免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導する蛋白質
【課題】 免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するヒト細胞由来の蛋白質並びにその蛋白質の製造方法及び感受性疾患剤としての用途を提供する。
【解決手段】Ｎ末端付近に特定のアミノ酸配列を有し、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するヒト細胞由来の蛋白質と、同蛋白質を産生し得るヒト細胞を増殖させ、増殖細胞から蛋白質を採取してなる蛋白質の製造方法と、有効成分として同蛋白質を含んでなる感受性疾患剤を要旨とする。
【解決手段】Ｎ末端付近に特定のアミノ酸配列を有し、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するヒト細胞由来の蛋白質と、同蛋白質を産生し得るヒト細胞を増殖させ、増殖細胞から蛋白質を採取してなる蛋白質の製造方法と、有効成分として同蛋白質を含んでなる感受性疾患剤を要旨とする。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、免疫担当細胞においてインターフェロン−γ（以下、「ＩＦＮ−γ」と略記する。）の産生を誘導するヒト細胞由来の蛋白質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ＩＦＮ−γは抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、免疫調節作用を有する蛋白質として知られ、抗原やマイトジェンによる刺激をうけた免疫担当細胞が産生すると云われている。これら生物作用故に、ＩＦＮ−γはその発見当初より抗腫瘍剤としての実用化が鶴首され、現在では脳腫瘍を始めとする悪性腫瘍一般の治療剤として精力的に臨床試験が進められている。現在入手し得るＩＦＮ−γは免疫担当細胞が産生する天然型ＩＦＮ−γと、免疫担当細胞から採取したＩＦＮ−γをコードするＤＮＡを大腸菌に導入してなる形質転換体が産生する組換え型ＩＦＮ−γに大別され、上記臨床試験においては、これらのうちのいずれかが「外来ＩＦＮ−γ」として投与されている。
【０００３】このうち、天然型ＩＦＮ−γは、通常、培養株化した免疫担当細胞をＩＦＮ−γ誘導剤を含む培養培地で培養し、その培養物を精製することにより製造される。この方法では、ＩＦＮ−γ誘導剤の種類がＩＦＮ−γの産生量や精製のし易さ、さらには、製品の安全性等に多大の影響を及ぼすと云われており、通常、コンカナバリンＡ、レンズ豆レクチン、アメリカヤマゴボウレクチン、エンドトキシン、リポ多糖などのマイトジェンが頻用される。しかしながら、これら物質はいずれも分子中に多様性があり、給源や精製方法に依って品質が変動し易く、誘導能の一定したＩＦＮ−γ誘導剤を所望量入手し難いという問題がある。くわえて、上記物質の多くは生体に投与すると顕著な副作用を示したり、物質に依っては毒性を示すものすらあり、生体に直接投与してＩＦＮ−γの産生を誘導するのが極めて困難であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】この発明は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する新規な蛋白質の発見に基づくものである。本発明者らが哺乳類の細胞が産生するサイトカインにつき研究していたところ、コリネバクテリウム死菌体とリポ多糖で予処理したマウスの肝臓中にＩＦＮ−γの産生を誘導する物質が存在することを見出した。カラムクロマトグラフィーを中心とする種々の方法を組合せてこの物質を単離し、その性質・性状を調べたところ、その本質は蛋白質であり、次のような理化学的性質を有していることが判明した。
（１） 分子量ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又はゲル濾過法で測定すると、分子量１９，０００±５，０００ダルトンを示す。
（２） 等電点クロマトフォーカシング法で測定すると、４．８±１．０に等電点を示す。
（３） 部分アミノ酸配列配列表における配列番号８及び９に示す部分アミノ酸配列を有する。
（４） 生物作用免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する。
【０００５】斯かる理化学的性質を有する蛋白質は未だ知られておらず、新規物質であると判断される。そこで、本発明者らが引続きマウス肝細胞を鋭意検索したところ、この蛋白質をコードするＤＮＡを単離するのに成功した。解読したところ、このＤＮＡは４７１塩基対からなり、配列表における配列番号１０に示すアミノ酸配列をコードしていることが判明した（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、メチオニン又はトレオニンを表わすものとする）。
【０００６】これら知見に基づき、ヒト肝細胞を引続き検索したところ、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するさらに別の新規物質をコードするＤＮＡが得られた。この物質の本質はポリペプチドであり、ＤＮＡを解読したところ、配列表における配列番号６に示すアミノ酸配列を含んでなることが判明した（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表わすものとする）。その後、このＤＮＡを大腸菌に導入し、発現させたところ、培養物中にポリペプチドが好収量で産生した。以上の知見は、同じ特許出願人による特開平８−２７１８９号公報及び特開平８−１９３０９８号公報に開示されている。また、同じ特許出願人による特願平７−７８３５７号明細書には、斯かるポリペプチドの感受性疾患剤としての用途が開示されている。ところが、一般に、医薬品に配合してヒトに投与する生理活性蛋白質はヒト細胞由来のものが望ましいところ、斯かるポリペプチドを産生し得るヒト細胞は未だ見出されていない。
【０００７】斯かる状況に鑑み、この発明の課題は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するヒト細胞由来の蛋白質を提供することにある。
【０００８】この発明の別の課題は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するヒト細胞由来の蛋白質の製造方法を提供することにある。
【０００９】この発明のさらに別の課題は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するヒト細胞由来の蛋白質の感受性疾患剤としての用途を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】この発明は、前記第一の課題を、Ｎ末端付近に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するヒト細胞由来の蛋白質により解決するものである。
【００１１】この発明は、前記第二の課題を、斯かる蛋白質を産生し得るヒト細胞を増殖させ、増殖細胞から蛋白質を採取してなる蛋白質の製造方法により解決するものである。
【００１２】この発明は、前記第三の課題を、有効成分として斯かる蛋白質を含んでなる感受性疾患剤により解決するものである。
【００１３】
【作用】この発明の蛋白質は、免疫担当細胞に単独又は適宜補因子とともに作用させると、ＩＦＮ−γの産生を誘導する。
【００１４】ヒト細胞由来の斯かる蛋白質は、ヒト細胞を用いるこの発明の製造方法により、所望量を比較的容易に製造することができる。
【００１５】この発明の感受性疾患剤は、ヒトに投与すると、ヒト体内の免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導し、ＩＦＮ−γ感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。当該蛋白質がキラー細胞による細胞障害性の増強又はキラー細胞の生成を誘導する性質を兼備するときには、悪性腫瘍を始めとする難治性疾患の治療に効果を発揮する。
【００１６】
【発明の実施の形態】以下、この発明の実施の形態につき説明するに、この発明でいう蛋白質とは、Ｎ末端付近に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチド及び糖蛋白質全般を意味する。ヒト細胞の種類や増殖条件にも依るが、この発明の蛋白質はＮ末端及びＣ末端付近にそれぞれ配列表における配列番号１及び３に示すアミノ酸配列を有し、中間部に配列表における配列番号４乃至５に示すアミノ酸配列を介して、全体として配列表における配列番号６に示すアミノ酸配列を含んでなることがある（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表わすものとする）。そして、還元剤存在下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定すると、分子量１４，０００乃至２４，０００ダルトン、通常、１８，０００乃至１９，５００ダルトンに相当する位置に蛋白質のバンドを示す。ヒト細胞の種類や増殖条件に依っては、配列表における配列番号１及び３に示すＮ末端及び／又はＣ末端付近のアミノ酸配列にアミノ酸がさらに１個又は２個以上付加したり、それらＮ末端及び／又はＣ末端付近のアミノ酸配列におけるアミノ酸が１個又は２個以上欠失することがあるが、斯かるアミノ酸配列を有する蛋白質であっても、それがヒト細胞に由来し、免疫担当細胞において単独又は適宜補因子と協働してＩＦＮ−γの産生を誘導するかぎり、すべてこの発明の蛋白質に包含されるものとする。
【００１７】斯かる蛋白質は、ヒト細胞を用いるこの発明の製造方法により製造することができる。ヒト細胞としては、通常、リンパ芽球、リンパ球、単芽球、単球、骨髄芽球、骨髄球、顆粒球、マクロファージなどのヒト造血系細胞や、例えば、肺癌、大腸癌、結腸癌、類表皮癌などの固形腫瘍由来の細胞株が用いられ、個々の細胞株としては、例えば、顎下腺類表皮癌由来の上皮様細胞株であるＡ−２５３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ４１）や、ジュン・ミノワダ『キャンサー・レビュー』、第１０巻、１乃至１８頁（１９８８年）などに記載されている骨髄性白血病、前骨髄性白血病、単球性白血病、成人Ｔ細胞白血病及びヘアリー細胞白血病を含む白血病又はリンパ腫由来のＨＢＬ−３８細胞、ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４０）、Ｋ−５６２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４３）、ＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４６）、Ｍｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ８０６６）、ＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ２０２）、Ｕ−９３７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９３）などの白血病細胞株及びそれらの変異株が挙げられる。これら細胞株はいずれも増殖容易であり、しかも、当該蛋白質の産生能が高いので、この発明の製造方法を有利に適用できる。殊に、Ａ−２５３細胞を始めとする上皮様細胞株や、ＨＢＬ−３８細胞、ＨＬ−６０細胞、ＫＧ−１細胞、ＴＨＰ−１細胞及びＵ−９３７細胞を始めとするヒト骨髄単球系細胞株は当該蛋白質の産生能が抜きん出て高く、この発明の製造方法を実施するうえで極めて有用である。
【００１８】この発明の製造方法においては、斯かるヒト細胞を増殖させ、得られる増殖細胞から目的とする蛋白質を採取する。ヒト細胞を増殖させる方法に特に制限はなく、通常一般の生体外又は生体内の方法を適用すればよい。生体外の方法とは培養培地を用いて増殖させる方法をいい、ヒト細胞を、例えば、ウシ胎児血清を０．３乃至３０％（ｗ／ｖ）程度補足したＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥ培地などの動物細胞を増殖させるための斯界における慣用の培養培地に細胞密度約１×１０4 乃至１×１０7 個／ｍｌ、望ましくは、約１×１０5 乃至１×１０6 個／ｍｌになるように浮遊させ、培養培地を適宜新鮮なものと取換えつつ、ｐＨ７乃至８、望ましくは、ｐＨ７．２乃至７．４、温度３６乃至３８℃、望ましくは、３７℃前後で約１日乃至１週間培養する。そして、培養物から増殖細胞を分離し、目的とする蛋白質を採取する。なお、ヒト細胞の種類や培養条件に依っては、培養中、産生した当該蛋白質が細胞外に放出されることがある。すなわち、ヒト細胞において当該蛋白質の産生を誘導し得る、例えば、マイトジェンやＩＦＮ−γなどの誘導剤を培養培地に共存させるときには、産生した当該蛋白質の一部又は全部が細胞外に分泌されることがあり、この場合には、培養上清からも当該蛋白質を採取できる。
【００１９】一方、ヒト以外の温血動物を利用する生体内の方法により増殖させるには、通常、マウス、ヌードマウス、ラット、ヌードラット、モルモット、ハムスターなどの齧歯類の新生児にウサギ由来の抗胸腺抗体などを注射して免疫反応を減弱させた後、ヒト細胞を動物１匹当たり約１×１０5乃至１×１０8個皮下又は腹腔内に注射移植するか、あるいは、これら温血動物の成長個体の体外又は体内に設けられ、動物の栄養体液が環流可能な拡散チェンバーなどの容器内にヒト細胞を収容し、その後、通常一般の方法により動物を約２乃至１０週間飼育する。この飼育の間、移植したヒト細胞は温血動物の体液を利用しながら増殖する。増殖細胞は細胞塊、腹水又は細胞浮遊液として採取され、必要に応じて、これを適宜分散媒中で分散・洗浄した後、目的とする蛋白質を採取する。生体内の増殖方法は、生体外の増殖方法と比較して、より少ないコストと労力で短時間に所望量の増殖細胞の得られる利点がある。なお、生体内の増殖方法は、例えば、特公昭５６−５４１５８号公報などにも詳述されている。
【００２０】増殖細胞から当該蛋白質を採取するには、増殖細胞を一旦分離するか培養上清とともに超音波を印加するか、ホモゲナイズ、凍結融解、あるいは、低張媒体中に浸漬するなどして破砕し、得られる破砕物又は破砕物と培養上清との混合物から当該蛋白質を採取すればよい。斯かる破砕物又は混合物から当該蛋白質を採取するには、必要に応じて、３７℃前後で１乃至２４時間インキュベートした後、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動及び／又は等電点電気泳動などの生理活性蛋白質を精製するための斯界における慣用の方法を適用すればよく、これらは適宜組合せて適用される。そして、最終使用形態に応じて、採取した蛋白質を濃縮・凍結乾燥して液状又は固状とする。なお、同じ特許出願人による特願平７−５８２４０号明細書に開示されたモノクローナル抗体は当該蛋白質の精製に極めて有用であり、このモノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーによるときには、高純度の当該蛋白質を最少のコストと労力で得ることができる。
【００２１】前述のとおり、この発明の蛋白質は免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する性質を有する。この性質により、この発明の蛋白質は細胞培養法によりＩＦＮ−γを製造する際の誘導剤として、さらには、ＩＦＮ−γに感受性を有する、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）や尖圭コンジロムなどのウイルス性疾患、悪性腎腫瘍、肉芽腫、菌状息肉症、脳腫瘍などの悪性腫瘍、関節リウマチやアレルギー症などの免疫疾患に対する治療剤・予防剤として有用である。
【００２２】この発明の蛋白質は、通常、免疫担当細胞を培養してＩＦＮ−γを製造するための培養培地に共存させるか、ＩＦＮ−γ感受性疾患の治療・予防のためにヒトに投与される。すなわち、前者の用途においては、哺乳類の末梢血から分離される白血球や、例えば、ＨＢＬ−３８細胞、Ｍｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ８０６６）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ８１６３）、ＨｕＴ７８細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ１６１）、ＥＬ４細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ３９）、Ｌ１２−Ｒ４細胞などの培養株化した免疫担当細胞又はその変異株をこの発明の蛋白質を１ｍｌ当たり約０．１ｎｇ乃至１μｇ、望ましくは、約１乃至１００ｎｇ含む適宜の培養培地に浮遊させる。必要に応じて、培養培地にマイトジェンやインターロイキン２、抗ＣＤ３抗体などのＴ細胞刺激物質を加え、培養培地を適宜新鮮なものと取換えながら、通常一般の方法により約１乃至１００時間培養する。斯くして得られる培養物にＩＦＮ−γを精製するための慣用の方法、すなわち、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの１種又は２種以上を適宜組合せて適用することにより、ＩＦＮ−γを採取することができる。
