土壌から抽出したＲＮＡの精製法
【課題】夾雑物を限りなく除去するＲＮＡ精製法を開発する。
【解決手段】セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）をＲＮＡ抽出液へ添加してＲＮＡ溶液を調製する第１工程、およびポリエチレングリコール存在下にて該ＲＮＡ溶液からＲＮＡを回収する第２工程を包含するＲＮＡ精製法を提供する。
【解決手段】セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）をＲＮＡ抽出液へ添加してＲＮＡ溶液を調製する第１工程、およびポリエチレングリコール存在下にて該ＲＮＡ溶液からＲＮＡを回収する第２工程を包含するＲＮＡ精製法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、土壌中の微生物に関する情報を簡便に得る技術に関するものであり、より詳細には、土壌から抽出したＲＮＡを高度に精製する技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
植物内における本来の物質動態を知るためには、植物におけるイメージングを行う際の環境がその植物にとっての本来の生育環境に近似していることが重要である。植物にとっての本来の生育環境を知るためには、植物が生育する土壌についての情報を解析する、優れた技術が不可欠である。植物の生育に大きな影響を与える要因としては、土壌のｐＨ、無機塩類濃度といった土壌の理化学性に加え、植物と共生、共存の関係にある土壌の微生物の存在が挙げられる。
【０００３】
土壌から微生物ＤＮＡを検出または分離する技術は、これまでにいくつも報告されている。土壌から核酸を抽出するための既知の方法は、界面活性剤、リン酸、キレート剤などを含む抽出液で微生物菌体を破壊する。この抽出液は、土壌から腐植物質（例えば、腐植酸など）も同時に抽出する。この腐植物質が少しでも混入すると、引き続く分子生物学的な解析に弊害が生じる（例えば、Ｔａｑ、制限酵素などの酵素活性を阻害する）。よって、酵素を用いる解析（例えば、ＲＴ−ＰＣＲなど）の前に、十分な精製作業を行う必要がある。しかし、このような精製操作は非常に煩雑であり、時間もコストもかかる。
【０００４】
本発明者らは、高塩濃度下にて抽出した核酸抽出液に、高分子ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加するとともにその溶液のｐＨを上昇させることによって、ＤＮＡだけを沈殿させる土壌ＤＮＡ回収法を開発した（特許文献１参照）。
【特許文献１】ＷＯ２００５／０７３３７７（国際公開日：２００５（平成１７）年８月１１日）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、特許文献１は、高塩濃度下にて抽出した核酸抽出液を用いる技術であり、特許文献１に記載されるような高い塩濃度（２Ｍ〜）における精製処理ではＲＮＡは沈殿してしまう。このような技術はあくまでもＤＮＡ精製法であり、この精製法をＲＮＡ精製に採用することはできない。また、ＲＮＡを除去することが当該分野においてよく知られているＰＥＧが用いられた核酸精製技術はあくまでもＤＮＡ精製法でありＲＮＡ精製に適用されることはない。ＲＮＡはＤＮＡよりもはるかに分解されやすいため、より慎重かつ簡便なＲＮＡ精製法が開発される必要がある。
【０００６】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、夾雑物を限りなく除去するＲＮＡ法を開発することであり、具体的には、土壌から抽出したＲＮＡを、土壌からの腐植物質を混入させることなく、高度にかつ簡便に精製する技術を実現することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係るＲＮＡ精製法は、陽イオン性界面活性剤をＲＮＡ抽出液へ添加してＲＮＡ溶液を調製する第１工程、およびＰＥＧ存在下にて該ＲＮＡ溶液からＲＮＡを回収する第２工程を包含することを特徴としている。なお、上記陽イオン性界面活性剤はセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）であることが好ましい。
【０００８】
本発明に係るＲＮＡ精製法において、ＣＴＡＢの濃度は２％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましく、３％（ｗ／ｖ）以上であることがさらに好ましい。また、本発明に係るＲＮＡ精製法において、ＰＥＧの濃度は５（ｗ／ｖ）以上であることが好ましく、７％（ｗ／ｖ）〜１５％（ｗ／ｖ）であることがより好ましい。
【０００９】
第１工程は、０．５〜１．２５Ｍの範囲内の塩存在下にて行われることが好ましく、１．０〜１．２５Ｍの範囲内の塩存在下にて行われることがより好ましく、１．０ＭのＮａ＋存在下にて行われることがさらに好ましい。
【００１０】
本発明に係るＲＮＡ精製法において、第１工程は、ｐＨ５．０〜６．５の範囲内で行われることが好ましく、ｐＨ５．０〜５．５の範囲内で行われることがより好ましい。
【００１１】
本発明に係るＲＮＡ精製法において、第２工程は、ｐＨ８．０以上にて行われることが好ましく、さらなる塩を添加することなく行われることが好ましい。
【００１２】
本発明に係るＲＮＡ精製法において、上記ＲＮＡ抽出液は、ＳＤＳ抽出またはグアニジンチオシアネート抽出によって得られたものであってもよい。
【００１３】
本発明に係るＲＮＡ精製法は、回収したＲＮＡを限外濾過に供する工程をさらに包含してもよく、この場合、限外濾過はＮＭＷＬ５０，０００以上を分画し得る濾過であることが好ましい。
【００１４】
本発明に係るＲＮＡ精製法は、土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥および糞便からなる群より選択される少なくとも１つに由来するサンプルからのＲＮＡ抽出液であっても適用可能である。
【００１５】
本発明に係るＲＮＡ精製キットは、陽イオン性界面活性剤およびＰＥＧを備えていることを特徴としている。上記陽イオン性界面活性剤はＣＴＡＢであることが好ましい。
【００１６】
本発明に係るＲＮＡ精製キットは、緩衝液または緩衝化能を有する塩を備えていることが好ましい。上記緩衝液は、弱酸性環境を提供するために必要な緩衝液およびアルカリ性環境を提供するために必要な緩衝液であり得、上記塩は、このようなｐＨ環境を提供する緩衝化能を有していればよい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係るＲＮＡ精製法を用いれば、土壌由来の腐植物質のような強固な夾雑物がＲＮＡ抽出液中に存在してもＲＮＡを首尾よく分離／精製し得る。すなわち、本発明を用いれば、土壌からの腐植物質を混入させることなく、高度にかつ簡便にＲＮＡを精製することができるので、植物が生育する土壌についての微生物の情報を解析することができる。このことは、土壌微生物の解析のみならず、本来の生育環境における養分吸収、植物体内での物質挙動を調査する際の指標として非常に有効である。また、ＡＴＡ（aurintricarboxylic acid）等のＲＮａｓｅ阻害剤がＲＮＡ抽出液中に存在している場合であっても、本発明を用いれば、このような物質を首尾よく除去し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
遺伝子の解析には、ＰＣＲ反応、クローニング、シークエンシング、ハイブリダイゼーション、遺伝子発現試験などの技術が用いられる。特に、ＰＣＲ反応は、多くの遺伝子解析にとって重要で欠くことができない基本技術であり、遺伝情報に基づく微生物群集構造解析にとっても必須の操作である。
【００１９】
土壌には、微生物または植物およびこれらの細胞膜または細胞壁、タンパク質、腐植物質や重金属などが含まれている。このような土壌からの核酸抽出液には上記物質が夾雑物として含まれているので、解析のためにはこれらの夾雑物をできるだけ取り除くべきである。特に、腐植物質は、精製した核酸サンプルに夾雑していると、極めて微量であっても酵素反応（例えば、ＰＣＲ反応）を強力に阻害する。よって、腐植物質を核酸抽出液からできるだけ取り除くことが重要である。
【００２０】
腐植物質は、植物の葉／茎が微生物により分解されてできた高分子の有機成分であり、一般的には、土壌からＮａＯＨなどのアルカリ溶液により抽出される画分である。このように、腐植物質は、単なるアルカリ抽出画分であるので、単一の化合物というよりむしろ種々の高分子を含んだ不均一な混合物である。なお、本明細書中において、土壌由来の腐植物質を例に挙げて説明するが、本発明を実施するに際して、腐植物質は、土壌由来のものに限定されず、堆肥、水系堆積物、活性汚泥、糞便などに由来するものであってもよい。
【００２１】
土壌由来の腐植物質は茶色もしくは黒色の物質である。有機物を多く含む土壌から核酸を抽出する場合、通常多量の腐植物質が核酸とともに抽出されるので、抽出液は暗褐色を呈している。
【００２２】
ＤＮＡと腐植物質との分離には、両者の分子量の差が利用されており、多くのＤＮＡ精製法がこの原理（サイズ分画）に基づいている。また、カオトロピック効果によりＤＮＡがガラス表面に吸着しやすくなることを利用する技術や磁性ビーズを利用した精製法も知られている。さらに、ＣＴＡＢやポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）なども腐植物質の除去剤として使用されている。これらの物質を用いることによって土壌由来のＤＮＡサンプルへの腐植物質の混入は軽減されているものの、完全な除去にまでは至っていない。特に、ＰＶＰＰはＤＮＡの収量が下げるなどの問題を有していることも知られている（特許文献１参照）。
【００２３】
特許文献１に記載されるように、土壌ＤＮＡ抽出液からのおおまかな腐植物質除去のために、ＣＴＡＢ、ＰＶＰＰなどのような腐植物質除去剤が使用されることがある。本発明者らは、公知の腐植物質の除去法を用いた後にサイズ分画によるＲＮＡ精製を試みたが、腐植物質の除去が不十分なために目詰まりが生じてしまった。しかし、本発明者らは、ＣＴＡＢなどの陽イオン性界面活性剤を特定の条件下で用いれば、従来ＲＮＡ精製において採用され得ないＰＥＧを組み合わせることが可能になるとともに、引き続く限外濾過もスムーズに行い得る程度または限外濾過を行う必要がない程度に高度なＲＮＡ精製が高収率にて達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２４】
本発明は、ＲＮＡを高度に分離／精製し得るＲＮＡ精製法を提供する。本発明に係るＲＮＡ精製法を用いれば、腐植物質のような除去困難な夾雑物が存在してもＲＮＡを高度に分離／精製し得る。また、腐植物質のような除去困難な夾雑物が存在してもＲＮＡを高度に分離／精製し得る本発明は、土壌から抽出したＲＮＡに限らず、あらゆるＲＮＡ抽出物に適用可能である。
【００２５】
本発明に係るＲＮＡ精製法は、陽イオン性界面活性剤をＲＮＡ抽出液へ添加してＲＮＡ溶液を調製する第１工程、およびポリエチレングリコール存在下にて該ＲＮＡ溶液からＲＮＡを回収する第２工程を包含することを特徴としている。なお、上記陽イオン性界面活性剤はＣＴＡＢであることが好ましく、その濃度は２％（ｗ／ｖ）以上が好ましい。また、ＰＥＧの濃度は５（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。
【００２６】
第１工程では、ＲＮＡ抽出液にＣＴＡＢを添加してインキュベートした後にクロロホルムによる除タンパク操作を行う。第１工程ではＣＴＡＢ以外に塩を共存させることが好ましい。この場合、抽出液に１．０Ｍ以上の１価のカチオンを添加し得る塩が好ましく、例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびリン酸アンモニウムが挙げられる。本発明の第１工程において用いられる塩は、ＮａＣｌまたは酢酸ナトリウムが好ましい。
【００２７】
なお、塩濃度が１．２５Ｍを超えるとＲＮＡの塩析が生じ、塩濃度が低すぎるとＣＴＡＢと結合するので除タンパク時にＲＮＡが消失することから、第１工程において用いられる塩濃度は０．５〜１．２５Ｍの範囲内であることが好ましく、１．０〜１．２５Ｍの範囲内であることがより好ましい。最も好ましくは、第１工程は１．０ＭのＮａ＋存在下にて行われ得る。
