好熱性微生物の形質転換方法
【課題】本発明は、形質転換効率が高い好熱性微生物の形質転換方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、好熱性微生物の形質転換方法を提供し、該方法は、該好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素によってメチル化ＤＮＡを調製する工程、および該メチル化ＤＮＡを該好熱性微生物に導入する工程を含み、該酵素は、該好熱性微生物とは異なる種の宿主中に存在し、そして該酵素以外のＤＮＡメチル化酵素は、該宿主中に存在しない。
【解決手段】本発明は、好熱性微生物の形質転換方法を提供し、該方法は、該好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素によってメチル化ＤＮＡを調製する工程、および該メチル化ＤＮＡを該好熱性微生物に導入する工程を含み、該酵素は、該好熱性微生物とは異なる種の宿主中に存在し、そして該酵素以外のＤＮＡメチル化酵素は、該宿主中に存在しない。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好熱性微生物の形質転換方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
好熱性微生物は古くから研究されており、数多くの好熱性微生物が単離、同定されている。好熱性微生物は耐熱性酵素の供給源であるとともに、高温下の発酵などバイオプロセスの宿主としても適している。高温下のバイオプロセスは、菌体内の高い代謝速度に加えて、雑菌増殖の防止、発酵熱の有効利用、原料および生産物の水溶性向上など、数多くの点で、従来の常温下のバイオプロセスにはない利点を有する。
【０００３】
しかし、好熱性微生物の形質転換方法は、一部の微生物について報告されているのみである。一般に、微生物は、外敵の侵入から自らを防護する手段として制限修飾系を発達させている。制限修飾系とは、ウイルスやファージなどといった外来ＤＮＡから自己を守るために発達した機構である。Ｉ〜ＩＩＩ型制限修飾系は、ＤＮＡを切断する制限酵素とＤＮＡをメチル化する修飾酵素とから構成される。これら制限修飾系を保有する細菌内では、異種生物由来またはウイルスなどのＤＮＡが細菌に侵入したとしても、制限酵素により切断を受け複製できない。修飾酵素は、制限酵素が認識する塩基配列と同じ塩基配列を認識してこれをメチル化し、制限酵素による切断からＤＮＡを守る役割を果たす。自らのＤＮＡが生成した直後にこれをメチル化することによって、自らのＤＮＡを自らの制限酵素から保護している。すなわち、外来ＤＮＡを微生物に導入して微生物を形質転換するには、制限修飾系の解除または克服が重要な手段となり得る。好熱性微生物の多くは、上述のＩ〜ＩＩＩ型の制限修飾系のほかにＩＶ型の制限系も有している。ＩＶ型の制限系は、「余分なメチル化」を認識し切断するという特徴を有し、ＩＶ型の制限系の解除もきわめて重要である。このため、バイオプロセスには、制限修飾系が詳しく研究されている大腸菌や枯草菌など特定の微生物が汎用されている。
【０００４】
新たな宿主に対する形質転換系の開発も進められている。非特許文献１には、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）ＣＤ６株に対する形質転換系が記載されている。クロストリジウム・ディフィシルに導入する核酸を調製するための大腸菌ＨＢ１０１株に対して、クロストリジウム・ディフィシルの制限修飾系による制限を回避するために、クロストリジウム・ディフィシルの修飾酵素と類似の修飾酵素であるＭ．Ｓａｕ９６Ｉの遺伝子を導入して、このメチル化酵素の遺伝子を発現する宿主を構築したことが記載されている。このような大腸菌宿主を用いて調製した核酸を接合伝達法によりクロストリジウム・ディフィシルに導入したところ、形質転換効率が上昇し、核酸供与体あたり１．０×１０−７〜１．０×１０−６の値が得られている。
【０００５】
非特許文献２には、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）に対する形質転換系が記載されている。ビフィドバクテリウム・アドレセンティスに導入する核酸を調製するための大腸菌ＴＯＰ１０株に対して、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスの制限修飾系による制限を回避するために、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスのゲノム情報からＩＩ型制限修飾系の修飾酵素であるメチル化酵素のＢＡＤ１２３３およびＢＡＤ１２８３の遺伝子を同定し、これらの遺伝子を導入してこれらのメチル化酵素の遺伝子を発現する宿主を構築したことが記載されている。このような大腸菌宿主を用いて調製した核酸を電気穿孔法によりビフィドバクテリウム・アドレセンティスに導入したところ、形質転換効率が１０４〜１０５倍上昇している。非特許文献２には、Ｉ型制限修飾系の修飾酵素の利用についても記載されている。
【０００６】
特許文献１には、好熱性バチラス属細菌に対する形質転換系が記載されている。具体的には、ヘモフィラス・アエジプチウス（Haemophilus aegyptius）由来のＨａｅＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（メチル化酵素）の遺伝子を大腸菌に導入してこの酵素の遺伝子を発現する宿主を構築し、このような大腸菌宿主を用いて調製した核酸を電気穿孔法によりバチラス属細菌に導入すると、形質転換効率が上昇した。このバチラス属細菌にはＨａｅＩＩＩ制限修飾系（GGCC配列を認識する系）に相同または類似の制限修飾系（例えば、GGGCCC配列を認識する系など）があると思われる。
【０００７】
ところで、好熱性微生物の中でも、特にジオバチラス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）に対する期待が大きい。ジオバチラス・カウストフィラスは、耐熱性酵素の供給源として長く利用されてきた経緯があり、ゲノム情報が公開されている点、培養が容易である点、栄養要求性がほとんどない点、グラム陽性菌のため高いタンパク質分泌能が期待できる点、ＧＣ含量が５０％程度であるため比較的ＧＣ含量の影響を受けずに異種遺伝子の発現が期待できる点など、数多くの利点を有するからである。しかし、形質転換系はまだ確立されていない。ジオバチラス・カウストフィラスは、ゲノム情報から２つのＩ型制限修飾系および１つのＩＩ型制限修飾系のほかに３つのＩＶ型制限系を有すると推定されている。ゲノムが公開されているジオバチラス（Geobacillus）属の多く（例えば、Geobacillus kaustophilus、Geobacillus sp. WCH70、Geobacillus sp. Y412MC10、Geobacillus sp. Y412MC61、Geobacillus thermodenitrificans NG80-2）もＩＶ型制限系を有すると推定されている。
【０００８】
特許文献２および非特許文献３には、核酸受容体となるジオバチラス・サーモグルコシダシウス（Geobacillus thermoglucosidasius）に対して核酸供与体となる大腸菌ＪＭ１０９株で調製したＤＮＡを電気穿孔法により導入して形質転換体を得たことが記載されている。しかし、この例では、特に制限修飾系の解除は行われていない。これは、この細菌が、たまたま制限修飾系を有していないからと考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際特許出願公開第０１／８５９６６号公報
【特許文献２】特表２００８−５３９７１０号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】D. Purdyら、Mol. Microbiol.、2002年、第46巻、p. 439-452
【非特許文献２】K. Yasuiら、［online］、2008年11月12日、Nucleic Acids Res.、2009年、第37巻、第１号、e3、doi:10.1093/nar/gkn884
【非特許文献３】R. E. Crippsら、Metabolic Engineering、2009年、第11巻、p. 398-408
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、形質転換効率が高い好熱性微生物の形質転換方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素の遺伝子を好熱性微生物とは異なる種の宿主中で発現させ、かつこの宿主中でこれらの酵素以外のＤＮＡメチル化酵素の遺伝子を発現させないことによって、このように作製された宿主を用いて調製したＤＮＡによる好熱性微生物の形質転換効率が非常に高いことを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
本発明は、好熱性微生物の形質転換方法を提供し、該方法は、該好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素によってメチル化ＤＮＡを調製する工程、および該メチル化ＤＮＡを該好熱性微生物に導入する工程を含み、該酵素は、該好熱性微生物とは異なる種の宿主中に存在し、そして該酵素以外のＤＮＡメチル化酵素は、該宿主中に存在しない。
【００１４】
１つの実施態様では、制限酵素は、上記宿主中に存在しない。
【００１５】
１つの実施態様では、上記メチル化ＤＮＡを調製する工程は、（１）上記好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素の遺伝子を発現し、該酵素以外のＤＮＡメチル化酵素の遺伝子を発現しない宿主を作製する工程、および（２）該工程（１）で得られた宿主に任意のＤＮＡを導入して、形質転換体を調製する工程を含む。
【００１６】
１つの実施態様では、上記工程（１）において、上記宿主は、制限酵素の遺伝子を発現しない。
【００１７】
１つの実施態様では、上記メチル化ＤＮＡを上記好熱性微生物に導入する工程において、該メチル化ＤＮＡを接合伝達法により導入する。
【００１８】
１つの実施態様では、上記好熱性微生物は、ジオバチラス属細菌である。
【００１９】
１つの実施態様では、上記ジオバチラス属細菌は、ジオバチラス・カウストフィラスである。
【００２０】
１つの実施態様では、上記宿主は、大腸菌である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、好熱性微生物の形質転換を高い形質転換効率で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】プラスミドｐＩＲ４０８（ａ）、ｐＳＴＥ３３Ｔ（ｂ）およびｐＵＣＧ１８Ｔ（ｃ）の構造を示す模式図である。
【図２】２重交叉相同組換え実験において、用いたプラスミドｐΔＧＫ１１５５−１の構造を示す模式図（ａ）、ＰＣＲ解析の結果を示す電気泳動写真（ｂ）、ウラシル要求性のスクリーニング結果を示す写真（ｃ）および実験手順を示す模式図（ｄ）である。
【図３】ＧＫ１１５５遺伝子のマーカーフリー欠失実験において、用いたプラスミドｐΔＧＫ１１５５−２の構造を示す模式図（ａ）、ＰＣＲ解析の結果を示す電気泳動写真（ｂ）および実験手順を示す模式図（ｃ）である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明で用いる好熱性微生物とは、生育至適温度が４５℃以上または生育限界温度が５５℃以上の微生物をいい、生育可能温度が好ましくは４０〜１３０℃、より好ましくは４２〜７５℃の微生物をいう。ここで、微生物とは、細菌（真正細菌）、始原菌（古細菌）および真核微生物を含む。好熱性微生物としては、例えば、ジオバチラス（Geobacillus）属細菌、バチラス（Bacillus）属細菌、サーマス（Thermus）属細菌、アクイフェックス（Aquifex）属細菌、サーモトーガ（Thermotoga）属細菌、サーモデスルフォバクテリウム（Thermodesulfobacterium）属細菌、メタノピラス（Methanopyrus）属始原菌、ジオゲンマ（Geogemma）属始原菌、ピロロバス（Pyrolobus）属始原菌、ピロディクチウム（Pyrodictium）属始原菌、ハイパーサーマス（Hyperthermus）属始原菌，ピロコッカス（Pyrococcus）属始原菌、ピロバキュルム（Pyrobaculum）属始原菌、アエロピュルム（Aeropyrum）属始原菌、サーモコッカス（Thermococcus）属細菌、メタノカルドコッカス（Methanocaldococcus）属始原菌、スルフォロバス（Sulfolobus）属始原菌、サーモマイセス（Thermomyces）属子嚢菌が挙げられる。好ましくはジオバチラス属細菌であり、より好ましくはジオバチラス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）である。
【００２４】
本発明でいう形質転換とは、微生物のゲノムＤＮＡの改変または微生物へのＤＮＡの導入によりもたらされる改変をいい、染色体ＤＮＡの欠失、複製、変異、または自律複製プラスミドの導入による形質変化すべてを含む。導入されたＤＮＡは、染色体に組み込まれて維持、複製されてもよく、プラスミドなどのように染色体とは独立して維持、複製されてもよい。ＤＮＡを微生物の染色体の特定の部位に組み込む場合には、相同組換え技術を用いてもよい。
【００２５】
本発明の方法は、形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素によってメチル化ＤＮＡを調製する工程と、このように調製されたメチル化ＤＮＡを形質転換の対象とする好熱性微生物に導入する工程とを含む。
【００２６】
本発明で用いるＤＮＡメチル化酵素とは、ＤＮＡの塩基配列上の特定の塩基をメチル化する酵素（メチラーゼ）、特定の塩基にメチル基を転移する酵素（メチルトランスフェラーゼ）、または修飾酵素をいう。
【００２７】
ＤＮＡメチル化酵素は主として微生物などの生体防御系の１つである制限修飾系に由来する。制限修飾系としては、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型が挙げられる。
【００２８】
Ｉ〜ＩＩＩ型制限修飾系は、自身のＤＮＡをメチル化などで修飾する修飾酵素と、ＤＮＡの特定配列を認識切断するが、修飾を受けた部位は切断しない制限酵素との組み合わせからなり、外部から侵入したファージなどのＤＮＡを選択的に切断分解する生体防御系である。Ｉ型制限修飾系は、３種類のサブユニットＲ、ＭおよびＳから構成される複合体であり、サブユニットは、それぞれ制限（切断）、修飾（メチル化）および認識を担う。ＩＩ型制限修飾系は、制限酵素および修飾酵素から構成されるが、一般に複合体を形成していない。ＩＩ型制限修飾系には、遺伝子工学で用いられる制限酵素のほとんどが属し、対応するメチラーゼによって制限酵素の反応が抑制される。ＩＩＩ型制限修飾系は、２種類のサブユニットＲおよびＭから構成される複合体であり、サブユニットは、それぞれ制限（切断）および修飾（メチル化）を担う。
【００２９】
ＩＶ型制限系は制限酵素のみから構成され、修飾酵素を含まない。ファージなどにみられるメチル化ＤＮＡを認識し切断する。ＩＶ型制限系は、「余分なメチル化」を認識し切断するという特徴を有する。認識配列については不明確なものがほとんどであるが、様々なメチル化ＤＮＡを認識し切断するとされている。
【００３０】
本発明では、形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素を用いるが、これと同一の活性を有する限り、ほかに由来する酵素を用いてもよい。すなわち、形質転換の対象とする好熱性微生物の制限修飾系によるＤＮＡの切断を回避するメチル化をＤＮＡに導入することができる酵素であればよい。
【００３１】
形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素によってメチル化されたＤＮＡは、好熱性微生物に導入された後もＤＮＡメチル化酵素に対応する制限酵素による切断を受けない。このため、形質転換効率が上昇する。
【００３２】
メチル化されるＤＮＡは、特に制限されず、任意のＤＮＡである。天然由来のものであっても、人工的なものであってもよい。例えば、生物から抽出して得られるものであっても、ＰＣＲや有機合成などの人工的な方法によって得られるものであってもよい。
【００３３】
ＤＮＡ上の塩基配列が有する情報の観点からは、好ましくは遺伝子であり、より好ましくはタンパク質をコードする遺伝子である。タンパク質をコードする遺伝子を導入する場合には、該遺伝子を導入した好熱性微生物中で該遺伝子からタンパク質を発現するために、様々なＤＮＡ断片を該遺伝子に付加し得る。例えば、プロモーター断片を該遺伝子の上流に付加し得る。例えば、ターミネーター断片を該遺伝子の下流に付加し得る。プロモーターとしては、シグマプロモーター、マルトース代謝オペロンプロモーター、トリプトファン生合成オペロンプロモーターが挙げられるが、特に制限されない。ターミネーターとしては、Ｔ７ターミネーター、ラムダバクテリオファージｔ０ターミネーター、ｒｒｎＢターミネーターが挙げられるが、特に制限されない。さらに、例えば、該遺伝子から発現するタンパク質を菌体外に分泌させるために分泌シグナルを該遺伝子の上流に付加し得る。これらのＤＮＡ断片が発現カセットを構成し、プラスミドとして維持されていることが好ましい。
【００３４】
プラスミドは、プラスミドの調製および形質転換体の検出を容易にする点で、選択マーカーと適切な複製遺伝子とを有することが好ましい。選択マーカーとしては、例えば、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子が挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）が挙げられるが、特に制限されない。栄養要求性遺伝子としては、ウラシル生合成遺伝子、トリプトファン生合成遺伝子、ヒスチジン生合成遺伝子が挙げられるが、特に制限されない。栄養要求性遺伝子は、対応する栄養生合成遺伝子が欠失している宿主を用いる場合に好ましく用いられる。
【００３５】