【００２３】さらに、この発明の蛋白質はヒトの免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導することから、有効成分として当該蛋白質を含んでなる感受性疾患剤は、ヒトに投与すると、体内の免疫担当細胞がＩＦＮ−γを産生するのを促し、ＩＦＮ−γ感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。また、後記実験例及び実施例に例示する蛋白質のように、蛋白質が免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する性質に加えて、ＮＫ細胞やＬＡＫ細胞（リンホカイン活性化キラー細胞）、細胞障害性Ｔ細胞などのキラー細胞による細胞障害性の増強又はキラー細胞の生成を誘導する性質を兼備するときには、キラー細胞も感受性疾患の治療・予防に関与することとなる。したがって、この発明でいう感受性疾患とは、ＩＦＮ−γ感受性疾患を含む、ＩＦＮ−γ及び／又はキラー細胞が直接又は間接に関与して治療及び／又は予防し得る疾患一般を意味するものとし、具体的には、例えば、肝炎、ヘルペス症、尖圭コンジロム、ＡＩＤＳなどのウイルス性疾患、カンジダ症、マラリヤ症、クリプトコックス症、エルシニア症などの感染症、悪性腎腫瘍、菌状息肉症、慢性肉芽腫などの固形悪性腫瘍、成人Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、悪性リンパ腫などの血球系悪性腫瘍、さらには、アレルギー症、リウマチなどの免疫疾患を挙げることができる。また、インターロイキン３と併用するときには、白血病、骨髄腫、さらには、悪性腫瘍を治療する際の放射線照射や化学療法剤の投与に伴なう白血球減少症や血小板減少症の完治又は緩解にも効果を発揮する。
【００２４】斯くして、この発明の感受性疾患剤は、上記のごとき感受性疾患を治療・予防するための抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、免疫疾患剤、血小板増多剤、白血球増多剤などとして多種多様な用途を有することとなる。剤型並びに感受性疾患の種類及び症状にも依るが、この発明の感受性疾患剤は、通常、液状、ペースト状又は固形状に調製され、当該蛋白質を０．０００００１乃至１００％（ｗ／ｗ）、望ましくは、０．０００１乃至０．１％（ｗ／ｗ）含んでなる。
【００２５】この発明の感受性疾患剤は当該蛋白質単独の形態はもとより、当該蛋白質とそれ以外の生理的に許容される、例えば、担体、賦形剤、希釈剤、免疫助成剤、安定剤、さらには、必要に応じて、他の生理活性物質の１種又は２種以上との組成物としての形態をも包含する。安定剤としては、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、トレハロース及びマルトースなどが、また、併用し得る他の生理活性物質としては、例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン１２、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、カルボコン、シクロホスファミド、アクラルビシン、チオテパ、ブスルファン、アンシタビン、シタラビン、フルオロウラシル、テトラヒドロフリルフルオロウラシル、メトトレキセート、アクチノマイシンＤ、クロモマイシンＡ3 、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、金コロイド、クレスチン、ピシバニール、レンチナン及び丸山ワクチンなどが挙げられる。このうち、インターロイキン２との併用は、インターロイキン２がこの発明の蛋白質が免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する際の補因子として機能するので特に有利である。天然型又は組換え型ヒトインターロイキン２を併用することにより、当該蛋白質単独ではＩＦＮ−γを産生し難い免疫担当細胞においても所期のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。また、インターロイキン１２と併用するときには、当該蛋白質又はインターロイキン１２単独では容易に達成し得ない、極めて高レベルのＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。しかも、当該蛋白質は、ヒト体内におけるインターロイキン１２によるイムノグロブリンＥ抗体の産生阻害を高めるので、イムノグロブリンＥ抗体の産生を主因とする、例えば、アトピー性喘息、アトピー性気管支喘息、枯草熱、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、血管性浮腫、アトピー性消化器異常を始めとするアトピー性疾患を治療するための免疫疾患剤においても極めて有用である。なお、ヒトの体内には、微量ではあるが、インターロイキン１２が存在することがあるので、斯かる場合には、当該蛋白質のみを投与すれば所期の治療効果が達成できる。
【００２６】さらに、この発明の感受性疾患剤は、投薬単位形態の薬剤をも包含し、その投薬単位形態の薬剤とは、当該蛋白質を、例えば、１回当たりの用量又はその整数倍（４倍まで）若しくはその約数（１／４０まで）に相当する量を含んでなり、投薬に適する物理的に一体の剤型にある薬剤を意味する。このような投薬単位形態の薬剤としては、注射剤、液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、点眼剤、点鼻剤、坐剤などが挙げられる。
【００２７】この発明の感受性疾患剤は経口的に投与しても非経口的に投与しても、また、以下に述べるように抗腫瘍細胞などを体外で活性化させる場合に用いてもよく、いずれの場合にも、感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。感受性疾患の種類や症状にも依るが、具体的には、患者の症状や投与後の経過を観察しながら、成人当たり約０．１μｇ乃至５０ｍｇ／回、望ましくは、約１μｇ乃至１ｍｇ／回の蛋白質を１乃至４回／日又は１乃至５回／週の用量で１日乃至１年間に亙って経口投与するか、皮内、皮下、筋肉内又は静脈内に非経口投与すればよい。
【００２８】この発明の感受性疾患剤は、インターロイキン２を用いる、いわゆる「抗腫瘍免疫療法」にも有用である。抗腫瘍免疫療法は、一般に、（ｉ）悪性腫瘍患者の体内に直接インターロイキン２を投与する方法と、（ｉｉ）インターロイキン２により生体外で活性化させた抗腫瘍細胞を患者の体内に移入する方法（養子免疫療法）に大別されるが、当該蛋白質を併用するときには、その効果を有意に高めることができる。具体的には、前記（ｉ）の方法の場合、患者にインターロイキン２を投与するのと同時又は事前に当該蛋白質を成人当たり約０．１μｇ乃至１ｍｇ／回の用量で１乃至１０回投与する。インターロイキン２の投与量は、悪性腫瘍の種類、患者の症状及び蛋白質の用量にも依るが、通常、成人当たり約１０，０００乃至１，０００，０００単位／回とする。一方、前記（ｉｉ）の方法の場合には、悪性腫瘍患者から採取した単核球又はリンパ球をインターロイキン２の存在下で培養するに当たり、それら血球１×１０6 個当たり当該蛋白質を約０．１ｎｇ乃至１μｇ共存させておく。そして、一定時間培養後、培養物からＮＫ細胞又はＬＡＫ細胞を採取し、これを元の患者に移入するのである。この発明による抗腫瘍免疫療法の対象となり得る疾患としては、例えば、結腸癌、直腸癌、大腸癌、胃癌、甲状腺癌、舌癌、膀胱癌、絨毛癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、喉頭癌、肺癌、乳癌、悪性黒色腫、カポジ肉腫、脳腫瘍、神経芽細胞腫、卵巣腫瘍、睾丸腫瘍、骨肉腫、膵臓癌、悪性腎腫瘍、副腎腫、血管内皮腫などの固形悪性腫瘍や白血病、悪性リンパ腫などの血球系悪性腫瘍が挙げられる。
【００２９】次に、この発明の蛋白質につき、実験例を挙げて説明する。
【００３０】
【実験例１】
＜蛋白質の調製＞常法により、生後間もないハムスターの新生児にウサギ由来の抗胸腺抗血清を注射して免疫反応を減弱させた後、ハムスターの背部皮下にヒト急性単球性白血病由来の骨髄単球系細胞株の一種であるＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ２０２）を約５×１０5 個／匹注射移植し、通常一般の方法で３週間飼育した。そして、皮下に生じた腫瘍塊（約１５ｇ／匹）を摘出し、常法により生理食塩水中で分散させた後、燐酸食塩緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と云う。）で洗浄した。
【００３１】得られた増殖細胞をマシュー・ジェー・コスラら『プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユー・エス・エー』、第８６巻、５，２２７乃至５，２３１頁（１９８９年）に記載された方法に準じて１０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩を含む１０倍容の氷冷２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄し、３倍容の新鮮な同一緩衝液中、氷冷下で２０分間静置し、−８０℃で凍結後、解凍して細胞を破砕した。破砕物を遠心分離し、上清を予め１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）で平衡化させておいたファルマシア製イオン交換クロマトグラフィー用ゲル『ＤＥＡＥ−セファロース』のカラムに負荷し、カラムを１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）で洗浄後、塩化ナトリウム濃度が０Ｍから０．５Ｍまで段階的に上昇する１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）を通液し、塩化ナトリウム濃度が０．２Ｍ付近で溶出した画分を採取した。
【００３２】この画分を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）に対して透析後、予め１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化させておいたトーソー製イオン交換クロマトグラフィー用ゲル『ＤＥＡＥ ５ＰＷ』のカラムに負荷し、０Ｍから０．５Ｍに直線的に上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）を通液し、塩化ナトリウム濃度が０．２乃至０．３Ｍ付近で溶出した画分を採取した。
【００３３】この新たに得られた画分を合一し、ＰＢＳに対して透析する一方、同じ特許出願人による特願平７−５８２４０号明細書に記載された方法にしたがってモノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィー用ゲルを調製し、プラスチック製円筒管内部にカラム状に充填し、ＰＢＳで洗浄後、上記透析内液をカラムに負荷した。カラムに１００ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）を通液し、得られる溶出画分から免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質を含む画分を採取し、滅菌蒸留水に対して透析し、膜濾過により濃縮後、凍結乾燥して精製蛋白質の固状物を得た。収量は、ハムスター１匹当たり約５０ｎｇであった。
【００３４】
【実験例２】
＜分子量＞実験例１の方法により得た精製蛋白質をユー・ケー・レムリが『ネイチャー』、第２２７巻、６８０乃至６８５頁（１９７０年）に報告している方法に準じ、還元剤としての２％（ｗ／ｖ）ジチオトレイトール存在下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、分子量１８，０００乃至１９，５００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ誘導能ある蛋白質の主バンドが観察された。なお、このときの分子量マーカは、ウシ血清アルブミン（６７，０００ダルトン）、オボアルブミン（４５，０００ダルトン）、カーボニックアンヒドラーゼ（３０，０００ダルトン）、大豆トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）及びα−ラクトアルブミン（１４，４００ダルトン）であった。
【００３５】
【実験例３】
＜Ｎ末端付近のアミノ酸配列及びペプチド・マッピング＞
【００３６】
【実験例３−１】
＜Ｎ末端付近のアミノ酸配列＞パーキン・エルマー製プロテイン・シーケンサ『４７３Ａ型』を使用し、常法にしたがって分析したところ、実験例１の方法により得た精製蛋白質はＮ末端付近に配列表における配列番号１、詳細には、配列番号２に示すアミノ酸配列を有していた。
【００３７】
【実験例３−２】
＜ペプチド・マッピング＞実験例１の方法により得た精製蛋白質を適量の滅菌蒸留水に溶解し、溶液を予め０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液により平衡化させておいた昭和電工製高速液体クロマトグラフィー用ゲル『アサヒパックＣ４Ｐ−５０ ４Ｅ』のカラムに負荷し、カラムを０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液により洗浄した後、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含み、アセトニトリルの濃度が０％（ｖ／ｖ）から９０％（ｖ／ｖ）に直線的に上昇するトリフルオロ酢酸／アセトニトリル／水混液を６０ｍｌ／時間の流速で通液した。溶出画分から免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質を含む画分を採取し、１Ｍトリス水溶液（ｐＨ１１．２）により中和し、常法にしたがって濃縮し、アセトニトリルを除去する一方、別途、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）にシグマ製クロストリパイン剤を適量溶解し、この溶液に濃縮蛋白質を対クロストリパインのモル比で約５０倍加え、ｐＨを８乃至９に保ちつつ、３７℃で１２時間反応させて蛋白質のペプチド断片を含む反応物を得た。
【００３８】この反応物を予め０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液により平衡化させておいたトーソー製高速液体クロマトグラフィー用ゲル『ＯＤＳ−１２０Ｔ』のカラムに負荷し、カラムを０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液により洗浄した後、溶出画分中のペプチド濃度を波長２１４ｎｍにおける吸光度によりモニタしながら、０．０９％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含み、アセトニトリルの濃度が０％（ｖ／ｖ）から７０％（ｖ／ｖ）まで直線的に上昇するトリフルオロ酢酸／アセトニトリル／水混液を３０ｍｌ／時間の流速で通液した。このとき得られたペプチド・マップを図１に示す。
【００３９】図１のペプチド・マップにおいて、溶出開始から約５９分、約６２分及び約６８分後に溶出したペプチド断片（以下、それぞれ「ペプチド断片１」、「ペプチド断片２」及び「ペプチド断片３」と云う。）をそれぞれ別々に採取し、そのアミノ酸配列をパーキン・エルマー製プロテイン・シーケンサ『４７３Ａ型』を使用し、常法にしたがって分析した。その結果、ペプチド断片１及び２は、それぞれ、配列表における配列番号３及び７に示すアミノ酸配列を、また、ペプチド断片３は配列表における配列番号４及び５に示すアミノ酸配列を有することが判明した。これらアミノ酸配列と配列表における配列番号６に示すアミノ酸配列を比較したところ、ペプチド断片１乃至３のアミノ酸配列は、その配列番号６に示すアミノ酸配列におけるそれぞれ第１４８乃至１５７番目、第１乃至１３番目及び第４５乃至５８番目若しくは第８０乃至９６番目に相当することが判明した。したがって、ペプチド断片１及び２は分析に供した蛋白質におけるそれぞれＣ末端及びＮ末端フラグメントに、また、ペプチド断片３はその蛋白質における中間部フラグメントに相当すると判断された。
【００４０】これらの結果と精製蛋白質がＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において分子量約１８，０００乃至１９，５００ダルトンに相当する位置に蛋白質の主バンドを示すという実験例２の知見、さらには、配列表における配列番号６に示すアミノ酸配列から計算される分子量が１８，１９９ダルトンであることを総合的に判断すると、実験例１の方法により得た精製蛋白質は配列表における配列番号６に示すアミノ酸配列を含んでなると結論される。
【００４１】
【実験例４】
＜生物作用＞
【００４２】
【実験例４−１】
＜免疫担当細胞におけるＩＦＮ−γの産生＞ヘパリン加注射器により健常者から血液を採取し、血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）により２倍希釈した。血液をファルマシア製フィコール上に重層し、遠心分離して採取したリンパ球を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）により洗浄した後、新鮮な同一培地に細胞密度５×１０6 個／ｍｌになるように浮遊させ、９６ウェルマイクロプレートに０．１５ｍｌ／ウェルずつ分注した。
【００４３】別途、実験例１の方法により得た精製蛋白質を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）により適宜濃度に希釈して上記マイクロプレートに０．０５ｍｌ／ウェルずつ分注し、２．５μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ又は５０単位／ｍｌ組換え型ヒトインターロイキン２を含むか含まない新鮮な同一培地を０．０５ｍｌ／ウェル加えた後、５％ＣＯ2 インキュベータ中、３７℃で２４時間培養した。培養後、各ウェルから培養上清を０．１ｍｌずつ採取し、通常の酵素免疫測定法によりＩＦＮ−γを測定した。同時に、精製蛋白質のみを省略した系を設け、上記と同様に処置して対照とした。結果を表１に示す。なお、表１中のＩＦＮ−γ含量は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）から入手したＩＦＮ−γ標品（Ｇｇ２３−９０１−５３０）に基づき国際単位（ＩＵ）に換算している。