【００２８】
また、ＣＴＡＢによる腐植物質の除去効率はｐＨが低いほどよいが、ｐＨが低すぎるとＲＮＡの分解および塩析が生じ、特にｐＨが５を下回るとＲＮＡ回収効率が著しく低減することから、第１工程が行われる反応のｐＨは５．０以上が好ましく、５．０〜６．５の範囲内であることがより好ましく、５．０〜５．５の範囲内であることがさらに好ましい。このようなｐＨ環境を提供するために、第１工程において用いられる塩は酢酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウム／ＮａＣｌが好ましい。
【００２９】
このような条件下において腐植物質を首尾よく除去しかつＲＮＡ回収効率を高めるためには、添加するＣＴＡＢは２．５％（ｗ／ｖ）以上がより好ましく、３．０％（ｗ／ｖ）以上がなお好ましく、３．３％（ｗ／ｖ）以上がさらに好ましい。
【００３０】
このような第１工程を経て調製されたＲＮＡ溶液からＲＮＡを回収する第２工程は、ＰＥＧが用いられることを特徴としている。特許文献１に記載されているように、ＰＥＧには腐植物質を沈殿させにくく、腐植物質の混入を低減させるという効果があるが、それ以上に、ＲＮＡを除去してＤＮＡの回収率を高めることが、当該分野においてよく知られている。よって、ＲＮＡの回収／精製にＰＥＧが用いられることはない。
【００３１】
本発明に係るＲＮＡ精製法において、第２工程は、ｐＨ７．０以上にて行われることが好ましく、このｐＨ環境を提供するに必要な塩または緩衝液以外にはさらなる塩（例えば、ＬｉＣｌ）を添加することなく行われることが好ましい。通常、ＲＮＡを遠心分離によって回収する（沈殿させる）場合、２−プロパノールまたはＬｉＣｌがよく用いられる。しかし、本発明の実施において、ＲＮＡ溶液中には０．５Ｍ以上の塩が用いられているので２−プロパノールが首尾よく混合しない。また、後述する実施例において示されるように、アルカリ環境下でＰＥＧを使用する第２工程ではＬｉＣｌを用いない方がＲＮＡ回収効率は非常に優れている。この場合、用いるＰＥＧの濃度は７％（ｗ／ｖ）〜１５％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、１０％（ｗ／ｖ）であることがより好ましい。
【００３２】
このような第１工程および第２工程を包含するＲＮＡ精製法を用いれば、土壌由来の腐植物質のような強固な夾雑物がＲＮＡ抽出液中に存在している場合であってもＲＮＡを首尾よく分離／精製し得る。すなわち、本発明を用いれば、土壌からの腐植物質を混入させることなく、高度にかつ簡便にＲＮＡを精製することができる。腐植物質のような強固で除去困難な夾雑物が存在してもＲＮＡを高度に分離／精製し得る本発明は、土壌から抽出したＲＮＡに限らず、あらゆるＲＮＡ抽出物に適用可能であり、本発明に係るＲＮＡ精製法に用いられるＲＮＡ抽出液は、ＳＤＳ抽出またはグアニジンチオシアネート抽出、あるいは当該分野において公知の他の抽出技術によって得られたものであってもよい。
【００３３】
本発明はさらに、上述したＲＮＡ精製法を行うためのＲＮＡ精製キットを提供する。本発明に係るＲＮＡ精製キットを用いれば、腐植物質のような強固で除去困難な夾雑物が存在してもＲＮＡを高度に分離／精製し得る。また、腐植物質のような強固で除去困難な夾雑物が存在してもＲＮＡを高度に分離／精製し得る本発明は、土壌から抽出したＲＮＡに限らず、あらゆるＲＮＡ抽出物に適用可能である。
【００３４】
本発明に係るＲＮＡ精製キットは、上述したＲＮＡ精製法を実施するに必要な試薬または器具が備えられていればよい。本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは試薬または器具の各々を使用するための指示書が備えられている。本明細書中にてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に試薬などが内包されている状態が意図される。「指示書」は、紙またはその他の媒体に印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に記録されていてもよい。
【００３５】
本発明に係るＲＮＡ精製キットは、陽イオン性界面活性剤およびＰＥＧを備えていることを特徴とする。ここで、上記陽イオン性界面活性剤はＣＴＡＢであることが好ましい。
【００３６】
上述したように、本発明に係るＲＮＡ精製法において、ＣＴＡＢの濃度は２％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。よって、本発明に係るＲＮＡ精製キットに備えられているＣＴＡＢは、２％（ｗ／ｖ）以上の濃度を提供し得る濃度であればよい。また、本発明に係るＲＮＡ精製法において、ＰＥＧの濃度は５％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。よって、本発明に係るＲＮＡ精製キットに備えられているＰＥＧは、５％（ｗ／ｖ）以上の濃度を提供し得る濃度であればよい。さらに、本発明に係るＲＮＡ精製キットは、上記ＣＴＡＢおよびＰＥＧを必要な濃度に希釈するための溶液（例えば、蒸留水）がさらに備えられていてもよい。
【００３７】
上述したように、本発明を実施するに際して、陽イオン性界面活性剤は弱酸性環境下にて用いられることが好ましく、ＰＥＧはアルカリ性環境下にて用いられることが好ましい。このような観点から、本発明に係るＲＮＡ精製キットは、緩衝液または緩衝化能を有する塩をさらに備えていることが好ましい。弱酸性環境を提供するために必要な緩衝液は当該分野において周知である（例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩酸緩衝液又は硫酸緩衝液）が、抽出液に１．０Ｍ以上の１価のカチオンを添加する観点から、用いられるべき緩衝化剤（塩）は酢酸ナトリウムが最も好ましく、ＮａＣｌをさらに備えていてもよい。また、アルカリ性環境を提供するために必要な緩衝液または緩衝化剤（塩）もまた、当該分野において周知であるが、ｐＨ環境を提供するに必要な塩以外にさらなる塩を添加することなくＲＮＡ回収が行われるべきという観点から、Ｔｒｉｓが好ましい。本発明に係るＲＮＡ精製キットにおいて、上記緩衝液または緩衝化剤（塩）は上述した第１工程および第２工程を実施するに適切な態様で備えられていればよく、特定の濃度の溶液形態で備えられていれば迅速に混合溶液を調製し得るので即時使用に好ましい。
【００３８】
本発明に係るＲＮＡ精製キットは、精製を実行するに必要な器具をさらに備えていてもよい。また、精製すべきＲＮＡを抽出するために必要な試薬および器具をさらに備えていてもよい。
【００３９】
以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００４０】
土壌から核酸を抽出した場合、その抽出液には、微生物または植物などに由来する細胞膜または細胞壁の破砕物、界面活性剤によって変性したタンパク質、あるいは土壌自体に蓄積されていた土壌有機物（例えば、腐植物質）または重金属などの夾雑物が含まれている。抽出した核酸をその後の解析に供するためには、これらの夾雑物を除去する必要がある。ＲＮＡを遺伝子解析の対象とする場合、ＲＮＡを鋳型として一本鎖のＤＮＡを合成するＲＴ反応またはＲＴ−ＰＣＲ反応を行う必要がある。しかし、このような酵素反応は、土壌由来の夾雑物によって強力に阻害されることが知られている。特に腐植物質は、ナノグラム単位の微量な混入であってもＰＣＲ反応をはじめとする酵素反応を強く阻害することが知られている。よって、土壌から抽出した核酸を用いて遺伝子解析を行う場合は、抽出した核酸溶液からできるだけ腐植物質を除去する必要があり、腐植物質と核酸とを分離するための優れた精製技術が求められている。
【００４１】
本実施例では、土壌からの腐植物質抽出液とＥ．ｃｏｌｉからのＲＮＡ抽出液との混合液を用いて、腐植物質の除去試験を行った。具体的には、以下に示す腐植物質抽出液２．５ｍｌ（必要に応じて２倍量の５ｍｌ）を、以下に示すＥ．ｃｏｌｉからのＲＮＡ抽出液５０ｍｌに添加した混合液を用いた。
【００４２】
〔腐植物質抽出液の調製〕
以下の手順に従って、図２１に示す３種類の土壌（腐植物質を多量に含む火山灰土壌）から腐植物質を抽出し、次いで濃縮して腐植物質抽出液を得た。
【００４３】
２．５ｍｌの２００ｍＭ ＥＤＴＡ／２００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．６）に土壌１ｇを添加して１時間振とうした。次いで、この溶液を６５℃で一昼夜インキュベートし、８０００×ｇにて１０分間遠心分離した。得られた上清に０．６等量の２−プロパノールを添加し、８０００×ｇにて１０分間遠心分離して腐植物質の沈殿を回収した。回収した沈殿を乾燥した後、４Ｍグアニジンチオシアネート溶液を添加し、室温で３０分間振とうした。次いで、この溶液に等量のフェノール：クロロホルム（１：１）溶液を添加し、振とうした後に、８０００×ｇにて１０分間遠心分離した。この除タンパク処理によって土壌由来のＲｎａｓｅが除去される。回収した上清に等量の２−プロパノールを添加し、８０００×ｇにて１０分間遠心分離して暗褐色の腐植物質を沈殿として回収した。回収した沈殿を乾燥し、次いでＴＥに溶解して腐植物質抽出液を得た。なお、実験には、１５ｇの乾燥土壌から腐植物質抽出液を２ｍｌ調製した。
【００４４】
〔ＲＮＡ抽出液の調製〕
大腸菌（ＤＨ−５α）を、ＬＢ培地（１Ｌ当たり１０ｇ ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，１０ｇ ＮａＣｌ）中で一晩培養し、この培養液を８０００×ｇにて５分間遠心分離し、菌体を沈殿として回収した。１Ｌの培養液から集菌したＥ．ｃｏｌｉを５ｍｌの１％ＮａＣｌに懸濁した。このＥ．ｃｏｌｉ菌体液５０μｌを１サンプル分として試験に使用した。このＥ．ｃｏｌｉ菌体液に、ＲＮＡ抽出用溶液（ＳＤＳ溶液（２％ ＳＤＳ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））またはグアニジンチオシアネート溶液（４Ｍグアニジンチオシアネート，２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０），１％ Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩））を添加し、次いで１０分間の振とうした。この溶液を８０００×ｇにて１０分間遠心分離し、上清をＲＮＡ抽出液として得た。
【００４５】
〔試薬の調製〕
cetyltrimethylammmonium bromide (sigma-aldrich)をミリＱ水に溶解して、１０％ＣＴＡＢ溶液を調製した。分子量8000および58000のpolyvinylpyrorridoneをミリＱ水に溶解、10％ポリビニルピロリドン溶液を調製した。４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを、酢酸を用いてｐＨ４．０，４．５，５．０または５．５に調整し、オートクレーブ処理して酢酸ナトリウム溶液を調製した。５Ｍ ＮａＣｌ溶液および１０Ｍ ＬｉＣｌ溶液を調製した。polyethylene glycol MW 8000 (sigma-aldrich)をミリＱ水に溶解して、オートクレーブ処理して２０％ＰＥＧ溶液を調製した。
【００４６】
〔ＲＮＡ精製工程〕
ＲＮＡ抽出液５００μｌに対し、１０％ＣＴＡＢ溶液、１０％ポリビニルピロリドン溶液（ＭＷ ８０００）、１０％ポリビニルピロリドン溶液（ＭＷ ５８０００）、５Ｍ ＮａＣｌ、４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨ４．０，４．５，５．０または５．５）を所定の濃度になるように添加した。この溶液をＶｏｒｔａｘで３０秒間攪拌した後、６５℃で１０分間インキュベートした。この溶液を室温に戻し、次いで等量のクロロホルムを添加した。この溶液をｖｏｒｔａｘで３０秒間攪拌し、１２，０００×ｇにて１５分間遠心分離し、上清を回収した。この精製工程によって、腐植物質の除去および除タンパクを行い得る。
