免疫測定法
【課題】 検体を希釈することなく、検体中に存在するＣＡ１５−３を精度よく広い濃度域で測定し得る方法を提供する。
【解決手段】 ＣＡ１５−３とＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）との反応をポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を含有する水溶液（Ｗ）中で行う工程を含むことを特徴とするＣＡ１５−３の免疫測定法。前記免疫測定法は下記工程１〜４を含むヘテロジニアスな免疫測定法であることが好ましい。
工程１：不溶性担体（Ｂ）に結合した前記配位子（Ａ１）とＣＡ１５−３の反応を前記水溶液（Ｗ）中で行う工程。
工程２：工程１のポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤をＢ／Ｆ分離で除く工程。
工程３：工程１で得られた反応物に標識体（Ｃ）を反応させる工程。
工程４：工程３で得られた反応物中の標識体（Ｄ）の量を計測する工程。
【解決手段】 ＣＡ１５−３とＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）との反応をポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を含有する水溶液（Ｗ）中で行う工程を含むことを特徴とするＣＡ１５−３の免疫測定法。前記免疫測定法は下記工程１〜４を含むヘテロジニアスな免疫測定法であることが好ましい。
工程１：不溶性担体（Ｂ）に結合した前記配位子（Ａ１）とＣＡ１５−３の反応を前記水溶液（Ｗ）中で行う工程。
工程２：工程１のポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤をＢ／Ｆ分離で除く工程。
工程３：工程１で得られた反応物に標識体（Ｃ）を反応させる工程。
工程４：工程３で得られた反応物中の標識体（Ｄ）の量を計測する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は臨床検査薬等に応用可能な免疫測定法に関する。更に詳しくは、体液中に広い濃度域で存在するＣＡ１５−３を精度良く測定が可能な免疫測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＡ１５−３は、ヒト乳脂肪球膜上の糖蛋白ＭＡＭ−６を免疫原として作製されたモノクローナル抗体１１５Ｄ８と乳癌の肝転移細胞株ＭＣＦ−７の細胞膜成分を免疫原として樹立されたモノクローナル抗体ＤＦ３により認識される糖鎖抗原である。ＣＡ１５−３は、癌細胞の破壊により血中に放出されると考えられており、再発乳癌や転移性乳癌においては血中濃度の上昇が著しいことが知られている。
【０００３】
従来、高濃度の抗原をホモジニアスな免疫測定で定量する場合には比濁法や比朧法が主に用いられてきた（例えば非特許文献１参照）。しかし、比濁法や比朧法では低濃度域を測定することは困難である。一方、ヘテロジニアスな免疫測定で高い濃度域の抗原を含む検体を希釈せずに免疫測定する方法としては、反応系のｐＨを２〜４．５とする方法（例えば特許文献１参照）や、測定対象物と不溶性担体に結合した配位子を反応させる際、遊離の配位子を添加する方法（例えば特許文献２参照）等が知られている。しかし、これらの方法では希釈無しに測定できる抗原の濃度範囲が狭く、またｐＨや添加する配位子量のわずかな変動により測定可能な濃度域が変化するという問題がある。一方、検体を希釈することにより測定できる抗原の濃度範囲は広くなるが、多数の検体を測定する時、繁雑な希釈操作が必要なばかりでなく、希釈誤差による測定値の変動が起きるという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】「臨床検査マニュアル」（株式会社文光堂、１９８８年刊行）ｐ１１７〜１１９
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平０２−１２８１５９号公報
【特許文献２】特開平０２−０８２１６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、検体を希釈することなく、検体中に存在するＣＡ１５−３を精度よく広い濃度域で測定し得る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、ＣＡ１５−３とＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）との反応をポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を含有する水溶液（Ｗ）中で行う工程を含むことを特徴とするＣＡ１５−３の免疫測定法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の免疫測定法を用いることにより、再発乳癌や転移性乳癌において血中濃度の上昇が著しいことが知られているＣＡ１５−３を、検体を希釈することなく、広範囲な濃度域で精度よく測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】標準液のＣＡ１５−３濃度と発光量の関係を表したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
ＣＡ１５−３とＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）との反応をポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を含有する水溶液（Ｗ）中で行うことにより、検体を希釈することなく、広範囲な濃度域で精度よくＣＡ１５−３を測定することができる。
【００１１】
水溶液（Ｗ）中のＣＡ１５−３の濃度は、測定精度の観点から好ましくは０．５〜４００Ｕ／ｍＬ、更に好ましくは０．５〜３００Ｕ／ｍＬである。
【００１２】
ＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）は、ＣＡ１５−３を特異的に認識する物質であり、従来免疫測定で用いられた物が全て使用できる。即ち、ＣＡ１５−３に対する抗体並びにレクチン、アビジン及びビオチン等の特異的な結合を生じる物質等が使用できる。また、ＣＡ１５−３を特異的に認識する配位子（１）と、配位子（１）を特異的に認識する配位子（２）を組み合わせて用いることも可能である。
【００１３】
配位子（Ａ１）が抗体の場合、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、更に免疫活性を保持した抗体の分解物、例えば抗体をペプシンで消化して得られるＦ（ａｂ’）２、これを更に還元して得られるＦａｂ’等であってもよい。
使用する配位子（Ａ１）の量は、（Ａ１）の種類やＣＡ１５−３の量等により適宜好ましい範囲を選択することができる。
【００１４】
本発明に用いられるポリエチレングリコールの数平均分子量（以下、Ｍｎと略記）は、２，０００〜２００，０００が好ましく、更に好ましくは５，０００〜１００，０００、特に好ましくは６，０００〜５０，０００である。Ｍｎ５，０００以下であるとＣＡ１５−３と比較してＭｎが小さく、ＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）間との作用が起きにくくなる傾向にあり、またＭｎが２００，０００を超えると溶液の粘度が高くなり、免疫反応性が低下する傾向にある。
本発明におけるＭｎはゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより、溶媒としてテトラヒドロフランを用い、ポリエチレングリコールを標準物質として測定される。
【００１５】
非イオン界面活性剤としては、アルキレンオキサイド（以下、ＡＯと略記）付加型非イオン界面活性剤［高級アルコールのＡＯ付加物、アルキルフェノールのＡＯ付加物、ポリプロピレングリコールエチレンオキサイド付加物、ポリエチレングリコールプロピレンオキサイド付加物及び脂肪酸ＡＯ付加物］及び多価アルコール型非イオン界面活性剤等が挙げられる。
【００１６】
非イオン界面活性剤におけるＡＯとしては、エチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記）、プロピレンオキサイド（以下、ＰＯと略記）及びブチレンオキサイド等が挙げられる。
【００１７】
高級アルコールのＡＯ付加物としては、炭素数８〜２４の高級アルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコール及びオレイルアルコール等）のＥＯ１〜２０モル付加物等及び炭素数８〜２４の高級アルコールのＰＯ１〜４０モル付加物等が挙げられる。
【００１８】
アルキルフェノールのＡＯ付加物としては、炭素数７〜３６のアルキルフェノール（ノニルフェノール及びセチルフェノール等）のＥＯ１〜４０モル付加物等及び炭素数７〜３６のアルキルフェノールのＰＯ１〜４０モル付加物等が挙げられる。
【００１９】
ポリプロピレングリコールＥＯ付加物としては、プルロニック型界面活性剤が挙げられ、プロピレンオキシドの繰り返し単位が１０〜１００個のポリプロピレングリコールのＥＯ２〜４０モル付加物等が挙げられる。
【００２０】
ポリエチレングリコールＰＯ付加物としては、エチレンオキシドの繰り返し単位が１０〜１００個のポリエチレングリコールのＰＯ２〜２０モル付加物等が挙げられる。
【００２１】
脂肪酸ＡＯ付加物としては、炭素数８〜２４の高級脂肪酸（ラウリル酸、ステアリン酸及びオレイン酸等）のＥＯ１〜２５モル付加物等が挙げられる。
【００２２】
多価アルコール型非イオン界面活性剤としては、炭素数３〜３６の２〜８価の多価アルコール（グリセリン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ソルビット及びソルビタン等）の脂肪酸（炭素数８〜２４）エステル等、炭素数３〜３６の２〜８価の多価アルコールの脂肪酸（炭素数８〜２４）エステルのＥＯ及び／又はＰＯ付加物等並びに脂肪酸（炭素数１０〜１８）アルカノールアミド（ラウリン酸モノエタノールアミド及びラウリン酸ジエタノールアミド等）等が挙げられる。
【００２３】
これらの内、好ましいのはＣＡ１５−３とＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）との反応性の観点から、高級アルコールのＡＯ付加物及びアルキルフェノールのＡＯ付加物であり、更に好ましいのは炭素数８〜２４の高級アルコールのＥＯ１〜２０モル付加物であり、特に好ましいのはラウリルアルコールのＥＯ１〜１０モル付加物である。
【００２４】
ポリエチレングリコール及び非イオン界面活性剤はそれぞれ１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用することも可能である。
ポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤の含有量は、ＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）の種類等により種々の値を取り得るが、水溶液（Ｗ）の重量を基準として、測定精度及び免疫反応性の観点から好ましくは１〜７重量％、更に好ましくは２〜５重量％、特に好ましくは３〜５重量％である。
【００２５】
ポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を含有する水溶液（Ｗ）は、更に通常免疫反応に用いられる緩衝剤（例えばリン酸及びグッド緩衝剤等）、牛血清アルブミン等のタンパク質、食塩及び防腐剤等を含有することができる。
【００２６】
