卒中のインビトロ診断のための方法
この発明は、個体における卒中および一過性の虚血性発作（ＴＩＡ）のインビトロ診断のための方法であって：（ａ）個体の生体サンプルにおいてｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベルを測定するステップと；（ｂ）測定されたレベルをカットオフ値と比較するステップと；（ｃ）それから、卒中またはＴＩＡが個体に生じたかどうかを判断するステップとを含む方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
この発明は卒中のインビトロ診断のための方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
卒中は、脳血管障害（ＣＶＡ）としても知られている、毎年卒中と診断される推定で７００，０００人の患者の死亡および病態の主要な原因の１つである。卒中は、現在、合衆国において、死因の第３位である。
【０００３】
「卒中」という語は、区別するのに最も重要な２つの幅広く異なる臨床設定を包含する。虚血性卒中は、したがって通常は、血管の封鎖によって引き起こされ、最善の治療は、症状の発症の３時間以内におけるｔ−ＰＡなどのような血栓溶解剤による。対照的に、出血性卒中は、脳内への出血によって引き起こされ、それは抗血液凝固剤による如何なる処置も禁じるものであり、なぜならば、それは致命的となり得るからである。
【０００４】
一過性虚血発作（ＴＩＡ、しばしば、口語的に、「ミニ卒中」とも呼ばれる）は、脳のある特定の領域への血液供給における変化によって引き起こされ、結果として、定義上では、２４時間未満の間持続する短い神経機能障害をもたらし；症状が持続する場合には、それは卒中として分類される（たとえばTransient Ischemic Attacks: Stroke (CVA): Merck Manual Home Editionを参照）。ＴＩＡと診断された患者は、時として、近づきつつある卒中に対する警告を受けた、と言われることがある。血管供給障害の期間が数分以上続く場合、脳の当該領域の神経細胞は死に、永久的な神経障害を引き起こす。ＴＩＡのある人々の３分の１は、後に、再発性のＴＩＡを引き起こし、３分の１が、永久的な神経細胞欠損のため、卒中を引き起こす(Transient ischemic attack Mount Sinai Hospital, New York)。したがって、ＴＩＡの同定は、これらの患者が将来において大きな卒中のリスクを有するという点において、有益である。
【０００５】
突然の痺れ感または失明、錯乱、激しい頭痛、不明瞭な言語、および局部的麻痺など、卒中を示す症状を呈する患者における卒中の診断ならびに虚血性卒中と出血性卒中との間における区分は、現在のところ、本質的には、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）に依存している。ＣＴは、しかしながら、完全に満足のゆくものではなく、なぜならば、それは、急性卒中を診断する際において２６％未満の推定感度を有し（Chalela et al. (2007) Lancet 369:293-298）、それは、３３％未満の感度での、虚血性卒中を検出する際における非常に貧弱な性能に結びつけられる（Reynolds et al. (2003) Clin. Chem. 49:1733-1739）。磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）は、急性卒中、特に虚血性卒中を診断することにおいて、ＣＴよりも優れていると示されている（８４％感度、Chalela et al. (2007) Lancet 369:293-298）。しかしながら、ＭＲＩスキャナは高価な設備であり、救急処置室において常に利用可能であるとは限らない。
【０００６】
したがって、特に、ＣＴに対する代替的または相補的な、卒中およびＴＩＡを診断するための方法に対するニーズが依然として存在する。
【０００７】
この点において、生化学的マーカが、特に、虚血性卒中の早期検出に鑑み、卒中を検出する際における一助として提案されている。
【０００８】
Ｓ−１００ｂ（アストロサイト賦活のマーカ）およびニューロン特異エノラーゼ（ＮＳＥ）は、最もよく特徴付けられるそのようなマーカの中にある（Jauch et al. (2006) Stroke 37:2508-2513）。心臓型脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰ）も有望なマーカとして考えられている(Lescuyer et al. (2005) Mol. Diagn. 9:1-7)。しかしながら、これらのマーカによって提供される識別能力は、個々では、臨床的な価値のものとしては十分ではないように思われる。
【０００９】
したがって、Ｓ−１００ｂ、Ｂ型神経栄養成長因子（ＢＮＧＦ）、フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）および単球走化性蛋白−１（ＭＣＰ−１）などのような、虚血性卒中を診断するためのいくつかのマーカを組合せるパネルを用いることが提案されている(Reynolds et al. (2003) Clin. Chem. 49:1733-1739)。実際には、このパネルは、症状の発症から６時間以内の虚血性卒中サンプルに対して、９３％の特異度で、９２％の感度を与えることが示された。しかしながら、発症から３時間以内では、感度は僅か８７％であり、それは、マーカが有するあまりに低い個々の感度／特異度のためであるかも知れない。
【００１０】
したがって、感度／特異度を増大させるか、またはパネルにおいてレベルを測定しなければならないマーカの数を減じることを可能にすることによって、単一マーカのテストに用いられるか、または複数マーカパネルを改善するよう、十分な個々の感度／特異度比率を提供するような代替的マーカに対するニーズが依然としてある。
【００１１】
１０８個のアミノ酸からなる前駆体タンパク質であるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）は、インビボで開裂されることにより、（ｉ）ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）の３２個のＣ末端アミノ酸からなる脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ（３２）または単にＢＮＰとも称される）、および（ii）ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）の７６個のＮ末端アミノ酸からなるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（１―７６）を産生する(Giuliani et al. (2006) Clinical Chemistry 52:1054-61)。生物学的には、ＢＮＰは、体積膨張および圧力過負荷に応答して主に左心室から放出される血圧調整物質である。ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）は重度の心不全の患者の中で循環していることが示されている(Hammerer-Lercher et al. (2008) Clinical Chemistry 54:5)。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この発明は、本発明者らによる、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）単独で卒中検出において高い識別能力（たとえば血漿サンプルで測定して９５％の感度および９５％の特異度）を有したという予期せぬ知見から生じている。
【００１３】
したがって、この発明は、個体における卒中および一過性の虚血性発作（ＴＩＡ）のインビトロ診断のための方法であって：
（ａ）個体の生体サンプルにおいてｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベルを測定するステップと；
（ｂ）測定されたレベルをカットオフ値と比較するステップと；
（ｃ）それから、卒中またはＴＩＡが個体に生じたかどうかを判断するステップとを含む方法に関する。
【００１４】
上に規定される方法のある実施の形態では、この発明はさらに特に、
（ａ’）個体の生体サンプルにおいてｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベルを測定するステップと、
（ｂ’）個体の生体サンプルにおいて少なくとも１つのさらなる卒中マーカのレベルを測定するステップと、
（ｃ’）ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベルおよび少なくとも１つのさらなる卒中マーカのレベルを、１つまたはいくつかのカットオフ値と比較するステップと、
（ｄ’）それから、卒中またはＴＩＡが個体に生じたか否かを判断するステップとを含む方法に関する。
【００１５】
この発明の別の実施の形態では、上に規定される方法は、さらに、少なくとも１つの心血管疾患のマーカのレベルを測定することをさらに含む。
【００１６】
この発明は、さらに、
−ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントを検出することに対して好適な少なくとも１つの抗体；および
−ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントを、好ましくは１〜１０００ｐｇ／ｍｌの濃度で含む少なくとも１つのキャリブレータを含む、卒中を診断するためのキットにも関する。
【００１７】
この発明は、さらに、卒中またはＴＩＡのインビトロ診断のための、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントの使用にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】卒中母集団および対照母集団におけるＨ−ＦＡＢＰ濃度（縦軸：ｎｇ／ｍｌ）の分布を表わす。
【図２】卒中母集団および対照母集団におけるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）濃度（縦軸：ｐｇ／ｍｌ）の分布を表わす。
【図３】卒中母集団、ＴＩＡ母集団および対照母集団におけるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）濃度（縦軸：ｐｇ／ｍｌ）の分布を表わす。
【図４】卒中母集団および対照母集団におけるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）濃度（縦軸：ｐｇ／ｍｌ）の分布を表わす。
【図５】卒中母集団および対照母集団におけるＳ−１００ｂ濃度（縦軸：ｎｇ／ｍｌ）の分布を表わす。
【図６】卒中母集団および対照母集団におけるＮＳＥ濃度（縦軸：ｎｇ／ｍｌ）の分布を表わす。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
ここで意図されるとおりでは、「診断する」または「診断」を確立するということは、卒中が個体に生じたかどうかを判断することに関する。
【００２０】
ここに意図されるとおりでは、「卒中」はすべての脳血管障害に関する。特に、「卒中」という語は、急性卒中および慢性卒中、ならびに虚血性卒中および出血性卒中を包含する。
【００２１】
虚血性卒中は、脳血管により供給を受ける脳細胞の梗塞および壊死に至るかも知れない、脳血管の部分的または全体的な閉塞により特徴付けられる。一過性の虚血性発作（ＴＩＡ）では、閉塞は、機能不全を引き起こすが、それは２４時間を超えては持続せず、自然に止まる。
【００２２】
出血性卒中は、一般に、脳血管の破裂からの脳内出血により特徴付けられる。
好ましくは、この発明に従うと、卒中は、虚血性卒中および出血性卒中からなる群から選択される。より好ましくは、ここに意図される卒中は急性の虚血性卒中である。
【００２３】
有利なことに、この発明の方法は早期の卒中診断を可能にする。早期の卒中診断は、虚血性卒中の場合において特に重要であり、なぜならば、閉塞した血管を卒中の症状の発症の３時間以内に処置することは大抵の不可逆的な脳損傷を防ぐことになる、と通常は推定されるからである。したがって、上に規定されるステップ（ａ）は、個体における卒中を示す少なくとも１つの症状の発症後、６時間以内、より好ましくは３時間以内、最も好ましくは２時間以内に実施されることが好ましい。
【００２４】
卒中を示す症状は、当業者には周知であり、特に、突然の痺れ感または失明、錯乱、重度の頭痛、不明瞭言語および局部的麻痺を包含する。
【００２５】
個体とは、好ましくはヒトである。
「ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）」は、前駆体ＢＮＰ（３２）およびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（１―７６）に関する。ここに意図されるとおりでは、「ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）」はすべてのその天然の変異体を含む。例示的に、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４によって表わされる。
【００２６】
