化学物質評価方法及び暴露装置
【課題】 化学物質による生物への影響を的確に評価できる化学物質評価方法及びそれに用いる暴露装置を提供すること。
【解決手段】 ホルモンに対する応答性を有し、かつ内因性の前記ホルモン濃度が低値である時期に、両生類への化学物質の暴露を開始する。これにより、化学物質がホルモン軸に影響を与えるものであれば、両生類に形態学的乃至組織学的変化が生じるので、この変化に基づいて、化学物質を評価することができる。
【解決手段】 ホルモンに対する応答性を有し、かつ内因性の前記ホルモン濃度が低値である時期に、両生類への化学物質の暴露を開始する。これにより、化学物質がホルモン軸に影響を与えるものであれば、両生類に形態学的乃至組織学的変化が生じるので、この変化に基づいて、化学物質を評価することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ある化学物質が内分泌かく乱作用を有しているか否かのスクリーニングをするための化学物質評価方法及びこれに用いる暴露装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、内分泌かく乱化学物質（いわゆる環境ホルモン）によって人や野生生物の内分泌系がかく乱され、人の健康や生態系へ影響を及ぼす危険性が懸念されている。内分泌かく乱化学物質に関しては未解明な点が残されているものの、一方で、こうした懸念を科学的に検証し、生物に対する内分泌かく乱作用の影響を確認するためには、化学物質の評価方法を標準化しなければならない。
【０００３】
現在までに、化学物質の内分泌かく乱作用を評価する方法として、受容体結合試験、レポーター遺伝子発現試験、細胞増殖試験等の試験管内試験、哺乳類を用いた繁殖試験、生殖毒性試験、海産魚、魚類等を用いた各種動物試験が考案されている。
【非特許文献１】内分泌撹乱化学物質の生物試験研究法：シュプリンガー・フェアラーク東京。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上述のような各種試験が考案され、多くの知見が集積されつつあるが、いまだ標準化された試験方法はない。
【０００５】
特に、化学物質が、甲状腺ホルモン軸に影響を与える化学物質であるか否かをスクリーニングする方法の開発は緒についたばかりである。
【０００６】
本発明はこのような事情に鑑みなされたものであり、化学物質による生物への影響を的確に評価できる化学物質評価方法及びそれに用いる暴露装置を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明の主たる観点に係る化学物質の評価方法は、ホルモンに対する応答性を有し、かつ内因性の前記ホルモン濃度が低値である時期に、両生類への化学物質の暴露を開始することを特徴とする。
【０００８】
本発明のこのような構成によれば、評価対象となる化学物質にホルモン軸に影響を与える作用があれば、両生類の変化として該作用が顕著に現れるため、高感度かつ容易に評価可能となる。上記時期は、例えば、ホルモンに応答できるだけのホルモンレセプターの発現が認められる一方で、内因性のホルモン濃度（分泌量）が低値である時期、として選定することができる。こうしたホルモンとして、例えば、甲状腺ホルモン（T3およびT4）レセプターとしては、甲状腺ホルモンレセプター（αおよびβ）があげられる。
【０００９】
本発明の一の形態によれば、前記時期は前変態期であることを特徴とする。前変態期（Premetamorphosis）では、甲状腺ホルモンレセプターの発現は認められるが、内因性のホルモンの分泌量はほとんど認められないので、上記時期として好適である。
【００１０】
本発明の一の形態によれば、前記ホルモンは甲状腺ホルモンであることを特徴とする。 両生類の変態の過程では、甲状腺ホルモンが重要な役割を果たしているため、化学物質の甲状腺ホルモン軸への影響を評価する方法として本発明の評価方法は適している。
【００１１】
本発明の一の形態によれば、前記両生類はXenopus属乃至Silurana属に属し、前記時期は発生段階５１であることを特徴とする。一般に、両生類では、幼生は水生、生体は陸生と１世代で２つの環境を生き抜くため、環境指標性が他の動物郡に比べ高いと言われており、また、変態過程では、成長や発達などに重要な役割を担う甲状腺ホルモンの作用が明快に現れる。特に、Xenopus属に属するアフリカツメガエル（Xenopus laevis）、Silurana属に属するSilurana tropicalis等は、基本的に水中生活を営むが、基本的な特徴は他の無尾両生類と共通であり、またホルモン注射により、通年、採卵できることから、両生類の試験動物として世界的に活用されている。試験動物として、Xenopus属に属するアフリカツメガエル（Xenopus laevis）、Silurana属に属するSilurana tropicalisを活用する場合には、発生段階５１において暴露を開始することが適切である。
【００１２】
本発明の一の形態によれば、前記時期から２１日間暴露を行い、暴露最終日に前記両生類の変化に基づいて前記化学物質を評価することを特徴とする。暴露期間に関しては、発生段階５１から２１日間とするとともに、暴露最終日（２１日目）に両生類の変化に基づいて前記化学物質を評価すると、化学物質の甲状腺ホルモン作用および抗甲状腺ホルモン作用等を確実に評価することができる。
【００１３】
本発明の一の形態によれば、前記両生類の変化は、発生段階、後肢長、全長、湿重量、頭胴長、甲状腺の量的変化、および甲状腺の質的変化からなる群より選択された少なくとも１つの指標により評価されることを特徴とする。
【００１４】
発生段階、後肢長、全長、湿重量、頭胴長については、いずれも、容易に計測/測定ができるので、実務上、指標（エンドポイント）として好適である。生物学的に、発生段階は、動物個体の発達を総合的に評価できる指標として活用できる。さらに、両生類の変態前期においては、特に、甲状腺ホルモンレセプターβが後肢に多く発現するため、化学物質が甲状腺ホルモン軸に影響を与えるものであれば、その影響が後肢長に顕著に現れる。このため、甲状腺軸に対する化学物質の影響を明瞭に評価できるエンドポイントの１つである。また、全長、湿重量、頭胴長に関しては、特に、試験動物の成長が正常であるか否か、例えば、化学物質の直接的あるいは間接的作用による成長不良が生じているかなど、甲状腺軸に対する影響とは異なる作用影響を見積もり、エンドポイントに変化が生じている場合、該作用が甲状腺ホルモン軸に対するものか否かを判断するための重要な情報を提供する。
【００１５】
また、上記発生段階、後肢長、全長、湿重量、頭胴長の他、両生類の甲状腺の量的変化、および甲状腺の質的変化に代表される組織学的検証により、確実に化学物質を評価することができる。すなわち、化学物質の特性により、その影響は必ず形態に反映されるわけではない。例えば、化学物質によっては、形態学的な指標に影響は認められないが、組織学的な検証により、はじめて、その影響を推測できる場合があるからである。したがって、組織学的検証は重要である。
【００１６】
本発明の他の観点にかかる暴露装置は、上述の評価方法に用いる暴露装置であって、前記化学物質を含有する飼育水及び前記両生類を収容する収容器と、前記収容器内に対し供給するための前記化学物質の複数濃度を含む前記飼育水を生成する生成装置とを具備することを特徴とする。
【００１７】
本発明の構成によれば、化学物質の複数濃度による暴露試験を行うことができる。
【００１８】
本発明の一の形態によれば、前記生成装置は複数個あることを特徴とする。これにより、複数種の化学物質について、複数濃度の飼育水を生成することができ、一度に、複数種類の化学物質について、両生類に対する影響を評価することができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の化学物質評価方法は、ホルモンに対する応答性を有し、かつ内因性の前記ホルモン濃度が低値である時期に、両生類への化学物質の暴露を開始するため、両生類の形態変化乃至組織学的検証により、高感度かつ容易に化学物質を評価できるという利点がある。
【００２０】
また、本発明の暴露装置は、複数濃度の化学物質を含む飼育水を生成かつ供給する生成装置を具備することにより、両生類に対し暴露試験を実施できるという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
<本実施形態における化学物質評価方法>
【００２２】
以下に、本実施形態における化学物質評価方法について説明する。
【００２３】
