変異インテグラーゼを有するレトロ因子
【課題】インテグラーゼ活性を欠損したレトロ因子、当該レトロ因子を含む細胞、レトロ因子によって引き起こされる疾患の発症を予防もしくは遅延させるか、または当該疾患を治療するための医薬組成物、および意図していない対象への感染がなく安全で、かつ簡便な遺伝子サイレンシング法のためのベクターなどを提供する。
【解決手段】遺伝子構造的にレトロウイルスに類似するＬＴＲ型レトロトランスポゾン、詳細には、イネいもち病菌（Magnaporthe grisea；Pyricularia griseaまたはPyricularia oryzae）に由来するｇｙｐｓｙ型のＬＴＲ型レトロトランスポゾン、ＭＡＧＧＹにおいて、インテグラーゼの特定のアミノ酸領域に変異を導入することによってインテグラーゼ活性を欠失した変異体のうち、ＲＮＡｉを誘導する。
【解決手段】遺伝子構造的にレトロウイルスに類似するＬＴＲ型レトロトランスポゾン、詳細には、イネいもち病菌（Magnaporthe grisea；Pyricularia griseaまたはPyricularia oryzae）に由来するｇｙｐｓｙ型のＬＴＲ型レトロトランスポゾン、ＭＡＧＧＹにおいて、インテグラーゼの特定のアミノ酸領域に変異を導入することによってインテグラーゼ活性を欠失した変異体のうち、ＲＮＡｉを誘導する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インテグラーゼ活性を欠損したレトロ因子、それらを含む核酸構築物、および当該核酸構築物で形質転換した細胞に関するものである。本発明はさらに、本発明のレトロ因子または当該レトロ因子を有する核酸構築物を含む、レトロ因子によって引き起こされる疾患の発症を予防もしくは遅延するか、または当該疾患を治療するための医薬組成物、ならびに上記レトロ因子または上記核酸構築物を用いた遺伝子サイレンシング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉：RNA interference）は、細胞内に２本鎖ＲＮＡが存在することによって配列特異的な遺伝子発現抑制が誘導されることであり、その機構は酵母からヒトに及ぶ広範な生物種で保存されている。ＲＮＡｉ機構はウイルスなどの侵入に対する防御機構として進化してきたとする説が一般的であり、ＲＮＡｉ機構の中間産物であるｓｉＲＮＡを用いた種々の研究において、レトロウイルスを含む様々なウイルスの増殖抑制効果を示唆する報告がなされている（非特許文献１を参照のこと）。
【０００３】
レトロウイルスの中でも、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：Human Immunodeficiency Virus）は、マクロファージ、樹状細胞およびＣＤ４ Ｔ細胞といった免疫細胞に感染し、これら細胞を破壊することが知られている。これにより被感染者はカリニ肺炎のような日和見感染症に代表される後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ：Acquired Immunodeficiency Syndrome）と呼ばれる重度の免疫不全状態に陥る。
【０００４】
ＨＩＶ感染症の発症を予防もしくは遅延するか、または当該感染症を治療するための様々な方法が開発されており、いくつかの抗ウイルス剤が臨床において既に用いられている。近年、ＨＩＶワクチンについてもその必要性は高まっているが、開発されたワクチンのＨＩＶタイプに対する特異性の問題やＨＩＶの変異頻度の高さから、未だ有効なワクチンの開発には至っていない。
【０００５】
一方で、タンパク質の機能解析を目的として特定の遺伝子の発現を抑制する遺伝子サイレンシング（gene silencing）を行うことは研究分野において広く用いられているストラテジーであり、ウイルス感染を利用してＲＮＡｉを誘導する手法としては、動物においてアデノ随伴ウイルスを用いる手法や、植物においてタバコ ラットル ウイルス（tabacco rattle virus）をベースにしたＶＩＧＳ法（Virus-Induced Gene Silencing）などが知られている（非特許文献２）。
【０００６】
しかし、これらの手法はウイルス感染を利用しているので、感染によって引き起こされる副次的な作用を排除することができずにいる。また、感染性を維持したウイルスを用いる場合、意図しない個体への感染の可能性があり、安全性の問題が指摘されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ウイルス 第５５巻 第１号: pp.1-8, 2005
【非特許文献２】Plant Cell, 27(2): 209-19, 2008
【非特許文献３】Mol Gen Genet, 26;251(6): 665-74, 1996
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の解決課題は、遺伝子操作技術を用いて変異を導入することでインテグラーゼ活性を欠損したレトロ因子を用いて、ＨＩＶなどのレトロ因子によって引き起こされる疾患の発症を予防もしくは遅延するか、または当該疾患を治療する上でより有効なワクチンを提供することであった。また、本発明の解決課題は、インテグラーゼ活性を欠損していることによって意図していない対象への感染がなく安全な遺伝子サイレンシング法を提供することにあった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、遺伝子構造的にレトロウイルスに類似するＬＴＲ型レトロトランスポゾン、詳細には、イネいもち病菌（Magnaporthe grisea；Pyricularia griseaまたはPyricularia oryzae）に由来するｇｙｐｓｙ型のＬＴＲ型レトロトランスポゾン、ＭＡＧＧＹ（非特許文献３）において、インテグラーゼの特定のアミノ酸領域に変異を導入することによってインテグラーゼ活性を欠失した変異体のうち、ＲＮＡｉを誘導するものを発見した。また、驚くべきことに、レトロウイルスにおいても同様の変異体がＲＮＡｉを誘導することを発見し、本発明を完成するに至った。これらのレトロ因子を用いることで、患者のＲＮＡｉ機構のみならず、免疫系をも介した、ＨＩＶなどのレトロ因子によって引き起こされる疾患の発症を予防もしくは遅延するか、または当該疾患を治療することが可能になった。また、これらのレトロ因子を用いることで意図していない対象への感染や新たな転移による遺伝子破壊等がなく安全で、かつ使用するベクターの構築に一度のクローニングしか必要としない簡便な遺伝子サイレンシング法が可能になった。
【００１０】
すなわち、本発明は下記に関するものである：
（１）インテグラーゼ活性を欠損したレトロ因子；
（２）インテグラーゼの触媒活性中心領域において変異が生じているものである、（１）に記載のレトロ因子；
（３）インテグラーゼ活性を欠損したＬＴＲ型レトロトランスポゾン；
（４）前記ＬＴＲ型レトロトランスポゾンがｇｙｐｓｙ型である、（３）に記載のＬＴＲ型レトロトランスポゾン；
（５）前記ＬＴＲ型レトロトランスポゾンがイネ科植物いもち病菌由来である、（３）または（４）に記載のＬＴＲ型レトロトランスポゾン；
（６）インテグラーゼの触媒活性中心領域において変異が生じている、（３）〜（５）のいずれかに記載のＬＴＲ型レトロトランスポゾン；
（７）インテグラーゼのアミノ酸配列において、前記ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードするヌクレオチド配列（配列番号１）の４２８４〜４２８６番目に対応するアミノ酸位置、４４６４〜４４６６番目に対応するアミノ酸位置および４５７２〜４５７４番目に対応するアミノ酸位置の少なくとも１つにて欠失、置換または付加が生じているものである、（６）に記載のＬＴＲ型レトロトランスポゾン；
（８）（３）〜（７）のいずれかに記載のＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードするヌクレオチド配列を有する核酸構築物；
（９）（８）に記載の核酸構築物で形質転換した細胞；
（１０）（８）に記載の核酸構築物を用いた遺伝子サイレンシング法；
（１１）インテグラーゼ活性を欠損したレトロウイルス；
（１２）前記レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：Human Immunodeficiency Virus）である、（１１）に記載のレトロウイルス；
（１３）前記レトロウイルスがＨＩＶ−１である、（１２）に記載のレトロウイルス；
（１４）インテグラーゼの触媒活性中心領域において変異が生じている、（１１）〜（１３）のいずれか１項に記載のレトロウイルス；
（１５）インテグラーゼのアミノ酸配列（配列番号３）において、６４番目のアミノ酸位置、１１６番目のアミノ酸位置および１５２番目のアミノ酸位置の少なくとも１つにて欠失、置換または付加が生じているものである、（１４）に記載のレトロウイルス；
（１６）（１１）〜（１５）のいずれかに記載のレトロウイルスを感染させた細胞；
（１７）（１１）〜（１５）のいずれかに記載のレトロウイルスを用いた遺伝子サイレンシング法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ＲＮＡｉ機構のみならず、免疫系をも介した、ＨＩＶなどのレトロ因子によって引き起こされる疾患の発症を予防もしくは遅延するか、または当該疾患を治療する上でより有効性の高い医薬組成物が提供される。また、意図していない対象への感染や新たな転移による遺伝子破壊等がなく安全で、かつ簡便な遺伝子サイレンシング法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＭＡＧＧＹおよびその変異体の遺伝子構造を示す。
【図２】図２は、ＭＡＧＧＹ変異体のＲＮＡｉ誘導能を示す。各変異体について、複数の株から得られた結果を示している。
【図３】図３Ａは、各株におけるＭＡＧＧＹが有する保存アミノ酸およびそれらに対して導入した変異を示す。図３Ｂは、ＭＡＧＧＹアミノ酸置換体のＲＮＡｉ誘導能を示す。各変異体について、複数の株から得られた結果を示している。
【図４】図４は、ＭＡＧＧＹのコピー数とＲＮＡｉ誘導能の関係を示す。各変異体のレーンについて、複数の株から得られた結果を示している。
【図５】図５は、細胞内でのＭＡＧＧＹに由来するｍＲＮＡの蓄積を示す。各変異体について、複数の株から得られた結果を示している。
【図６】図６は、ＨＩＶアミノ酸置換体のＲＮＡｉ誘導能を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
すなわち、本発明は、第１の態様において、インテグラーゼ活性を欠損したレトロ因子に関する。本発明のレトロ因子は、その両端に同方向反復配列（ＬＴＲ：Long Terminal Repeat）を有し、ＬＴＲ領域に存在するプロモーターの活性により転写され、ＲＮＡ中間体から逆転写された後にインテグラーゼによってゲノムＤＮＡに挿入される転移因子であればよい。本発明のレトロ因子としては、例えば、ＬＴＲ型レトロトランスポゾン、およびエンベロープタンパク質をコードするｅｎｖ遺伝子をさらに有するレトロウイルスが挙げられる。また、本発明のレトロ因子は、逆転写酵素によって合成されたヌクレオチド配列を宿主ゲノムに組込む活性が欠損したものであればいずれでもよい。例えば、インテグラーゼのＺｎフィンガー領域、触媒活性中心領域、または非特異的ＤＮＡ結合領域のいずれかに変異が生じていてもよいが、好ましくは、インテグラーゼの触媒活性中心領域にて変異が生じているものである。
【００１４】
