妊娠検査具
血液、血漿、血清、及び／又は尿サンプルから選択される女性から採取される体液サンプル中のホルモンｈＰＬ又はそれらのフラグメントの量を定量化するステップと、これに対応する妊娠の段階を確立するステップと、を具える妊娠段階（妊娠期間）を決定する方法を開示している。本開示は、更に妊娠段階を確立するために女性から採取した、血液、血漿、血清、及び／又は尿サンプルから選択される体液サンプル中のｈＰＬ又はそのフラグメントのレベル／量を検出するのに適した器具にまで及ぶものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
説明
本開示は、女性の体液サンプル中のヒト胎盤性ラクトゲン（ｈＰＬ）又はそれに関するフラグメントの濃度の確立に基づき、女性のおよその妊娠段階（妊娠期間）を確立するための方法及び器具に関する。本開示はまた、妊娠段階を特定するための抗−ｈＰＬ抗体の使用に関するものである。
【０００２】
妊娠検査具は、医療従事者や個人によって広く使用されている。妊娠検査具は、長年にわたりスーパーマーケットや薬局で市販されてきた。最も有名なブランドの一つはＣＬＥＡＲＢＬＵＥ（登録商標）である。後者の検査具は、個人が自宅で容易に使用することができて、ものの数分で結果が示されるという簡単で丈夫な器具（例えばＥＰ０２９１１９４を参照）である。この検査は、関連の女性の尿中のホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の検出の有無に基づくものである。
【０００３】
伝統的に検査の結果は、陽性か陰性か、すなわち妊娠しているか否かを示すものであった。しかし近年では、個人が妊娠１−２、２−３、又は３／３＋週であるかどうかを確認するｈＣＧの濃度を用いる、より精巧な検査が開始されている。この検査は、出願公開ＷＯ２００６／１００４１５に記載されている。
【０００４】
この新しい検査は有用であるものの、妊娠期間が３週を超えた場合に提供される情報は、非常に限定されたものとなっている。すなわち、単に妊娠期間が３週以上であることを示すに過ぎないのである。
【０００５】
例えば不完全又は不正確な情報であるため、妊婦自身が提供する情報からは妊娠の段階が計算できないときの、妊娠周期を定める唯一別の方法は、現時点では超音波スキャンである。妊娠の段階を決定する超音波スキャンの精度は、一般に非常に高く、誤差は３、４日であるものの、妊娠１３週未満でスキャンをすると、その精度は低下してしまう。更に、医療制度におけるリリースへの影響と負担のため、定期的に超音波スキャンを用いて妊娠段階を決定することは実行不可能である。現時点では、スキャンの需要は非常に高く、妊娠中の合併症が疑われる場合を除いて、妊娠１３週頃に最初の超音波スキャンがなされる。
【０００６】
超音波スキャンに頼らずに、好ましくは簡単な非侵襲的検査を用いて、妊娠周期を定めることができるのは有用である。
【０００７】
本発明者は、妊娠段階がヒト胎盤性ラクトゲンホルモン濃度と関連付けができることを発見した。
【０００８】
そのホルモン自体は、何年も知られており、例えば米国特許７，２３５，３５９を参照のとおり、特に子癇前症や胎児染色体異数性などの妊娠中及び／又は胎児の異常のバイオマーカーとして提示されている。
【０００９】
しかし、我々が知る限り、それは正常妊娠の段階を決定するために有用であると提示されたことはない。
【００１０】
従って、一態様では、血液、血漿、血清、及び／又は尿サンプルから選択される女性から採取される体液サンプル中のｈＰＬの濃度を定量化するステップと、これに対応する妊娠の段階を確立するステップと、を具える妊娠の段階を決定する方法を提供している。
【００１１】
ｈＰＬは、絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン１又はコリオマンモトロピンラクトゲンとしても知られている。ユニプロット（ＵｎｉＰｒｏｔ）は、配列番号Ｎｏ．１に示すように、そのペプチドが２１７個のアミノ酸の長さであることを示しているが、１９０個又は１９１個のアミノ酸の長さの形でも存在しているらしい。このホルモンは、二つのサブユニットを有する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、妊娠周期の関数として、ｎｍｏｌ／ＬにおけるｈＰＬの分泌プロファイルを示している。
【図２】図２は、妊娠の段階を示すのに適した検査配列の簡単な実施例を示している。
【図３】図３は、デジタルディスプレイユニットを具えた器具の色々な配置を示している。
【図４】図４は、デジタルディスプレイユニットを具えた器具の色々な配置を示している。
【図５】図５は、結果読み取り器具の配置を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
興味深いことに、胎盤の質量と存在するｈＰＬの量の間には相関関係があり、各々の絨毛細胞は一日あたり一定のｈＰＬ量を合成し、絨毛細胞の数が増加するにつれて合成及び分泌されるｈＰＬの量も増加すると仮定されている。このような理由からｈＰＬは、特に妊娠第三期の３０−３５週の期間で、妊娠中の特定の異常を検出する有効なマーカーとして推奨されている。６週未満では、ｈＰＬは非常に低いレベルのみ分泌される。６週以降に分泌される量は、濃度曲線が平らになり始める約２４週まで指数関数的に増加する（図１参照）。
【００１４】
ここで用いている妊娠段階は、例えば妊娠週の数を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２週又はその範囲といった時点を妊娠に関連付けて示すことを意図している。二元法の結果、すなわち陽性か陰性か、妊娠しているか否かを、単に示すことを意図してはいない。
【００１５】
ここで言及しているｈＰＬ又はその他のホルモンの量の定量化は、単位体積当たりの質量、単位体積当たりのモル数（ナノモル等）、又は単位体積当たりの国際単位での絶対量とすることができ、これには例えば標準を参照することにより相対量を確立することも含まれる。一実施例において用いられている方法は半定量的である。
【００１６】
ここで用いているフラグメントは、存在するｈＰＬの実際の量に対応する検出可能なフラグメントを指しており、ａ−サブユニットのようなサブユニットを含むこともある。
【００１７】
一実施例における方法は、以下の妊娠の時間ポイント：６週以前、６−９週、１０−１２週、１３−１５週、１６−１８週、１９−２１週、及び／又は２１−２４週を識別することができる。
【００１８】
６週未満の段階は、２ｎｍｏｌ／Ｌ以下のｈＰＬ濃度に特徴づけられる。６週から最大９週の段階は、２ｎｍｏｌ／Ｌより高く約９ｎｍｏｌ／Ｌまでの範囲の濃度に特徴づけられる。１０週から１２週の段階は、９ｎｍｏｌ／Ｌより高く約３４ｎｍｏｌ／Ｌまでの範囲の濃度に特徴づけられる。１３週から１５週の段階は、８０ｎｍｏｌ／Ｌより高く約９５ｎｍｏｌ／Ｌまでの範囲の濃度に特徴づけられる。１６週から１８週の段階は、９５ｎｍｏｌ／Ｌより高く約１０５ｎｍｏｌ／Ｌまでの範囲の濃度に特徴づけられる。１９週から２１週の段階は、１０５ｎｍｏｌ／Ｌより高く約２００ｎｍｏｌ／Ｌまでの範囲の濃度に特徴づけられる。２２週から２４週の段階は、２００ｎｍｏｌ／Ｌより高く約２２５ｎｍｏｌ／Ｌまでの範囲の濃度に特徴づけられる。
【００１９】
一実施例における方法は、以下の妊娠の段階：６週以下、７／８週、９週、１０／１１週、１１／１２週、１２／１３週、１４／１５／１６週、１７／１８週、１９／２０週、２１週、２２週、２３週、及び／又は２４週とそれ以上を識別する。
【００２０】
０．０４ｍｇ／Ｌ以下のｈＰＬ濃度は妊娠６週以下であることを示している。０．０４−０．０５ｍｇ／Ｌの範囲のｈＰＬ濃度は、妊娠７／８週であることを示している。０．１−０．２ｍｇ／Ｌの範囲のｈＰＬ濃度は、妊娠９週であることを示している。０．２５−０．３５ｍｇ／Ｌの範囲のｈＰＬ濃度は、妊娠１０／１１週であることを示している。０．３−０．５ｍｇ／Ｌの範囲のｈＰＬ濃度は、妊娠１１／１２週であることを示している。０．６５−０．７ｍｇ／Ｌの範囲のｈＰＬ濃度は、妊娠１２／１３週であることを示している。
【００２１】