【００４７】
〔ＲＮＡ回収工程〕
(I)ＰＥＧを使用する回収
上記精製工程において回収した上清５００μｌに、２０％ＰＥＧ溶液、２０％ ＰＥＧ／４Ｍ ＬｉＣｌ溶液、１０Ｍ ＬｉＣｌ、２０％ＰＥＧ／３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液または３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液を添加して、所定の濃度の溶液を調製した。得られた溶液を攪拌した後に、２００００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。得られた沈殿を７０％エタノールで洗浄した後、５０μｌ〜１００μｌのＴＥに溶解してＲＮＡ溶液とした。
【００４８】
(II)ＬｉＣｌを使用する回収
上記精製工程において回収した上清５００μｌに、１０Ｍ ＬｉＣｌ溶液または３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液を添加して、所定の濃度の溶液を調製した。得られた溶液を攪拌した後に、２００００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。得られた沈殿を７０％エタノールで洗浄した後、５０μｌ〜１００μｌのＴＥに溶解してＲＮＡ溶液とした。
【００４９】
(III)２−プロパノールを使用する回収
上記精製工程において回収した上清５００μｌにミリＱ水を添加して等量の２−プロパノールと完全に混合する濃度まで希釈した。この希釈溶液に等量の２−プロパノールを添加し、得られた溶液を攪拌し、次いで、２００００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。得られた沈殿を７０％エタノールで洗浄した後、５０μｌ〜１００μｌのＴＥに溶解してＲＮＡ溶液とした。
【００５０】
〔腐植物質のモニタリング〕
土壌から抽出される腐植物質は暗褐色であり、可視光の波長領域全域に非特徴的な光吸収特性を有している。腐植物質の定量には一般的に４００ｎｍにおける吸光度（ＡＢＳ）が用いられる。本研究においても同様に４０５ｎｍのＡＢＳを測定することによって腐植物質の量を測定した。ＡＢＳの値が低いほど溶液中の腐植物質の混入が少ない（腐植物質の除去率が高い）。
【００５１】
上記精製工程において回収した上清（１０〜２０μｌ）または沈殿をＴＥに溶解した溶液（１０〜２０μｌ）を、９６穴ウエル（263339 ＮＵＮＣ社製）に移し、合計１００μｌになるようＴＥ緩衝液を添加した。このウエルを用いてマイクロプレートリーダーＭｏｄｅｌ ６８０（バイオラット社製）にてＡＢＳを測定した。
【００５２】
〔ＲＮＡの定量〕
ＤＮＡとＲＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、ゲルを染色した後にｒＲＮＡ部分の蛍光を測定してＲＮＡを定量した。アガロースゲルの濃度は１．５％で作製した。電気泳動を、×０．５ ＴＡＥ緩衝液中で５０Ｖにて３０分間行った。ゲルの染色を、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩＩで１時間行った。ＢＡＳ３０００（富士写真フィルム社製）を用いて、４７３ｎｍ励起および５３２ｎｍ以下の蛍光をカットしてＤＮＡおよびＲＮＡを定量的に検出した。画像処理を、Ｉｍａｇｅ Ｇａｕｇｅを用いて２３Ｓ ｒＲＮＡおよび１６Ｓ ｒＲＮＡのｒＲＮＡバンドの輝度を計測した。なお、各ゲルには、４〜５段階の標準としてλＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物を０．０５μｇ〜０．２５μｇを同時に電気泳動し、λＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物を基準にした検量線に基づいてＲＮＡ量を定量した。
【００５３】
〔大腸菌からのＲＮＡ抽出液に対するＲＮＡ回収法の比較〕
２−プロパノールを使用するＲＮＡ回収法が通常よく用いられる。しかし、この方法は抽出液中の塩濃度が高い場合は抽出液と２−プロパノールが混和せず、２層に分かれてしまうため、好ましくない。ＬｉＣｌを使用するＲＮＡ回収法もまたよく用いられるが、ＲＮＡの回収量がさほどよくない。そこで、本発明者らはさらなるＲＮＡ回収法を検討し、試行錯誤の結果、ＬｉＣｌと、通常ＲＮＡ回収法に使用されることがないＰＥＧとを共存させると、ＬｉＣｌ単独と比較してＲＮＡ回収率が向上することを見出した（図１）。
【００５４】
図１は、２−プロパノールを使用した場合のＲＮＡ回収率を１００として他の回収法と比較した結果を示す。図１に示すように、０．５Ｍ〜２ＭのＬｉＣｌに対して５％〜１０％のＰＥＧを共存させるとＲＮＡ回収率が向上した。特に、１〜２ＭのＬｉＣｌと１０％ＰＥＧを共存させるとＲＮＡ回収率が優れていた。
【００５５】
〔腐植物質除去効果に対するＲＮＡ抽出用溶液中の界面活性剤の影響〕
土壌からの腐植物質抽出液とＥ．ｃｏｌｉからのＲＮＡ抽出液との混合液からの腐植物質除去効果を検討するに際し、ＲＮＡ抽出液中の界面活性剤の影響を検討した。その結果、ＲＮＡ抽出用溶液が４Ｍグアニジンチオシアネート溶液（図２、３）であっても２％ＳＤＳ溶液（図４、５、６）であっても有意な差はなかった。
【００５６】
〔ＣＴＡＢまたはＰＶＰＰによる腐植物質除去効果〕
土壌からの腐植物質抽出液とＥ．ｃｏｌｉからのＲＮＡ抽出液との混合液からの腐植物質除去効果を検討するに際し、腐植物質除去に用いる物質を検討した。図２、４および５はＣＴＡＢを用いた場合の腐植物質除去効果、図３（ａ）および図６はＰＶＰＰを用いた場合の腐植物質除去効果を示す。その結果、ＣＴＡＢが好ましいことがわかった。
【００５７】
〔腐植物質除去におけるｐＨの影響〕
ＳＤＳによりＥ．ｃｏｌｉより調整したＲＮＡ抽出液に腐植物質抽出液を混合した溶液からＣＴＡＢを用いて腐植物質除去を行う際のｐＨの影響を検討した。その結果、ＣＴＡＢを用いて腐植物質除去を行う際のｐＨは５．０を下回るとＲＮＡ回収量が半減した（図９〜１０）。
【００５８】
〔腐植物質除去に対するＣＴＡＢの濃度の影響〕
ＳＤＳによりＥ．ｃｏｌｉより調整したＲＮＡ抽出液に腐植物質抽出液を混合した溶液からＣＴＡＢを用いて腐植物質除去を行う際のＣＴＡＢの濃度を検討した。その結果、２％（ｗ／ｖ）以上のＣＴＡＢを用いれば、腐植物質除去効率が非常に良好であった（図７〜８、１１〜１２）。また、塩濃度（Ｎａ＋イオン濃度）が高くなるにつれて腐植物質除去効率が低下することもわかった（図１１〜１２）。しかし、［Ｎａ＋］が０．５Ｍまたは０．７５Ｍの場合は、２．５％以上のＣＴＡＢを用いるとＲＮＡが分解し、ｒＲＮＡのバンドを確認し得えない、もしくは不明瞭となった（図１３（ｂ）および図１４（ｂ））。さらに、［Ｎａ＋］が１．０Ｍ〜１．２５Ｍの場合は、いずれの濃度のＣＴＡＢを用いてもＲＮＡが分解しないことがわかった（図１５（ｃ））。また、ＣＴＡＢ濃度が２．５％または３％の場合の、塩の種類および濃度によるＲＮＡ回収率に対する影響を検討したが、［Ｎａ＋］が０．７５Ｍ〜１．２５ＭであればＲＮＡ回収率は良好であることがわかった（図１６）。
【００５９】
〔ＣＴＡＢを用いたＲＮＡ精製後のＲＮＡ回収法の検討〕
以上の結果より、３％ＣＴＡＢ／１．０Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを用いたＲＮＡ精製（腐植物質除去）が最適であることがわかった。このＲＮＡ溶液からのＲＮＡ回収法を検討した。その結果、腐植物質除去効率の観点から、アルカリ条件下のＰＥＧ溶液（ＰＥＧ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））溶液を用いてＲＮＡを回収する方法が最適であることがわかった（図１９〜２０）。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
生体内情報（例えば、生体内での物質の挙動）の画像化、すなわち物質の動態をリアルタイムで画像化する際に、自然環境が生体に与える影響を検討することは非常に重要である。本発明を用いれば、土壌での土壌微生物の生態をリアルタイムに検出し得る。さらに、本発明は、土壌からのＲＮＡの抽出技術として、土壌からのＤＮＡの抽出技術と同様に有用であり、土壌で活動している微生物を正確に評価し得る。本発明は、腐植物質の除去効率を改善し、土壌ＲＮＡの分子生物学的解析をより簡便にし得るので、土壌微生物生体解明にも大いに有用である。このように本発明は植物利用分野に大いに貢献できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】種々の回収方法によるＲＮＡ回収率を比較した結果を示すグラフである。
【図２】グアニジンチオシアネートを用いて抽出したＲＮＡ抽出液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程による腐植物質除去効果を比較した結果を示すグラフである。
【図３】（ａ）は、グアニジンチオシアネートを用いて抽出したＲＮＡ抽出液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程による腐植物質除去効果を比較した結果を示すグラフであり、（ｂ）は本発明のＲＮＡ精製工程を行わない場合の腐植物質の存在を示すグラフである。
【図４】ＳＤＳを用いて抽出したＲＮＡ抽出液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程による腐植物質除去効果を比較した結果を示すグラフである。
【図５】ＳＤＳを用いて抽出したＲＮＡ抽出液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程による腐植物質除去効果を比較した結果を示すグラフ、ならびに本発明のＲＮＡ精製工程を行わない場合の腐植物質の存在を示すグラフである。
【図６】ＳＤＳを用いて抽出したＲＮＡ抽出液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程による腐植物質除去効果を比較した結果を示すグラフ、ならびに本発明のＲＮＡ精製工程を行わない場合の腐植物質の存在を示すグラフである。
【図７】ＳＤＳを用いて抽出したＲＮＡ抽出液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程による腐植物質除去効果を比較した結果を示すグラフであり、（ａ）はｐＨ４．５、（ｂ）はｐＨ５．０で行った場合の結果を示す。（ｃ）はＳＤＳを用いて抽出したＲＮＡ抽出液に対する、本発明のＲＮＡ精製工程を行わない場合の腐植物質除去効果を比較した結果を示すグラフである。
【図８】ＳＤＳを用いて抽出したＲＮＡ抽出液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程による腐植物質除去効果を比較した結果を示すグラフであり、（ａ）はｐＨ４．５、（ｂ）はｐＨ５．０で行った場合の結果を示す。（ｃ）はＳＤＳを用いて抽出したＲＮＡ抽出液に対する、本発明のＲＮＡ精製工程を行わない場合の腐植物質除去効果を比較した結果を示すグラフである。
【図９】ＳＤＳを用いて抽出したＲＮＡ抽出液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程を行った場合のＲＮＡ回収率を比較した結果を示すグラフであり、（ａ）はｐＨ４．５、（ｂ）はｐＨ５．０で行った場合の結果を示す。
【図１０】ＳＤＳを用いて抽出したＲＮＡ抽出液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程を行った場合のＲＮＡ回収率を比較した結果を示すグラフであり、（ａ）はｐＨ４．５、（ｂ）はｐＨ５．０で行った場合の結果を示す。
【図１１】本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程が弥生堆肥区土壌由来の腐植物質除去に及ぼす効果を比較した結果を示すグラフであり、［Ｎａ＋］が（ａ）０．５Ｍ、（ｂ）０．７５Ｍ、（ｃ）１．０Ｍ、（ｄ）１．２５Ｍである。