なお、本発明のレトロ因子は、ＤＮＡ上にコードされている形態、および転移中間体としてＲＮＡ上にコードされている形態またはウイルス粒子形態のいずれでもよい。
【００１５】
また、本発明のレトロ因子がコードするインテグラーゼは、逆転写酵素によって合成したヌクレオチド配列を宿主ゲノムに組込む活性が欠損したものであればいずれでもよい。
【００１６】
本発明は、第２の態様において、インテグラーゼ活性を欠損したＬＴＲ型レトロトランスポゾンに関する。ＬＴＲ型レトロトランスポゾンは、逆転写酵素のほかにＲＮａｓｅＨ、インテグラーゼをコードするが、それぞれをコードするヌクレオチド配列上のドメインの配置によってｇｙｐｓｙ型またはｃｏｐｉａ型に分類される。ｇｙｐｓｙ型のＬＴＲ型レトロトランスポゾンとしては、ショウジョウバエのｇｙｐｓｙ因子、出芽酵母のＴｙ３が挙げられる。また、ｃｏｐｉａ型のＬＴＲ型レトロトランスポゾンとしては、ショウジョウバエのｃｏｐｉａ因子、出芽酵母のＴｙ１が挙げられる。本発明のＬＴＲ型レトロトランスポゾンは、ｇｙｐｓｙ型およびｃｏｐｉａ型のいずれのＬＴＲ型レトロトランスポゾンでもよいが、好ましくはｇｙｐｓｙ型のＬＴＲ型レトロトランスポゾンである。また、本発明のレトロトランスポゾンはいずれの生物種に由来してもよいが、好ましくはいもち病菌由来であって、より好ましくはイネいもち病菌由来である。最も好ましくは、本発明のレトロトランスポゾンは、イネいもち病菌に由来する、ｇｙｐｓｙ型のＬＴＲ型レトロトランスポゾンであって、例えば、配列番号１で示すヌクレオチド配列によってコードされるＭＡＧＧＹである。
【００１７】
本発明のＬＴＲ型レトロトランスポゾンは、逆転写酵素によって合成されたヌクレオチド配列を宿主ゲノムに組込む活性が欠損したものであればいずれでもよい。例えば、インテグラーゼのＺｎフィンガー領域、触媒活性中心領域、または非特異的ＤＮＡ結合領域のいずれかに変異が生じていてもよいが、好ましくは、インテグラーゼの触媒活性中心領域にて変異が生じているものである。例えば、上記ＭＡＧＧＹがコードするインテグラーゼのアミノ酸配列において、上記ＭＡＧＧＹをコードするヌクレオチド配列（配列番号１）の４２８４〜４２８６番目に対応するアミノ酸位置（Ａｓｐ）、４４６４〜４４６６番目に対応するアミノ酸位置（Ａｓｐ）および４５７２〜４５７４番目に対応するアミノ酸位置（Ｇｌｕ）の少なくとも１つにて欠失、置換または付加が生じているＬＴＲ型レトロトランスポゾンであってもよく、好ましくは４４６４〜４４６６番目に対応するアミノ酸位置（Ａｓｐ）および／または４５７２〜４５７４番目に対応するアミノ酸位置（Ｇｌｕ）にて欠失、置換または付加が生じているＬＴＲ型レトロトランスポゾンであるが、これらに限定されるものではない。上記アミノ酸位置での置換は、いずれのアミノ酸残基によるものでもよい。
【００１８】
本発明のＬＴＲ型レトロトランスポゾンは上記以外の変異体を包含する。すなわち、変異体は上記のアミノ酸位置のほかに変異を生じているものであって、上記と同等の機能を有するものである。例えば、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは４個、さらに好ましくは３個、最も好ましくは２個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するＬＴＲ型レトロトランスポゾンであってもよい。あるいは、変異体は、一般に、上記ＭＡＧＧＹと少なくとも５０％の相同性を有するヌクレオチド配列を有するレトロトランスポゾンであってもよく、好ましくは６０％、より好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、もっとも好ましくは９０％以上（例えば、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％など）の相同性を有するヌクレオチド配列を有するレトロトランスポゾンであってもよい。
【００１９】
上記のようなヌクレオチド配列の相同性は、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ジェネティクス製）を用いて測定することができる。
【００２０】
あるいは、前記変異体は、変異していないヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を有するレトロトランスポゾンであってもよい。上記ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーションおよび／またはハイブリダイゼーション後の洗浄に用いる溶液の組成、温度などによって決定され得る条件であって、当業者によって適宜設定され得る。例えば、J. Sambrook et al.,“Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition”, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されるような条件が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液（Denhardt's solution）、０．５％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、５０℃、より好ましくは６８℃にてプローブとハイブリダイズさせた後で、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの溶液中で室温にて洗浄してもよいが、ストリンジェンシーを増大させるために、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄してもよい。あるいは、ハイブリダイズさせた後で、６５℃で、２×ＳＳＰＥ（Frederick M. Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, 1987, John Wiley & Sons, Hoboken NJ.に記載）および０．１％ ＳＤＳを含む溶液中で１５分を２回、次いで０．５×ＳＳＰＥおよび０．１％ ＳＤＳを含む溶液中でさらに１５分を２回、さらに０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ ＳＤＳを含む溶液中で１５分を２回洗浄してもよく、ストリンジェンシーを増大させるために、好ましくは、６５℃で、２×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳおよびホルムアミド（５〜５０％）を含む溶液中で１５分を２回、０．５×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳおよびホルムアミド（５〜５０％）を含む溶液中でさらに１５分を２回、次いで０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳおよびホルムアミド（５〜５０％）を含む溶液中で１５分を２回洗浄を行ってもよい。
【００２１】
本発明は、第３の態様において、本発明のレトロトランスポゾンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物、および本発明のレトロトランスポゾンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸フラグメントまたは当該核酸構築物で形質転換した細胞に関する。本発明の核酸構築物を作製するために、いかなるベクターまたはプラスミドを使用してもよく、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ ＩＩ（＋）、ｐＵＣ１９およびｐＢＲ３２２などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、本発明のレトロトランスポゾンは、遺伝子サイレンシング法にて使用するために、所望のヌクレオチド配列をさらに有してもよい。例えば、特定の遺伝子のセンス鎖またはアンチセンス鎖をコードするヌクレオチド配列を有してもよい。これらの所望のヌクレオチド配列は、所望の遺伝子サイレンシング効果が得られる限り、ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードするヌクレオチド配列上であればいずれの部位に存在してもでもよい。上記ＭＡＧＧＹをコードするヌクレオチド配列において、ＯＲＦ２領域と３’ＵＴＲ領域との間の非翻訳領域（ＵＴＲ）であってもよく、例えば、配列番号１で示すヌクレオチド配列の５３５８番目から５３８５番目の間であってもよい。
【００２２】
さらに、本発明の細胞は、例えば、大腸菌、植物細胞などの宿主細胞を上記フラグメントまたは核酸構築物を用いて形質転換することにより製造することができる。核酸構築物を用いた細胞の形質転換には、当該分野において既知の方法を使用すればよい。例えば、上記フラグメントまたは核酸構築物を細胞に直接導入する種々の物理的方法および化学的方法であってもよい。例えば、物理的方法としては、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法やマイクロインジェクション法が挙げられ、化学的方法としては、ポリエチレングリコールを用いる方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、形質転換細胞の選抜、および所望の細胞の獲得には、当該分野において既知の方法を用いてもよい。また、形質転換細胞の選抜のために、当該核酸構築物は選択マーカーをさらに含むか、当該核酸構築物とは別の、選択マーカーを有するベクターで細胞を同時形質転換してもよい。本発明で使用し得る選択マーカーとしては、ハイグロマイシンＢ、ジェネティシン（Ｇ４１８）、およびベノミルやピリチアミンなどが挙げられる。
【００２３】
なお、本発明のレトロトランスポゾンは、ＤＮＡ上にコードされている形態、転移中間体としてＲＮＡ上にコードされる形態のいずれでもよい。
【００２４】
本発明は、第４の態様において、上記核酸構築物を用いた遺伝子サイレンシング法に関する。所望のヌクレオチド配列を有する本発明のレトロトランスポゾンを目的の細胞に導入すればよく、目的の細胞は、いずれの生物種由来のものでもよい。上記核酸構築物の細胞への導入には、当該分野において既知の方法を使用すればよい。
【００２５】