【００４４】
【表１】
【００４５】表１の結果は、当該蛋白質を作用させると、免疫担当細胞としてのリンパ球がＩＦＮ−γを産生したことを示している。また、表１の結果に見られるように、このＩＦＮ−γ産生は、補因子としてインターロイキン２又はコンカナバリンＡを共存させると、一段と高まる。
【００４６】
【実験例４−２】
＜ＮＫ細胞による細胞障害性の増強＞ヘパリン加注射器により健常者から血液を採取し、ＰＢＳにより２倍希釈した。血液をフィコール上に重層し、遠心分離して高密度リンパ球を得た。
【００４７】このリンパ球を細胞密度１×１０6 個／ｍｌになるように１０μｇ／ｍｌカナマイシン、５×１０-5Ｍ ２−メルカプトエタノール及び１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）に浮遊させ、１２ウェルマイクロプレートに０．５ｍｌ／ウェルずつ分注した。そして、実験例１の方法により得た精製蛋白質を新鮮な同一培地に適宜希釈してマイクロプレートに１．５ｍｌ／ウェルずつ加え、さらに、５０単位／ｍｌ組換え型ヒトインターロイキン２を含むか含まない新鮮な同一培地を０．５ｍｌ／ウェル加えた後、５％ＣＯ2インキュベータ中、３７℃で２４時間培養し、ＰＢＳで洗浄して効果細胞としてのＮＫ細胞を含む培養リンパ球を得た。
【００４８】別途、常法により51Ｃｒ標識したＮＫ細胞感受性標的細胞としてのヒト慢性骨髄性白血病由来のＫ−５６２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４３）を９６ウェルマイクロプレートに１×１０4 個／ウェルずつとり、上記で調製した効果細胞を効果細胞／標的細胞比で２．５：１、５：１又は１０：１の割合で加え、５％ＣＯ2インキュベータ中、３７℃で４時間培養した後、常法にしたがって培養上清の放射能を測定して死滅標的細胞数を求めた。そして、各々の系につき、試験に供した標的細胞数に対する死滅標的細胞数の百分率（％）を計算し、細胞障害性の目安とした。結果を表２に示す。
【００４９】
【表２】
【００５０】表２の結果は、当該蛋白質にＮＫ細胞による細胞障害性を増強する性質のあることを示している。また、表２の結果に見られるように、この細胞障害性の増強は、インターロイキン２が共存すると、一段と増強される。
【００５１】
【実験例４−３】
＜ＬＡＫ細胞の生成誘導＞常法により51Ｃｒ標識したＮＫ細胞非感受性標的細胞としてのヒトバーキットリンパ腫由来のＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８６）を９６ウェルマイクロプレートに１×１０4 個／ウェルずつとり、７２時間培養した以外は実験例４−２と同様にして調製した効果細胞としてのＬＡＫ細胞を含む培養リンパ球を効果細胞／標的細胞比で５：１、１０：１又は２０：１の割合で加え、５％ＣＯ2 インキュベータ中、３７℃で４時間培養した後、常法にしたがって培養上清の放射能を測定した。その後、実験例４−２と同様にして細胞障害性（％）を計算した。結果を表３に示す。
【００５２】
【表３】
【００５３】表３の結果は、当該蛋白質にＬＡＫ細胞の生成を誘導する性質のあることを示している。また、表３の結果に見られるように、この誘導は、インターロイキン２が共存すると、一段と増強される。
【００５４】
【実験例５】
＜急性毒性試験＞常法にしたがって、８週齢のマウスに実験例１の方法により得た精製蛋白質を経皮、経口又は腹腔内に注射投与した。その結果、精製蛋白質のＬＤ５０は、いずれの投与経路によっても約１ｍｇ／ｋｇ以上であった。このことは、当該蛋白質がヒトに投与する医薬品に配合して安全であることを裏付けている。
【００５５】周知のように、ＩＦＮ−γはウイルス、細菌などに対する感染防御、悪性腫瘍の増殖抑制、免疫機能の調節作用を通じてヒトの生体防御、さらには、イムノグロブリンＥ抗体の産生阻害に多大の関与をしている。前述のとおり、ＩＦＮ−γはヒトの感受性疾患剤としてすでに実用化されており、その対象疾患、用量、用法及び安全性はほぼ確立している。一方、フランセス・アール・バークウィル著、渡部好彦訳、『サイトカインとがん治療』、１９９１年、東京化学同人発行などにも記載されているように、ＮＫ細胞及びＬＡＫ細胞などのキラー細胞を利用する療法は、抗腫瘍免疫療法を始めとして、多種多様のヒト疾患に対して試みられ、総じて良好な成果が報告されている。最近では、サイトカインを用いるキラー細胞による細胞障害性の増強又はキラー細胞の生成の誘導と治療効果との関連性が注目されており、例えば、ティー・フジオカら『ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ユーロロジー』、第７３巻、第１号、２３乃至３１頁（１９９４年）には、ＬＡＫ細胞とインターロイキン２を併用する抗腫瘍免疫療法において、インターロイキン２がＬＡＫ細胞の生成を顕著に誘導し、重篤な毒性や副作用を惹起することなく、ヒトの転移癌に格別の効果を発揮したと報告されている。
【００５６】このように、多種多様のヒト疾患の治療・予防にＩＦＮ−γやキラー細胞が深く係わり、その完治又は緩解への多大の寄与が明らかになっている。斯かる状況において、実験例４乃至５の結果に見られるように、当該蛋白質が顕著な毒性を示すことなく、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するとともに、ＮＫ細胞による細胞障害性の増強又はＬＡＫ細胞の生成を誘導したことは、この発明の感受性疾患剤が重篤な副作用を惹起することなくヒトに長期間連用でき、ＩＦＮ−γ及び／又はキラー細胞が関与する疾患の治療・予防に効果を発揮することを示している。
【００５７】以下、この発明の実施の形態につき、実施例を挙げて具体的に説明する。なお、実施例Ａ−１乃至Ａ−８にはこの発明による蛋白質の製造方法の実施形態が、また、実施例Ｂ−１乃至Ｂ−６にはこの発明の感受性疾患剤の実施形態が例示されている。
【００５８】
【実施例Ａ−１】
＜蛋白質の製造＞常法により、生後間もないハムスターの新生児にウサギ由来の抗胸腺抗血清を注射して免疫反応を減弱させた後、ハムスターの背部皮下にヒト急性単球性白血病由来の骨髄単球系細胞株の一種であるＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ２０２）を約５×１０5 個／匹注射移植し、通常一般の方法で３週間飼育した。そして、皮下に生じた腫瘍塊（約１５ｇ／匹）を摘出し、常法により生理食塩水中で分散させた後、ＰＢＳで洗浄した。
【００５９】得られた増殖細胞をマシュー・ジェー・コスラら『プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユー・エス・エー』、第８６巻、５，２２７乃至５，２３１頁（１９８９年）に記載された方法に準じて１０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩を含む１０倍容の氷冷２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄し、３倍容の新鮮な同一緩衝液中、氷冷下で２０分間静置し、−８０℃で凍結後、解凍して細胞を破砕した。破砕物を遠心分離し、上清を予め１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）で平衡化させておいたファルマシア製イオン交換クロマトグラフィー用ゲル『ＤＥＡＥ−セファロース』のカラムに負荷し、カラムを１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）で洗浄後、塩化ナトリウム濃度が０Ｍから０．５Ｍまで段階的に上昇する１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）を通液し、塩化ナトリウム濃度が０．２Ｍ付近で溶出した画分を採取した。
【００６０】この画分を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）に対して透析後、予め１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化させておいたトーソー製イオン交換クロマトグラフィー用ゲル『ＤＥＡＥ ５ＰＷ』のカラムに負荷し、０Ｍから０．５Ｍに直線的に上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）を通液し、塩化ナトリウム濃度が０．２乃至０．３Ｍ付近で溶出した画分を採取した。
【００６１】この新たに得られた画分を合一し、ＰＢＳに対して透析する一方、同じ特許出願人による特願平７−５８２４０号明細書に記載された方法にしたがってモノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィー用ゲルを調製し、プラスチック製円筒管内部にカラム状に充填し、ＰＢＳで洗浄後、上記透析内液をカラムに負荷した。カラムに１００ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）を通液し、得られる溶出画分から免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質を含む画分を採取し、滅菌蒸留水に対して透析し、膜濾過により濃縮後、凍結乾燥して精製蛋白質の固状物を得た。収量は、ハムスター１匹当たり約５０ｎｇであった。
【００６２】
【実施例Ａ−２】
＜蛋白質の製造＞生後間もないヌードマウス新生児の背部皮下にヒト急性骨髄性白血病由来の骨髄単球系細胞株の一種であるＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４６）を約１×１０6 個／匹注射移植し、通常一般の方法で４週間飼育した。皮下に生じた腫瘍塊（約２０ｇ／匹）を摘出し、常法により生理食塩水中で分散させ、得られた増殖細胞を洗浄し、実施例Ａ−１と同様にして破砕し、破砕物を精製したところ、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する精製蛋白質がヌードマウス１匹当たり約２０ｎｇ得られた。
【００６３】その後、精製蛋白質の一部をとり、実験例２乃至４の方法に準じて分析したところ、精製蛋白質はＮ末端付近に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、実験例１の蛋白質と同様の分子量、生物作用を示した。
【００６４】
【実施例Ａ−３】
＜蛋白質の製造＞孔径０．５ミクロンのメンブランフィルターを取付けた内容量約１０ｍｌのプラスチック製円筒型拡散チェンバー内にＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）でヒト急性前骨髄性白血病由来の骨髄単球系細胞株の一種であるＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４０）を浮遊させ、成長ラットの腹腔内に埋設した。この状態でラットを通常一般の方法で４週間飼育した後、拡散チェンバーを取出した。拡散チェンバーから増殖細胞を採取し、生理食塩水で洗浄後、実施例Ａ−１と同様にして破砕し、破砕物を精製したところ、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する精製蛋白質がラット１匹当たり約２０ｎｇの収量で得られた。
【００６５】その後、精製蛋白質の一部をとり、実験例２乃至４の方法に準じて分析したところ、精製蛋白質はＮ末端付近に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、実験例１の蛋白質と同様の分子量、生物作用を示した。
【００６６】
【実施例Ａ−４】
＜蛋白質の製造＞ヒト急性単球性白血病由来の骨髄単球系細胞株の一種であるＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ２０２）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）に細胞密度約３×１０5 個／ｍｌになるように浮遊させ、培養培地を新鮮なものと取換えながら、１０％ＣＯ2 インキュベータ中、３７℃で３週間培養した。培養物から増殖細胞を分離し、生理食塩水で洗浄後、実施例Ａ−１と同様にして破砕し、破砕物を精製したところ、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する精製蛋白質が培養物１ｌ当たり約１０ｎｇの収量で得られた。
【００６７】その後、精製蛋白質の一部をとり、実験例２乃至４の方法に準じて分析したところ、精製蛋白質はＮ末端付近に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、実験例１の蛋白質と同様の分子量、生物作用を示した。
【００６８】
【実施例Ａ−５】
＜蛋白質の製造＞常法により、生後間もないハムスターの新生児にウサギ由来の抗胸腺抗血清を注射して免疫反応を減弱させた後、ハムスターの背部皮下にヒト顎下腺類表皮癌由来の上皮様細胞株の一種であるＡ−２５３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ４１）を約５×１０5 個／匹注射移植し、通常一般の方法で３週間飼育した。そして、皮下に生じた腫瘍塊（約１０ｇ／匹）を摘出し、常法により生理食塩水中で分散させた後、ＰＢＳで洗浄した。
【００６９】得られた増殖細胞を１０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム及び０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩をそれぞれ含む２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄し、新鮮な同一緩衝液に細胞密度約２×１０7 個／ｍｌになるように浮遊させ、ホモゲナイザーにより破砕し、遠心分離により細胞残渣を除去して得られた上清を限外濾過膜により濃縮して免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質を含む細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を実施例Ａ−１の方法により精製し、濃縮し、凍結乾燥したところ、精製蛋白質の固状物がハムスター１匹当たり約３μｇの収量で得られた。
【００７０】その後、精製蛋白質の一部をとり、実験例２乃至４の方法に準じて分析したところ、精製蛋白質はＮ末端付近に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、実験例１の蛋白質と同様の分子量、生物作用を示した。
【００７１】
【実施例Ａ−６】
＜蛋白質の製造＞１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）を用い、Ａ−２５３細胞を常法にしたがって単層状態になるまで３７℃で培養した後、ギブコ製トリプシン製剤『トリプシン−ＥＤＴＡ』により増殖細胞を培養器から剥離させ、ＰＢＳにより洗浄した。以後、実施例Ａ−１の方法に準じて、増殖細胞を破砕し、破砕物を遠心分離して得られた上清を３７℃で６時間インキュベートした後、精製し、濃縮し、凍結乾燥したところ、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質の精製固状物が細胞１０7 個当たり約１μｇの収量で得られた。
【００７２】その後、精製蛋白質の一部をとり、実験例２乃至４の方法に準じて分析したところ、精製蛋白質はＮ末端付近に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、実験例１の蛋白質と同様の分子量、生物作用を示した。
【００７３】
【実施例Ａ−７】
＜蛋白質の製造＞１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）を用い、Ａ−２５３細胞を常法にしたがって単層状態になるまで３７℃で培養した後、培養培地を血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）に取替え、誘導剤としてＫＧ−１細胞由来の天然型ヒトＩＦＮ−γを１０ＩＵ／ｍｌになるように加え、３７℃でさらに４８時間培養した。培養物を遠心分離し、得られた上清を実施例Ａ−１の方法により精製し、濃縮し、凍結乾燥したところ、免疫担当細胞にＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質の精製固状物が細胞１０7 個当たり約５ｎｇの収量で得られた。
【００７４】その後、精製蛋白質の一部をとり、実験例２乃至４の方法に準じて分析したところ、精製蛋白質はＮ末端付近に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、実験例１の蛋白質と同様の分子量、生物作用を示した。
【００７５】
【実施例Ａ−８】
＜蛋白質の製造＞実施例Ａ−１の方法により得た精製蛋白質を適量の滅菌蒸留水に溶解し、溶液を予め０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液により平衡化させておいた昭和電工製高速液体クロマトグラフィー用ゲル『アサヒパックＣ４Ｐ−５０ ４Ｅ』のカラムに負荷し、カラムを０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液により洗浄した後、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含み、アセトニトリルの濃度が０％（ｖ／ｖ）から９０％（ｖ／ｖ）に直線的に上昇するトリフルオロ酢酸／アセトニトリル／水混液を６０ｍｌ／時間の流速で通液した。溶出画分から免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質を含む画分を採取し、１Ｍトリス水溶液（ｐＨ１１．２）により中和し、常法にしたがって濃縮し、アセトニトリルを除去したところ、純度約９５％以上の濃縮蛋白質が原料蛋白質固形分当たり約１０％の収量で得られた。
