチド成分のレセプター結合ドメインから遠ざけることにある。
【００８２】
ｈは１又は２の正整数である。
【００８３】
存在するＺ基の１以上は光学イメージング用レポーターを表す。
【００８４】
造影剤は、好ましくはただ１つのＺ基を含む。
【００８５】
Ｚで表されるレポーターは、アミド結合の形成によってＸ'１は、Ｗ１、Ｘ６又はＸ７に結合できる。ＮＨＳエステルのようなレポーターの活性エステルは、造影剤を合成する場合に特に有用であると考えられる。
【００８６】
好ましい態様では、式ＸＩＩ〜ＸＩＶの造影剤又はその生理学的に許容し得る塩は下記の特性を有する。
【００８７】
Ｒａは−(ＣＨ２)−を表す。
【００８８】
さらに、Ｘ'１は酸基又はアミン基のような官能性側鎖を有するアミノ酸残基からなる。かかるアミノ酸は、好ましくはアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、ホモリシン、ジアミノアルシル酸及びジアミノプロピオン酸から選択され、さらに好ましくはアスパラギン酸又はリシンである。
【００８９】
Ｘ'２、Ｘ'４及びＸ'６は、好ましくは、独立にシステイン又はホモシステイン残基を表す。
【００９０】
Ｘ３は、好ましくはアルギニンを表す。
【００９１】
Ｘ５は、好ましくはチロシン、フェニルアラニン、３−ヨードチロシン又はナフチルアラニン、さらに好ましくはフェニルアラニン又は３−ヨードチロシンを表す。
【００９２】
Ｘ７及びＷ１は式ＸＩに関して定義した通りである。好ましくは、Ｘ７は単分散ＰＥＧ構成ブロックの１〜１０単位からなるか、或いは存在せず、Ｗ１は好ましくは存在しない。
【００９３】
Ｚは、造影剤が１以上の光学イメージング用レポーターを含むことを条件にして、光学イメージング用レポーターを表すか、或いは存在しない。
【００９４】
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法で使用する造影剤は式ＸＩＩ（入れ子型）のもの又はその生理学的に許容し得る塩であって、上記の特性を有する。
【００９５】
式Ｘａで定義されるアミノ酸残基のいずれもが、好ましくは天然に存在するアミノ酸を表す。大抵の場合、ペプチドベクター中のアミノ酸はすべてＬ形であることが好ましい。しかし、本発明の若干の実施形態では、ペプチド中のアミノ酸の１つ、２つ、３つ又はそれ以上が好ましくはＤ形である。かかるＤ形アミノ酸の含有は、造影剤の血清に対して顕著な効果を及ぼし得る。
【００９６】
本発明の方法で使用される若干の造影剤は、高親和性ＲＧＤ型ベクターを含んでいる。本明細書中で使用する「高親和性ＲＧＤ型ベクター」という用語は、αｖβ３インテグリンに関する競合的結合測定法で＜１０ｎＭ好ましくは＜５ｎＭのＫｉを有する造影剤をいう。この場合、Ｋｉ値は公知の高親和性リガンドであるエキスタチンとの競合で測定した。かかる競合測定を実施するための方法は当技術分野で公知である。
【００９７】
本発明の方法で使用するための式Ｘａの造影剤の若干の例を下記に示す。
【００９８】
造影剤Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれ１、２又は４のスルホン酸基を有するペンタメチンカルバシアニンをＲＧＤ含有ペプチド（Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ）に結合したものからなる。造影剤Ａ及びＢはＣｙ５染料を含む一方、造影剤ＣはＣｙ５．５染料を含んでいる。
【００９９】
造影剤Ａ：
【０１００】
【化１３】
造影剤Ｂ：
【０１０１】
【化１４】
造影剤Ｃ：
【０１０２】
【化１５】
造影剤Ｄ：
下記に示すようなＡｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−ＣｙｓペプチドからなるペプチドベクターＤは、アスパラギン酸（Ｘ１）をアミノ官能化シアニン染料に結合するか、或いはシアニン染料のＮＨＳエステルをＸ７に位置するアミノ−ＰＥＧと反応させることで、シアニン染料（例えば、Ｃｙ７）のような光学イメージング用レポーターに結合できる。
【０１０３】
【化１６】
造影剤Ｅ：
造影剤Ｅは、ＲＧＤ型ペプチド（Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ）を２つのシアニン染料基（Ｃｙ５．５）に結合したものからなる。
【０１０４】
【化１７】
造影剤Ｆ：
造影剤Ｆは、ＲＧＤ型ペプチド（Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）をＣｙ５に結合したものからなる。
【０１０５】
【化１８】