本発明は、第５の態様において、インテグラーゼ活性を欠損したレトロウイルスに関する。本発明のレトロウイルスは、ゲノムＲＮＡをＤＮＡに変換する生活環を有し、かつゲノムＲＮＡ中に逆転写酵素をコードしているものであればいずれでもよい。例えば、本発明のレトロウイルスとしては、ＲＮＡガンウイルスのほかに、スプマウイルス属およびレンチウイルス属レトロウイルスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＲＮＡガンウイルスとしては、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ：Rous Sarcoma Virus）、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ：Avian Leukosis Virus）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ：Murine Lekemia Virus)、マウス肉腫ウイルス（Ｈ−ＭＳＶ：Harvey Murine Sarcoma Virus）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ：Mouse Mammary Tumor Virus)、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ：Human T cell Leukemia Virus)、ウシ白血病ウイルス（Bovine Leukemia Virus）などが挙げられる。スプマウイルス属ウイルスとしては、チンパンジー泡沫状ウイルスなどが挙げられる。また、レンチウイルス属レトロウイルスとしては、ＨＩＶ、ネコ免疫不全ウイルス(ＦＩＶ：Feline Immunodeficiency Virus）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ：Simmian Immunodeficiency Virus）、ウマ免疫不全ウイルス（ＥＩＶ：Equine Immunodeficiency Virus）、およびウシ免疫不全ウイルス(ＢＩＶ：Bovine Imuunodeficiency Virus)などが挙げられる。好ましくは、本発明のレトロウイルはレンチウイルス属レトロウイルスであって、より好ましくはＨＩＶである。さらに、ＨＩＶはＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のいずれでもよいが、より好ましくはＨＩＶ−１であって、さらに好ましくは配列番号２で示すヌクレオチド配列を有するＨＩＶ−１ ＮＹ５／ＢＲＵ（ＬＡＶ−１）組換えクローンｐＮＬ４−３（Human immunodeficiency virus type 1, NY5/BRU (LAV-1) recombinant clone pNL4-3）株である。
【００２６】
さらに、本発明のレトロウイルスは、逆転写酵素によって合成されたヌクレオチド配列を宿主ゲノムに組込む活性が欠損したものであればいずれでもよい。例えば、インテグラーゼのＺｎフィンガー領域、触媒活性中心領域、または非特異的ＤＮＡ結合領域のいずれかに変異が生じていてもよいが、好ましくは、インテグラーゼの触媒活性中心領域に変異が生じているものである。上記ＨＩＶ−１ ＮＹ５／ＢＲＵ（ＬＡＶ−１）組換えクローンｐＮＬ４−３株がコードするインテグラーゼのアミノ酸配列（配列番号３）において、６４番目のアミノ酸位置（Ａｓｐ）、１１６番目のアミノ酸位置（Ａｓｐ）および１５２番目のアミノ酸位置（Ｇｌｕ）の少なくとも１つにて欠失、置換または付加が生じているレトロウイルスであってもよく、好ましくは、１１６番目のアミノ酸位置（Ａｓｐ）および／または１５２番目のアミノ酸位置（Ｇｌｕ）にて欠失、置換または付加が生じているレトロウイルスでもよいが、これらに限定されるものではない。上記アミノ酸位置の置換は、いずれのアミノ酸残基によるものでもよい。
【００２７】
本発明のレトロウイルスは上記以外の変異体を包含する。すなわち、変異体は上記のアミノ酸位置のほかに変異を生じているものであって、上記と同等の機能を有するものである。例えば、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは４個、さらに好ましくは３個、最も好ましくは２個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加されたヌクレオチド配列によってコードされるレトロウイルスであってもよい。あるいは、変異体は、一般に、上記ＨＩＶ−１ ＮＹ５／ＢＲＵ（ＬＡＶ−１）組換えクローンｐＮＬ４−３株をコードするヌクレオチド配列と少なくとも５０％の相同性を有するヌクレオチド配列を有するレトロウイルスであってもよく、好ましくは６０％、より好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、もっとも好ましくは９０％以上（例えば、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％など）の相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされるレトロウイルスであってもよい。あるいは、変異体は、変異していないヌクレオチド配列に上記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列によってコードされるレトロウイルスであってもよい。
【００２８】
また、本発明のレトロウイルスは、遺伝子サイレンシングで使用するために、所望のヌクレオチド配列をさらに有してもよい。例えば、目的の遺伝子のセンス鎖またはアンチセンス鎖をコードするヌクレオチド配列を有していてもよい。これらの所望のヌクレオチド配列は、所望の遺伝子サイレンシング効果が得られる限り、レトロウイルスをコードするヌクレオチド配列上であればいずれの部位に存在してもよい。例えば、配列番号２で示すヌクレオチド配列の５０９７番目から６２２０番目の間に存在してもよい。あるいは、所望の遺伝子サイレンシング効果が得られる限り、レトロウイルスが有する、例えば、ｅｎｖ遺伝子またはｎｅｆ遺伝子配列などを上記ヌクレオチド配列で作動可能に置換してもよい。
【００２９】
なお、本発明のレトロウイルスは、宿主のゲノムＤＮＡ上にコードされている形態、ウイルス粒子状の形態のいずれでもよい。
【００３０】
本発明は、第６の態様において、本発明のレトロウイルスを感染させた細胞に関する。本発明の細胞は、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などの宿主細胞を上記レトロウイルスに感染させることによって製造することができる。レトロウイルスの細胞への感染には、当該分野において既知の方法を使用すればよい。また、レトロウイルスに感染した細胞の選抜、および所望の細胞の取得には、公知の方法を用いてもよい。
【００３１】
本発明は、第７の態様において、本発明のレトロ因子を含む、レトロ因子によって引き起こされる疾患の発症を予防、遅延、および治療するための医薬組成物に関する。レトロ因子によって引き起こされる疾患としては、ヒトでは、ＨＴＬＶによるＨＴＬＶ関連脊髄症（ＨＡＭ：HTLV Associated Myelopathy)、ＨＩＶによるＡＩＤＳなどが挙げられる。
【００３２】
本発明は、第８の態様において、上記レトロウイルスを用いた遺伝子サイレンシング法に関する。所望のヌクレオチド配列を有する本発明のレトロウイルスを目的の細胞に感染させればよく、目的の細胞は、いずれの生物種由来のものでもよい。レトロウイルスの細胞への感染には、当該分野において既知の方法を使用すればよい。
【００３３】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００３４】
変異を導入したＭＡＧＧＹのＲＮＡｉ誘導能の検証
（１）ＭＡＧＧＹおよびその変異体を含むプラスミドの作製
ＭＡＧＧＹの全長を含むプラスミドｐＭＧＹ７０（Genetics,153, 693-703, 1999）を制限酵素ＳａｌＩおよびＳｔｕＩによって切断し、セルフライゲーションさせて、ＭＡＧＧＹのｇａｇ遺伝子内部をコードする領域（配列番号１で示すヌクレオチド配列の５３９番目から８８８番目）を欠失させて、ＧＡＧ変異体（ｐＭＧＹ-ΔＧＡＧ）を作製した。上記ｐＭＧＹ７０を制限酵素ＥｃｏＲＶによって切断し、セルフライゲーションさせ、ＭＡＧＧＹの逆転写酵素内部をコードする領域（配列番号１で示すヌクレオチド配列の２２４１番目から２７５３番目）を欠失させて、ＲＴ変異体（ｐＭＧＹ-ΔＲＴ）を作製した。上記ｐＭＧＹ７０を制限酵素ＥｃｏＥ６５Ｉによって切断し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、セルフライゲーションさせて５塩基対を挿入し、ＭＡＧＧＹのインテグラーゼのＮ末端側をコードする領域（配列番号１で示すヌクレオチド配列の４０９３番目）にてフレームシフトを生じさせ、インテグラーゼの読み枠の途中で終止コドンを有するＩＮＴ変異体（ｐＭＧＹ-ΔＩＮＴ）を作製した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ-Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、ＭＡＧＧＹがコードするインテグラーゼＣ末端側のクロモドメインモチーフをコードする領域中のチミン（配列番号１で示すヌクレオチド配列の５２４４番目）をグアニンに置換して、Ｔ５２４４Ｇ変異体（ｐＭＧＹ-Ｔ５２４４Ｇ）を作製した。
【００３５】
（２）形質転換体の作製および検証
ＭＡＧＧＹ因子を保有しないイネ科植物いもち病菌株（Ｂｒ４８）を、ＣＭ液体培地（０．３％カザミノ酸、０．３％酵母エキス、０．５％スクロース）にて、２６℃、５日間培養した。培養した液体培地を４層のガーゼによって濾過した。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌのＬｙｚｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ（Ｓｉｇｍａ社）を含むＳＴＣバッファー（１Ｍ ソルビトール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＣａＣｌ２）にて３時間振盪し、いもち病菌をプロトプラスト化した。菌体処理液を４層のガーゼで濾過し、濾液としてプロトプラストを回収した。回収した菌体を遠心分離（２，０００×ｇ、５分間）し、ＳＴＣバッファーを用いて１回洗浄した。氷上にて、得られたプロトプラスト液１００μｌにＭＡＧＧＹまたはその変異体を含むプラスミド約５μｇを加えた。また、形質転換の選択マーカーとして、ハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミド（ｐＳＨ７５）約５μｇを加えた。当該混合物を氷上にて１０分静置した。この混合物に、ＰＥＧ溶液（６０％ポリエチレングリコール ３３５０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、５０ｍＭ ＣａＣｌ２）１００μｌ、２００μｌ、４００μｌおよび８００μｌを懸濁しながら段階的に添加し、氷上にて１５分間静置した。遠心分離（２０００ｇ、５分間）によってプロトプラストを沈殿させ、回収したプロトプラスト液をＳＴＣバッファー１００μｌに再懸濁した。
【００３６】
得られたプロトプラスト液を、５０℃にて温浴したＣＭ培地（１％寒天を含む）と混合した後で、シャーレに注いだ。作製したシャーレを２６℃にて一晩培養した後で、５００μｇ／μｌのハイグロマイシンを含むＣＭ寒天培地を重層し、さらに３〜４日間、２６℃にて培養した。ハイグロマイシンを含んだ培地上に形成された形質転換体のコロニーをＣＭ液体培地にて４〜５日培養した後で、菌体を回収した。回収した菌体を液体窒素の存在下で磨砕し、菌体１００ｍｇあたりＴｒｉ−ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ社）１ｍｌを加え、混和した。５分間静置した後で、クロロホルム０．２ｍｌを加えて、ボルテックスで３０秒間混合した。遠心分離（１０，０００ｇ、１５分間）した後に、回収した上清にイソプロパノール２ｍｌを加えて、沈殿としてＲＮＡを得た。７５％エタノールによって沈殿を洗浄し、乾燥させた後で、３０〜５０μｌ程度のＤＥＰＣ処理水に溶解させた。得られたＲＮＡを１７．５％の尿素／アクリルアミド変性ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ＴＢＥバッファーを使用し、低分子ＲＮＡを含むゲルの下半分をトランスブロット装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）によってＨｙｂｏｎｄ−Ｎｘ（ＧＥヘルスケア社）に転写した。ランダムプライム法で調製した３２ＰラベルのＭＡＧＧＹ用プローブを、ＵｌｔｒａＨｙｂハイブリ溶液（Ａｍｂｉｏｎ社）中にて、４２℃で一晩ハイブリダイズさせた。得られたメンブレンを洗浄し、ＭＡＧＧＹ配列に由来するｓｉＲＮＡを検出した。マーカーとして２１ｎｔおよび２６ｎｔのＭＡＧＧＹ配列を持つオリゴＤＮＡを用いた。