本実施形態における化学物質評価方法では、試験動物として両生類、例えばアフリカツメガエル（Xenopus laevis）を用い、これに化学物質を暴露することによって、アフリカツメガエルの幼生にどのような形態学的及び組織学的変化が生じるかを観察する。これにより化学物質の内分泌かく乱作用を評価する。
【００２４】
ここで、本実施形態の評価方法に用いる試験動物として、アフリカツメガエルを選択したのは、両生類一般として環境指標性が他の動物郡に比べ高いと言われていること、変態過程では、成長や発達などに重要な役割を担う甲状腺ホルモンの作用が明快に現れること、そして、特に、Xenopus属に属するアフリカツメガエル（Xenopus laevis）、Silurana属に属するSilurana tropicalis等は、ホルモン注射により、通年、採卵できることから、両生類の試験動物として世界的に活用されているからである。
【００２５】
本実施形態の化学物質評価方法では、前変態期（Premetamorphosis）にあたる発生段階５１から、アフリカツメガエルの幼生に対して暴露を開始する。暴露は、後述する暴露装置の、化学物質を含有した飼育水が収容された収容器としての水槽内に、アフリカツメガエルの幼生を入れた状態で行う。暴露装置は流水式である。飼育水の調整にあたっては、活性炭により塩素除去した水道水を準備し、この脱塩素水をコントロール（以下、コントロール）の飼育水とし、一方。試験区には、この脱塩素水に対し化学物質を加えた飼育水を用いる。水温は２２±１℃、水のｐH値は７．０±０．５、飼育水の溶存酸素濃度は飽和酸素濃度の４０％以上、飼育水の流速は２５ｍｌ／分とした。餌は粉末飼料（sera micron、sera GmbH）を用い、１日に１匹に対して３０ｍｇの餌を与えた。明暗周期は１２：１２時間とした。
【００２６】
試験期間は、暴露開始から２１日間とし、最終日となる２１日目における、発生段階、体重、全長、頭胴長、後肢長、後肢長と全長の比、後肢長と頭胴長との比、甲状腺組織を評価した。
【００２７】
発生段階は、双眼実体顕微鏡（商品名ＳＭＺ６４５、株式会社ニコン製）下で、アフリカツメガエルの発生段階表に基づいて決定し、統計による検定は、各水槽の中央値を用いて、まずクラスカル・ウォリスの検定を行い、差を確認した場合には、更に詳細に検討するため、ダンの検定を行った。
【００２８】
一方、体重については、電子天秤(商品名ＢＰ２２１Ｓ、ザルトリウス株式会社製)を用いて湿重量を測定し、また、全長、頭胴長、後肢長に関しては、写真撮影（商品名ＥＯＳ Ｄ６０、キャノンン株式会社製）により各個体の画像を取得し、画像解析ソフト（商品名Image-Pro Plus version ４．０、Media Cybernetics,Inc.製）を用いて測定した。体重、全長、頭胴長、後肢長、後肢長と全長の比及び後肢長と頭胴長との比については、はじめに１標本コルモゴロフースミルノフ検定によりデータの分布の正規性を、ルビーンの検定によりデータに等分散性が認められかを検定し、分布の正規性が確認できたデータについては、各水槽の平均値を代表値として、濃度依存性を調べるため、ウィリアムズの方法を用いた。分布の正規性が確認できなかった場合には、ヨンクヒールの検定を行った。
【００２９】
また、組織学的検証は、甲状腺の中央部を通るように厚さ６μｍの組織切片を作製して行った。甲状腺の断面積は、画像解析ソフト（商品名Image-Pro Plus version ４．０、Media Cybernetics,Inc.製）を用いて測定し、はじめに、１標本コルモゴロフースミルノフ検定によりデータの分布の正規性を、ルビーンの検定によりデータに等分散性が認められるか検定し、全てのデータの分布の正規性を確認した後、ダネットの検定を行った。なお、有意差検定にあたっては、危険率を５％未満とした。甲状腺組織の評価では、甲状腺の量的変化及び甲状腺の質的変化を評価した。
【００３０】
なお、前変態期（Premetamorphosis）、変態始動期（Prometamorphosis）、変態最盛期（Climax）は、両生類の発生を変態から見たひとつの分類形式である。前変態期（Premetamorphosis）は甲状腺ホルモンに依存せず到達できる段階までを指し、変態始動期（Prometamorphosis）は甲状腺ホルモンにより前足が出現する段階までを指し、変態最盛期（Climax）は尾を失って幼若ガエルになるまでを指す。発生段階は、Niewkoop, P.D. and Faber、J.(1994):Normal Table of Xenopus laevis（Daudin）基づいており、前変態期（Premetamorphosis）は発生段階４６〜５３、変態始動期（Prometamorphosis）は発生段階５４〜５７、変態最盛期（Climax）は５８〜６５に相当する。
【００３１】
暴露開始から２１日目では、コントロールは発生段階５７乃至５８に到達するが、発生段階５７は変態始動期（Prometamorphosis）、発生段階５８は変態最盛期（Climax）の範囲に位置することになる。
【００３２】
<暴露装置>
【００３３】
上述の評価方法に用いる暴露装置について図１及び図２を用いて説明する。
【００３４】
図１は暴露装置の概略斜視図であり、図２は図１の暴露装置の一部である希釈装置の概略図である。
【００３５】
図１に示すように、暴露装置１は、複数の収容器としての水槽３００と、これら水槽３００を収容した暴露チャンバ２００と、暴露チャンバ２００の側面に設けられた生成装置としての希釈装置１００とを有する。
【００３６】
水槽３００は、アフリカツメガエルの幼生と飼育水を収容するガラス製の容器であり、飼育水は流水式となっている。水槽３００内へ供給される飼育水は希釈装置１００で生成され、図示しない供給管によって水槽３００内へ供給される。また、水槽３００内の飼育水を外部に排出する排出管（図示せず）も設けられている。
【００３７】
暴露チャンバ２００は、複数、ここでは２０個の水槽３００を収容する。水槽３００内の飼育水を水温２２±１℃に保持するために、暴露チャンバ２００内には水温２２±１℃の水が張られ、この水に水槽３００が浸かっている。暴露チャンバは斜側面がスライド式に開閉可能となっており、この斜側面を開けることによって、水槽３００内の試験個体にアクセス可能となっている。
【００３８】
複数の水槽３００内へは、希釈装置１００から化学物質の含有濃度が異なる飼育水が供給される。
【００３９】
希釈装置１００は、化学物質の含有濃度が異なる複数の飼育水を生成する装置である。
【００４０】
希釈装置１００は、図２に示すように、化学物質用セル（ＴＣ：Toxicant cell）１１１と、水用セル（ＷＣ：Water cell）１１２と、希釈セル（ＤＣ：Dilution Cell）１２０と、フローブースターセル（ＦＢＣ：Flow booster cell）１３０と、フロースプリッターセル（ＦＳＣ：Flow splitter cell）１４０とを有している。
【００４１】
化学物質用セル１１１は、評価対象の化学物質が供給/収容されるセルであり、このセルには化学物質供給管Ｔ１（符号１１３）が取り付けられている。化学物質供給管Ｔ１（符号１１３）からは例えば１００ｍｌ／分の割合で希釈セル１２０に化学物質が供給される。
【００４２】
水用セル１１２は、活性炭により塩素除去した水道水が収容されるセルであり、このセルには、４つの給水管Ｗ１(符号１１４)、Ｗ２（符号１１５）、Ｗ３(符号１１６)、Ｗ４（符号１１７）がそれぞれ間隔をおいて取り付けられている。給水管Ｗ１とＷ２との距離及び給水管Ｗ２とＷ３との距離はそれぞれ等しく、給水管Ｗ３とＷ４との距離は、給水管Ｗ１とＷ２との距離よりも広くなっている。３つの給水管Ｗ１（符号１１４）、Ｗ２（符号１１５）、Ｗ３(符号１１６)からは例えば５０ｍｌ／分の割合で希釈セル１２０に水が供給される。給水管Ｗ４（符号１１７）からは例えば１００ｍｌ／分の割合で希釈セル１２０に水が供給される。
【００４３】
化学物質用セル１１１及び水用セル１１２は隣接しており、本実施形態においては、１つのセル１１０を１枚の仕切り板によって空間的に分離して、化学物質用セル１１１と水用セル１１２を設けている。セル１１０には、化学物質用セル１１１と水用セル１１２と連結する非常用排出口１６０が設けられている。
【００４４】
希釈セル１２０は、１つの直方体状のセル内の上面及び底面に互い違いに複数の仕切り板１２１が設けられて構成されている。本実施形態においては、上面に設けられた仕切り板１２１は８枚、底面に設けられた仕切り板１２１は８枚である。
【００４５】