【００７６】その後、この濃縮蛋白質の一部をとり、実験例２の方法に準じて分析したところ、分子量１８，４００±１，０００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ誘導能ある蛋白質の単一バンドを示した。さらに、実験例３及び４の方法に準じて分析したところ、濃縮蛋白質はＣ末端付近に配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有するとともに、Ｎ末端付近に配列表における配列番号１、詳細には、配列番号７に示すアミノ酸配列を、また、中間部に配列表における配列番号４及び５に示すアミノ酸配列をそれぞれ有し、高純度に濃縮した場合においても、実験例１の蛋白質と同様の生物作用を示した。
【００７７】
【実施例Ｂ−１】
＜液剤＞安定剤として１％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミンを含む生理食塩水に実施例Ａ−１の方法により得た精製蛋白質を１ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、常法にしたがって精密濾過により除菌して液剤を得た。
【００７８】安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための注射剤、点眼剤及び点鼻剤として有用である。
【００７９】
【実施例Ｂ−２】
＜乾燥注射剤＞安定剤として１％（ｗ／ｖ）精製ゼラチンを含む生理食塩水１００ｍｌに実施例Ａ−２の方法により得た精製蛋白質を１００ｍｇ溶解し、常法にしたがって精密濾過により除菌し、バイアル瓶に１ｍｌずつ分注し、凍結乾燥後、密栓した。
【００８０】安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための乾燥注射剤として有用である。
【００８１】
【実施例Ｂ−３】
＜乾燥注射剤＞実施例Ａ−５の方法により得た精製蛋白質と、安定剤として林原製結晶トレハロース粉末『トレハオース』をそれぞれ用いた以外は実施例Ｂ−２と同様にして固形製剤を得た。
【００８２】安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための乾燥注射剤として有用である。
【００８３】
【実施例Ｂ−４】
＜軟膏剤＞滅菌蒸留水に和光純薬工業製カルボキシビニルポリマー『ハイビスワコー１０４』と林原製結晶トレハロース粉末『トレハオース』をそれぞれ濃度１．４％（ｗ／ｗ）及び２．０％（ｗ／ｗ）になるように溶解し、実施例Ａ−３の方法により得た精製蛋白質を均一に混合後、ｐＨ７．２に調整して、１ｇ当たり精製蛋白質を約１ｍｇ含むペースト状物を得た。
【００８４】延展性と安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患を含む感受性疾患の治療・予防するための軟膏剤として有用である。
【００８５】
【実施例Ｂ−５】
＜錠剤＞林原製無水結晶α−マルトース粉末『ファイントース』に実施例Ａ−４の方法により得た精製蛋白質と細胞賦活剤としてのルミンを均一に混合し、得られる混合物を常法により打錠して製品１錠（約２００ｍｇ）当たり精製蛋白質及びルミンをそれぞれ約１ｍｇ含む錠剤を得た。
【００８６】摂取性、安定性に優れ、細胞賦活作用も有する本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための錠剤として有用である。
【００８７】
【実施例Ｂ−６】
＜養子免疫療法剤＞悪性リンパ腫患者の末梢血から単核球を単離し、３７℃に予温した１０％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）に細胞密度約１×１０6 個／ｍｌになるように浮遊させ、実施例Ａ−１の方法により得た精製蛋白質を約１０ｎｇ／ｍｌと組換え型ヒトインターロイキン２を約１００単位／ｍｌ加え、５％ＣＯ2 インキュベータ中、３７℃で１週間培養した後、遠心分離によりＬＡＫ細胞を採取した。
【００８８】このＬＡＫ細胞は、元の悪性リンパ腫患者の体内に移入すると、リンパ腫細胞に顕著な細胞障害性を示し、インターロイキン２のみ用いる養子免疫療法と比較して有意に高い治療効果を発揮する。なお、ヒト単核球に代えて腫瘍組織浸潤リンパ球を同様に処置して得られる細胞障害性Ｔ細胞も、元の患者の体内に移入すると、ＬＡＫ細胞と同様の効果を発揮する。本例の養子免疫療法剤は、悪性リンパ腫以外に、例えば、悪性腎腫瘍、悪性黒色腫、大腸癌、肺癌などの固形悪性腫瘍にも有利に適用できる。
【００８９】
【発明の効果】以上説明したごとく、この発明は免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する新規な蛋白質と、その蛋白質を産生し得るヒト細胞の発見に基づくものである。この発明の蛋白質はアミノ酸配列の一部までが解明された物質であり、免疫担当細胞において安定したＩＦＮ−γ誘導能を発揮する。これにより、この発明の蛋白質は細胞培養によりＩＦＮ−γを製造するためのＩＦＮ−γ誘導剤として、さらには、ＩＦＮ−γ感受性を有するウイルス性疾患、悪性腫瘍、免疫疾患一般に対する治療剤・予防剤として多種多様の用途を有することとなる。また、キラー細胞による細胞障害性の増強又はキラー細胞の生成を誘導する性質を兼備するこの発明の蛋白質を有効成分とする感受性疾患剤は、悪性腫瘍などの難治性疾患の治療に格別の効果を発揮する。
【００９０】この発明の蛋白質は強力なＩＦＮ−γ誘導能を有することから、一般に少量で所期のＩＦＮ−γ産生を誘導でき、また、毒性が極めて低いことから、多量投与しても重篤な副作用を惹起することがない。したがって、この発明の蛋白質は、使用に際して用量を厳密に管理しなくても、所望のＩＦＮ−γ産生を迅速に誘導できる利点がある。特に、この発明の蛋白質はヒト細胞に由来するので、組換えＤＮＡ技術により人工的に創製したポリペプチドに比べて、医薬品に配合してヒトに投与したときの副作用や抗体産生の少ない特徴がある。
【００９１】斯くも有用なる蛋白質は、ヒト細胞を利用するこの発明の製造方法により、所望量を容易に製造することができる。
【００９２】この発明は斯くも顕著な作用効果を奏するものであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明であると云える。
【００９３】
【配列表】
配列番号：1配列の長さ：10配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：N末端フラグメント配列Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser1 5 10
【００９４】配列番号：2配列の長さ：50配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：N末端フラグメント配列 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn Asp 1 5 10 15 Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp Met Thr 20 25 30 Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile Ile Ser 35 40 45 50
【００９５】配列番号：3配列の長さ：10配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：C末端フラグメント配列Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp1 5 10
【００９６】配列番号：4配列の長さ：14配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg 1 5 10
【００９７】配列番号：5配列の長さ：17配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 1 5 10 15
【００９８】配列番号：6配列の長さ：157配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn Asp 1 5 10 15 Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp Met Thr 20 25 30 Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met 35 40 45 50 Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys 55 60 65 Glu Lys Ile Ser Xaa Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu 70 75 80 85 Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe 90 95 100 Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser 105 110 115 Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu 120 125 130 135 Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val 140 145 150 Gln Asn Glu Asp 155
【００９９】配列番号：7配列の長さ：13配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：N末端フラグメント配列 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg 1 5 10
【０１００】配列番号：8配列の長さ：25配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Ile Ile Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln 1 5 10 15 Ser Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys 20 25
【０１０１】配列番号：9配列の長さ：18配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Gln Pro Val Phe Glu Asp Met Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro 1 5 10 15 Gln
【０１０２】配列番号：10配列の長さ：471配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA配列の特徴起源生物名：マウス組織の種類：肝臓配列の特徴配列を表わす記号：mat peptide存在位置：1...471特徴を決定した方法：S配列 AAC TTT GGC CGA CTT CAC TGT ACA ACC GCA GTA ATA CGG AAT ATA AAT 48 Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn 1 5 10 15 GAC CAA GTT CTC TTC GTT GAC AAA AGA CAG CCT GTG TTC GAG GAT ATG 96 Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met 20 25 30 ACT GAT ATT GAT CAA AGT GCC AGT GAA CCC CAG ACC AGA CTG ATA ATA 144 Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile 35 40 45 TAC ATG TAC AAA GAC AGT GAA GTA AGA GGA CTG GCT GTG ACC CTC TCT 192 Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser 50 55 60 GTG AAG GAT AGT AAA AYG TCT ACC CTC TCC TGT AAG AAC AAG ATC ATT 240 Val Lys Asp Ser Lys Xaa Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile 65 70 75 80 TCC TTT GAG GAA ATG GAT CCA CCT GAA AAT ATT GAT GAT ATA CAA AGT 288 Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser 85 90 95 GAT CTC ATA TTC TTT CAG AAA CGT GTT CCA GGA CAC AAC AAG ATG GAG 336 Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu 100 105 110 TTT GAA TCT TCA CTG TAT GAA GGA CAC TTT CTT GCT TGC CAA AAG GAA 384 Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu 115 120 125 GAT GAT GCT TTC AAA CTC ATT CTG AAA AAA AAG GAT GAA AAT GGG GAT 432 Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp 130 135 140 AAA TCT GTA ATG TTC ACT CTC ACT AAC TTA CAT CAA AGT 471 Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser 145 150 155
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明による蛋白質のペプチド・マップである。
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、免疫担当細胞においてインターフェロン−γ（以下、「ＩＦＮ−γ」と略記する。）の産生を誘導するヒト細胞由来の蛋白質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ＩＦＮ−γは抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、免疫調節作用を有する蛋白質として知られ、抗原やマイトジェンによる刺激をうけた免疫担当細胞が産生すると云われている。これら生物作用故に、ＩＦＮ−γはその発見当初より抗腫瘍剤としての実用化が鶴首され、現在では脳腫瘍を始めとする悪性腫瘍一般の治療剤として精力的に臨床試験が進められている。現在入手し得るＩＦＮ−γは免疫担当細胞が産生する天然型ＩＦＮ−γと、免疫担当細胞から採取したＩＦＮ−γをコードするＤＮＡを大腸菌に導入してなる形質転換体が産生する組換え型ＩＦＮ−γに大別され、上記臨床試験においては、これらのうちのいずれかが「外来ＩＦＮ−γ」として投与されている。
【０００３】このうち、天然型ＩＦＮ−γは、通常、培養株化した免疫担当細胞をＩＦＮ−γ誘導剤を含む培養培地で培養し、その培養物を精製することにより製造される。この方法では、ＩＦＮ−γ誘導剤の種類がＩＦＮ−γの産生量や精製のし易さ、さらには、製品の安全性等に多大の影響を及ぼすと云われており、通常、コンカナバリンＡ、レンズ豆レクチン、アメリカヤマゴボウレクチン、エンドトキシン、リポ多糖などのマイトジェンが頻用される。しかしながら、これら物質はいずれも分子中に多様性があり、給源や精製方法に依って品質が変動し易く、誘導能の一定したＩＦＮ−γ誘導剤を所望量入手し難いという問題がある。くわえて、上記物質の多くは生体に投与すると顕著な副作用を示したり、物質に依っては毒性を示すものすらあり、生体に直接投与してＩＦＮ−γの産生を誘導するのが極めて困難であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】この発明は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する新規な蛋白質の発見に基づくものである。本発明者らが哺乳類の細胞が産生するサイトカインにつき研究していたところ、コリネバクテリウム死菌体とリポ多糖で予処理したマウスの肝臓中にＩＦＮ−γの産生を誘導する物質が存在することを見出した。カラムクロマトグラフィーを中心とする種々の方法を組合せてこの物質を単離し、その性質・性状を調べたところ、その本質は蛋白質であり、次のような理化学的性質を有していることが判明した。
（１） 分子量ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又はゲル濾過法で測定すると、分子量１９，０００±５，０００ダルトンを示す。
（２） 等電点クロマトフォーカシング法で測定すると、４．８±１．０に等電点を示す。
（３） 部分アミノ酸配列配列表における配列番号８及び９に示す部分アミノ酸配列を有する。
（４） 生物作用免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する。
【０００５】斯かる理化学的性質を有する蛋白質は未だ知られておらず、新規物質であると判断される。そこで、本発明者らが引続きマウス肝細胞を鋭意検索したところ、この蛋白質をコードするＤＮＡを単離するのに成功した。解読したところ、このＤＮＡは４７１塩基対からなり、配列表における配列番号１０に示すアミノ酸配列をコードしていることが判明した（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、メチオニン又はトレオニンを表わすものとする）。