【００３７】
（３）検証結果
結果を図２に示す。転移能を欠くｐＭＧＹ-ΔＧＡＧ、ｐＭＧＹ-ΔＲＴおよびｐＭＧＹ-ΔＩＮＴでは、著しいｓｉＲＮＡ蓄積量の減少が認められており、ＲＮＡｉの誘導能が失われているか、または大幅に低下していることが示唆された。また、転移効率が著しく低下したｐＭＧＹ-Ｔ５２４４Ｇでは、野生株と比べてｓｉＲＮＡ蓄積量がわずかながら減少しているものの、ＲＮＡｉを誘導することが示された。
【実施例２】
【００３８】
変異インテグラーゼを有するＭＡＧＧＹのＲＮＡｉ誘導能の検証
（１）ＭＡＧＧＹおよびその変異体を含むプラスミドの作製
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ-Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、変異体を作製した。配列番号１に示すヌクレオチド配列の４１８５番目および４１９４番目のチミンを、配列番号４および５でそれぞれ示すプライマーを用いてグアニンに置換して、インテグラーゼのＮ末端領域に存在するＺｎフィンガー様モチーフの二つのシステインを共にグリシンに置換したΔＨ２Ｃ２変異体を作製した。配列番号１に示すヌクレオチド配列の４４６４番目のグアニンを、配列番号６および７でそれぞれ示すプライマーを用いてチミジンに置換して、インテグラーゼの活性中心モチーフ中のアスパラギン酸をチロシンに置換したＤｄＥ変異体を作製した。配列番号１で示すヌクレオチド配列の４５７３番目のアデニンを、配列番号８および９でそれぞれ示すプライマーを用いてチミンに置換して、インテグラーゼの活性中心モチーフ中のグルタミン酸をシステインに置換したＤＤｅ変異体を作製した。配列番号１で示すヌクレオチド配列のグアニンおよび４５７３番目のアデニンを、上記変異体の作製に用いたプライマーを用いてそれぞれチミンに置換して、インテグラーゼの活性中心モチーフに存在するアスパラギン酸をチロシンに置換し、かつグルタミン酸をシステインに置換したＤｄｅ変異体を作製した。
【００３９】
（２）形質転換体の作製および検証
実施例１（２）と同様の方法によって、形質転換体を作製し、ＲＮＡｉ誘導能を検証した。
【００４０】
（３）検証結果
結果を図３に示す。ΔＨ２Ｃ２変異体においてｓｉＲＮＡ蓄積量が著しく減少しており、ＲＮＡｉの誘導能が失われているか、または大幅に低下していることが示唆された。インテグラーゼの触媒活性中心領域の変異体であるＤｄＥ変異体およびＤｄｅ変異体では、ｓｉＲＮＡ蓄積量が低下したものの、ＲＮＡｉを誘導していることが示された。一方、ＤＤｅ変異体では野生型と同等のｓｉＲＮＡの蓄積が認められ、強いＲＮＡｉ誘導能を保持していることが示された。
【実施例３】
【００４１】
変異インテグラーゼを有するＭＡＧＧＹのコピー数とＲＮＡｉ誘導能の間の相関の検証
（１）ＭＡＧＧＹおよびその変異体を含むプラスミドの作製
実施例１（１）および実施例２（１）で作製した変異体を用いた。
【００４２】
（２）形質転換体の作製および検証
ゲノムＤＮＡの解析は、サザン法によって行った。Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＶＩＯＧＥＮＥ社）を用いて、実施例１（２）で示す方法で培養した菌体からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡ約２μｇをＥｃｏＲＩで３７℃、１時間処理した後で、ＴＡＥ ０．９％ アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後のゲルに対してアルカリ処理（０．５Ｎ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）を施し、次いで中和処理（１Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１．５Ｍ ＮａＣｌ）を行い、キャピラリートランスファーによって、ゲル中のゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン（ＨＹＢＯＮＤ-Ｎｘ）に転写した。ＭＡＧＧＹ配列の検出は、３２ＰラベルしたＭＡＧＧＹ断片（配列番号１で示すヌクレオチド配列の４６６０〜５３４８番目）をプローブとして用いることによって行った。
【００４３】
（３）検証結果
結果を図４に示す。ゲノム中の各因子の数は１〜１０コピー程度と推定されたが、蓄積されるｓｉＲＮＡの量、すなわち誘導されるＲＮＡｉの強度は、ゲノム中のコピー数とほとんど相関はなかった。むしろ導入された変異体のタイプによって規定されていることが示された。誘起されたＲＮＡｉの強度は、図２および３で示すものとほぼ合致するものであった。
【実施例４】
【００４４】
細胞内でのＭＡＧＧＹに由来するｍＲＮＡの蓄積の検証
（１）ＭＡＧＧＹおよびその変異体を含むプラスミドの作製
実施例１（１）および実施例２（１）で作製した変異体を用いた。
【００４５】
（２）形質転換体の作製および検証
実施例１（２）と同様の方法により形質転換体を作製した。ノーザン法によりＭＡＧＧＹ ｍＲＮＡの解析を行った。ＱＩＡＧＥＮ社のＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ ｋｉｔを用いて、実施例１（２）で示す方法で培養した菌体から全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ約１０μｇを、ホルムアルデヒド／ＭＯＰＳ変性１％アガロースゲルを用いた電気泳動に供した。キャピラリートランスファーを用いて、泳動後のゲルからナイロンメンブレン（ＨＹＢＯＮＤ-Ｎｘ）にＲＮＡを転写した。ＭＡＧＧＹ配列の検出は、３２ＰラベルされたＭＡＧＧＹの断片（配列番号１で示すヌクレオチド配列の４６６０〜５３４８番目）をプローブとして用いることによって行った。
【００４６】
（３）検証結果
結果を図５に示す。野生株（ＷＴ）に比べて、ＲＮＡｉをほとんど誘起していないｐＭＧＹ-ΔＧＡＧ、ｐＭＧＹ-ΔＲＴおよびｐＭＧＹ-ΔＩＮＴでは多量のＭＡＧＧＹ ｍＲＮＡの蓄積が認められた。これらは、ＲＮＡｉによるｍＲＮＡの分解が起こっていないか、またはその程度が軽微であることが原因であると考えられる。一方で、ＲＮＡｉの誘導が認められたＤＤｅ変異体およびＤｄｅ変異体では、ＭＡＧＧＹ ｍＲＮＡの蓄積量の減少とＲＮＡｉの誘導に相関関係が認められた。
【実施例５】
【００４７】
変異インテグラーゼを有するＨＩＶのＲＮＡｉ誘導能の検証
（１）変異インテグラーゼを有するＨＩＶ−１の作製
ＨＩＶ-１の感染性クローン（ＨＩＶ−１ ＮＹ５／ＢＲＵ（ＬＡＶ−１）組換えクローンｐＮＬ４−３）をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドｐＮＬ４-３（J. Virol, 59, 284-291, 1986）由来の４．３ｋｂフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（ストラタジーン社製）にサブクローニングした。塩基置換Ｔ７−ＧＥＮ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ(Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を用いて、上記プラスミドに変異を導入し、ＨＩＶ−１インテグラーゼＤ１１６Ｇ変異体（ＤｄＥ）を作製した。上記Ｄ１１６Ｇ変異体では、ＨＩＶ-１インテグラーゼの触媒活性中心領域に存在するアスパラギン酸（配列番号３で示すアミノ酸配列の１１６番目）がグリシンに置換されている。
【００４８】
野生型ＨＩＶ-１またはＤ１１６Ｇ変異体をコードするプラスミドＤＮＡ １μｇ、およびマウス白血病ウイルス アンホトロピックエンベロープ発現ベクター（ｐＤＪ−１）１μｇをリポフェクトアミン（ＢＲＬ社製）１０μｌと混合し、３０℃にて３０分間反応させた。この反応物を２９３Ｔ細胞に加え、トランスフェクションさせた。トランスフェクションを６時間行った後で、１０％子牛血清を含むＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium）４ｍｌを加えて、さらに培養した。培養を４８時間行った後で、２９３Ｔ細胞から培養液中に放出されたシュードタイプウイルスを含む培養液の上清を回収し、０．４５μｍのフィルターで濾過した。４μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅで処理したものを、シュードタイプウイルス液とした。
【００４９】
（２）形質転換体の作製および検証
ＴＨＰ-１細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ １２-ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３-ａｃｅｔａｔｅ）で処理することによってマクロファージ様に分化させた細胞を、１×１０６細胞あたり２０ｐｍｏｌｅのＤｉｃｅｒ１またはＤｉｃｅｒ２ ｓｉＲＮＡ、およびコントロールｓｉＲＮＡ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｍｅｄｉｕｍ ＧＣ Ｄｕｐｌｅｘ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））で処理した。ｓｉＲＮＡで処理した細胞を、シュードタイプウイルス液と混合し、３７℃で６時間静置し、感染させた。シュードタイプウイルスに感染させたＴＨＰ-１細胞をＰＢＳで３回洗浄した後で、培養液に再懸濁した。２４時間培養した後で、全ての感染細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１×ルシフェラーゼ溶解液（プロメガ社製）２００μｌを加えて溶解した。この溶解液１０μｌをｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ Ｍｏｎｏｌｉｇｈｔ ２０１０（カリフォルニア州のサンディエゴのアナリティカル・ルミネッセンス・ラボラトリー社製）を用いるルシフェラーゼアッセイ法に供し、ウイルス遺伝子発現量を測定した。
【００５０】
（３）検証結果
結果を図６に示す。野生株では、Ｄｉｃｅｒ１およびＤｉｃｅｒ２ ｓｉＲＮＡの処理によってルシフェラーゼ活性が約２倍に増加した。ＨＩＶ-１がＲＮＡｉ誘導し、その結果感染が抑制されていることが示唆された。また、Ｄ１１６Ｇ変異体では、Ｄｉｃｅｒ１およびＤｉｃｅｒ２ ｓｉＲＮＡの処理によって、ルシフェラーゼ活性が約２０倍、または約１０倍それぞれ増高した。Ｄ１１６Ｇ変異体もまたＲＮＡｉを誘導する能力を保持していることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明により、インテグラーゼ活性を欠損したレトロ因子によりＲＮＡｉが誘導されるので、レトロ因子によって引き起こされる疾患の発症を予防もしくは遅延させるか、または当該疾患を治療するための医薬組成物の分野において利用可能である。また、意図していない対象への感染、および新たな転移がなく安全で、かつ簡便な遺伝子サイレンシング法の分野においても利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００５２】
SEQ ID NO: 4-9 ; PCR primer.