ＣＡ１５−３とＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）との反応をポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を含有する水溶液（Ｗ）中で行う工程を含む免疫測定法の内、最も好ましいのは、不溶性担体（Ｂ）を用いたヘテロジニアスな免疫測定法であり、以下の工程１〜４を含む免疫測定法である。
工程１：不溶性担体（Ｂ）に結合したＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）とＣＡ１５−３の反応をポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を含有する水溶液（Ｗ）中で行う工程。
工程２：ポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤をＢ／Ｆ分離で除く工程。
工程３：工程１で得られた反応物に標識体（Ｃ）を反応させる工程。
工程４：工程３で得られた反応物中の標識体（Ｄ）の量を計測する工程。
【００２７】
工程１における不溶性担体（Ｂ）としては、従来公知のもの等、例えば、ガラス又はポリスチレン等の高分子を素材とするビーズ、試験管又は微粒子等の形状のものが使用できる。
また、配位子（Ａ１）と不溶性担体（Ｂ）の結合方法も従来公知の物理吸着法又は化学結合法等が使用でき、例えば、不溶性担体（Ｂ）がポリスチレンの場合、物理吸着法が一般に用いられ、配位子（Ａ１）を０．００１〜０．０４％（Ｗ／Ｖ）含有する炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に不溶性担体（Ｂ）を適当時間浸漬することにより行われる。化学結合法としては、シランカップリング剤を用いて配位子をガラスに結合させる方法（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２４２巻，１９７１年，ｐ．６５９−６６１に記載の方法）等がある。
【００２８】
工程２は、通常Ｂ／Ｆ分離の操作で実施できる。例えば、液をアスピレーター等で除去し、脱イオン水、生理食塩水等を加えてＣＡ１５−３と反応した配位子（Ａ１）を有する不溶性担体（Ｂ）を洗浄し、再度液を除去することで、ポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を除くことができる。
工程２は、工程１と工程３の間又は工程３と工程４の間に実施することが好ましく、両方で実施することが更に好ましい。
【００２９】
工程３で使用される標識体（Ｃ）は、標識物質と配位子（Ａ２）の結合体である。
標識物質は、従来公知のもの等、例えばラジオアイソトープ、蛍光物質、発光物質及び酵素等が使用でき、標識物質と配位子（Ａ２）の結合は従来公知の方法等、例えば「続生化学実験講座５免疫生化学実験法」（日本生化学会編、東京化学同人、１９８６年発行）ｐ１０２〜１１２に記載の方法で実施することができる。
標識物質がアイソトープの場合、例えばクロラミンＴを酸化剤として用いて放射性ヨウ素を配位子（Ａ２）のチロシン残基に導入できる。標識物質が蛍光物質の場合、例えばフルオレセインイソチオシアネートを緩衝液中で配位子（Ａ２）に反応させると、配位子（Ａ２）のリシン残基に結合する。
標識物質が酵素の場合、例えば酵素の持つアミノ基と配位子（Ａ２）の持つチオール基をＮ−スクシンイミジル６−マレイドヘキサノエート等のニ架橋性試薬で結合することができる。
標識物質が発光物質の場合、例えばアクリジニウム誘導体−Ｉ（同人化学研究所社製）を緩衝液中で配位子（Ａ２）に反応させると、配位子（Ａ２）のアミノ基に発光化合物であるアクリジニウム誘導体を結合できる。
【００３０】
標識体（Ｃ）に用いられる配位子（Ａ２）としては、前述のＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）と同様のものが使用できる。この場合、工程１においてポリエチレングリコール及び／又はノニオン性界面活性剤を含有する水溶液（Ｗ）中でＣＡ１５−３との反応に用いられる配位子（Ａ１）と同じものを配位子（Ａ２）として使用可能であるが、ＣＡ１５−３との認識部位（結合部位）が配位子（Ａ１）と異なるもの、由来する動物が配位子（Ａ１）と異なるもの等を使用する方が望ましい。
【００３１】
工程３の反応は、通常の免疫反応に用いられる緩衝液（例えば、緩衝剤と、タンパク質、食塩及び・又は防腐剤等とを含む水溶液）中で行われる。また、工程３の反応をポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤の存在下で行うことも可能である。
【００３２】
工程４は、標識体（Ｄ）に用いられる標識物質の種類に応じた従来公知の方法で実施できる。標識物質が酵素の場合を例示すると、酵素としてペルオキシダーゼを選択した場合、基質としてはＡＢＴＳ［２、２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ニアンモニウム］や、ルミノール類／過酸化物等が選択でき、それぞれ比色（分光光度計を使用し波長は通常４２０ｎｍ、６２０〜６７０ｎｍで計測）、発光検出（光電子増倍管を用いたフォトンカウンティングで計測）で計測できる。酵素としてアルカリフォスファターゼを選択すれば、基質はｐ−ニトロフェニルフォスフェート、４−ＭＵＰ（４−メチルウンベリフェリルリン酸）又はＡＭＰＰＤ［３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’’−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン］等が使用でき、それぞれ比色（分光光度計を使用し波長は通常４０５ｎｍで計測）、蛍光（蛍光測定機を使用し励起波長は通常３６５ｎｍ、測定波長は通常４５０ｎｍで蛍光強度を計測）、発光検出（光電子増倍管を用いたフォトンカウンティングで計測）で計測できる。
【００３３】