約０．９ｍｇ／ＬのｈＰＬ濃度は妊娠１４／１５／１６週であることを示している。約１．５ｍｇ／ＬのｈＰＬ濃度は妊娠１７／１８週であることを示している。約２．５ｍｇ／ＬのｈＰＬ濃度は妊娠１９／２０週であることを示している。
【００２２】
上記の特定された数値は、血清中のｈＰＬの量に基づいている。ｈＰＬは血清中で半減期が短いが、ペプチドの大きさにより、少なくともいくつかのｈＰＬは、糸球体から尿中に濾過される。尿中に入ると、ｈＰＬは分解から又は更なる分解から保護される。従って、例え尿中のｈＰＬの絶対量は血清中に観察されるものよりも少なくても、尿中のｈＰＬの分泌プロファイルは、血清で観察されたものと同一の曲線をとると思われる。しかし、ＥＬＩＳＡ分析のような感度分析法は、２４時間以上かけて妊娠約８週で約１０μｇの尿中のｈＰＬの量を検出し定量化することができる。
【００２３】
この方法は、妊娠２４週を超える妊娠段階を決定するために適用することができる。妊娠終期に向かって、血清中のｈＰＬの量は、５−７ｍｇ／Ｌのレベルに達する。
【００２４】
少なくとも表１に示すように、尿中のｈＰＬの量が同定される。
【表１】
【００２５】
サンプルから検出及び／又は抽出されるｈＰＬの絶対量は、まさに用いる方法に依存する。より感度の高い技術であれば、最終的により高い値が検出されるだろう。従って、表１のレベルは用いられる方法に応じて高くなることがある。
【００２６】
本開示は、女性が妊娠第１期又は第２期のときの妊娠段階を確立するのに特に適している。
【００２７】
一実施例では、この方法は特に７−２８週の妊娠期間で、ある妊娠週を別の妊娠週と識別するのに適している。
【００２８】
本開示の使用に適するホルモン（分析物）及びアルゴリズムに基づいて妊娠段階を確立する方法は、ＷＯ２００６／１００４１５に記載されている（特に１１ページから１６ページを参照）。
【００２９】
サンプルとして尿を使用して側方流動法に基づき妊娠段階を確立することができるのは非常に便利である。従って、ここに記載される方法は、関連する技術分野の当業者により容易に実施され、広く適用される可能性がある。
【００３０】
当然ながら、女性の妊娠を認定するｈＣＧレベルに基づいた検査をした後に、上記の検査をしてもよい。６週未満ではｈＰＬにのみ基づいた検査では妊娠を確定することができないので、これは妊娠が未確定の初期段階で重要である。従って一実施例では、例えばＣＬＥＡＲＢＬＵＥ ＥＡＳＹ（登録商標）は、ｈＰＬ濃度を検査する器具が、ｈＣＧレベルを検査する別個の器具と共に一のキットで提供されている。
【００３１】
本開示の方法の一実施例では、ホルモンレベルの組み合わせ、例えばｈＰＬとｈＣＧの濃度は、同じ器具（又は別の器具）内で同時に又は連続して測定される。これは、ｈＰＬのみを使用して認定しうる段階に加え、妊娠段階を１−２週、２−３週、又は３−６週として確立することができるので、妊娠６週未満の段階において特に有用である。
【００３２】
これは、２、３、又は４といった別個の複数の分析ストリップを具える単一の器具を使用することにより達成することができる。
【００３３】
代替的又は付加的に、この方法はリラキシン濃度も検査できる。このホルモンはｈＣＧと同じく、着床後の極く短期間に分泌されるので、例えば妊娠６週まではｈＰＬのみを使用し認定しうる段階に追加して、リラキシンとｈＰＬを組み合わせて妊娠段階を確認するのに使用することができる。
【００３４】
一実施例では、関連する女性から採取されるサンプルが、その関連する女性が妊娠しているかどうかを示す検査の分析にリラキシンが用いられ、その後の検査は、妊娠の段階を確立するために、ｈＰＬレベルを決定するため行われる。
【００３５】
リラキシンのレベルは、約１０−１２週で最高レベルに達する。従って、少なくともｈＰＬ及び例えばここに記載されるその他のホルモンと任意に組み合わせると、リラキシンは１０−１２週の段階の妊娠を識別するのに特に有用である。
【００３６】
非抱合型エストラジオールのレベルは、妊娠１３週付近で著しく高くなるので、適切な妊娠段階を識別するために、少なくともｈＰＬ及び特にここに記載されるその他のホルモンと組み合わせて用いることができる。エストラジオールとｈＰＬの組み合わせは、特に１３週の段階の妊娠を識別するのに有用である。
【００３７】
更に本開示によると、方法／器具内で分析されるホルモンは、黄体形成ホルモン及び／卵胞刺激ホルモンを含んでいる。
【００３８】
この方法の一実施例は、６−２８週の範囲の妊娠、例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２若しくは２３週、又はこれらの組み合わせといった７−２４週などの段階を同定するのに適している。
【００３９】
代替の実施例では、例えば少なくとも二つのホルモン類（検体）を伴う妊娠段階の分析で、１−２、２−３、３−６週の範囲を同定することができ、残りの段階は、ここに記載される実施例のうちのいずれかによって同定されうる。
【００４０】
ホルモンレベルの測定方法は、タンパク質配列、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフ）、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ、ウェスタンブロッティング、及び免疫学的測定法を含む。免疫学的測定法には異なる形式があり、例えば酵素及び／又は蛍光を用いたものがある。免疫学的測定法の特に感度の高い形式の一つは、サンドイッチ測定と呼ばれることもあるＥＬＩＳＡ測定（酵素結合免疫測定法）である。同じターゲットに向けられた二つの異なる抗体を用いることによって測定の精度／特異性が向上する。
【００４１】
本開示の実施に適する技術は、ＥＰ０２１９１９４に記載されており、特に検査ストリップが記載されているページの１４−２３行、典型的な器具が記載されている２ページの３７−３６行、更に多孔質の固相、“サンドイッチ”、及び競合法が記載されている２ページの３７−５５行、ラベル／粒子の許容動作に照らし、ニトロセルロースなどの多孔質担体の適切な特性について説明する３ページの３４−３９行を参照するとよい。文章の後半で適切なラベルは一般に０．０５−０．５ミクロンの大きさであることも説明されている。
【００４２】
適切なラベルは更に、特に検出ゾーンでシグナル／結果を提供するために蓄積する、例えばレイテックス（ｌａｙｔｅｘ）などの金溶液、染料液、又は着色ポリマーなどの材料の着色粒子を含む。ＥＰ０２１９１９４の５ページの２−１５行に金溶液、染色液の調整、１２ページに着色粒子、及び１３ページの１０−１９行に前記ラベルの一つに対する抗体結合について記載されている。
【００４３】
代替として、専門家により行われる検査で、免疫学的測定法で使用される抗体上のラベルには、例えば放射性ラベルがある。
【００４４】
代替として、例えばＱＰＣＲを用いて血液サンプル中のｍＲＮＡのレベルを測定して、間接的にｈＰＬのレベルを確立することができる。
【００４５】
一実施例では、サンプルは血液、血清、又は血漿である。
【００４６】
一実施例では、サンプルは尿サンプルである。
【００４７】
一般に、方法、検査及び／又は器具は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、又は４５ＩＵ／Ｌなど５０ＩＵ／Ｌ（リットルあたりの国際単位）の感度を有する必要がある。
【００４８】
ターゲット分子に特異な抗体が不溶性ビーズ（色つきの場合もある）又は表面に固定されている点で、ＥＬＩＳＡ測定の原理は単純である。次いで検査サンプルが導入され、ターゲット分子が存在していれば、抗体はそれらに結合する。最後に、検出できるようにラベルされている第二次抗体が導入され（又は検査容器に存在している場合もある）、第一次抗体とは異なる部位でターゲット分子と結合し、それによってターゲットのサンドイッチを形成する。あるいは、第二次抗体は第一次抗体に向けられてもよい。結合すると、ラベルが活性化して、必要に応じて検出、測定、及び定量化が可能となる。
【００４９】
一実施例では、器具は、例えばニトロセルロースなどの多孔質担体である液体輸送手段を具える側方流動器具である。
【００５０】