【図１２】弥生堆肥区土壌由来の腐植物質除去の際に、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程が、ＰＥＧ沈殿法により回収したＲＮＡ溶液と混合された腐植物質の除去に及ぼす効果を比較した結果を示すグラフであり、［Ｎａ＋］が（ａ）０．５Ｍ、（ｂ）０．７５Ｍ、（ｃ）１．０Ｍ、（ｄ）１．２５Ｍである。
【図１３】（ａ）は弥生堆肥区土壌由来の腐植物質除去の際に、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程がＲＮＡ回収率に及ぼす影響を比較した結果を示すグラフであり、［Ｎａ＋］が０．５Ｍの場合を示す。（ｂ）は（ａ）によって得られたＲＮＡを電気泳動した結果を示す図である。なお、（ｂ）において、１は２．５％ＣＴＡＢ処理を０．５Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ存在下で精製処理を行い、ＰＥＧ沈殿法により回収を行ったＲＮＡ溶液を示し、２は３％ＣＴＡＢ処理を元の抽出液（５００μｌ）の１／１０量（５０μｌ）の４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを添加しさらに０．５ＭとなるようＮａＣｌで調整して精製処理を行い、回収したＲＮＡ溶液について示している。３は３％のＣＴＡＢ処理を０．５Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ存在下で行った結果を示し、４は３．３％のＣＴＡＢ処理を１／１０量の４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを添加した結果を示し、５は３．３％ＣＴＡＢ処理を０．５Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ存在下で行った結果を示す。
【図１４】（ａ）は弥生堆肥区土壌由来の腐植物質除去の際に、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程がＲＮＡ回収率に及ぼす影響を比較した結果を示すグラフであり、［Ｎａ＋］が０．７５Ｍの場合を示す。（ｂ）は（ａ）によって得られたＲＮＡを電気泳動した結果を示す図である。なお、（ｂ）において、１、２、３は２．５％ＣＴＡＢ処理、４、５、６は３％ＣＴＡＢ処理、７、８、９は３．３％ＣＴＡＢ処理を行った結果であり、１は元の抽出液（５００μｌ）に対し、１／１０量（５０μｌ）の４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを添加しさらに０．７５ＭとなるようＮａＣｌで調整して精製処理を行い、ＰＥＧ沈殿法により回収を行ったＲＮＡ溶液についての結果であり、２は元の抽出液（５００μｌ）に対し、１／５量（１００μｌ）の４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを添加しさらに０．７５ＭとなるようＮａＣｌで調整して精製処理を行った結果、３は０．７５Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ存在下で精製処理を行い、ＰＥＧ沈殿法により回収を行った結果について示している。同様に４、７は１／１０量の４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを添加して０．７５Ｍに調整して行った精製処理の結果、５、８は１／５量の４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを添加した結果、６、９は０．７５Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ存在下での精製処理を示す。
【図１５】弥生堆肥区土壌由来の腐植物質除去の際に、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程がＲＮＡ回収率に及ぼす影響を比較した結果を示すグラフであり、（ａ）は［Ｎａ＋］が１．０Ｍの場合を示し、［Ｎａ＋］が１．２５Ｍの場合を示す。（ｃ）は（ａ）および（ｂ）によって得られたＲＮＡを電気泳動した結果を示す図である。なお、（ｃ）において、1は０．０５μｇのλＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物、２は０．１μｇ、３は０．１５μｇ、４は０．２μｇ、５は０．２５μｇを電気泳動した。６，７，８は１％ＣＴＡＢ処理、９、１０、１１は２％ＣＴＡＢ処理、１２、１３、１４は２．５％ＣＴＡＢ処理、１５、１６、１７は３％ＣＴＡＢ処理、１８、１９、２０は３．３％ＣＴＡＢ処理についての結果を示している。６は元の抽出液（５００μｌ）に対し、１／１０量（５０μｌ）の４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを添加しさらに１ＭとなるようＮａＣｌで調整して精製処理を行い、ＰＥＧ沈殿法により回収を行ったＲＮＡ溶液についての結果であり、７は元の抽出液（５００μｌ）に対し、１／５量（１００μｌ）の４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを添加しさらに１ＭとなるようＮａＣｌで調整して精製処理を行った結果、８は１Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ存在下で精製処理を行い、ＰＥＧ沈殿法により回収を行った結果について示している。同様に９、１２、１５、１８は１／１０量の４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを添加して１Ｍに調整して行った精製処理の結果、１０、１３、１６、１９は１／５量の４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを添加した結果、１１、１４、１７、２０は１Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ存在下での精製処理を示す。
【図１６】本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程における塩の種類およびＮａイオン濃度がＲＮＡ回収率に及ぼす影響を比較した結果を示すグラフである。
【図１７】本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程が東北大学森林土壌由来の腐植物質除去に及ぼす効果を比較した結果を示すグラフであり、（ａ）は、ＲＮＡ溶液と腐植物質抽出液との混合液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程の除タンパク後の上清における腐植物質除去効果を比較した結果を示し、（ｂ）は、ＲＮＡ溶液と腐植物質抽出液との混合液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程後、ＰＥＧ沈殿により回収したＲＮＡ溶液における腐植物質除去効果を比較した結果を示し、（ｃ）は本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程がＲＮＡ回収率に及ぼす効果を比較した結果を示す。
【図１８】本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程に係るＲＮＡ精製工程が栃木森林土壌由来の腐植物質除去に及ぼす効果を比較した結果を示すグラフであり、（ａ）は、ＲＮＡ溶液と腐植物質抽出液との混合液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程の除タンパク後の上清における腐植物質除去効果を比較した結果を示し、（ｂ）は、ＲＮＡ溶液と腐植物質抽出液との混合液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程後、ＰＥＧ沈殿により回収したＲＮＡ溶液における腐植物質除去効果を比較した結果を示し、（ｃ）は本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程がＲＮＡ回収率に及ぼす効果を比較した結果を示す。
【図１９】（ａ）は、栃木森林土壌由来の腐植物質を用いた、ＰＥＧまたはＬｉＣｌ法によるＲＮＡ回収法の腐植物質除去効果に及ぼす影響を比較した結果を示すグラフであり、（ｂ）は、栃木森林土壌由来の腐植物質を用いた、ＰＥＧまたはＬｉＣｌ法によるＲＮＡ回収法のＲＮＡ回収率に及ぼす影響を比較した結果を示すグラフである。
【図２０】（ａ）は、東北大学森林土壌由来の腐植物質を用いた、ＰＥＧまたはＬｉＣｌ法によるＲＮＡ回収法の腐植物質除去効果に及ぼす影響を比較した結果を示すグラフであり、（ｂ）はＣＴＡＢによる精製処理を行わず、クロロホルムによる除タンパク処理のみを行い、２−プロパノールの等量添加により回収したＲＮＡ溶液であり、（ｃ）は、栃木森林土壌由来の腐植物質を用いた、ＰＥＧまたはＬｉＣｌ法によるＲＮＡ回収法のＲＮＡ回収率に及ぼす影響を比較した結果を示すグラフである。
【図２１】実施例において用いた土壌の性状を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、土壌中の微生物に関する情報を簡便に得る技術に関するものであり、より詳細には、土壌から抽出したＲＮＡを高度に精製する技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
植物内における本来の物質動態を知るためには、植物におけるイメージングを行う際の環境がその植物にとっての本来の生育環境に近似していることが重要である。植物にとっての本来の生育環境を知るためには、植物が生育する土壌についての情報を解析する、優れた技術が不可欠である。植物の生育に大きな影響を与える要因としては、土壌のｐＨ、無機塩類濃度といった土壌の理化学性に加え、植物と共生、共存の関係にある土壌の微生物の存在が挙げられる。
【０００３】
土壌から微生物ＤＮＡを検出または分離する技術は、これまでにいくつも報告されている。土壌から核酸を抽出するための既知の方法は、界面活性剤、リン酸、キレート剤などを含む抽出液で微生物菌体を破壊する。この抽出液は、土壌から腐植物質（例えば、腐植酸など）も同時に抽出する。この腐植物質が少しでも混入すると、引き続く分子生物学的な解析に弊害が生じる（例えば、Ｔａｑ、制限酵素などの酵素活性を阻害する）。よって、酵素を用いる解析（例えば、ＲＴ−ＰＣＲなど）の前に、十分な精製作業を行う必要がある。しかし、このような精製操作は非常に煩雑であり、時間もコストもかかる。
【０００４】
本発明者らは、高塩濃度下にて抽出した核酸抽出液に、高分子ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加するとともにその溶液のｐＨを上昇させることによって、ＤＮＡだけを沈殿させる土壌ＤＮＡ回収法を開発した（特許文献１参照）。
【特許文献１】ＷＯ２００５／０７３３７７（国際公開日：２００５（平成１７）年８月１１日）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、特許文献１は、高塩濃度下にて抽出した核酸抽出液を用いる技術であり、特許文献１に記載されるような高い塩濃度（２Ｍ〜）における精製処理ではＲＮＡは沈殿してしまう。このような技術はあくまでもＤＮＡ精製法であり、この精製法をＲＮＡ精製に採用することはできない。また、ＲＮＡを除去することが当該分野においてよく知られているＰＥＧが用いられた核酸精製技術はあくまでもＤＮＡ精製法でありＲＮＡ精製に適用されることはない。ＲＮＡはＤＮＡよりもはるかに分解されやすいため、より慎重かつ簡便なＲＮＡ精製法が開発される必要がある。