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インテグラーゼ活性を欠損したレトロ因子、それらを含む核酸構築物、および当該核酸構築物で形質転換した細胞に関するものである。本発明はさらに、本発明のレトロ因子または当該レトロ因子を有する核酸構築物を含む、レトロ因子によって引き起こされる疾患の発症を予防もしくは遅延するか、または当該疾患を治療するための医薬組成物、ならびに上記レトロ因子または上記核酸構築物を用いた遺伝子サイレンシング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉：RNA interference）は、細胞内に２本鎖ＲＮＡが存在することによって配列特異的な遺伝子発現抑制が誘導されることであり、その機構は酵母からヒトに及ぶ広範な生物種で保存されている。ＲＮＡｉ機構はウイルスなどの侵入に対する防御機構として進化してきたとする説が一般的であり、ＲＮＡｉ機構の中間産物であるｓｉＲＮＡを用いた種々の研究において、レトロウイルスを含む様々なウイルスの増殖抑制効果を示唆する報告がなされている（非特許文献１を参照のこと）。
【０００３】
レトロウイルスの中でも、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：Human Immunodeficiency Virus）は、マクロファージ、樹状細胞およびＣＤ４ Ｔ細胞といった免疫細胞に感染し、これら細胞を破壊することが知られている。これにより被感染者はカリニ肺炎のような日和見感染症に代表される後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ：Acquired Immunodeficiency Syndrome）と呼ばれる重度の免疫不全状態に陥る。
【０００４】
ＨＩＶ感染症の発症を予防もしくは遅延するか、または当該感染症を治療するための様々な方法が開発されており、いくつかの抗ウイルス剤が臨床において既に用いられている。近年、ＨＩＶワクチンについてもその必要性は高まっているが、開発されたワクチンのＨＩＶタイプに対する特異性の問題やＨＩＶの変異頻度の高さから、未だ有効なワクチンの開発には至っていない。
【０００５】
一方で、タンパク質の機能解析を目的として特定の遺伝子の発現を抑制する遺伝子サイレンシング（gene silencing）を行うことは研究分野において広く用いられているストラテジーであり、ウイルス感染を利用してＲＮＡｉを誘導する手法としては、動物においてアデノ随伴ウイルスを用いる手法や、植物においてタバコ ラットル ウイルス（tabacco rattle virus）をベースにしたＶＩＧＳ法（Virus-Induced Gene Silencing）などが知られている（非特許文献２）。
【０００６】
しかし、これらの手法はウイルス感染を利用しているので、感染によって引き起こされる副次的な作用を排除することができずにいる。また、感染性を維持したウイルスを用いる場合、意図しない個体への感染の可能性があり、安全性の問題が指摘されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ウイルス 第５５巻 第１号: pp.1-8, 2005
【非特許文献２】Plant Cell, 27(2): 209-19, 2008
【非特許文献３】Mol Gen Genet, 26;251(6): 665-74, 1996
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の解決課題は、遺伝子操作技術を用いて変異を導入することでインテグラーゼ活性を欠損したレトロ因子を用いて、ＨＩＶなどのレトロ因子によって引き起こされる疾患の発症を予防もしくは遅延するか、または当該疾患を治療する上でより有効なワクチンを提供することであった。また、本発明の解決課題は、インテグラーゼ活性を欠損していることによって意図していない対象への感染がなく安全な遺伝子サイレンシング法を提供することにあった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、遺伝子構造的にレトロウイルスに類似するＬＴＲ型レトロトランスポゾン、詳細には、イネいもち病菌（Magnaporthe grisea；Pyricularia griseaまたはPyricularia oryzae）に由来するｇｙｐｓｙ型のＬＴＲ型レトロトランスポゾン、ＭＡＧＧＹ（非特許文献３）において、インテグラーゼの特定のアミノ酸領域に変異を導入することによってインテグラーゼ活性を欠失した変異体のうち、ＲＮＡｉを誘導するものを発見した。また、驚くべきことに、レトロウイルスにおいても同様の変異体がＲＮＡｉを誘導することを発見し、本発明を完成するに至った。これらのレトロ因子を用いることで、患者のＲＮＡｉ機構のみならず、免疫系をも介した、ＨＩＶなどのレトロ因子によって引き起こされる疾患の発症を予防もしくは遅延するか、または当該疾患を治療することが可能になった。また、これらのレトロ因子を用いることで意図していない対象への感染や新たな転移による遺伝子破壊等がなく安全で、かつ使用するベクターの構築に一度のクローニングしか必要としない簡便な遺伝子サイレンシング法が可能になった。
【００１０】
すなわち、本発明は下記に関するものである：
（１）インテグラーゼ活性を欠損したレトロ因子；
（２）インテグラーゼの触媒活性中心領域において変異が生じているものである、（１）に記載のレトロ因子；
（３）インテグラーゼ活性を欠損したＬＴＲ型レトロトランスポゾン；
（４）前記ＬＴＲ型レトロトランスポゾンがｇｙｐｓｙ型である、（３）に記載のＬＴＲ型レトロトランスポゾン；
（５）前記ＬＴＲ型レトロトランスポゾンがイネ科植物いもち病菌由来である、（３）または（４）に記載のＬＴＲ型レトロトランスポゾン；
（６）インテグラーゼの触媒活性中心領域において変異が生じている、（３）〜（５）のいずれかに記載のＬＴＲ型レトロトランスポゾン；
（７）インテグラーゼのアミノ酸配列において、前記ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードするヌクレオチド配列（配列番号１）の４２８４〜４２８６番目に対応するアミノ酸位置、４４６４〜４４６６番目に対応するアミノ酸位置および４５７２〜４５７４番目に対応するアミノ酸位置の少なくとも１つにて欠失、置換または付加が生じているものである、（６）に記載のＬＴＲ型レトロトランスポゾン；
（８）（３）〜（７）のいずれかに記載のＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードするヌクレオチド配列を有する核酸構築物；
（９）（８）に記載の核酸構築物で形質転換した細胞；
（１０）（８）に記載の核酸構築物を用いた遺伝子サイレンシング法；
（１１）インテグラーゼ活性を欠損したレトロウイルス；
（１２）前記レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：Human Immunodeficiency Virus）である、（１１）に記載のレトロウイルス；
（１３）前記レトロウイルスがＨＩＶ−１である、（１２）に記載のレトロウイルス；
（１４）インテグラーゼの触媒活性中心領域において変異が生じている、（１１）〜（１３）のいずれか１項に記載のレトロウイルス；
（１５）インテグラーゼのアミノ酸配列（配列番号３）において、６４番目のアミノ酸位置、１１６番目のアミノ酸位置および１５２番目のアミノ酸位置の少なくとも１つにて欠失、置換または付加が生じているものである、（１４）に記載のレトロウイルス；
（１６）（１１）〜（１５）のいずれかに記載のレトロウイルスを感染させた細胞；
（１７）（１１）〜（１５）のいずれかに記載のレトロウイルスを用いた遺伝子サイレンシング法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ＲＮＡｉ機構のみならず、免疫系をも介した、ＨＩＶなどのレトロ因子によって引き起こされる疾患の発症を予防もしくは遅延するか、または当該疾患を治療する上でより有効性の高い医薬組成物が提供される。また、意図していない対象への感染や新たな転移による遺伝子破壊等がなく安全で、かつ簡便な遺伝子サイレンシング法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＭＡＧＧＹおよびその変異体の遺伝子構造を示す。
【図２】図２は、ＭＡＧＧＹ変異体のＲＮＡｉ誘導能を示す。各変異体について、複数の株から得られた結果を示している。
【図３】図３Ａは、各株におけるＭＡＧＧＹが有する保存アミノ酸およびそれらに対して導入した変異を示す。図３Ｂは、ＭＡＧＧＹアミノ酸置換体のＲＮＡｉ誘導能を示す。各変異体について、複数の株から得られた結果を示している。
【図４】図４は、ＭＡＧＧＹのコピー数とＲＮＡｉ誘導能の関係を示す。各変異体のレーンについて、複数の株から得られた結果を示している。
【図５】図５は、細胞内でのＭＡＧＧＹに由来するｍＲＮＡの蓄積を示す。各変異体について、複数の株から得られた結果を示している。
【図６】図６は、ＨＩＶアミノ酸置換体のＲＮＡｉ誘導能を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
すなわち、本発明は、第１の態様において、インテグラーゼ活性を欠損したレトロ因子に関する。本発明のレトロ因子は、その両端に同方向反復配列（ＬＴＲ：Long Terminal Repeat）を有し、ＬＴＲ領域に存在するプロモーターの活性により転写され、ＲＮＡ中間体から逆転写された後にインテグラーゼによってゲノムＤＮＡに挿入される転移因子であればよい。本発明のレトロ因子としては、例えば、ＬＴＲ型レトロトランスポゾン、およびエンベロープタンパク質をコードするｅｎｖ遺伝子をさらに有するレトロウイルスが挙げられる。また、本発明のレトロ因子は、逆転写酵素によって合成されたヌクレオチド配列を宿主ゲノムに組込む活性が欠損したものであればいずれでもよい。例えば、インテグラーゼのＺｎフィンガー領域、触媒活性中心領域、または非特異的ＤＮＡ結合領域のいずれかに変異が生じていてもよいが、好ましくは、インテグラーゼの触媒活性中心領域にて変異が生じているものである。
【００１４】
なお、本発明のレトロ因子は、ＤＮＡ上にコードされている形態、および転移中間体としてＲＮＡ上にコードされている形態またはウイルス粒子形態のいずれでもよい。
【００１５】
また、本発明のレトロ因子がコードするインテグラーゼは、逆転写酵素によって合成したヌクレオチド配列を宿主ゲノムに組込む活性が欠損したものであればいずれでもよい。
【００１６】
本発明は、第２の態様において、インテグラーゼ活性を欠損したＬＴＲ型レトロトランスポゾンに関する。ＬＴＲ型レトロトランスポゾンは、逆転写酵素のほかにＲＮａｓｅＨ、インテグラーゼをコードするが、それぞれをコードするヌクレオチド配列上のドメインの配置によってｇｙｐｓｙ型またはｃｏｐｉａ型に分類される。ｇｙｐｓｙ型のＬＴＲ型レトロトランスポゾンとしては、ショウジョウバエのｇｙｐｓｙ因子、出芽酵母のＴｙ３が挙げられる。また、ｃｏｐｉａ型のＬＴＲ型レトロトランスポゾンとしては、ショウジョウバエのｃｏｐｉａ因子、出芽酵母のＴｙ１が挙げられる。本発明のＬＴＲ型レトロトランスポゾンは、ｇｙｐｓｙ型およびｃｏｐｉａ型のいずれのＬＴＲ型レトロトランスポゾンでもよいが、好ましくはｇｙｐｓｙ型のＬＴＲ型レトロトランスポゾンである。また、本発明のレトロトランスポゾンはいずれの生物種に由来してもよいが、好ましくはいもち病菌由来であって、より好ましくはイネいもち病菌由来である。最も好ましくは、本発明のレトロトランスポゾンは、イネいもち病菌に由来する、ｇｙｐｓｙ型のＬＴＲ型レトロトランスポゾンであって、例えば、配列番号１で示すヌクレオチド配列によってコードされるＭＡＧＧＹである。
【００１７】
本発明のＬＴＲ型レトロトランスポゾンは、逆転写酵素によって合成されたヌクレオチド配列を宿主ゲノムに組込む活性が欠損したものであればいずれでもよい。例えば、インテグラーゼのＺｎフィンガー領域、触媒活性中心領域、または非特異的ＤＮＡ結合領域のいずれかに変異が生じていてもよいが、好ましくは、インテグラーゼの触媒活性中心領域にて変異が生じているものである。例えば、上記ＭＡＧＧＹがコードするインテグラーゼのアミノ酸配列において、上記ＭＡＧＧＹをコードするヌクレオチド配列（配列番号１）の４２８４〜４２８６番目に対応するアミノ酸位置（Ａｓｐ）、４４６４〜４４６６番目に対応するアミノ酸位置（Ａｓｐ）および４５７２〜４５７４番目に対応するアミノ酸位置（Ｇｌｕ）の少なくとも１つにて欠失、置換または付加が生じているＬＴＲ型レトロトランスポゾンであってもよく、好ましくは４４６４〜４４６６番目に対応するアミノ酸位置（Ａｓｐ）および／または４５７２〜４５７４番目に対応するアミノ酸位置（Ｇｌｕ）にて欠失、置換または付加が生じているＬＴＲ型レトロトランスポゾンであるが、これらに限定されるものではない。上記アミノ酸位置での置換は、いずれのアミノ酸残基によるものでもよい。
【００１８】