第一世代の妊娠検査のようないくつかの簡単な検査では、陽性の結果は、単に検査ウィンドウに表示される青の線であった。本開示の簡単な実施例では、必要な薬剤を具えた検査ストリップは、時間ポイントの形式で提供され、図２に示すように対応する妊娠段階がラベルされる。これは、ＥＰ２９１１９４に記載されているような技術を、ＷＯ２００６／１００４１５に記載されている定量化の手法を用いる。このような検査からの読み出しは非常に簡単である。従って、一実施例では、器具は複数の結果ウィンドウを具え、例えば各々の結果ウィンドウには時間ポイントがラベルされおり、使用者はいかなる説明も必要としないでそこから容易に結果を読み取り、段階を確立することができる。関連するウィンドウ内の着色ビーズの蓄積が結果を表示する。
【００５１】
しかし、例えばＷＯ２００７／０１７６４８に記載されているように、光学濃度表示は、実験室又は携帯用使い捨て器具のどちらでもデジタル装置となりうる。本開示の一実施例では、図３又は４に示すように、器具は長さが約１２ｃｍと２ｃｍである。器具は、例えば不透明なプラスチック材料から構成されたハウジング（２）を具えている。ハウジングの一端に狭い開口が設けられており、ここを通って液体の輸送口又は運搬口がハウジングを超えて突出してサンプル液に接触することができる。
【００５２】
使用者に情報を表示するディスプレイ（６）が、分析結果が出た後に器具から除去することができるように、取り外し可能に器具に取り付けられている。変形可能なクリップ（８）に下向きに圧をかけると容易に取り外せる。ディスプレイ上の結果とその他のあらゆる情報は、将来の参考のために器具からディスプレイを除去した後も保持されてもよい。
【００５３】
器具のハウジングは、二のＬＥＤ及び二のフォトダイオード（１４）を支持する回路基板（１２）を具えたラベルされた分析アッセンブリ（１０）を具え、二のＬＥＤ及び二のフォトダイオードは液体輸送口又は運搬口のサンプリング部分（４）と流体連通するニトロセルロースストリップである側方流動ストリップ（１６）の検査領域と整列している。検査領域は、対象である分析物の存在（又は、必要に応じて不在）に、ラベルされた試薬が蓄積する領域である。この蓄積は、その反射率や透過率、ＬＥＤ／フォトダイオードの配列により測定することができる特性など、検査ストリップ（１６）の光学特性に影響を与える。この構成は出力電流を生じ、その大きさは検査領域に蓄積されたラベルの量に関連する。
【００５４】
分析アセンブリ（１０）は、また、ハウジング（２）に取り付けたときにディスプレイ（６）に電力を供給する電力源（ボタン電池１８）を具えている。
【００５５】
ハウジングの頂部に、 ディスプレイ（６）部分のわずかに広がった部分に適合する溝（２０）が設けられている。ディスプレイ（６）は、ハウジング内で適切に形成され寸法付けられた開口部内に、クリップ（８）により保持されている。正しく配置されると、ディスプレイ上の電気コネクタは、ハウジングに設けられた電気コネクタ（２２）に接触し、これにより、ディスプレイ（６）と分析アセンブリ（１０）間の電気的接続が確実になる。
【００５６】
分析部材（１０）は、データ保存バッファ、アナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）、及びマイクロプロセッサ又はマイクロコントローラを具えるシグナル変換要素（２４）を具えている。ディスプレイ（６）は、マイクロプロセッサ又はマイクロコントローラからの出力に応答する。
【００５７】
分析結果を決定するための流れの検出が、米国特許出願公開２００５／０３７５１１に記載されている。分析器具及び方法は、米国特許出願公開２００８／２１３８７５に教示されている。
【００５８】
一実施例では、本開示は、例えばここに記載される一又は複数の要素を具える、サンプル中の少なくともｈＰＬの濃度からおおよその妊娠段階を確立するのに適した器具を提供する。器具は例えばｈＣＧに基づいて、必要に応じ妊娠に関する陽性又は陰性の結果を提供することができる。この実施例では、使用される器具は、ｈＰＬ及びｈＣＧの分析用の試薬を具えてもよい。
【００５９】
都合のよいことに、妊娠が進行し胎児が成長している証拠を提供するために、異なる時点で繰り返し分析をすることができる。
【００６０】
一実施例では、結果は、例えばデジタルディスプレイのウィンドウ内に数値又は範囲として表示される。
【００６１】
一実施例では、器具は、例えば使い捨て携帯器具のような携帯器具である。
【００６２】
一態様では、器具は、例えばモノクローナル抗体のような抗ヒト胎盤性ラクトゲン抗体を具えている。抗体は、例えば上記のように必要に応じてラベルされてもよい。
【００６３】
一実施例では、器具は、例えばモノクローナル抗体など更なる別個の胎盤性ラクトゲン抗体を具え、当該更なる抗体は、ｈＰＬ又はそれらに関連するフラグメントへの結合を検出できるようにラベルされている。
【００６４】
代替として、使用される第二次抗体は、抗抗体抗体でもよく、例えば第一次抗体のＦｃ領域に向けられてもよい。この第二次抗体はラベルされていてもよい。
【００６５】
第一次及び第二次抗体は使用されるところで、各々の抗体はラベルされてもよい。
【００６６】
ここで用いられる抗ヒト胎盤性ラクトゲン抗体は、前記抗原（ｈＰＬ）に特異的な抗体であることが予定されている。
【００６７】
一実施例では、例えば混合されたモノクローナル抗体のような抗体の組み合わせが使用され、検査対象の特異的なホルモンに導かれる。
【００６８】
一実施例では、使用される抗体は蛍光ラベルを有する。一実施例では、例えば異なるホルモンに対しては、最初の蛍光ラベルされた抗体とは異なる波長の光を発生する蛍光ラベルがなされた更なる抗体が使用されている。
【００６９】
例えば薬局やスーパーマーケットの店頭で器具が一般に販売されている場合、その中の分析は、エンドユーザーに接して結果を提供するのに適した、関連ホルモンの濃度の適切な範囲を処理するのに充分に丈夫でなければならない。
【００７０】
女性から渡されるその日最初の尿サンプルについて検査を行うのが望ましい場合がある。従って、一実施例では、器具には後者を説明する説明書が添付されている。
【００７１】
とは言うものの、器具が病院や医師に提供される場合には、妊娠９週未満、１２週未満、１８週未満、２１週及び／又は２４週なのかを極めて正確に知ることが重要である。この場合には、検査、キット、器具及び／又は試薬は、関連する各時点に対して個別に最適化したものが提供される。
【００７２】
最適化には、使用される試薬及び／又は使用されるホルモンの組み合わせの濃度を変更することが含まれる。
【００７３】
更なる実施例では、本書記載の方法は、流産又は胎児の死亡を監視する手段として、女性のｈＰＬレベルの低下を検出するのに適合してもよい。後者の適切な監視は、医療の専門家にとって厄介であることがある。従って、ｈＰＬのレベルの低下を識別するための定期検査は、非常に有用である。
【００７４】
一実施例では、本開示は、妊娠段階を推定する目的で、血、血清、血漿、又は尿サンプルなどの体液サンプル中のｈＰＬの定量化に使用するため、例えばネズミ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ラクダ、ラット、ウサギ、又はその他の抗体のようなモノクローナル抗体などの抗ｈＰＬ抗体の使用を提供する。
【００７５】
一又は複数の実施例では、使用される抗体としてｈＰＬのａ−サブユニットに関するものが開示されている。
【００７６】
例えばマウス抗−ヒト胎盤性ラクトゲン（エピトープ２）モノクローナル抗体、Ａｂｃａｍ社の非抱合型のクローンＩＮＮ−ｈＰＬ−３７、マウス抗−ヒト胎盤性ラクトゲンモノクローナル抗体、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ社の非抱合型のクローンＩＮＮ−ｈＰＬ−５、マウス抗−胎盤性ラクトゲン（ｈＰＬ）モノクローナル抗体、及びＡｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨ社の非抱合型のクローンＬＩＰ−６０３など多くのモノクローナル抗体が市販されている。
【００７７】