【０００６】これら知見に基づき、ヒト肝細胞を引続き検索したところ、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するさらに別の新規物質をコードするＤＮＡが得られた。この物質の本質はポリペプチドであり、ＤＮＡを解読したところ、配列表における配列番号６に示すアミノ酸配列を含んでなることが判明した（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表わすものとする）。その後、このＤＮＡを大腸菌に導入し、発現させたところ、培養物中にポリペプチドが好収量で産生した。以上の知見は、同じ特許出願人による特開平８−２７１８９号公報及び特開平８−１９３０９８号公報に開示されている。また、同じ特許出願人による特願平７−７８３５７号明細書には、斯かるポリペプチドの感受性疾患剤としての用途が開示されている。ところが、一般に、医薬品に配合してヒトに投与する生理活性蛋白質はヒト細胞由来のものが望ましいところ、斯かるポリペプチドを産生し得るヒト細胞は未だ見出されていない。
【０００７】斯かる状況に鑑み、この発明の課題は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するヒト細胞由来の蛋白質を提供することにある。
【０００８】この発明の別の課題は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するヒト細胞由来の蛋白質の製造方法を提供することにある。
【０００９】この発明のさらに別の課題は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するヒト細胞由来の蛋白質の感受性疾患剤としての用途を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】この発明は、前記第一の課題を、Ｎ末端付近に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するヒト細胞由来の蛋白質により解決するものである。
【００１１】この発明は、前記第二の課題を、斯かる蛋白質を産生し得るヒト細胞を増殖させ、増殖細胞から蛋白質を採取してなる蛋白質の製造方法により解決するものである。
【００１２】この発明は、前記第三の課題を、有効成分として斯かる蛋白質を含んでなる感受性疾患剤により解決するものである。
【００１３】
【作用】この発明の蛋白質は、免疫担当細胞に単独又は適宜補因子とともに作用させると、ＩＦＮ−γの産生を誘導する。
【００１４】ヒト細胞由来の斯かる蛋白質は、ヒト細胞を用いるこの発明の製造方法により、所望量を比較的容易に製造することができる。
【００１５】この発明の感受性疾患剤は、ヒトに投与すると、ヒト体内の免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導し、ＩＦＮ−γ感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。当該蛋白質がキラー細胞による細胞障害性の増強又はキラー細胞の生成を誘導する性質を兼備するときには、悪性腫瘍を始めとする難治性疾患の治療に効果を発揮する。
【００１６】
【発明の実施の形態】以下、この発明の実施の形態につき説明するに、この発明でいう蛋白質とは、Ｎ末端付近に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチド及び糖蛋白質全般を意味する。ヒト細胞の種類や増殖条件にも依るが、この発明の蛋白質はＮ末端及びＣ末端付近にそれぞれ配列表における配列番号１及び３に示すアミノ酸配列を有し、中間部に配列表における配列番号４乃至５に示すアミノ酸配列を介して、全体として配列表における配列番号６に示すアミノ酸配列を含んでなることがある（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表わすものとする）。そして、還元剤存在下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定すると、分子量１４，０００乃至２４，０００ダルトン、通常、１８，０００乃至１９，５００ダルトンに相当する位置に蛋白質のバンドを示す。ヒト細胞の種類や増殖条件に依っては、配列表における配列番号１及び３に示すＮ末端及び／又はＣ末端付近のアミノ酸配列にアミノ酸がさらに１個又は２個以上付加したり、それらＮ末端及び／又はＣ末端付近のアミノ酸配列におけるアミノ酸が１個又は２個以上欠失することがあるが、斯かるアミノ酸配列を有する蛋白質であっても、それがヒト細胞に由来し、免疫担当細胞において単独又は適宜補因子と協働してＩＦＮ−γの産生を誘導するかぎり、すべてこの発明の蛋白質に包含されるものとする。
【００１７】斯かる蛋白質は、ヒト細胞を用いるこの発明の製造方法により製造することができる。ヒト細胞としては、通常、リンパ芽球、リンパ球、単芽球、単球、骨髄芽球、骨髄球、顆粒球、マクロファージなどのヒト造血系細胞や、例えば、肺癌、大腸癌、結腸癌、類表皮癌などの固形腫瘍由来の細胞株が用いられ、個々の細胞株としては、例えば、顎下腺類表皮癌由来の上皮様細胞株であるＡ−２５３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ４１）や、ジュン・ミノワダ『キャンサー・レビュー』、第１０巻、１乃至１８頁（１９８８年）などに記載されている骨髄性白血病、前骨髄性白血病、単球性白血病、成人Ｔ細胞白血病及びヘアリー細胞白血病を含む白血病又はリンパ腫由来のＨＢＬ−３８細胞、ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４０）、Ｋ−５６２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４３）、ＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４６）、Ｍｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ８０６６）、ＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ２０２）、Ｕ−９３７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９３）などの白血病細胞株及びそれらの変異株が挙げられる。これら細胞株はいずれも増殖容易であり、しかも、当該蛋白質の産生能が高いので、この発明の製造方法を有利に適用できる。殊に、Ａ−２５３細胞を始めとする上皮様細胞株や、ＨＢＬ−３８細胞、ＨＬ−６０細胞、ＫＧ−１細胞、ＴＨＰ−１細胞及びＵ−９３７細胞を始めとするヒト骨髄単球系細胞株は当該蛋白質の産生能が抜きん出て高く、この発明の製造方法を実施するうえで極めて有用である。
【００１８】この発明の製造方法においては、斯かるヒト細胞を増殖させ、得られる増殖細胞から目的とする蛋白質を採取する。ヒト細胞を増殖させる方法に特に制限はなく、通常一般の生体外又は生体内の方法を適用すればよい。生体外の方法とは培養培地を用いて増殖させる方法をいい、ヒト細胞を、例えば、ウシ胎児血清を０．３乃至３０％（ｗ／ｖ）程度補足したＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥ培地などの動物細胞を増殖させるための斯界における慣用の培養培地に細胞密度約１×１０4 乃至１×１０7 個／ｍｌ、望ましくは、約１×１０5 乃至１×１０6 個／ｍｌになるように浮遊させ、培養培地を適宜新鮮なものと取換えつつ、ｐＨ７乃至８、望ましくは、ｐＨ７．２乃至７．４、温度３６乃至３８℃、望ましくは、３７℃前後で約１日乃至１週間培養する。そして、培養物から増殖細胞を分離し、目的とする蛋白質を採取する。なお、ヒト細胞の種類や培養条件に依っては、培養中、産生した当該蛋白質が細胞外に放出されることがある。すなわち、ヒト細胞において当該蛋白質の産生を誘導し得る、例えば、マイトジェンやＩＦＮ−γなどの誘導剤を培養培地に共存させるときには、産生した当該蛋白質の一部又は全部が細胞外に分泌されることがあり、この場合には、培養上清からも当該蛋白質を採取できる。
【００１９】一方、ヒト以外の温血動物を利用する生体内の方法により増殖させるには、通常、マウス、ヌードマウス、ラット、ヌードラット、モルモット、ハムスターなどの齧歯類の新生児にウサギ由来の抗胸腺抗体などを注射して免疫反応を減弱させた後、ヒト細胞を動物１匹当たり約１×１０5乃至１×１０8個皮下又は腹腔内に注射移植するか、あるいは、これら温血動物の成長個体の体外又は体内に設けられ、動物の栄養体液が環流可能な拡散チェンバーなどの容器内にヒト細胞を収容し、その後、通常一般の方法により動物を約２乃至１０週間飼育する。この飼育の間、移植したヒト細胞は温血動物の体液を利用しながら増殖する。増殖細胞は細胞塊、腹水又は細胞浮遊液として採取され、必要に応じて、これを適宜分散媒中で分散・洗浄した後、目的とする蛋白質を採取する。生体内の増殖方法は、生体外の増殖方法と比較して、より少ないコストと労力で短時間に所望量の増殖細胞の得られる利点がある。なお、生体内の増殖方法は、例えば、特公昭５６−５４１５８号公報などにも詳述されている。
【００２０】増殖細胞から当該蛋白質を採取するには、増殖細胞を一旦分離するか培養上清とともに超音波を印加するか、ホモゲナイズ、凍結融解、あるいは、低張媒体中に浸漬するなどして破砕し、得られる破砕物又は破砕物と培養上清との混合物から当該蛋白質を採取すればよい。斯かる破砕物又は混合物から当該蛋白質を採取するには、必要に応じて、３７℃前後で１乃至２４時間インキュベートした後、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動及び／又は等電点電気泳動などの生理活性蛋白質を精製するための斯界における慣用の方法を適用すればよく、これらは適宜組合せて適用される。そして、最終使用形態に応じて、採取した蛋白質を濃縮・凍結乾燥して液状又は固状とする。なお、同じ特許出願人による特願平７−５８２４０号明細書に開示されたモノクローナル抗体は当該蛋白質の精製に極めて有用であり、このモノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーによるときには、高純度の当該蛋白質を最少のコストと労力で得ることができる。
【００２１】前述のとおり、この発明の蛋白質は免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する性質を有する。この性質により、この発明の蛋白質は細胞培養法によりＩＦＮ−γを製造する際の誘導剤として、さらには、ＩＦＮ−γに感受性を有する、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）や尖圭コンジロムなどのウイルス性疾患、悪性腎腫瘍、肉芽腫、菌状息肉症、脳腫瘍などの悪性腫瘍、関節リウマチやアレルギー症などの免疫疾患に対する治療剤・予防剤として有用である。
【００２２】この発明の蛋白質は、通常、免疫担当細胞を培養してＩＦＮ−γを製造するための培養培地に共存させるか、ＩＦＮ−γ感受性疾患の治療・予防のためにヒトに投与される。すなわち、前者の用途においては、哺乳類の末梢血から分離される白血球や、例えば、ＨＢＬ−３８細胞、Ｍｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ８０６６）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ８１６３）、ＨｕＴ７８細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ１６１）、ＥＬ４細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ３９）、Ｌ１２−Ｒ４細胞などの培養株化した免疫担当細胞又はその変異株をこの発明の蛋白質を１ｍｌ当たり約０．１ｎｇ乃至１μｇ、望ましくは、約１乃至１００ｎｇ含む適宜の培養培地に浮遊させる。必要に応じて、培養培地にマイトジェンやインターロイキン２、抗ＣＤ３抗体などのＴ細胞刺激物質を加え、培養培地を適宜新鮮なものと取換えながら、通常一般の方法により約１乃至１００時間培養する。斯くして得られる培養物にＩＦＮ−γを精製するための慣用の方法、すなわち、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの１種又は２種以上を適宜組合せて適用することにより、ＩＦＮ−γを採取することができる。
【００２３】さらに、この発明の蛋白質はヒトの免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導することから、有効成分として当該蛋白質を含んでなる感受性疾患剤は、ヒトに投与すると、体内の免疫担当細胞がＩＦＮ−γを産生するのを促し、ＩＦＮ−γ感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。また、後記実験例及び実施例に例示する蛋白質のように、蛋白質が免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する性質に加えて、ＮＫ細胞やＬＡＫ細胞（リンホカイン活性化キラー細胞）、細胞障害性Ｔ細胞などのキラー細胞による細胞障害性の増強又はキラー細胞の生成を誘導する性質を兼備するときには、キラー細胞も感受性疾患の治療・予防に関与することとなる。したがって、この発明でいう感受性疾患とは、ＩＦＮ−γ感受性疾患を含む、ＩＦＮ−γ及び／又はキラー細胞が直接又は間接に関与して治療及び／又は予防し得る疾患一般を意味するものとし、具体的には、例えば、肝炎、ヘルペス症、尖圭コンジロム、ＡＩＤＳなどのウイルス性疾患、カンジダ症、マラリヤ症、クリプトコックス症、エルシニア症などの感染症、悪性腎腫瘍、菌状息肉症、慢性肉芽腫などの固形悪性腫瘍、成人Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、悪性リンパ腫などの血球系悪性腫瘍、さらには、アレルギー症、リウマチなどの免疫疾患を挙げることができる。また、インターロイキン３と併用するときには、白血病、骨髄腫、さらには、悪性腫瘍を治療する際の放射線照射や化学療法剤の投与に伴なう白血球減少症や血小板減少症の完治又は緩解にも効果を発揮する。
【００２４】斯くして、この発明の感受性疾患剤は、上記のごとき感受性疾患を治療・予防するための抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、免疫疾患剤、血小板増多剤、白血球増多剤などとして多種多様な用途を有することとなる。剤型並びに感受性疾患の種類及び症状にも依るが、この発明の感受性疾患剤は、通常、液状、ペースト状又は固形状に調製され、当該蛋白質を０．０００００１乃至１００％（ｗ／ｗ）、望ましくは、０．０００１乃至０．１％（ｗ／ｗ）含んでなる。
【００２５】この発明の感受性疾患剤は当該蛋白質単独の形態はもとより、当該蛋白質とそれ以外の生理的に許容される、例えば、担体、賦形剤、希釈剤、免疫助成剤、安定剤、さらには、必要に応じて、他の生理活性物質の１種又は２種以上との組成物としての形態をも包含する。安定剤としては、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、トレハロース及びマルトースなどが、また、併用し得る他の生理活性物質としては、例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン１２、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、カルボコン、シクロホスファミド、アクラルビシン、チオテパ、ブスルファン、アンシタビン、シタラビン、フルオロウラシル、テトラヒドロフリルフルオロウラシル、メトトレキセート、アクチノマイシンＤ、クロモマイシンＡ3 、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、金コロイド、クレスチン、ピシバニール、レンチナン及び丸山ワクチンなどが挙げられる。このうち、インターロイキン２との併用は、インターロイキン２がこの発明の蛋白質が免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する際の補因子として機能するので特に有利である。天然型又は組換え型ヒトインターロイキン２を併用することにより、当該蛋白質単独ではＩＦＮ−γを産生し難い免疫担当細胞においても所期のＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。また、インターロイキン１２と併用するときには、当該蛋白質又はインターロイキン１２単独では容易に達成し得ない、極めて高レベルのＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。しかも、当該蛋白質は、ヒト体内におけるインターロイキン１２によるイムノグロブリンＥ抗体の産生阻害を高めるので、イムノグロブリンＥ抗体の産生を主因とする、例えば、アトピー性喘息、アトピー性気管支喘息、枯草熱、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、血管性浮腫、アトピー性消化器異常を始めとするアトピー性疾患を治療するための免疫疾患剤においても極めて有用である。なお、ヒトの体内には、微量ではあるが、インターロイキン１２が存在することがあるので、斯かる場合には、当該蛋白質のみを投与すれば所期の治療効果が達成できる。
【００２６】さらに、この発明の感受性疾患剤は、投薬単位形態の薬剤をも包含し、その投薬単位形態の薬剤とは、当該蛋白質を、例えば、１回当たりの用量又はその整数倍（４倍まで）若しくはその約数（１／４０まで）に相当する量を含んでなり、投薬に適する物理的に一体の剤型にある薬剤を意味する。このような投薬単位形態の薬剤としては、注射剤、液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、点眼剤、点鼻剤、坐剤などが挙げられる。