造影剤Ｇ：単環式ＲＧＤ型ペプチドｃ［−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｃｙ５．５）−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−］
【０１０６】
【化１９】
造影剤Ｈ及びＩは、ＲＧＤ型ペプチド（Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ）を異なる部位でフルオレセインに結合したものからなる。
【０１０７】
造影剤Ｈ：
【０１０８】
【化２０】
造影剤Ｉ：
【０１０９】
【化２１】
造影剤Ｊ：
造影剤Ｊは、ＲＧＤペプチド（Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）をフルオレセインに結合したものからなり、「離散型」構造をなしている。
【０１１０】
【化２２】
造影剤Ｋ：
造影剤Ｋは、ＲＧＤペプチド（Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ）を異なる部位でフルオレセインに結合したものからなり、「からみ合い型」構造をなしている。
【０１１１】
【化２３】
上記造影剤のベクターはすべての公知化学合成方法を用いて合成できるが、特に有用なのは自動ペプチド合成機を用いるＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法である（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６４））。
【０１１２】
ベクターへのレポーター（例えば、染料の活性エステル）の連結も自動的に実施してペプチドとレポーターとの間にアミド結合を生み出すことができ、或いは実施例１及び２に記載するようにしてレポーターをペプチドベクターに結合することができる。ペプチドベクター及びペプチド造影剤は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製でき、イン・ビトロスクリーンでの試験前に質量分析法及び分析ＨＰＬＣで特性決定することができる。
【実施例】
【０１１３】
次に、以下の非限定的な実施例によって本発明をさらに例証する。
【０１１４】
図１及び２は実施例３に関するものであって、誘発ＣＮＶを有するＬｏｎｇ Ｅｖａｎｓラットの眼の画像を示す。図１は造影剤Ｈを注射したラットの眼の画像であり、図２は陰性対照化合物を注射した眼の画像である。
【０１１５】
略語：
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
Ｆｍｏｃ Ｎ−α−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）
ＨＡＴＵ ２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３− テトラメチルウロニウム
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＬＣ＿ＭＳ 液体クロマトグラフィー質量分析法
ＮＭＭ Ｎ−メチルモルホリン
ｔＢｕ ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
実施例１：Ｃｙｓ２−６：ｃ［ＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ(Ｃｙ５ビス−ＳＯ３)−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−(ＰＥＧ)ｎ−ＮＨ２（ｎ＝１）（造影剤Ｂ）の合成
【０１１６】
【化２４】
標準的な固相ペプチド合成方法を用いて上記のペプチドを組み立てた。クロロアセチル化ペプチドを固体担体から分離し、溶液中で環化することで、まずチオエーテル架橋を形成し、次いでジスルフィド架橋を形成した。ＤＭＦ（２ｍｌ）中におけるＣｙ５モノＮＨＳエステルビス−ＳＯ３（７．５ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）の溶液に二環式ペプチド（２４ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を固体として添加し、次いでＮＭＭ（０．０１ｍｌ、０．０９ｍｍｏｌ）を添加した。光を避けながら、反応を１晩進行させた。ＤＭＦを減圧下で蒸発させ、粗生成物を逆相分取用クロマトグラフィー（Ｖｙｄａｃ Ｃ１８カラム，２１８ＴＰ１０２２；溶媒，Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ；勾配，６０分間で１０〜３０％Ｂ；流量，１０ｍｌ／分；２５４ｎｍで検出）で精製することで、６．６ｍｇの純生成物（分析用ＨＰＬＣ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８カラム，００Ｇ−４２５２−Ｅ０；溶媒，Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ；勾配，２０分間で１５〜３５％Ｂ；流量，１．０ｍｌ／分；保持時間，１９．５分；２１４ｎｍ及び２５４ｎｍで検出）を得た。質量分析法を用いて追加の特性決定を行うことで、９４９．１［ＭＨ２＋］のｍ／ｚ値を得た。