希釈セル１２０には、５つの濃縮供給管Ｃ１〜Ｃ５及び濃縮供給管Ｃ４とＣ５との間に水排出管１６１が取り付けられている。隣り合う濃縮供給管の間には、底面に仕切り板が２枚づつ設けられている。更に、濃縮供給管Ｃ１とＣ２の間、濃縮供給管Ｃ２とＣ３の間、及び濃縮供給管Ｃ３とＣ４の間には、それぞれ上面に仕切り板が２枚、底面に設けられた仕切り板と互い違いになるように設けられている。濃縮供給管Ｃ４とＣ５の間には上面に設けられた仕切り板はない。また、５つの濃縮供給管Ｃ１〜Ｃ５を挟み込むように、両脇にそれぞれ１枚づつ上面に仕切り板が設けられている。
【００４６】
濃縮供給管Ｃ１とＣ２の間に位置する４枚の仕切り板の内、中央の２枚の仕切り板の間に給水管Ｗ１（符号１１４）からの水が供給されるように、給水管Ｗ１（符号１１４）が設けられている。同様に、濃縮供給管Ｃ２とＣ３の間に位置する４枚の仕切り板の内、中央の２枚の仕切り板の間に給水管Ｗ２（符号１１５）からの水が供給されるように、給水管Ｗ２（符号１１５）が設けられている。濃縮供給管Ｃ３とＣ４の間に位置する４枚の仕切り板の内、中央の２枚の仕切り板の間に給水管Ｗ３（符号１１６）からの水が供給されるように、給水管Ｗ３（符号１１６）が設けられている。５つの濃縮供給管Ｃ１〜Ｃ５を挟み込むように両脇にそれぞれ１枚づつ上面に設けられた仕切り板よりも外側にそれぞれ化学物質供給管Ｔ１（符号１１３）からの化学物質が、そして給水管Ｗ４（符号１１７）からの水が供給されるように、化学物質供給管Ｔ１（符号１１３）及び給水管Ｗ４（符号１１７）が設けられている。濃縮供給管Ｃ１とＣ２との距離、Ｃ２とＣ３との距離、Ｃ３とＣ４との距離は、それぞれ等しく、Ｃ４とＣ５との距離はＣ１とＣ２との距離よりも狭くなっている。
【００４７】
セル１１０から供給された化学物質及び水は、図に示す矢印のように、仕切り板１２１によって設けられた流路を通って流れていく。これにより、濃縮供給管Ｃ１（符号１２２）からは希釈されていない化学物質からなる飼育水がフローブースターセル１３０に供給される。濃縮供給管Ｃ２（符号１２３）からは、濃縮供給管Ｃ１（符号１２２）から排出されなかった化学物質が給水管W１（符号１１４）からの水によって希釈されて、フローブースターセル１３０に供給される。濃縮供給管Ｃ３（符号１２４）からは、濃縮供給管Ｃ２（符号１２３）から排出されなかった飼育水が給水管W２（符号１１５）からの水によって更に希釈されてフローブースターセル１３０に供給される。濃縮供給管Ｃ４（符号１２５）からは、濃縮供給管Ｃ３（符号１２４）から排出されなかった飼育水が給水管W３（符号１１６）からの水によって更に希釈されてフローブースターセル１３０に供給される。濃縮供給管Ｃ４（符号１２５）から排出されなかった飼育水は、水排出管１６１を介して外部に排出される。濃縮供給管Ｃ５（符号１２７）からは、給水管Ｗ４（符号１１７）から供給された、化学物質を含有しない水からなるコントロールとして用いられる飼育水が、フローブースターセル１３０に供給される。濃縮供給管Ｃ５（符号１２７）から排出されなかった飼育水は、水排出管１６１を介して外部に排出される。例えば、濃縮供給管Ｃ１（符号１２２）からは濃度６．０ｍｇ／Ｌ、濃縮供給管Ｃ２（符号１２３）からは濃度３．０ｍｇ／Ｌ、濃縮供給管Ｃ３（符号１２４）からは濃度１．５ｍｇ／Ｌ、濃縮供給管Ｃ４（符号１２５）からは濃度０．７５ｍｇ／Ｌというように、前段にある飼育水が倍に希釈された飼育水が排出される。
【００４８】
このように、希釈セル１２０において、底面及び上面に仕切り板を設け、化学物質を１箇所から、水を複数箇所から供給することにより、１つのセル内で段階的に複数の異なる化学物質濃度の異なる飼育水を生成することができる。
【００４９】
フローブースターセル１３０は５つのセル１３１〜１３５からなり、各セル１３１〜１３５に毛細管１３１ａ〜１３５ａが取り付けられている。各セル１３１〜１３５には化学物質濃度が異なる飼育水が希釈セル１２０から供給され、セル１３１〜１３５に供給された飼育水は毛細管１３１ａ〜１３５ａを介してフロースプリッターセル１４０に供給される。
【００５０】
フロースプリッターセル１４０は５つのセル１４１〜１４５からなり、各セル１４１〜１４５の底部にはそれぞれ４つづつ穴が設けられている。この穴は分配収容器１４６〜１５０と連結しており、各分配収容器１４６〜１５０は図示しない供給管に連結されている。セル１４１〜１４５にはそれぞれ化学物質濃度が異なる飼育水が供給され、フロースプリッターセル１４０によって５種類の化学物質濃度が異なる飼育水は各濃度毎に４つづつ分配収容器１４６〜１５０に分配される。そして、暴露チャンバ２００内の１槽の水槽３００に対して１つの分配収容器が割り当てられ、供給管を介して各水槽３００内に飼育水が供給される。従って、５種類の化学物質濃度が異なる飼育水を収容した水槽が、各濃度毎に４つづつ設けられることとなる。
【００５１】
このように、本実施形態においては、希釈装置１００によって複数の化学物質濃度の異なる飼育水を生成することができる。
【００５２】
また、本実施形態においては、１つの暴露チャンバに対して１つの希釈装置を設けたが、１つの暴露チャンバに対して複数の希釈装置を設けてもよい。これにより複数種の化学物質各々について、複数濃度の飼育水を生成することができ、１つの暴露チャンバ内で複数種類の化学物質について評価することができる。
【００５３】
尚、本実施形態においては、試験動物としてアフリカツメガエルを用いたが、これに限られるものではなく、Xenopus、Silurana、Rana属等に属する各種無尾両生類、有尾両生類等、種々の両生類に適用可能である。また、必要に応じて、魚類等、各種水生生物に対して活用できる。
【００５４】
次に、本実施形態について、具体的な試験を参照しながら説明する。
【００５５】
<試験１>
【００５６】
上述の化学物質評価方法では暴露開始時期を発生段階５１とし、評価時期を暴露最終日である２１日目としているが、これは、発生段階５４に達したアフリカツメガエルの幼生を１４日間暴露した試験と、発生段階５１に達したアフリカツメガエルの幼生を２１日間暴露した試験とを比較し、その結果に基づいて設定された。
【００５７】
試験は、化学物質として抗甲状腺ホルモン作用があるＰＴＵ（Propylthiouracil）と、甲状腺ホルモンであるＴ４（Thyroxine）の２種類を用い、上述した暴露装置により実施した。
【００５８】
まず、発生段階５４に達したアフリカツメガエルの幼生を２００匹と、発生段階５１に達したアフリカツメガエルの幼生を２００匹用意した。発生段階５４に達したアフリカツメガエルの幼生には１４日間、発生段階５１に達したアフリカツメガエルの幼生には２１日間に渡り試験を行った。
【００５９】
飼育水としては、化学物質を含有しない脱塩素水道水（以下、コントロール）、該脱塩素水道水を用いて、２．５ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌの４種類の濃度となるようにＰＴＵ（プロピルウラシル）を添加した飼育水、０．２５μｇ／Ｌ、０．５μｇ／Ｌ、１．０μｇ／Ｌ、２．０μｇ／Ｌの４種類の濃度のＴ４を添加した飼育水を使用した。水槽１槽あたり２０匹の幼生を入れ、コントロールとして１４日試験及び２１日試験それぞれ２連用意し、同様に、各化学物質毎、各濃度毎、１４日試験及び２１日試験毎に、２連用意した。試験終了後、試験最終日に全長、体重、発生段階、後肢長を測定した。なお、測定結果の評価は、上述の統計方法を用いて行った。
【００６０】
ＰＴＵに関しては、コントロールと比較して、全長は、１４日間試験、２１日間試験ともに差がなかった。体重は、１４日間試験では全ての濃度で差がなく、２１日間試験では５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ及び２０ｍｇ／Ｌで差が確認された。発生段階は、１４日間試験と２１日間試験ともに、２０ｍｇ／Ｌで発生の抑制が確認された。後肢長は、１４日間試験では２０ｍｇ／Ｌにおいて差があり、２１日間試験では５ｍｇ／Ｌと２０ｍｇ／Ｌで差が確認できた。更に、５ｍｇ／Ｌと２０ｍｇ／Ｌとを比較すると２０ｍｇ／Ｌの方が顕著に成長を抑制していた。
【００６１】
以上から、１４日間試験、２１日間試験ともに、発生段階及び後肢長において、ＰＴＵの影響を確認することができた。しかし、２０ｍｇ／Ｌにおいて、２１日間試験では、１４日間試験と比較して、コントロールとの差が大きかった。すなわち、２１日試験において、より顕著にコントロールとの差を確認できたことから、弱い抗甲状腺ホルモン作用を持つ化学物質を対象とした場合を想定すると、２１日試験で評価すべきと結論した。
【００６２】