インビボでは、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）はしばしば部分的に切断され、特に、Ｎ末端側または選択肢的にＣ末端側において１つ以上のアミノ酸を、たとえばプロテアーゼを循環させることによって削除することにより、いわゆる「ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）フラグメント」を形成する。そのようなｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）フラグメントの一例である、ジベプチターゼによる開裂により産生されるｐｒｏＢＮＰ（３−１０８）がLam et al. (2007) J. Am. Coll. Cardiol. 49:1193-1202において記載されている。診断価値があるのは、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のみならず、そのさまざまな天然のフラグメントもそうである、と考えられる。したがって、この発明は、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のレベルを測定することのみならず、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベルにも依存する。
【００２７】
「ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）」および「ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメント」という表現は、リン酸化、糖鎖形成などのような、少なくとも１つの翻訳後修飾を受けた任意のポリペプチドも含む。たとえば、Schellenberger et al. (2006) Arch. Biochem. Biophys. 51 :160-6は、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）は全体的または部分的にＯ糖鎖形成される糖タンパク質であることを示した。
【００２８】
ここにおいて意図されるとおりでは、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントはＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含む。このＲＡＰＲＳＰ配列は、インビボで開裂することでＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（１―７６）およびＢＮＰ（３２）を産生するｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）の部位を含む。したがって、ＲＡＰＲＳＰはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）に特有であり、ＢＮＰ（３２）およびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（１―７６）には見出され得ないため、それらは、したがって、この発明に従うと、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントの定義からは除外される。
【００２９】
この発明に従うｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントはＦＧＲＫＭＤＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を含むことがさらに好ましい。この配列は、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のＢＮＰ（３２）部分に含まれる。さらにより好ましくは、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントは、ＢＮＰ（３２）の全配列を含む（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）。
【００３０】
「さらなる卒中マーカ」という表現は、上に定義されるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメント以外の任意の生化学的マーカに関するものであり、そのレベルは上に定義される卒中またはＴＩＡを示すものである。
【００３１】
「心疾患のマーカ」という表現は、心血管疾患を検出または診断するのに有用な任意のマーカに関する。そのようなマーカは当業者には周知である。好ましくは、心血管疾患のマーカは，Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）からなる群から選択される。心血管疾患のマーカのレベルを測定することはこの発明の方法において有利であるかも知れず、なぜならば、それは、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のレベルの変動に対する原因として、心血管疾患を排除することを可能にするからである。
【００３２】
好ましくは、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメント、少なくとも１つのさらなる卒中マーカ、または少なくとも１つの心血管疾患のマーカのレベルを測定または判断することは、イムノアッセイを用いて判断される。
【００３３】
ここに意図されるとおりでは、「イムノアッセイ」は、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメント、少なくとも１つのさらなる卒中マーカ、または少なくとも１つの心血管疾患のマーカのレベルを、それに特異的に結合する少なくとも１つの化合物（またはリガンド）を用いて判断する任意の方法に関する。それに特異的に結合する化合物（またはリガンド）は如何なる種類のものでもあり得るが、好ましくは、ファージディスプレイによって得られる抗体、アプタマーまたはペプチドである。イムノアッセイ法は当業者には周知であり、当業者に周知のさまざまなフォーマット、たとえば、固相または均相、１つまたは２つのステップ、サンドイッチ法または競合法で実施されてもよい。
【００３４】
好ましくは、一方は捕捉リガンドであり他方は検出リガンドである２つのリガンド間における固相におけるサンドイッチ法が用いられることになる。この種のイムノアッセイは当業者には特に周知である。たとえば、Seferian et al. (2007) Clin. Chem. 53:866-873による論文は、各回毎に、抗体の対（固相で固定された抗体および検出で標識された抗体）を用いる、ＢＮＰ（３２）およびｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）を検定するためのサンドイッチイムノアッセイ（または２つの部位におけるイムノメトリックアッセイ）の一例を示している。
【００３５】
生体サンプルにおける抗原の存在は、検出手段、特に「検出リガンド」によって明らかにされる。検出リガンドは、標識され、捕捉リガンドによって認識されるものとは異なるエピトープの部位を認識することにより、捕捉された抗原に結合することができる。
【００３６】
「標識された」という表現は、直接的な標識および間接的な標識（例えば、それら自体が標識されている他のリガンドにより、または、排他的ではないが、標識されたアビジン−ビオチン対などの、標識された「親和対」の試薬を用いて）の双方を指す。
【００３７】
サンドイッチ法の場合では、捕捉リガンドは、好ましくは、それが患者の天然の抗原におけるエピトープを特異的に認識するように選択され、一方、検出リガンドは、好ましくは、それが患者の天然の抗原における他のエピトープを特異的に認識するような態様で選択される。
【００３８】
好ましくは、捕捉リガンドは固相において固定される。固相の非限定的な例として、マイクロプレート、特に、デンマークのNuncによって販売されているようなポリスチレンマイクロプレートを用いることができる。固形粒子またはビーズ、常磁性ビーズ、たとえば、（EstaporTMの商標で）Dynal, Merck-Eurolab（フランス）およびPolymer Laboratoriesによって製造されるようなもの、またはポリスチレンもしくはポリプロピレン試験管、ガラス、プラスチックもしくはシリコンチップなどさえも、用いられてもよい。
【００３９】
ＥＬＩＳＡアッセイ、ラジオイムノアッセイ、または任意の他の検出方法を用いて、形成された抗原抗体複合体の存在を明らかにしてもよい。このように、異なる種類のリガンド、特に抗体の標識が可能である（放射性、酵素、蛍光など）。
【００４０】
さらに、検出は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のような質量蓄積に基づく方法、圧電検出、さらには質量分析法または第２の標識されたリガンドが存在しない状態でリガンド−抗原タイプの相互作用の研究を可能にするとして規定される任意の他の方法によって実行されてもよい。
【００４１】
「特異的」という語は、それがリガンドの認識または標的に対するリガンドの結合に言及する場合、リガンドと標的との相互作用が、そのリガンドがその標的と構造上類似しない他の標的と実質的に相互作用することなく生ずることを意味する。
【００４２】
「抗体」は、ここで意図されるとおりでは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギまたはラクダ科の種などのような任意の種に属する抗体に関する。抗体は、さらに、キメラ抗体、つまり異なる種に由来する部分を含む抗体でもあり得る。好ましいキメラ抗体は、いわゆる「人体に適合された」抗体であり、定常部（ＣＨおよびＣＬ）はヒト起源であり、可変部（ＶＨおよびＶＬ）はたとえばマウスなどの他の種である。この発明の抗体は、動物感作、またはたとえば組換え法もしくは合成法などのような、当業者に公知の任意の方法で産生することができる。その上、この発明による「抗体」は、さらに、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、ｓｃＦｖフラグメント、およびラクダ科単鎖抗体などのような、前記抗体のパラトープの少なくとも１つを含む抗体フラグメントを包含する。この発明の抗体は、ポリクローナル抗体、特に単一特異性ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体であり得る。
【００４３】
「アプタマー」は当業者に周知である。アプタマーは、ヌクレオチドの化合物、特にリボヌクレオチドもしくはデゾキシリボヌクレオチド、または標的、特にタンパク質標的に特異的に結合することができる天然のペプチドである。天然のヌクレオチドのアプタマーおよびその産生は、特に、Ellington et al. (1990) Nature 346:818-22およびBock et al. (1992) Nature 355:564-6によって記載されている。
【００４４】
「ファージディスプレイ」とは、バクテリオファージのキャプシド上に発現し、キャプシド符号化遺伝子に挿入される核酸配列によって符号化されるポリペプチドリガンドを選択するための技術である。この方法は、当業者には周知であり、特に、ScottおよびSmith (1990) Science 249:386-390、ならびにMarks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597によって記載されている。好ましくは、ファージディスプレイによって得られ得るポリペプチドはｓｃＦｖタイプのポリペプチド（一本鎖可変フラグメント）である。この技術は、特に、Winter et al. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455に記載されている。
【００４５】
好ましくは、上に定義されるイムノアッセイは、ＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むエピトープを標的とする抗体を含む。より好ましくは、抗体は、ブダペスト条約の下で、２００５年４月２９日に、登録番号Ｉ−３０７３でＣＮＣＭ(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75 724 Paris Cedex 15, France)に寄託されたハイブリドーマによって分泌される。そのような抗体は、特に、国際公開ＷＯ２００４／０１４９５２に記載されている。この抗体が有利であるのは、それが、ＢＮＰ（３２）、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（１―７６）およびそれらのそれぞれのフラグメントを特に除く、この発明に従うｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）およびｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のすべてのフラグメントの特異的検出を可能にし、それによって、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）およびそのさまざまなフラグメントの十分な診断の恩恵を得ることを確実にするという点である。
【００４６】
さらに好ましくは、このイムノアッセイは、ＦＧＲＫＭＤＲ配列を含むエピトープを標的とする抗体を含む。より好ましくは、この抗体は、ブダペスト条約の下で、２００７年４月１３日に登録番号Ｉ−３７４６でＢｉｏ−Ｒａｄ(3 boulevard Raymond Poincare, 92430 Marnes la Coquette, France)によりＣＮＣＭ(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75 724 Paris Cedex 15, France)に寄託されたハイブリドーマによって分泌される。そのような抗体は、特に、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６０１８８に記載されている。
【００４７】