【０１１７】
実施例２：ジスルフィド［Ｃｙｓ２−６］チオエーテルシクロ［ＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ(フルオレセイン)−Ｃｙｓ２−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−ＰＥＧ−ＮＨ２（ｎ＝１）（造影剤Ｈ）の合成
２ａ）１７−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸の合成
【０１１８】
【化２５】
Ｆｍｏｃ化学を用いてこの構成ブロックを固相に結合した。この構成ブロックの結合形を簡単にＰＥＧという。
【０１１９】
１，１１−ジアジド−３，６，９−トリオキサウンデカン
乾燥ＴＨＦ（１００ｍｌ）中における乾燥テトラエチレングリコール（１９．４ｇ、０．１００ｍｏｌ）及びメタンスルホニルクロリド（２５．２ｇ、０．２２０ｍｏｌ）の溶液をアルゴン下に保ち、氷／水浴中で０℃に冷却した。フラスコに、乾燥ＴＨＦ（２５ｍｌ）中におけるトリエチルアミン（２２．６ｇ、０．２２０ｍｏｌ）の溶液を４５分かけて滴下した。１時間後、冷却浴を取り除き、撹拌を４時間続けた。水（６０ｍｌ）を添加した。混合物に炭酸水素ナトリウム（６ｇ、ｐＨ８）及びアジ化ナトリウム（１４．３ｇ、０．２２０ｍｏｌ）をこの順序で添加した。ＴＨＦを留去し、水溶液を２４時間還流した（２つの層が生じた）。混合物を冷却し、エーテル（１００ｍｌ）を添加した。水性相を塩化ナトリウムで飽和させた。両相を分離し、水性相をエーテル（４×５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相をブライン（２×５０ｍｌ）で洗い、乾燥した（ＭｇＳＯ４）。濾過及び濃縮により、２２．１ｇ（９１％）の黄色油を得た。それ以上の精製なしに生成物を次の段階で使用した。
【０１２０】
１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカナミン
塩酸（２００ｍｌ）中における１，１１−ジアジド−３，６，９−トリオキサウンデカン（２０．８ｇ、０．０８５ｍｏｌ）の懸濁液を機械的に激しく撹拌しながら、エーテル（１５０ｍｌ）中におけるトリフェニルホスフィン（１９．９ｇ、０．０７３ｍｏｌ）の溶液を室温で３時間かけて添加した。反応混合物をさらに２４時間撹拌した。両相を分離し、水性相をジクロロメタン（３×４０ｍｌ）で抽出した。水性相を氷／水浴中で冷却し、ｐＨをＫＯＨの添加で約１２に調整した。生成物をジクロロメタン（５×５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相を乾燥した（ＭｇＳＯ４）。濾過及び蒸発により、１４．０ｇ（８８％）の黄色油を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（マトリックス：α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）による分析の結果、予想通り２１９にＭ＋Ｈピークが得られた。１Ｈ（５００ＭＨｚ）及び１３Ｃ（１２５ＭＨｚ）ＮＭＲ分光法を用いた追加の特性決定により、構造が確認された。
【０１２１】
１７−アジド−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸
ジクロロメタン（１００ｍｌ）中における１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカナミン（１０．９ｇ、５０．０ｍｍｏｌ）の溶液に、無水ジグリコール酸（６．３８ｇ、５５．０ｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１晩撹拌した。ＨＰＬＣ分析（カラム，Ｖｙｄａｃ ２１８ＴＰ５４、溶媒，Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ；勾配，２０分間で４〜１６％Ｂ；流量，１．０ｍｌ／分；２１４ｎｍ及び２８４ｎｍでＵＶ検出）は、出発原料が１８．３分の保持時間を有する生成物に完全に転化したことを示した。溶液を濃縮することで定量的収量の黄色シロップを得た。ＬＣ＿ＭＳ（ＥＳイオン化）で生成物を分析したところ、予想通り３３５に[ＭＨ]＋が得られた。１Ｈ（５００ＭＨｚ）及び１３Ｃ（１２５ＭＨｚ）ＮＭＲ分光法の結果は構造に一致していた。それ以上の精製なしに生成物を次の段階で使用した。