【０００６】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、夾雑物を限りなく除去するＲＮＡ法を開発することであり、具体的には、土壌から抽出したＲＮＡを、土壌からの腐植物質を混入させることなく、高度にかつ簡便に精製する技術を実現することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係るＲＮＡ精製法は、陽イオン性界面活性剤をＲＮＡ抽出液へ添加してＲＮＡ溶液を調製する第１工程、およびＰＥＧ存在下にて該ＲＮＡ溶液からＲＮＡを回収する第２工程を包含することを特徴としている。なお、上記陽イオン性界面活性剤はセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）であることが好ましい。
【０００８】
本発明に係るＲＮＡ精製法において、ＣＴＡＢの濃度は２％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましく、３％（ｗ／ｖ）以上であることがさらに好ましい。また、本発明に係るＲＮＡ精製法において、ＰＥＧの濃度は５（ｗ／ｖ）以上であることが好ましく、７％（ｗ／ｖ）〜１５％（ｗ／ｖ）であることがより好ましい。
【０００９】
第１工程は、０．５〜１．２５Ｍの範囲内の塩存在下にて行われることが好ましく、１．０〜１．２５Ｍの範囲内の塩存在下にて行われることがより好ましく、１．０ＭのＮａ＋存在下にて行われることがさらに好ましい。
【００１０】
本発明に係るＲＮＡ精製法において、第１工程は、ｐＨ５．０〜６．５の範囲内で行われることが好ましく、ｐＨ５．０〜５．５の範囲内で行われることがより好ましい。
【００１１】
本発明に係るＲＮＡ精製法において、第２工程は、ｐＨ８．０以上にて行われることが好ましく、さらなる塩を添加することなく行われることが好ましい。
【００１２】
本発明に係るＲＮＡ精製法において、上記ＲＮＡ抽出液は、ＳＤＳ抽出またはグアニジンチオシアネート抽出によって得られたものであってもよい。
【００１３】
本発明に係るＲＮＡ精製法は、回収したＲＮＡを限外濾過に供する工程をさらに包含してもよく、この場合、限外濾過はＮＭＷＬ５０，０００以上を分画し得る濾過であることが好ましい。
【００１４】
本発明に係るＲＮＡ精製法は、土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥および糞便からなる群より選択される少なくとも１つに由来するサンプルからのＲＮＡ抽出液であっても適用可能である。
【００１５】
本発明に係るＲＮＡ精製キットは、陽イオン性界面活性剤およびＰＥＧを備えていることを特徴としている。上記陽イオン性界面活性剤はＣＴＡＢであることが好ましい。
【００１６】
本発明に係るＲＮＡ精製キットは、緩衝液または緩衝化能を有する塩を備えていることが好ましい。上記緩衝液は、弱酸性環境を提供するために必要な緩衝液およびアルカリ性環境を提供するために必要な緩衝液であり得、上記塩は、このようなｐＨ環境を提供する緩衝化能を有していればよい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係るＲＮＡ精製法を用いれば、土壌由来の腐植物質のような強固な夾雑物がＲＮＡ抽出液中に存在してもＲＮＡを首尾よく分離／精製し得る。すなわち、本発明を用いれば、土壌からの腐植物質を混入させることなく、高度にかつ簡便にＲＮＡを精製することができるので、植物が生育する土壌についての微生物の情報を解析することができる。このことは、土壌微生物の解析のみならず、本来の生育環境における養分吸収、植物体内での物質挙動を調査する際の指標として非常に有効である。また、ＡＴＡ（aurintricarboxylic acid）等のＲＮａｓｅ阻害剤がＲＮＡ抽出液中に存在している場合であっても、本発明を用いれば、このような物質を首尾よく除去し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
遺伝子の解析には、ＰＣＲ反応、クローニング、シークエンシング、ハイブリダイゼーション、遺伝子発現試験などの技術が用いられる。特に、ＰＣＲ反応は、多くの遺伝子解析にとって重要で欠くことができない基本技術であり、遺伝情報に基づく微生物群集構造解析にとっても必須の操作である。
【００１９】
土壌には、微生物または植物およびこれらの細胞膜または細胞壁、タンパク質、腐植物質や重金属などが含まれている。このような土壌からの核酸抽出液には上記物質が夾雑物として含まれているので、解析のためにはこれらの夾雑物をできるだけ取り除くべきである。特に、腐植物質は、精製した核酸サンプルに夾雑していると、極めて微量であっても酵素反応（例えば、ＰＣＲ反応）を強力に阻害する。よって、腐植物質を核酸抽出液からできるだけ取り除くことが重要である。
【００２０】
腐植物質は、植物の葉／茎が微生物により分解されてできた高分子の有機成分であり、一般的には、土壌からＮａＯＨなどのアルカリ溶液により抽出される画分である。このように、腐植物質は、単なるアルカリ抽出画分であるので、単一の化合物というよりむしろ種々の高分子を含んだ不均一な混合物である。なお、本明細書中において、土壌由来の腐植物質を例に挙げて説明するが、本発明を実施するに際して、腐植物質は、土壌由来のものに限定されず、堆肥、水系堆積物、活性汚泥、糞便などに由来するものであってもよい。
【００２１】
土壌由来の腐植物質は茶色もしくは黒色の物質である。有機物を多く含む土壌から核酸を抽出する場合、通常多量の腐植物質が核酸とともに抽出されるので、抽出液は暗褐色を呈している。
【００２２】
ＤＮＡと腐植物質との分離には、両者の分子量の差が利用されており、多くのＤＮＡ精製法がこの原理（サイズ分画）に基づいている。また、カオトロピック効果によりＤＮＡがガラス表面に吸着しやすくなることを利用する技術や磁性ビーズを利用した精製法も知られている。さらに、ＣＴＡＢやポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）なども腐植物質の除去剤として使用されている。これらの物質を用いることによって土壌由来のＤＮＡサンプルへの腐植物質の混入は軽減されているものの、完全な除去にまでは至っていない。特に、ＰＶＰＰはＤＮＡの収量が下げるなどの問題を有していることも知られている（特許文献１参照）。
【００２３】
特許文献１に記載されるように、土壌ＤＮＡ抽出液からのおおまかな腐植物質除去のために、ＣＴＡＢ、ＰＶＰＰなどのような腐植物質除去剤が使用されることがある。本発明者らは、公知の腐植物質の除去法を用いた後にサイズ分画によるＲＮＡ精製を試みたが、腐植物質の除去が不十分なために目詰まりが生じてしまった。しかし、本発明者らは、ＣＴＡＢなどの陽イオン性界面活性剤を特定の条件下で用いれば、従来ＲＮＡ精製において採用され得ないＰＥＧを組み合わせることが可能になるとともに、引き続く限外濾過もスムーズに行い得る程度または限外濾過を行う必要がない程度に高度なＲＮＡ精製が高収率にて達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２４】
本発明は、ＲＮＡを高度に分離／精製し得るＲＮＡ精製法を提供する。本発明に係るＲＮＡ精製法を用いれば、腐植物質のような除去困難な夾雑物が存在してもＲＮＡを高度に分離／精製し得る。また、腐植物質のような除去困難な夾雑物が存在してもＲＮＡを高度に分離／精製し得る本発明は、土壌から抽出したＲＮＡに限らず、あらゆるＲＮＡ抽出物に適用可能である。
【００２５】
本発明に係るＲＮＡ精製法は、陽イオン性界面活性剤をＲＮＡ抽出液へ添加してＲＮＡ溶液を調製する第１工程、およびポリエチレングリコール存在下にて該ＲＮＡ溶液からＲＮＡを回収する第２工程を包含することを特徴としている。なお、上記陽イオン性界面活性剤はＣＴＡＢであることが好ましく、その濃度は２％（ｗ／ｖ）以上が好ましい。また、ＰＥＧの濃度は５（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。
【００２６】
第１工程では、ＲＮＡ抽出液にＣＴＡＢを添加してインキュベートした後にクロロホルムによる除タンパク操作を行う。第１工程ではＣＴＡＢ以外に塩を共存させることが好ましい。この場合、抽出液に１．０Ｍ以上の１価のカチオンを添加し得る塩が好ましく、例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびリン酸アンモニウムが挙げられる。本発明の第１工程において用いられる塩は、ＮａＣｌまたは酢酸ナトリウムが好ましい。
【００２７】
なお、塩濃度が１．２５Ｍを超えるとＲＮＡの塩析が生じ、塩濃度が低すぎるとＣＴＡＢと結合するので除タンパク時にＲＮＡが消失することから、第１工程において用いられる塩濃度は０．５〜１．２５Ｍの範囲内であることが好ましく、１．０〜１．２５Ｍの範囲内であることがより好ましい。最も好ましくは、第１工程は１．０ＭのＮａ＋存在下にて行われ得る。
【００２８】
また、ＣＴＡＢによる腐植物質の除去効率はｐＨが低いほどよいが、ｐＨが低すぎるとＲＮＡの分解および塩析が生じ、特にｐＨが５を下回るとＲＮＡ回収効率が著しく低減することから、第１工程が行われる反応のｐＨは５．０以上が好ましく、５．０〜６．５の範囲内であることがより好ましく、５．０〜５．５の範囲内であることがさらに好ましい。このようなｐＨ環境を提供するために、第１工程において用いられる塩は酢酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウム／ＮａＣｌが好ましい。
【００２９】
このような条件下において腐植物質を首尾よく除去しかつＲＮＡ回収効率を高めるためには、添加するＣＴＡＢは２．５％（ｗ／ｖ）以上がより好ましく、３．０％（ｗ／ｖ）以上がなお好ましく、３．３％（ｗ／ｖ）以上がさらに好ましい。
【００３０】
このような第１工程を経て調製されたＲＮＡ溶液からＲＮＡを回収する第２工程は、ＰＥＧが用いられることを特徴としている。特許文献１に記載されているように、ＰＥＧには腐植物質を沈殿させにくく、腐植物質の混入を低減させるという効果があるが、それ以上に、ＲＮＡを除去してＤＮＡの回収率を高めることが、当該分野においてよく知られている。よって、ＲＮＡの回収／精製にＰＥＧが用いられることはない。
【００３１】
本発明に係るＲＮＡ精製法において、第２工程は、ｐＨ７．０以上にて行われることが好ましく、このｐＨ環境を提供するに必要な塩または緩衝液以外にはさらなる塩（例えば、ＬｉＣｌ）を添加することなく行われることが好ましい。通常、ＲＮＡを遠心分離によって回収する（沈殿させる）場合、２−プロパノールまたはＬｉＣｌがよく用いられる。しかし、本発明の実施において、ＲＮＡ溶液中には０．５Ｍ以上の塩が用いられているので２−プロパノールが首尾よく混合しない。また、後述する実施例において示されるように、アルカリ環境下でＰＥＧを使用する第２工程ではＬｉＣｌを用いない方がＲＮＡ回収効率は非常に優れている。この場合、用いるＰＥＧの濃度は７％（ｗ／ｖ）〜１５％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、１０％（ｗ／ｖ）であることがより好ましい。
【００３２】
このような第１工程および第２工程を包含するＲＮＡ精製法を用いれば、土壌由来の腐植物質のような強固な夾雑物がＲＮＡ抽出液中に存在している場合であってもＲＮＡを首尾よく分離／精製し得る。すなわち、本発明を用いれば、土壌からの腐植物質を混入させることなく、高度にかつ簡便にＲＮＡを精製することができる。腐植物質のような強固で除去困難な夾雑物が存在してもＲＮＡを高度に分離／精製し得る本発明は、土壌から抽出したＲＮＡに限らず、あらゆるＲＮＡ抽出物に適用可能であり、本発明に係るＲＮＡ精製法に用いられるＲＮＡ抽出液は、ＳＤＳ抽出またはグアニジンチオシアネート抽出、あるいは当該分野において公知の他の抽出技術によって得られたものであってもよい。
【００３３】
本発明はさらに、上述したＲＮＡ精製法を行うためのＲＮＡ精製キットを提供する。本発明に係るＲＮＡ精製キットを用いれば、腐植物質のような強固で除去困難な夾雑物が存在してもＲＮＡを高度に分離／精製し得る。また、腐植物質のような強固で除去困難な夾雑物が存在してもＲＮＡを高度に分離／精製し得る本発明は、土壌から抽出したＲＮＡに限らず、あらゆるＲＮＡ抽出物に適用可能である。
【００３４】