有利なことに、ＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むエピトープを標的とする抗体、およびＦＧＲＫＭＤＲ配列を含むエピトープを標的とする抗体は、同じイムノアッセイにおいて組合され、それによって、この発明に従うｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）およびｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントの特異的検出を可能にする。
【００４８】
好ましくは、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントに関する場合、上に規定されるカットオフ値は、明らかに健康な個体の母集団から得られた生体サンプルにおいてこの発明に従うｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントの少なくとも中央値レベルである。より好ましくは、上に規定されるカットオフ値は、明らかに健康な個体の母集団から得られたこの発明に従うｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベルの少なくとも第７５百分位数、第９５百分位数または第９９百分位数に対応する値である。最も好ましくは、このカットオフ値は、少なくとも０ｐｇ／ｍｌ、１ｐｇ／ｍｌ、２ｐｇ／ｍｌ、３ｐｇ／ｍｌ、５ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、５０ｐｇ／ｍｌ、または１００ｐｇ／ｍｌである。カットオフ値が少なくとも０ｐｇ／ｍｌである場合、これは、この発明の方法の上で規定されたステップａ）およびｂ）、またはａ’）またはｃ’）は、単に、上に定義されるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントが個体の生体サンプルに存在するかどうかを判断することにあることを意味する。
【００４９】
同様に、少なくともさらなる卒中マーカに関する場合、上に定義されるカットオフ値は、好ましくは、明らかに健康な個体の母集団から得られる生体サンプルにおける前記少なくとも１つのさらなる卒中マーカの少なくとも中央値レベルである。
【００５０】
この発明に従ってカットオフ値を判断することは、十分に当業者の通常の技術の範囲内である。特に、好ましくは、同じ性質の生体サンプルにおいて、この発明に従うｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメント、または少なくとも１つのさらなる卒中マーカのレベルを測定する際に注意すべきである。ここに意図されるとおりでは、「明らかに健康な個体の母集団」は、好ましくは、上に定義されるような卒中を示す症状を何も呈さない個体に関係する。
【００５１】
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメント、および少なくとも１つのさらなる卒中マーカのレベルを１つまたはいくつかのカットオフ値と比較する場合、それは、一方のｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベル、および他方の少なくとも１つのさらなる卒中マーカのレベルは、各々それぞれのカットオフ値と比較することができること、またはそれらは両方とも単一のカットオフ値と比較できることを意味する。
【００５２】
少なくともさらなる卒中マーカまたは少なくとも１つの心血管疾患のマーカのレベルは、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベルが測定されるサンプルと同じ生体サンプルにおいて測定されることが好ましい。
【００５３】
ここに意図されるとおりでは、「生体サンプル」という表現は、採取されたとおりのサンプル、ならびに、特に、この発明に従うプロセスおよび方法において用いるのに好適にするためにさまざまな処理を経たサンプルの両方を含む。この発明に従う生体サンプルはどのような種類のものでもあり得るが、好ましくは、その生体サンプルは、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、脳脊髄液サンプル、尿サンプルおよび唾液サンプルからなる群から選択されることが好ましい。
【００５４】
実施例
【実施例１】
【００５５】
１．方法
ａ．サンプル
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）およびＨ−ＦＡＢＰのレベルを、発症後３時間以内に卒中が生じた個体から得られた７０の血清サンプル（１５の出血性卒中サンプル（ＨＭ）および５５の虚血性卒中サンプル（ＩＭ））ならびに明らかに健康な個体からの１４８の対照血清サンプルにおいて測定した。
【００５６】
ｂ．バイオマーカ測定
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）レベルの測定を、ＢｉｏＰｌｅｘ（商標）２２００ ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて行なった。
【００５７】
ＢｉｏＰｌｅｘ（商標）２２００は、多重の磁気ビーズおよびフローサイトメトリ技術を組合せて、十分に自動化されたランダムアクセスプラットホーム上において複数分析物検出を提供する。磁気粒子（８μｍ直径、カルボキシル修飾された表面）を、別個の波長で発光し、６３５ｎｍで有意に吸収する、２つの発蛍光団（分類染料、ＣＬ１およびＣＬ２）で染色する。レポータ発蛍光団、β−フィコエリトリン（ＰＥ）が、その高いモル吸光係数、量子収量、耐光退色性、自己消光がないこと、および安定性のために選ばれた。検出器は、同時に、３つの波長：つまり２つの分類染料およびレポータ染料を測定する。
【００５８】
ＢｉｏＰｌｅｘ（商標）２２００ ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）アッセイは２ステップサンドイッチ蛍光イムノアッセイである。第１のステップでは、ＢｉｏＰｌｅｘ（商標）２２００システムは、５０μＬの患者サンプル、登録番号Ｉ−３０７３でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマによって分泌される抗ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）モノクロナール抗体でコーティングされた磁気染色ビーズおよびアッセイバッファを反応容器において組合せる。次いで、１１分間のインキュベーションおよび洗浄サイクルの後、フィコエリトリン（ＰＥ）にコンジュゲートされた登録番号Ｉ−３７４６でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマにより分泌される抗ヒトＢＮＰモノクロナール抗体を添加し、２分間インキュベーションを行なった。過剰なコンジュゲート物の除去後、ビーズ混合物を検出器に通し、それによって、染色されたビーズおよびＰＥの蛍光によりビーズ上に捕捉された抗原の量を同定する。６つの別個のキャリブレータの組を用いた較正の後、３つのレベルの品質コントロールおよび患者サンプル結果をｐｇ／ｍＬで表わす。
【００５９】
２つの品質コントロールビーズも各サンプルで試験を行なって、全体のシステムの統合性を向上させる。
【００６０】
Ｈ−ＦＡＢＰレベルを、Hycult biotechnologyからのヒトＨ−ＦＡＢＰ ＥＬＩＳＡキットを製造業者の指示に従って用いて測定した。
【００６１】
ｃ．統計学的分析
患者の状態に従ったバイオマーカの分布をボックスプロット表現によって表現した、というのも、それは、数値データの群を、５つの数による概要（最小観測値、下位四分位数（Ｑ１）、中央値（Ｑ２）、上位四分位数（Ｑ３）、および最大観測値）を介して図形的に表現する便利な方法であるからである。
【００６２】
データは、Ｂｏｘ−Ｃｏｘ法を用いて、ガウス分布に従い、統計学的分析を可能にするよう、正規化されている(Box, G. E. P. and Cox, D. R. (1964) An analysis of transformations. JRSS B 26, 211-246)。
【００６３】
対照サンプルと卒中サンプルとの間における微分解析を、以下の統計学的検定：ノンパラメトリックである（統計学的分布の仮定を必要とせず、スチューデントのt検定の代替物となり得る）the Wilcoxon Rank Sum Test (Wilcoxon, F. (1945). Individual comparisons by ranking methods. Biometrics, 1, 80-83) 、および恐らくは不等分散を有する２つのサンプルを用いて使用することに対して意図されるスチューデントのt検定の適合物であるウェルチの検定を用いて行なった。解析は、さらに、Benjamini/Hochber法(Benjamini and Y. Hochberg (1995). Controlling the False Discovery Rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J. R. Statist. Soc. B. Vol. 57: 289-300)によるこれらの検定の調整（補正）版も行なった。
【００６４】
マーカの診断性能は２つの指標：感度（疾患母集団を検出する能力）および特異度（対照母集団を検出する能力）によって特徴付けられた。診断検査の結果は、さらに、ＲＯＣ（受信者動作特性）分析の曲線下面積（ＡＵＣ）を判断することによって特徴付けられ得る。ＲＯＣ曲線は、さまざまな濃度に対する検査の感度（Ｓｅ）と特異度（Ｓｐ）との間における相反関係のグラフによる視覚化である(M. H. Zweig and G. Campbell (1993). "Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine". Clinical chemistry 39 (8): 561-57)。
【００６５】
２．結果
ａ．ボックスプロット表現によるバイオマーカの分布
図１および図２は、それぞれ、卒中母集団および対照母集団におけるＨ−ＦＡＢＰ濃度およびｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）濃度の分布を表わす。
【００６６】
表１：対照母集団および卒中母集団におけるＨ−ＦＡＢＰレベルおよびｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）レベル
【００６７】
【表１】
【００６８】
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）マーカは、対照サンプルにおいてよりも卒中サンプルにおいてより高い濃度レベルを示す。一方、測定されたＨ−ＦＡＢＰ濃度は、卒中患者サンプルと対照サンプルとの間において有意な差異を全く示さない。
【００６９】
ｂ）微分解析
卒中サンプルと対照サンプルとの間におけるＨ−ＦＡＢＰレベルおよびｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）レベルにおける差異の統計学的有意性を判断した：
表２：Ｈ−ＦＡＢＰマーカおよびｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）マーカに関して対照母集団および卒中母集団から測定された濃度間における微分解析
【００７０】
【表２】
【００７１】
卒中サンプルと対照サンプルとの間における濃度間の差異は、双方のマーカ（ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）およびＨ−ＦＡＢＰ）について統計学的に有意であったが、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）は、非常に低いｐ値（１０-4）を伴う特に興味深い特性を呈している（表２）。
【００７２】
ｃ）ＲＯＣ曲線分析
臨床状態に対する受信動作特性（ＲＯＣ）分析に基づき、および表３にまとめられるように、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）に対する曲線下領域は、９０％の感度、８５％の特異度で、卒中について診断された患者を健康な被験者と区別することに成功している。さらに、この識別能力は、虚血性卒中患者および出血性卒中患者の双方に対して、それぞれ、０．９３６および０．９３５のＡＵＣで、非常に高い。
【００７３】
表３：対照被験者と比較した場合の卒中患者に関するｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）についての受信動作特性分析データ
【００７４】
【表３】
【００７５】
下の表４に示されるように、Ｈ−ＦＡＢＰマーカは、５７％の感度、５４．７％の特異度で、卒中診断に対する低い識別能力を有する。
【００７６】
表４：対照被験者と比較した場合の卒中患者についてのＨ−ＦＡＢＰに対する受信動作特性分析データ
【００７７】
【表４】
【実施例２】
【００７８】
１．方法
ａ．サンプル
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のレベルを、発症後３時間以内に卒中が生じた個体から得られた２３の血清サンプル（５つの出血性卒中サンプル（ＨＭ）および１８の虚血性卒中サンプル（ＩＭ））、ＴＩＡが臨床診断された個体から得られた７つの血清サンプル、ならびに明らかに健康な個体からの９４の対照血清サンプルにおいて測定した。
【００７９】
ｂ．マーカレベル測定
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）レベルを実施例１に示されるように測定した。
【００８０】