本発明の方法に使用するポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を含有する試薬を、標識体（Ｃ）や不溶性担体（Ｂ）等と組み合わせて、測定試薬セットとして用意することが可能である。これにより、臨床診断に必要な検査を簡便に実施することが可能となる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例により本発明を更に説明するが本発明はこれに限定されるものではない。
［実施例１〜７及び比較例１］
＜ポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を含有する水溶液（Ｗ）の調製＞
脱イオン水１０ｍＬにリン酸二水素カリウム８ｍｇ、リン酸水素二ナトリウム５０ｍｇ、塩化ナトリウム０．０８５ｇ及び１０重量％のアジ化ナトリウム水溶液０．０５ｇを加えて３０分間撹拌を行った後、牛血清アルブミン０．０２ｇを加えて完全に溶解するまで２時間撹拌した。更に表１に記載の量のポリエチレングリコール及び／又はラウリルアルコールＥＯ９モル付加物を加えて１時間撹拌することにより実施例１〜７で使用する水溶液（Ｗ１）〜（Ｗ７）及び比較例１で使用する水溶液（Ｗ’−１）を調整した。
【００３５】
【表１】
【００３６】
＜抗ＣＡ１５−３モノクローナル抗体結合ビーズの調製＞
抗ＣＡ１５−３モノクローナル抗体（ＢＩＯＤＥＳＩＧＮ社製）をｐＨ９の０．１Ｍ炭酸緩衝液に２０μｇ／ｍｌの濃度で溶解させた。直径３ｍｍのガラスビーズ［（株）岡部製作所製ケイ酸塩ガラス］を加え、４８時間反応させた後、０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液でコーティングし乾燥させた。
【００３７】
＜ペルオキシダーゼ標識抗ＣＡ１５−３モノクローナル抗体の調製＞
抗ＣＡ１５−３モノクローナル抗体（ＢＩＯＤＥＳＩＧＮ社製）及び西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（東洋紡社製）を用い、文献［エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２（１９８２）１４１３−１４２４］に記載の方法でペルオキシダーゼ標識抗ＣＡ１５−３モノクローナル抗体を調製した。
【００３８】
＜過酸化水素水の調製＞
２００μｌの３５％過酸化水素水を脱イオン水１リットルに溶解し、過酸化水素水とした。
【００３９】
＜基質液の調製＞
ルミノール［東京化成工業（株）社製］０．１８ｇ及び４−（シアノメチルチオ）フェノール０．１ｇをｐＨ８．５の０．１Ｍ（モル／Ｌ）トリス／塩酸緩衝液１リットルに溶解した。
【００４０】
上記で調製した試薬を用いて、全自動酵素免疫測定装置［オリンパス（株）製「スフィアライト１８０」］」により発光量の測定を行った。即ちまず、抗ＣＡ１５−３モノクローナル抗体結合ビーズ１個が入った反応槽に検体１０μＬ及びポリエチレングリコール及び／又はラウリルアルコールＥＯ９モル付加物を含有する水溶液（Ｗ）１３０μＬを加え、３７℃、約７分間反応させた（工程１）。次いで、ポリエチレングリコール及び／又はラウリルアルコールＥＯ９モル付加物をＢ／Ｆ分離で除いた（工程２）。次に工程１で得られた反応物に１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液で１０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ＣＡ１５−３モノクローナル抗体を１４０μＬ加えて反応させた（工程３）。最後に過酸化水素水７０μＬ及び基質液７０μＬを更に加えて、工程３で得られた反応物中のペルオキシダーゼと反応させることにより、発光量を計測した（工程４）。
上記検体として、０、０．５、３００、４００、１０００Ｕ／ｍＬの各濃度の標準ＣＡ１５−３溶液を用い、上記水溶液（Ｗ）として上記水溶液（Ｗ１）〜（Ｗ７）及び（Ｗ’−１）を用いて測定した発光量の値を表２及び図１に示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】
図１から、本願発明の方法によればＣＡ１５−３の濃度が４００Ｕ／ｍＬ以上の領域では傾きがやや小さくなるものの１０００Ｕ／ｍＬまでの領域で発光量からＣＡ１５−３の濃度を精度よく算出できるのに対し、比較例１の方法では３００Ｕ／ｍＬ以上の領域では発光量が異常に低下し、１０００Ｕ／ｍＬでの発光量は４００Ｕ／ｍＬでの発光量より減少しているため発光量からＣＡ１５−３の濃度を算出できないことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
ＣＡ１５−３とＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）との反応をポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を含有する水溶液（Ｗ）中で行うことにより、広い濃度域のＣＡ１５−３を検体を希釈することなく測定することができるので、ＣＡ１５−３の免疫測定に好適に使用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は臨床検査薬等に応用可能な免疫測定法に関する。更に詳しくは、体液中に広い濃度域で存在するＣＡ１５−３を精度良く測定が可能な免疫測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＡ１５−３は、ヒト乳脂肪球膜上の糖蛋白ＭＡＭ−６を免疫原として作製されたモノクローナル抗体１１５Ｄ８と乳癌の肝転移細胞株ＭＣＦ−７の細胞膜成分を免疫原として樹立されたモノクローナル抗体ＤＦ３により認識される糖鎖抗原である。ＣＡ１５−３は、癌細胞の破壊により血中に放出されると考えられており、再発乳癌や転移性乳癌においては血中濃度の上昇が著しいことが知られている。
【０００３】