【０１２２】
１７−アミノ−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸
Ｈ２（ｇ）−Ｐｄ／Ｃ（１０％）を用いて、水（１００ｍｌ）中における１７−アジド−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸（８．３６ｇ、２５．０ｍｍｏｌ）の溶液を還元した。反応は、ＬＣ−ＭＳ分析が出発原料の完全な転化を示すまで行った（カラム，Ｖｙｄａｃ ２１８ＴＰ５４；溶媒，Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ；勾配，２０分間で４〜１６％Ｂ；流量，１．０ｍｌ／分；２１４ｎｍ及び２８４ｎｍでＵＶ検出；ＥＳイオン化は出発原料について３３５及び生成物について３０９にＭ＋Ｈを与えた）。溶液を濾過し、次の段階ので直接使用した。
【０１２３】
１７−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸
（２５．０ｍｍｏｌのアミノ酸に相当する）上記１７−アミノ−５−オキソ−６−アザ−３，９，１２，１５−テトラオキサヘプタデカン酸の水溶液に、重炭酸ナトリウム（５．０４ｇ、６０．０ｍｍｏｌ）及びジオキサン（４０ｍｌ）を添加した。ジオキサン中におけるＦｍｏｃクロリド（７．１１ｇ、０．２７５ｍｏｌ）の溶液を滴下した。反応混合物を１晩撹拌した。ジオキサンを蒸発させて除去し（ｒｏｔａｖａｐｏｒ）、水性相を酢酸エチレンで抽出した。水性相を塩酸の添加で酸性化し、沈殿した物質をクロロホルムで抽出した。有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮することで、１１．３ｇ（８５％）の黄色シロップを得た。ＬＣ−ＭＳ分析（カラム，Ｖｙｄａｃ ２１８ＴＰ５４；溶媒，Ａ＝水／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ；勾配，２０分間で４０〜６０％Ｂ；流量，１．０ｍｌ／分；２１４ｎｍ及び２８４ｎｍでＵＶ検出；ＥＳイオン化は５．８分の生成物ピークについて予想通り５３１にＭ＋Ｈを与えた）で構造を確認した。分析結果は極めて低い副生物含有量を示し、それ以上の精製なしにこの物質を使用した。
【０１２４】
２ｂ）ＣｌＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ−ＮＨ２の合成
【０１２５】
【化２６】
０．２５ｍｍｏｌスケールで開始し、ＨＡＴＵ活性化を介して、Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＡＭ樹脂にＰＥＧ単位を手作業で結合した。残りのペプチドは、１ｍｍｏｌアミノ酸カートリッジを用いてＡＢＩ ４３３Ａ自動ペプチド合成機上で組み立てた。結合前に、ＨＢＴＵを用いてアミノ酸を予備活性化した。ＤＭＦ中のクロロ酢酸無水物溶液を用いて、Ｎ末端アミン基を３０分間クロロアセチル化した。樹脂からのペプチド及び側鎖保護基（ｔＢｕを除く）の同時除去を、ＴＩＳ（５％）、Ｈ２Ｏ（５％）及びフェノール（２．５％）を含むＴＦＡ中で２時間実施した。処理後、３２２ｍｇの粗ペプチドを得た（分析用ＨＰＬＣ：勾配，１０分間で５〜５０％Ｂ（ここで、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）；カラム，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２）５０×４．６ｍｍ；流量，２ｍＬ／分；検出，ＵＶ２１４ｎｍ；生成物の保持時間，６．３７分）。質量分析法を用いてさらに生成物の特性決定を行ったところ、Ｍ＋Ｈの予想値は１４０９、実測値は１４１５であった。
【０１２６】
２ｃ）チオエーテルシクロ［ＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−ＰＥＧ−ＮＨ２の合成
【０１２７】
【化２７】
３２２ｍｇのＣｌＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−(ＰＥＧ)ｎ−ＮＨ２を水／アセトニトリルに溶解した。混合物をアンモニア溶液でｐＨ８に調整し、１６時間撹拌した。処理後、粗ペプチドを得た（分析用ＨＰＬＣ：勾配，１０分間で５〜５０％Ｂ（ここで、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）；カラム，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２）５０×４．６ｍｍ；流量，２ｍＬ／分；検出，ＵＶ２１４ｎｍ；生成物の保持時間，６．２２分）。質量分析法を用いてさらに生成物の特性決定を行ったところ、Ｍ＋Ｈの予想値は１３７３、実測値は１３７８であった。