ｃ．統計学的分析
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）レベル分布のボックスプロット表現およびＲＯＣ分析を実施例１に示されるように行なった。
【００８１】
２．結果
ａ）ボックスプロット表現によるバイオマーカの分布
図３は、卒中母集団、ＴＩＡ母集団および対照母集団におけるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）濃度の分布を表現する。
【００８２】
表５：対照母集団、ＴＩＡ母集団および卒中母集団におけるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）分布値
【００８３】
【表５】
【００８４】
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）マーカは、対照サンプルにおいてよりも卒中患者サンプルまたはＴＩＡ患者サンプルにおいてより高い濃度レベルを示す。
【００８５】
ｂ）ＲＯＣ曲線分析
臨床状態に対する受信動作特性（ＲＯＣ）分析に基づき、および表６にまとめられるように、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）に対する曲線下領域は、９１％の感度、８４％の特異度で、卒中について診断された患者を健康な被験者と区別することに成功している。
【００８６】
表６：対照被験者と比較した場合の卒中患者に関するｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）についての受信動作特性分析データ
【００８７】
【表６】
【００８８】
実施例１において立証された、卒中患者を診断するためのｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）の能力が、かくして、これらの新たな病的母集団および健康な母集団において確認される。
【実施例３】
【００８９】
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）が有する識別能力を、さらに、同一の母集団において、先行技術の２つの基準卒中マーカ（Ｓ−１００ｂおよびＮＳＥ）のそれと比較した。
【００９０】
１．方法
ａ．サンプル
マーカのレベルを、発症から３時間以内に卒中が生じた個体から得られた４１の血漿サンプル、および明らかに健康な個体からの対照血漿サンプルにおいて測定した。
【００９１】
ｂ．マーカレベル測定
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）レベルを実施例１に示されるように測定した。
【００９２】
ＮＳＥレベルを、NanogenからのNexus DX（商標） Neuron Specific Enolase (NSE) Testキットを用いて、製造業者の指示に従い測定した。
【００９３】
Ｓ−１００ｂレベルを、NanogenからのNexus DX（商標） S-100 ELISA Testキットを用いて、製造業者の指示に従い測定した。
【００９４】
ｃ．統計学的分析
統計学的分析を実施例１に示されるように行なった。
【００９５】
２．結果
ａ）ボックスプロット表現によるバイオマーカの分布
図４、図５および図６は、それぞれ卒中母集団および対照母集団におけるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）濃度、Ｓ−１００ｂ濃度およびＮＳＥ濃度の分布を表現する。
【００９６】
表７：対照母集団および卒中母集団におけるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）分布値、Ｓ１００分布値およびＮＳＥ分布値
【００９７】
【表７】
【００９８】
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）マーカおよびＮＳＥマーカは、対照サンプルにおいてよりも卒中サンプルにおいてより高い濃度レベルを示す。双方の母集団間における最もよい識別は、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）マーカで観察される。一方、測定されたＳ−１００濃度は卒中患者サンプルと対照サンプルとの間において有意差を全く示さない。
【００９９】
ｂ）微分解析
卒中サンプルおよび対照サンプルにおけるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）レベル、ＮＳＥレベルおよびＳ−１００レベルにおける差の統計学的有意性を判断した：
表８：ＮＳＥマーカ、Ｓ−１００マーカおよびｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）マーカに関して対照母集団および卒中母集団から測定された濃度間における微分解析
【０１００】
【表８】
【０１０１】
ＮＳＥおよびｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）は、非常に低いｐ値（ｐ＜０．００１）を伴って、統計学的に有意である。
【０１０２】
ｃ）ＲＯＣ曲線分析
臨床状態に対する受信動作特性（ＲＯＣ）分析に基づき、および表９にまとめられるように、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）に対する曲線下領域は、９５％の感度、９５％の特異度および０．９７４のＡＵＣで、卒中について診断された患者を健康な被験者と区別することに成功している。
【０１０３】
表９：対照被験者と比較した場合の卒中患者に関する、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）、ＮＳＥおよびＳ−１００についての受信動作特性分析データ
【０１０４】
【表９】
【０１０５】
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）は、卒中患者を対照被験者から区別することにおいて、ＮＳＥおよびＳ−１００ｂにより提供される識別能力を超える高い識別能力を呈することがわかる。
【実施例４】
【０１０６】
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）の診断能力を、さらに、虚血性卒中患者において、実施例１に記載されるようにＢｉｏＰｌｅｘ（商標）２２００ ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）アッセイを用いて評価した。
【０１０７】
ａ）サンプル
−卒中発症の３時間以内に救急部に受入れられた虚血性卒中患者からの３２のクエン酸塩添加血漿サンプルを検査した。卒中重症度は米国立衛生研究所の脳卒中スケール（ＮＩＨＳＳ）で評価した。
【０１０８】
−卒中母集団からの患者と性別および年齢を適合させた明らかに健康な血液提供者からの４２のクエン酸塩添加血漿サンプルを検査した。
【０１０９】
すべてのクエン酸塩添加血漿サンプルを−８０℃で保存した。分析に先立って、サンプルを解凍し、３０００ｇで１５分間４℃で遠心分離した。
【０１１０】
ｂ）結果
対照母集団および虚血性卒中母集団に対するｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）値の分布を表１０に示す。ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のレベルは、対照群と比較して虚血性卒中群において有意に高かった（Mann-Whitney、ｐ＜０．０００１）。これらの結果により、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）はしたがって虚血性卒中の早期診断に対して有用な血漿バイオマーカであることが確認される。
【０１１１】
表１０：虚血性卒中のクエン酸塩添加血漿サンプルおよび対照のクエン酸塩添加血漿サンプルにおけるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）濃度（最小値、第一四分位数、中央値、第三四分位数および最大値）
【０１１２】
【表１０】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
この発明は卒中のインビトロ診断のための方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
卒中は、脳血管障害（ＣＶＡ）としても知られている、毎年卒中と診断される推定で７００，０００人の患者の死亡および病態の主要な原因の１つである。卒中は、現在、合衆国において、死因の第３位である。
【０００３】
「卒中」という語は、区別するのに最も重要な２つの幅広く異なる臨床設定を包含する。虚血性卒中は、したがって通常は、血管の封鎖によって引き起こされ、最善の治療は、症状の発症の３時間以内におけるｔ−ＰＡなどのような血栓溶解剤による。対照的に、出血性卒中は、脳内への出血によって引き起こされ、それは抗血液凝固剤による如何なる処置も禁じるものであり、なぜならば、それは致命的となり得るからである。
【０００４】
一過性虚血発作（ＴＩＡ、しばしば、口語的に、「ミニ卒中」とも呼ばれる）は、脳のある特定の領域への血液供給における変化によって引き起こされ、結果として、定義上では、２４時間未満の間持続する短い神経機能障害をもたらし；症状が持続する場合には、それは卒中として分類される（たとえばTransient Ischemic Attacks: Stroke (CVA): Merck Manual Home Editionを参照）。ＴＩＡと診断された患者は、時として、近づきつつある卒中に対する警告を受けた、と言われることがある。血管供給障害の期間が数分以上続く場合、脳の当該領域の神経細胞は死に、永久的な神経障害を引き起こす。ＴＩＡのある人々の３分の１は、後に、再発性のＴＩＡを引き起こし、３分の１が、永久的な神経細胞欠損のため、卒中を引き起こす(Transient ischemic attack Mount Sinai Hospital, New York)。したがって、ＴＩＡの同定は、これらの患者が将来において大きな卒中のリスクを有するという点において、有益である。
【０００５】
突然の痺れ感または失明、錯乱、激しい頭痛、不明瞭な言語、および局部的麻痺など、卒中を示す症状を呈する患者における卒中の診断ならびに虚血性卒中と出血性卒中との間における区分は、現在のところ、本質的には、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）に依存している。ＣＴは、しかしながら、完全に満足のゆくものではなく、なぜならば、それは、急性卒中を診断する際において２６％未満の推定感度を有し（Chalela et al. (2007) Lancet 369:293-298）、それは、３３％未満の感度での、虚血性卒中を検出する際における非常に貧弱な性能に結びつけられる（Reynolds et al. (2003) Clin. Chem. 49:1733-1739）。磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）は、急性卒中、特に虚血性卒中を診断することにおいて、ＣＴよりも優れていると示されている（８４％感度、Chalela et al. (2007) Lancet 369:293-298）。しかしながら、ＭＲＩスキャナは高価な設備であり、救急処置室において常に利用可能であるとは限らない。
【０００６】
したがって、特に、ＣＴに対する代替的または相補的な、卒中およびＴＩＡを診断するための方法に対するニーズが依然として存在する。
【０００７】
この点において、生化学的マーカが、特に、虚血性卒中の早期検出に鑑み、卒中を検出する際における一助として提案されている。
【０００８】
Ｓ−１００ｂ（アストロサイト賦活のマーカ）およびニューロン特異エノラーゼ（ＮＳＥ）は、最もよく特徴付けられるそのようなマーカの中にある（Jauch et al. (2006) Stroke 37:2508-2513）。心臓型脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰ）も有望なマーカとして考えられている(Lescuyer et al. (2005) Mol. Diagn. 9:1-7)。しかしながら、これらのマーカによって提供される識別能力は、個々では、臨床的な価値のものとしては十分ではないように思われる。
【０００９】
したがって、Ｓ−１００ｂ、Ｂ型神経栄養成長因子（ＢＮＧＦ）、フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）および単球走化性蛋白−１（ＭＣＰ−１）などのような、虚血性卒中を診断するためのいくつかのマーカを組合せるパネルを用いることが提案されている(Reynolds et al. (2003) Clin. Chem. 49:1733-1739)。実際には、このパネルは、症状の発症から６時間以内の虚血性卒中サンプルに対して、９３％の特異度で、９２％の感度を与えることが示された。しかしながら、発症から３時間以内では、感度は僅か８７％であり、それは、マーカが有するあまりに低い個々の感度／特異度のためであるかも知れない。
【００１０】
したがって、感度／特異度を増大させるか、またはパネルにおいてレベルを測定しなければならないマーカの数を減じることを可能にすることによって、単一マーカのテストに用いられるか、または複数マーカパネルを改善するよう、十分な個々の感度／特異度比率を提供するような代替的マーカに対するニーズが依然としてある。
【００１１】