メチル化ＤＮＡを形質転換の対象とする好熱性微生物に導入する方法としては、特に制限されないが、例えば、接合伝達法、電気穿孔法、プロトプラスト融合法、パーティクルガン法、コンピテントセルを用いる方法が挙げられる。好ましくは接合伝達法である。接合伝達法では、核酸供与体（好熱性微生物とは異なる種の宿主、大腸菌など）が核酸受容体（好熱性微生物）と接合し、核酸供与体の中の核酸を核酸受容体に伝達する。接合伝達法によりＤＮＡを導入するには、核酸供与体の中に接合と伝達に関与する遺伝子（ｔｒａ遺伝子またはｍｏｂ遺伝子）が発現している必要がある。このような遺伝子を含むプラスミドとしては、例えば、ＲＰ４由来プラスミド、ＲＰ１由来プラスミド、Ｒ６８．４５由来プラスミド、Ｒ３８８由来プラスミド、Ｓ−ａ由来プラスミド、プラスミドｐＭＤ１０１、プラスミドｐＵＢ３０７、プラスミドｐＲＫ２０１３、プラスミドｐＪＲＤ２１５、プラスミドｐＳＵＰ１０１１が挙げられる。接合伝達は、核酸供与体から核酸を一旦回収する必要がなく、単に核酸供与体と核酸受容体とを混合させるだけでよいため、簡単にＤＮＡを導入することができる。大腸菌などの好熱性微生物とは異なる種の宿主、特に常温菌から好熱性微生物にＤＮＡを接合伝達する場合、接合伝達後に、温度を好熱性微生物の生育温度まで上昇させることにより、核酸供与体が死滅するため、ＤＮＡが導入された核酸受容体を簡単に選別することができる。
【００３６】
本発明の特徴は、形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素が好熱性微生物とは異なる種の宿主中に存在して、すなわちインビボにおいて、形質転換に用いるＤＮＡをメチル化する点にある。インビボのメチル化は、インビトロのメチル化に比べて、簡単かつ確実に大量のメチル化ＤＮＡを調製できる。
【００３７】
形質転換の対象とする好熱性微生物とは異なる種の宿主としては、特に制限されないが、ゲノムや形質転換系などがよく研究されている点で大腸菌が好ましい。
【００３８】
本発明の特徴はまた、形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素以外のＤＮＡメチル化酵素が、上記宿主中に存在しない点、すなわち形質転換に用いるＤＮＡは、形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素によるメチル化以外にはメチル化されない点にある。ＩＶ型制限系は「余分なメチル化」を認識して切断する。ＩＶ型制限系による制限を回避するために、好ましくは形質転換に用いるＤＮＡは、形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素によるメチル化以外に受けるメチル化が抑制される必要がある。このために、メチル化ＤＮＡを調製する宿主由来のＤＮＡメチル化酵素の遺伝子を欠失させることが好ましい。
【００３９】
本発明では、形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素が、好熱性微生物とは異なる種の宿主中に存在して、形質転換に用いるＤＮＡをメチル化する。このメチル化ＤＮＡを宿主由来のＩＶ型制限系による制限から保護するために、制限酵素が上記宿主中に存在しないことが好ましい。このために、メチル化ＤＮＡを調製する宿主由来の制限酵素の遺伝子を欠失させることが好ましい。
【００４０】
具体的に、メチル化ＤＮＡを調製する工程は、
（１）メチル化ＤＮＡの調製に用いる宿主として、形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素の遺伝子を発現し、これらの酵素以外のＤＮＡメチル化酵素の遺伝子を発現しない宿主を作製する工程、および
（２）工程（１）で得られた宿主に任意のＤＮＡを導入して、形質転換体を調製する工程
を含む。
【００４１】
（１）形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素の遺伝子を発現し、これらの酵素以外のＤＮＡメチル化酵素の遺伝子を発現しない宿主を作製する方法としては、特に制限されないが、例えば、メチル化ＤＮＡの調製に用いる宿主に対して、宿主由来のＤＮＡメチル化酵素の遺伝子を欠失させ、かつ形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素の遺伝子を導入する方法が挙げられる。好ましくは、宿主由来のすべてのＤＮＡメチル化酵素の遺伝子を欠失させ、かつ形質転換の対象とする好熱性微生物由来のすべてのＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素の遺伝子を導入する。
【００４２】
さらに、上記工程（１）において用いる宿主に対して、宿主由来の制限酵素の遺伝子を欠失させることが好ましい。より好ましくは、宿主由来のすべての制限酵素の遺伝子を欠失させる。
【００４３】
あるいは、形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素と同一の活性を有する酵素がメチル化ＤＮＡの調製に用いる宿主中に存在する場合には、これを好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素の代用として用いることができる。この場合、特に宿主の遺伝子を操作する必要がない。
【００４４】
遺伝子を欠失させる方法としては、特に制限されない。例えば、相同組換え技術、変異誘発剤を用いる方法が挙げられる。目的とする遺伝子を効率的に欠失させることができる点で、相同組換え技術が好ましい。相同組換え技術としては、例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰを用いる方法、ＦＬＰリコンビナーゼを用いる方法、遺伝子ターゲティング法が挙げられる。具体的には、例えば、欠失させるＤＮＡメチル化酵素の遺伝子のコーディング領域の中に薬剤耐性遺伝子が挿入された構造を有するプラスミドを構築し、このプラスミドを大腸菌に導入する。大腸菌を薬剤存在下で培養すると、薬剤耐性遺伝子によって破壊されたＤＮＡメチル化酵素の遺伝子が、正常なＤＮＡメチル化酵素の遺伝子と組換えを起こした大腸菌が選択的に増殖する。好ましくは、すべてのＤＮＡメチル化酵素の遺伝子について同様の操作を繰り返す。
【００４５】
遺伝子を導入する方法としては、特に制限されない。上述のメチル化ＤＮＡを好熱性微生物に導入する方法と同様の方法が用いられる。好ましくは、すべてのＤＮＡメチル化酵素の遺伝子について同様の操作を繰り返す。
【００４６】
（２）工程（１）で得られた宿主に任意のＤＮＡを導入して、形質転換体を調製する方法としては、特に制限されない。上述のメチル化ＤＮＡを好熱性微生物に導入する方法と同様の方法が用いられる。形質転換体は、形質転換体の由来に応じて、当業者が通常用いる方法により適宜培養して調製し得る。
【００４７】
本発明の方法において、メチル化ＤＮＡを形質転換の対象とする好熱性微生物に導入する工程で、例えば、接合伝達法、プロトプラスト融合法を用いる場合は、上記工程（２）の後、形質転換体からＤＮＡを回収する必要はないが、例えば、電気穿孔法を用いる場合は、上記工程（２）の後、形質転換体からＤＮＡを回収する必要がある。形質転換体からのＤＮＡの回収は、形質転換体の由来に応じて、当業者が通常用いる方法により行われ得る。
【実施例】
【００４８】
以下に、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００４９】
プラスミドＤＮＡの抽出にはWizard Plus SV Minipreps（Promega社製）を用いた。アガロースゲルからのＤＮＡの回収にはQIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen社製）を用いた。
【００５０】
実施例１：好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素遺伝子発現プラスミドの作製
プラスミドｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１（Novagen社製）のｐ１５Ａ複製起点（ｐ１５Ａｏｒｉ）およびクロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍｒ）を含む領域をＰＣＲ法（プライマー１Ｆ：配列番号１およびプライマー１Ｒ：配列番号２）により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素ＢｇｌＩＩで消化し、DNA ligaseを用いて自己環化させた。得られたプラスミドをｐＩＲ１０１と命名した。
【００５１】
QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagen社製）を用いてｐＩＲ１０１に含まれる２ヶ所の制限酵素ＤｒａＩ部位を破壊した。制限酵素ＤｒａＩ部位の破壊には、プライマー２Ｆ：配列番号３およびプライマー２Ｒ：配列番号４、ならびにプライマー３Ｆ：配列番号５およびプライマー３Ｒ：配列番号６を用いた。得られたプラスミドをｐＩＲ２００と命名した。
【００５２】
プラスミドｐＵＣ１９（タカラバイオ株式会社製）に含まれるｌａｃプロモーター領域をＰＣＲ法（プライマー４Ｆ：配列番号７およびプライマー４Ｒ：配列番号８）により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＩＲ１０１の制限酵素ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位間に挿入した。得られたプラスミドをｐＩＲ１０２と命名した。
【００５３】
ｐＩＲ１０２に含まれるｌａｃプロモーター領域をＰＣＲ法（プライマー５Ｆ：配列番号９およびプライマー５Ｒ：配列番号１０）により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＩＲ２００の制限酵素ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位間に挿入した。得られたプラスミドをｐＩＲ２０１と命名した。
【００５４】
ｐＩＲ２０１中に含まれるｌａｃプロモーター領域をＰＣＲ法（プライマー６Ｆ：配列番号１１およびプライマー６Ｒ：配列番号１２）により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＩＲ２００の制限酵素ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位間に挿入した。得られたプラスミドをｐＩＲ２０２と命名した。
【００５５】
QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用いてｐＩＲ２０２に制限酵素ＢａｍＨＩ部位を導入した。制限酵素ＢａｍＨＩ部位の導入には、プライマー７Ｆ：配列番号１３およびプライマー７Ｒ：配列番号１４を用いた。得られたプラスミドをｐＩＲ２０３と命名した。
【００５６】
大腸菌ＤＨ５α株のゲノムＤＮＡを鋳型としてｈｓｐ７０（ｄｎａＫ）遺伝子上流のプロモーター領域（ｄｎａＫ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）をＰＣＲ法（プライマー８Ｆ：配列番号１５およびプライマー８Ｒ：配列番号１６）により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩおよび制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、ｐＩＲ２０３の制限酵素ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入した。得られたプラスミドをｐＩＲ２０７と命名した。このプラスミドは、ｐ１５Ａ複製起点（ｐ１５Ａｏｒｉ）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍｒ）、およびｈｓｐ７０（ｄｎａＫ）遺伝子上流のプロモーター領域（ｄｎａＫ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を含み、プロモーター領域の下流にマルチクローニング部位を有する。プロモーターからマルチクローニング部位までを含む領域は２つのＳｗａＩ部位に挟まれている。
【００５７】
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株（ＪＣＭ１２８９３）のゲノムＤＮＡには、２つのＩ型制限修飾系遺伝子群（ＧＫ０３４３−ＧＫ０３４４−ＧＫ０３４６およびＧＫ１３８０−ＧＫ１３８１−ＧＫ１３８２）が存在する。これらのうちＤＮＡのメチル化に関与するＭサブユニット遺伝子（ＧＫ０３４３およびＧＫ１３８０）ならびにＳサブユニット遺伝子（ＧＫ０３４４およびＧＫ１３８１）をそれぞれＰＣＲ法により増幅した。ＧＫ０３４３遺伝子の増幅にはプライマー９Ｆ：配列番号１７およびプライマー９Ｒ：配列番号１８を用いた。ＧＫ０３４４遺伝子の増幅には、プライマー１０Ｆ：配列番号１９およびプライマー１０Ｒ：配列番号２０を用いた。ＧＫ１３８０遺伝子の増幅にはプライマー１１Ｆ：配列番号２１およびプライマー１１Ｒ：配列番号２２を用いた。ＧＫ１３８１遺伝子の増幅にはプライマー１２Ｆ：配列番号２３およびプライマー１２Ｒ：配列番号２４を用いた。
【００５８】
ＧＫ０３４３遺伝子とＧＫ０３４４遺伝子との増幅断片を融合ＰＣＲ法によって連結し、連結した断片をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Invitrogen社製）ベクターにクローニングした。得られたプラスミドのＧＫ０３４３−ＧＫ０３４４遺伝子に含まれる２ヶ所のＮｄｅＩ部位を破壊するために、このプラスミドを鋳型としてＰＣＲ（プライマー１３Ｆ：配列番号２５およびプライマー１３Ｒ：配列番号２６）を行い、次いで得られた増幅断片に対してQuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて部位特異的変異を導入した。得られたプラスミドからＧＫ０３４３−ＧＫ０３４４遺伝子領域を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化して切り出し、ｐＩＲ２０７の制限酵素ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入した。得られたプラスミドをｐＩＲ３９９と命名した。
【００５９】
ＧＫ１３８０遺伝子とＧＫ１３８１遺伝子との増幅断片を融合ＰＣＲ法によって連結し、連結した断片をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。得られたプラスミドのＧＫ１３８０−ＧＫ１３８１遺伝子に含まれる２ヶ所のＮｄｅＩ部位を破壊するために、このプラスミドを鋳型としてＰＣＲ（プライマー１４Ｆ：配列番号２７およびプライマー１４Ｒ：配列番号２８）を行い、次いで得られた増幅断片に対してQuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて部位特異的変異を導入した。得られたプラスミドからＧＫ１３８０−ＧＫ１３８１遺伝子領域を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化して切り出し、ｐＩＲ２０７の制限酵素ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入した。得られたプラスミドをｐＩＲ４０１と命名した。
【００６０】
ｐＩＲ３９９からＧＫ０３４３−ＧＫ０３４４遺伝子発現カセットを制限酵素ＳｗａＩで消化して切り出した。このカセット断片と制限酵素ＳｐｅＩで消化したｐＩＲ４０１とを混合し、In-fusion PCR Cloning Kit（Clontech社製）を用いて両ＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドをｐＩＲ４０８（図１（ａ））と命名した。このプラスミドは、直列に連結されたＧＫ１３８０−ＧＫ１３８１遺伝子発現カセット（上流：ｈｓｄＭ２Ｓ２）とＧＫ０３４３−ＧＫ０３４４遺伝子発現カセット（下流：ｈｓｄＭ１Ｓ１）を有する。
【００６１】
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株のゲノムＤＮＡには、２つのＩ型制限修飾系遺伝子群のほかに１つのＩＩ型制限修飾系遺伝子群（ＧＫＰ０８−ＧＫＰ０９）が存在する。これらのうちＤＮＡメチラーゼ遺伝子ＧＫＰ０８をＰＣＲ法（プライマー１５Ｆ：配列番号２９およびプライマー１５Ｒ：配列番号３０）により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＩＲ２０７の制限酵素ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入した。得られたプラスミドをｐＩＲ４０５と命名した。
【００６２】
実施例２：形質転換に用いる発現プラスミドの作製
プラスミドｐＲＫ２０１３（D. H. Figurskiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1979年、第76巻、p. 1648-1652）に含まれるｏｒｉＴ領域をＰＣＲ法（プライマー１６Ｆ：配列番号３１およびプライマー１６Ｒ：配列番号３２）により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＳＴＥ３３（I. Narumiら、Biotechnol. Lett.、1993年、第15巻、p. 815-820）およびｐＵＣＧ１８（M. P. Taylorら、Plasmid、2008年、第60巻、p. 45-52）の制限酵素ＥｃｏＲＩ部位にそれぞれ挿入した。得られたプラスミドをそれぞれｐＳＴＥ３３Ｔ（図１（ｂ））およびｐＵＣＧ１８Ｔ（図１（ｃ））と命名した。
【００６３】
２つのオリゴヌクレオチド（プライマー１７Ｆ：配列番号３３およびプライマー１７Ｒ：配列番号３４）を融合ＰＣＲ法によって連結し、連結した断片を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、ｐＵＣ１９の制限酵素ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドをｐＬＸ１９と命名した。このプラスミドは２つの制限酵素ＢａｍＨＩ部位間にｌｏｘＰ配列を有する。
【００６４】
QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて、ｐＵＣ１９に制限酵素ＭｕｎＩ、ＦｂａＩおよびＢｇｌＩＩ部位を導入した。制限酵素部位の導入には、プライマー１８Ｆ：配列番号３５およびプライマー１８Ｒ：配列番号３６を用いた。得られたプラスミドをｐＧＫＥ１１と命名した。
【００６５】
ｐＲＫ２０１３に含まれるｏｒｉＴ領域をＰＣＲ法（プライマー１９Ｆ：配列番号３７およびプライマー１９Ｒ：配列番号３８）により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素ＰｃｉＩで消化し、ｐＧＫＥ１１およびｐＵＣ１９の制限酵素ＰｃｉＩ部位にそれぞれ挿入した。得られたプラスミドをそれぞれｐＧＫＥ１１ＴおよびｐＵＣ１９Ｔと命名した。
【００６６】
ｐＳＴＥ３３に含まれるＴＫ１０１遺伝子（耐熱性カナマイシン耐性遺伝子）をＰＣＲ法（プライマー２０Ｆ：配列番号３９およびプライマー２０Ｒ：配列番号４０）により増幅した。ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株のゲノムＤＮＡを鋳型としてシグマＡプロモーター領域をＰＣＲ法（プライマー２１Ｆ：配列番号４１およびプライマー２１Ｒ：配列番号４２）により増幅した。得られた２つのＤＮＡ断片を融合ＰＣＲ法によって連結した。得られたＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、ｐＬＸ１９の制限酵素ＢａｍＨＩ部位およびＢｇｌＩＩ部位にそれぞれクローニングした。得られたプラスミドをそれぞれｐＬＸ１９−ＴＫ１０１およびｐＴＫ１９と命名した。
【００６７】
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＧＫ１１５５遺伝子の上流領域（プライマー２２Ｆ：配列番号４３およびプライマー２２Ｒ：配列番号４４）および下流領域（プライマー２３Ｆ：配列番号４５およびプライマー２３Ｒ：配列番号４６）をそれぞれＰＣＲ法により増幅した。得られた上流領域の断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＵＣ１９の制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位間にクローニングし、得られた下流領域の断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩで消化し、ｐＵＣ１９の制限酵素ＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ部位間にクローニングした。得られたプラスミドの制限酵素ＢａｍＨＩ部位に、ｐＬＸ１９−ＴＫ１０１から制限酵素ＢａｍＨＩで消化して切り出したＴＫ１０１遺伝子を挿入した。得られたプラスミドの制限酵素ＥｃｏＲＩ部位に、プラスミドｐＲＫ２０１３に含まれるｏｒｉＴ領域をＰＣＲ法（プライマー１６Ｆおよび１６Ｒ）により増幅して得られた増幅断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、挿入した。得られたプラスミドをｐΔＧＫ１１５５−１と命名した。
【００６８】
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＧＫ１１５５遺伝子の上流領域（プライマー２２Ｆおよび２２Ｒ）および下流領域（プライマー２４Ｆ：配列番号４７およびプライマー２３Ｒ）をそれぞれＰＣＲ法により増幅した。得られた上流領域の断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＴＫ１９の制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位間にクローニングし、得られた下流領域の断片を制限酵素ＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩで消化し、ｐＴＫ１９の制限酵素ＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ部位間にクローニングした。得られたプラスミドをｐΔＧＫ１１５５−２と命名した。
【００６９】
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＧＫ０７０７遺伝子の上流領域（プライマー２５Ｆ：配列番号４８およびプライマー２５Ｒ：配列番号４９）および下流領域（プライマー２６Ｆ：配列番号５０およびプライマー２６Ｒ：配列番号５１）をそれぞれＰＣＲ法により増幅した。得られた上流領域の断片を制限酵素ＡａｔＩＩで消化し、ｐＧＫＥ１１の制限酵素ＡａｔＩＩ部位にクローニングし、得られた下流領域の断片を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、ｐＧＫＥ１１の制限酵素ＢｇｌＩＩ部位にクローニングした。次いで、ｐＬＸ１９−ＴＫ１０１から制限酵素ＢａｍＨＩで消化して切り出したＴＫ１０１遺伝子をｐＧＫＥ１１の制限酵素ＦｂａＩ部位にクローニングし、ｐＵＣ１９Ｔから制限酵素ＰｃｉＩで消化して切り出したｏｒｉＴ遺伝子をｐＧＫＥ１１の制限酵素ＰｃｉＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドをｐＧＡＭ１５と命名した。
【００７０】
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＧＫ０７０４遺伝子のプロモーター領域をＰＣＲ法（プライマー２７Ｆ：配列番号５２およびプライマー２７Ｒ：配列番号５３）により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化し、ｐＧＡＭ１５の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ部位間に挿入した。得られたプラスミドをｐＧＡＭ３１と命名した。
【００７１】
ジオバチラス・カウストフィラスＡＴＣＣ８００５株のゲノムＤＮＡを鋳型として耐熱性β−ガラクトシダーゼをコードするｂｇａＢ遺伝子（H. Hirataら、J. Bacteriol.、1986年、第166巻、p. 722-727）をＰＣＲ法（プライマー２８Ｆ：配列番号５４およびプライマー２８Ｒ：配列番号５５）により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＧＡＭ１５およびｐＧＡＭ３１の制限酵素ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ部位間にそれぞれ挿入した。得られたプラスミドをそれぞれｐＧＡＭ１５−ｂｇａＢおよびｐＧＡＭ３１−ｂｇａＢと命名した。
【００７２】
ジオバチラス・ステアロサーモフィラスＡＴＣＣ１２９８０株のゲノムＤＮＡを鋳型として耐熱性α−アミラーゼをコードするａｍｙＥ遺伝子（N. Suzukiら、Appl. Microbiol. Biotechnol.、2009年、第82巻、p. 491-500）をＰＣＲ法（プライマー２９Ｆ：配列番号５６およびプライマー２９Ｒ：配列番号５７）により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素ＳｐｈＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ｐＧＡＭ１５の制限酵素ＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入した。得られたプラスミドをｐＧＡＭ１５−ＢＳａｍｙＥと命名した。
【００７３】
実施例３：ＤＮＡメチル化酵素を欠失させるためのプラスミドの作製
大腸菌ＴＯＰ１０株（Invitrogen社製）のゲノムＤＮＡを鋳型としてｄａｍ遺伝子の上流領域（プライマー３０Ｆ：配列番号５８およびプライマー３０Ｒ：配列番号５９）および下流領域（プライマー３１Ｆ：配列番号６０およびプライマー３１Ｒ：配列番号６１）をそれぞれＰＣＲ法により増幅した。大腸菌ＥＲ１８２１株（New England BioLab社製）のゲノムＤＮＡを鋳型としてｍｅｔＢ遺伝子を含む領域をＰＣＲ法（プライマー３２Ｆ：配列番号６２およびプライマー３２Ｒ：配列番号６３）により増幅した。得られた上流領域の断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化し、ｐＵＣ１９の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ部位間に挿入した。次いで、得られたプラスミドの制限酵素ＳｐｈＩ−ＸｂａＩ部位間に、上記で得られたｍｅｔＢ遺伝子を含む領域の断片を制限酵素ＳｐｈＩおよびＮｏｔＩで消化し、上記で得られた下流領域の断片を制限酵素ＮｏｔＩおよびＸｂａＩで消化し、これらを直列に連結して挿入した。得られたプラスミドをｐΔＤａｍと命名した。
【００７４】
大腸菌ＴＯＰ１０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてｄｃｍ遺伝子の上流領域（プライマー３３Ｆ：配列番号６４およびプライマー３３Ｒ：配列番号６５）および下流領域（プライマー３４Ｆ：配列番号６６およびプライマー３４Ｒ：配列番号６７）をそれぞれＰＣＲ法により増幅した。大腸菌ＥＲ１８２１株のゲノムＤＮＡを鋳型としてプロモーターを含むｌａｃＺ遺伝子をＰＣＲ法（プライマー３５Ｆ：配列番号６８およびプライマー３５Ｒ：配列番号６９）により増幅した。得られた上流領域を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化し、ｐＵＣ１９の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ部位間に挿入した。次いで、得られたプラスミドの制限酵素ＳｐｈＩ−ＸｂａＩ部位間に、上記で得られたプロモーターを含むｌａｃＺ遺伝子を制限酵素ＳｐｈＩおよびＮｏｔＩで消化し、上記で得られた下流領域の断片を制限酵素ＮｏｔＩおよびＸｂａＩで消化し、これらを直列に連結して挿入した。得られたプラスミドをｐΔＤｃｍと命名した。
【００７５】
実施例４：大腸菌宿主の作製
ｐΔＤａｍを鋳型としてｄａｍ遺伝子欠失用ＤＮＡ断片をＰＣＲ法（プライマー３０Ｆおよび３１Ｒ）により増幅した。得られたＤＮＡ断片に混入する鋳型ＤＮＡ（ｐΔＤａｍ）を制限酵素ＤｐｎＩで消化した。得られたＤＮＡ断片をQIAquick PCR Purification Kit（Qiagen社製）を用いて精製し、大腸菌ＥＲ１７９３株（New England BioLab社製）に電気穿孔法により導入した。菌体を滅菌水で洗浄し、ＭＭ１最少固体培地（０．６％(w/v)Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％(w/v)ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％(w/v)ＮａＣｌ、０．０１％(w/v)チアミン、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、３３μＭ ＦｅＣｌ３、０．００４％(w/v)Ｌ−トリプトファン、０．００２％(w/v)Ｌ−ヒスチジン、０．２％(w/v)Ｄ−グルコース、１．５％(w/v)寒天末）に塗布し、３７℃にて２日間培養した。生育したコロニーの中からアンピシリン感受性株をスクリーニングして、大腸菌ＩＲ２１株を得た。ＩＲ２１株のｄａｍ遺伝子が欠失していることは、ＰＣＲ解析および制限酵素マッピングにより確認した。ＩＲ２１株の遺伝子型は以下のとおりである：F- fhuA2 Δ(lacZ)r1 glnV44 e14-(McrA-) trp-31 his-1 rpsL104(StrR) xyl-4 mtl-2 metB1 Δ(mcrC-mrr)114::IS10 Δdam::metB。
【００７６】
ｐΔＤｃｍを鋳型としてｄｃｍ遺伝子欠失用ＤＮＡ断片をＰＣＲ法（プライマー３３Ｆおよび３４Ｒ）により増幅した。得られたＤＮＡ断片に混入する鋳型ＤＮＡ（ｐΔＤｃｍ）を制限酵素ＤｐｎＩで消化した。得られたＤＮＡ断片をQIAquick PCR Purification Kitを用いて精製し、大腸菌ＥＲ１７９３株およびＩＲ２１株に電気穿孔法によりそれぞれ導入した。菌体を滅菌水で洗浄し、ＭＭ２最少固体培地（０．６％(w/v)Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％(w/v)ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％(w/v)ＮａＣｌ、０．０１％(w/v)チアミン、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、３３μＭ ＦｅＣｌ３、０．００４％(w/v)Ｌ−トリプトファン、０．００２％(w/v)Ｌ−ヒスチジン、０．００２％(w/v)Ｌ−メチオニン、０．２％(w/v)ラクトース、０．００２％(w/v)５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、１．５％(w/v)寒天末）に塗布し、３７℃で２日間培養した。青色を呈するコロニーの中からアンピシリン感受性株をスクリーニングすることで、ＩＲ２４株ならびにＩＲ２７株をそれぞれ得た。両株のｄｃｍ遺伝子が欠失して、ＰＣＲ解析および制限酵素マッピングにより確認した。両株の遺伝子型は以下のとおりである：IR24、Δ(lacZ)r1 glnV44 e14-(McrA-) trp-31 his-1 rpsL104(StrR) xyl-4 mtl-2 metB1 Δ(mcrC-mrr)114::IS10 Δdcm::lacZ;IR27、Δ(lacZ)r1 glnV44 e14-(McrA-) trp-31 his-1 rpsL104(StrR) xyl-4 mtl-2 metB1 Δ(mcrC-mrr)114::IS10 Δdam::metB Δdcm::lacZ。
【００７７】
ＩＲ２７株に接合伝達プラスミドｐＵＢ３０７（P. M. Bennettら、Mol. Gen. Genet.、1977年、第154巻、p. 205-211）（ＲＰ１由来プラスミド）を電気穿孔法で導入し、菌体を２５μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび６．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有するＬＢ固体培地に塗布し、３７℃にて培養した。生育したコロニーの１つを大腸菌ＢＲ２７株として得た。
【００７８】
ＩＲ２４株にｐＵＢ３０７を電気穿孔法で導入し、菌体を２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ固体培地に塗布し、３７℃にて培養した。生育したコロニーの１つを大腸菌ＢＲ２４株として得た。
【００７９】
ＢＲ２７株にｐＩＲ２０７を電気穿孔法で導入し、菌体を２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、６．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンおよび１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェノコールを含有するＬＢ固体培地に塗布し、３７℃にて培養した。生育したコロニーの１つを大腸菌ＢＲ３９７株として得た。同様にして、ＢＲ２４株にｐＩＲ２０７、ｐＩＲ３９９、ｐＩＲ４０１およびｐＩＲ４０８をそれぞれ導入し、得られた大腸菌をそれぞれ大腸菌ＢＲ３９８株、大腸菌ＢＲ３９９株、大腸菌ＢＲ４０１株および大腸菌ＢＲ４０８株と命名した。
【００８０】
実施例５：異種メチル化の確認
大腸菌を１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＬＢ液体培地で３７℃にて２４時間培養し、ゲノムＤＮＡを常法に従い抽出した。C. W. Gehrkeら、J. Chromatog.、1984年、第301巻、p. 199-219に記載の方法に従い、ゲノムＤＮＡをモノデオキシヌクレオシドにまで分解し、逆相ＨＰＬＣを用いてその組成を分析した。実施例４と同様にして、大腸菌ＩＲ２７株にｐＩＲ２０７を電気穿孔法で導入して得られた大腸菌（以下、このようにして得られた大腸菌を「大腸菌ＩＲ２７［ｐＩＲ２０７］」のように記載することがある）のゲノムＤＮＡからは、既知のいかなるメチル化核酸（５−メチルデオキシシチジン、５ｍｄＣ；Ｎ−６−メトルデオキシアデノシン、６ｍｄＡ；Ｎ−４−メチルデオキシシチジン、４ｍｄＣ）も検出されなかった。大腸菌ＩＲ２７［ｐＩＲ３９９］のゲノムＤＮＡからは、有意な６ｍｄＡが検出された。そのモル比率は全デオキシアデノシンの０．０８％であった。大腸菌ＩＲ２７［ｐＩＲ４０１］およびＩＲ２７［ｐＩＲ４０８］のゲノムＤＮＡからも、有意な６ｍｄＡが検出された。そのモル比率は、それぞれ全デオキシアデノシンの０．１０％および０．２１％であった。以上の結果から、ｐＩＲ３９９、ｐＩＲ４０１およびｐＩＲ４０８にクローン化したジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株由来のＩ型メチル化酵素遺伝子群は、大腸菌中で機能的に発現し、宿主大腸菌のＤＮＡを異種メチル化することが示された。
【００８１】
同様にして、ｐＩＲ４０５を導入して得られた大腸菌を解析したところ、大腸菌ＩＲ２７［ｐＩＲ４０５］のゲノムＤＮＡからは、全デオキシアデノシンの１．９％に相当する６ｍｄＡが検出された。ＧＫＰ０８は、ＡｌｗＩメチラーゼと５８％の遺伝子配列相同性を示すことから、ＡｌｗＩメチラーゼと同じく「ＧＧＡＴＣ」配列中のアデニンのＮ−６−メチル化を触媒すると予想できた。そこで、ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株およびＩＲ２７［ｐＩＲ４０５］のゲノムＤＮＡの制限酵素マッピングを行ったところ、いずれも制限酵素ＤｐｎＩで消化されたが、制限酵素ＡｌｗＩでは切断されなかった。以上の結果は、ＧＫＰ０８が「ＧＧＡＴＣ」配列中アデニンのＮ−６−メチル化の原因となることを示す。
【００８２】
実施例６：ジオバチラス・カウストフィラスの形質転換１：プラスミドの導入
（接合伝達法）