【０１２８】
２ｄ）ジスルフィド［Ｃｙｓ２−６］チオエーテルシクロ［ＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ２−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−ＰＥＧ−ＮＨ２の合成
【０１２９】
【化２８】
チオエーテルシクロ［ＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−(ＰＥＧ)ｎ−ＮＨ２を、アニソール（２００μＬ）、ＤＭＳＯ（２ｍＬ）及びＴＦＡ（１００ｍＬ）の溶液で６０分間処理した。次いで、ＴＦＡを真空中で除去し、ジエチルエーテルの添加でペプチドを沈殿させた。分取用ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μ Ｃ１８（２）２５０×２１．２０ｍｍカラム）により、４０分間で０〜３０％Ｂ（ここで、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）の勾配及び１０ｍＬ／分の流量を用いて７０ｍｇの粗物質の精製を行った。凍結乾燥後、４６ｍｇの純物質を得た（分析用ＨＰＬＣ：勾配，１０分間で０〜３０％Ｂ（ここで、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）；カラム，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２）５０×４．６ｍｍ；流量，２ｍＬ／分；検出，ＵＶ２１４ｎｍ；生成物の保持時間，６．８０分）。質量分析法を用いてさらに生成物の特性決定を行ったところ、Ｍ＋Ｈの予想値は１２５８．５、実測値は１２５８．８であった。
【０１３０】
２ｅ）ジスルフィド［Ｃｙｓ２−６］チオエーテルシクロ［ＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ（フルオレセイン）−Ｃｙｓ２−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ６−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−ＰＥＧ−ＮＨ２の合成
【０１３１】
【化２９】
３０ｍｇの［Ｃｙｓ２−６］シクロ［ＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ］−ＰＥＧ−ＮＨ２、１６．２ｍｇのフルオレセインＮＨＳエステル、及び４μＬのＮ−メチルモルホリンをＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解した。混合物を遮光し、１晩撹拌した。分取用ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ ２１８ＴＰ１０２２ Ｃ１８カラム）により、４０分間で２０〜３０％Ｂ（ここで、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）の勾配及び１０ｍＬ／分の流量を用いて反応混合物の精製を行った。凍結乾燥後、２１．６ｍｇの純物質を得た（分析用ＨＰＬＣ：勾配，１０分間で１０〜４０％Ｂ（ここで、Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ及びＢ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ）；カラム，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｃ１８（２）５０×４．６ｍｍ；流量，２ｍＬ／分；検出，ＵＶ２１４ｎｍ；生成物の保持時間，７．０分）。質量分析法を用いてさらに生成物の特性決定を行ったところ、Ｍ＋Ｈの予想値は１６１６．５、実測値は１６１６．３であった。
【０１３２】
実施例３：ＣＮＶのイメージング
実施例２の造影剤（造影剤Ｈ）を光学イメージング用造影剤として用いて、ラットにおける脈絡膜血管新生のイメージングを行った。
【０１３３】
本研究には、体重３５０〜４００ｇのＬｏｎｇ−Ｅｖａｎｓ色素沈着ラットを使用した。ラットをケタミン（１００μｌ／１００ｇ）の筋肉内注射で麻酔し、１％トロピカミド点眼薬及び０．１％フェニレフリン点眼薬を用いて散瞳した後、光凝固術及びペプチド血管造影検査を行った。ダイオードレーザー間接検眼鏡送達系を用いて、下記の条件下でラットの右眼に眼底の光凝固を施した。出力は９０ｍＷ、波長は８１０ｎｍ、持続時間は０．１秒、スポットサイズは７５μｍであった。各眼の視神経頭部の周囲に１６回のレーザー焼灼を施した。レーザー（ＩＲＩＳ Ｍｅｄｉｃａｌ社、ＯｃｕＬｉｇｈｔ（商標）、Ｓ／Ｎ２５７４５）を用いて、ブルーフ膜及び脈絡膜中に１０の病変を作った。各病変は半径方向パターンで視神経頭部から約１ｍｍの位置にあった。