代替として、モノクローナル抗体を含む抗体は、例えばオボアルブミンなどの適切な担体に結合するｈＰＬで宿主を免疫することにより、関連する技術分野における慣例技術で容易に調製することができる。使用される抗体は、例えば１％以下の又は状況に応じた適切な交差反応性を有するなど、ｈＰＬに特異的である必要がある。
【００７８】
一実施例では、本開示は、妊娠段階を確立する目的で女性から採取される体液サンプル中のｈＰＬ濃度を検査する器具及び／又は試薬を具えるキットを提供する。
【００７９】
一実施例では、流産又は胎児の死亡後のｈＰＬレベルの低下を識別するのに適したキットが提供されている。
【００８０】
ここに記載された検査は、胎盤の質量とｈＰＬの分泌濃度の間の相関関係を利用しており、女性が双子又は多胎児を妊娠している場合に、本方法は実際よりも遅い妊娠段階を結果として提示してしまう可能性がある。そうは言っても、多胎児を妊娠する可能性はわずか３％を占めるに過ぎないので、本開示の検査／方法／器具及び方法は、個人に便利で、費用対効果の高い、効率的な方法を提供する実用的なステップを示している。
【００８１】
ここに記載される一以上の実施例は、技術的に適切であれば組み合わせてもよいことを想定している。
【００８２】
本明細書の文脈の中で、“具える”は、“含む”として解釈されるべきである。
【００８３】
特定の要素を具える開示の態様も、関連する要素“〜から成る”又は“本質的に〜から成る”など、代替の実施例に拡張することを意図している。
【００８４】
ここで言及された全ての文献はそれらの全体が参照により組み込まれる。
【実施例】
【００８５】
“共有”光検知器と“通常読み取り”領域の両方を有する分析結果読み取り器具の実施例を、図５に示している。読み取り器具は、長さが約１２ｃｍ、幅が約２ｃｍで一般に指又は煙草の形状をしている。
【００８６】
好ましい実施例では、ハウジングは長さが約１２ｃｍ以内、幅が約２．５ｃｍ以内で、高さが約２．２ｃｍ以内である。しかし、クレジットカード形状のリーダーのような、任意の便利な形状を使用してもよい。この器具は光不透過性の合成プラスチック材料（例えば、炭素などの適切な遮光性顔料を含む、ポリカーボネート、ＡＢＳ、ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリプロピレン、又はポリスチロールなど）から形成されたハウジング１を具える。読み取り器具の一端部は、検査ストリップ（図示せず）がリーダーに挿入できるように狭いスロット又は開口３となっている。
【００８７】
リーダーの上面には、二つの楕円形状の開口がある。
【００８８】
一方の開口は、分析の結果など定性的に又は定量的に使用者に情報を提示する液晶ディスプレイ５の画面を収容している。他方の開口は、挿入された分析器具を、作動時に強制的に分析読み取り器具から放出するイジェクト機構のアクチュエータ７（チルドボタンの形式で）を収容している。
【００８９】
読み取り器具で使用する検査ストリップは、例えば米国特許第６，１５６，２７１号、米国特許第５，５０４，０１３号、欧州特許第７２８３０９号、又は欧州特許第７８２７０７号に開示されているような一般的に従来型の側流検査スティックである。検査ストリップと、当該検査ストリップが挿入されるリーダー内のスロットの表面は、検査ストリップがリーダー内に適切な方向に上手く挿入されるようにのみ形成及び寸法付けられている。分析器具と当該分析器具が挿入されるリーダー内のスロットの表面もまた、リーダーが正確に三次元配置され、正確にリーダーを読み取って分析結果を得ることを確実にするように形成及び寸法付けられている。
【００９０】
検査ストリップが正確にリーダーに挿入されると、エネルギー消費を減少すべくリーダーがとる通常の状態である“休眠”状態から、リーダーを活性化させるスイッチが閉じられる。
【００９１】
リーダーのハウジング内（従って図５では見えない）には、三つのＬＥＤを具えたリーダーを含む、更なる多くの部品がある。検査ストリップがリーダーに挿入されると、各ＬＥＤは検査ストリップのそれぞれの領域と整列する。第一のＬＥＤは、検査領域と整列し、第二のＬＥＤは、参考領域と整列し、及び第三のＬＥＤは、制御領域と整列する。二つのフォトダイオードが、様々な領域から反射光を検出し、フォトダイオードに入射した光の量に比例する大きさの電流を発生させる。電流は電圧に変換され、バッファにより緩衝され、アナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）に供給される。
【００９２】
得られたデジタル信号は、マイクロコントローラーによって読み取られる。
【００９３】
いくつかの実施例では、別々のフォトダイオードが、各領域から検出するために提供されている（すなわち、フォトダイオードの数は反射光測定がされる数に等しい）。
【００９４】
別の実施例では、フォトダイオードの数は領域の数より少ない。一のフォトダイオードが、検査領域からの反射光と参照領域からの反射光の一部を検出する。他のフォトダイオードが、参照領域からの光反射の一部と制御領域からの光反射の一部を検出する。マイクロコントローラーはＬＥＤを一ずつスイッチを入れ、任意の与えられた時間に三つの領域の一つのみが照明される。この方法により、それぞれの領域からの反射光により発生された信号は、時間に基づいて判別することができる。
【００９５】
分析器具をリーダーに挿入することによりスイッチが閉じられ、マイクロコントローラーを作動させる。器具は更に、電源（通常はボタン電池又は二つのボタン電池）と、マイクロコントローラーからの出力に応じる液晶表示器具を具える。
【００９６】
使用にあたり、乾いた検査ストリップ（すなわちサンプルに接触する前）がリーダーに挿入され、スイッチが閉じてリーダーが作動し、次いで初期キャリブレーションが行われる。さまざまなＬＥＤからの光出力の強度は滅多に同じではない。同様に、光検出器は、同一の感度を持っていることもない。そのような差が分析読み取りに影響を与える可能性があるので、初期キャリブレーションが行われ、マイクロコントローラーが、三つのＬＥＤの各々の点灯している時間の長さを調整し、これにより三つの領域（検査、参考及び制御）の各々から測定された信号がだいたい等しくなり、（さまざまな領域からの反射光の強度の差が信号に直接に比例する変化をもたらすように）システムの応答プロファイルの線形領域で適切な動作位置となる。
【００９７】
初期キャリブレーションを行った後、器具は更により細かいキャリブレーションを行う。これは、検査ストリップが乾いている間の各領域の反射光の強度の測定（「校正値」）を取り、次の測定（「検査値」）について、それぞれの領域の校正値を参照して正規化することを含む（すなわち、正規化された値＝検査値／校正値）。
【００９８】
分析を行うため、検査ストリップのサンプル受け部分を液体サンプルに接触させる。例えばこの場合尿サンプルについて、サンプル受け部分を尿の流れの中で保持してもよいし、尿サンプルを容器の中に採取して、サンプル受け部分をそのサンプルに一時的（約５−１０秒）に浸してもよい。検査ストリップがリーダーに挿入されている時に、サンプリングを行うことができ、それほど好ましいことではないが、サンプリングのために、ストリップを一時的にリーダーから取り外し、その後リーダーに再導入してもよい。
【００９９】
一般に検査ストリップをリーダーに挿入した後の特定の時間間隔の後に、一以上の領域（好ましくは三つ全部）からの反射光の強度の測定が次いで開始される。測定は、一定の間隔（例えば１−１０秒間隔、好ましくは１−５秒間隔で）で行われるのが望ましい。測定は、領域ごとに交互に多くの配列を短期間（１０ミリ秒以下）で連続的に読み取って行われ、それによりリーダーのハウジング内部を貫通する周囲の光強度の変化に起因するあらゆる影響を最小限に抑えることができる。
【０１００】
〔参考文献〕
Ｓｏｒｅｎｓｏｎ他（１９９５）ヒトの生殖 １０：４５３−４５８頁
Ｋａｐｌａｎ他（１９６５）科学 １４７：７５１頁
Ｊｏｓｉｍｏｖｉｃｈ他（１９６４）Ａｍ Ｊ．産科学と婦人科学 ８８：８６７−８７９頁
【技術分野】
【０００１】
説明
本開示は、女性の体液サンプル中のヒト胎盤性ラクトゲン（ｈＰＬ）又はそれに関するフラグメントの濃度の確立に基づき、女性のおよその妊娠段階（妊娠期間）を確立するための方法及び器具に関する。本開示はまた、妊娠段階を特定するための抗−ｈＰＬ抗体の使用に関するものである。