【００２７】この発明の感受性疾患剤は経口的に投与しても非経口的に投与しても、また、以下に述べるように抗腫瘍細胞などを体外で活性化させる場合に用いてもよく、いずれの場合にも、感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。感受性疾患の種類や症状にも依るが、具体的には、患者の症状や投与後の経過を観察しながら、成人当たり約０．１μｇ乃至５０ｍｇ／回、望ましくは、約１μｇ乃至１ｍｇ／回の蛋白質を１乃至４回／日又は１乃至５回／週の用量で１日乃至１年間に亙って経口投与するか、皮内、皮下、筋肉内又は静脈内に非経口投与すればよい。
【００２８】この発明の感受性疾患剤は、インターロイキン２を用いる、いわゆる「抗腫瘍免疫療法」にも有用である。抗腫瘍免疫療法は、一般に、（ｉ）悪性腫瘍患者の体内に直接インターロイキン２を投与する方法と、（ｉｉ）インターロイキン２により生体外で活性化させた抗腫瘍細胞を患者の体内に移入する方法（養子免疫療法）に大別されるが、当該蛋白質を併用するときには、その効果を有意に高めることができる。具体的には、前記（ｉ）の方法の場合、患者にインターロイキン２を投与するのと同時又は事前に当該蛋白質を成人当たり約０．１μｇ乃至１ｍｇ／回の用量で１乃至１０回投与する。インターロイキン２の投与量は、悪性腫瘍の種類、患者の症状及び蛋白質の用量にも依るが、通常、成人当たり約１０，０００乃至１，０００，０００単位／回とする。一方、前記（ｉｉ）の方法の場合には、悪性腫瘍患者から採取した単核球又はリンパ球をインターロイキン２の存在下で培養するに当たり、それら血球１×１０6 個当たり当該蛋白質を約０．１ｎｇ乃至１μｇ共存させておく。そして、一定時間培養後、培養物からＮＫ細胞又はＬＡＫ細胞を採取し、これを元の患者に移入するのである。この発明による抗腫瘍免疫療法の対象となり得る疾患としては、例えば、結腸癌、直腸癌、大腸癌、胃癌、甲状腺癌、舌癌、膀胱癌、絨毛癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、喉頭癌、肺癌、乳癌、悪性黒色腫、カポジ肉腫、脳腫瘍、神経芽細胞腫、卵巣腫瘍、睾丸腫瘍、骨肉腫、膵臓癌、悪性腎腫瘍、副腎腫、血管内皮腫などの固形悪性腫瘍や白血病、悪性リンパ腫などの血球系悪性腫瘍が挙げられる。
【００２９】次に、この発明の蛋白質につき、実験例を挙げて説明する。
【００３０】
【実験例１】
＜蛋白質の調製＞常法により、生後間もないハムスターの新生児にウサギ由来の抗胸腺抗血清を注射して免疫反応を減弱させた後、ハムスターの背部皮下にヒト急性単球性白血病由来の骨髄単球系細胞株の一種であるＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ２０２）を約５×１０5 個／匹注射移植し、通常一般の方法で３週間飼育した。そして、皮下に生じた腫瘍塊（約１５ｇ／匹）を摘出し、常法により生理食塩水中で分散させた後、燐酸食塩緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と云う。）で洗浄した。
【００３１】得られた増殖細胞をマシュー・ジェー・コスラら『プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユー・エス・エー』、第８６巻、５，２２７乃至５，２３１頁（１９８９年）に記載された方法に準じて１０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩を含む１０倍容の氷冷２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄し、３倍容の新鮮な同一緩衝液中、氷冷下で２０分間静置し、−８０℃で凍結後、解凍して細胞を破砕した。破砕物を遠心分離し、上清を予め１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）で平衡化させておいたファルマシア製イオン交換クロマトグラフィー用ゲル『ＤＥＡＥ−セファロース』のカラムに負荷し、カラムを１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）で洗浄後、塩化ナトリウム濃度が０Ｍから０．５Ｍまで段階的に上昇する１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）を通液し、塩化ナトリウム濃度が０．２Ｍ付近で溶出した画分を採取した。
【００３２】この画分を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）に対して透析後、予め１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化させておいたトーソー製イオン交換クロマトグラフィー用ゲル『ＤＥＡＥ ５ＰＷ』のカラムに負荷し、０Ｍから０．５Ｍに直線的に上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）を通液し、塩化ナトリウム濃度が０．２乃至０．３Ｍ付近で溶出した画分を採取した。
【００３３】この新たに得られた画分を合一し、ＰＢＳに対して透析する一方、同じ特許出願人による特願平７−５８２４０号明細書に記載された方法にしたがってモノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィー用ゲルを調製し、プラスチック製円筒管内部にカラム状に充填し、ＰＢＳで洗浄後、上記透析内液をカラムに負荷した。カラムに１００ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）を通液し、得られる溶出画分から免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質を含む画分を採取し、滅菌蒸留水に対して透析し、膜濾過により濃縮後、凍結乾燥して精製蛋白質の固状物を得た。収量は、ハムスター１匹当たり約５０ｎｇであった。
【００３４】
【実験例２】
＜分子量＞実験例１の方法により得た精製蛋白質をユー・ケー・レムリが『ネイチャー』、第２２７巻、６８０乃至６８５頁（１９７０年）に報告している方法に準じ、還元剤としての２％（ｗ／ｖ）ジチオトレイトール存在下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、分子量１８，０００乃至１９，５００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ誘導能ある蛋白質の主バンドが観察された。なお、このときの分子量マーカは、ウシ血清アルブミン（６７，０００ダルトン）、オボアルブミン（４５，０００ダルトン）、カーボニックアンヒドラーゼ（３０，０００ダルトン）、大豆トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）及びα−ラクトアルブミン（１４，４００ダルトン）であった。
【００３５】
【実験例３】
＜Ｎ末端付近のアミノ酸配列及びペプチド・マッピング＞
【００３６】
【実験例３−１】
＜Ｎ末端付近のアミノ酸配列＞パーキン・エルマー製プロテイン・シーケンサ『４７３Ａ型』を使用し、常法にしたがって分析したところ、実験例１の方法により得た精製蛋白質はＮ末端付近に配列表における配列番号１、詳細には、配列番号２に示すアミノ酸配列を有していた。
【００３７】
【実験例３−２】
＜ペプチド・マッピング＞実験例１の方法により得た精製蛋白質を適量の滅菌蒸留水に溶解し、溶液を予め０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液により平衡化させておいた昭和電工製高速液体クロマトグラフィー用ゲル『アサヒパックＣ４Ｐ−５０ ４Ｅ』のカラムに負荷し、カラムを０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液により洗浄した後、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含み、アセトニトリルの濃度が０％（ｖ／ｖ）から９０％（ｖ／ｖ）に直線的に上昇するトリフルオロ酢酸／アセトニトリル／水混液を６０ｍｌ／時間の流速で通液した。溶出画分から免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質を含む画分を採取し、１Ｍトリス水溶液（ｐＨ１１．２）により中和し、常法にしたがって濃縮し、アセトニトリルを除去する一方、別途、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）にシグマ製クロストリパイン剤を適量溶解し、この溶液に濃縮蛋白質を対クロストリパインのモル比で約５０倍加え、ｐＨを８乃至９に保ちつつ、３７℃で１２時間反応させて蛋白質のペプチド断片を含む反応物を得た。
【００３８】この反応物を予め０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液により平衡化させておいたトーソー製高速液体クロマトグラフィー用ゲル『ＯＤＳ−１２０Ｔ』のカラムに負荷し、カラムを０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液により洗浄した後、溶出画分中のペプチド濃度を波長２１４ｎｍにおける吸光度によりモニタしながら、０．０９％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含み、アセトニトリルの濃度が０％（ｖ／ｖ）から７０％（ｖ／ｖ）まで直線的に上昇するトリフルオロ酢酸／アセトニトリル／水混液を３０ｍｌ／時間の流速で通液した。このとき得られたペプチド・マップを図１に示す。
【００３９】図１のペプチド・マップにおいて、溶出開始から約５９分、約６２分及び約６８分後に溶出したペプチド断片（以下、それぞれ「ペプチド断片１」、「ペプチド断片２」及び「ペプチド断片３」と云う。）をそれぞれ別々に採取し、そのアミノ酸配列をパーキン・エルマー製プロテイン・シーケンサ『４７３Ａ型』を使用し、常法にしたがって分析した。その結果、ペプチド断片１及び２は、それぞれ、配列表における配列番号３及び７に示すアミノ酸配列を、また、ペプチド断片３は配列表における配列番号４及び５に示すアミノ酸配列を有することが判明した。これらアミノ酸配列と配列表における配列番号６に示すアミノ酸配列を比較したところ、ペプチド断片１乃至３のアミノ酸配列は、その配列番号６に示すアミノ酸配列におけるそれぞれ第１４８乃至１５７番目、第１乃至１３番目及び第４５乃至５８番目若しくは第８０乃至９６番目に相当することが判明した。したがって、ペプチド断片１及び２は分析に供した蛋白質におけるそれぞれＣ末端及びＮ末端フラグメントに、また、ペプチド断片３はその蛋白質における中間部フラグメントに相当すると判断された。
【００４０】これらの結果と精製蛋白質がＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において分子量約１８，０００乃至１９，５００ダルトンに相当する位置に蛋白質の主バンドを示すという実験例２の知見、さらには、配列表における配列番号６に示すアミノ酸配列から計算される分子量が１８，１９９ダルトンであることを総合的に判断すると、実験例１の方法により得た精製蛋白質は配列表における配列番号６に示すアミノ酸配列を含んでなると結論される。
【００４１】
【実験例４】
＜生物作用＞
【００４２】
【実験例４−１】
＜免疫担当細胞におけるＩＦＮ−γの産生＞ヘパリン加注射器により健常者から血液を採取し、血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）により２倍希釈した。血液をファルマシア製フィコール上に重層し、遠心分離して採取したリンパ球を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）により洗浄した後、新鮮な同一培地に細胞密度５×１０6 個／ｍｌになるように浮遊させ、９６ウェルマイクロプレートに０．１５ｍｌ／ウェルずつ分注した。
【００４３】別途、実験例１の方法により得た精製蛋白質を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）により適宜濃度に希釈して上記マイクロプレートに０．０５ｍｌ／ウェルずつ分注し、２．５μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ又は５０単位／ｍｌ組換え型ヒトインターロイキン２を含むか含まない新鮮な同一培地を０．０５ｍｌ／ウェル加えた後、５％ＣＯ2 インキュベータ中、３７℃で２４時間培養した。培養後、各ウェルから培養上清を０．１ｍｌずつ採取し、通常の酵素免疫測定法によりＩＦＮ−γを測定した。同時に、精製蛋白質のみを省略した系を設け、上記と同様に処置して対照とした。結果を表１に示す。なお、表１中のＩＦＮ−γ含量は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）から入手したＩＦＮ−γ標品（Ｇｇ２３−９０１−５３０）に基づき国際単位（ＩＵ）に換算している。
【００４４】
【表１】
【００４５】表１の結果は、当該蛋白質を作用させると、免疫担当細胞としてのリンパ球がＩＦＮ−γを産生したことを示している。また、表１の結果に見られるように、このＩＦＮ−γ産生は、補因子としてインターロイキン２又はコンカナバリンＡを共存させると、一段と高まる。
【００４６】
【実験例４−２】
＜ＮＫ細胞による細胞障害性の増強＞ヘパリン加注射器により健常者から血液を採取し、ＰＢＳにより２倍希釈した。血液をフィコール上に重層し、遠心分離して高密度リンパ球を得た。
【００４７】このリンパ球を細胞密度１×１０6 個／ｍｌになるように１０μｇ／ｍｌカナマイシン、５×１０-5Ｍ ２−メルカプトエタノール及び１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）に浮遊させ、１２ウェルマイクロプレートに０．５ｍｌ／ウェルずつ分注した。そして、実験例１の方法により得た精製蛋白質を新鮮な同一培地に適宜希釈してマイクロプレートに１．５ｍｌ／ウェルずつ加え、さらに、５０単位／ｍｌ組換え型ヒトインターロイキン２を含むか含まない新鮮な同一培地を０．５ｍｌ／ウェル加えた後、５％ＣＯ2インキュベータ中、３７℃で２４時間培養し、ＰＢＳで洗浄して効果細胞としてのＮＫ細胞を含む培養リンパ球を得た。
【００４８】別途、常法により51Ｃｒ標識したＮＫ細胞感受性標的細胞としてのヒト慢性骨髄性白血病由来のＫ−５６２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４３）を９６ウェルマイクロプレートに１×１０4 個／ウェルずつとり、上記で調製した効果細胞を効果細胞／標的細胞比で２．５：１、５：１又は１０：１の割合で加え、５％ＣＯ2インキュベータ中、３７℃で４時間培養した後、常法にしたがって培養上清の放射能を測定して死滅標的細胞数を求めた。そして、各々の系につき、試験に供した標的細胞数に対する死滅標的細胞数の百分率（％）を計算し、細胞障害性の目安とした。結果を表２に示す。
【００４９】
【表２】
【００５０】表２の結果は、当該蛋白質にＮＫ細胞による細胞障害性を増強する性質のあることを示している。また、表２の結果に見られるように、この細胞障害性の増強は、インターロイキン２が共存すると、一段と増強される。
【００５１】
【実験例４−３】
＜ＬＡＫ細胞の生成誘導＞常法により51Ｃｒ標識したＮＫ細胞非感受性標的細胞としてのヒトバーキットリンパ腫由来のＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８６）を９６ウェルマイクロプレートに１×１０4 個／ウェルずつとり、７２時間培養した以外は実験例４−２と同様にして調製した効果細胞としてのＬＡＫ細胞を含む培養リンパ球を効果細胞／標的細胞比で５：１、１０：１又は２０：１の割合で加え、５％ＣＯ2 インキュベータ中、３７℃で４時間培養した後、常法にしたがって培養上清の放射能を測定した。その後、実験例４−２と同様にして細胞障害性（％）を計算した。結果を表３に示す。
【００５２】
【表３】
【００５３】表３の結果は、当該蛋白質にＬＡＫ細胞の生成を誘導する性質のあることを示している。また、表３の結果に見られるように、この誘導は、インターロイキン２が共存すると、一段と増強される。
【００５４】
【実験例５】
＜急性毒性試験＞常法にしたがって、８週齢のマウスに実験例１の方法により得た精製蛋白質を経皮、経口又は腹腔内に注射投与した。その結果、精製蛋白質のＬＤ５０は、いずれの投与経路によっても約１ｍｇ／ｋｇ以上であった。このことは、当該蛋白質がヒトに投与する医薬品に配合して安全であることを裏付けている。
【００５５】周知のように、ＩＦＮ−γはウイルス、細菌などに対する感染防御、悪性腫瘍の増殖抑制、免疫機能の調節作用を通じてヒトの生体防御、さらには、イムノグロブリンＥ抗体の産生阻害に多大の関与をしている。前述のとおり、ＩＦＮ−γはヒトの感受性疾患剤としてすでに実用化されており、その対象疾患、用量、用法及び安全性はほぼ確立している。一方、フランセス・アール・バークウィル著、渡部好彦訳、『サイトカインとがん治療』、１９９１年、東京化学同人発行などにも記載されているように、ＮＫ細胞及びＬＡＫ細胞などのキラー細胞を利用する療法は、抗腫瘍免疫療法を始めとして、多種多様のヒト疾患に対して試みられ、総じて良好な成果が報告されている。最近では、サイトカインを用いるキラー細胞による細胞障害性の増強又はキラー細胞の生成の誘導と治療効果との関連性が注目されており、例えば、ティー・フジオカら『ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ユーロロジー』、第７３巻、第１号、２３乃至３１頁（１９９４年）には、ＬＡＫ細胞とインターロイキン２を併用する抗腫瘍免疫療法において、インターロイキン２がＬＡＫ細胞の生成を顕著に誘導し、重篤な毒性や副作用を惹起することなく、ヒトの転移癌に格別の効果を発揮したと報告されている。