本発明に係るＲＮＡ精製キットは、上述したＲＮＡ精製法を実施するに必要な試薬または器具が備えられていればよい。本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは試薬または器具の各々を使用するための指示書が備えられている。本明細書中にてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に試薬などが内包されている状態が意図される。「指示書」は、紙またはその他の媒体に印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に記録されていてもよい。
【００３５】
本発明に係るＲＮＡ精製キットは、陽イオン性界面活性剤およびＰＥＧを備えていることを特徴とする。ここで、上記陽イオン性界面活性剤はＣＴＡＢであることが好ましい。
【００３６】
上述したように、本発明に係るＲＮＡ精製法において、ＣＴＡＢの濃度は２％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。よって、本発明に係るＲＮＡ精製キットに備えられているＣＴＡＢは、２％（ｗ／ｖ）以上の濃度を提供し得る濃度であればよい。また、本発明に係るＲＮＡ精製法において、ＰＥＧの濃度は５％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。よって、本発明に係るＲＮＡ精製キットに備えられているＰＥＧは、５％（ｗ／ｖ）以上の濃度を提供し得る濃度であればよい。さらに、本発明に係るＲＮＡ精製キットは、上記ＣＴＡＢおよびＰＥＧを必要な濃度に希釈するための溶液（例えば、蒸留水）がさらに備えられていてもよい。
【００３７】
上述したように、本発明を実施するに際して、陽イオン性界面活性剤は弱酸性環境下にて用いられることが好ましく、ＰＥＧはアルカリ性環境下にて用いられることが好ましい。このような観点から、本発明に係るＲＮＡ精製キットは、緩衝液または緩衝化能を有する塩をさらに備えていることが好ましい。弱酸性環境を提供するために必要な緩衝液は当該分野において周知である（例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩酸緩衝液又は硫酸緩衝液）が、抽出液に１．０Ｍ以上の１価のカチオンを添加する観点から、用いられるべき緩衝化剤（塩）は酢酸ナトリウムが最も好ましく、ＮａＣｌをさらに備えていてもよい。また、アルカリ性環境を提供するために必要な緩衝液または緩衝化剤（塩）もまた、当該分野において周知であるが、ｐＨ環境を提供するに必要な塩以外にさらなる塩を添加することなくＲＮＡ回収が行われるべきという観点から、Ｔｒｉｓが好ましい。本発明に係るＲＮＡ精製キットにおいて、上記緩衝液または緩衝化剤（塩）は上述した第１工程および第２工程を実施するに適切な態様で備えられていればよく、特定の濃度の溶液形態で備えられていれば迅速に混合溶液を調製し得るので即時使用に好ましい。
【００３８】
本発明に係るＲＮＡ精製キットは、精製を実行するに必要な器具をさらに備えていてもよい。また、精製すべきＲＮＡを抽出するために必要な試薬および器具をさらに備えていてもよい。
【００３９】
以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００４０】
土壌から核酸を抽出した場合、その抽出液には、微生物または植物などに由来する細胞膜または細胞壁の破砕物、界面活性剤によって変性したタンパク質、あるいは土壌自体に蓄積されていた土壌有機物（例えば、腐植物質）または重金属などの夾雑物が含まれている。抽出した核酸をその後の解析に供するためには、これらの夾雑物を除去する必要がある。ＲＮＡを遺伝子解析の対象とする場合、ＲＮＡを鋳型として一本鎖のＤＮＡを合成するＲＴ反応またはＲＴ−ＰＣＲ反応を行う必要がある。しかし、このような酵素反応は、土壌由来の夾雑物によって強力に阻害されることが知られている。特に腐植物質は、ナノグラム単位の微量な混入であってもＰＣＲ反応をはじめとする酵素反応を強く阻害することが知られている。よって、土壌から抽出した核酸を用いて遺伝子解析を行う場合は、抽出した核酸溶液からできるだけ腐植物質を除去する必要があり、腐植物質と核酸とを分離するための優れた精製技術が求められている。
【００４１】
本実施例では、土壌からの腐植物質抽出液とＥ．ｃｏｌｉからのＲＮＡ抽出液との混合液を用いて、腐植物質の除去試験を行った。具体的には、以下に示す腐植物質抽出液２．５ｍｌ（必要に応じて２倍量の５ｍｌ）を、以下に示すＥ．ｃｏｌｉからのＲＮＡ抽出液５０ｍｌに添加した混合液を用いた。
【００４２】
〔腐植物質抽出液の調製〕
以下の手順に従って、図２１に示す３種類の土壌（腐植物質を多量に含む火山灰土壌）から腐植物質を抽出し、次いで濃縮して腐植物質抽出液を得た。
【００４３】
２．５ｍｌの２００ｍＭ ＥＤＴＡ／２００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．６）に土壌１ｇを添加して１時間振とうした。次いで、この溶液を６５℃で一昼夜インキュベートし、８０００×ｇにて１０分間遠心分離した。得られた上清に０．６等量の２−プロパノールを添加し、８０００×ｇにて１０分間遠心分離して腐植物質の沈殿を回収した。回収した沈殿を乾燥した後、４Ｍグアニジンチオシアネート溶液を添加し、室温で３０分間振とうした。次いで、この溶液に等量のフェノール：クロロホルム（１：１）溶液を添加し、振とうした後に、８０００×ｇにて１０分間遠心分離した。この除タンパク処理によって土壌由来のＲｎａｓｅが除去される。回収した上清に等量の２−プロパノールを添加し、８０００×ｇにて１０分間遠心分離して暗褐色の腐植物質を沈殿として回収した。回収した沈殿を乾燥し、次いでＴＥに溶解して腐植物質抽出液を得た。なお、実験には、１５ｇの乾燥土壌から腐植物質抽出液を２ｍｌ調製した。
【００４４】
〔ＲＮＡ抽出液の調製〕
大腸菌（ＤＨ−５α）を、ＬＢ培地（１Ｌ当たり１０ｇ ｔｒｙｐｔｏｎｅ，５ｇ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，１０ｇ ＮａＣｌ）中で一晩培養し、この培養液を８０００×ｇにて５分間遠心分離し、菌体を沈殿として回収した。１Ｌの培養液から集菌したＥ．ｃｏｌｉを５ｍｌの１％ＮａＣｌに懸濁した。このＥ．ｃｏｌｉ菌体液５０μｌを１サンプル分として試験に使用した。このＥ．ｃｏｌｉ菌体液に、ＲＮＡ抽出用溶液（ＳＤＳ溶液（２％ ＳＤＳ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））またはグアニジンチオシアネート溶液（４Ｍグアニジンチオシアネート，２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０），１％ Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩））を添加し、次いで１０分間の振とうした。この溶液を８０００×ｇにて１０分間遠心分離し、上清をＲＮＡ抽出液として得た。
【００４５】
〔試薬の調製〕
cetyltrimethylammmonium bromide (sigma-aldrich)をミリＱ水に溶解して、１０％ＣＴＡＢ溶液を調製した。分子量8000および58000のpolyvinylpyrorridoneをミリＱ水に溶解、10％ポリビニルピロリドン溶液を調製した。４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを、酢酸を用いてｐＨ４．０，４．５，５．０または５．５に調整し、オートクレーブ処理して酢酸ナトリウム溶液を調製した。５Ｍ ＮａＣｌ溶液および１０Ｍ ＬｉＣｌ溶液を調製した。polyethylene glycol MW 8000 (sigma-aldrich)をミリＱ水に溶解して、オートクレーブ処理して２０％ＰＥＧ溶液を調製した。
【００４６】
〔ＲＮＡ精製工程〕
ＲＮＡ抽出液５００μｌに対し、１０％ＣＴＡＢ溶液、１０％ポリビニルピロリドン溶液（ＭＷ ８０００）、１０％ポリビニルピロリドン溶液（ＭＷ ５８０００）、５Ｍ ＮａＣｌ、４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨ４．０，４．５，５．０または５．５）を所定の濃度になるように添加した。この溶液をＶｏｒｔａｘで３０秒間攪拌した後、６５℃で１０分間インキュベートした。この溶液を室温に戻し、次いで等量のクロロホルムを添加した。この溶液をｖｏｒｔａｘで３０秒間攪拌し、１２，０００×ｇにて１５分間遠心分離し、上清を回収した。この精製工程によって、腐植物質の除去および除タンパクを行い得る。
【００４７】
〔ＲＮＡ回収工程〕
(I)ＰＥＧを使用する回収
上記精製工程において回収した上清５００μｌに、２０％ＰＥＧ溶液、２０％ ＰＥＧ／４Ｍ ＬｉＣｌ溶液、１０Ｍ ＬｉＣｌ、２０％ＰＥＧ／３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液または３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液を添加して、所定の濃度の溶液を調製した。得られた溶液を攪拌した後に、２００００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。得られた沈殿を７０％エタノールで洗浄した後、５０μｌ〜１００μｌのＴＥに溶解してＲＮＡ溶液とした。
【００４８】
(II)ＬｉＣｌを使用する回収
上記精製工程において回収した上清５００μｌに、１０Ｍ ＬｉＣｌ溶液または３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液を添加して、所定の濃度の溶液を調製した。得られた溶液を攪拌した後に、２００００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。得られた沈殿を７０％エタノールで洗浄した後、５０μｌ〜１００μｌのＴＥに溶解してＲＮＡ溶液とした。
【００４９】
(III)２−プロパノールを使用する回収
上記精製工程において回収した上清５００μｌにミリＱ水を添加して等量の２−プロパノールと完全に混合する濃度まで希釈した。この希釈溶液に等量の２−プロパノールを添加し、得られた溶液を攪拌し、次いで、２００００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。得られた沈殿を７０％エタノールで洗浄した後、５０μｌ〜１００μｌのＴＥに溶解してＲＮＡ溶液とした。
【００５０】
〔腐植物質のモニタリング〕
土壌から抽出される腐植物質は暗褐色であり、可視光の波長領域全域に非特徴的な光吸収特性を有している。腐植物質の定量には一般的に４００ｎｍにおける吸光度（ＡＢＳ）が用いられる。本研究においても同様に４０５ｎｍのＡＢＳを測定することによって腐植物質の量を測定した。ＡＢＳの値が低いほど溶液中の腐植物質の混入が少ない（腐植物質の除去率が高い）。
【００５１】
上記精製工程において回収した上清（１０〜２０μｌ）または沈殿をＴＥに溶解した溶液（１０〜２０μｌ）を、９６穴ウエル（263339 ＮＵＮＣ社製）に移し、合計１００μｌになるようＴＥ緩衝液を添加した。このウエルを用いてマイクロプレートリーダーＭｏｄｅｌ ６８０（バイオラット社製）にてＡＢＳを測定した。
【００５２】
〔ＲＮＡの定量〕
ＤＮＡとＲＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、ゲルを染色した後にｒＲＮＡ部分の蛍光を測定してＲＮＡを定量した。アガロースゲルの濃度は１．５％で作製した。電気泳動を、×０．５ ＴＡＥ緩衝液中で５０Ｖにて３０分間行った。ゲルの染色を、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩＩで１時間行った。ＢＡＳ３０００（富士写真フィルム社製）を用いて、４７３ｎｍ励起および５３２ｎｍ以下の蛍光をカットしてＤＮＡおよびＲＮＡを定量的に検出した。画像処理を、Ｉｍａｇｅ Ｇａｕｇｅを用いて２３Ｓ ｒＲＮＡおよび１６Ｓ ｒＲＮＡのｒＲＮＡバンドの輝度を計測した。なお、各ゲルには、４〜５段階の標準としてλＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物を０．０５μｇ〜０．２５μｇを同時に電気泳動し、λＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物を基準にした検量線に基づいてＲＮＡ量を定量した。