従来、高濃度の抗原をホモジニアスな免疫測定で定量する場合には比濁法や比朧法が主に用いられてきた（例えば非特許文献１参照）。しかし、比濁法や比朧法では低濃度域を測定することは困難である。一方、ヘテロジニアスな免疫測定で高い濃度域の抗原を含む検体を希釈せずに免疫測定する方法としては、反応系のｐＨを２〜４．５とする方法（例えば特許文献１参照）や、測定対象物と不溶性担体に結合した配位子を反応させる際、遊離の配位子を添加する方法（例えば特許文献２参照）等が知られている。しかし、これらの方法では希釈無しに測定できる抗原の濃度範囲が狭く、またｐＨや添加する配位子量のわずかな変動により測定可能な濃度域が変化するという問題がある。一方、検体を希釈することにより測定できる抗原の濃度範囲は広くなるが、多数の検体を測定する時、繁雑な希釈操作が必要なばかりでなく、希釈誤差による測定値の変動が起きるという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】「臨床検査マニュアル」（株式会社文光堂、１９８８年刊行）ｐ１１７〜１１９
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平０２−１２８１５９号公報
【特許文献２】特開平０２−０８２１６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、検体を希釈することなく、検体中に存在するＣＡ１５−３を精度よく広い濃度域で測定し得る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、ＣＡ１５−３とＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）との反応をポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を含有する水溶液（Ｗ）中で行う工程を含むことを特徴とするＣＡ１５−３の免疫測定法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の免疫測定法を用いることにより、再発乳癌や転移性乳癌において血中濃度の上昇が著しいことが知られているＣＡ１５−３を、検体を希釈することなく、広範囲な濃度域で精度よく測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】標準液のＣＡ１５−３濃度と発光量の関係を表したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
ＣＡ１５−３とＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）との反応をポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を含有する水溶液（Ｗ）中で行うことにより、検体を希釈することなく、広範囲な濃度域で精度よくＣＡ１５−３を測定することができる。
【００１１】
水溶液（Ｗ）中のＣＡ１５−３の濃度は、測定精度の観点から好ましくは０．５〜４００Ｕ／ｍＬ、更に好ましくは０．５〜３００Ｕ／ｍＬである。
【００１２】
ＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）は、ＣＡ１５−３を特異的に認識する物質であり、従来免疫測定で用いられた物が全て使用できる。即ち、ＣＡ１５−３に対する抗体並びにレクチン、アビジン及びビオチン等の特異的な結合を生じる物質等が使用できる。また、ＣＡ１５−３を特異的に認識する配位子（１）と、配位子（１）を特異的に認識する配位子（２）を組み合わせて用いることも可能である。
【００１３】
配位子（Ａ１）が抗体の場合、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、更に免疫活性を保持した抗体の分解物、例えば抗体をペプシンで消化して得られるＦ（ａｂ’）２、これを更に還元して得られるＦａｂ’等であってもよい。
使用する配位子（Ａ１）の量は、（Ａ１）の種類やＣＡ１５−３の量等により適宜好ましい範囲を選択することができる。
【００１４】
本発明に用いられるポリエチレングリコールの数平均分子量（以下、Ｍｎと略記）は、２，０００〜２００，０００が好ましく、更に好ましくは５，０００〜１００，０００、特に好ましくは６，０００〜５０，０００である。Ｍｎ５，０００以下であるとＣＡ１５−３と比較してＭｎが小さく、ＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）間との作用が起きにくくなる傾向にあり、またＭｎが２００，０００を超えると溶液の粘度が高くなり、免疫反応性が低下する傾向にある。
本発明におけるＭｎはゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより、溶媒としてテトラヒドロフランを用い、ポリエチレングリコールを標準物質として測定される。
【００１５】
非イオン界面活性剤としては、アルキレンオキサイド（以下、ＡＯと略記）付加型非イオン界面活性剤［高級アルコールのＡＯ付加物、アルキルフェノールのＡＯ付加物、ポリプロピレングリコールエチレンオキサイド付加物、ポリエチレングリコールプロピレンオキサイド付加物及び脂肪酸ＡＯ付加物］及び多価アルコール型非イオン界面活性剤等が挙げられる。
【００１６】
非イオン界面活性剤におけるＡＯとしては、エチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記）、プロピレンオキサイド（以下、ＰＯと略記）及びブチレンオキサイド等が挙げられる。
【００１７】
高級アルコールのＡＯ付加物としては、炭素数８〜２４の高級アルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコール及びオレイルアルコール等）のＥＯ１〜２０モル付加物等及び炭素数８〜２４の高級アルコールのＰＯ１〜４０モル付加物等が挙げられる。
【００１８】
アルキルフェノールのＡＯ付加物としては、炭素数７〜３６のアルキルフェノール（ノニルフェノール及びセチルフェノール等）のＥＯ１〜４０モル付加物等及び炭素数７〜３６のアルキルフェノールのＰＯ１〜４０モル付加物等が挙げられる。