１０８個のアミノ酸からなる前駆体タンパク質であるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）は、インビボで開裂されることにより、（ｉ）ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）の３２個のＣ末端アミノ酸からなる脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ（３２）または単にＢＮＰとも称される）、および（ii）ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）の７６個のＮ末端アミノ酸からなるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（１―７６）を産生する(Giuliani et al. (2006) Clinical Chemistry 52:1054-61)。生物学的には、ＢＮＰは、体積膨張および圧力過負荷に応答して主に左心室から放出される血圧調整物質である。ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）は重度の心不全の患者の中で循環していることが示されている(Hammerer-Lercher et al. (2008) Clinical Chemistry 54:5)。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この発明は、本発明者らによる、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）単独で卒中検出において高い識別能力（たとえば血漿サンプルで測定して９５％の感度および９５％の特異度）を有したという予期せぬ知見から生じている。
【００１３】
したがって、この発明は、個体における卒中および一過性の虚血性発作（ＴＩＡ）のインビトロ診断のための方法であって：
（ａ）個体の生体サンプルにおいてｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベルを測定するステップと；
（ｂ）測定されたレベルをカットオフ値と比較するステップと；
（ｃ）それから、卒中またはＴＩＡが個体に生じたかどうかを判断するステップとを含む方法に関する。
【００１４】
上に規定される方法のある実施の形態では、この発明はさらに特に、
（ａ’）個体の生体サンプルにおいてｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベルを測定するステップと、
（ｂ’）個体の生体サンプルにおいて少なくとも１つのさらなる卒中マーカのレベルを測定するステップと、
（ｃ’）ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベルおよび少なくとも１つのさらなる卒中マーカのレベルを、１つまたはいくつかのカットオフ値と比較するステップと、
（ｄ’）それから、卒中またはＴＩＡが個体に生じたか否かを判断するステップとを含む方法に関する。
【００１５】
この発明の別の実施の形態では、上に規定される方法は、さらに、少なくとも１つの心血管疾患のマーカのレベルを測定することをさらに含む。
【００１６】
この発明は、さらに、
−ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントを検出することに対して好適な少なくとも１つの抗体；および
−ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントを、好ましくは１〜１０００ｐｇ／ｍｌの濃度で含む少なくとも１つのキャリブレータを含む、卒中を診断するためのキットにも関する。
【００１７】
この発明は、さらに、卒中またはＴＩＡのインビトロ診断のための、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントの使用にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】卒中母集団および対照母集団におけるＨ−ＦＡＢＰ濃度（縦軸：ｎｇ／ｍｌ）の分布を表わす。
【図２】卒中母集団および対照母集団におけるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）濃度（縦軸：ｐｇ／ｍｌ）の分布を表わす。
【図３】卒中母集団、ＴＩＡ母集団および対照母集団におけるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）濃度（縦軸：ｐｇ／ｍｌ）の分布を表わす。
【図４】卒中母集団および対照母集団におけるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）濃度（縦軸：ｐｇ／ｍｌ）の分布を表わす。
【図５】卒中母集団および対照母集団におけるＳ−１００ｂ濃度（縦軸：ｎｇ／ｍｌ）の分布を表わす。
【図６】卒中母集団および対照母集団におけるＮＳＥ濃度（縦軸：ｎｇ／ｍｌ）の分布を表わす。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
ここで意図されるとおりでは、「診断する」または「診断」を確立するということは、卒中が個体に生じたかどうかを判断することに関する。
【００２０】
ここに意図されるとおりでは、「卒中」はすべての脳血管障害に関する。特に、「卒中」という語は、急性卒中および慢性卒中、ならびに虚血性卒中および出血性卒中を包含する。
【００２１】
虚血性卒中は、脳血管により供給を受ける脳細胞の梗塞および壊死に至るかも知れない、脳血管の部分的または全体的な閉塞により特徴付けられる。一過性の虚血性発作（ＴＩＡ）では、閉塞は、機能不全を引き起こすが、それは２４時間を超えては持続せず、自然に止まる。
【００２２】
出血性卒中は、一般に、脳血管の破裂からの脳内出血により特徴付けられる。
好ましくは、この発明に従うと、卒中は、虚血性卒中および出血性卒中からなる群から選択される。より好ましくは、ここに意図される卒中は急性の虚血性卒中である。
【００２３】
有利なことに、この発明の方法は早期の卒中診断を可能にする。早期の卒中診断は、虚血性卒中の場合において特に重要であり、なぜならば、閉塞した血管を卒中の症状の発症の３時間以内に処置することは大抵の不可逆的な脳損傷を防ぐことになる、と通常は推定されるからである。したがって、上に規定されるステップ（ａ）は、個体における卒中を示す少なくとも１つの症状の発症後、６時間以内、より好ましくは３時間以内、最も好ましくは２時間以内に実施されることが好ましい。
【００２４】
卒中を示す症状は、当業者には周知であり、特に、突然の痺れ感または失明、錯乱、重度の頭痛、不明瞭言語および局部的麻痺を包含する。
【００２５】
個体とは、好ましくはヒトである。
「ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）」は、前駆体ＢＮＰ（３２）およびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（１―７６）に関する。ここに意図されるとおりでは、「ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）」はすべてのその天然の変異体を含む。例示的に、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４によって表わされる。
【００２６】
インビボでは、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）はしばしば部分的に切断され、特に、Ｎ末端側または選択肢的にＣ末端側において１つ以上のアミノ酸を、たとえばプロテアーゼを循環させることによって削除することにより、いわゆる「ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）フラグメント」を形成する。そのようなｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）フラグメントの一例である、ジベプチターゼによる開裂により産生されるｐｒｏＢＮＰ（３−１０８）がLam et al. (2007) J. Am. Coll. Cardiol. 49:1193-1202において記載されている。診断価値があるのは、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のみならず、そのさまざまな天然のフラグメントもそうである、と考えられる。したがって、この発明は、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のレベルを測定することのみならず、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベルにも依存する。
【００２７】
「ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）」および「ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメント」という表現は、リン酸化、糖鎖形成などのような、少なくとも１つの翻訳後修飾を受けた任意のポリペプチドも含む。たとえば、Schellenberger et al. (2006) Arch. Biochem. Biophys. 51 :160-6は、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）は全体的または部分的にＯ糖鎖形成される糖タンパク質であることを示した。
【００２８】
ここにおいて意図されるとおりでは、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントはＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含む。このＲＡＰＲＳＰ配列は、インビボで開裂することでＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（１―７６）およびＢＮＰ（３２）を産生するｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）の部位を含む。したがって、ＲＡＰＲＳＰはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）に特有であり、ＢＮＰ（３２）およびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（１―７６）には見出され得ないため、それらは、したがって、この発明に従うと、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントの定義からは除外される。
【００２９】
この発明に従うｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントはＦＧＲＫＭＤＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を含むことがさらに好ましい。この配列は、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のＢＮＰ（３２）部分に含まれる。さらにより好ましくは、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントは、ＢＮＰ（３２）の全配列を含む（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）。
【００３０】
「さらなる卒中マーカ」という表現は、上に定義されるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメント以外の任意の生化学的マーカに関するものであり、そのレベルは上に定義される卒中またはＴＩＡを示すものである。
【００３１】
「心疾患のマーカ」という表現は、心血管疾患を検出または診断するのに有用な任意のマーカに関する。そのようなマーカは当業者には周知である。好ましくは、心血管疾患のマーカは，Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）からなる群から選択される。心血管疾患のマーカのレベルを測定することはこの発明の方法において有利であるかも知れず、なぜならば、それは、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のレベルの変動に対する原因として、心血管疾患を排除することを可能にするからである。
【００３２】
好ましくは、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメント、少なくとも１つのさらなる卒中マーカ、または少なくとも１つの心血管疾患のマーカのレベルを測定または判断することは、イムノアッセイを用いて判断される。
【００３３】
ここに意図されるとおりでは、「イムノアッセイ」は、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメント、少なくとも１つのさらなる卒中マーカ、または少なくとも１つの心血管疾患のマーカのレベルを、それに特異的に結合する少なくとも１つの化合物（またはリガンド）を用いて判断する任意の方法に関する。それに特異的に結合する化合物（またはリガンド）は如何なる種類のものでもあり得るが、好ましくは、ファージディスプレイによって得られる抗体、アプタマーまたはペプチドである。イムノアッセイ法は当業者には周知であり、当業者に周知のさまざまなフォーマット、たとえば、固相または均相、１つまたは２つのステップ、サンドイッチ法または競合法で実施されてもよい。
【００３４】