ＧＫＰ０８遺伝子が原因となるＮ−６−メチル化は、大腸菌におけるＤａｍメチル化に包括されることから、核酸供与体となる大腸菌として、特記のない限りＢＲ２４派生株を用いた。適切な抗生物質（２５μｇ／ｍＬカナマイシン、６．５μｇ／ｍＬテトラサイクリン、１２．５μｇ／ｍＬクロラムフェノコール、２５μｇ／ｍＬアンピシリン）を含有するＬＢ液体培地で核酸供与体を３７℃にて一晩前培養し、回収した菌体を、抗生物質を含まないＬＢ液体培地で洗浄した。菌体を光学濁度（ＯＤ６００）が約０．１になるように新しいＬＢ液体培地に接種し、光学濁度が０．５になるまで３７℃にて振盪培養した。核酸受容体となるジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株はＬＢ液体培地で５５℃にて一晩前培養した。得られた培養液を０．１％(v/v)となるように新しいＬＢ液体培地に接種し、５５〜６０℃にて、ＯＤ６００が０．５になるまで培養した。得られたジオバチラス・カウストフィラス培養液は室温まで冷却した。ジオバチラス・カウストフィラス培養液（９ｍＬ）と核酸供与体培養液（１ｍＬ）とを混合し、菌体を吸引ろ過により膜フィルター（０．２２μｍ）上に濃縮した。得られた膜フィルターを、菌体回収面がＬＢ固体培地表面に接するように、ＬＢ固体培地上に静置した（３７℃、一晩）。次いで、膜フィルター上の菌体をＬＢ液体培地に懸濁し、５μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ固体培地に塗布し、６０℃にて一晩培養し、生育したコロニーを形質転換体として得た。
【００８３】
（プラスミドの導入）
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株をｐＵＣＧ１８Ｔの核酸受容体とし、大腸菌ＢＲ３９７［ｐＵＣＧ１８Ｔ］、ＢＲ３９８［ｐＵＣＧ１８Ｔ］、ＢＲ３９９［ｐＵＣＧ１８Ｔ］、ＢＲ４０１［ｐＵＣＧ１８Ｔ］およびＢＲ４０８［ｐＵＣＧ１８Ｔ］をｐＵＣＧ１８Ｔの核酸供与体とした接合伝達を行った。接合伝達後のジオバチラス・カウストフィラス菌体をＬＢ固体培地および５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ固体培地にそれぞれ塗布し、６０℃にて一晩培養し、生育したコロニー数から接合伝達効率を算出した。結果を以下の表１に示す。
【００８４】
同様にして、ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株をｐＳＴＥ３３Ｔの核酸受容体とし、大腸菌ＢＲ３９７［ｐＳＴＥ３３Ｔ］、ＢＲ３９８［ｐＳＴＥ３３Ｔ］、ＢＲ３９９［ｐＳＴＥ３３Ｔ］、ＢＲ４０１［ｐＳＴＥ３３Ｔ］およびＢＲ４０８［ｐＳＴＥ３３Ｔ］をｐＳＴＥ３３Ｔの核酸供与体とした接合伝達を行った。接合伝達後のジオバチラス・カウストフィラス菌体をＬＢ固体培地および５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ固体培地にそれぞれ塗布し、６０℃にて一晩培養し、生育したコロニー数から接合伝達効率を算出した。結果を表１に示す。
【００８５】
【表１】
【００８６】
表１より、ｐＵＣＧ１８Ｔの場合、ＤＮＡメチル化酵素としてｄａｍが接合伝達効率（形質転換効率）に支配的に影響を及ぼしていることがわかる。しかし、ｐＳＴＥ３３Ｔの場合、ＤＮＡメチル化酵素としてｈｓｄＭ１Ｓ１、ｈｓｄＭ２Ｓ２およびｄａｍのすべてが接合伝達効率（形質転換効率）に均等に影響を及ぼしており、３つの酵素が揃うと形質転換効率が高くなることがわかる。
【００８７】
ｐＳＴＥ３３Ｔで形質転換されたジオバチラス・カウストフィラスを５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ液体培地で６０℃にて一晩振盪培養し、培養菌体中に含まれるプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドＤＮＡは、制限酵素マッピング、ＰＣＲ解析およびＤＮＡ配列解析により、ｐＳＴＥ３３Ｔであることを確認した。得られたプラスミドＤＮＡは大腸菌を形質転換できることも確認した。
【００８８】
ｐＵＣＧ１８Ｔで形質転換されたジオバチラス・カウストフィラスを５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ液体培地で６０℃にて一晩振盪培養し、培養菌体中に含まれるプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドＤＮＡは、低コピー数のため、制限酵素マッピングできるほど量がなかったが、ＰＣＲ解析により、ｐＵＣＧ１８Ｔであることを確認した。得られたプラスミドは大腸菌を形質転換できることも確認した。
【００８９】
ｐＵＣＧ１８ＴおよびｐＳＴＥ３３Ｔで形質転換されたジオバチラス・カウストフィラスを５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ液体培地で６０℃にて一晩それぞれ振盪培養した。培養菌体中に含まれるプラスミドのコピー数をL. Wuら、J. Gen. Microbiol.、1989年、第135巻、p. 1315-1324に記載の方法に従い解析した。
【００９０】
ｐＵＣＧ１８ＴおよびｐＳＴＥ３３Ｔで形質転換されたジオバチラス・カウストフィラスをＬＢ液体培地で６０℃にて一晩それぞれ振盪培養した後、その一部をＬＢ固体培地および５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ固体培地に塗布し、６０℃にて一晩それぞれ培養した。生育したコロニー数から各プラスミドの残存率を算出した。
【００９１】
実施例７：ジオバチラス・カウストフィラスの形質転換２：２重交叉相同組換えによるＧＫ１１５５遺伝子の欠失
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株を核酸受容体とし、大腸菌ＢＲ４０８［ｐΔＧＫ１１５５−１］を核酸供与体とした接合伝達により、ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株にｐΔＧＫ１１５５−１を導入した。接合伝達後の菌体を５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ固体培地上に塗布し、６０℃にて一晩培養した。生育したコロニーをＭＭ３最少固体培地（０．０３％(w/v)Ｋ２ＳＯ４、０．２５％(w/v)Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１％(w/v)ＮＨ４Ｃｌ、０．０００３％(w/v)ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．０００５％(w/v)ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０００７％(w/v)ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．００００４％(w/v)ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０００００１％(w/v)Ｈ３ＢＯ３、０．０００００５％(w/v)ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．００００２％(w/v)ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０００００１％(w/v)ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．００００２５％(w/v)エチレンジアミン四酢酸塩、１％(w/v)Ｄ−グルコース、０．１％(w/v)カザミノ酸、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５、０．０４％(w/v)ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２％(w/v)寒天末、１０μｇ／ｍＬウラシル）に移し、ウラシル要求性株をスクリーニングした。得られたウラシル要求性株の１つを、ＭＫ２７株と命名した。ＭＫ２７株のＧＫ１１５５遺伝子はＴＫ１０１遺伝子の挿入により欠失（ΔＧＫ１１５５：：ＴＫ１０１）していることをＰＣＲ解析により確認した（図２）。
【００９２】
実施例８：ジオバチラス・カウストフィラスの形質転換３：ＧＫ１１５５遺伝子のマーカーフリー欠失
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株を核酸受容体とし、大腸菌ＢＲ４０８［ｐΔＧＫ１１５５−２］を核酸供与体とした接合伝達により、ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株にｐΔＧＫ１１５５−２を導入した。接合伝達後の菌体を５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ固体培地上に塗布し、６０℃にて一晩培養した。生育したコロニーの１つをＬＢ液体培地１００ｍＬに接種し、６０℃にて一晩振盪培養した。得られた培養液の一部（１０μｌ）を新しいＬＢ液体培地１００ｍＬに接種し、引き続き６０℃にて一晩振盪培養した。同様の操作をさらに２回繰り返した後、培養液の一部をＬＢ固体培地に塗布し、６０℃にて一晩培養した。生育したコロニー約１０００個をＬＢ固体培地および５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ液体培地に接種し、カナマイシン感受性株をスクリーニングした。得られた８株のカナマイシン感受性株をＭＭ３最少固体培地および１０μｇ／ｍＬのウラシルを含有するＭＭ３最少固体培地に塗布し、ウラシル要求性株をスクリーニングした。得られた４株のウラシル要求性株のうち１クローンをジオバチラス・カウストフィラスＭＫ５４株と命名した。ＭＫ５４株のＧＫ１１５５遺伝子はｉｎ−ｆｒａｍｅ欠失（ΔＧＫ１１５５）していることをＰＣＲ解析により確認した（図３）。
【００９３】
実施例９：ジオバチラス・カウストフィラスの形質転換４：異種遺伝子ａｍｙＥの発現
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株を核酸受容体とし、大腸菌ＢＲ４０８［ｐＧＡＭ１５−ＢＳａｍｙＥ］を核酸供与体とした接合伝達により、ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株にｐＧＡＭ１５−ＢＳａｍｙＥを導入した。得られた形質転換体の１つをＭＫ４２株と命名した。ＭＫ４２株のゲノムにｐＧＡＭ１５−ＢＳａｍｙＥ由来の発現カセット（ｓｉｇＡプロモーターとその下流のａｍｙＥ遺伝子）が組み込まれていることをＰＣＲ解析により確認した。ＭＫ４２株を１％(w/v)可溶性デンプンを含むＬＢ固体培地に塗布し、６０℃にて一晩培養した。培地中の未分解デンプンをヨウ素・よう化カリウム液（ナカライテスク）で染色することで、α−アミラーゼ活性の有無を定性的に評価した。
【００９４】
ＭＫ４２株を５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ液体培地に接種し、６０℃にて２４時間培養した。得られた菌体を遠心分離により回収し、２ｍＬの抽出用緩衝液（０．１Ｍ ３−モルホリノプロパンスルホン酸−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ６．９）に懸濁した後、超音波破砕した。均一化された懸濁液を遠心分離し、上清を粗酵素抽出液として得た。EnzChek Ultra Amylase Assay Kit（Molecular Probes社製）を用いて粗酵素抽出液中のα−アミラーゼ活性を定量した。なお、酵素反応は６０℃にて行った。結果を以下の表２に示す。
【００９５】
実施例１０：ジオバチラス・カウストフィラスの形質転換５：異種遺伝子ｂｇａＢの発現
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株を核酸受容体とし、大腸菌ＢＲ４０８［ｐＧＡＭ１５−ｂｇａＢ］を核酸供与体とした接合伝達により、ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株にｐＧＡＭ１５−ｂｇａＢを導入した。得られた形質転換体の１つをＭＫ３９株と命名した。ＭＫ３９株のゲノムにｐＧＡＭ１５−ｂｇａＢ由来の発現カセット（ｓｉｇＡプロモーターとその下流のｂｇａＢ遺伝子）が組み込まれていることをＰＣＲ解析により確認した。ＭＫ３９株を２００μｇ／ｍＬの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含有するＬＢ固体培地に塗布し、６０℃にて一晩培養した。コロニーが青色を呈色するか否かでβ−ガラクトシダーゼ活性の有無を定性的に評価した。
【００９６】
ＭＫ３９株を５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ液体培地に接種し、６０℃にて２４時間培養した。得られた菌体を遠心分離により回収し、２ｍＬの抽出用緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）に懸濁した後、超音波破砕した。均一化された懸濁液を遠心分離し、上清を粗酵素抽出液として得た。粗酵素抽出液にｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを加え、その分解速度を測定することにより、粗酵素抽出液中のβ−ガラクトシダーゼ活性を評価した。なお、酵素反応は６０℃にて行った。結果を表２に示す。
【００９７】
【表２】
【００９８】
表２より、異種遺伝子のａｍｙＥおよびｂｇａＢは、ジオバチラス・カウストフィラスに導入された後も、菌体内で維持されるだけでなく、それぞれα−アミラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼの遺伝子を発現することがわかる。また、ａｍｙＥから発現したα−アミラーゼは、正常にプロセッシングを受けて分泌されることがわかる。
【００９９】
実施例１１：ジオバチラス・カウストフィラスの形質転換６：誘導型プロモーターによるｂｇａＢ遺伝子の発現
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株を核酸受容体とし、大腸菌ＢＲ４０８［ｐＧＡＭ３１−ｂｇａＢ］を核酸供与体とした接合伝達により、ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株にｐＧＡＭ３１−ｂｇａＢを導入した。得られた形質転換体の１つをＭＫ６１株と命名した。ＭＫ６１株のゲノムにｐＧＡＭ３１−ｂｇａＢ由来の発現カセット（ＧＫ０７０４プロモーターとその下流のｂｇａＢ遺伝子）が組み込まれていることをＰＣＲ解析により確認した。ＭＫ６１株をＭＭ３最少液体培地、１％(w/v)Ｄ−グルコースを含有するＭＭ３最少液体培地、１％(w/v)マルトースを含有するＭＭ３最少液体培地、１％(w/v)可溶性デンプンを含有するＭＭ３最少液体培地、１％(w/v)ミオ−イノシトールを含有するＭＭ３最少液体培地、１％(w/v)Ｄ−キシロースを含有するＭＭ３最少液体培地、１％(w/v)Ｌ−アラビノースを含有するＭＭ３最少液体培地、および１％(w/v)キシロオリゴ糖を含有するＭＭ３最少液体培地にそれぞれ接種し、６０℃にて４８時間培養した。実施例１０と同様にして、得られた菌体から粗酵素抽出液を調製し、粗酵素抽出液中のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。Bio-Rad Protein Assay kit（Bio-Rad社製）を用いて粗酵素抽出液中の総タンパク質量を測定した。その際に、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質として用いた。総タンパク質量あたりのβ−ガラクトシダーゼ活性を比活性として求めた。結果を表３に示す。
【０１００】
【表３】
【０１０１】
表３より、マルトースや可溶性デンプンによりｂｇａＢの発現が強く誘導されていることがわかる。このことから、ＧＫ０７０４プロモーターは誘導型プロモーターとして利用できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明によれば、好熱性微生物の形質転換を高い形質転換効率で行うことができる。好熱性微生物の形質転換体は、高温下の発酵などバイオプロセスに用いることができ、高温下のバイオプロセスは、菌体内の高い代謝速度に加えて、雑菌増殖の防止、発酵熱の有効利用、原料および生産物の水溶性向上など、数多くの点で、従来の常温下のバイオプロセスにはない利点を有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好熱性微生物の形質転換方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
好熱性微生物は古くから研究されており、数多くの好熱性微生物が単離、同定されている。好熱性微生物は耐熱性酵素の供給源であるとともに、高温下の発酵などバイオプロセスの宿主としても適している。高温下のバイオプロセスは、菌体内の高い代謝速度に加えて、雑菌増殖の防止、発酵熱の有効利用、原料および生産物の水溶性向上など、数多くの点で、従来の常温下のバイオプロセスにはない利点を有する。
【０００３】
しかし、好熱性微生物の形質転換方法は、一部の微生物について報告されているのみである。一般に、微生物は、外敵の侵入から自らを防護する手段として制限修飾系を発達させている。制限修飾系とは、ウイルスやファージなどといった外来ＤＮＡから自己を守るために発達した機構である。Ｉ〜ＩＩＩ型制限修飾系は、ＤＮＡを切断する制限酵素とＤＮＡをメチル化する修飾酵素とから構成される。これら制限修飾系を保有する細菌内では、異種生物由来またはウイルスなどのＤＮＡが細菌に侵入したとしても、制限酵素により切断を受け複製できない。修飾酵素は、制限酵素が認識する塩基配列と同じ塩基配列を認識してこれをメチル化し、制限酵素による切断からＤＮＡを守る役割を果たす。自らのＤＮＡが生成した直後にこれをメチル化することによって、自らのＤＮＡを自らの制限酵素から保護している。すなわち、外来ＤＮＡを微生物に導入して微生物を形質転換するには、制限修飾系の解除または克服が重要な手段となり得る。好熱性微生物の多くは、上述のＩ〜ＩＩＩ型の制限修飾系のほかにＩＶ型の制限系も有している。ＩＶ型の制限系は、「余分なメチル化」を認識し切断するという特徴を有し、ＩＶ型の制限系の解除もきわめて重要である。このため、バイオプロセスには、制限修飾系が詳しく研究されている大腸菌や枯草菌など特定の微生物が汎用されている。