一方、Ｔ４に関しては、コントロールと比較して、全長は、１４日間試験では全ての濃度において、２１日間試験では２．０μｇ／Ｌにおいて短くなった。体重は、１４日間試験、２１日間試験において、一定の傾向を確認することができなかった。発生段階は、１４日間試験では２．０μｇ／Ｌで促進された。また、２１日間試験でも１．０及び２．０μｇ／Ｌにおいて促進された。後肢長は、１４日試験では０．２５μｇ／Ｌと１．０μｇ／Ｌで差が確認できたが、０．５μｇ／Ｌと２．０μｇ／Ｌにおいて差が認められず、明確な結果を得られなかった。一方、２１日間試験では、１．０μｇ／Ｌと２．０μｇ／Ｌにおいて差が確認された。
【００６３】
以上から、１４日間試験では全長、発生段階において、２１日間試験では全長、発生段階、後肢長においてＴ４の影響を評価することができた。
【００６４】
以上、ＰＴＵとＴ４の両方を評価できたのは、２１日間試験であり、発生段階、後肢長は有効なエンドポイントと考えられた。変態始動期（Prometamorphosis）にあるステージ５４では、甲状腺ホルモンレセプター（ＴＲβ）の発現が上昇しつつあり、かつ甲状腺ホルモンの分泌量も増加し始めているが、前変態期（Premetamorphosis）にあるステージ５１では、甲状腺ホルモンレセプター（TRβ）の発現はほとんど認められないものの、該ホルモンに対する応答性は備わっており、かつ内因性の甲状腺ホルモンの分泌もほとんど認められない。したがって、ステージ５１で暴露を開始した方が、ステージ５４で暴露を開始した場合と比較して、化学物質の影響が反映されやすいと考えられる。なお、ステージ５１以前、例えば、ステージ48/49でも暴露は可能であるが、甲状腺ホルモン軸に対する感受性がステージ５１と比較して劣るため実際的ではない。したがって、アフリカツメガエルの幼生の場合、暴露開始時期を発生段階５１と設定した。
【００６５】
また、試験期間を２１日間と設定したのは、上述したように、化学物質の甲状腺ホルモン作用はもちろん、抗甲状腺ホルモン作用をより明確に評価できたからであり、特に、弱い抗甲状腺ホルモン作用を持つ化学物質を評価するには２１日間の試験が必要と考えられる。
【００６６】
<試験２>
【００６７】
以下の試験により、試験１において設定した試験条件について検証した。
【００６８】
化学物質として、甲状腺ホルモンであるＴ４、甲状腺ホルモン合成阻害作用があるＰＥＲ（Perchlorate）、モノデイオディナーゼ（monodeiodinase）の阻害作用を持つＩＯＰ（Iopanoic acid）の３種類を用いて、上述の暴露装置で暴露した。
【００６９】
まず、発生段階５１に達したアフリカツメガエルの幼生を４００匹用意した。飼育水としては、化学物質を含有しない飼育水（以下、コントロール）、０．７５ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ、６．０ｍｇ／Ｌの４種類の濃度のＩＯＰを含有した飼育水、０．２５μｇ／Ｌ、０．５μｇ／Ｌ、１．０μｇ／Ｌ、２．０μｇ／Ｌの４種類の濃度のＴ４を含有した飼育水、６２．５μｇ／Ｌ、１２５μｇ／Ｌ、２５０μｇ／Ｌ、５００μｇ／Ｌの４種類の濃度のＰＥＲを含有した飼育水を使用した。水槽１槽あたり２０匹の幼生を入れ、コントロールは４連、同様に、化学物質毎、濃度毎に４連用意した。そして、幼生を２１日間に渡り暴露した。そして、暴露開始７日目及び２１日目における、発生段階、体重、全長、頭胴長、後肢長および甲状腺を評価した。また、統計による検証は、上述したとおりに行った。
【００７０】
（Ｔ４試験）
【００７１】
発生段階は７日目と２１日目のいずれにおいても差が認められなった。体重は２１日目の１．０μｇ／Ｌ、２．０μｇ／Ｌの濃度において、全長及び頭胴長については、２１日目の２．０μｇ／Ｌの濃度でのみ差があり、これらの濃度ではいずれも統計学的に有意な低値が認められた。７日目においては、いずれも差が認められなかった。後肢長は、７日目の全ての濃度、２１日目の１．０μｇ／Ｌ、２．０μｇ／Ｌの濃度において、統計学的に有意な高値が認められた。
【００７２】
体重、全長および頭胴長で認められた差は、いずれもＴ４による尾の退縮の影響を捕らえているものと思われる。また、後肢の伸張は、尾の退縮とは異なり、暴露を開始する発生段階５１において既に始まっており、またＴ４により、甲状腺ホルモンレセプターの発現も促進されるため、７日目において、Ｔ４の作用が明確に現れたと考えられる。したがって、後肢長は甲状腺ホルモンレセプターを介した甲状腺軸かく乱作用を評価するために、非常に適したエンドポイントと考えられる。また、組織切片より、甲状腺の断面積を測定して検証した結果、コントロールと比較して、甲状腺の肥大や縮小は認められなかった。以上、Ｔ４の暴露試験においては、体重、全長、頭胴長及び後肢長でＴ４の影響を検出できた。
【００７３】
（ＰＥＲ試験）
【００７４】
発生段階、全長、頭胴長、後肢長においては、７日目と２１日目のいずれにおいても差が認められなかった。体重については、２１日目の５００μｇ／Ｌの濃度において、統計学的に有意な高値が認められた。一方、組織切片より、甲状腺の断面積を測定して検証した結果、コントロールと比較して、全濃度において甲状腺の肥大が認められた。ＰＥＲは、ヨウ化ナトリウム共輸送体（sodium/iodide symporter）を阻害することで、甲状腺ホルモンの合成を阻害し、甲状腺ホルモンのレベルを減少させ、ＴＳＨ（Thyroid stimulating hormone；甲状腺刺激ホルモン）の分泌を促進させる。このため、全濃度において甲状腺の肥大が生じたと考えられる。なお、組織学的検証では、甲状腺の肥大が認められるとともに、甲状腺の濾胞上皮細胞において、２５０μｇ／Ｌと５００μｇ／Ｌで過形成が認められた。
【００７５】
（ＩＯＰ試験）
【００７６】
ＩＯＰの暴露試験においては、発生段階を決定できない個体が生じた。アフリカツメガエルでは、T4からT3への変換を担うタイプIIモノデイオディナーゼと、T4からrT3への変換を担うタイプIIIモノデイオディナーゼの２つのモノデイオディナーゼが知られており、これら２タイプのモノデイオディナーゼは、組織や発生段階によって発現量が異なっている。ＩＯＰは、これら２タイプのモノデイオディナーゼのどちらの働きも抑えることから、発生段階が決定できない個体が生じたと思われる。また、体重、全長、頭胴長及び後肢長について、全濃度で統計的に有意な低値が認められた。また、組織切片より、甲状腺の断面積を測定して検証した結果、コントロールと比較して、１．５ｍｇ／Ｌと３．０ｍｇ／Ｌの濃度において甲状腺の肥大が認められた。なお、甲状腺の濾胞上皮細胞について、病理学的な異常は認められなかった。
【００７７】
以上より、試験１において設定した試験条件において、化学物質の甲状腺ホルモンかく乱作用を評価することができた。また、エンドポイントに関しては、形態学的なエンドポイント（発生段階、後肢長、全長、湿重量、頭胴長等）と、組織学的エンドポイント（甲状腺の量的変化、甲状腺の質的変化等）とを適宜組み合わせることがより望ましいと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】暴露装置の概略斜視図。
【図２】図１の一部である希釈装置の概略図である。
【符号の説明】
【００７９】
１・・・暴露装置
１００・・・希釈装置
２００・・・暴露チャンバ
３００・・・水槽
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ある化学物質が内分泌かく乱作用を有しているか否かのスクリーニングをするための化学物質評価方法及びこれに用いる暴露装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、内分泌かく乱化学物質（いわゆる環境ホルモン）によって人や野生生物の内分泌系がかく乱され、人の健康や生態系へ影響を及ぼす危険性が懸念されている。内分泌かく乱化学物質に関しては未解明な点が残されているものの、一方で、こうした懸念を科学的に検証し、生物に対する内分泌かく乱作用の影響を確認するためには、化学物質の評価方法を標準化しなければならない。
【０００３】
現在までに、化学物質の内分泌かく乱作用を評価する方法として、受容体結合試験、レポーター遺伝子発現試験、細胞増殖試験等の試験管内試験、哺乳類を用いた繁殖試験、生殖毒性試験、海産魚、魚類等を用いた各種動物試験が考案されている。
【非特許文献１】内分泌撹乱化学物質の生物試験研究法：シュプリンガー・フェアラーク東京。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上述のような各種試験が考案され、多くの知見が集積されつつあるが、いまだ標準化された試験方法はない。
【０００５】
特に、化学物質が、甲状腺ホルモン軸に影響を与える化学物質であるか否かをスクリーニングする方法の開発は緒についたばかりである。
【０００６】