【００１９】
ポリプロピレングリコールＥＯ付加物としては、プルロニック型界面活性剤が挙げられ、プロピレンオキシドの繰り返し単位が１０〜１００個のポリプロピレングリコールのＥＯ２〜４０モル付加物等が挙げられる。
【００２０】
ポリエチレングリコールＰＯ付加物としては、エチレンオキシドの繰り返し単位が１０〜１００個のポリエチレングリコールのＰＯ２〜２０モル付加物等が挙げられる。
【００２１】
脂肪酸ＡＯ付加物としては、炭素数８〜２４の高級脂肪酸（ラウリル酸、ステアリン酸及びオレイン酸等）のＥＯ１〜２５モル付加物等が挙げられる。
【００２２】
多価アルコール型非イオン界面活性剤としては、炭素数３〜３６の２〜８価の多価アルコール（グリセリン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ソルビット及びソルビタン等）の脂肪酸（炭素数８〜２４）エステル等、炭素数３〜３６の２〜８価の多価アルコールの脂肪酸（炭素数８〜２４）エステルのＥＯ及び／又はＰＯ付加物等並びに脂肪酸（炭素数１０〜１８）アルカノールアミド（ラウリン酸モノエタノールアミド及びラウリン酸ジエタノールアミド等）等が挙げられる。
【００２３】
これらの内、好ましいのはＣＡ１５−３とＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）との反応性の観点から、高級アルコールのＡＯ付加物及びアルキルフェノールのＡＯ付加物であり、更に好ましいのは炭素数８〜２４の高級アルコールのＥＯ１〜２０モル付加物であり、特に好ましいのはラウリルアルコールのＥＯ１〜１０モル付加物である。
【００２４】
ポリエチレングリコール及び非イオン界面活性剤はそれぞれ１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用することも可能である。
ポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤の含有量は、ＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）の種類等により種々の値を取り得るが、水溶液（Ｗ）の重量を基準として、測定精度及び免疫反応性の観点から好ましくは１〜７重量％、更に好ましくは２〜５重量％、特に好ましくは３〜５重量％である。
【００２５】
ポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を含有する水溶液（Ｗ）は、更に通常免疫反応に用いられる緩衝剤（例えばリン酸及びグッド緩衝剤等）、牛血清アルブミン等のタンパク質、食塩及び防腐剤等を含有することができる。
【００２６】
ＣＡ１５−３とＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）との反応をポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を含有する水溶液（Ｗ）中で行う工程を含む免疫測定法の内、最も好ましいのは、不溶性担体（Ｂ）を用いたヘテロジニアスな免疫測定法であり、以下の工程１〜４を含む免疫測定法である。
工程１：不溶性担体（Ｂ）に結合したＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）とＣＡ１５−３の反応をポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を含有する水溶液（Ｗ）中で行う工程。
工程２：ポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤をＢ／Ｆ分離で除く工程。
工程３：工程１で得られた反応物に標識体（Ｃ）を反応させる工程。
工程４：工程３で得られた反応物中の標識体（Ｄ）の量を計測する工程。
【００２７】
工程１における不溶性担体（Ｂ）としては、従来公知のもの等、例えば、ガラス又はポリスチレン等の高分子を素材とするビーズ、試験管又は微粒子等の形状のものが使用できる。
また、配位子（Ａ１）と不溶性担体（Ｂ）の結合方法も従来公知の物理吸着法又は化学結合法等が使用でき、例えば、不溶性担体（Ｂ）がポリスチレンの場合、物理吸着法が一般に用いられ、配位子（Ａ１）を０．００１〜０．０４％（Ｗ／Ｖ）含有する炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に不溶性担体（Ｂ）を適当時間浸漬することにより行われる。化学結合法としては、シランカップリング剤を用いて配位子をガラスに結合させる方法（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２４２巻，１９７１年，ｐ．６５９−６６１に記載の方法）等がある。
【００２８】
工程２は、通常Ｂ／Ｆ分離の操作で実施できる。例えば、液をアスピレーター等で除去し、脱イオン水、生理食塩水等を加えてＣＡ１５−３と反応した配位子（Ａ１）を有する不溶性担体（Ｂ）を洗浄し、再度液を除去することで、ポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を除くことができる。
工程２は、工程１と工程３の間又は工程３と工程４の間に実施することが好ましく、両方で実施することが更に好ましい。
【００２９】
工程３で使用される標識体（Ｃ）は、標識物質と配位子（Ａ２）の結合体である。
標識物質は、従来公知のもの等、例えばラジオアイソトープ、蛍光物質、発光物質及び酵素等が使用でき、標識物質と配位子（Ａ２）の結合は従来公知の方法等、例えば「続生化学実験講座５免疫生化学実験法」（日本生化学会編、東京化学同人、１９８６年発行）ｐ１０２〜１１２に記載の方法で実施することができる。
標識物質がアイソトープの場合、例えばクロラミンＴを酸化剤として用いて放射性ヨウ素を配位子（Ａ２）のチロシン残基に導入できる。標識物質が蛍光物質の場合、例えばフルオレセインイソチオシアネートを緩衝液中で配位子（Ａ２）に反応させると、配位子（Ａ２）のリシン残基に結合する。