【０００２】
妊娠検査具は、医療従事者や個人によって広く使用されている。妊娠検査具は、長年にわたりスーパーマーケットや薬局で市販されてきた。最も有名なブランドの一つはＣＬＥＡＲＢＬＵＥ（登録商標）である。後者の検査具は、個人が自宅で容易に使用することができて、ものの数分で結果が示されるという簡単で丈夫な器具（例えばＥＰ０２９１１９４を参照）である。この検査は、関連の女性の尿中のホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の検出の有無に基づくものである。
【０００３】
伝統的に検査の結果は、陽性か陰性か、すなわち妊娠しているか否かを示すものであった。しかし近年では、個人が妊娠１−２、２−３、又は３／３＋週であるかどうかを確認するｈＣＧの濃度を用いる、より精巧な検査が開始されている。この検査は、出願公開ＷＯ２００６／１００４１５に記載されている。
【０００４】
この新しい検査は有用であるものの、妊娠期間が３週を超えた場合に提供される情報は、非常に限定されたものとなっている。すなわち、単に妊娠期間が３週以上であることを示すに過ぎないのである。
【０００５】
例えば不完全又は不正確な情報であるため、妊婦自身が提供する情報からは妊娠の段階が計算できないときの、妊娠周期を定める唯一別の方法は、現時点では超音波スキャンである。妊娠の段階を決定する超音波スキャンの精度は、一般に非常に高く、誤差は３、４日であるものの、妊娠１３週未満でスキャンをすると、その精度は低下してしまう。更に、医療制度におけるリリースへの影響と負担のため、定期的に超音波スキャンを用いて妊娠段階を決定することは実行不可能である。現時点では、スキャンの需要は非常に高く、妊娠中の合併症が疑われる場合を除いて、妊娠１３週頃に最初の超音波スキャンがなされる。
【０００６】
超音波スキャンに頼らずに、好ましくは簡単な非侵襲的検査を用いて、妊娠周期を定めることができるのは有用である。
【０００７】
本発明者は、妊娠段階がヒト胎盤性ラクトゲンホルモン濃度と関連付けができることを発見した。
【０００８】
そのホルモン自体は、何年も知られており、例えば米国特許７，２３５，３５９を参照のとおり、特に子癇前症や胎児染色体異数性などの妊娠中及び／又は胎児の異常のバイオマーカーとして提示されている。
【０００９】
しかし、我々が知る限り、それは正常妊娠の段階を決定するために有用であると提示されたことはない。
【００１０】
従って、一態様では、血液、血漿、血清、及び／又は尿サンプルから選択される女性から採取される体液サンプル中のｈＰＬの濃度を定量化するステップと、これに対応する妊娠の段階を確立するステップと、を具える妊娠の段階を決定する方法を提供している。
【００１１】
ｈＰＬは、絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン１又はコリオマンモトロピンラクトゲンとしても知られている。ユニプロット（ＵｎｉＰｒｏｔ）は、配列番号Ｎｏ．１に示すように、そのペプチドが２１７個のアミノ酸の長さであることを示しているが、１９０個又は１９１個のアミノ酸の長さの形でも存在しているらしい。このホルモンは、二つのサブユニットを有する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、妊娠周期の関数として、ｎｍｏｌ／ＬにおけるｈＰＬの分泌プロファイルを示している。
【図２】図２は、妊娠の段階を示すのに適した検査配列の簡単な実施例を示している。
【図３】図３は、デジタルディスプレイユニットを具えた器具の色々な配置を示している。
【図４】図４は、デジタルディスプレイユニットを具えた器具の色々な配置を示している。
【図５】図５は、結果読み取り器具の配置を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
興味深いことに、胎盤の質量と存在するｈＰＬの量の間には相関関係があり、各々の絨毛細胞は一日あたり一定のｈＰＬ量を合成し、絨毛細胞の数が増加するにつれて合成及び分泌されるｈＰＬの量も増加すると仮定されている。このような理由からｈＰＬは、特に妊娠第三期の３０−３５週の期間で、妊娠中の特定の異常を検出する有効なマーカーとして推奨されている。６週未満では、ｈＰＬは非常に低いレベルのみ分泌される。６週以降に分泌される量は、濃度曲線が平らになり始める約２４週まで指数関数的に増加する（図１参照）。
【００１４】
ここで用いている妊娠段階は、例えば妊娠週の数を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２週又はその範囲といった時点を妊娠に関連付けて示すことを意図している。二元法の結果、すなわち陽性か陰性か、妊娠しているか否かを、単に示すことを意図してはいない。
【００１５】
ここで言及しているｈＰＬ又はその他のホルモンの量の定量化は、単位体積当たりの質量、単位体積当たりのモル数（ナノモル等）、又は単位体積当たりの国際単位での絶対量とすることができ、これには例えば標準を参照することにより相対量を確立することも含まれる。一実施例において用いられている方法は半定量的である。
【００１６】
ここで用いているフラグメントは、存在するｈＰＬの実際の量に対応する検出可能なフラグメントを指しており、ａ−サブユニットのようなサブユニットを含むこともある。
【００１７】
一実施例における方法は、以下の妊娠の時間ポイント：６週以前、６−９週、１０−１２週、１３−１５週、１６−１８週、１９−２１週、及び／又は２１−２４週を識別することができる。
【００１８】
６週未満の段階は、２ｎｍｏｌ／Ｌ以下のｈＰＬ濃度に特徴づけられる。６週から最大９週の段階は、２ｎｍｏｌ／Ｌより高く約９ｎｍｏｌ／Ｌまでの範囲の濃度に特徴づけられる。１０週から１２週の段階は、９ｎｍｏｌ／Ｌより高く約３４ｎｍｏｌ／Ｌまでの範囲の濃度に特徴づけられる。１３週から１５週の段階は、８０ｎｍｏｌ／Ｌより高く約９５ｎｍｏｌ／Ｌまでの範囲の濃度に特徴づけられる。１６週から１８週の段階は、９５ｎｍｏｌ／Ｌより高く約１０５ｎｍｏｌ／Ｌまでの範囲の濃度に特徴づけられる。１９週から２１週の段階は、１０５ｎｍｏｌ／Ｌより高く約２００ｎｍｏｌ／Ｌまでの範囲の濃度に特徴づけられる。２２週から２４週の段階は、２００ｎｍｏｌ／Ｌより高く約２２５ｎｍｏｌ／Ｌまでの範囲の濃度に特徴づけられる。
【００１９】
一実施例における方法は、以下の妊娠の段階：６週以下、７／８週、９週、１０／１１週、１１／１２週、１２／１３週、１４／１５／１６週、１７／１８週、１９／２０週、２１週、２２週、２３週、及び／又は２４週とそれ以上を識別する。
【００２０】
０．０４ｍｇ／Ｌ以下のｈＰＬ濃度は妊娠６週以下であることを示している。０．０４−０．０５ｍｇ／Ｌの範囲のｈＰＬ濃度は、妊娠７／８週であることを示している。０．１−０．２ｍｇ／Ｌの範囲のｈＰＬ濃度は、妊娠９週であることを示している。０．２５−０．３５ｍｇ／Ｌの範囲のｈＰＬ濃度は、妊娠１０／１１週であることを示している。０．３−０．５ｍｇ／Ｌの範囲のｈＰＬ濃度は、妊娠１１／１２週であることを示している。０．６５−０．７ｍｇ／Ｌの範囲のｈＰＬ濃度は、妊娠１２／１３週であることを示している。
【００２１】
約０．９ｍｇ／ＬのｈＰＬ濃度は妊娠１４／１５／１６週であることを示している。約１．５ｍｇ／ＬのｈＰＬ濃度は妊娠１７／１８週であることを示している。約２．５ｍｇ／ＬのｈＰＬ濃度は妊娠１９／２０週であることを示している。
【００２２】
上記の特定された数値は、血清中のｈＰＬの量に基づいている。ｈＰＬは血清中で半減期が短いが、ペプチドの大きさにより、少なくともいくつかのｈＰＬは、糸球体から尿中に濾過される。尿中に入ると、ｈＰＬは分解から又は更なる分解から保護される。従って、例え尿中のｈＰＬの絶対量は血清中に観察されるものよりも少なくても、尿中のｈＰＬの分泌プロファイルは、血清で観察されたものと同一の曲線をとると思われる。しかし、ＥＬＩＳＡ分析のような感度分析法は、２４時間以上かけて妊娠約８週で約１０μｇの尿中のｈＰＬの量を検出し定量化することができる。
【００２３】
この方法は、妊娠２４週を超える妊娠段階を決定するために適用することができる。妊娠終期に向かって、血清中のｈＰＬの量は、５−７ｍｇ／Ｌのレベルに達する。