本発明はこのような事情に鑑みなされたものであり、化学物質による生物への影響を的確に評価できる化学物質評価方法及びそれに用いる暴露装置を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明の主たる観点に係る化学物質の評価方法は、ホルモンに対する応答性を有し、かつ内因性の前記ホルモン濃度が低値である時期に、両生類への化学物質の暴露を開始することを特徴とする。
【０００８】
本発明のこのような構成によれば、評価対象となる化学物質にホルモン軸に影響を与える作用があれば、両生類の変化として該作用が顕著に現れるため、高感度かつ容易に評価可能となる。上記時期は、例えば、ホルモンに応答できるだけのホルモンレセプターの発現が認められる一方で、内因性のホルモン濃度（分泌量）が低値である時期、として選定することができる。こうしたホルモンとして、例えば、甲状腺ホルモン（T3およびT4）レセプターとしては、甲状腺ホルモンレセプター（αおよびβ）があげられる。
【０００９】
本発明の一の形態によれば、前記時期は前変態期であることを特徴とする。前変態期（Premetamorphosis）では、甲状腺ホルモンレセプターの発現は認められるが、内因性のホルモンの分泌量はほとんど認められないので、上記時期として好適である。
【００１０】
本発明の一の形態によれば、前記ホルモンは甲状腺ホルモンであることを特徴とする。 両生類の変態の過程では、甲状腺ホルモンが重要な役割を果たしているため、化学物質の甲状腺ホルモン軸への影響を評価する方法として本発明の評価方法は適している。
【００１１】
本発明の一の形態によれば、前記両生類はXenopus属乃至Silurana属に属し、前記時期は発生段階５１であることを特徴とする。一般に、両生類では、幼生は水生、生体は陸生と１世代で２つの環境を生き抜くため、環境指標性が他の動物郡に比べ高いと言われており、また、変態過程では、成長や発達などに重要な役割を担う甲状腺ホルモンの作用が明快に現れる。特に、Xenopus属に属するアフリカツメガエル（Xenopus laevis）、Silurana属に属するSilurana tropicalis等は、基本的に水中生活を営むが、基本的な特徴は他の無尾両生類と共通であり、またホルモン注射により、通年、採卵できることから、両生類の試験動物として世界的に活用されている。試験動物として、Xenopus属に属するアフリカツメガエル（Xenopus laevis）、Silurana属に属するSilurana tropicalisを活用する場合には、発生段階５１において暴露を開始することが適切である。
【００１２】
本発明の一の形態によれば、前記時期から２１日間暴露を行い、暴露最終日に前記両生類の変化に基づいて前記化学物質を評価することを特徴とする。暴露期間に関しては、発生段階５１から２１日間とするとともに、暴露最終日（２１日目）に両生類の変化に基づいて前記化学物質を評価すると、化学物質の甲状腺ホルモン作用および抗甲状腺ホルモン作用等を確実に評価することができる。
【００１３】
本発明の一の形態によれば、前記両生類の変化は、発生段階、後肢長、全長、湿重量、頭胴長、甲状腺の量的変化、および甲状腺の質的変化からなる群より選択された少なくとも１つの指標により評価されることを特徴とする。
【００１４】
発生段階、後肢長、全長、湿重量、頭胴長については、いずれも、容易に計測/測定ができるので、実務上、指標（エンドポイント）として好適である。生物学的に、発生段階は、動物個体の発達を総合的に評価できる指標として活用できる。さらに、両生類の変態前期においては、特に、甲状腺ホルモンレセプターβが後肢に多く発現するため、化学物質が甲状腺ホルモン軸に影響を与えるものであれば、その影響が後肢長に顕著に現れる。このため、甲状腺軸に対する化学物質の影響を明瞭に評価できるエンドポイントの１つである。また、全長、湿重量、頭胴長に関しては、特に、試験動物の成長が正常であるか否か、例えば、化学物質の直接的あるいは間接的作用による成長不良が生じているかなど、甲状腺軸に対する影響とは異なる作用影響を見積もり、エンドポイントに変化が生じている場合、該作用が甲状腺ホルモン軸に対するものか否かを判断するための重要な情報を提供する。
【００１５】
また、上記発生段階、後肢長、全長、湿重量、頭胴長の他、両生類の甲状腺の量的変化、および甲状腺の質的変化に代表される組織学的検証により、確実に化学物質を評価することができる。すなわち、化学物質の特性により、その影響は必ず形態に反映されるわけではない。例えば、化学物質によっては、形態学的な指標に影響は認められないが、組織学的な検証により、はじめて、その影響を推測できる場合があるからである。したがって、組織学的検証は重要である。
【００１６】
本発明の他の観点にかかる暴露装置は、上述の評価方法に用いる暴露装置であって、前記化学物質を含有する飼育水及び前記両生類を収容する収容器と、前記収容器内に対し供給するための前記化学物質の複数濃度を含む前記飼育水を生成する生成装置とを具備することを特徴とする。
【００１７】
本発明の構成によれば、化学物質の複数濃度による暴露試験を行うことができる。
【００１８】
本発明の一の形態によれば、前記生成装置は複数個あることを特徴とする。これにより、複数種の化学物質について、複数濃度の飼育水を生成することができ、一度に、複数種類の化学物質について、両生類に対する影響を評価することができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の化学物質評価方法は、ホルモンに対する応答性を有し、かつ内因性の前記ホルモン濃度が低値である時期に、両生類への化学物質の暴露を開始するため、両生類の形態変化乃至組織学的検証により、高感度かつ容易に化学物質を評価できるという利点がある。
【００２０】
また、本発明の暴露装置は、複数濃度の化学物質を含む飼育水を生成かつ供給する生成装置を具備することにより、両生類に対し暴露試験を実施できるという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
<本実施形態における化学物質評価方法>
【００２２】
以下に、本実施形態における化学物質評価方法について説明する。
【００２３】
本実施形態における化学物質評価方法では、試験動物として両生類、例えばアフリカツメガエル（Xenopus laevis）を用い、これに化学物質を暴露することによって、アフリカツメガエルの幼生にどのような形態学的及び組織学的変化が生じるかを観察する。これにより化学物質の内分泌かく乱作用を評価する。
【００２４】
ここで、本実施形態の評価方法に用いる試験動物として、アフリカツメガエルを選択したのは、両生類一般として環境指標性が他の動物郡に比べ高いと言われていること、変態過程では、成長や発達などに重要な役割を担う甲状腺ホルモンの作用が明快に現れること、そして、特に、Xenopus属に属するアフリカツメガエル（Xenopus laevis）、Silurana属に属するSilurana tropicalis等は、ホルモン注射により、通年、採卵できることから、両生類の試験動物として世界的に活用されているからである。
【００２５】
本実施形態の化学物質評価方法では、前変態期（Premetamorphosis）にあたる発生段階５１から、アフリカツメガエルの幼生に対して暴露を開始する。暴露は、後述する暴露装置の、化学物質を含有した飼育水が収容された収容器としての水槽内に、アフリカツメガエルの幼生を入れた状態で行う。暴露装置は流水式である。飼育水の調整にあたっては、活性炭により塩素除去した水道水を準備し、この脱塩素水をコントロール（以下、コントロール）の飼育水とし、一方。試験区には、この脱塩素水に対し化学物質を加えた飼育水を用いる。水温は２２±１℃、水のｐH値は７．０±０．５、飼育水の溶存酸素濃度は飽和酸素濃度の４０％以上、飼育水の流速は２５ｍｌ／分とした。餌は粉末飼料（sera micron、sera GmbH）を用い、１日に１匹に対して３０ｍｇの餌を与えた。明暗周期は１２：１２時間とした。
【００２６】
試験期間は、暴露開始から２１日間とし、最終日となる２１日目における、発生段階、体重、全長、頭胴長、後肢長、後肢長と全長の比、後肢長と頭胴長との比、甲状腺組織を評価した。
【００２７】
発生段階は、双眼実体顕微鏡（商品名ＳＭＺ６４５、株式会社ニコン製）下で、アフリカツメガエルの発生段階表に基づいて決定し、統計による検定は、各水槽の中央値を用いて、まずクラスカル・ウォリスの検定を行い、差を確認した場合には、更に詳細に検討するため、ダンの検定を行った。
【００２８】