【０００４】
新たな宿主に対する形質転換系の開発も進められている。非特許文献１には、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）ＣＤ６株に対する形質転換系が記載されている。クロストリジウム・ディフィシルに導入する核酸を調製するための大腸菌ＨＢ１０１株に対して、クロストリジウム・ディフィシルの制限修飾系による制限を回避するために、クロストリジウム・ディフィシルの修飾酵素と類似の修飾酵素であるＭ．Ｓａｕ９６Ｉの遺伝子を導入して、このメチル化酵素の遺伝子を発現する宿主を構築したことが記載されている。このような大腸菌宿主を用いて調製した核酸を接合伝達法によりクロストリジウム・ディフィシルに導入したところ、形質転換効率が上昇し、核酸供与体あたり１．０×１０−７〜１．０×１０−６の値が得られている。
【０００５】
非特許文献２には、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）に対する形質転換系が記載されている。ビフィドバクテリウム・アドレセンティスに導入する核酸を調製するための大腸菌ＴＯＰ１０株に対して、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスの制限修飾系による制限を回避するために、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスのゲノム情報からＩＩ型制限修飾系の修飾酵素であるメチル化酵素のＢＡＤ１２３３およびＢＡＤ１２８３の遺伝子を同定し、これらの遺伝子を導入してこれらのメチル化酵素の遺伝子を発現する宿主を構築したことが記載されている。このような大腸菌宿主を用いて調製した核酸を電気穿孔法によりビフィドバクテリウム・アドレセンティスに導入したところ、形質転換効率が１０４〜１０５倍上昇している。非特許文献２には、Ｉ型制限修飾系の修飾酵素の利用についても記載されている。
【０００６】
特許文献１には、好熱性バチラス属細菌に対する形質転換系が記載されている。具体的には、ヘモフィラス・アエジプチウス（Haemophilus aegyptius）由来のＨａｅＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（メチル化酵素）の遺伝子を大腸菌に導入してこの酵素の遺伝子を発現する宿主を構築し、このような大腸菌宿主を用いて調製した核酸を電気穿孔法によりバチラス属細菌に導入すると、形質転換効率が上昇した。このバチラス属細菌にはＨａｅＩＩＩ制限修飾系（GGCC配列を認識する系）に相同または類似の制限修飾系（例えば、GGGCCC配列を認識する系など）があると思われる。
【０００７】
ところで、好熱性微生物の中でも、特にジオバチラス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）に対する期待が大きい。ジオバチラス・カウストフィラスは、耐熱性酵素の供給源として長く利用されてきた経緯があり、ゲノム情報が公開されている点、培養が容易である点、栄養要求性がほとんどない点、グラム陽性菌のため高いタンパク質分泌能が期待できる点、ＧＣ含量が５０％程度であるため比較的ＧＣ含量の影響を受けずに異種遺伝子の発現が期待できる点など、数多くの利点を有するからである。しかし、形質転換系はまだ確立されていない。ジオバチラス・カウストフィラスは、ゲノム情報から２つのＩ型制限修飾系および１つのＩＩ型制限修飾系のほかに３つのＩＶ型制限系を有すると推定されている。ゲノムが公開されているジオバチラス（Geobacillus）属の多く（例えば、Geobacillus kaustophilus、Geobacillus sp. WCH70、Geobacillus sp. Y412MC10、Geobacillus sp. Y412MC61、Geobacillus thermodenitrificans NG80-2）もＩＶ型制限系を有すると推定されている。
【０００８】
特許文献２および非特許文献３には、核酸受容体となるジオバチラス・サーモグルコシダシウス（Geobacillus thermoglucosidasius）に対して核酸供与体となる大腸菌ＪＭ１０９株で調製したＤＮＡを電気穿孔法により導入して形質転換体を得たことが記載されている。しかし、この例では、特に制限修飾系の解除は行われていない。これは、この細菌が、たまたま制限修飾系を有していないからと考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際特許出願公開第０１／８５９６６号公報
【特許文献２】特表２００８−５３９７１０号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】D. Purdyら、Mol. Microbiol.、2002年、第46巻、p. 439-452
【非特許文献２】K. Yasuiら、［online］、2008年11月12日、Nucleic Acids Res.、2009年、第37巻、第１号、e3、doi:10.1093/nar/gkn884
【非特許文献３】R. E. Crippsら、Metabolic Engineering、2009年、第11巻、p. 398-408
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、形質転換効率が高い好熱性微生物の形質転換方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素の遺伝子を好熱性微生物とは異なる種の宿主中で発現させ、かつこの宿主中でこれらの酵素以外のＤＮＡメチル化酵素の遺伝子を発現させないことによって、このように作製された宿主を用いて調製したＤＮＡによる好熱性微生物の形質転換効率が非常に高いことを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
本発明は、好熱性微生物の形質転換方法を提供し、該方法は、該好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素によってメチル化ＤＮＡを調製する工程、および該メチル化ＤＮＡを該好熱性微生物に導入する工程を含み、該酵素は、該好熱性微生物とは異なる種の宿主中に存在し、そして該酵素以外のＤＮＡメチル化酵素は、該宿主中に存在しない。
【００１４】
１つの実施態様では、制限酵素は、上記宿主中に存在しない。
【００１５】
１つの実施態様では、上記メチル化ＤＮＡを調製する工程は、（１）上記好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素の遺伝子を発現し、該酵素以外のＤＮＡメチル化酵素の遺伝子を発現しない宿主を作製する工程、および（２）該工程（１）で得られた宿主に任意のＤＮＡを導入して、形質転換体を調製する工程を含む。
【００１６】
１つの実施態様では、上記工程（１）において、上記宿主は、制限酵素の遺伝子を発現しない。
【００１７】
１つの実施態様では、上記メチル化ＤＮＡを上記好熱性微生物に導入する工程において、該メチル化ＤＮＡを接合伝達法により導入する。
【００１８】
１つの実施態様では、上記好熱性微生物は、ジオバチラス属細菌である。
【００１９】
１つの実施態様では、上記ジオバチラス属細菌は、ジオバチラス・カウストフィラスである。
【００２０】
１つの実施態様では、上記宿主は、大腸菌である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、好熱性微生物の形質転換を高い形質転換効率で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】プラスミドｐＩＲ４０８（ａ）、ｐＳＴＥ３３Ｔ（ｂ）およびｐＵＣＧ１８Ｔ（ｃ）の構造を示す模式図である。
【図２】２重交叉相同組換え実験において、用いたプラスミドｐΔＧＫ１１５５−１の構造を示す模式図（ａ）、ＰＣＲ解析の結果を示す電気泳動写真（ｂ）、ウラシル要求性のスクリーニング結果を示す写真（ｃ）および実験手順を示す模式図（ｄ）である。
【図３】ＧＫ１１５５遺伝子のマーカーフリー欠失実験において、用いたプラスミドｐΔＧＫ１１５５−２の構造を示す模式図（ａ）、ＰＣＲ解析の結果を示す電気泳動写真（ｂ）および実験手順を示す模式図（ｃ）である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明で用いる好熱性微生物とは、生育至適温度が４５℃以上または生育限界温度が５５℃以上の微生物をいい、生育可能温度が好ましくは４０〜１３０℃、より好ましくは４２〜７５℃の微生物をいう。ここで、微生物とは、細菌（真正細菌）、始原菌（古細菌）および真核微生物を含む。好熱性微生物としては、例えば、ジオバチラス（Geobacillus）属細菌、バチラス（Bacillus）属細菌、サーマス（Thermus）属細菌、アクイフェックス（Aquifex）属細菌、サーモトーガ（Thermotoga）属細菌、サーモデスルフォバクテリウム（Thermodesulfobacterium）属細菌、メタノピラス（Methanopyrus）属始原菌、ジオゲンマ（Geogemma）属始原菌、ピロロバス（Pyrolobus）属始原菌、ピロディクチウム（Pyrodictium）属始原菌、ハイパーサーマス（Hyperthermus）属始原菌，ピロコッカス（Pyrococcus）属始原菌、ピロバキュルム（Pyrobaculum）属始原菌、アエロピュルム（Aeropyrum）属始原菌、サーモコッカス（Thermococcus）属細菌、メタノカルドコッカス（Methanocaldococcus）属始原菌、スルフォロバス（Sulfolobus）属始原菌、サーモマイセス（Thermomyces）属子嚢菌が挙げられる。好ましくはジオバチラス属細菌であり、より好ましくはジオバチラス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）である。
【００２４】
本発明でいう形質転換とは、微生物のゲノムＤＮＡの改変または微生物へのＤＮＡの導入によりもたらされる改変をいい、染色体ＤＮＡの欠失、複製、変異、または自律複製プラスミドの導入による形質変化すべてを含む。導入されたＤＮＡは、染色体に組み込まれて維持、複製されてもよく、プラスミドなどのように染色体とは独立して維持、複製されてもよい。ＤＮＡを微生物の染色体の特定の部位に組み込む場合には、相同組換え技術を用いてもよい。
【００２５】
本発明の方法は、形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素によってメチル化ＤＮＡを調製する工程と、このように調製されたメチル化ＤＮＡを形質転換の対象とする好熱性微生物に導入する工程とを含む。
【００２６】
本発明で用いるＤＮＡメチル化酵素とは、ＤＮＡの塩基配列上の特定の塩基をメチル化する酵素（メチラーゼ）、特定の塩基にメチル基を転移する酵素（メチルトランスフェラーゼ）、または修飾酵素をいう。
【００２７】
ＤＮＡメチル化酵素は主として微生物などの生体防御系の１つである制限修飾系に由来する。制限修飾系としては、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型が挙げられる。
【００２８】
Ｉ〜ＩＩＩ型制限修飾系は、自身のＤＮＡをメチル化などで修飾する修飾酵素と、ＤＮＡの特定配列を認識切断するが、修飾を受けた部位は切断しない制限酵素との組み合わせからなり、外部から侵入したファージなどのＤＮＡを選択的に切断分解する生体防御系である。Ｉ型制限修飾系は、３種類のサブユニットＲ、ＭおよびＳから構成される複合体であり、サブユニットは、それぞれ制限（切断）、修飾（メチル化）および認識を担う。ＩＩ型制限修飾系は、制限酵素および修飾酵素から構成されるが、一般に複合体を形成していない。ＩＩ型制限修飾系には、遺伝子工学で用いられる制限酵素のほとんどが属し、対応するメチラーゼによって制限酵素の反応が抑制される。ＩＩＩ型制限修飾系は、２種類のサブユニットＲおよびＭから構成される複合体であり、サブユニットは、それぞれ制限（切断）および修飾（メチル化）を担う。
【００２９】
ＩＶ型制限系は制限酵素のみから構成され、修飾酵素を含まない。ファージなどにみられるメチル化ＤＮＡを認識し切断する。ＩＶ型制限系は、「余分なメチル化」を認識し切断するという特徴を有する。認識配列については不明確なものがほとんどであるが、様々なメチル化ＤＮＡを認識し切断するとされている。
【００３０】
本発明では、形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素を用いるが、これと同一の活性を有する限り、ほかに由来する酵素を用いてもよい。すなわち、形質転換の対象とする好熱性微生物の制限修飾系によるＤＮＡの切断を回避するメチル化をＤＮＡに導入することができる酵素であればよい。
【００３１】
形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素によってメチル化されたＤＮＡは、好熱性微生物に導入された後もＤＮＡメチル化酵素に対応する制限酵素による切断を受けない。このため、形質転換効率が上昇する。
【００３２】
メチル化されるＤＮＡは、特に制限されず、任意のＤＮＡである。天然由来のものであっても、人工的なものであってもよい。例えば、生物から抽出して得られるものであっても、ＰＣＲや有機合成などの人工的な方法によって得られるものであってもよい。
【００３３】
ＤＮＡ上の塩基配列が有する情報の観点からは、好ましくは遺伝子であり、より好ましくはタンパク質をコードする遺伝子である。タンパク質をコードする遺伝子を導入する場合には、該遺伝子を導入した好熱性微生物中で該遺伝子からタンパク質を発現するために、様々なＤＮＡ断片を該遺伝子に付加し得る。例えば、プロモーター断片を該遺伝子の上流に付加し得る。例えば、ターミネーター断片を該遺伝子の下流に付加し得る。プロモーターとしては、シグマプロモーター、マルトース代謝オペロンプロモーター、トリプトファン生合成オペロンプロモーターが挙げられるが、特に制限されない。ターミネーターとしては、Ｔ７ターミネーター、ラムダバクテリオファージｔ０ターミネーター、ｒｒｎＢターミネーターが挙げられるが、特に制限されない。さらに、例えば、該遺伝子から発現するタンパク質を菌体外に分泌させるために分泌シグナルを該遺伝子の上流に付加し得る。これらのＤＮＡ断片が発現カセットを構成し、プラスミドとして維持されていることが好ましい。
【００３４】
プラスミドは、プラスミドの調製および形質転換体の検出を容易にする点で、選択マーカーと適切な複製遺伝子とを有することが好ましい。選択マーカーとしては、例えば、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子が挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）が挙げられるが、特に制限されない。栄養要求性遺伝子としては、ウラシル生合成遺伝子、トリプトファン生合成遺伝子、ヒスチジン生合成遺伝子が挙げられるが、特に制限されない。栄養要求性遺伝子は、対応する栄養生合成遺伝子が欠失している宿主を用いる場合に好ましく用いられる。
【００３５】
メチル化ＤＮＡを形質転換の対象とする好熱性微生物に導入する方法としては、特に制限されないが、例えば、接合伝達法、電気穿孔法、プロトプラスト融合法、パーティクルガン法、コンピテントセルを用いる方法が挙げられる。好ましくは接合伝達法である。接合伝達法では、核酸供与体（好熱性微生物とは異なる種の宿主、大腸菌など）が核酸受容体（好熱性微生物）と接合し、核酸供与体の中の核酸を核酸受容体に伝達する。接合伝達法によりＤＮＡを導入するには、核酸供与体の中に接合と伝達に関与する遺伝子（ｔｒａ遺伝子またはｍｏｂ遺伝子）が発現している必要がある。このような遺伝子を含むプラスミドとしては、例えば、ＲＰ４由来プラスミド、ＲＰ１由来プラスミド、Ｒ６８．４５由来プラスミド、Ｒ３８８由来プラスミド、Ｓ−ａ由来プラスミド、プラスミドｐＭＤ１０１、プラスミドｐＵＢ３０７、プラスミドｐＲＫ２０１３、プラスミドｐＪＲＤ２１５、プラスミドｐＳＵＰ１０１１が挙げられる。接合伝達は、核酸供与体から核酸を一旦回収する必要がなく、単に核酸供与体と核酸受容体とを混合させるだけでよいため、簡単にＤＮＡを導入することができる。大腸菌などの好熱性微生物とは異なる種の宿主、特に常温菌から好熱性微生物にＤＮＡを接合伝達する場合、接合伝達後に、温度を好熱性微生物の生育温度まで上昇させることにより、核酸供与体が死滅するため、ＤＮＡが導入された核酸受容体を簡単に選別することができる。
【００３６】
本発明の特徴は、形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素が好熱性微生物とは異なる種の宿主中に存在して、すなわちインビボにおいて、形質転換に用いるＤＮＡをメチル化する点にある。インビボのメチル化は、インビトロのメチル化に比べて、簡単かつ確実に大量のメチル化ＤＮＡを調製できる。
【００３７】
形質転換の対象とする好熱性微生物とは異なる種の宿主としては、特に制限されないが、ゲノムや形質転換系などがよく研究されている点で大腸菌が好ましい。
【００３８】
本発明の特徴はまた、形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素以外のＤＮＡメチル化酵素が、上記宿主中に存在しない点、すなわち形質転換に用いるＤＮＡは、形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素によるメチル化以外にはメチル化されない点にある。ＩＶ型制限系は「余分なメチル化」を認識して切断する。ＩＶ型制限系による制限を回避するために、好ましくは形質転換に用いるＤＮＡは、形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素によるメチル化以外に受けるメチル化が抑制される必要がある。このために、メチル化ＤＮＡを調製する宿主由来のＤＮＡメチル化酵素の遺伝子を欠失させることが好ましい。
【００３９】