本発明のＬＴＲ型レトロトランスポゾンは上記以外の変異体を包含する。すなわち、変異体は上記のアミノ酸位置のほかに変異を生じているものであって、上記と同等の機能を有するものである。例えば、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは４個、さらに好ましくは３個、最も好ましくは２個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するＬＴＲ型レトロトランスポゾンであってもよい。あるいは、変異体は、一般に、上記ＭＡＧＧＹと少なくとも５０％の相同性を有するヌクレオチド配列を有するレトロトランスポゾンであってもよく、好ましくは６０％、より好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、もっとも好ましくは９０％以上（例えば、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％など）の相同性を有するヌクレオチド配列を有するレトロトランスポゾンであってもよい。
【００１９】
上記のようなヌクレオチド配列の相同性は、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ジェネティクス製）を用いて測定することができる。
【００２０】
あるいは、前記変異体は、変異していないヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を有するレトロトランスポゾンであってもよい。上記ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーションおよび／またはハイブリダイゼーション後の洗浄に用いる溶液の組成、温度などによって決定され得る条件であって、当業者によって適宜設定され得る。例えば、J. Sambrook et al.,“Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition”, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されるような条件が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液（Denhardt's solution）、０．５％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、５０℃、より好ましくは６８℃にてプローブとハイブリダイズさせた後で、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの溶液中で室温にて洗浄してもよいが、ストリンジェンシーを増大させるために、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄してもよい。あるいは、ハイブリダイズさせた後で、６５℃で、２×ＳＳＰＥ（Frederick M. Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, 1987, John Wiley & Sons, Hoboken NJ.に記載）および０．１％ ＳＤＳを含む溶液中で１５分を２回、次いで０．５×ＳＳＰＥおよび０．１％ ＳＤＳを含む溶液中でさらに１５分を２回、さらに０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ ＳＤＳを含む溶液中で１５分を２回洗浄してもよく、ストリンジェンシーを増大させるために、好ましくは、６５℃で、２×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳおよびホルムアミド（５〜５０％）を含む溶液中で１５分を２回、０．５×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳおよびホルムアミド（５〜５０％）を含む溶液中でさらに１５分を２回、次いで０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳおよびホルムアミド（５〜５０％）を含む溶液中で１５分を２回洗浄を行ってもよい。
【００２１】
本発明は、第３の態様において、本発明のレトロトランスポゾンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物、および本発明のレトロトランスポゾンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸フラグメントまたは当該核酸構築物で形質転換した細胞に関する。本発明の核酸構築物を作製するために、いかなるベクターまたはプラスミドを使用してもよく、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ ＩＩ（＋）、ｐＵＣ１９およびｐＢＲ３２２などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、本発明のレトロトランスポゾンは、遺伝子サイレンシング法にて使用するために、所望のヌクレオチド配列をさらに有してもよい。例えば、特定の遺伝子のセンス鎖またはアンチセンス鎖をコードするヌクレオチド配列を有してもよい。これらの所望のヌクレオチド配列は、所望の遺伝子サイレンシング効果が得られる限り、ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードするヌクレオチド配列上であればいずれの部位に存在してもでもよい。上記ＭＡＧＧＹをコードするヌクレオチド配列において、ＯＲＦ２領域と３’ＵＴＲ領域との間の非翻訳領域（ＵＴＲ）であってもよく、例えば、配列番号１で示すヌクレオチド配列の５３５８番目から５３８５番目の間であってもよい。
【００２２】
さらに、本発明の細胞は、例えば、大腸菌、植物細胞などの宿主細胞を上記フラグメントまたは核酸構築物を用いて形質転換することにより製造することができる。核酸構築物を用いた細胞の形質転換には、当該分野において既知の方法を使用すればよい。例えば、上記フラグメントまたは核酸構築物を細胞に直接導入する種々の物理的方法および化学的方法であってもよい。例えば、物理的方法としては、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法やマイクロインジェクション法が挙げられ、化学的方法としては、ポリエチレングリコールを用いる方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、形質転換細胞の選抜、および所望の細胞の獲得には、当該分野において既知の方法を用いてもよい。また、形質転換細胞の選抜のために、当該核酸構築物は選択マーカーをさらに含むか、当該核酸構築物とは別の、選択マーカーを有するベクターで細胞を同時形質転換してもよい。本発明で使用し得る選択マーカーとしては、ハイグロマイシンＢ、ジェネティシン（Ｇ４１８）、およびベノミルやピリチアミンなどが挙げられる。
【００２３】
なお、本発明のレトロトランスポゾンは、ＤＮＡ上にコードされている形態、転移中間体としてＲＮＡ上にコードされる形態のいずれでもよい。
【００２４】
本発明は、第４の態様において、上記核酸構築物を用いた遺伝子サイレンシング法に関する。所望のヌクレオチド配列を有する本発明のレトロトランスポゾンを目的の細胞に導入すればよく、目的の細胞は、いずれの生物種由来のものでもよい。上記核酸構築物の細胞への導入には、当該分野において既知の方法を使用すればよい。
【００２５】
本発明は、第５の態様において、インテグラーゼ活性を欠損したレトロウイルスに関する。本発明のレトロウイルスは、ゲノムＲＮＡをＤＮＡに変換する生活環を有し、かつゲノムＲＮＡ中に逆転写酵素をコードしているものであればいずれでもよい。例えば、本発明のレトロウイルスとしては、ＲＮＡガンウイルスのほかに、スプマウイルス属およびレンチウイルス属レトロウイルスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＲＮＡガンウイルスとしては、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ：Rous Sarcoma Virus）、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ：Avian Leukosis Virus）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ：Murine Lekemia Virus)、マウス肉腫ウイルス（Ｈ−ＭＳＶ：Harvey Murine Sarcoma Virus）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ：Mouse Mammary Tumor Virus)、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ：Human T cell Leukemia Virus)、ウシ白血病ウイルス（Bovine Leukemia Virus）などが挙げられる。スプマウイルス属ウイルスとしては、チンパンジー泡沫状ウイルスなどが挙げられる。また、レンチウイルス属レトロウイルスとしては、ＨＩＶ、ネコ免疫不全ウイルス(ＦＩＶ：Feline Immunodeficiency Virus）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ：Simmian Immunodeficiency Virus）、ウマ免疫不全ウイルス（ＥＩＶ：Equine Immunodeficiency Virus）、およびウシ免疫不全ウイルス(ＢＩＶ：Bovine Imuunodeficiency Virus)などが挙げられる。好ましくは、本発明のレトロウイルはレンチウイルス属レトロウイルスであって、より好ましくはＨＩＶである。さらに、ＨＩＶはＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のいずれでもよいが、より好ましくはＨＩＶ−１であって、さらに好ましくは配列番号２で示すヌクレオチド配列を有するＨＩＶ−１ ＮＹ５／ＢＲＵ（ＬＡＶ−１）組換えクローンｐＮＬ４−３（Human immunodeficiency virus type 1, NY5/BRU (LAV-1) recombinant clone pNL4-3）株である。
【００２６】
さらに、本発明のレトロウイルスは、逆転写酵素によって合成されたヌクレオチド配列を宿主ゲノムに組込む活性が欠損したものであればいずれでもよい。例えば、インテグラーゼのＺｎフィンガー領域、触媒活性中心領域、または非特異的ＤＮＡ結合領域のいずれかに変異が生じていてもよいが、好ましくは、インテグラーゼの触媒活性中心領域に変異が生じているものである。上記ＨＩＶ−１ ＮＹ５／ＢＲＵ（ＬＡＶ−１）組換えクローンｐＮＬ４−３株がコードするインテグラーゼのアミノ酸配列（配列番号３）において、６４番目のアミノ酸位置（Ａｓｐ）、１１６番目のアミノ酸位置（Ａｓｐ）および１５２番目のアミノ酸位置（Ｇｌｕ）の少なくとも１つにて欠失、置換または付加が生じているレトロウイルスであってもよく、好ましくは、１１６番目のアミノ酸位置（Ａｓｐ）および／または１５２番目のアミノ酸位置（Ｇｌｕ）にて欠失、置換または付加が生じているレトロウイルスでもよいが、これらに限定されるものではない。上記アミノ酸位置の置換は、いずれのアミノ酸残基によるものでもよい。
【００２７】
本発明のレトロウイルスは上記以外の変異体を包含する。すなわち、変異体は上記のアミノ酸位置のほかに変異を生じているものであって、上記と同等の機能を有するものである。例えば、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは４個、さらに好ましくは３個、最も好ましくは２個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加されたヌクレオチド配列によってコードされるレトロウイルスであってもよい。あるいは、変異体は、一般に、上記ＨＩＶ−１ ＮＹ５／ＢＲＵ（ＬＡＶ−１）組換えクローンｐＮＬ４−３株をコードするヌクレオチド配列と少なくとも５０％の相同性を有するヌクレオチド配列を有するレトロウイルスであってもよく、好ましくは６０％、より好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、もっとも好ましくは９０％以上（例えば、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％など）の相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされるレトロウイルスであってもよい。あるいは、変異体は、変異していないヌクレオチド配列に上記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列によってコードされるレトロウイルスであってもよい。
【００２８】