【００２４】
少なくとも表１に示すように、尿中のｈＰＬの量が同定される。
【表１】
【００２５】
サンプルから検出及び／又は抽出されるｈＰＬの絶対量は、まさに用いる方法に依存する。より感度の高い技術であれば、最終的により高い値が検出されるだろう。従って、表１のレベルは用いられる方法に応じて高くなることがある。
【００２６】
本開示は、女性が妊娠第１期又は第２期のときの妊娠段階を確立するのに特に適している。
【００２７】
一実施例では、この方法は特に７−２８週の妊娠期間で、ある妊娠週を別の妊娠週と識別するのに適している。
【００２８】
本開示の使用に適するホルモン（分析物）及びアルゴリズムに基づいて妊娠段階を確立する方法は、ＷＯ２００６／１００４１５に記載されている（特に１１ページから１６ページを参照）。
【００２９】
サンプルとして尿を使用して側方流動法に基づき妊娠段階を確立することができるのは非常に便利である。従って、ここに記載される方法は、関連する技術分野の当業者により容易に実施され、広く適用される可能性がある。
【００３０】
当然ながら、女性の妊娠を認定するｈＣＧレベルに基づいた検査をした後に、上記の検査をしてもよい。６週未満ではｈＰＬにのみ基づいた検査では妊娠を確定することができないので、これは妊娠が未確定の初期段階で重要である。従って一実施例では、例えばＣＬＥＡＲＢＬＵＥ ＥＡＳＹ（登録商標）は、ｈＰＬ濃度を検査する器具が、ｈＣＧレベルを検査する別個の器具と共に一のキットで提供されている。
【００３１】
本開示の方法の一実施例では、ホルモンレベルの組み合わせ、例えばｈＰＬとｈＣＧの濃度は、同じ器具（又は別の器具）内で同時に又は連続して測定される。これは、ｈＰＬのみを使用して認定しうる段階に加え、妊娠段階を１−２週、２−３週、又は３−６週として確立することができるので、妊娠６週未満の段階において特に有用である。
【００３２】
これは、２、３、又は４といった別個の複数の分析ストリップを具える単一の器具を使用することにより達成することができる。
【００３３】
代替的又は付加的に、この方法はリラキシン濃度も検査できる。このホルモンはｈＣＧと同じく、着床後の極く短期間に分泌されるので、例えば妊娠６週まではｈＰＬのみを使用し認定しうる段階に追加して、リラキシンとｈＰＬを組み合わせて妊娠段階を確認するのに使用することができる。
【００３４】
一実施例では、関連する女性から採取されるサンプルが、その関連する女性が妊娠しているかどうかを示す検査の分析にリラキシンが用いられ、その後の検査は、妊娠の段階を確立するために、ｈＰＬレベルを決定するため行われる。
【００３５】
リラキシンのレベルは、約１０−１２週で最高レベルに達する。従って、少なくともｈＰＬ及び例えばここに記載されるその他のホルモンと任意に組み合わせると、リラキシンは１０−１２週の段階の妊娠を識別するのに特に有用である。
【００３６】
非抱合型エストラジオールのレベルは、妊娠１３週付近で著しく高くなるので、適切な妊娠段階を識別するために、少なくともｈＰＬ及び特にここに記載されるその他のホルモンと組み合わせて用いることができる。エストラジオールとｈＰＬの組み合わせは、特に１３週の段階の妊娠を識別するのに有用である。
【００３７】
更に本開示によると、方法／器具内で分析されるホルモンは、黄体形成ホルモン及び／卵胞刺激ホルモンを含んでいる。
【００３８】
この方法の一実施例は、６−２８週の範囲の妊娠、例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２若しくは２３週、又はこれらの組み合わせといった７−２４週などの段階を同定するのに適している。
【００３９】
代替の実施例では、例えば少なくとも二つのホルモン類（検体）を伴う妊娠段階の分析で、１−２、２−３、３−６週の範囲を同定することができ、残りの段階は、ここに記載される実施例のうちのいずれかによって同定されうる。
【００４０】
ホルモンレベルの測定方法は、タンパク質配列、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフ）、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ、ウェスタンブロッティング、及び免疫学的測定法を含む。免疫学的測定法には異なる形式があり、例えば酵素及び／又は蛍光を用いたものがある。免疫学的測定法の特に感度の高い形式の一つは、サンドイッチ測定と呼ばれることもあるＥＬＩＳＡ測定（酵素結合免疫測定法）である。同じターゲットに向けられた二つの異なる抗体を用いることによって測定の精度／特異性が向上する。
【００４１】
本開示の実施に適する技術は、ＥＰ０２１９１９４に記載されており、特に検査ストリップが記載されているページの１４−２３行、典型的な器具が記載されている２ページの３７−３６行、更に多孔質の固相、“サンドイッチ”、及び競合法が記載されている２ページの３７−５５行、ラベル／粒子の許容動作に照らし、ニトロセルロースなどの多孔質担体の適切な特性について説明する３ページの３４−３９行を参照するとよい。文章の後半で適切なラベルは一般に０．０５−０．５ミクロンの大きさであることも説明されている。
【００４２】
適切なラベルは更に、特に検出ゾーンでシグナル／結果を提供するために蓄積する、例えばレイテックス（ｌａｙｔｅｘ）などの金溶液、染料液、又は着色ポリマーなどの材料の着色粒子を含む。ＥＰ０２１９１９４の５ページの２−１５行に金溶液、染色液の調整、１２ページに着色粒子、及び１３ページの１０−１９行に前記ラベルの一つに対する抗体結合について記載されている。
【００４３】
代替として、専門家により行われる検査で、免疫学的測定法で使用される抗体上のラベルには、例えば放射性ラベルがある。
【００４４】
代替として、例えばＱＰＣＲを用いて血液サンプル中のｍＲＮＡのレベルを測定して、間接的にｈＰＬのレベルを確立することができる。
【００４５】
一実施例では、サンプルは血液、血清、又は血漿である。
【００４６】
一実施例では、サンプルは尿サンプルである。
【００４７】
一般に、方法、検査及び／又は器具は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、又は４５ＩＵ／Ｌなど５０ＩＵ／Ｌ（リットルあたりの国際単位）の感度を有する必要がある。
【００４８】
ターゲット分子に特異な抗体が不溶性ビーズ（色つきの場合もある）又は表面に固定されている点で、ＥＬＩＳＡ測定の原理は単純である。次いで検査サンプルが導入され、ターゲット分子が存在していれば、抗体はそれらに結合する。最後に、検出できるようにラベルされている第二次抗体が導入され（又は検査容器に存在している場合もある）、第一次抗体とは異なる部位でターゲット分子と結合し、それによってターゲットのサンドイッチを形成する。あるいは、第二次抗体は第一次抗体に向けられてもよい。結合すると、ラベルが活性化して、必要に応じて検出、測定、及び定量化が可能となる。
【００４９】
一実施例では、器具は、例えばニトロセルロースなどの多孔質担体である液体輸送手段を具える側方流動器具である。
【００５０】
第一世代の妊娠検査のようないくつかの簡単な検査では、陽性の結果は、単に検査ウィンドウに表示される青の線であった。本開示の簡単な実施例では、必要な薬剤を具えた検査ストリップは、時間ポイントの形式で提供され、図２に示すように対応する妊娠段階がラベルされる。これは、ＥＰ２９１１９４に記載されているような技術を、ＷＯ２００６／１００４１５に記載されている定量化の手法を用いる。このような検査からの読み出しは非常に簡単である。従って、一実施例では、器具は複数の結果ウィンドウを具え、例えば各々の結果ウィンドウには時間ポイントがラベルされおり、使用者はいかなる説明も必要としないでそこから容易に結果を読み取り、段階を確立することができる。関連するウィンドウ内の着色ビーズの蓄積が結果を表示する。
【００５１】