本発明では、形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素が、好熱性微生物とは異なる種の宿主中に存在して、形質転換に用いるＤＮＡをメチル化する。このメチル化ＤＮＡを宿主由来のＩＶ型制限系による制限から保護するために、制限酵素が上記宿主中に存在しないことが好ましい。このために、メチル化ＤＮＡを調製する宿主由来の制限酵素の遺伝子を欠失させることが好ましい。
【００４０】
具体的に、メチル化ＤＮＡを調製する工程は、
（１）メチル化ＤＮＡの調製に用いる宿主として、形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素の遺伝子を発現し、これらの酵素以外のＤＮＡメチル化酵素の遺伝子を発現しない宿主を作製する工程、および
（２）工程（１）で得られた宿主に任意のＤＮＡを導入して、形質転換体を調製する工程
を含む。
【００４１】
（１）形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素の遺伝子を発現し、これらの酵素以外のＤＮＡメチル化酵素の遺伝子を発現しない宿主を作製する方法としては、特に制限されないが、例えば、メチル化ＤＮＡの調製に用いる宿主に対して、宿主由来のＤＮＡメチル化酵素の遺伝子を欠失させ、かつ形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素の遺伝子を導入する方法が挙げられる。好ましくは、宿主由来のすべてのＤＮＡメチル化酵素の遺伝子を欠失させ、かつ形質転換の対象とする好熱性微生物由来のすべてのＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素の遺伝子を導入する。
【００４２】
さらに、上記工程（１）において用いる宿主に対して、宿主由来の制限酵素の遺伝子を欠失させることが好ましい。より好ましくは、宿主由来のすべての制限酵素の遺伝子を欠失させる。
【００４３】
あるいは、形質転換の対象とする好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素と同一の活性を有する酵素がメチル化ＤＮＡの調製に用いる宿主中に存在する場合には、これを好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素の代用として用いることができる。この場合、特に宿主の遺伝子を操作する必要がない。
【００４４】
遺伝子を欠失させる方法としては、特に制限されない。例えば、相同組換え技術、変異誘発剤を用いる方法が挙げられる。目的とする遺伝子を効率的に欠失させることができる点で、相同組換え技術が好ましい。相同組換え技術としては、例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰを用いる方法、ＦＬＰリコンビナーゼを用いる方法、遺伝子ターゲティング法が挙げられる。具体的には、例えば、欠失させるＤＮＡメチル化酵素の遺伝子のコーディング領域の中に薬剤耐性遺伝子が挿入された構造を有するプラスミドを構築し、このプラスミドを大腸菌に導入する。大腸菌を薬剤存在下で培養すると、薬剤耐性遺伝子によって破壊されたＤＮＡメチル化酵素の遺伝子が、正常なＤＮＡメチル化酵素の遺伝子と組換えを起こした大腸菌が選択的に増殖する。好ましくは、すべてのＤＮＡメチル化酵素の遺伝子について同様の操作を繰り返す。
【００４５】
遺伝子を導入する方法としては、特に制限されない。上述のメチル化ＤＮＡを好熱性微生物に導入する方法と同様の方法が用いられる。好ましくは、すべてのＤＮＡメチル化酵素の遺伝子について同様の操作を繰り返す。
【００４６】
（２）工程（１）で得られた宿主に任意のＤＮＡを導入して、形質転換体を調製する方法としては、特に制限されない。上述のメチル化ＤＮＡを好熱性微生物に導入する方法と同様の方法が用いられる。形質転換体は、形質転換体の由来に応じて、当業者が通常用いる方法により適宜培養して調製し得る。
【００４７】
本発明の方法において、メチル化ＤＮＡを形質転換の対象とする好熱性微生物に導入する工程で、例えば、接合伝達法、プロトプラスト融合法を用いる場合は、上記工程（２）の後、形質転換体からＤＮＡを回収する必要はないが、例えば、電気穿孔法を用いる場合は、上記工程（２）の後、形質転換体からＤＮＡを回収する必要がある。形質転換体からのＤＮＡの回収は、形質転換体の由来に応じて、当業者が通常用いる方法により行われ得る。
【実施例】
【００４８】
以下に、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００４９】
プラスミドＤＮＡの抽出にはWizard Plus SV Minipreps（Promega社製）を用いた。アガロースゲルからのＤＮＡの回収にはQIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen社製）を用いた。
【００５０】
実施例１：好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素遺伝子発現プラスミドの作製
プラスミドｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１（Novagen社製）のｐ１５Ａ複製起点（ｐ１５Ａｏｒｉ）およびクロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍｒ）を含む領域をＰＣＲ法（プライマー１Ｆ：配列番号１およびプライマー１Ｒ：配列番号２）により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素ＢｇｌＩＩで消化し、DNA ligaseを用いて自己環化させた。得られたプラスミドをｐＩＲ１０１と命名した。
【００５１】
QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagen社製）を用いてｐＩＲ１０１に含まれる２ヶ所の制限酵素ＤｒａＩ部位を破壊した。制限酵素ＤｒａＩ部位の破壊には、プライマー２Ｆ：配列番号３およびプライマー２Ｒ：配列番号４、ならびにプライマー３Ｆ：配列番号５およびプライマー３Ｒ：配列番号６を用いた。得られたプラスミドをｐＩＲ２００と命名した。
【００５２】
プラスミドｐＵＣ１９（タカラバイオ株式会社製）に含まれるｌａｃプロモーター領域をＰＣＲ法（プライマー４Ｆ：配列番号７およびプライマー４Ｒ：配列番号８）により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＩＲ１０１の制限酵素ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位間に挿入した。得られたプラスミドをｐＩＲ１０２と命名した。
【００５３】
ｐＩＲ１０２に含まれるｌａｃプロモーター領域をＰＣＲ法（プライマー５Ｆ：配列番号９およびプライマー５Ｒ：配列番号１０）により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＩＲ２００の制限酵素ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位間に挿入した。得られたプラスミドをｐＩＲ２０１と命名した。
【００５４】
ｐＩＲ２０１中に含まれるｌａｃプロモーター領域をＰＣＲ法（プライマー６Ｆ：配列番号１１およびプライマー６Ｒ：配列番号１２）により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＩＲ２００の制限酵素ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位間に挿入した。得られたプラスミドをｐＩＲ２０２と命名した。
【００５５】
QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用いてｐＩＲ２０２に制限酵素ＢａｍＨＩ部位を導入した。制限酵素ＢａｍＨＩ部位の導入には、プライマー７Ｆ：配列番号１３およびプライマー７Ｒ：配列番号１４を用いた。得られたプラスミドをｐＩＲ２０３と命名した。
【００５６】
大腸菌ＤＨ５α株のゲノムＤＮＡを鋳型としてｈｓｐ７０（ｄｎａＫ）遺伝子上流のプロモーター領域（ｄｎａＫ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）をＰＣＲ法（プライマー８Ｆ：配列番号１５およびプライマー８Ｒ：配列番号１６）により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩおよび制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、ｐＩＲ２０３の制限酵素ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入した。得られたプラスミドをｐＩＲ２０７と命名した。このプラスミドは、ｐ１５Ａ複製起点（ｐ１５Ａｏｒｉ）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍｒ）、およびｈｓｐ７０（ｄｎａＫ）遺伝子上流のプロモーター領域（ｄｎａＫ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を含み、プロモーター領域の下流にマルチクローニング部位を有する。プロモーターからマルチクローニング部位までを含む領域は２つのＳｗａＩ部位に挟まれている。
【００５７】
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株（ＪＣＭ１２８９３）のゲノムＤＮＡには、２つのＩ型制限修飾系遺伝子群（ＧＫ０３４３−ＧＫ０３４４−ＧＫ０３４６およびＧＫ１３８０−ＧＫ１３８１−ＧＫ１３８２）が存在する。これらのうちＤＮＡのメチル化に関与するＭサブユニット遺伝子（ＧＫ０３４３およびＧＫ１３８０）ならびにＳサブユニット遺伝子（ＧＫ０３４４およびＧＫ１３８１）をそれぞれＰＣＲ法により増幅した。ＧＫ０３４３遺伝子の増幅にはプライマー９Ｆ：配列番号１７およびプライマー９Ｒ：配列番号１８を用いた。ＧＫ０３４４遺伝子の増幅には、プライマー１０Ｆ：配列番号１９およびプライマー１０Ｒ：配列番号２０を用いた。ＧＫ１３８０遺伝子の増幅にはプライマー１１Ｆ：配列番号２１およびプライマー１１Ｒ：配列番号２２を用いた。ＧＫ１３８１遺伝子の増幅にはプライマー１２Ｆ：配列番号２３およびプライマー１２Ｒ：配列番号２４を用いた。
【００５８】
ＧＫ０３４３遺伝子とＧＫ０３４４遺伝子との増幅断片を融合ＰＣＲ法によって連結し、連結した断片をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Invitrogen社製）ベクターにクローニングした。得られたプラスミドのＧＫ０３４３−ＧＫ０３４４遺伝子に含まれる２ヶ所のＮｄｅＩ部位を破壊するために、このプラスミドを鋳型としてＰＣＲ（プライマー１３Ｆ：配列番号２５およびプライマー１３Ｒ：配列番号２６）を行い、次いで得られた増幅断片に対してQuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて部位特異的変異を導入した。得られたプラスミドからＧＫ０３４３−ＧＫ０３４４遺伝子領域を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化して切り出し、ｐＩＲ２０７の制限酵素ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入した。得られたプラスミドをｐＩＲ３９９と命名した。
【００５９】
ＧＫ１３８０遺伝子とＧＫ１３８１遺伝子との増幅断片を融合ＰＣＲ法によって連結し、連結した断片をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。得られたプラスミドのＧＫ１３８０−ＧＫ１３８１遺伝子に含まれる２ヶ所のＮｄｅＩ部位を破壊するために、このプラスミドを鋳型としてＰＣＲ（プライマー１４Ｆ：配列番号２７およびプライマー１４Ｒ：配列番号２８）を行い、次いで得られた増幅断片に対してQuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて部位特異的変異を導入した。得られたプラスミドからＧＫ１３８０−ＧＫ１３８１遺伝子領域を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化して切り出し、ｐＩＲ２０７の制限酵素ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入した。得られたプラスミドをｐＩＲ４０１と命名した。
【００６０】
ｐＩＲ３９９からＧＫ０３４３−ＧＫ０３４４遺伝子発現カセットを制限酵素ＳｗａＩで消化して切り出した。このカセット断片と制限酵素ＳｐｅＩで消化したｐＩＲ４０１とを混合し、In-fusion PCR Cloning Kit（Clontech社製）を用いて両ＤＮＡ断片を連結した。得られたプラスミドをｐＩＲ４０８（図１（ａ））と命名した。このプラスミドは、直列に連結されたＧＫ１３８０−ＧＫ１３８１遺伝子発現カセット（上流：ｈｓｄＭ２Ｓ２）とＧＫ０３４３−ＧＫ０３４４遺伝子発現カセット（下流：ｈｓｄＭ１Ｓ１）を有する。
【００６１】
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株のゲノムＤＮＡには、２つのＩ型制限修飾系遺伝子群のほかに１つのＩＩ型制限修飾系遺伝子群（ＧＫＰ０８−ＧＫＰ０９）が存在する。これらのうちＤＮＡメチラーゼ遺伝子ＧＫＰ０８をＰＣＲ法（プライマー１５Ｆ：配列番号２９およびプライマー１５Ｒ：配列番号３０）により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＩＲ２０７の制限酵素ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入した。得られたプラスミドをｐＩＲ４０５と命名した。
【００６２】
実施例２：形質転換に用いる発現プラスミドの作製
プラスミドｐＲＫ２０１３（D. H. Figurskiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1979年、第76巻、p. 1648-1652）に含まれるｏｒｉＴ領域をＰＣＲ法（プライマー１６Ｆ：配列番号３１およびプライマー１６Ｒ：配列番号３２）により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＳＴＥ３３（I. Narumiら、Biotechnol. Lett.、1993年、第15巻、p. 815-820）およびｐＵＣＧ１８（M. P. Taylorら、Plasmid、2008年、第60巻、p. 45-52）の制限酵素ＥｃｏＲＩ部位にそれぞれ挿入した。得られたプラスミドをそれぞれｐＳＴＥ３３Ｔ（図１（ｂ））およびｐＵＣＧ１８Ｔ（図１（ｃ））と命名した。
【００６３】
２つのオリゴヌクレオチド（プライマー１７Ｆ：配列番号３３およびプライマー１７Ｒ：配列番号３４）を融合ＰＣＲ法によって連結し、連結した断片を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、ｐＵＣ１９の制限酵素ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドをｐＬＸ１９と命名した。このプラスミドは２つの制限酵素ＢａｍＨＩ部位間にｌｏｘＰ配列を有する。
【００６４】
QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて、ｐＵＣ１９に制限酵素ＭｕｎＩ、ＦｂａＩおよびＢｇｌＩＩ部位を導入した。制限酵素部位の導入には、プライマー１８Ｆ：配列番号３５およびプライマー１８Ｒ：配列番号３６を用いた。得られたプラスミドをｐＧＫＥ１１と命名した。
【００６５】
ｐＲＫ２０１３に含まれるｏｒｉＴ領域をＰＣＲ法（プライマー１９Ｆ：配列番号３７およびプライマー１９Ｒ：配列番号３８）により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素ＰｃｉＩで消化し、ｐＧＫＥ１１およびｐＵＣ１９の制限酵素ＰｃｉＩ部位にそれぞれ挿入した。得られたプラスミドをそれぞれｐＧＫＥ１１ＴおよびｐＵＣ１９Ｔと命名した。
【００６６】
ｐＳＴＥ３３に含まれるＴＫ１０１遺伝子（耐熱性カナマイシン耐性遺伝子）をＰＣＲ法（プライマー２０Ｆ：配列番号３９およびプライマー２０Ｒ：配列番号４０）により増幅した。ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株のゲノムＤＮＡを鋳型としてシグマＡプロモーター領域をＰＣＲ法（プライマー２１Ｆ：配列番号４１およびプライマー２１Ｒ：配列番号４２）により増幅した。得られた２つのＤＮＡ断片を融合ＰＣＲ法によって連結した。得られたＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、ｐＬＸ１９の制限酵素ＢａｍＨＩ部位およびＢｇｌＩＩ部位にそれぞれクローニングした。得られたプラスミドをそれぞれｐＬＸ１９−ＴＫ１０１およびｐＴＫ１９と命名した。
【００６７】
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＧＫ１１５５遺伝子の上流領域（プライマー２２Ｆ：配列番号４３およびプライマー２２Ｒ：配列番号４４）および下流領域（プライマー２３Ｆ：配列番号４５およびプライマー２３Ｒ：配列番号４６）をそれぞれＰＣＲ法により増幅した。得られた上流領域の断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＵＣ１９の制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位間にクローニングし、得られた下流領域の断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩで消化し、ｐＵＣ１９の制限酵素ＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ部位間にクローニングした。得られたプラスミドの制限酵素ＢａｍＨＩ部位に、ｐＬＸ１９−ＴＫ１０１から制限酵素ＢａｍＨＩで消化して切り出したＴＫ１０１遺伝子を挿入した。得られたプラスミドの制限酵素ＥｃｏＲＩ部位に、プラスミドｐＲＫ２０１３に含まれるｏｒｉＴ領域をＰＣＲ法（プライマー１６Ｆおよび１６Ｒ）により増幅して得られた増幅断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、挿入した。得られたプラスミドをｐΔＧＫ１１５５−１と命名した。