標識物質が酵素の場合、例えば酵素の持つアミノ基と配位子（Ａ２）の持つチオール基をＮ−スクシンイミジル６−マレイドヘキサノエート等のニ架橋性試薬で結合することができる。
標識物質が発光物質の場合、例えばアクリジニウム誘導体−Ｉ（同人化学研究所社製）を緩衝液中で配位子（Ａ２）に反応させると、配位子（Ａ２）のアミノ基に発光化合物であるアクリジニウム誘導体を結合できる。
【００３０】
標識体（Ｃ）に用いられる配位子（Ａ２）としては、前述のＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）と同様のものが使用できる。この場合、工程１においてポリエチレングリコール及び／又はノニオン性界面活性剤を含有する水溶液（Ｗ）中でＣＡ１５−３との反応に用いられる配位子（Ａ１）と同じものを配位子（Ａ２）として使用可能であるが、ＣＡ１５−３との認識部位（結合部位）が配位子（Ａ１）と異なるもの、由来する動物が配位子（Ａ１）と異なるもの等を使用する方が望ましい。
【００３１】
工程３の反応は、通常の免疫反応に用いられる緩衝液（例えば、緩衝剤と、タンパク質、食塩及び・又は防腐剤等とを含む水溶液）中で行われる。また、工程３の反応をポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤の存在下で行うことも可能である。
【００３２】
工程４は、標識体（Ｄ）に用いられる標識物質の種類に応じた従来公知の方法で実施できる。標識物質が酵素の場合を例示すると、酵素としてペルオキシダーゼを選択した場合、基質としてはＡＢＴＳ［２、２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ニアンモニウム］や、ルミノール類／過酸化物等が選択でき、それぞれ比色（分光光度計を使用し波長は通常４２０ｎｍ、６２０〜６７０ｎｍで計測）、発光検出（光電子増倍管を用いたフォトンカウンティングで計測）で計測できる。酵素としてアルカリフォスファターゼを選択すれば、基質はｐ−ニトロフェニルフォスフェート、４−ＭＵＰ（４−メチルウンベリフェリルリン酸）又はＡＭＰＰＤ［３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’’−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン］等が使用でき、それぞれ比色（分光光度計を使用し波長は通常４０５ｎｍで計測）、蛍光（蛍光測定機を使用し励起波長は通常３６５ｎｍ、測定波長は通常４５０ｎｍで蛍光強度を計測）、発光検出（光電子増倍管を用いたフォトンカウンティングで計測）で計測できる。
【００３３】
本発明の方法に使用するポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を含有する試薬を、標識体（Ｃ）や不溶性担体（Ｂ）等と組み合わせて、測定試薬セットとして用意することが可能である。これにより、臨床診断に必要な検査を簡便に実施することが可能となる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例により本発明を更に説明するが本発明はこれに限定されるものではない。
［実施例１〜７及び比較例１］
＜ポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を含有する水溶液（Ｗ）の調製＞
脱イオン水１０ｍＬにリン酸二水素カリウム８ｍｇ、リン酸水素二ナトリウム５０ｍｇ、塩化ナトリウム０．０８５ｇ及び１０重量％のアジ化ナトリウム水溶液０．０５ｇを加えて３０分間撹拌を行った後、牛血清アルブミン０．０２ｇを加えて完全に溶解するまで２時間撹拌した。更に表１に記載の量のポリエチレングリコール及び／又はラウリルアルコールＥＯ９モル付加物を加えて１時間撹拌することにより実施例１〜７で使用する水溶液（Ｗ１）〜（Ｗ７）及び比較例１で使用する水溶液（Ｗ’−１）を調整した。
【００３５】
【表１】
【００３６】
＜抗ＣＡ１５−３モノクローナル抗体結合ビーズの調製＞
抗ＣＡ１５−３モノクローナル抗体（ＢＩＯＤＥＳＩＧＮ社製）をｐＨ９の０．１Ｍ炭酸緩衝液に２０μｇ／ｍｌの濃度で溶解させた。直径３ｍｍのガラスビーズ［（株）岡部製作所製ケイ酸塩ガラス］を加え、４８時間反応させた後、０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液でコーティングし乾燥させた。
【００３７】
＜ペルオキシダーゼ標識抗ＣＡ１５−３モノクローナル抗体の調製＞
抗ＣＡ１５−３モノクローナル抗体（ＢＩＯＤＥＳＩＧＮ社製）及び西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（東洋紡社製）を用い、文献［エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２（１９８２）１４１３−１４２４］に記載の方法でペルオキシダーゼ標識抗ＣＡ１５−３モノクローナル抗体を調製した。
【００３８】
＜過酸化水素水の調製＞
２００μｌの３５％過酸化水素水を脱イオン水１リットルに溶解し、過酸化水素水とした。
【００３９】
＜基質液の調製＞
ルミノール［東京化成工業（株）社製］０．１８ｇ及び４−（シアノメチルチオ）フェノール０．１ｇをｐＨ８．５の０．１Ｍ（モル／Ｌ）トリス／塩酸緩衝液１リットルに溶解した。
【００４０】