好ましくは、一方は捕捉リガンドであり他方は検出リガンドである２つのリガンド間における固相におけるサンドイッチ法が用いられることになる。この種のイムノアッセイは当業者には特に周知である。たとえば、Seferian et al. (2007) Clin. Chem. 53:866-873による論文は、各回毎に、抗体の対（固相で固定された抗体および検出で標識された抗体）を用いる、ＢＮＰ（３２）およびｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）を検定するためのサンドイッチイムノアッセイ（または２つの部位におけるイムノメトリックアッセイ）の一例を示している。
【００３５】
生体サンプルにおける抗原の存在は、検出手段、特に「検出リガンド」によって明らかにされる。検出リガンドは、標識され、捕捉リガンドによって認識されるものとは異なるエピトープの部位を認識することにより、捕捉された抗原に結合することができる。
【００３６】
「標識された」という表現は、直接的な標識および間接的な標識（例えば、それら自体が標識されている他のリガンドにより、または、排他的ではないが、標識されたアビジン−ビオチン対などの、標識された「親和対」の試薬を用いて）の双方を指す。
【００３７】
サンドイッチ法の場合では、捕捉リガンドは、好ましくは、それが患者の天然の抗原におけるエピトープを特異的に認識するように選択され、一方、検出リガンドは、好ましくは、それが患者の天然の抗原における他のエピトープを特異的に認識するような態様で選択される。
【００３８】
好ましくは、捕捉リガンドは固相において固定される。固相の非限定的な例として、マイクロプレート、特に、デンマークのNuncによって販売されているようなポリスチレンマイクロプレートを用いることができる。固形粒子またはビーズ、常磁性ビーズ、たとえば、（EstaporTMの商標で）Dynal, Merck-Eurolab（フランス）およびPolymer Laboratoriesによって製造されるようなもの、またはポリスチレンもしくはポリプロピレン試験管、ガラス、プラスチックもしくはシリコンチップなどさえも、用いられてもよい。
【００３９】
ＥＬＩＳＡアッセイ、ラジオイムノアッセイ、または任意の他の検出方法を用いて、形成された抗原抗体複合体の存在を明らかにしてもよい。このように、異なる種類のリガンド、特に抗体の標識が可能である（放射性、酵素、蛍光など）。
【００４０】
さらに、検出は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のような質量蓄積に基づく方法、圧電検出、さらには質量分析法または第２の標識されたリガンドが存在しない状態でリガンド−抗原タイプの相互作用の研究を可能にするとして規定される任意の他の方法によって実行されてもよい。
【００４１】
「特異的」という語は、それがリガンドの認識または標的に対するリガンドの結合に言及する場合、リガンドと標的との相互作用が、そのリガンドがその標的と構造上類似しない他の標的と実質的に相互作用することなく生ずることを意味する。
【００４２】
「抗体」は、ここで意図されるとおりでは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギまたはラクダ科の種などのような任意の種に属する抗体に関する。抗体は、さらに、キメラ抗体、つまり異なる種に由来する部分を含む抗体でもあり得る。好ましいキメラ抗体は、いわゆる「人体に適合された」抗体であり、定常部（ＣＨおよびＣＬ）はヒト起源であり、可変部（ＶＨおよびＶＬ）はたとえばマウスなどの他の種である。この発明の抗体は、動物感作、またはたとえば組換え法もしくは合成法などのような、当業者に公知の任意の方法で産生することができる。その上、この発明による「抗体」は、さらに、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、ｓｃＦｖフラグメント、およびラクダ科単鎖抗体などのような、前記抗体のパラトープの少なくとも１つを含む抗体フラグメントを包含する。この発明の抗体は、ポリクローナル抗体、特に単一特異性ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体であり得る。
【００４３】
「アプタマー」は当業者に周知である。アプタマーは、ヌクレオチドの化合物、特にリボヌクレオチドもしくはデゾキシリボヌクレオチド、または標的、特にタンパク質標的に特異的に結合することができる天然のペプチドである。天然のヌクレオチドのアプタマーおよびその産生は、特に、Ellington et al. (1990) Nature 346:818-22およびBock et al. (1992) Nature 355:564-6によって記載されている。
【００４４】
「ファージディスプレイ」とは、バクテリオファージのキャプシド上に発現し、キャプシド符号化遺伝子に挿入される核酸配列によって符号化されるポリペプチドリガンドを選択するための技術である。この方法は、当業者には周知であり、特に、ScottおよびSmith (1990) Science 249:386-390、ならびにMarks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597によって記載されている。好ましくは、ファージディスプレイによって得られ得るポリペプチドはｓｃＦｖタイプのポリペプチド（一本鎖可変フラグメント）である。この技術は、特に、Winter et al. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455に記載されている。
【００４５】
好ましくは、上に定義されるイムノアッセイは、ＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むエピトープを標的とする抗体を含む。より好ましくは、抗体は、ブダペスト条約の下で、２００５年４月２９日に、登録番号Ｉ−３０７３でＣＮＣＭ(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75 724 Paris Cedex 15, France)に寄託されたハイブリドーマによって分泌される。そのような抗体は、特に、国際公開ＷＯ２００４／０１４９５２に記載されている。この抗体が有利であるのは、それが、ＢＮＰ（３２）、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（１―７６）およびそれらのそれぞれのフラグメントを特に除く、この発明に従うｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）およびｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のすべてのフラグメントの特異的検出を可能にし、それによって、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）およびそのさまざまなフラグメントの十分な診断の恩恵を得ることを確実にするという点である。
【００４６】
さらに好ましくは、このイムノアッセイは、ＦＧＲＫＭＤＲ配列を含むエピトープを標的とする抗体を含む。より好ましくは、この抗体は、ブダペスト条約の下で、２００７年４月１３日に登録番号Ｉ−３７４６でＢｉｏ−Ｒａｄ(3 boulevard Raymond Poincare, 92430 Marnes la Coquette, France)によりＣＮＣＭ(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75 724 Paris Cedex 15, France)に寄託されたハイブリドーマによって分泌される。そのような抗体は、特に、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６０１８８に記載されている。
【００４７】
有利なことに、ＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むエピトープを標的とする抗体、およびＦＧＲＫＭＤＲ配列を含むエピトープを標的とする抗体は、同じイムノアッセイにおいて組合され、それによって、この発明に従うｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）およびｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントの特異的検出を可能にする。
【００４８】
好ましくは、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントに関する場合、上に規定されるカットオフ値は、明らかに健康な個体の母集団から得られた生体サンプルにおいてこの発明に従うｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントの少なくとも中央値レベルである。より好ましくは、上に規定されるカットオフ値は、明らかに健康な個体の母集団から得られたこの発明に従うｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベルの少なくとも第７５百分位数、第９５百分位数または第９９百分位数に対応する値である。最も好ましくは、このカットオフ値は、少なくとも０ｐｇ／ｍｌ、１ｐｇ／ｍｌ、２ｐｇ／ｍｌ、３ｐｇ／ｍｌ、５ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、５０ｐｇ／ｍｌ、または１００ｐｇ／ｍｌである。カットオフ値が少なくとも０ｐｇ／ｍｌである場合、これは、この発明の方法の上で規定されたステップａ）およびｂ）、またはａ’）またはｃ’）は、単に、上に定義されるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントが個体の生体サンプルに存在するかどうかを判断することにあることを意味する。
【００４９】
同様に、少なくともさらなる卒中マーカに関する場合、上に定義されるカットオフ値は、好ましくは、明らかに健康な個体の母集団から得られる生体サンプルにおける前記少なくとも１つのさらなる卒中マーカの少なくとも中央値レベルである。
【００５０】
この発明に従ってカットオフ値を判断することは、十分に当業者の通常の技術の範囲内である。特に、好ましくは、同じ性質の生体サンプルにおいて、この発明に従うｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメント、または少なくとも１つのさらなる卒中マーカのレベルを測定する際に注意すべきである。ここに意図されるとおりでは、「明らかに健康な個体の母集団」は、好ましくは、上に定義されるような卒中を示す症状を何も呈さない個体に関係する。
【００５１】
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメント、および少なくとも１つのさらなる卒中マーカのレベルを１つまたはいくつかのカットオフ値と比較する場合、それは、一方のｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベル、および他方の少なくとも１つのさらなる卒中マーカのレベルは、各々それぞれのカットオフ値と比較することができること、またはそれらは両方とも単一のカットオフ値と比較できることを意味する。
【００５２】
少なくともさらなる卒中マーカまたは少なくとも１つの心血管疾患のマーカのレベルは、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベルが測定されるサンプルと同じ生体サンプルにおいて測定されることが好ましい。
【００５３】
ここに意図されるとおりでは、「生体サンプル」という表現は、採取されたとおりのサンプル、ならびに、特に、この発明に従うプロセスおよび方法において用いるのに好適にするためにさまざまな処理を経たサンプルの両方を含む。この発明に従う生体サンプルはどのような種類のものでもあり得るが、好ましくは、その生体サンプルは、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、脳脊髄液サンプル、尿サンプルおよび唾液サンプルからなる群から選択されることが好ましい。
【００５４】
実施例
【実施例１】
【００５５】
１．方法
ａ．サンプル
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）およびＨ−ＦＡＢＰのレベルを、発症後３時間以内に卒中が生じた個体から得られた７０の血清サンプル（１５の出血性卒中サンプル（ＨＭ）および５５の虚血性卒中サンプル（ＩＭ））ならびに明らかに健康な個体からの１４８の対照血清サンプルにおいて測定した。
【００５６】
ｂ．バイオマーカ測定
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）レベルの測定を、ＢｉｏＰｌｅｘ（商標）２２００ ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて行なった。
【００５７】
ＢｉｏＰｌｅｘ（商標）２２００は、多重の磁気ビーズおよびフローサイトメトリ技術を組合せて、十分に自動化されたランダムアクセスプラットホーム上において複数分析物検出を提供する。磁気粒子（８μｍ直径、カルボキシル修飾された表面）を、別個の波長で発光し、６３５ｎｍで有意に吸収する、２つの発蛍光団（分類染料、ＣＬ１およびＣＬ２）で染色する。レポータ発蛍光団、β−フィコエリトリン（ＰＥ）が、その高いモル吸光係数、量子収量、耐光退色性、自己消光がないこと、および安定性のために選ばれた。検出器は、同時に、３つの波長：つまり２つの分類染料およびレポータ染料を測定する。
【００５８】