【０１３４】
無菌水中の０．９％塩化ナトリウム溶液をビヒクルとして用いて投与溶液を調製した。適当量の造影剤を容器内に直接秤取し、適当な体積に合わせ、必要に応じて振り回すことで造影剤を溶解させた。かかる処方薬は室温で保存し、遮光し、振ってから投与し、毎日調製した。
【０１３５】
陰性対照：下記の化合物を陰性対照として使用した。陰性対照は造影剤Ｈと同じ分子量を有するが、ＲＧＤ配列を含まないのでインテグリンに対する親和性をもたない。陰性対照化合物は、血管新生に関連するレセプターに親和性をもたない。
【０１３６】
【化３０】
陰性対照：［Ｃｙｓ２−６］チオエーテルシクロ［ＣＨ２ＣＯ−Ｌｙｓ（フルオレセイン）−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ］−ＰＥＧ−ＮＨ２
造影剤溶液を静脈内注射（２００μｇ／ｋｇ）することで、レーザー処置後０日目から１４日目まで造影剤を用いた分子血管造影検査を行った。
【０１３７】
動物：
Ｈａｒｌａｎ社から供給されるＬｏｎｇ Ｅｖａｎｓ（系統）ラットを投与前に最低１週間環境順化させた。本研究のためには、全部で２７頭の雄及び０頭の雌を入手した。飼育のためには、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ固体底型ポリスルホンケージを個別に使用した。
【０１３８】
結果：
ＣＮＶ誘発後１時間目（レーザー処置後０日目）に、造影剤溶液（造影剤Ｈ又は陰性対照）を２０μｇ／ｋｇの投与量でラットに注射した。投与直後に画像を撮影した。
【０１３９】
画像は、陰性対照（図２）に比べて、造影剤Ｈ（図１）を注射したラットの眼の誘発病変に関する信号強度が増加していることを示している。イメージングシステムのパラメーターは、図１及び２に示す画像について同一であった。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】造影剤Ｈを注射したラットの眼の画像である。
【図２】陰性対照化合物を注射した眼の画像である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生に関連するレセプターに親和性を有するベクターを光学イメージング用レポーターに結合してなる造影剤を使用してヒト又は動物の身体の湿性加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）のイメージングを行う方法。
【請求項２】
ヒト又は動物の身体に造影剤を投与し、ヒト又は動物の身体の眼又は眼の一部に光を照射し、前記造影剤が分布した眼又は眼の一部の画像を形成することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
通常の検眼鏡検査、共焦点走査レーザー検眼鏡検査、インビボ共焦点顕微鏡検査、時間ドメイン及び周波数ドメインイメージング技術、並びに眼底カメラの使用からなる群から選択されるイメージング技術の使用で画像が形成される、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
ヒト又は動物の身体の眼又は眼の一部における血管新生レベルを評価することを含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
潜在ＡＭＤの検出のための、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記ベクターが、ＶＥＧＦレセプター、胎盤増殖因子レセプター及び繊維芽細胞増殖因子レセプター、血小板由来内皮細胞増殖因子、アンジオポエチン、並びにインテグリンからなる群から選択されるレセプターのいずれかに親和性を有する、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ベクターがインテグリンに対して親和性を有する、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記ベクターが、アンジオスタチン、エンドスタチン、バソスタチン、血小板第４因子及び抗トロンビンＩＩＩの開裂生成物、ＲＧＤトリペプチド配列の小分子非ペプチド模倣体、並びにアミノ酸配列Ｘ３−Ｇ−Ｄ（式中、Ｘ３はアルギニン、Ｎ−メチルアルギニン又はアルギニン模倣体を表し、Ｇはグリシンを表し、Ｄはアスパラギン酸を表す。）を含むペプチドからなる群から選択される、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