【００５３】
〔大腸菌からのＲＮＡ抽出液に対するＲＮＡ回収法の比較〕
２−プロパノールを使用するＲＮＡ回収法が通常よく用いられる。しかし、この方法は抽出液中の塩濃度が高い場合は抽出液と２−プロパノールが混和せず、２層に分かれてしまうため、好ましくない。ＬｉＣｌを使用するＲＮＡ回収法もまたよく用いられるが、ＲＮＡの回収量がさほどよくない。そこで、本発明者らはさらなるＲＮＡ回収法を検討し、試行錯誤の結果、ＬｉＣｌと、通常ＲＮＡ回収法に使用されることがないＰＥＧとを共存させると、ＬｉＣｌ単独と比較してＲＮＡ回収率が向上することを見出した（図１）。
【００５４】
図１は、２−プロパノールを使用した場合のＲＮＡ回収率を１００として他の回収法と比較した結果を示す。図１に示すように、０．５Ｍ〜２ＭのＬｉＣｌに対して５％〜１０％のＰＥＧを共存させるとＲＮＡ回収率が向上した。特に、１〜２ＭのＬｉＣｌと１０％ＰＥＧを共存させるとＲＮＡ回収率が優れていた。
【００５５】
〔腐植物質除去効果に対するＲＮＡ抽出用溶液中の界面活性剤の影響〕
土壌からの腐植物質抽出液とＥ．ｃｏｌｉからのＲＮＡ抽出液との混合液からの腐植物質除去効果を検討するに際し、ＲＮＡ抽出液中の界面活性剤の影響を検討した。その結果、ＲＮＡ抽出用溶液が４Ｍグアニジンチオシアネート溶液（図２、３）であっても２％ＳＤＳ溶液（図４、５、６）であっても有意な差はなかった。
【００５６】
〔ＣＴＡＢまたはＰＶＰＰによる腐植物質除去効果〕
土壌からの腐植物質抽出液とＥ．ｃｏｌｉからのＲＮＡ抽出液との混合液からの腐植物質除去効果を検討するに際し、腐植物質除去に用いる物質を検討した。図２、４および５はＣＴＡＢを用いた場合の腐植物質除去効果、図３（ａ）および図６はＰＶＰＰを用いた場合の腐植物質除去効果を示す。その結果、ＣＴＡＢが好ましいことがわかった。
【００５７】
〔腐植物質除去におけるｐＨの影響〕
ＳＤＳによりＥ．ｃｏｌｉより調整したＲＮＡ抽出液に腐植物質抽出液を混合した溶液からＣＴＡＢを用いて腐植物質除去を行う際のｐＨの影響を検討した。その結果、ＣＴＡＢを用いて腐植物質除去を行う際のｐＨは５．０を下回るとＲＮＡ回収量が半減した（図９〜１０）。
【００５８】
〔腐植物質除去に対するＣＴＡＢの濃度の影響〕
ＳＤＳによりＥ．ｃｏｌｉより調整したＲＮＡ抽出液に腐植物質抽出液を混合した溶液からＣＴＡＢを用いて腐植物質除去を行う際のＣＴＡＢの濃度を検討した。その結果、２％（ｗ／ｖ）以上のＣＴＡＢを用いれば、腐植物質除去効率が非常に良好であった（図７〜８、１１〜１２）。また、塩濃度（Ｎａ＋イオン濃度）が高くなるにつれて腐植物質除去効率が低下することもわかった（図１１〜１２）。しかし、［Ｎａ＋］が０．５Ｍまたは０．７５Ｍの場合は、２．５％以上のＣＴＡＢを用いるとＲＮＡが分解し、ｒＲＮＡのバンドを確認し得えない、もしくは不明瞭となった（図１３（ｂ）および図１４（ｂ））。さらに、［Ｎａ＋］が１．０Ｍ〜１．２５Ｍの場合は、いずれの濃度のＣＴＡＢを用いてもＲＮＡが分解しないことがわかった（図１５（ｃ））。また、ＣＴＡＢ濃度が２．５％または３％の場合の、塩の種類および濃度によるＲＮＡ回収率に対する影響を検討したが、［Ｎａ＋］が０．７５Ｍ〜１．２５ＭであればＲＮＡ回収率は良好であることがわかった（図１６）。
【００５９】
〔ＣＴＡＢを用いたＲＮＡ精製後のＲＮＡ回収法の検討〕
以上の結果より、３％ＣＴＡＢ／１．０Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを用いたＲＮＡ精製（腐植物質除去）が最適であることがわかった。このＲＮＡ溶液からのＲＮＡ回収法を検討した。その結果、腐植物質除去効率の観点から、アルカリ条件下のＰＥＧ溶液（ＰＥＧ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））溶液を用いてＲＮＡを回収する方法が最適であることがわかった（図１９〜２０）。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
生体内情報（例えば、生体内での物質の挙動）の画像化、すなわち物質の動態をリアルタイムで画像化する際に、自然環境が生体に与える影響を検討することは非常に重要である。本発明を用いれば、土壌での土壌微生物の生態をリアルタイムに検出し得る。さらに、本発明は、土壌からのＲＮＡの抽出技術として、土壌からのＤＮＡの抽出技術と同様に有用であり、土壌で活動している微生物を正確に評価し得る。本発明は、腐植物質の除去効率を改善し、土壌ＲＮＡの分子生物学的解析をより簡便にし得るので、土壌微生物生体解明にも大いに有用である。このように本発明は植物利用分野に大いに貢献できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】種々の回収方法によるＲＮＡ回収率を比較した結果を示すグラフである。
【図２】グアニジンチオシアネートを用いて抽出したＲＮＡ抽出液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程による腐植物質除去効果を比較した結果を示すグラフである。
【図３】（ａ）は、グアニジンチオシアネートを用いて抽出したＲＮＡ抽出液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程による腐植物質除去効果を比較した結果を示すグラフであり、（ｂ）は本発明のＲＮＡ精製工程を行わない場合の腐植物質の存在を示すグラフである。
【図４】ＳＤＳを用いて抽出したＲＮＡ抽出液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程による腐植物質除去効果を比較した結果を示すグラフである。
【図５】ＳＤＳを用いて抽出したＲＮＡ抽出液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程による腐植物質除去効果を比較した結果を示すグラフ、ならびに本発明のＲＮＡ精製工程を行わない場合の腐植物質の存在を示すグラフである。
【図６】ＳＤＳを用いて抽出したＲＮＡ抽出液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程による腐植物質除去効果を比較した結果を示すグラフ、ならびに本発明のＲＮＡ精製工程を行わない場合の腐植物質の存在を示すグラフである。
【図７】ＳＤＳを用いて抽出したＲＮＡ抽出液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程による腐植物質除去効果を比較した結果を示すグラフであり、（ａ）はｐＨ４．５、（ｂ）はｐＨ５．０で行った場合の結果を示す。（ｃ）はＳＤＳを用いて抽出したＲＮＡ抽出液に対する、本発明のＲＮＡ精製工程を行わない場合の腐植物質除去効果を比較した結果を示すグラフである。
【図８】ＳＤＳを用いて抽出したＲＮＡ抽出液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程による腐植物質除去効果を比較した結果を示すグラフであり、（ａ）はｐＨ４．５、（ｂ）はｐＨ５．０で行った場合の結果を示す。（ｃ）はＳＤＳを用いて抽出したＲＮＡ抽出液に対する、本発明のＲＮＡ精製工程を行わない場合の腐植物質除去効果を比較した結果を示すグラフである。
【図９】ＳＤＳを用いて抽出したＲＮＡ抽出液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程を行った場合のＲＮＡ回収率を比較した結果を示すグラフであり、（ａ）はｐＨ４．５、（ｂ）はｐＨ５．０で行った場合の結果を示す。
【図１０】ＳＤＳを用いて抽出したＲＮＡ抽出液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程を行った場合のＲＮＡ回収率を比較した結果を示すグラフであり、（ａ）はｐＨ４．５、（ｂ）はｐＨ５．０で行った場合の結果を示す。
【図１１】本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程が弥生堆肥区土壌由来の腐植物質除去に及ぼす効果を比較した結果を示すグラフであり、［Ｎａ＋］が（ａ）０．５Ｍ、（ｂ）０．７５Ｍ、（ｃ）１．０Ｍ、（ｄ）１．２５Ｍである。
【図１２】弥生堆肥区土壌由来の腐植物質除去の際に、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程が、ＰＥＧ沈殿法により回収したＲＮＡ溶液と混合された腐植物質の除去に及ぼす効果を比較した結果を示すグラフであり、［Ｎａ＋］が（ａ）０．５Ｍ、（ｂ）０．７５Ｍ、（ｃ）１．０Ｍ、（ｄ）１．２５Ｍである。
【図１３】（ａ）は弥生堆肥区土壌由来の腐植物質除去の際に、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程がＲＮＡ回収率に及ぼす影響を比較した結果を示すグラフであり、［Ｎａ＋］が０．５Ｍの場合を示す。（ｂ）は（ａ）によって得られたＲＮＡを電気泳動した結果を示す図である。なお、（ｂ）において、１は２．５％ＣＴＡＢ処理を０．５Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ存在下で精製処理を行い、ＰＥＧ沈殿法により回収を行ったＲＮＡ溶液を示し、２は３％ＣＴＡＢ処理を元の抽出液（５００μｌ）の１／１０量（５０μｌ）の４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを添加しさらに０．５ＭとなるようＮａＣｌで調整して精製処理を行い、回収したＲＮＡ溶液について示している。３は３％のＣＴＡＢ処理を０．５Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ存在下で行った結果を示し、４は３．３％のＣＴＡＢ処理を１／１０量の４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを添加した結果を示し、５は３．３％ＣＴＡＢ処理を０．５Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ存在下で行った結果を示す。
【図１４】（ａ）は弥生堆肥区土壌由来の腐植物質除去の際に、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程がＲＮＡ回収率に及ぼす影響を比較した結果を示すグラフであり、［Ｎａ＋］が０．７５Ｍの場合を示す。（ｂ）は（ａ）によって得られたＲＮＡを電気泳動した結果を示す図である。なお、（ｂ）において、１、２、３は２．５％ＣＴＡＢ処理、４、５、６は３％ＣＴＡＢ処理、７、８、９は３．３％ＣＴＡＢ処理を行った結果であり、１は元の抽出液（５００μｌ）に対し、１／１０量（５０μｌ）の４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを添加しさらに０．７５ＭとなるようＮａＣｌで調整して精製処理を行い、ＰＥＧ沈殿法により回収を行ったＲＮＡ溶液についての結果であり、２は元の抽出液（５００μｌ）に対し、１／５量（１００μｌ）の４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを添加しさらに０．７５ＭとなるようＮａＣｌで調整して精製処理を行った結果、３は０．７５Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ存在下で精製処理を行い、ＰＥＧ沈殿法により回収を行った結果について示している。同様に４、７は１／１０量の４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを添加して０．７５Ｍに調整して行った精製処理の結果、５、８は１／５量の４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを添加した結果、６、９は０．７５Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ存在下での精製処理を示す。