しかし、例えばＷＯ２００７／０１７６４８に記載されているように、光学濃度表示は、実験室又は携帯用使い捨て器具のどちらでもデジタル装置となりうる。本開示の一実施例では、図３又は４に示すように、器具は長さが約１２ｃｍと２ｃｍである。器具は、例えば不透明なプラスチック材料から構成されたハウジング（２）を具えている。ハウジングの一端に狭い開口が設けられており、ここを通って液体の輸送口又は運搬口がハウジングを超えて突出してサンプル液に接触することができる。
【００５２】
使用者に情報を表示するディスプレイ（６）が、分析結果が出た後に器具から除去することができるように、取り外し可能に器具に取り付けられている。変形可能なクリップ（８）に下向きに圧をかけると容易に取り外せる。ディスプレイ上の結果とその他のあらゆる情報は、将来の参考のために器具からディスプレイを除去した後も保持されてもよい。
【００５３】
器具のハウジングは、二のＬＥＤ及び二のフォトダイオード（１４）を支持する回路基板（１２）を具えたラベルされた分析アッセンブリ（１０）を具え、二のＬＥＤ及び二のフォトダイオードは液体輸送口又は運搬口のサンプリング部分（４）と流体連通するニトロセルロースストリップである側方流動ストリップ（１６）の検査領域と整列している。検査領域は、対象である分析物の存在（又は、必要に応じて不在）に、ラベルされた試薬が蓄積する領域である。この蓄積は、その反射率や透過率、ＬＥＤ／フォトダイオードの配列により測定することができる特性など、検査ストリップ（１６）の光学特性に影響を与える。この構成は出力電流を生じ、その大きさは検査領域に蓄積されたラベルの量に関連する。
【００５４】
分析アセンブリ（１０）は、また、ハウジング（２）に取り付けたときにディスプレイ（６）に電力を供給する電力源（ボタン電池１８）を具えている。
【００５５】
ハウジングの頂部に、 ディスプレイ（６）部分のわずかに広がった部分に適合する溝（２０）が設けられている。ディスプレイ（６）は、ハウジング内で適切に形成され寸法付けられた開口部内に、クリップ（８）により保持されている。正しく配置されると、ディスプレイ上の電気コネクタは、ハウジングに設けられた電気コネクタ（２２）に接触し、これにより、ディスプレイ（６）と分析アセンブリ（１０）間の電気的接続が確実になる。
【００５６】
分析部材（１０）は、データ保存バッファ、アナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）、及びマイクロプロセッサ又はマイクロコントローラを具えるシグナル変換要素（２４）を具えている。ディスプレイ（６）は、マイクロプロセッサ又はマイクロコントローラからの出力に応答する。
【００５７】
分析結果を決定するための流れの検出が、米国特許出願公開２００５／０３７５１１に記載されている。分析器具及び方法は、米国特許出願公開２００８／２１３８７５に教示されている。
【００５８】
一実施例では、本開示は、例えばここに記載される一又は複数の要素を具える、サンプル中の少なくともｈＰＬの濃度からおおよその妊娠段階を確立するのに適した器具を提供する。器具は例えばｈＣＧに基づいて、必要に応じ妊娠に関する陽性又は陰性の結果を提供することができる。この実施例では、使用される器具は、ｈＰＬ及びｈＣＧの分析用の試薬を具えてもよい。
【００５９】
都合のよいことに、妊娠が進行し胎児が成長している証拠を提供するために、異なる時点で繰り返し分析をすることができる。
【００６０】
一実施例では、結果は、例えばデジタルディスプレイのウィンドウ内に数値又は範囲として表示される。
【００６１】
一実施例では、器具は、例えば使い捨て携帯器具のような携帯器具である。
【００６２】
一態様では、器具は、例えばモノクローナル抗体のような抗ヒト胎盤性ラクトゲン抗体を具えている。抗体は、例えば上記のように必要に応じてラベルされてもよい。
【００６３】
一実施例では、器具は、例えばモノクローナル抗体など更なる別個の胎盤性ラクトゲン抗体を具え、当該更なる抗体は、ｈＰＬ又はそれらに関連するフラグメントへの結合を検出できるようにラベルされている。
【００６４】
代替として、使用される第二次抗体は、抗抗体抗体でもよく、例えば第一次抗体のＦｃ領域に向けられてもよい。この第二次抗体はラベルされていてもよい。
【００６５】
第一次及び第二次抗体は使用されるところで、各々の抗体はラベルされてもよい。
【００６６】
ここで用いられる抗ヒト胎盤性ラクトゲン抗体は、前記抗原（ｈＰＬ）に特異的な抗体であることが予定されている。
【００６７】
一実施例では、例えば混合されたモノクローナル抗体のような抗体の組み合わせが使用され、検査対象の特異的なホルモンに導かれる。
【００６８】
一実施例では、使用される抗体は蛍光ラベルを有する。一実施例では、例えば異なるホルモンに対しては、最初の蛍光ラベルされた抗体とは異なる波長の光を発生する蛍光ラベルがなされた更なる抗体が使用されている。
【００６９】
例えば薬局やスーパーマーケットの店頭で器具が一般に販売されている場合、その中の分析は、エンドユーザーに接して結果を提供するのに適した、関連ホルモンの濃度の適切な範囲を処理するのに充分に丈夫でなければならない。
【００７０】
女性から渡されるその日最初の尿サンプルについて検査を行うのが望ましい場合がある。従って、一実施例では、器具には後者を説明する説明書が添付されている。
【００７１】
とは言うものの、器具が病院や医師に提供される場合には、妊娠９週未満、１２週未満、１８週未満、２１週及び／又は２４週なのかを極めて正確に知ることが重要である。この場合には、検査、キット、器具及び／又は試薬は、関連する各時点に対して個別に最適化したものが提供される。
【００７２】
最適化には、使用される試薬及び／又は使用されるホルモンの組み合わせの濃度を変更することが含まれる。
【００７３】
更なる実施例では、本書記載の方法は、流産又は胎児の死亡を監視する手段として、女性のｈＰＬレベルの低下を検出するのに適合してもよい。後者の適切な監視は、医療の専門家にとって厄介であることがある。従って、ｈＰＬのレベルの低下を識別するための定期検査は、非常に有用である。
【００７４】
一実施例では、本開示は、妊娠段階を推定する目的で、血、血清、血漿、又は尿サンプルなどの体液サンプル中のｈＰＬの定量化に使用するため、例えばネズミ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ラクダ、ラット、ウサギ、又はその他の抗体のようなモノクローナル抗体などの抗ｈＰＬ抗体の使用を提供する。
【００７５】
一又は複数の実施例では、使用される抗体としてｈＰＬのａ−サブユニットに関するものが開示されている。
【００７６】
例えばマウス抗−ヒト胎盤性ラクトゲン（エピトープ２）モノクローナル抗体、Ａｂｃａｍ社の非抱合型のクローンＩＮＮ−ｈＰＬ−３７、マウス抗−ヒト胎盤性ラクトゲンモノクローナル抗体、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ社の非抱合型のクローンＩＮＮ−ｈＰＬ−５、マウス抗−胎盤性ラクトゲン（ｈＰＬ）モノクローナル抗体、及びＡｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨ社の非抱合型のクローンＬＩＰ−６０３など多くのモノクローナル抗体が市販されている。
【００７７】
代替として、モノクローナル抗体を含む抗体は、例えばオボアルブミンなどの適切な担体に結合するｈＰＬで宿主を免疫することにより、関連する技術分野における慣例技術で容易に調製することができる。使用される抗体は、例えば１％以下の又は状況に応じた適切な交差反応性を有するなど、ｈＰＬに特異的である必要がある。
【００７８】
一実施例では、本開示は、妊娠段階を確立する目的で女性から採取される体液サンプル中のｈＰＬ濃度を検査する器具及び／又は試薬を具えるキットを提供する。
【００７９】
一実施例では、流産又は胎児の死亡後のｈＰＬレベルの低下を識別するのに適したキットが提供されている。
【００８０】
ここに記載された検査は、胎盤の質量とｈＰＬの分泌濃度の間の相関関係を利用しており、女性が双子又は多胎児を妊娠している場合に、本方法は実際よりも遅い妊娠段階を結果として提示してしまう可能性がある。そうは言っても、多胎児を妊娠する可能性はわずか３％を占めるに過ぎないので、本開示の検査／方法／器具及び方法は、個人に便利で、費用対効果の高い、効率的な方法を提供する実用的なステップを示している。