ＢｉｏＰｌｅｘ（商標）２２００ ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）アッセイは２ステップサンドイッチ蛍光イムノアッセイである。第１のステップでは、ＢｉｏＰｌｅｘ（商標）２２００システムは、５０μＬの患者サンプル、登録番号Ｉ−３０７３でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマによって分泌される抗ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）モノクロナール抗体でコーティングされた磁気染色ビーズおよびアッセイバッファを反応容器において組合せる。次いで、１１分間のインキュベーションおよび洗浄サイクルの後、フィコエリトリン（ＰＥ）にコンジュゲートされた登録番号Ｉ−３７４６でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマにより分泌される抗ヒトＢＮＰモノクロナール抗体を添加し、２分間インキュベーションを行なった。過剰なコンジュゲート物の除去後、ビーズ混合物を検出器に通し、それによって、染色されたビーズおよびＰＥの蛍光によりビーズ上に捕捉された抗原の量を同定する。６つの別個のキャリブレータの組を用いた較正の後、３つのレベルの品質コントロールおよび患者サンプル結果をｐｇ／ｍＬで表わす。
【００５９】
２つの品質コントロールビーズも各サンプルで試験を行なって、全体のシステムの統合性を向上させる。
【００６０】
Ｈ−ＦＡＢＰレベルを、Hycult biotechnologyからのヒトＨ−ＦＡＢＰ ＥＬＩＳＡキットを製造業者の指示に従って用いて測定した。
【００６１】
ｃ．統計学的分析
患者の状態に従ったバイオマーカの分布をボックスプロット表現によって表現した、というのも、それは、数値データの群を、５つの数による概要（最小観測値、下位四分位数（Ｑ１）、中央値（Ｑ２）、上位四分位数（Ｑ３）、および最大観測値）を介して図形的に表現する便利な方法であるからである。
【００６２】
データは、Ｂｏｘ−Ｃｏｘ法を用いて、ガウス分布に従い、統計学的分析を可能にするよう、正規化されている(Box, G. E. P. and Cox, D. R. (1964) An analysis of transformations. JRSS B 26, 211-246)。
【００６３】
対照サンプルと卒中サンプルとの間における微分解析を、以下の統計学的検定：ノンパラメトリックである（統計学的分布の仮定を必要とせず、スチューデントのt検定の代替物となり得る）the Wilcoxon Rank Sum Test (Wilcoxon, F. (1945). Individual comparisons by ranking methods. Biometrics, 1, 80-83) 、および恐らくは不等分散を有する２つのサンプルを用いて使用することに対して意図されるスチューデントのt検定の適合物であるウェルチの検定を用いて行なった。解析は、さらに、Benjamini/Hochber法(Benjamini and Y. Hochberg (1995). Controlling the False Discovery Rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J. R. Statist. Soc. B. Vol. 57: 289-300)によるこれらの検定の調整（補正）版も行なった。
【００６４】
マーカの診断性能は２つの指標：感度（疾患母集団を検出する能力）および特異度（対照母集団を検出する能力）によって特徴付けられた。診断検査の結果は、さらに、ＲＯＣ（受信者動作特性）分析の曲線下面積（ＡＵＣ）を判断することによって特徴付けられ得る。ＲＯＣ曲線は、さまざまな濃度に対する検査の感度（Ｓｅ）と特異度（Ｓｐ）との間における相反関係のグラフによる視覚化である(M. H. Zweig and G. Campbell (1993). "Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine". Clinical chemistry 39 (8): 561-57)。
【００６５】
２．結果
ａ．ボックスプロット表現によるバイオマーカの分布
図１および図２は、それぞれ、卒中母集団および対照母集団におけるＨ−ＦＡＢＰ濃度およびｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）濃度の分布を表わす。
【００６６】
表１：対照母集団および卒中母集団におけるＨ−ＦＡＢＰレベルおよびｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）レベル
【００６７】
【表１】
【００６８】
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）マーカは、対照サンプルにおいてよりも卒中サンプルにおいてより高い濃度レベルを示す。一方、測定されたＨ−ＦＡＢＰ濃度は、卒中患者サンプルと対照サンプルとの間において有意な差異を全く示さない。
【００６９】
ｂ）微分解析
卒中サンプルと対照サンプルとの間におけるＨ−ＦＡＢＰレベルおよびｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）レベルにおける差異の統計学的有意性を判断した：
表２：Ｈ−ＦＡＢＰマーカおよびｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）マーカに関して対照母集団および卒中母集団から測定された濃度間における微分解析
【００７０】
【表２】
【００７１】
卒中サンプルと対照サンプルとの間における濃度間の差異は、双方のマーカ（ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）およびＨ−ＦＡＢＰ）について統計学的に有意であったが、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）は、非常に低いｐ値（１０-4）を伴う特に興味深い特性を呈している（表２）。
【００７２】
ｃ）ＲＯＣ曲線分析
臨床状態に対する受信動作特性（ＲＯＣ）分析に基づき、および表３にまとめられるように、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）に対する曲線下領域は、９０％の感度、８５％の特異度で、卒中について診断された患者を健康な被験者と区別することに成功している。さらに、この識別能力は、虚血性卒中患者および出血性卒中患者の双方に対して、それぞれ、０．９３６および０．９３５のＡＵＣで、非常に高い。
【００７３】
表３：対照被験者と比較した場合の卒中患者に関するｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）についての受信動作特性分析データ
【００７４】
【表３】
【００７５】
下の表４に示されるように、Ｈ−ＦＡＢＰマーカは、５７％の感度、５４．７％の特異度で、卒中診断に対する低い識別能力を有する。
【００７６】
表４：対照被験者と比較した場合の卒中患者についてのＨ−ＦＡＢＰに対する受信動作特性分析データ
【００７７】
【表４】
【実施例２】
【００７８】
１．方法
ａ．サンプル
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のレベルを、発症後３時間以内に卒中が生じた個体から得られた２３の血清サンプル（５つの出血性卒中サンプル（ＨＭ）および１８の虚血性卒中サンプル（ＩＭ））、ＴＩＡが臨床診断された個体から得られた７つの血清サンプル、ならびに明らかに健康な個体からの９４の対照血清サンプルにおいて測定した。
【００７９】
ｂ．マーカレベル測定
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）レベルを実施例１に示されるように測定した。
【００８０】
ｃ．統計学的分析
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）レベル分布のボックスプロット表現およびＲＯＣ分析を実施例１に示されるように行なった。
【００８１】
２．結果
ａ）ボックスプロット表現によるバイオマーカの分布
図３は、卒中母集団、ＴＩＡ母集団および対照母集団におけるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）濃度の分布を表現する。
【００８２】
表５：対照母集団、ＴＩＡ母集団および卒中母集団におけるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）分布値
【００８３】
【表５】
【００８４】
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）マーカは、対照サンプルにおいてよりも卒中患者サンプルまたはＴＩＡ患者サンプルにおいてより高い濃度レベルを示す。
【００８５】
ｂ）ＲＯＣ曲線分析
臨床状態に対する受信動作特性（ＲＯＣ）分析に基づき、および表６にまとめられるように、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）に対する曲線下領域は、９１％の感度、８４％の特異度で、卒中について診断された患者を健康な被験者と区別することに成功している。
【００８６】
表６：対照被験者と比較した場合の卒中患者に関するｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）についての受信動作特性分析データ
【００８７】
【表６】
【００８８】
実施例１において立証された、卒中患者を診断するためのｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）の能力が、かくして、これらの新たな病的母集団および健康な母集団において確認される。
【実施例３】
【００８９】
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）が有する識別能力を、さらに、同一の母集団において、先行技術の２つの基準卒中マーカ（Ｓ−１００ｂおよびＮＳＥ）のそれと比較した。
【００９０】
１．方法
ａ．サンプル
マーカのレベルを、発症から３時間以内に卒中が生じた個体から得られた４１の血漿サンプル、および明らかに健康な個体からの対照血漿サンプルにおいて測定した。
【００９１】
ｂ．マーカレベル測定
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）レベルを実施例１に示されるように測定した。
【００９２】
ＮＳＥレベルを、NanogenからのNexus DX（商標） Neuron Specific Enolase (NSE) Testキットを用いて、製造業者の指示に従い測定した。
【００９３】
Ｓ−１００ｂレベルを、NanogenからのNexus DX（商標） S-100 ELISA Testキットを用いて、製造業者の指示に従い測定した。
【００９４】
ｃ．統計学的分析
統計学的分析を実施例１に示されるように行なった。
【００９５】
２．結果
ａ）ボックスプロット表現によるバイオマーカの分布
図４、図５および図６は、それぞれ卒中母集団および対照母集団におけるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）濃度、Ｓ−１００ｂ濃度およびＮＳＥ濃度の分布を表現する。
【００９６】
表７：対照母集団および卒中母集団におけるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）分布値、Ｓ１００分布値およびＮＳＥ分布値
【００９７】
【表７】
【００９８】
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）マーカおよびＮＳＥマーカは、対照サンプルにおいてよりも卒中サンプルにおいてより高い濃度レベルを示す。双方の母集団間における最もよい識別は、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）マーカで観察される。一方、測定されたＳ−１００濃度は卒中患者サンプルと対照サンプルとの間において有意差を全く示さない。
【００９９】
ｂ）微分解析
卒中サンプルおよび対照サンプルにおけるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）レベル、ＮＳＥレベルおよびＳ−１００レベルにおける差の統計学的有意性を判断した：
表８：ＮＳＥマーカ、Ｓ−１００マーカおよびｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）マーカに関して対照母集団および卒中母集団から測定された濃度間における微分解析
【０１００】
【表８】
【０１０１】
ＮＳＥおよびｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）は、非常に低いｐ値（ｐ＜０．００１）を伴って、統計学的に有意である。
【０１０２】
ｃ）ＲＯＣ曲線分析
臨床状態に対する受信動作特性（ＲＯＣ）分析に基づき、および表９にまとめられるように、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）に対する曲線下領域は、９５％の感度、９５％の特異度および０．９７４のＡＵＣで、卒中について診断された患者を健康な被験者と区別することに成功している。
【０１０３】
表９：対照被験者と比較した場合の卒中患者に関する、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）、ＮＳＥおよびＳ−１００についての受信動作特性分析データ
【０１０４】
【表９】
【０１０５】
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）は、卒中患者を対照被験者から区別することにおいて、ＮＳＥおよびＳ−１００ｂにより提供される識別能力を超える高い識別能力を呈することがわかる。
【実施例４】
【０１０６】