【図１５】弥生堆肥区土壌由来の腐植物質除去の際に、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程がＲＮＡ回収率に及ぼす影響を比較した結果を示すグラフであり、（ａ）は［Ｎａ＋］が１．０Ｍの場合を示し、［Ｎａ＋］が１．２５Ｍの場合を示す。（ｃ）は（ａ）および（ｂ）によって得られたＲＮＡを電気泳動した結果を示す図である。なお、（ｃ）において、1は０．０５μｇのλＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物、２は０．１μｇ、３は０．１５μｇ、４は０．２μｇ、５は０．２５μｇを電気泳動した。６，７，８は１％ＣＴＡＢ処理、９、１０、１１は２％ＣＴＡＢ処理、１２、１３、１４は２．５％ＣＴＡＢ処理、１５、１６、１７は３％ＣＴＡＢ処理、１８、１９、２０は３．３％ＣＴＡＢ処理についての結果を示している。６は元の抽出液（５００μｌ）に対し、１／１０量（５０μｌ）の４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを添加しさらに１ＭとなるようＮａＣｌで調整して精製処理を行い、ＰＥＧ沈殿法により回収を行ったＲＮＡ溶液についての結果であり、７は元の抽出液（５００μｌ）に対し、１／５量（１００μｌ）の４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを添加しさらに１ＭとなるようＮａＣｌで調整して精製処理を行った結果、８は１Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ存在下で精製処理を行い、ＰＥＧ沈殿法により回収を行った結果について示している。同様に９、１２、１５、１８は１／１０量の４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを添加して１Ｍに調整して行った精製処理の結果、１０、１３、１６、１９は１／５量の４Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａを添加した結果、１１、１４、１７、２０は１Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ存在下での精製処理を示す。
【図１６】本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程における塩の種類およびＮａイオン濃度がＲＮＡ回収率に及ぼす影響を比較した結果を示すグラフである。
【図１７】本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程が東北大学森林土壌由来の腐植物質除去に及ぼす効果を比較した結果を示すグラフであり、（ａ）は、ＲＮＡ溶液と腐植物質抽出液との混合液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程の除タンパク後の上清における腐植物質除去効果を比較した結果を示し、（ｂ）は、ＲＮＡ溶液と腐植物質抽出液との混合液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程後、ＰＥＧ沈殿により回収したＲＮＡ溶液における腐植物質除去効果を比較した結果を示し、（ｃ）は本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程がＲＮＡ回収率に及ぼす効果を比較した結果を示す。
【図１８】本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程に係るＲＮＡ精製工程が栃木森林土壌由来の腐植物質除去に及ぼす効果を比較した結果を示すグラフであり、（ａ）は、ＲＮＡ溶液と腐植物質抽出液との混合液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程の除タンパク後の上清における腐植物質除去効果を比較した結果を示し、（ｂ）は、ＲＮＡ溶液と腐植物質抽出液との混合液に対する、本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程後、ＰＥＧ沈殿により回収したＲＮＡ溶液における腐植物質除去効果を比較した結果を示し、（ｃ）は本発明の一実施形態のＲＮＡ精製工程がＲＮＡ回収率に及ぼす効果を比較した結果を示す。
【図１９】（ａ）は、栃木森林土壌由来の腐植物質を用いた、ＰＥＧまたはＬｉＣｌ法によるＲＮＡ回収法の腐植物質除去効果に及ぼす影響を比較した結果を示すグラフであり、（ｂ）は、栃木森林土壌由来の腐植物質を用いた、ＰＥＧまたはＬｉＣｌ法によるＲＮＡ回収法のＲＮＡ回収率に及ぼす影響を比較した結果を示すグラフである。
【図２０】（ａ）は、東北大学森林土壌由来の腐植物質を用いた、ＰＥＧまたはＬｉＣｌ法によるＲＮＡ回収法の腐植物質除去効果に及ぼす影響を比較した結果を示すグラフであり、（ｂ）はＣＴＡＢによる精製処理を行わず、クロロホルムによる除タンパク処理のみを行い、２−プロパノールの等量添加により回収したＲＮＡ溶液であり、（ｃ）は、栃木森林土壌由来の腐植物質を用いた、ＰＥＧまたはＬｉＣｌ法によるＲＮＡ回収法のＲＮＡ回収率に及ぼす影響を比較した結果を示すグラフである。
【図２１】実施例において用いた土壌の性状を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
陽イオン性界面活性剤をＲＮＡ抽出液へ添加してＲＮＡ溶液を調製する第１工程、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）存在下にて該ＲＮＡ溶液からＲＮＡを回収する第２工程を包含することを特徴とするＲＮＡ精製法。
【請求項２】
前記陽イオン性界面活性剤がセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）であることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡ精製法。
【請求項３】
前記ＣＴＡＢの濃度が２％（ｗ／ｖ）以上であることを特徴とする請求項２に記載のＲＮＡ精製法。
【請求項４】
前記ＰＥＧの濃度が５〜１５％（ｗ／ｖ）の範囲内であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のＲＮＡ精製法。
【請求項５】
第１工程が０．５〜１．２５Ｍの範囲内の塩存在下にて行われることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＮＡ精製法。
【請求項６】
第１工程がｐＨ５．０〜６．５の範囲内で行われることを特徴とする請求項５に記載のＲＮＡ精製法。
【請求項７】
第２工程がｐＨ７．０以上にて行われることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のＲＮＡ精製法。
【請求項８】
前記ＲＮＡ抽出液が、ＳＤＳ抽出またはグアニジンチオシアネート抽出によって得られたものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のＲＮＡ精製法。
【請求項９】
回収したＲＮＡを限外濾過に供する工程をさらに包含することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のＲＮＡ精製法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡ抽出液が、土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥および糞便からなる群より選択される少なくとも１つに由来することを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡ精製法。
【請求項１１】
陽イオン性界面活性剤およびＰＥＧを備えていることを特徴とするＲＮＡ精製キット。
【請求項１２】
前記陽イオン性界面活性剤がＣＴＡＢであることを特徴とする請求項１１に記載のＲＮＡ精製キット。
【請求項１３】
弱酸性環境を提供し得る緩衝液または緩衝化能を有する塩をさらに備えていることを特徴とする請求項１１に記載のＲＮＡ精製キット。
【請求項１４】
アルカリ性環境を提供し得る緩衝液または緩衝化能を有する塩をさらに備えていることを特徴とする請求項１１に記載のＲＮＡ精製キット。
【請求項１】
陽イオン性界面活性剤をＲＮＡ抽出液へ添加してＲＮＡ溶液を調製する第１工程、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）存在下にて該ＲＮＡ溶液からＲＮＡを回収する第２工程を包含することを特徴とするＲＮＡ精製法。
【請求項２】
前記陽イオン性界面活性剤がセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）であることを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡ精製法。
【請求項３】
前記ＣＴＡＢの濃度が２％（ｗ／ｖ）以上であることを特徴とする請求項２に記載のＲＮＡ精製法。
【請求項４】
前記ＰＥＧの濃度が５〜１５％（ｗ／ｖ）の範囲内であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のＲＮＡ精製法。
【請求項５】
第１工程が０．５〜１．２５Ｍの範囲内の塩存在下にて行われることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＮＡ精製法。
【請求項６】
第１工程がｐＨ５．０〜６．５の範囲内で行われることを特徴とする請求項５に記載のＲＮＡ精製法。
【請求項７】
第２工程がｐＨ７．０以上にて行われることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のＲＮＡ精製法。
【請求項８】
前記ＲＮＡ抽出液が、ＳＤＳ抽出またはグアニジンチオシアネート抽出によって得られたものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のＲＮＡ精製法。
【請求項９】
回収したＲＮＡを限外濾過に供する工程をさらに包含することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のＲＮＡ精製法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡ抽出液が、土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥および糞便からなる群より選択される少なくとも１つに由来することを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡ精製法。
【請求項１１】
陽イオン性界面活性剤およびＰＥＧを備えていることを特徴とするＲＮＡ精製キット。
【請求項１２】
前記陽イオン性界面活性剤がＣＴＡＢであることを特徴とする請求項１１に記載のＲＮＡ精製キット。
【請求項１３】
弱酸性環境を提供し得る緩衝液または緩衝化能を有する塩をさらに備えていることを特徴とする請求項１１に記載のＲＮＡ精製キット。
【請求項１４】
アルカリ性環境を提供し得る緩衝液または緩衝化能を有する塩をさらに備えていることを特徴とする請求項１１に記載のＲＮＡ精製キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２００９−８２０６６（Ｐ２００９−８２０６６Ａ）
【公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２５５９２１（Ｐ２００７−２５５９２１）
【出願日】平成１９年９月２８日（２００７．９．２８）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月２８日（２００７．９．２８）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
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