造影剤が下記の式（Ｘａ）で定義される、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
Ａ−Ｚ （Ｘａ）
（式中、Ａは下記の式（Ｘｂ）で定義され、Ｚは任意にはスペーサー基を介してＡのＸ１、Ｘ６又はＸ７の１以上に結合した１以上の光学イメージング用レポーターを表し、Ａは２つの環化架橋を含む。
Ｒａ−Ｃ(＝Ｏ)−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｄ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７
（Ｘｂ）
（式中、Ｘ３、Ｇ及びＤは請求項８に定義した通りであり、
ＲａはＸ２、Ｘ４又はＸ６に結合する架橋の一部をなす−(ＣＨ２)ｎ−又は−(ＣＨ２)ｎ−Ｃ６Ｈ４−基（式中、ｎは１〜１０の正の整数を表す。）を表し、
Ｘ１は結合或いは１、２、３、４又は５のアミノ酸残基を表していて、１以上のアミノ酸残基はスペーサー部分で任意に官能化されているか、或いは前記アミノ酸残基は官能性側鎖を有しており、
Ｘ２及びＸ４は独立に環化架橋を形成し得るアミノ酸残基を表し、
Ｘ５は疎水性アミノ酸又はその誘導体を表し、
Ｘ６は環化架橋を形成し得るアミノ酸残基を表し、
Ｘ７はスペーサー又はバイオモディファイアー部分を表すか、或いは存在しない。））
【請求項１０】
ＡＭＤを処置するための薬物によるヒト又は動物の身体の湿性ＡＭＤの治療効果を監視するための、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
光学イメージング用レポーターがフルオレセイン又はフルオレセイン誘導体或いはシアニン染料である、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
湿性ＡＭＤのイメージングで使用するためのコントラスト増強組成物の製造のための、血管新生に関連するレセプターに親和性を有するベクターを光学イメージング用レポーターに結合してなる造影剤の使用。
【請求項１３】
ベクターがアミノ酸配列Ｘ３−Ｇ−Ｄを含んでいて、ベクターと光学イメージング用レポーターとは結合しており、式中のＸ３はアルギニン、Ｎ−メチルアルギニン又はアルギニン模倣体を表し、Ｇはグリシンを表し、Ｄはアスパラギン酸又はその生理学的に許容し得る塩を表す、請求項１２記載の造影剤の使用。
【請求項１４】
血管新生に関連するレセプターに親和性を有するベクターを光学イメージング用レポーターに結合してなる造影剤を予め投与しておいたヒト又は動物の身体の眼の湿性ＡＭＤの画像を光学イメージングによって形成する方法。
【請求項１】
血管新生に関連するレセプターに親和性を有するベクターを光学イメージング用レポーターに結合してなる造影剤を使用してヒト又は動物の身体の湿性加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）のイメージングを行う方法。
【請求項２】
ヒト又は動物の身体に造影剤を投与し、ヒト又は動物の身体の眼又は眼の一部に光を照射し、前記造影剤が分布した眼又は眼の一部の画像を形成することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
通常の検眼鏡検査、共焦点走査レーザー検眼鏡検査、インビボ共焦点顕微鏡検査、時間ドメイン及び周波数ドメインイメージング技術、並びに眼底カメラの使用からなる群から選択されるイメージング技術の使用で画像が形成される、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
ヒト又は動物の身体の眼又は眼の一部における血管新生レベルを評価することを含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
潜在ＡＭＤの検出のための、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記ベクターが、ＶＥＧＦレセプター、胎盤増殖因子レセプター及び繊維芽細胞増殖因子レセプター、血小板由来内皮細胞増殖因子、アンジオポエチン、並びにインテグリンからなる群から選択されるレセプターのいずれかに親和性を有する、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ベクターがインテグリンに対して親和性を有する、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記ベクターが、アンジオスタチン、エンドスタチン、バソスタチン、血小板第４因子及び抗トロンビンＩＩＩの開裂生成物、ＲＧＤトリペプチド配列の小分子非ペプチド模倣体、並びにアミノ酸配列Ｘ３−Ｇ−Ｄ（式中、Ｘ３はアルギニン、Ｎ−メチルアルギニン又はアルギニン模倣体を表し、Ｇはグリシンを表し、Ｄはアスパラギン酸を表す。）を含むペプチドからなる群から選択される、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