一方、体重については、電子天秤(商品名ＢＰ２２１Ｓ、ザルトリウス株式会社製)を用いて湿重量を測定し、また、全長、頭胴長、後肢長に関しては、写真撮影（商品名ＥＯＳ Ｄ６０、キャノンン株式会社製）により各個体の画像を取得し、画像解析ソフト（商品名Image-Pro Plus version ４．０、Media Cybernetics,Inc.製）を用いて測定した。体重、全長、頭胴長、後肢長、後肢長と全長の比及び後肢長と頭胴長との比については、はじめに１標本コルモゴロフースミルノフ検定によりデータの分布の正規性を、ルビーンの検定によりデータに等分散性が認められかを検定し、分布の正規性が確認できたデータについては、各水槽の平均値を代表値として、濃度依存性を調べるため、ウィリアムズの方法を用いた。分布の正規性が確認できなかった場合には、ヨンクヒールの検定を行った。
【００２９】
また、組織学的検証は、甲状腺の中央部を通るように厚さ６μｍの組織切片を作製して行った。甲状腺の断面積は、画像解析ソフト（商品名Image-Pro Plus version ４．０、Media Cybernetics,Inc.製）を用いて測定し、はじめに、１標本コルモゴロフースミルノフ検定によりデータの分布の正規性を、ルビーンの検定によりデータに等分散性が認められるか検定し、全てのデータの分布の正規性を確認した後、ダネットの検定を行った。なお、有意差検定にあたっては、危険率を５％未満とした。甲状腺組織の評価では、甲状腺の量的変化及び甲状腺の質的変化を評価した。
【００３０】
なお、前変態期（Premetamorphosis）、変態始動期（Prometamorphosis）、変態最盛期（Climax）は、両生類の発生を変態から見たひとつの分類形式である。前変態期（Premetamorphosis）は甲状腺ホルモンに依存せず到達できる段階までを指し、変態始動期（Prometamorphosis）は甲状腺ホルモンにより前足が出現する段階までを指し、変態最盛期（Climax）は尾を失って幼若ガエルになるまでを指す。発生段階は、Niewkoop, P.D. and Faber、J.(1994):Normal Table of Xenopus laevis（Daudin）基づいており、前変態期（Premetamorphosis）は発生段階４６〜５３、変態始動期（Prometamorphosis）は発生段階５４〜５７、変態最盛期（Climax）は５８〜６５に相当する。
【００３１】
暴露開始から２１日目では、コントロールは発生段階５７乃至５８に到達するが、発生段階５７は変態始動期（Prometamorphosis）、発生段階５８は変態最盛期（Climax）の範囲に位置することになる。
【００３２】
<暴露装置>
【００３３】
上述の評価方法に用いる暴露装置について図１及び図２を用いて説明する。
【００３４】
図１は暴露装置の概略斜視図であり、図２は図１の暴露装置の一部である希釈装置の概略図である。
【００３５】
図１に示すように、暴露装置１は、複数の収容器としての水槽３００と、これら水槽３００を収容した暴露チャンバ２００と、暴露チャンバ２００の側面に設けられた生成装置としての希釈装置１００とを有する。
【００３６】
水槽３００は、アフリカツメガエルの幼生と飼育水を収容するガラス製の容器であり、飼育水は流水式となっている。水槽３００内へ供給される飼育水は希釈装置１００で生成され、図示しない供給管によって水槽３００内へ供給される。また、水槽３００内の飼育水を外部に排出する排出管（図示せず）も設けられている。
【００３７】
暴露チャンバ２００は、複数、ここでは２０個の水槽３００を収容する。水槽３００内の飼育水を水温２２±１℃に保持するために、暴露チャンバ２００内には水温２２±１℃の水が張られ、この水に水槽３００が浸かっている。暴露チャンバは斜側面がスライド式に開閉可能となっており、この斜側面を開けることによって、水槽３００内の試験個体にアクセス可能となっている。
【００３８】
複数の水槽３００内へは、希釈装置１００から化学物質の含有濃度が異なる飼育水が供給される。
【００３９】
希釈装置１００は、化学物質の含有濃度が異なる複数の飼育水を生成する装置である。
【００４０】
希釈装置１００は、図２に示すように、化学物質用セル（ＴＣ：Toxicant cell）１１１と、水用セル（ＷＣ：Water cell）１１２と、希釈セル（ＤＣ：Dilution Cell）１２０と、フローブースターセル（ＦＢＣ：Flow booster cell）１３０と、フロースプリッターセル（ＦＳＣ：Flow splitter cell）１４０とを有している。
【００４１】
化学物質用セル１１１は、評価対象の化学物質が供給/収容されるセルであり、このセルには化学物質供給管Ｔ１（符号１１３）が取り付けられている。化学物質供給管Ｔ１（符号１１３）からは例えば１００ｍｌ／分の割合で希釈セル１２０に化学物質が供給される。
【００４２】
水用セル１１２は、活性炭により塩素除去した水道水が収容されるセルであり、このセルには、４つの給水管Ｗ１(符号１１４)、Ｗ２（符号１１５）、Ｗ３(符号１１６)、Ｗ４（符号１１７）がそれぞれ間隔をおいて取り付けられている。給水管Ｗ１とＷ２との距離及び給水管Ｗ２とＷ３との距離はそれぞれ等しく、給水管Ｗ３とＷ４との距離は、給水管Ｗ１とＷ２との距離よりも広くなっている。３つの給水管Ｗ１（符号１１４）、Ｗ２（符号１１５）、Ｗ３(符号１１６)からは例えば５０ｍｌ／分の割合で希釈セル１２０に水が供給される。給水管Ｗ４（符号１１７）からは例えば１００ｍｌ／分の割合で希釈セル１２０に水が供給される。
【００４３】
化学物質用セル１１１及び水用セル１１２は隣接しており、本実施形態においては、１つのセル１１０を１枚の仕切り板によって空間的に分離して、化学物質用セル１１１と水用セル１１２を設けている。セル１１０には、化学物質用セル１１１と水用セル１１２と連結する非常用排出口１６０が設けられている。
【００４４】
希釈セル１２０は、１つの直方体状のセル内の上面及び底面に互い違いに複数の仕切り板１２１が設けられて構成されている。本実施形態においては、上面に設けられた仕切り板１２１は８枚、底面に設けられた仕切り板１２１は８枚である。
【００４５】
希釈セル１２０には、５つの濃縮供給管Ｃ１〜Ｃ５及び濃縮供給管Ｃ４とＣ５との間に水排出管１６１が取り付けられている。隣り合う濃縮供給管の間には、底面に仕切り板が２枚づつ設けられている。更に、濃縮供給管Ｃ１とＣ２の間、濃縮供給管Ｃ２とＣ３の間、及び濃縮供給管Ｃ３とＣ４の間には、それぞれ上面に仕切り板が２枚、底面に設けられた仕切り板と互い違いになるように設けられている。濃縮供給管Ｃ４とＣ５の間には上面に設けられた仕切り板はない。また、５つの濃縮供給管Ｃ１〜Ｃ５を挟み込むように、両脇にそれぞれ１枚づつ上面に仕切り板が設けられている。
【００４６】
濃縮供給管Ｃ１とＣ２の間に位置する４枚の仕切り板の内、中央の２枚の仕切り板の間に給水管Ｗ１（符号１１４）からの水が供給されるように、給水管Ｗ１（符号１１４）が設けられている。同様に、濃縮供給管Ｃ２とＣ３の間に位置する４枚の仕切り板の内、中央の２枚の仕切り板の間に給水管Ｗ２（符号１１５）からの水が供給されるように、給水管Ｗ２（符号１１５）が設けられている。濃縮供給管Ｃ３とＣ４の間に位置する４枚の仕切り板の内、中央の２枚の仕切り板の間に給水管Ｗ３（符号１１６）からの水が供給されるように、給水管Ｗ３（符号１１６）が設けられている。５つの濃縮供給管Ｃ１〜Ｃ５を挟み込むように両脇にそれぞれ１枚づつ上面に設けられた仕切り板よりも外側にそれぞれ化学物質供給管Ｔ１（符号１１３）からの化学物質が、そして給水管Ｗ４（符号１１７）からの水が供給されるように、化学物質供給管Ｔ１（符号１１３）及び給水管Ｗ４（符号１１７）が設けられている。濃縮供給管Ｃ１とＣ２との距離、Ｃ２とＣ３との距離、Ｃ３とＣ４との距離は、それぞれ等しく、Ｃ４とＣ５との距離はＣ１とＣ２との距離よりも狭くなっている。
【００４７】
セル１１０から供給された化学物質及び水は、図に示す矢印のように、仕切り板１２１によって設けられた流路を通って流れていく。これにより、濃縮供給管Ｃ１（符号１２２）からは希釈されていない化学物質からなる飼育水がフローブースターセル１３０に供給される。濃縮供給管Ｃ２（符号１２３）からは、濃縮供給管Ｃ１（符号１２２）から排出されなかった化学物質が給水管W１（符号１１４）からの水によって希釈されて、フローブースターセル１３０に供給される。濃縮供給管Ｃ３（符号１２４）からは、濃縮供給管Ｃ２（符号１２３）から排出されなかった飼育水が給水管W２（符号１１５）からの水によって更に希釈されてフローブースターセル１３０に供給される。濃縮供給管Ｃ４（符号１２５）からは、濃縮供給管Ｃ３（符号１２４）から排出されなかった飼育水が給水管W３（符号１１６）からの水によって更に希釈されてフローブースターセル１３０に供給される。濃縮供給管Ｃ４（符号１２５）から排出されなかった飼育水は、水排出管１６１を介して外部に排出される。濃縮供給管Ｃ５（符号１２７）からは、給水管Ｗ４（符号１１７）から供給された、化学物質を含有しない水からなるコントロールとして用いられる飼育水が、フローブースターセル１３０に供給される。濃縮供給管Ｃ５（符号１２７）から排出されなかった飼育水は、水排出管１６１を介して外部に排出される。例えば、濃縮供給管Ｃ１（符号１２２）からは濃度６．０ｍｇ／Ｌ、濃縮供給管Ｃ２（符号１２３）からは濃度３．０ｍｇ／Ｌ、濃縮供給管Ｃ３（符号１２４）からは濃度１．５ｍｇ／Ｌ、濃縮供給管Ｃ４（符号１２５）からは濃度０．７５ｍｇ／Ｌというように、前段にある飼育水が倍に希釈された飼育水が排出される。