また、本発明のレトロウイルスは、遺伝子サイレンシングで使用するために、所望のヌクレオチド配列をさらに有してもよい。例えば、目的の遺伝子のセンス鎖またはアンチセンス鎖をコードするヌクレオチド配列を有していてもよい。これらの所望のヌクレオチド配列は、所望の遺伝子サイレンシング効果が得られる限り、レトロウイルスをコードするヌクレオチド配列上であればいずれの部位に存在してもよい。例えば、配列番号２で示すヌクレオチド配列の５０９７番目から６２２０番目の間に存在してもよい。あるいは、所望の遺伝子サイレンシング効果が得られる限り、レトロウイルスが有する、例えば、ｅｎｖ遺伝子またはｎｅｆ遺伝子配列などを上記ヌクレオチド配列で作動可能に置換してもよい。
【００２９】
なお、本発明のレトロウイルスは、宿主のゲノムＤＮＡ上にコードされている形態、ウイルス粒子状の形態のいずれでもよい。
【００３０】
本発明は、第６の態様において、本発明のレトロウイルスを感染させた細胞に関する。本発明の細胞は、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などの宿主細胞を上記レトロウイルスに感染させることによって製造することができる。レトロウイルスの細胞への感染には、当該分野において既知の方法を使用すればよい。また、レトロウイルスに感染した細胞の選抜、および所望の細胞の取得には、公知の方法を用いてもよい。
【００３１】
本発明は、第７の態様において、本発明のレトロ因子を含む、レトロ因子によって引き起こされる疾患の発症を予防、遅延、および治療するための医薬組成物に関する。レトロ因子によって引き起こされる疾患としては、ヒトでは、ＨＴＬＶによるＨＴＬＶ関連脊髄症（ＨＡＭ：HTLV Associated Myelopathy)、ＨＩＶによるＡＩＤＳなどが挙げられる。
【００３２】
本発明は、第８の態様において、上記レトロウイルスを用いた遺伝子サイレンシング法に関する。所望のヌクレオチド配列を有する本発明のレトロウイルスを目的の細胞に感染させればよく、目的の細胞は、いずれの生物種由来のものでもよい。レトロウイルスの細胞への感染には、当該分野において既知の方法を使用すればよい。
【００３３】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００３４】
変異を導入したＭＡＧＧＹのＲＮＡｉ誘導能の検証
（１）ＭＡＧＧＹおよびその変異体を含むプラスミドの作製
ＭＡＧＧＹの全長を含むプラスミドｐＭＧＹ７０（Genetics,153, 693-703, 1999）を制限酵素ＳａｌＩおよびＳｔｕＩによって切断し、セルフライゲーションさせて、ＭＡＧＧＹのｇａｇ遺伝子内部をコードする領域（配列番号１で示すヌクレオチド配列の５３９番目から８８８番目）を欠失させて、ＧＡＧ変異体（ｐＭＧＹ-ΔＧＡＧ）を作製した。上記ｐＭＧＹ７０を制限酵素ＥｃｏＲＶによって切断し、セルフライゲーションさせ、ＭＡＧＧＹの逆転写酵素内部をコードする領域（配列番号１で示すヌクレオチド配列の２２４１番目から２７５３番目）を欠失させて、ＲＴ変異体（ｐＭＧＹ-ΔＲＴ）を作製した。上記ｐＭＧＹ７０を制限酵素ＥｃｏＥ６５Ｉによって切断し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、セルフライゲーションさせて５塩基対を挿入し、ＭＡＧＧＹのインテグラーゼのＮ末端側をコードする領域（配列番号１で示すヌクレオチド配列の４０９３番目）にてフレームシフトを生じさせ、インテグラーゼの読み枠の途中で終止コドンを有するＩＮＴ変異体（ｐＭＧＹ-ΔＩＮＴ）を作製した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ-Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、ＭＡＧＧＹがコードするインテグラーゼＣ末端側のクロモドメインモチーフをコードする領域中のチミン（配列番号１で示すヌクレオチド配列の５２４４番目）をグアニンに置換して、Ｔ５２４４Ｇ変異体（ｐＭＧＹ-Ｔ５２４４Ｇ）を作製した。
【００３５】
（２）形質転換体の作製および検証
ＭＡＧＧＹ因子を保有しないイネ科植物いもち病菌株（Ｂｒ４８）を、ＣＭ液体培地（０．３％カザミノ酸、０．３％酵母エキス、０．５％スクロース）にて、２６℃、５日間培養した。培養した液体培地を４層のガーゼによって濾過した。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌのＬｙｚｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ（Ｓｉｇｍａ社）を含むＳＴＣバッファー（１Ｍ ソルビトール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＣａＣｌ２）にて３時間振盪し、いもち病菌をプロトプラスト化した。菌体処理液を４層のガーゼで濾過し、濾液としてプロトプラストを回収した。回収した菌体を遠心分離（２，０００×ｇ、５分間）し、ＳＴＣバッファーを用いて１回洗浄した。氷上にて、得られたプロトプラスト液１００μｌにＭＡＧＧＹまたはその変異体を含むプラスミド約５μｇを加えた。また、形質転換の選択マーカーとして、ハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミド（ｐＳＨ７５）約５μｇを加えた。当該混合物を氷上にて１０分静置した。この混合物に、ＰＥＧ溶液（６０％ポリエチレングリコール ３３５０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、５０ｍＭ ＣａＣｌ２）１００μｌ、２００μｌ、４００μｌおよび８００μｌを懸濁しながら段階的に添加し、氷上にて１５分間静置した。遠心分離（２０００ｇ、５分間）によってプロトプラストを沈殿させ、回収したプロトプラスト液をＳＴＣバッファー１００μｌに再懸濁した。
【００３６】
得られたプロトプラスト液を、５０℃にて温浴したＣＭ培地（１％寒天を含む）と混合した後で、シャーレに注いだ。作製したシャーレを２６℃にて一晩培養した後で、５００μｇ／μｌのハイグロマイシンを含むＣＭ寒天培地を重層し、さらに３〜４日間、２６℃にて培養した。ハイグロマイシンを含んだ培地上に形成された形質転換体のコロニーをＣＭ液体培地にて４〜５日培養した後で、菌体を回収した。回収した菌体を液体窒素の存在下で磨砕し、菌体１００ｍｇあたりＴｒｉ−ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ社）１ｍｌを加え、混和した。５分間静置した後で、クロロホルム０．２ｍｌを加えて、ボルテックスで３０秒間混合した。遠心分離（１０，０００ｇ、１５分間）した後に、回収した上清にイソプロパノール２ｍｌを加えて、沈殿としてＲＮＡを得た。７５％エタノールによって沈殿を洗浄し、乾燥させた後で、３０〜５０μｌ程度のＤＥＰＣ処理水に溶解させた。得られたＲＮＡを１７．５％の尿素／アクリルアミド変性ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ＴＢＥバッファーを使用し、低分子ＲＮＡを含むゲルの下半分をトランスブロット装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）によってＨｙｂｏｎｄ−Ｎｘ（ＧＥヘルスケア社）に転写した。ランダムプライム法で調製した３２ＰラベルのＭＡＧＧＹ用プローブを、ＵｌｔｒａＨｙｂハイブリ溶液（Ａｍｂｉｏｎ社）中にて、４２℃で一晩ハイブリダイズさせた。得られたメンブレンを洗浄し、ＭＡＧＧＹ配列に由来するｓｉＲＮＡを検出した。マーカーとして２１ｎｔおよび２６ｎｔのＭＡＧＧＹ配列を持つオリゴＤＮＡを用いた。
【００３７】
（３）検証結果
結果を図２に示す。転移能を欠くｐＭＧＹ-ΔＧＡＧ、ｐＭＧＹ-ΔＲＴおよびｐＭＧＹ-ΔＩＮＴでは、著しいｓｉＲＮＡ蓄積量の減少が認められており、ＲＮＡｉの誘導能が失われているか、または大幅に低下していることが示唆された。また、転移効率が著しく低下したｐＭＧＹ-Ｔ５２４４Ｇでは、野生株と比べてｓｉＲＮＡ蓄積量がわずかながら減少しているものの、ＲＮＡｉを誘導することが示された。
【実施例２】
【００３８】
変異インテグラーゼを有するＭＡＧＧＹのＲＮＡｉ誘導能の検証
（１）ＭＡＧＧＹおよびその変異体を含むプラスミドの作製
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ-Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、変異体を作製した。配列番号１に示すヌクレオチド配列の４１８５番目および４１９４番目のチミンを、配列番号４および５でそれぞれ示すプライマーを用いてグアニンに置換して、インテグラーゼのＮ末端領域に存在するＺｎフィンガー様モチーフの二つのシステインを共にグリシンに置換したΔＨ２Ｃ２変異体を作製した。配列番号１に示すヌクレオチド配列の４４６４番目のグアニンを、配列番号６および７でそれぞれ示すプライマーを用いてチミジンに置換して、インテグラーゼの活性中心モチーフ中のアスパラギン酸をチロシンに置換したＤｄＥ変異体を作製した。配列番号１で示すヌクレオチド配列の４５７３番目のアデニンを、配列番号８および９でそれぞれ示すプライマーを用いてチミンに置換して、インテグラーゼの活性中心モチーフ中のグルタミン酸をシステインに置換したＤＤｅ変異体を作製した。配列番号１で示すヌクレオチド配列のグアニンおよび４５７３番目のアデニンを、上記変異体の作製に用いたプライマーを用いてそれぞれチミンに置換して、インテグラーゼの活性中心モチーフに存在するアスパラギン酸をチロシンに置換し、かつグルタミン酸をシステインに置換したＤｄｅ変異体を作製した。
【００３９】
（２）形質転換体の作製および検証
実施例１（２）と同様の方法によって、形質転換体を作製し、ＲＮＡｉ誘導能を検証した。
【００４０】
（３）検証結果
結果を図３に示す。ΔＨ２Ｃ２変異体においてｓｉＲＮＡ蓄積量が著しく減少しており、ＲＮＡｉの誘導能が失われているか、または大幅に低下していることが示唆された。インテグラーゼの触媒活性中心領域の変異体であるＤｄＥ変異体およびＤｄｅ変異体では、ｓｉＲＮＡ蓄積量が低下したものの、ＲＮＡｉを誘導していることが示された。一方、ＤＤｅ変異体では野生型と同等のｓｉＲＮＡの蓄積が認められ、強いＲＮＡｉ誘導能を保持していることが示された。
【実施例３】
【００４１】
変異インテグラーゼを有するＭＡＧＧＹのコピー数とＲＮＡｉ誘導能の間の相関の検証
（１）ＭＡＧＧＹおよびその変異体を含むプラスミドの作製
実施例１（１）および実施例２（１）で作製した変異体を用いた。
【００４２】
（２）形質転換体の作製および検証
ゲノムＤＮＡの解析は、サザン法によって行った。Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＶＩＯＧＥＮＥ社）を用いて、実施例１（２）で示す方法で培養した菌体からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡ約２μｇをＥｃｏＲＩで３７℃、１時間処理した後で、ＴＡＥ ０．９％ アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後のゲルに対してアルカリ処理（０．５Ｎ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）を施し、次いで中和処理（１Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１．５Ｍ ＮａＣｌ）を行い、キャピラリートランスファーによって、ゲル中のゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン（ＨＹＢＯＮＤ-Ｎｘ）に転写した。ＭＡＧＧＹ配列の検出は、３２ＰラベルしたＭＡＧＧＹ断片（配列番号１で示すヌクレオチド配列の４６６０〜５３４８番目）をプローブとして用いることによって行った。
【００４３】
（３）検証結果
結果を図４に示す。ゲノム中の各因子の数は１〜１０コピー程度と推定されたが、蓄積されるｓｉＲＮＡの量、すなわち誘導されるＲＮＡｉの強度は、ゲノム中のコピー数とほとんど相関はなかった。むしろ導入された変異体のタイプによって規定されていることが示された。誘起されたＲＮＡｉの強度は、図２および３で示すものとほぼ合致するものであった。
【実施例４】
【００４４】
細胞内でのＭＡＧＧＹに由来するｍＲＮＡの蓄積の検証
（１）ＭＡＧＧＹおよびその変異体を含むプラスミドの作製
実施例１（１）および実施例２（１）で作製した変異体を用いた。
【００４５】
（２）形質転換体の作製および検証
実施例１（２）と同様の方法により形質転換体を作製した。ノーザン法によりＭＡＧＧＹ ｍＲＮＡの解析を行った。ＱＩＡＧＥＮ社のＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ ｋｉｔを用いて、実施例１（２）で示す方法で培養した菌体から全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ約１０μｇを、ホルムアルデヒド／ＭＯＰＳ変性１％アガロースゲルを用いた電気泳動に供した。キャピラリートランスファーを用いて、泳動後のゲルからナイロンメンブレン（ＨＹＢＯＮＤ-Ｎｘ）にＲＮＡを転写した。ＭＡＧＧＹ配列の検出は、３２ＰラベルされたＭＡＧＧＹの断片（配列番号１で示すヌクレオチド配列の４６６０〜５３４８番目）をプローブとして用いることによって行った。