【００５６】このように、多種多様のヒト疾患の治療・予防にＩＦＮ−γやキラー細胞が深く係わり、その完治又は緩解への多大の寄与が明らかになっている。斯かる状況において、実験例４乃至５の結果に見られるように、当該蛋白質が顕著な毒性を示すことなく、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するとともに、ＮＫ細胞による細胞障害性の増強又はＬＡＫ細胞の生成を誘導したことは、この発明の感受性疾患剤が重篤な副作用を惹起することなくヒトに長期間連用でき、ＩＦＮ−γ及び／又はキラー細胞が関与する疾患の治療・予防に効果を発揮することを示している。
【００５７】以下、この発明の実施の形態につき、実施例を挙げて具体的に説明する。なお、実施例Ａ−１乃至Ａ−８にはこの発明による蛋白質の製造方法の実施形態が、また、実施例Ｂ−１乃至Ｂ−６にはこの発明の感受性疾患剤の実施形態が例示されている。
【００５８】
【実施例Ａ−１】
＜蛋白質の製造＞常法により、生後間もないハムスターの新生児にウサギ由来の抗胸腺抗血清を注射して免疫反応を減弱させた後、ハムスターの背部皮下にヒト急性単球性白血病由来の骨髄単球系細胞株の一種であるＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ２０２）を約５×１０5 個／匹注射移植し、通常一般の方法で３週間飼育した。そして、皮下に生じた腫瘍塊（約１５ｇ／匹）を摘出し、常法により生理食塩水中で分散させた後、ＰＢＳで洗浄した。
【００５９】得られた増殖細胞をマシュー・ジェー・コスラら『プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユー・エス・エー』、第８６巻、５，２２７乃至５，２３１頁（１９８９年）に記載された方法に準じて１０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩を含む１０倍容の氷冷２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄し、３倍容の新鮮な同一緩衝液中、氷冷下で２０分間静置し、−８０℃で凍結後、解凍して細胞を破砕した。破砕物を遠心分離し、上清を予め１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）で平衡化させておいたファルマシア製イオン交換クロマトグラフィー用ゲル『ＤＥＡＥ−セファロース』のカラムに負荷し、カラムを１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）で洗浄後、塩化ナトリウム濃度が０Ｍから０．５Ｍまで段階的に上昇する１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）を通液し、塩化ナトリウム濃度が０．２Ｍ付近で溶出した画分を採取した。
【００６０】この画分を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）に対して透析後、予め１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化させておいたトーソー製イオン交換クロマトグラフィー用ゲル『ＤＥＡＥ ５ＰＷ』のカラムに負荷し、０Ｍから０．５Ｍに直線的に上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．８）を通液し、塩化ナトリウム濃度が０．２乃至０．３Ｍ付近で溶出した画分を採取した。
【００６１】この新たに得られた画分を合一し、ＰＢＳに対して透析する一方、同じ特許出願人による特願平７−５８２４０号明細書に記載された方法にしたがってモノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィー用ゲルを調製し、プラスチック製円筒管内部にカラム状に充填し、ＰＢＳで洗浄後、上記透析内液をカラムに負荷した。カラムに１００ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）を通液し、得られる溶出画分から免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質を含む画分を採取し、滅菌蒸留水に対して透析し、膜濾過により濃縮後、凍結乾燥して精製蛋白質の固状物を得た。収量は、ハムスター１匹当たり約５０ｎｇであった。
【００６２】
【実施例Ａ−２】
＜蛋白質の製造＞生後間もないヌードマウス新生児の背部皮下にヒト急性骨髄性白血病由来の骨髄単球系細胞株の一種であるＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４６）を約１×１０6 個／匹注射移植し、通常一般の方法で４週間飼育した。皮下に生じた腫瘍塊（約２０ｇ／匹）を摘出し、常法により生理食塩水中で分散させ、得られた増殖細胞を洗浄し、実施例Ａ−１と同様にして破砕し、破砕物を精製したところ、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する精製蛋白質がヌードマウス１匹当たり約２０ｎｇ得られた。
【００６３】その後、精製蛋白質の一部をとり、実験例２乃至４の方法に準じて分析したところ、精製蛋白質はＮ末端付近に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、実験例１の蛋白質と同様の分子量、生物作用を示した。
【００６４】
【実施例Ａ−３】
＜蛋白質の製造＞孔径０．５ミクロンのメンブランフィルターを取付けた内容量約１０ｍｌのプラスチック製円筒型拡散チェンバー内にＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）でヒト急性前骨髄性白血病由来の骨髄単球系細胞株の一種であるＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４０）を浮遊させ、成長ラットの腹腔内に埋設した。この状態でラットを通常一般の方法で４週間飼育した後、拡散チェンバーを取出した。拡散チェンバーから増殖細胞を採取し、生理食塩水で洗浄後、実施例Ａ−１と同様にして破砕し、破砕物を精製したところ、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する精製蛋白質がラット１匹当たり約２０ｎｇの収量で得られた。
【００６５】その後、精製蛋白質の一部をとり、実験例２乃至４の方法に準じて分析したところ、精製蛋白質はＮ末端付近に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、実験例１の蛋白質と同様の分子量、生物作用を示した。
【００６６】
【実施例Ａ−４】
＜蛋白質の製造＞ヒト急性単球性白血病由来の骨髄単球系細胞株の一種であるＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ２０２）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）に細胞密度約３×１０5 個／ｍｌになるように浮遊させ、培養培地を新鮮なものと取換えながら、１０％ＣＯ2 インキュベータ中、３７℃で３週間培養した。培養物から増殖細胞を分離し、生理食塩水で洗浄後、実施例Ａ−１と同様にして破砕し、破砕物を精製したところ、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する精製蛋白質が培養物１ｌ当たり約１０ｎｇの収量で得られた。
【００６７】その後、精製蛋白質の一部をとり、実験例２乃至４の方法に準じて分析したところ、精製蛋白質はＮ末端付近に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、実験例１の蛋白質と同様の分子量、生物作用を示した。
【００６８】
【実施例Ａ−５】
＜蛋白質の製造＞常法により、生後間もないハムスターの新生児にウサギ由来の抗胸腺抗血清を注射して免疫反応を減弱させた後、ハムスターの背部皮下にヒト顎下腺類表皮癌由来の上皮様細胞株の一種であるＡ−２５３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ４１）を約５×１０5 個／匹注射移植し、通常一般の方法で３週間飼育した。そして、皮下に生じた腫瘍塊（約１０ｇ／匹）を摘出し、常法により生理食塩水中で分散させた後、ＰＢＳで洗浄した。
【００６９】得られた増殖細胞を１０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム及び０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩をそれぞれ含む２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄し、新鮮な同一緩衝液に細胞密度約２×１０7 個／ｍｌになるように浮遊させ、ホモゲナイザーにより破砕し、遠心分離により細胞残渣を除去して得られた上清を限外濾過膜により濃縮して免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質を含む細胞抽出液を得た。この細胞抽出液を実施例Ａ−１の方法により精製し、濃縮し、凍結乾燥したところ、精製蛋白質の固状物がハムスター１匹当たり約３μｇの収量で得られた。
【００７０】その後、精製蛋白質の一部をとり、実験例２乃至４の方法に準じて分析したところ、精製蛋白質はＮ末端付近に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、実験例１の蛋白質と同様の分子量、生物作用を示した。
【００７１】
【実施例Ａ−６】
＜蛋白質の製造＞１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）を用い、Ａ−２５３細胞を常法にしたがって単層状態になるまで３７℃で培養した後、ギブコ製トリプシン製剤『トリプシン−ＥＤＴＡ』により増殖細胞を培養器から剥離させ、ＰＢＳにより洗浄した。以後、実施例Ａ−１の方法に準じて、増殖細胞を破砕し、破砕物を遠心分離して得られた上清を３７℃で６時間インキュベートした後、精製し、濃縮し、凍結乾燥したところ、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質の精製固状物が細胞１０7 個当たり約１μｇの収量で得られた。
【００７２】その後、精製蛋白質の一部をとり、実験例２乃至４の方法に準じて分析したところ、精製蛋白質はＮ末端付近に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、実験例１の蛋白質と同様の分子量、生物作用を示した。
【００７３】
【実施例Ａ−７】
＜蛋白質の製造＞１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）を用い、Ａ−２５３細胞を常法にしたがって単層状態になるまで３７℃で培養した後、培養培地を血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）に取替え、誘導剤としてＫＧ−１細胞由来の天然型ヒトＩＦＮ−γを１０ＩＵ／ｍｌになるように加え、３７℃でさらに４８時間培養した。培養物を遠心分離し、得られた上清を実施例Ａ−１の方法により精製し、濃縮し、凍結乾燥したところ、免疫担当細胞にＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質の精製固状物が細胞１０7 個当たり約５ｎｇの収量で得られた。
【００７４】その後、精製蛋白質の一部をとり、実験例２乃至４の方法に準じて分析したところ、精製蛋白質はＮ末端付近に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、実験例１の蛋白質と同様の分子量、生物作用を示した。
【００７５】
【実施例Ａ−８】
＜蛋白質の製造＞実施例Ａ−１の方法により得た精製蛋白質を適量の滅菌蒸留水に溶解し、溶液を予め０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液により平衡化させておいた昭和電工製高速液体クロマトグラフィー用ゲル『アサヒパックＣ４Ｐ−５０ ４Ｅ』のカラムに負荷し、カラムを０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液により洗浄した後、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含み、アセトニトリルの濃度が０％（ｖ／ｖ）から９０％（ｖ／ｖ）に直線的に上昇するトリフルオロ酢酸／アセトニトリル／水混液を６０ｍｌ／時間の流速で通液した。溶出画分から免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質を含む画分を採取し、１Ｍトリス水溶液（ｐＨ１１．２）により中和し、常法にしたがって濃縮し、アセトニトリルを除去したところ、純度約９５％以上の濃縮蛋白質が原料蛋白質固形分当たり約１０％の収量で得られた。
【００７６】その後、この濃縮蛋白質の一部をとり、実験例２の方法に準じて分析したところ、分子量１８，４００±１，０００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ誘導能ある蛋白質の単一バンドを示した。さらに、実験例３及び４の方法に準じて分析したところ、濃縮蛋白質はＣ末端付近に配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有するとともに、Ｎ末端付近に配列表における配列番号１、詳細には、配列番号７に示すアミノ酸配列を、また、中間部に配列表における配列番号４及び５に示すアミノ酸配列をそれぞれ有し、高純度に濃縮した場合においても、実験例１の蛋白質と同様の生物作用を示した。
【００７７】
【実施例Ｂ−１】
＜液剤＞安定剤として１％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミンを含む生理食塩水に実施例Ａ−１の方法により得た精製蛋白質を１ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、常法にしたがって精密濾過により除菌して液剤を得た。
【００７８】安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための注射剤、点眼剤及び点鼻剤として有用である。
【００７９】
【実施例Ｂ−２】
＜乾燥注射剤＞安定剤として１％（ｗ／ｖ）精製ゼラチンを含む生理食塩水１００ｍｌに実施例Ａ−２の方法により得た精製蛋白質を１００ｍｇ溶解し、常法にしたがって精密濾過により除菌し、バイアル瓶に１ｍｌずつ分注し、凍結乾燥後、密栓した。
【００８０】安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための乾燥注射剤として有用である。
【００８１】
【実施例Ｂ−３】
＜乾燥注射剤＞実施例Ａ−５の方法により得た精製蛋白質と、安定剤として林原製結晶トレハロース粉末『トレハオース』をそれぞれ用いた以外は実施例Ｂ−２と同様にして固形製剤を得た。
【００８２】安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための乾燥注射剤として有用である。
【００８３】
【実施例Ｂ−４】
＜軟膏剤＞滅菌蒸留水に和光純薬工業製カルボキシビニルポリマー『ハイビスワコー１０４』と林原製結晶トレハロース粉末『トレハオース』をそれぞれ濃度１．４％（ｗ／ｗ）及び２．０％（ｗ／ｗ）になるように溶解し、実施例Ａ−３の方法により得た精製蛋白質を均一に混合後、ｐＨ７．２に調整して、１ｇ当たり精製蛋白質を約１ｍｇ含むペースト状物を得た。
【００８４】延展性と安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患を含む感受性疾患の治療・予防するための軟膏剤として有用である。
【００８５】
【実施例Ｂ−５】
＜錠剤＞林原製無水結晶α−マルトース粉末『ファイントース』に実施例Ａ−４の方法により得た精製蛋白質と細胞賦活剤としてのルミンを均一に混合し、得られる混合物を常法により打錠して製品１錠（約２００ｍｇ）当たり精製蛋白質及びルミンをそれぞれ約１ｍｇ含む錠剤を得た。
【００８６】摂取性、安定性に優れ、細胞賦活作用も有する本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための錠剤として有用である。
【００８７】
【実施例Ｂ−６】
＜養子免疫療法剤＞悪性リンパ腫患者の末梢血から単核球を単離し、３７℃に予温した１０％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）に細胞密度約１×１０6 個／ｍｌになるように浮遊させ、実施例Ａ−１の方法により得た精製蛋白質を約１０ｎｇ／ｍｌと組換え型ヒトインターロイキン２を約１００単位／ｍｌ加え、５％ＣＯ2 インキュベータ中、３７℃で１週間培養した後、遠心分離によりＬＡＫ細胞を採取した。
【００８８】このＬＡＫ細胞は、元の悪性リンパ腫患者の体内に移入すると、リンパ腫細胞に顕著な細胞障害性を示し、インターロイキン２のみ用いる養子免疫療法と比較して有意に高い治療効果を発揮する。なお、ヒト単核球に代えて腫瘍組織浸潤リンパ球を同様に処置して得られる細胞障害性Ｔ細胞も、元の患者の体内に移入すると、ＬＡＫ細胞と同様の効果を発揮する。本例の養子免疫療法剤は、悪性リンパ腫以外に、例えば、悪性腎腫瘍、悪性黒色腫、大腸癌、肺癌などの固形悪性腫瘍にも有利に適用できる。
【００８９】