【００６８】
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＧＫ１１５５遺伝子の上流領域（プライマー２２Ｆおよび２２Ｒ）および下流領域（プライマー２４Ｆ：配列番号４７およびプライマー２３Ｒ）をそれぞれＰＣＲ法により増幅した。得られた上流領域の断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＴＫ１９の制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位間にクローニングし、得られた下流領域の断片を制限酵素ＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩで消化し、ｐＴＫ１９の制限酵素ＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ部位間にクローニングした。得られたプラスミドをｐΔＧＫ１１５５−２と命名した。
【００６９】
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＧＫ０７０７遺伝子の上流領域（プライマー２５Ｆ：配列番号４８およびプライマー２５Ｒ：配列番号４９）および下流領域（プライマー２６Ｆ：配列番号５０およびプライマー２６Ｒ：配列番号５１）をそれぞれＰＣＲ法により増幅した。得られた上流領域の断片を制限酵素ＡａｔＩＩで消化し、ｐＧＫＥ１１の制限酵素ＡａｔＩＩ部位にクローニングし、得られた下流領域の断片を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、ｐＧＫＥ１１の制限酵素ＢｇｌＩＩ部位にクローニングした。次いで、ｐＬＸ１９−ＴＫ１０１から制限酵素ＢａｍＨＩで消化して切り出したＴＫ１０１遺伝子をｐＧＫＥ１１の制限酵素ＦｂａＩ部位にクローニングし、ｐＵＣ１９Ｔから制限酵素ＰｃｉＩで消化して切り出したｏｒｉＴ遺伝子をｐＧＫＥ１１の制限酵素ＰｃｉＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドをｐＧＡＭ１５と命名した。
【００７０】
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＧＫ０７０４遺伝子のプロモーター領域をＰＣＲ法（プライマー２７Ｆ：配列番号５２およびプライマー２７Ｒ：配列番号５３）により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化し、ｐＧＡＭ１５の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ部位間に挿入した。得られたプラスミドをｐＧＡＭ３１と命名した。
【００７１】
ジオバチラス・カウストフィラスＡＴＣＣ８００５株のゲノムＤＮＡを鋳型として耐熱性β−ガラクトシダーゼをコードするｂｇａＢ遺伝子（H. Hirataら、J. Bacteriol.、1986年、第166巻、p. 722-727）をＰＣＲ法（プライマー２８Ｆ：配列番号５４およびプライマー２８Ｒ：配列番号５５）により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＧＡＭ１５およびｐＧＡＭ３１の制限酵素ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ部位間にそれぞれ挿入した。得られたプラスミドをそれぞれｐＧＡＭ１５−ｂｇａＢおよびｐＧＡＭ３１−ｂｇａＢと命名した。
【００７２】
ジオバチラス・ステアロサーモフィラスＡＴＣＣ１２９８０株のゲノムＤＮＡを鋳型として耐熱性α−アミラーゼをコードするａｍｙＥ遺伝子（N. Suzukiら、Appl. Microbiol. Biotechnol.、2009年、第82巻、p. 491-500）をＰＣＲ法（プライマー２９Ｆ：配列番号５６およびプライマー２９Ｒ：配列番号５７）により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素ＳｐｈＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ｐＧＡＭ１５の制限酵素ＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入した。得られたプラスミドをｐＧＡＭ１５−ＢＳａｍｙＥと命名した。
【００７３】
実施例３：ＤＮＡメチル化酵素を欠失させるためのプラスミドの作製
大腸菌ＴＯＰ１０株（Invitrogen社製）のゲノムＤＮＡを鋳型としてｄａｍ遺伝子の上流領域（プライマー３０Ｆ：配列番号５８およびプライマー３０Ｒ：配列番号５９）および下流領域（プライマー３１Ｆ：配列番号６０およびプライマー３１Ｒ：配列番号６１）をそれぞれＰＣＲ法により増幅した。大腸菌ＥＲ１８２１株（New England BioLab社製）のゲノムＤＮＡを鋳型としてｍｅｔＢ遺伝子を含む領域をＰＣＲ法（プライマー３２Ｆ：配列番号６２およびプライマー３２Ｒ：配列番号６３）により増幅した。得られた上流領域の断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化し、ｐＵＣ１９の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ部位間に挿入した。次いで、得られたプラスミドの制限酵素ＳｐｈＩ−ＸｂａＩ部位間に、上記で得られたｍｅｔＢ遺伝子を含む領域の断片を制限酵素ＳｐｈＩおよびＮｏｔＩで消化し、上記で得られた下流領域の断片を制限酵素ＮｏｔＩおよびＸｂａＩで消化し、これらを直列に連結して挿入した。得られたプラスミドをｐΔＤａｍと命名した。
【００７４】
大腸菌ＴＯＰ１０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてｄｃｍ遺伝子の上流領域（プライマー３３Ｆ：配列番号６４およびプライマー３３Ｒ：配列番号６５）および下流領域（プライマー３４Ｆ：配列番号６６およびプライマー３４Ｒ：配列番号６７）をそれぞれＰＣＲ法により増幅した。大腸菌ＥＲ１８２１株のゲノムＤＮＡを鋳型としてプロモーターを含むｌａｃＺ遺伝子をＰＣＲ法（プライマー３５Ｆ：配列番号６８およびプライマー３５Ｒ：配列番号６９）により増幅した。得られた上流領域を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化し、ｐＵＣ１９の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ部位間に挿入した。次いで、得られたプラスミドの制限酵素ＳｐｈＩ−ＸｂａＩ部位間に、上記で得られたプロモーターを含むｌａｃＺ遺伝子を制限酵素ＳｐｈＩおよびＮｏｔＩで消化し、上記で得られた下流領域の断片を制限酵素ＮｏｔＩおよびＸｂａＩで消化し、これらを直列に連結して挿入した。得られたプラスミドをｐΔＤｃｍと命名した。
【００７５】
実施例４：大腸菌宿主の作製
ｐΔＤａｍを鋳型としてｄａｍ遺伝子欠失用ＤＮＡ断片をＰＣＲ法（プライマー３０Ｆおよび３１Ｒ）により増幅した。得られたＤＮＡ断片に混入する鋳型ＤＮＡ（ｐΔＤａｍ）を制限酵素ＤｐｎＩで消化した。得られたＤＮＡ断片をQIAquick PCR Purification Kit（Qiagen社製）を用いて精製し、大腸菌ＥＲ１７９３株（New England BioLab社製）に電気穿孔法により導入した。菌体を滅菌水で洗浄し、ＭＭ１最少固体培地（０．６％(w/v)Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％(w/v)ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％(w/v)ＮａＣｌ、０．０１％(w/v)チアミン、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、３３μＭ ＦｅＣｌ３、０．００４％(w/v)Ｌ−トリプトファン、０．００２％(w/v)Ｌ−ヒスチジン、０．２％(w/v)Ｄ−グルコース、１．５％(w/v)寒天末）に塗布し、３７℃にて２日間培養した。生育したコロニーの中からアンピシリン感受性株をスクリーニングして、大腸菌ＩＲ２１株を得た。ＩＲ２１株のｄａｍ遺伝子が欠失していることは、ＰＣＲ解析および制限酵素マッピングにより確認した。ＩＲ２１株の遺伝子型は以下のとおりである：F- fhuA2 Δ(lacZ)r1 glnV44 e14-(McrA-) trp-31 his-1 rpsL104(StrR) xyl-4 mtl-2 metB1 Δ(mcrC-mrr)114::IS10 Δdam::metB。
【００７６】
ｐΔＤｃｍを鋳型としてｄｃｍ遺伝子欠失用ＤＮＡ断片をＰＣＲ法（プライマー３３Ｆおよび３４Ｒ）により増幅した。得られたＤＮＡ断片に混入する鋳型ＤＮＡ（ｐΔＤｃｍ）を制限酵素ＤｐｎＩで消化した。得られたＤＮＡ断片をQIAquick PCR Purification Kitを用いて精製し、大腸菌ＥＲ１７９３株およびＩＲ２１株に電気穿孔法によりそれぞれ導入した。菌体を滅菌水で洗浄し、ＭＭ２最少固体培地（０．６％(w/v)Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％(w/v)ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％(w/v)ＮａＣｌ、０．０１％(w/v)チアミン、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、３３μＭ ＦｅＣｌ３、０．００４％(w/v)Ｌ−トリプトファン、０．００２％(w/v)Ｌ−ヒスチジン、０．００２％(w/v)Ｌ−メチオニン、０．２％(w/v)ラクトース、０．００２％(w/v)５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、１．５％(w/v)寒天末）に塗布し、３７℃で２日間培養した。青色を呈するコロニーの中からアンピシリン感受性株をスクリーニングすることで、ＩＲ２４株ならびにＩＲ２７株をそれぞれ得た。両株のｄｃｍ遺伝子が欠失して、ＰＣＲ解析および制限酵素マッピングにより確認した。両株の遺伝子型は以下のとおりである：IR24、Δ(lacZ)r1 glnV44 e14-(McrA-) trp-31 his-1 rpsL104(StrR) xyl-4 mtl-2 metB1 Δ(mcrC-mrr)114::IS10 Δdcm::lacZ;IR27、Δ(lacZ)r1 glnV44 e14-(McrA-) trp-31 his-1 rpsL104(StrR) xyl-4 mtl-2 metB1 Δ(mcrC-mrr)114::IS10 Δdam::metB Δdcm::lacZ。
【００７７】
ＩＲ２７株に接合伝達プラスミドｐＵＢ３０７（P. M. Bennettら、Mol. Gen. Genet.、1977年、第154巻、p. 205-211）（ＲＰ１由来プラスミド）を電気穿孔法で導入し、菌体を２５μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび６．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有するＬＢ固体培地に塗布し、３７℃にて培養した。生育したコロニーの１つを大腸菌ＢＲ２７株として得た。
【００７８】
ＩＲ２４株にｐＵＢ３０７を電気穿孔法で導入し、菌体を２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ固体培地に塗布し、３７℃にて培養した。生育したコロニーの１つを大腸菌ＢＲ２４株として得た。
【００７９】
ＢＲ２７株にｐＩＲ２０７を電気穿孔法で導入し、菌体を２５μｇ／ｍＬのカナマイシン、６．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンおよび１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェノコールを含有するＬＢ固体培地に塗布し、３７℃にて培養した。生育したコロニーの１つを大腸菌ＢＲ３９７株として得た。同様にして、ＢＲ２４株にｐＩＲ２０７、ｐＩＲ３９９、ｐＩＲ４０１およびｐＩＲ４０８をそれぞれ導入し、得られた大腸菌をそれぞれ大腸菌ＢＲ３９８株、大腸菌ＢＲ３９９株、大腸菌ＢＲ４０１株および大腸菌ＢＲ４０８株と命名した。
【００８０】
実施例５：異種メチル化の確認
大腸菌を１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＬＢ液体培地で３７℃にて２４時間培養し、ゲノムＤＮＡを常法に従い抽出した。C. W. Gehrkeら、J. Chromatog.、1984年、第301巻、p. 199-219に記載の方法に従い、ゲノムＤＮＡをモノデオキシヌクレオシドにまで分解し、逆相ＨＰＬＣを用いてその組成を分析した。実施例４と同様にして、大腸菌ＩＲ２７株にｐＩＲ２０７を電気穿孔法で導入して得られた大腸菌（以下、このようにして得られた大腸菌を「大腸菌ＩＲ２７［ｐＩＲ２０７］」のように記載することがある）のゲノムＤＮＡからは、既知のいかなるメチル化核酸（５−メチルデオキシシチジン、５ｍｄＣ；Ｎ−６−メトルデオキシアデノシン、６ｍｄＡ；Ｎ−４−メチルデオキシシチジン、４ｍｄＣ）も検出されなかった。大腸菌ＩＲ２７［ｐＩＲ３９９］のゲノムＤＮＡからは、有意な６ｍｄＡが検出された。そのモル比率は全デオキシアデノシンの０．０８％であった。大腸菌ＩＲ２７［ｐＩＲ４０１］およびＩＲ２７［ｐＩＲ４０８］のゲノムＤＮＡからも、有意な６ｍｄＡが検出された。そのモル比率は、それぞれ全デオキシアデノシンの０．１０％および０．２１％であった。以上の結果から、ｐＩＲ３９９、ｐＩＲ４０１およびｐＩＲ４０８にクローン化したジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株由来のＩ型メチル化酵素遺伝子群は、大腸菌中で機能的に発現し、宿主大腸菌のＤＮＡを異種メチル化することが示された。
【００８１】
同様にして、ｐＩＲ４０５を導入して得られた大腸菌を解析したところ、大腸菌ＩＲ２７［ｐＩＲ４０５］のゲノムＤＮＡからは、全デオキシアデノシンの１．９％に相当する６ｍｄＡが検出された。ＧＫＰ０８は、ＡｌｗＩメチラーゼと５８％の遺伝子配列相同性を示すことから、ＡｌｗＩメチラーゼと同じく「ＧＧＡＴＣ」配列中のアデニンのＮ−６−メチル化を触媒すると予想できた。そこで、ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株およびＩＲ２７［ｐＩＲ４０５］のゲノムＤＮＡの制限酵素マッピングを行ったところ、いずれも制限酵素ＤｐｎＩで消化されたが、制限酵素ＡｌｗＩでは切断されなかった。以上の結果は、ＧＫＰ０８が「ＧＧＡＴＣ」配列中アデニンのＮ−６−メチル化の原因となることを示す。
【００８２】
実施例６：ジオバチラス・カウストフィラスの形質転換１：プラスミドの導入
（接合伝達法）
ＧＫＰ０８遺伝子が原因となるＮ−６−メチル化は、大腸菌におけるＤａｍメチル化に包括されることから、核酸供与体となる大腸菌として、特記のない限りＢＲ２４派生株を用いた。適切な抗生物質（２５μｇ／ｍＬカナマイシン、６．５μｇ／ｍＬテトラサイクリン、１２．５μｇ／ｍＬクロラムフェノコール、２５μｇ／ｍＬアンピシリン）を含有するＬＢ液体培地で核酸供与体を３７℃にて一晩前培養し、回収した菌体を、抗生物質を含まないＬＢ液体培地で洗浄した。菌体を光学濁度（ＯＤ６００）が約０．１になるように新しいＬＢ液体培地に接種し、光学濁度が０．５になるまで３７℃にて振盪培養した。核酸受容体となるジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株はＬＢ液体培地で５５℃にて一晩前培養した。得られた培養液を０．１％(v/v)となるように新しいＬＢ液体培地に接種し、５５〜６０℃にて、ＯＤ６００が０．５になるまで培養した。得られたジオバチラス・カウストフィラス培養液は室温まで冷却した。ジオバチラス・カウストフィラス培養液（９ｍＬ）と核酸供与体培養液（１ｍＬ）とを混合し、菌体を吸引ろ過により膜フィルター（０．２２μｍ）上に濃縮した。得られた膜フィルターを、菌体回収面がＬＢ固体培地表面に接するように、ＬＢ固体培地上に静置した（３７℃、一晩）。次いで、膜フィルター上の菌体をＬＢ液体培地に懸濁し、５μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ固体培地に塗布し、６０℃にて一晩培養し、生育したコロニーを形質転換体として得た。
【００８３】
（プラスミドの導入）
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株をｐＵＣＧ１８Ｔの核酸受容体とし、大腸菌ＢＲ３９７［ｐＵＣＧ１８Ｔ］、ＢＲ３９８［ｐＵＣＧ１８Ｔ］、ＢＲ３９９［ｐＵＣＧ１８Ｔ］、ＢＲ４０１［ｐＵＣＧ１８Ｔ］およびＢＲ４０８［ｐＵＣＧ１８Ｔ］をｐＵＣＧ１８Ｔの核酸供与体とした接合伝達を行った。接合伝達後のジオバチラス・カウストフィラス菌体をＬＢ固体培地および５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ固体培地にそれぞれ塗布し、６０℃にて一晩培養し、生育したコロニー数から接合伝達効率を算出した。結果を以下の表１に示す。
【００８４】
同様にして、ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株をｐＳＴＥ３３Ｔの核酸受容体とし、大腸菌ＢＲ３９７［ｐＳＴＥ３３Ｔ］、ＢＲ３９８［ｐＳＴＥ３３Ｔ］、ＢＲ３９９［ｐＳＴＥ３３Ｔ］、ＢＲ４０１［ｐＳＴＥ３３Ｔ］およびＢＲ４０８［ｐＳＴＥ３３Ｔ］をｐＳＴＥ３３Ｔの核酸供与体とした接合伝達を行った。接合伝達後のジオバチラス・カウストフィラス菌体をＬＢ固体培地および５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ固体培地にそれぞれ塗布し、６０℃にて一晩培養し、生育したコロニー数から接合伝達効率を算出した。結果を表１に示す。