造影剤が下記の式（Ｘａ）で定義される、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
Ａ−Ｚ （Ｘａ）
（式中、Ａは下記の式（Ｘｂ）で定義され、Ｚは任意にはスペーサー基を介してＡのＸ１、Ｘ６又はＸ７の１以上に結合した１以上の光学イメージング用レポーターを表し、Ａは２つの環化架橋を含む。
Ｒａ−Ｃ(＝Ｏ)−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｄ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７
（Ｘｂ）
（式中、Ｘ３、Ｇ及びＤは請求項８に定義した通りであり、
ＲａはＸ２、Ｘ４又はＸ６に結合する架橋の一部をなす−(ＣＨ２)ｎ−又は−(ＣＨ２)ｎ−Ｃ６Ｈ４−基（式中、ｎは１〜１０の正の整数を表す。）を表し、
Ｘ１は結合或いは１、２、３、４又は５のアミノ酸残基を表していて、１以上のアミノ酸残基はスペーサー部分で任意に官能化されているか、或いは前記アミノ酸残基は官能性側鎖を有しており、
Ｘ２及びＸ４は独立に環化架橋を形成し得るアミノ酸残基を表し、
Ｘ５は疎水性アミノ酸又はその誘導体を表し、
Ｘ６は環化架橋を形成し得るアミノ酸残基を表し、
Ｘ７はスペーサー又はバイオモディファイアー部分を表すか、或いは存在しない。））
【請求項１０】
ＡＭＤを処置するための薬物によるヒト又は動物の身体の湿性ＡＭＤの治療効果を監視するための、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
光学イメージング用レポーターがフルオレセイン又はフルオレセイン誘導体或いはシアニン染料である、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
湿性ＡＭＤのイメージングで使用するためのコントラスト増強組成物の製造のための、血管新生に関連するレセプターに親和性を有するベクターを光学イメージング用レポーターに結合してなる造影剤の使用。
【請求項１３】
ベクターがアミノ酸配列Ｘ３−Ｇ−Ｄを含んでいて、ベクターと光学イメージング用レポーターとは結合しており、式中のＸ３はアルギニン、Ｎ−メチルアルギニン又はアルギニン模倣体を表し、Ｇはグリシンを表し、Ｄはアスパラギン酸又はその生理学的に許容し得る塩を表す、請求項１２記載の造影剤の使用。
【請求項１４】
血管新生に関連するレセプターに親和性を有するベクターを光学イメージング用レポーターに結合してなる造影剤を予め投与しておいたヒト又は動物の身体の眼の湿性ＡＭＤの画像を光学イメージングによって形成する方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００８−５２６３５２（Ｐ２００８−５２６３５２Ａ）
【公表日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５０３２０（Ｐ２００７−５５０３２０）
【出願日】平成１８年１月６日（２００６．１．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＯ２００６／０００００５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７３３１４
【国際公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【出願人】（３９６０１９３８７）ジーイー・ヘルスケア・アクスイェ・セルスカプ (82)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月６日（２００６．１．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＯ２００６／０００００５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７３３１４
【国際公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【出願人】（３９６０１９３８７）ジーイー・ヘルスケア・アクスイェ・セルスカプ (82)
【Ｆターム（参考）】
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