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）の診断能力を、さらに、虚血性卒中患者において、実施例１に記載されるようにＢｉｏＰｌｅｘ（商標）２２００ ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）アッセイを用いて評価した。
【０１０７】
ａ）サンプル
−卒中発症の３時間以内に救急部に受入れられた虚血性卒中患者からの３２のクエン酸塩添加血漿サンプルを検査した。卒中重症度は米国立衛生研究所の脳卒中スケール（ＮＩＨＳＳ）で評価した。
【０１０８】
−卒中母集団からの患者と性別および年齢を適合させた明らかに健康な血液提供者からの４２のクエン酸塩添加血漿サンプルを検査した。
【０１０９】
すべてのクエン酸塩添加血漿サンプルを−８０℃で保存した。分析に先立って、サンプルを解凍し、３０００ｇで１５分間４℃で遠心分離した。
【０１１０】
ｂ）結果
対照母集団および虚血性卒中母集団に対するｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）値の分布を表１０に示す。ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のレベルは、対照群と比較して虚血性卒中群において有意に高かった（Mann-Whitney、ｐ＜０．０００１）。これらの結果により、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）はしたがって虚血性卒中の早期診断に対して有用な血漿バイオマーカであることが確認される。
【０１１１】
表１０：虚血性卒中のクエン酸塩添加血漿サンプルおよび対照のクエン酸塩添加血漿サンプルにおけるｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）濃度（最小値、第一四分位数、中央値、第三四分位数および最大値）
【０１１２】
【表１０】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における卒中および一過性の虚血性発作（ＴＩＡ）のインビトロ診断のための方法であって：
（ａ）前記個体の生体サンプルにおいてｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベルを測定するステップと；
（ｂ）前記測定されたレベルをカットオフ値と比較するステップと；
（ｃ）それから、卒中またはＴＩＡが前記個体に生じたかどうかを判断するステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントはＦＧＲＫＭＤＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントはＢＮＰ（３２）の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記卒中は、虚血性卒中、出血性卒中、および一過性の虚血性発作（ＴＩＡ）からなる群から選択される、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）は前記個体において卒中を示す少なくとも１つの症状の発症後６時間以内に実施される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベルはイムノアッセイを用いて測定される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記イムノアッセイは、ＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むエピトープを標的とする抗体を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体は、ブダペスト条約の下２００５年４月２９日に登録番号Ｉ−３０７３でＣＮＣＭ（フランス、パリ）に寄託されたハイブリドーマによって分泌される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記イムノアッセイは、ＦＧＲＫＭＤＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を含むエピトープを標的とする抗体を含む、請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体は、ブダペスト条約の下２００７年４月１３日に登録番号Ｉ−３７４６でＣＮＣＭ（フランス、パリ）に寄託されたハイブリドーマによって分泌される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記カットオフ値は少なくとも１ｐｇ／ｍｌである、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
（ａ’）個体の生体サンプルにおいてｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベルを測定するステップと、
（ｂ’）前記個体の生体サンプルにおいて少なくとも１つのさらなる卒中マーカのレベルを測定するステップと、
（ｃ’）ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベルおよび前記少なくとも１つのさらなる卒中マーカのレベルを、１つまたはいくつかのカットオフ値と比較するステップと、
（ｄ’）それから、卒中またはＴＩＡが前記個体に生じたか否かを判断するステップとを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくともさらなる卒中マーカのレベルは、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベルが測定される生体サンプルと同じサンプルにおいて測定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体サンプルは、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、脳脊髄液サンプル、尿サンプルおよび唾液サンプルからなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの心血管疾患のマーカのレベルを測定することをさらに含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの心血管疾患のマーカはＣＲＰおよびｃＴｎＩからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
卒中またはＴＩＡのインビトロ診断のための、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントの使用。
【請求項１】
個体における卒中および一過性の虚血性発作（ＴＩＡ）のインビトロ診断のための方法であって：
（ａ）前記個体の生体サンプルにおいてｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベルを測定するステップと；
（ｂ）前記測定されたレベルをカットオフ値と比較するステップと；
（ｃ）それから、卒中またはＴＩＡが前記個体に生じたかどうかを判断するステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントはＦＧＲＫＭＤＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントはＢＮＰ（３２）の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記卒中は、虚血性卒中、出血性卒中、および一過性の虚血性発作（ＴＩＡ）からなる群から選択される、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）は前記個体において卒中を示す少なくとも１つの症状の発症後６時間以内に実施される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベルはイムノアッセイを用いて測定される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記イムノアッセイは、ＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むエピトープを標的とする抗体を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体は、ブダペスト条約の下２００５年４月２９日に登録番号Ｉ−３０７３でＣＮＣＭ（フランス、パリ）に寄託されたハイブリドーマによって分泌される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記イムノアッセイは、ＦＧＲＫＭＤＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を含むエピトープを標的とする抗体を含む、請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体は、ブダペスト条約の下２００７年４月１３日に登録番号Ｉ−３７４６でＣＮＣＭ（フランス、パリ）に寄託されたハイブリドーマによって分泌される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記カットオフ値は少なくとも１ｐｇ／ｍｌである、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
（ａ’）個体の生体サンプルにおいてｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベルを測定するステップと、
（ｂ’）前記個体の生体サンプルにおいて少なくとも１つのさらなる卒中マーカのレベルを測定するステップと、
（ｃ’）ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベルおよび前記少なくとも１つのさらなる卒中マーカのレベルを、１つまたはいくつかのカットオフ値と比較するステップと、
（ｄ’）それから、卒中またはＴＩＡが前記個体に生じたか否かを判断するステップとを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくともさらなる卒中マーカのレベルは、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントのレベルが測定される生体サンプルと同じサンプルにおいて測定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体サンプルは、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、脳脊髄液サンプル、尿サンプルおよび唾液サンプルからなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの心血管疾患のマーカのレベルを測定することをさらに含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの心血管疾患のマーカはＣＲＰおよびｃＴｎＩからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
卒中またはＴＩＡのインビトロ診断のための、ｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）またはＲＡＰＲＳＰ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含むｐｒｏＢＮＰ（１−１０８）のフラグメントの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１３−５０１２０９（Ｐ２０１３−５０１２０９Ａ）
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２０５２９（Ｐ２０１１−５２０５２９）
【出願日】平成２１年７月３１日（２００９．７．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５９９８２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１２８３４
【国際公開日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【出願人】（５０６２１５５８２）
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯ−ＲＡＤ ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮＳ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月３１日（２００９．７．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５９９８２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１２８３４
【国際公開日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【出願人】（５０６２１５５８２）
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯ−ＲＡＤ ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮＳ
【Ｆターム（参考）】
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