【００８５】
【表１】
【００８６】
表１より、ｐＵＣＧ１８Ｔの場合、ＤＮＡメチル化酵素としてｄａｍが接合伝達効率（形質転換効率）に支配的に影響を及ぼしていることがわかる。しかし、ｐＳＴＥ３３Ｔの場合、ＤＮＡメチル化酵素としてｈｓｄＭ１Ｓ１、ｈｓｄＭ２Ｓ２およびｄａｍのすべてが接合伝達効率（形質転換効率）に均等に影響を及ぼしており、３つの酵素が揃うと形質転換効率が高くなることがわかる。
【００８７】
ｐＳＴＥ３３Ｔで形質転換されたジオバチラス・カウストフィラスを５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ液体培地で６０℃にて一晩振盪培養し、培養菌体中に含まれるプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドＤＮＡは、制限酵素マッピング、ＰＣＲ解析およびＤＮＡ配列解析により、ｐＳＴＥ３３Ｔであることを確認した。得られたプラスミドＤＮＡは大腸菌を形質転換できることも確認した。
【００８８】
ｐＵＣＧ１８Ｔで形質転換されたジオバチラス・カウストフィラスを５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ液体培地で６０℃にて一晩振盪培養し、培養菌体中に含まれるプラスミドＤＮＡを単離した。得られたプラスミドＤＮＡは、低コピー数のため、制限酵素マッピングできるほど量がなかったが、ＰＣＲ解析により、ｐＵＣＧ１８Ｔであることを確認した。得られたプラスミドは大腸菌を形質転換できることも確認した。
【００８９】
ｐＵＣＧ１８ＴおよびｐＳＴＥ３３Ｔで形質転換されたジオバチラス・カウストフィラスを５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ液体培地で６０℃にて一晩それぞれ振盪培養した。培養菌体中に含まれるプラスミドのコピー数をL. Wuら、J. Gen. Microbiol.、1989年、第135巻、p. 1315-1324に記載の方法に従い解析した。
【００９０】
ｐＵＣＧ１８ＴおよびｐＳＴＥ３３Ｔで形質転換されたジオバチラス・カウストフィラスをＬＢ液体培地で６０℃にて一晩それぞれ振盪培養した後、その一部をＬＢ固体培地および５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ固体培地に塗布し、６０℃にて一晩それぞれ培養した。生育したコロニー数から各プラスミドの残存率を算出した。
【００９１】
実施例７：ジオバチラス・カウストフィラスの形質転換２：２重交叉相同組換えによるＧＫ１１５５遺伝子の欠失
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株を核酸受容体とし、大腸菌ＢＲ４０８［ｐΔＧＫ１１５５−１］を核酸供与体とした接合伝達により、ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株にｐΔＧＫ１１５５−１を導入した。接合伝達後の菌体を５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ固体培地上に塗布し、６０℃にて一晩培養した。生育したコロニーをＭＭ３最少固体培地（０．０３％(w/v)Ｋ２ＳＯ４、０．２５％(w/v)Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１％(w/v)ＮＨ４Ｃｌ、０．０００３％(w/v)ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．０００５％(w/v)ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０００７％(w/v)ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．００００４％(w/v)ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０００００１％(w/v)Ｈ３ＢＯ３、０．０００００５％(w/v)ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．００００２％(w/v)ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０００００１％(w/v)ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．００００２５％(w/v)エチレンジアミン四酢酸塩、１％(w/v)Ｄ−グルコース、０．１％(w/v)カザミノ酸、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５、０．０４％(w/v)ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２％(w/v)寒天末、１０μｇ／ｍＬウラシル）に移し、ウラシル要求性株をスクリーニングした。得られたウラシル要求性株の１つを、ＭＫ２７株と命名した。ＭＫ２７株のＧＫ１１５５遺伝子はＴＫ１０１遺伝子の挿入により欠失（ΔＧＫ１１５５：：ＴＫ１０１）していることをＰＣＲ解析により確認した（図２）。
【００９２】
実施例８：ジオバチラス・カウストフィラスの形質転換３：ＧＫ１１５５遺伝子のマーカーフリー欠失
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株を核酸受容体とし、大腸菌ＢＲ４０８［ｐΔＧＫ１１５５−２］を核酸供与体とした接合伝達により、ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株にｐΔＧＫ１１５５−２を導入した。接合伝達後の菌体を５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ固体培地上に塗布し、６０℃にて一晩培養した。生育したコロニーの１つをＬＢ液体培地１００ｍＬに接種し、６０℃にて一晩振盪培養した。得られた培養液の一部（１０μｌ）を新しいＬＢ液体培地１００ｍＬに接種し、引き続き６０℃にて一晩振盪培養した。同様の操作をさらに２回繰り返した後、培養液の一部をＬＢ固体培地に塗布し、６０℃にて一晩培養した。生育したコロニー約１０００個をＬＢ固体培地および５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ液体培地に接種し、カナマイシン感受性株をスクリーニングした。得られた８株のカナマイシン感受性株をＭＭ３最少固体培地および１０μｇ／ｍＬのウラシルを含有するＭＭ３最少固体培地に塗布し、ウラシル要求性株をスクリーニングした。得られた４株のウラシル要求性株のうち１クローンをジオバチラス・カウストフィラスＭＫ５４株と命名した。ＭＫ５４株のＧＫ１１５５遺伝子はｉｎ−ｆｒａｍｅ欠失（ΔＧＫ１１５５）していることをＰＣＲ解析により確認した（図３）。
【００９３】
実施例９：ジオバチラス・カウストフィラスの形質転換４：異種遺伝子ａｍｙＥの発現
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株を核酸受容体とし、大腸菌ＢＲ４０８［ｐＧＡＭ１５−ＢＳａｍｙＥ］を核酸供与体とした接合伝達により、ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株にｐＧＡＭ１５−ＢＳａｍｙＥを導入した。得られた形質転換体の１つをＭＫ４２株と命名した。ＭＫ４２株のゲノムにｐＧＡＭ１５−ＢＳａｍｙＥ由来の発現カセット（ｓｉｇＡプロモーターとその下流のａｍｙＥ遺伝子）が組み込まれていることをＰＣＲ解析により確認した。ＭＫ４２株を１％(w/v)可溶性デンプンを含むＬＢ固体培地に塗布し、６０℃にて一晩培養した。培地中の未分解デンプンをヨウ素・よう化カリウム液（ナカライテスク）で染色することで、α−アミラーゼ活性の有無を定性的に評価した。
【００９４】
ＭＫ４２株を５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ液体培地に接種し、６０℃にて２４時間培養した。得られた菌体を遠心分離により回収し、２ｍＬの抽出用緩衝液（０．１Ｍ ３−モルホリノプロパンスルホン酸−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ６．９）に懸濁した後、超音波破砕した。均一化された懸濁液を遠心分離し、上清を粗酵素抽出液として得た。EnzChek Ultra Amylase Assay Kit（Molecular Probes社製）を用いて粗酵素抽出液中のα−アミラーゼ活性を定量した。なお、酵素反応は６０℃にて行った。結果を以下の表２に示す。
【００９５】
実施例１０：ジオバチラス・カウストフィラスの形質転換５：異種遺伝子ｂｇａＢの発現
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株を核酸受容体とし、大腸菌ＢＲ４０８［ｐＧＡＭ１５−ｂｇａＢ］を核酸供与体とした接合伝達により、ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株にｐＧＡＭ１５−ｂｇａＢを導入した。得られた形質転換体の１つをＭＫ３９株と命名した。ＭＫ３９株のゲノムにｐＧＡＭ１５−ｂｇａＢ由来の発現カセット（ｓｉｇＡプロモーターとその下流のｂｇａＢ遺伝子）が組み込まれていることをＰＣＲ解析により確認した。ＭＫ３９株を２００μｇ／ｍＬの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含有するＬＢ固体培地に塗布し、６０℃にて一晩培養した。コロニーが青色を呈色するか否かでβ−ガラクトシダーゼ活性の有無を定性的に評価した。
【００９６】
ＭＫ３９株を５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ液体培地に接種し、６０℃にて２４時間培養した。得られた菌体を遠心分離により回収し、２ｍＬの抽出用緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）に懸濁した後、超音波破砕した。均一化された懸濁液を遠心分離し、上清を粗酵素抽出液として得た。粗酵素抽出液にｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを加え、その分解速度を測定することにより、粗酵素抽出液中のβ−ガラクトシダーゼ活性を評価した。なお、酵素反応は６０℃にて行った。結果を表２に示す。
【００９７】
【表２】
【００９８】
表２より、異種遺伝子のａｍｙＥおよびｂｇａＢは、ジオバチラス・カウストフィラスに導入された後も、菌体内で維持されるだけでなく、それぞれα−アミラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼの遺伝子を発現することがわかる。また、ａｍｙＥから発現したα−アミラーゼは、正常にプロセッシングを受けて分泌されることがわかる。
【００９９】
実施例１１：ジオバチラス・カウストフィラスの形質転換６：誘導型プロモーターによるｂｇａＢ遺伝子の発現
ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株を核酸受容体とし、大腸菌ＢＲ４０８［ｐＧＡＭ３１−ｂｇａＢ］を核酸供与体とした接合伝達により、ジオバチラス・カウストフィラスＨＴＡ４２６株にｐＧＡＭ３１−ｂｇａＢを導入した。得られた形質転換体の１つをＭＫ６１株と命名した。ＭＫ６１株のゲノムにｐＧＡＭ３１−ｂｇａＢ由来の発現カセット（ＧＫ０７０４プロモーターとその下流のｂｇａＢ遺伝子）が組み込まれていることをＰＣＲ解析により確認した。ＭＫ６１株をＭＭ３最少液体培地、１％(w/v)Ｄ−グルコースを含有するＭＭ３最少液体培地、１％(w/v)マルトースを含有するＭＭ３最少液体培地、１％(w/v)可溶性デンプンを含有するＭＭ３最少液体培地、１％(w/v)ミオ−イノシトールを含有するＭＭ３最少液体培地、１％(w/v)Ｄ−キシロースを含有するＭＭ３最少液体培地、１％(w/v)Ｌ−アラビノースを含有するＭＭ３最少液体培地、および１％(w/v)キシロオリゴ糖を含有するＭＭ３最少液体培地にそれぞれ接種し、６０℃にて４８時間培養した。実施例１０と同様にして、得られた菌体から粗酵素抽出液を調製し、粗酵素抽出液中のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。Bio-Rad Protein Assay kit（Bio-Rad社製）を用いて粗酵素抽出液中の総タンパク質量を測定した。その際に、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質として用いた。総タンパク質量あたりのβ−ガラクトシダーゼ活性を比活性として求めた。結果を表３に示す。
【０１００】
【表３】
【０１０１】
表３より、マルトースや可溶性デンプンによりｂｇａＢの発現が強く誘導されていることがわかる。このことから、ＧＫ０７０４プロモーターは誘導型プロモーターとして利用できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明によれば、好熱性微生物の形質転換を高い形質転換効率で行うことができる。好熱性微生物の形質転換体は、高温下の発酵などバイオプロセスに用いることができ、高温下のバイオプロセスは、菌体内の高い代謝速度に加えて、雑菌増殖の防止、発酵熱の有効利用、原料および生産物の水溶性向上など、数多くの点で、従来の常温下のバイオプロセスにはない利点を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
好熱性微生物の形質転換方法であって、
該好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素によってメチル化ＤＮＡを調製する工程、および
該メチル化ＤＮＡを該好熱性微生物に導入する工程
を含み、
該酵素が、該好熱性微生物とは異なる種の宿主中に存在し、そして
該酵素以外のＤＮＡメチル化酵素が、該宿主中に存在しない、方法。
【請求項２】
制限酵素が、前記宿主中に存在しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記メチル化ＤＮＡを調製する工程が、
（１）前記好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素の遺伝子を発現し、該酵素以外のＤＮＡメチル化酵素の遺伝子を発現しない宿主を作製する工程、および
（２）該工程（１）で得られた宿主に任意のＤＮＡを導入して、形質転換体を調製する工程
を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（１）において、前記宿主が、制限酵素の遺伝子を発現しない、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記メチル化ＤＮＡを前記好熱性微生物に導入する工程において、該メチル化ＤＮＡを接合伝達法により導入する、請求項１から４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項６】
前記好熱性微生物が、ジオバチラス属細菌である、請求項１から５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項７】
前記ジオバチラス属細菌が、ジオバチラス・カウストフィラスである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記宿主が、大腸菌である、請求項１から７のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１】
好熱性微生物の形質転換方法であって、
該好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素によってメチル化ＤＮＡを調製する工程、および
該メチル化ＤＮＡを該好熱性微生物に導入する工程
を含み、
該酵素が、該好熱性微生物とは異なる種の宿主中に存在し、そして
該酵素以外のＤＮＡメチル化酵素が、該宿主中に存在しない、方法。
【請求項２】
制限酵素が、前記宿主中に存在しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記メチル化ＤＮＡを調製する工程が、
（１）前記好熱性微生物由来のＤＮＡメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素の遺伝子を発現し、該酵素以外のＤＮＡメチル化酵素の遺伝子を発現しない宿主を作製する工程、および
（２）該工程（１）で得られた宿主に任意のＤＮＡを導入して、形質転換体を調製する工程
を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（１）において、前記宿主が、制限酵素の遺伝子を発現しない、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記メチル化ＤＮＡを前記好熱性微生物に導入する工程において、該メチル化ＤＮＡを接合伝達法により導入する、請求項１から４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項６】
前記好熱性微生物が、ジオバチラス属細菌である、請求項１から５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項７】
前記ジオバチラス属細菌が、ジオバチラス・カウストフィラスである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記宿主が、大腸菌である、請求項１から７のいずれかの項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−２１１９６８（Ｐ２０１１−２１１９６８Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−８３５４３（Ｐ２０１０−８３５４３）
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
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