【００４８】
このように、希釈セル１２０において、底面及び上面に仕切り板を設け、化学物質を１箇所から、水を複数箇所から供給することにより、１つのセル内で段階的に複数の異なる化学物質濃度の異なる飼育水を生成することができる。
【００４９】
フローブースターセル１３０は５つのセル１３１〜１３５からなり、各セル１３１〜１３５に毛細管１３１ａ〜１３５ａが取り付けられている。各セル１３１〜１３５には化学物質濃度が異なる飼育水が希釈セル１２０から供給され、セル１３１〜１３５に供給された飼育水は毛細管１３１ａ〜１３５ａを介してフロースプリッターセル１４０に供給される。
【００５０】
フロースプリッターセル１４０は５つのセル１４１〜１４５からなり、各セル１４１〜１４５の底部にはそれぞれ４つづつ穴が設けられている。この穴は分配収容器１４６〜１５０と連結しており、各分配収容器１４６〜１５０は図示しない供給管に連結されている。セル１４１〜１４５にはそれぞれ化学物質濃度が異なる飼育水が供給され、フロースプリッターセル１４０によって５種類の化学物質濃度が異なる飼育水は各濃度毎に４つづつ分配収容器１４６〜１５０に分配される。そして、暴露チャンバ２００内の１槽の水槽３００に対して１つの分配収容器が割り当てられ、供給管を介して各水槽３００内に飼育水が供給される。従って、５種類の化学物質濃度が異なる飼育水を収容した水槽が、各濃度毎に４つづつ設けられることとなる。
【００５１】
このように、本実施形態においては、希釈装置１００によって複数の化学物質濃度の異なる飼育水を生成することができる。
【００５２】
また、本実施形態においては、１つの暴露チャンバに対して１つの希釈装置を設けたが、１つの暴露チャンバに対して複数の希釈装置を設けてもよい。これにより複数種の化学物質各々について、複数濃度の飼育水を生成することができ、１つの暴露チャンバ内で複数種類の化学物質について評価することができる。
【００５３】
尚、本実施形態においては、試験動物としてアフリカツメガエルを用いたが、これに限られるものではなく、Xenopus、Silurana、Rana属等に属する各種無尾両生類、有尾両生類等、種々の両生類に適用可能である。また、必要に応じて、魚類等、各種水生生物に対して活用できる。
【００５４】
次に、本実施形態について、具体的な試験を参照しながら説明する。
【００５５】
<試験１>
【００５６】
上述の化学物質評価方法では暴露開始時期を発生段階５１とし、評価時期を暴露最終日である２１日目としているが、これは、発生段階５４に達したアフリカツメガエルの幼生を１４日間暴露した試験と、発生段階５１に達したアフリカツメガエルの幼生を２１日間暴露した試験とを比較し、その結果に基づいて設定された。
【００５７】
試験は、化学物質として抗甲状腺ホルモン作用があるＰＴＵ（Propylthiouracil）と、甲状腺ホルモンであるＴ４（Thyroxine）の２種類を用い、上述した暴露装置により実施した。
【００５８】
まず、発生段階５４に達したアフリカツメガエルの幼生を２００匹と、発生段階５１に達したアフリカツメガエルの幼生を２００匹用意した。発生段階５４に達したアフリカツメガエルの幼生には１４日間、発生段階５１に達したアフリカツメガエルの幼生には２１日間に渡り試験を行った。
【００５９】
飼育水としては、化学物質を含有しない脱塩素水道水（以下、コントロール）、該脱塩素水道水を用いて、２．５ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌの４種類の濃度となるようにＰＴＵ（プロピルウラシル）を添加した飼育水、０．２５μｇ／Ｌ、０．５μｇ／Ｌ、１．０μｇ／Ｌ、２．０μｇ／Ｌの４種類の濃度のＴ４を添加した飼育水を使用した。水槽１槽あたり２０匹の幼生を入れ、コントロールとして１４日試験及び２１日試験それぞれ２連用意し、同様に、各化学物質毎、各濃度毎、１４日試験及び２１日試験毎に、２連用意した。試験終了後、試験最終日に全長、体重、発生段階、後肢長を測定した。なお、測定結果の評価は、上述の統計方法を用いて行った。
【００６０】
ＰＴＵに関しては、コントロールと比較して、全長は、１４日間試験、２１日間試験ともに差がなかった。体重は、１４日間試験では全ての濃度で差がなく、２１日間試験では５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ及び２０ｍｇ／Ｌで差が確認された。発生段階は、１４日間試験と２１日間試験ともに、２０ｍｇ／Ｌで発生の抑制が確認された。後肢長は、１４日間試験では２０ｍｇ／Ｌにおいて差があり、２１日間試験では５ｍｇ／Ｌと２０ｍｇ／Ｌで差が確認できた。更に、５ｍｇ／Ｌと２０ｍｇ／Ｌとを比較すると２０ｍｇ／Ｌの方が顕著に成長を抑制していた。
【００６１】
以上から、１４日間試験、２１日間試験ともに、発生段階及び後肢長において、ＰＴＵの影響を確認することができた。しかし、２０ｍｇ／Ｌにおいて、２１日間試験では、１４日間試験と比較して、コントロールとの差が大きかった。すなわち、２１日試験において、より顕著にコントロールとの差を確認できたことから、弱い抗甲状腺ホルモン作用を持つ化学物質を対象とした場合を想定すると、２１日試験で評価すべきと結論した。
【００６２】
一方、Ｔ４に関しては、コントロールと比較して、全長は、１４日間試験では全ての濃度において、２１日間試験では２．０μｇ／Ｌにおいて短くなった。体重は、１４日間試験、２１日間試験において、一定の傾向を確認することができなかった。発生段階は、１４日間試験では２．０μｇ／Ｌで促進された。また、２１日間試験でも１．０及び２．０μｇ／Ｌにおいて促進された。後肢長は、１４日試験では０．２５μｇ／Ｌと１．０μｇ／Ｌで差が確認できたが、０．５μｇ／Ｌと２．０μｇ／Ｌにおいて差が認められず、明確な結果を得られなかった。一方、２１日間試験では、１．０μｇ／Ｌと２．０μｇ／Ｌにおいて差が確認された。
【００６３】
以上から、１４日間試験では全長、発生段階において、２１日間試験では全長、発生段階、後肢長においてＴ４の影響を評価することができた。
【００６４】
以上、ＰＴＵとＴ４の両方を評価できたのは、２１日間試験であり、発生段階、後肢長は有効なエンドポイントと考えられた。変態始動期（Prometamorphosis）にあるステージ５４では、甲状腺ホルモンレセプター（ＴＲβ）の発現が上昇しつつあり、かつ甲状腺ホルモンの分泌量も増加し始めているが、前変態期（Premetamorphosis）にあるステージ５１では、甲状腺ホルモンレセプター（TRβ）の発現はほとんど認められないものの、該ホルモンに対する応答性は備わっており、かつ内因性の甲状腺ホルモンの分泌もほとんど認められない。したがって、ステージ５１で暴露を開始した方が、ステージ５４で暴露を開始した場合と比較して、化学物質の影響が反映されやすいと考えられる。なお、ステージ５１以前、例えば、ステージ48/49でも暴露は可能であるが、甲状腺ホルモン軸に対する感受性がステージ５１と比較して劣るため実際的ではない。したがって、アフリカツメガエルの幼生の場合、暴露開始時期を発生段階５１と設定した。
【００６５】
また、試験期間を２１日間と設定したのは、上述したように、化学物質の甲状腺ホルモン作用はもちろん、抗甲状腺ホルモン作用をより明確に評価できたからであり、特に、弱い抗甲状腺ホルモン作用を持つ化学物質を評価するには２１日間の試験が必要と考えられる。
【００６６】
<試験２>
【００６７】
以下の試験により、試験１において設定した試験条件について検証した。
【００６８】
化学物質として、甲状腺ホルモンであるＴ４、甲状腺ホルモン合成阻害作用があるＰＥＲ（Perchlorate）、モノデイオディナーゼ（monodeiodinase）の阻害作用を持つＩＯＰ（Iopanoic acid）の３種類を用いて、上述の暴露装置で暴露した。
【００６９】