【発明の効果】以上説明したごとく、この発明は免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する新規な蛋白質と、その蛋白質を産生し得るヒト細胞の発見に基づくものである。この発明の蛋白質はアミノ酸配列の一部までが解明された物質であり、免疫担当細胞において安定したＩＦＮ−γ誘導能を発揮する。これにより、この発明の蛋白質は細胞培養によりＩＦＮ−γを製造するためのＩＦＮ−γ誘導剤として、さらには、ＩＦＮ−γ感受性を有するウイルス性疾患、悪性腫瘍、免疫疾患一般に対する治療剤・予防剤として多種多様の用途を有することとなる。また、キラー細胞による細胞障害性の増強又はキラー細胞の生成を誘導する性質を兼備するこの発明の蛋白質を有効成分とする感受性疾患剤は、悪性腫瘍などの難治性疾患の治療に格別の効果を発揮する。
【００９０】この発明の蛋白質は強力なＩＦＮ−γ誘導能を有することから、一般に少量で所期のＩＦＮ−γ産生を誘導でき、また、毒性が極めて低いことから、多量投与しても重篤な副作用を惹起することがない。したがって、この発明の蛋白質は、使用に際して用量を厳密に管理しなくても、所望のＩＦＮ−γ産生を迅速に誘導できる利点がある。特に、この発明の蛋白質はヒト細胞に由来するので、組換えＤＮＡ技術により人工的に創製したポリペプチドに比べて、医薬品に配合してヒトに投与したときの副作用や抗体産生の少ない特徴がある。
【００９１】斯くも有用なる蛋白質は、ヒト細胞を利用するこの発明の製造方法により、所望量を容易に製造することができる。
【００９２】この発明は斯くも顕著な作用効果を奏するものであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明であると云える。
【００９３】
【配列表】
配列番号：1配列の長さ：10配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：N末端フラグメント配列Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser1 5 10
【００９４】配列番号：2配列の長さ：50配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：N末端フラグメント配列 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn Asp 1 5 10 15 Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp Met Thr 20 25 30 Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile Ile Ser 35 40 45 50
【００９５】配列番号：3配列の長さ：10配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：C末端フラグメント配列Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp1 5 10
【００９６】配列番号：4配列の長さ：14配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg 1 5 10
【００９７】配列番号：5配列の長さ：17配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 1 5 10 15
【００９８】配列番号：6配列の長さ：157配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn Asp 1 5 10 15 Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp Met Thr 20 25 30 Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met 35 40 45 50 Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys 55 60 65 Glu Lys Ile Ser Xaa Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu 70 75 80 85 Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe 90 95 100 Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser 105 110 115 Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu 120 125 130 135 Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val 140 145 150 Gln Asn Glu Asp 155
【００９９】配列番号：7配列の長さ：13配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：N末端フラグメント配列 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg 1 5 10
【０１００】配列番号：8配列の長さ：25配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Ile Ile Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln 1 5 10 15 Ser Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys 20 25
【０１０１】配列番号：9配列の長さ：18配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Gln Pro Val Phe Glu Asp Met Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro 1 5 10 15 Gln
【０１０２】配列番号：10配列の長さ：471配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA配列の特徴起源生物名：マウス組織の種類：肝臓配列の特徴配列を表わす記号：mat peptide存在位置：1...471特徴を決定した方法：S配列 AAC TTT GGC CGA CTT CAC TGT ACA ACC GCA GTA ATA CGG AAT ATA AAT 48 Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn 1 5 10 15 GAC CAA GTT CTC TTC GTT GAC AAA AGA CAG CCT GTG TTC GAG GAT ATG 96 Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met 20 25 30 ACT GAT ATT GAT CAA AGT GCC AGT GAA CCC CAG ACC AGA CTG ATA ATA 144 Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile 35 40 45 TAC ATG TAC AAA GAC AGT GAA GTA AGA GGA CTG GCT GTG ACC CTC TCT 192 Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser 50 55 60 GTG AAG GAT AGT AAA AYG TCT ACC CTC TCC TGT AAG AAC AAG ATC ATT 240 Val Lys Asp Ser Lys Xaa Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile 65 70 75 80 TCC TTT GAG GAA ATG GAT CCA CCT GAA AAT ATT GAT GAT ATA CAA AGT 288 Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser 85 90 95 GAT CTC ATA TTC TTT CAG AAA CGT GTT CCA GGA CAC AAC AAG ATG GAG 336 Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu 100 105 110 TTT GAA TCT TCA CTG TAT GAA GGA CAC TTT CTT GCT TGC CAA AAG GAA 384 Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu 115 120 125 GAT GAT GCT TTC AAA CTC ATT CTG AAA AAA AAG GAT GAA AAT GGG GAT 432 Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp 130 135 140 AAA TCT GTA ATG TTC ACT CTC ACT AAC TTA CAT CAA AGT 471 Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser 145 150 155
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明による蛋白質のペプチド・マップである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 Ｎ末端付近に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するヒト細胞由来の蛋白質。
【請求項２】 Ｎ末端に配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列を有する請求項１に記載の蛋白質。
【請求項３】 Ｃ末端付近に配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有する請求項１又は２に記載の蛋白質。
【請求項４】 中間部に配列表における配列番号４及び５に示すアミノ酸配列を有する請求項１、２又は３に記載の蛋白質。
【請求項５】 配列表における配列番号６に示すアミノ酸配列（ただし、符合「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表わすものとする）を含んでなる請求項１、２、３又は４に記載の蛋白質。
【請求項６】 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定すると、分子量１４，０００乃至２４，０００ダルトンを示す請求項１、２、３、４又は５に記載の蛋白質。
【請求項７】 キラー細胞による細胞障害性の増強又はキラー細胞の生成を誘導する性質を有する請求項１、２、３、４、５又は６に記載の蛋白質。
【請求項８】 ヒト造血系細胞に由来する請求項１、２、３、４、５、６又は７に記載の蛋白質。
【請求項９】 請求項１乃至８に記載の蛋白質を産生し得るヒト細胞を増殖させ、増殖細胞から蛋白質を採取してなる蛋白質の製造方法。
【請求項１０】ヒト細胞がヒト造血系細胞株である請求項９に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１１】ヒト細胞をヒト以外の温血動物に移植し、その温血動物の体液を利用しながら増殖させる請求項９又は１０に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１２】温血動物が齧歯類である請求項１１に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１３】増殖細胞を破砕し、破砕物から蛋白質を採取する請求項９、１０、１１又は１２に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１４】増殖細胞に誘導剤を作用させる請求項９、１０、１１、１２又は１３に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１５】蛋白質を塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動及び／又は等電点電気泳動により採取する請求項９、１０、１１、１２、１３又は１４に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１６】有効成分として請求項１乃至８に記載の蛋白質を含んでなる感受性疾患剤。
【請求項１７】インターロイキン２をさらに含んでなる請求項１６に記載の感受性疾患剤。
【請求項１８】安定剤として血清アルブミン、ゼラチン、トレハロース及び／又はマルトースを含んでなる請求項１６又は１７に記載の感受性疾患剤。
【請求項１９】抗腫瘍剤としての請求項１６、１７又は１８に記載の感受性疾患剤。
【請求項２０】抗腫瘍免疫療法剤としての請求項１９に記載の感受性疾患剤。
【請求項２１】抗ウイルス剤としての請求項１６、１７又は１８に記載の感受性疾患剤。
【請求項２２】抗菌剤としての請求項１６、１７又は１８に記載の感受性疾患剤。
【請求項２３】免疫疾患剤としての請求項１６、１７又は１８に記載の感受性疾患剤。
【請求項２４】インターロイキン１２をさらに含んでなる請求項２３に記載の感受性疾患剤。
【請求項２５】アトピー性疾患を治療するための請求項２３又は２４に記載の感受性疾患剤。
【請求項１】 Ｎ末端付近に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するヒト細胞由来の蛋白質。
【請求項２】 Ｎ末端に配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列を有する請求項１に記載の蛋白質。
【請求項３】 Ｃ末端付近に配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有する請求項１又は２に記載の蛋白質。
【請求項４】 中間部に配列表における配列番号４及び５に示すアミノ酸配列を有する請求項１、２又は３に記載の蛋白質。
【請求項５】 配列表における配列番号６に示すアミノ酸配列（ただし、符合「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表わすものとする）を含んでなる請求項１、２、３又は４に記載の蛋白質。
【請求項６】 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定すると、分子量１４，０００乃至２４，０００ダルトンを示す請求項１、２、３、４又は５に記載の蛋白質。
【請求項７】 キラー細胞による細胞障害性の増強又はキラー細胞の生成を誘導する性質を有する請求項１、２、３、４、５又は６に記載の蛋白質。
【請求項８】 ヒト造血系細胞に由来する請求項１、２、３、４、５、６又は７に記載の蛋白質。
【請求項９】 請求項１乃至８に記載の蛋白質を産生し得るヒト細胞を増殖させ、増殖細胞から蛋白質を採取してなる蛋白質の製造方法。
【請求項１０】ヒト細胞がヒト造血系細胞株である請求項９に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１１】ヒト細胞をヒト以外の温血動物に移植し、その温血動物の体液を利用しながら増殖させる請求項９又は１０に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１２】温血動物が齧歯類である請求項１１に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１３】増殖細胞を破砕し、破砕物から蛋白質を採取する請求項９、１０、１１又は１２に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１４】増殖細胞に誘導剤を作用させる請求項９、１０、１１、１２又は１３に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１５】蛋白質を塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動及び／又は等電点電気泳動により採取する請求項９、１０、１１、１２、１３又は１４に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１６】有効成分として請求項１乃至８に記載の蛋白質を含んでなる感受性疾患剤。
【請求項１７】インターロイキン２をさらに含んでなる請求項１６に記載の感受性疾患剤。
【請求項１８】安定剤として血清アルブミン、ゼラチン、トレハロース及び／又はマルトースを含んでなる請求項１６又は１７に記載の感受性疾患剤。
【請求項１９】抗腫瘍剤としての請求項１６、１７又は１８に記載の感受性疾患剤。
【請求項２０】抗腫瘍免疫療法剤としての請求項１９に記載の感受性疾患剤。
【請求項２１】抗ウイルス剤としての請求項１６、１７又は１８に記載の感受性疾患剤。
【請求項２２】抗菌剤としての請求項１６、１７又は１８に記載の感受性疾患剤。
【請求項２３】免疫疾患剤としての請求項１６、１７又は１８に記載の感受性疾患剤。
【請求項２４】インターロイキン１２をさらに含んでなる請求項２３に記載の感受性疾患剤。
【請求項２５】アトピー性疾患を治療するための請求項２３又は２４に記載の感受性疾患剤。
【図１】
【公開番号】特開平９−２８９８９６
【公開日】平成９年（１９９７）１１月１１日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平８−２６９１０５
【出願日】平成８年（１９９６）９月２０日
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【公開日】平成９年（１９９７）１１月１１日
【国際特許分類】
【出願日】平成８年（１９９６）９月２０日
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
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