上記で調製した試薬を用いて、全自動酵素免疫測定装置［オリンパス（株）製「スフィアライト１８０」］」により発光量の測定を行った。即ちまず、抗ＣＡ１５−３モノクローナル抗体結合ビーズ１個が入った反応槽に検体１０μＬ及びポリエチレングリコール及び／又はラウリルアルコールＥＯ９モル付加物を含有する水溶液（Ｗ）１３０μＬを加え、３７℃、約７分間反応させた（工程１）。次いで、ポリエチレングリコール及び／又はラウリルアルコールＥＯ９モル付加物をＢ／Ｆ分離で除いた（工程２）。次に工程１で得られた反応物に１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液で１０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ＣＡ１５−３モノクローナル抗体を１４０μＬ加えて反応させた（工程３）。最後に過酸化水素水７０μＬ及び基質液７０μＬを更に加えて、工程３で得られた反応物中のペルオキシダーゼと反応させることにより、発光量を計測した（工程４）。
上記検体として、０、０．５、３００、４００、１０００Ｕ／ｍＬの各濃度の標準ＣＡ１５−３溶液を用い、上記水溶液（Ｗ）として上記水溶液（Ｗ１）〜（Ｗ７）及び（Ｗ’−１）を用いて測定した発光量の値を表２及び図１に示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】
図１から、本願発明の方法によればＣＡ１５−３の濃度が４００Ｕ／ｍＬ以上の領域では傾きがやや小さくなるものの１０００Ｕ／ｍＬまでの領域で発光量からＣＡ１５−３の濃度を精度よく算出できるのに対し、比較例１の方法では３００Ｕ／ｍＬ以上の領域では発光量が異常に低下し、１０００Ｕ／ｍＬでの発光量は４００Ｕ／ｍＬでの発光量より減少しているため発光量からＣＡ１５−３の濃度を算出できないことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
ＣＡ１５−３とＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）との反応をポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を含有する水溶液（Ｗ）中で行うことにより、広い濃度域のＣＡ１５−３を検体を希釈することなく測定することができるので、ＣＡ１５−３の免疫測定に好適に使用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＡ１５−３とＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）との反応をポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を含有する水溶液（Ｗ）中で行う工程を含むことを特徴とするＣＡ１５−３の免疫測定法。
【請求項２】
下記工程１〜４を含む請求項１記載のヘテロジニアスな免疫測定法。
工程１：不溶性担体（Ｂ）に結合したＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）とＣＡ１５−３の反応をポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を含有する水溶液（Ｗ）中で行う工程。
工程２：工程１のポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤をＢ／Ｆ分離で除く工程。
工程３：工程１で得られた反応物に標識体（Ｃ）を反応させる工程。
工程４：工程３で得られた反応物中の標識体（Ｄ）の量を計測する工程。
【請求項３】
前記水溶液（Ｗ）中の前記ＣＡ１５−３の濃度が、０．５〜４００Ｕ／ｍＬである請求項１又は２記載の免疫測定法。
【請求項４】
ポリエチレングリコールの数平均分子量が、２，０００〜２００，０００である請求項１〜３のいずれか記載の免疫測定法。
【請求項５】
前記水溶液（Ｗ）中の前記ポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤の濃度が、１〜７重量％である請求項１〜４のいずれか記載の免疫測定法。
【請求項１】
ＣＡ１５−３とＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）との反応をポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を含有する水溶液（Ｗ）中で行う工程を含むことを特徴とするＣＡ１５−３の免疫測定法。
【請求項２】
下記工程１〜４を含む請求項１記載のヘテロジニアスな免疫測定法。
工程１：不溶性担体（Ｂ）に結合したＣＡ１５−３を認識する配位子（Ａ１）とＣＡ１５−３の反応をポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤を含有する水溶液（Ｗ）中で行う工程。
工程２：工程１のポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤をＢ／Ｆ分離で除く工程。
工程３：工程１で得られた反応物に標識体（Ｃ）を反応させる工程。
工程４：工程３で得られた反応物中の標識体（Ｄ）の量を計測する工程。
【請求項３】
前記水溶液（Ｗ）中の前記ＣＡ１５−３の濃度が、０．５〜４００Ｕ／ｍＬである請求項１又は２記載の免疫測定法。
【請求項４】
ポリエチレングリコールの数平均分子量が、２，０００〜２００，０００である請求項１〜３のいずれか記載の免疫測定法。
【請求項５】
前記水溶液（Ｗ）中の前記ポリエチレングリコール及び／又は非イオン界面活性剤の濃度が、１〜７重量％である請求項１〜４のいずれか記載の免疫測定法。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−１９８１２５（Ｐ２０１２−１９８１２５Ａ）
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−６２８５３（Ｐ２０１１−６２８５３）
【出願日】平成２３年３月２２日（２０１１．３．２２）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２２日（２０１１．３．２２）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
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