まず、発生段階５１に達したアフリカツメガエルの幼生を４００匹用意した。飼育水としては、化学物質を含有しない飼育水（以下、コントロール）、０．７５ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ、６．０ｍｇ／Ｌの４種類の濃度のＩＯＰを含有した飼育水、０．２５μｇ／Ｌ、０．５μｇ／Ｌ、１．０μｇ／Ｌ、２．０μｇ／Ｌの４種類の濃度のＴ４を含有した飼育水、６２．５μｇ／Ｌ、１２５μｇ／Ｌ、２５０μｇ／Ｌ、５００μｇ／Ｌの４種類の濃度のＰＥＲを含有した飼育水を使用した。水槽１槽あたり２０匹の幼生を入れ、コントロールは４連、同様に、化学物質毎、濃度毎に４連用意した。そして、幼生を２１日間に渡り暴露した。そして、暴露開始７日目及び２１日目における、発生段階、体重、全長、頭胴長、後肢長および甲状腺を評価した。また、統計による検証は、上述したとおりに行った。
【００７０】
（Ｔ４試験）
【００７１】
発生段階は７日目と２１日目のいずれにおいても差が認められなった。体重は２１日目の１．０μｇ／Ｌ、２．０μｇ／Ｌの濃度において、全長及び頭胴長については、２１日目の２．０μｇ／Ｌの濃度でのみ差があり、これらの濃度ではいずれも統計学的に有意な低値が認められた。７日目においては、いずれも差が認められなかった。後肢長は、７日目の全ての濃度、２１日目の１．０μｇ／Ｌ、２．０μｇ／Ｌの濃度において、統計学的に有意な高値が認められた。
【００７２】
体重、全長および頭胴長で認められた差は、いずれもＴ４による尾の退縮の影響を捕らえているものと思われる。また、後肢の伸張は、尾の退縮とは異なり、暴露を開始する発生段階５１において既に始まっており、またＴ４により、甲状腺ホルモンレセプターの発現も促進されるため、７日目において、Ｔ４の作用が明確に現れたと考えられる。したがって、後肢長は甲状腺ホルモンレセプターを介した甲状腺軸かく乱作用を評価するために、非常に適したエンドポイントと考えられる。また、組織切片より、甲状腺の断面積を測定して検証した結果、コントロールと比較して、甲状腺の肥大や縮小は認められなかった。以上、Ｔ４の暴露試験においては、体重、全長、頭胴長及び後肢長でＴ４の影響を検出できた。
【００７３】
（ＰＥＲ試験）
【００７４】
発生段階、全長、頭胴長、後肢長においては、７日目と２１日目のいずれにおいても差が認められなかった。体重については、２１日目の５００μｇ／Ｌの濃度において、統計学的に有意な高値が認められた。一方、組織切片より、甲状腺の断面積を測定して検証した結果、コントロールと比較して、全濃度において甲状腺の肥大が認められた。ＰＥＲは、ヨウ化ナトリウム共輸送体（sodium/iodide symporter）を阻害することで、甲状腺ホルモンの合成を阻害し、甲状腺ホルモンのレベルを減少させ、ＴＳＨ（Thyroid stimulating hormone；甲状腺刺激ホルモン）の分泌を促進させる。このため、全濃度において甲状腺の肥大が生じたと考えられる。なお、組織学的検証では、甲状腺の肥大が認められるとともに、甲状腺の濾胞上皮細胞において、２５０μｇ／Ｌと５００μｇ／Ｌで過形成が認められた。
【００７５】
（ＩＯＰ試験）
【００７６】
ＩＯＰの暴露試験においては、発生段階を決定できない個体が生じた。アフリカツメガエルでは、T4からT3への変換を担うタイプIIモノデイオディナーゼと、T4からrT3への変換を担うタイプIIIモノデイオディナーゼの２つのモノデイオディナーゼが知られており、これら２タイプのモノデイオディナーゼは、組織や発生段階によって発現量が異なっている。ＩＯＰは、これら２タイプのモノデイオディナーゼのどちらの働きも抑えることから、発生段階が決定できない個体が生じたと思われる。また、体重、全長、頭胴長及び後肢長について、全濃度で統計的に有意な低値が認められた。また、組織切片より、甲状腺の断面積を測定して検証した結果、コントロールと比較して、１．５ｍｇ／Ｌと３．０ｍｇ／Ｌの濃度において甲状腺の肥大が認められた。なお、甲状腺の濾胞上皮細胞について、病理学的な異常は認められなかった。
【００７７】
以上より、試験１において設定した試験条件において、化学物質の甲状腺ホルモンかく乱作用を評価することができた。また、エンドポイントに関しては、形態学的なエンドポイント（発生段階、後肢長、全長、湿重量、頭胴長等）と、組織学的エンドポイント（甲状腺の量的変化、甲状腺の質的変化等）とを適宜組み合わせることがより望ましいと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】暴露装置の概略斜視図。
【図２】図１の一部である希釈装置の概略図である。
【符号の説明】
【００７９】
１・・・暴露装置
１００・・・希釈装置
２００・・・暴露チャンバ
３００・・・水槽
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルモンに対する応答性を有し、かつ内因性の前記ホルモン濃度が低値である時期に、両生類への化学物質の暴露を開始することを特徴とする化学物質評価方法。
【請求項２】
前記時期は前変態期であることを特徴とする請求項１記載の化学物質評価方法。
【請求項３】
前記ホルモンは甲状腺ホルモンであることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の化学物質評価方法。
【請求項４】
前記両生類はXenopus属乃至Silurana属に属し、前記時期は発生段階５１であることを特徴とする請求項１から請求項３いずれか一項に記載の化学物質評価方法。
【請求項５】
前記時期から２１日間暴露を行い、暴露最終日に前記両生類の変化に基づいて前記化学物質を評価することを特徴とする請求項１から請求項４いずれか一項に記載の化学物質評価方法。
【請求項６】
前記両生類の変化は、発生段階、後肢長、全長、湿重量、頭胴長、甲状腺の量的変化、および甲状腺の質的変化からなる群より選択された少なくとも１つの指標により評価されることを特徴とする請求項５記載の化学物質評価方法。
【請求項７】
請求項１から請求項６いずれか一項に記載の評価方法に用いる暴露装置であって、
前記化学物質を含有する飼育水及び前記両生類を収容する収容器と、
前記収容器内に対し供給するための前記化学物質の複数濃度を含む前記飼育水を生成する生成装置と
を具備することを特徴とする暴露装置。
【請求項８】
前記生成装置は複数個あることを特徴とする請求項７記載の暴露装置。
【請求項１】
ホルモンに対する応答性を有し、かつ内因性の前記ホルモン濃度が低値である時期に、両生類への化学物質の暴露を開始することを特徴とする化学物質評価方法。
【請求項２】
前記時期は前変態期であることを特徴とする請求項１記載の化学物質評価方法。
【請求項３】
前記ホルモンは甲状腺ホルモンであることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の化学物質評価方法。
【請求項４】
前記両生類はXenopus属乃至Silurana属に属し、前記時期は発生段階５１であることを特徴とする請求項１から請求項３いずれか一項に記載の化学物質評価方法。
【請求項５】
前記時期から２１日間暴露を行い、暴露最終日に前記両生類の変化に基づいて前記化学物質を評価することを特徴とする請求項１から請求項４いずれか一項に記載の化学物質評価方法。
【請求項６】
前記両生類の変化は、発生段階、後肢長、全長、湿重量、頭胴長、甲状腺の量的変化、および甲状腺の質的変化からなる群より選択された少なくとも１つの指標により評価されることを特徴とする請求項５記載の化学物質評価方法。
【請求項７】
請求項１から請求項６いずれか一項に記載の評価方法に用いる暴露装置であって、
前記化学物質を含有する飼育水及び前記両生類を収容する収容器と、
前記収容器内に対し供給するための前記化学物質の複数濃度を含む前記飼育水を生成する生成装置と
を具備することを特徴とする暴露装置。
【請求項８】
前記生成装置は複数個あることを特徴とする請求項７記載の暴露装置。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−１３９０９８（Ｐ２００８−１３９０９８Ａ）
【公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３２３９７７（Ｐ２００６−３２３９７７）
【出願日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【出願人】（０００２２３１０４）東和科学株式会社 (9)
【公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【出願人】（０００２２３１０４）東和科学株式会社 (9)
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