【００４６】
（３）検証結果
結果を図５に示す。野生株（ＷＴ）に比べて、ＲＮＡｉをほとんど誘起していないｐＭＧＹ-ΔＧＡＧ、ｐＭＧＹ-ΔＲＴおよびｐＭＧＹ-ΔＩＮＴでは多量のＭＡＧＧＹ ｍＲＮＡの蓄積が認められた。これらは、ＲＮＡｉによるｍＲＮＡの分解が起こっていないか、またはその程度が軽微であることが原因であると考えられる。一方で、ＲＮＡｉの誘導が認められたＤＤｅ変異体およびＤｄｅ変異体では、ＭＡＧＧＹ ｍＲＮＡの蓄積量の減少とＲＮＡｉの誘導に相関関係が認められた。
【実施例５】
【００４７】
変異インテグラーゼを有するＨＩＶのＲＮＡｉ誘導能の検証
（１）変異インテグラーゼを有するＨＩＶ−１の作製
ＨＩＶ-１の感染性クローン（ＨＩＶ−１ ＮＹ５／ＢＲＵ（ＬＡＶ−１）組換えクローンｐＮＬ４−３）をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドｐＮＬ４-３（J. Virol, 59, 284-291, 1986）由来の４．３ｋｂフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（ストラタジーン社製）にサブクローニングした。塩基置換Ｔ７−ＧＥＮ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ(Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を用いて、上記プラスミドに変異を導入し、ＨＩＶ−１インテグラーゼＤ１１６Ｇ変異体（ＤｄＥ）を作製した。上記Ｄ１１６Ｇ変異体では、ＨＩＶ-１インテグラーゼの触媒活性中心領域に存在するアスパラギン酸（配列番号３で示すアミノ酸配列の１１６番目）がグリシンに置換されている。
【００４８】
野生型ＨＩＶ-１またはＤ１１６Ｇ変異体をコードするプラスミドＤＮＡ １μｇ、およびマウス白血病ウイルス アンホトロピックエンベロープ発現ベクター（ｐＤＪ−１）１μｇをリポフェクトアミン（ＢＲＬ社製）１０μｌと混合し、３０℃にて３０分間反応させた。この反応物を２９３Ｔ細胞に加え、トランスフェクションさせた。トランスフェクションを６時間行った後で、１０％子牛血清を含むＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium）４ｍｌを加えて、さらに培養した。培養を４８時間行った後で、２９３Ｔ細胞から培養液中に放出されたシュードタイプウイルスを含む培養液の上清を回収し、０．４５μｍのフィルターで濾過した。４μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅで処理したものを、シュードタイプウイルス液とした。
【００４９】
（２）形質転換体の作製および検証
ＴＨＰ-１細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ １２-ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３-ａｃｅｔａｔｅ）で処理することによってマクロファージ様に分化させた細胞を、１×１０６細胞あたり２０ｐｍｏｌｅのＤｉｃｅｒ１またはＤｉｃｅｒ２ ｓｉＲＮＡ、およびコントロールｓｉＲＮＡ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｍｅｄｉｕｍ ＧＣ Ｄｕｐｌｅｘ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））で処理した。ｓｉＲＮＡで処理した細胞を、シュードタイプウイルス液と混合し、３７℃で６時間静置し、感染させた。シュードタイプウイルスに感染させたＴＨＰ-１細胞をＰＢＳで３回洗浄した後で、培養液に再懸濁した。２４時間培養した後で、全ての感染細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１×ルシフェラーゼ溶解液（プロメガ社製）２００μｌを加えて溶解した。この溶解液１０μｌをｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ Ｍｏｎｏｌｉｇｈｔ ２０１０（カリフォルニア州のサンディエゴのアナリティカル・ルミネッセンス・ラボラトリー社製）を用いるルシフェラーゼアッセイ法に供し、ウイルス遺伝子発現量を測定した。
【００５０】
（３）検証結果
結果を図６に示す。野生株では、Ｄｉｃｅｒ１およびＤｉｃｅｒ２ ｓｉＲＮＡの処理によってルシフェラーゼ活性が約２倍に増加した。ＨＩＶ-１がＲＮＡｉ誘導し、その結果感染が抑制されていることが示唆された。また、Ｄ１１６Ｇ変異体では、Ｄｉｃｅｒ１およびＤｉｃｅｒ２ ｓｉＲＮＡの処理によって、ルシフェラーゼ活性が約２０倍、または約１０倍それぞれ増高した。Ｄ１１６Ｇ変異体もまたＲＮＡｉを誘導する能力を保持していることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明により、インテグラーゼ活性を欠損したレトロ因子によりＲＮＡｉが誘導されるので、レトロ因子によって引き起こされる疾患の発症を予防もしくは遅延させるか、または当該疾患を治療するための医薬組成物の分野において利用可能である。また、意図していない対象への感染、および新たな転移がなく安全で、かつ簡便な遺伝子サイレンシング法の分野においても利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００５２】
SEQ ID NO: 4-9 ; PCR primer.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インテグラーゼ活性を欠損したレトロ因子。
【請求項２】
インテグラーゼの触媒活性中心領域において変異が生じているものである、請求項１に記載のレトロ因子。
【請求項３】
インテグラーゼ活性を欠損したＬＴＲ型レトロトランスポゾン。
【請求項４】
前記ＬＴＲ型レトロトランスポゾンがｇｙｐｓｙ型である、請求項３に記載のＬＴＲ型レトロトランスポゾン。
【請求項５】
前記ＬＴＲ型レトロトランスポゾンがイネ科植物いもち病菌由来である、請求項３または４に記載のＬＴＲ型レトロトランスポゾン。
【請求項６】
インテグラーゼの触媒活性中心領域において変異が生じている、請求項３〜５のいずれか１項に記載のＬＴＲ型レトロトランスポゾン。
【請求項７】
インテグラーゼのアミノ酸配列において、前記ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードするヌクレオチド配列（配列番号１）の４２８４〜４２８６番目に対応するアミノ酸位置、４４６４〜４４６６番目に対応するアミノ酸位置および４５７２〜４５７４番目に対応するアミノ酸位置の少なくとも１つにて欠失、置換または付加が生じているものである、請求項６に記載のＬＴＲ型レトロトランスポゾン。
【請求項８】
請求項３〜７のいずれか１項に記載のＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードするヌクレオチド配列を有する核酸構築物。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸構築物で形質転換した細胞。
【請求項１０】
請求項８に記載の核酸構築物を用いた遺伝子サイレンシング法。
【請求項１１】
インテグラーゼ活性を欠損したレトロウイルス。
【請求項１２】
前記レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：Human Immunodeficiency Virus）である、請求項１１に記載のレトロウイルス。
【請求項１３】
前記レトロウイルスがＨＩＶ−１である、請求項１２に記載のレトロウイルス。
【請求項１４】
インテグラーゼの触媒活性中心領域において変異が生じている、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のレトロウイルス。
【請求項１５】
インテグラーゼのアミノ酸配列（配列番号３）において、６４番目のアミノ酸位置、１１６番目のアミノ酸位置および１５２番目のアミノ酸位置の少なくとも１つにて欠失、置換または付加が生じているものである、請求項１４に記載のレトロウイルス。
【請求項１６】
請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のレトロウイルスを感染させた細胞。
【請求項１７】
請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のレトロウイルスを用いた遺伝子サイレンシング法。
【請求項１】
インテグラーゼ活性を欠損したレトロ因子。
【請求項２】
インテグラーゼの触媒活性中心領域において変異が生じているものである、請求項１に記載のレトロ因子。
【請求項３】
インテグラーゼ活性を欠損したＬＴＲ型レトロトランスポゾン。
【請求項４】
前記ＬＴＲ型レトロトランスポゾンがｇｙｐｓｙ型である、請求項３に記載のＬＴＲ型レトロトランスポゾン。
【請求項５】
前記ＬＴＲ型レトロトランスポゾンがイネ科植物いもち病菌由来である、請求項３または４に記載のＬＴＲ型レトロトランスポゾン。
【請求項６】
インテグラーゼの触媒活性中心領域において変異が生じている、請求項３〜５のいずれか１項に記載のＬＴＲ型レトロトランスポゾン。
【請求項７】
インテグラーゼのアミノ酸配列において、前記ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードするヌクレオチド配列（配列番号１）の４２８４〜４２８６番目に対応するアミノ酸位置、４４６４〜４４６６番目に対応するアミノ酸位置および４５７２〜４５７４番目に対応するアミノ酸位置の少なくとも１つにて欠失、置換または付加が生じているものである、請求項６に記載のＬＴＲ型レトロトランスポゾン。
【請求項８】
請求項３〜７のいずれか１項に記載のＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードするヌクレオチド配列を有する核酸構築物。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸構築物で形質転換した細胞。
【請求項１０】
請求項８に記載の核酸構築物を用いた遺伝子サイレンシング法。
【請求項１１】
インテグラーゼ活性を欠損したレトロウイルス。
【請求項１２】
前記レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：Human Immunodeficiency Virus）である、請求項１１に記載のレトロウイルス。
【請求項１３】
前記レトロウイルスがＨＩＶ−１である、請求項１２に記載のレトロウイルス。
【請求項１４】
インテグラーゼの触媒活性中心領域において変異が生じている、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のレトロウイルス。
【請求項１５】
インテグラーゼのアミノ酸配列（配列番号３）において、６４番目のアミノ酸位置、１１６番目のアミノ酸位置および１５２番目のアミノ酸位置の少なくとも１つにて欠失、置換または付加が生じているものである、請求項１４に記載のレトロウイルス。
【請求項１６】
請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のレトロウイルスを感染させた細胞。
【請求項１７】
請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のレトロウイルスを用いた遺伝子サイレンシング法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−１９３７７９（Ｐ２０１０−１９３７７９Ａ）
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−４２４０５（Ｐ２００９−４２４０５）
【出願日】平成２１年２月２５日（２００９．２．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年９月５日 日本遺伝学会主催の「日本遺伝学会第８０回大会」において発表
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２５日（２００９．２．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年９月５日 日本遺伝学会主催の「日本遺伝学会第８０回大会」において発表
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
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