【００８１】
ここに記載される一以上の実施例は、技術的に適切であれば組み合わせてもよいことを想定している。
【００８２】
本明細書の文脈の中で、“具える”は、“含む”として解釈されるべきである。
【００８３】
特定の要素を具える開示の態様も、関連する要素“〜から成る”又は“本質的に〜から成る”など、代替の実施例に拡張することを意図している。
【００８４】
ここで言及された全ての文献はそれらの全体が参照により組み込まれる。
【実施例】
【００８５】
“共有”光検知器と“通常読み取り”領域の両方を有する分析結果読み取り器具の実施例を、図５に示している。読み取り器具は、長さが約１２ｃｍ、幅が約２ｃｍで一般に指又は煙草の形状をしている。
【００８６】
好ましい実施例では、ハウジングは長さが約１２ｃｍ以内、幅が約２．５ｃｍ以内で、高さが約２．２ｃｍ以内である。しかし、クレジットカード形状のリーダーのような、任意の便利な形状を使用してもよい。この器具は光不透過性の合成プラスチック材料（例えば、炭素などの適切な遮光性顔料を含む、ポリカーボネート、ＡＢＳ、ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリプロピレン、又はポリスチロールなど）から形成されたハウジング１を具える。読み取り器具の一端部は、検査ストリップ（図示せず）がリーダーに挿入できるように狭いスロット又は開口３となっている。
【００８７】
リーダーの上面には、二つの楕円形状の開口がある。
【００８８】
一方の開口は、分析の結果など定性的に又は定量的に使用者に情報を提示する液晶ディスプレイ５の画面を収容している。他方の開口は、挿入された分析器具を、作動時に強制的に分析読み取り器具から放出するイジェクト機構のアクチュエータ７（チルドボタンの形式で）を収容している。
【００８９】
読み取り器具で使用する検査ストリップは、例えば米国特許第６，１５６，２７１号、米国特許第５，５０４，０１３号、欧州特許第７２８３０９号、又は欧州特許第７８２７０７号に開示されているような一般的に従来型の側流検査スティックである。検査ストリップと、当該検査ストリップが挿入されるリーダー内のスロットの表面は、検査ストリップがリーダー内に適切な方向に上手く挿入されるようにのみ形成及び寸法付けられている。分析器具と当該分析器具が挿入されるリーダー内のスロットの表面もまた、リーダーが正確に三次元配置され、正確にリーダーを読み取って分析結果を得ることを確実にするように形成及び寸法付けられている。
【００９０】
検査ストリップが正確にリーダーに挿入されると、エネルギー消費を減少すべくリーダーがとる通常の状態である“休眠”状態から、リーダーを活性化させるスイッチが閉じられる。
【００９１】
リーダーのハウジング内（従って図５では見えない）には、三つのＬＥＤを具えたリーダーを含む、更なる多くの部品がある。検査ストリップがリーダーに挿入されると、各ＬＥＤは検査ストリップのそれぞれの領域と整列する。第一のＬＥＤは、検査領域と整列し、第二のＬＥＤは、参考領域と整列し、及び第三のＬＥＤは、制御領域と整列する。二つのフォトダイオードが、様々な領域から反射光を検出し、フォトダイオードに入射した光の量に比例する大きさの電流を発生させる。電流は電圧に変換され、バッファにより緩衝され、アナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）に供給される。
【００９２】
得られたデジタル信号は、マイクロコントローラーによって読み取られる。
【００９３】
いくつかの実施例では、別々のフォトダイオードが、各領域から検出するために提供されている（すなわち、フォトダイオードの数は反射光測定がされる数に等しい）。
【００９４】
別の実施例では、フォトダイオードの数は領域の数より少ない。一のフォトダイオードが、検査領域からの反射光と参照領域からの反射光の一部を検出する。他のフォトダイオードが、参照領域からの光反射の一部と制御領域からの光反射の一部を検出する。マイクロコントローラーはＬＥＤを一ずつスイッチを入れ、任意の与えられた時間に三つの領域の一つのみが照明される。この方法により、それぞれの領域からの反射光により発生された信号は、時間に基づいて判別することができる。
【００９５】
分析器具をリーダーに挿入することによりスイッチが閉じられ、マイクロコントローラーを作動させる。器具は更に、電源（通常はボタン電池又は二つのボタン電池）と、マイクロコントローラーからの出力に応じる液晶表示器具を具える。
【００９６】
使用にあたり、乾いた検査ストリップ（すなわちサンプルに接触する前）がリーダーに挿入され、スイッチが閉じてリーダーが作動し、次いで初期キャリブレーションが行われる。さまざまなＬＥＤからの光出力の強度は滅多に同じではない。同様に、光検出器は、同一の感度を持っていることもない。そのような差が分析読み取りに影響を与える可能性があるので、初期キャリブレーションが行われ、マイクロコントローラーが、三つのＬＥＤの各々の点灯している時間の長さを調整し、これにより三つの領域（検査、参考及び制御）の各々から測定された信号がだいたい等しくなり、（さまざまな領域からの反射光の強度の差が信号に直接に比例する変化をもたらすように）システムの応答プロファイルの線形領域で適切な動作位置となる。
【００９７】
初期キャリブレーションを行った後、器具は更により細かいキャリブレーションを行う。これは、検査ストリップが乾いている間の各領域の反射光の強度の測定（「校正値」）を取り、次の測定（「検査値」）について、それぞれの領域の校正値を参照して正規化することを含む（すなわち、正規化された値＝検査値／校正値）。
【００９８】
分析を行うため、検査ストリップのサンプル受け部分を液体サンプルに接触させる。例えばこの場合尿サンプルについて、サンプル受け部分を尿の流れの中で保持してもよいし、尿サンプルを容器の中に採取して、サンプル受け部分をそのサンプルに一時的（約５−１０秒）に浸してもよい。検査ストリップがリーダーに挿入されている時に、サンプリングを行うことができ、それほど好ましいことではないが、サンプリングのために、ストリップを一時的にリーダーから取り外し、その後リーダーに再導入してもよい。
【００９９】
一般に検査ストリップをリーダーに挿入した後の特定の時間間隔の後に、一以上の領域（好ましくは三つ全部）からの反射光の強度の測定が次いで開始される。測定は、一定の間隔（例えば１−１０秒間隔、好ましくは１−５秒間隔で）で行われるのが望ましい。測定は、領域ごとに交互に多くの配列を短期間（１０ミリ秒以下）で連続的に読み取って行われ、それによりリーダーのハウジング内部を貫通する周囲の光強度の変化に起因するあらゆる影響を最小限に抑えることができる。
【０１００】
〔参考文献〕
Ｓｏｒｅｎｓｏｎ他（１９９５）ヒトの生殖 １０：４５３−４５８頁
Ｋａｐｌａｎ他（１９６５）科学 １４７：７５１頁
Ｊｏｓｉｍｏｖｉｃｈ他（１９６４）Ａｍ Ｊ．産科学と婦人科学 ８８：８６７−８７９頁
【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠段階を決定する方法であって、血液、血漿、血清、及び／又は尿サンプルから選択される女性から採取される体液サンプル中のホルモンｈＰＬ又はそのフラグメントの量を定量化するステップと、これに対応する妊娠の段階を確立するステップと、を具えることを特徴とする方法。
【請求項２】
さらに、第二のホルモンの量を定量化するステップを具えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第二のホルモンが、ｈＣＧ、非抱合型エストラジオール、リラキシン、又はこれらの組み合わせから選択されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記定量化が、各ホルモンに特異的な一又はそれ以上の抗体を用いて、一又は複数のホルモンの存在を検出することを用いることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
妊娠段階を確立するために女性から採取される、血液、血漿、血清、及び／又は尿サンプルから選択される体液サンプル中のｈＰＬ又はそのフラグメントのレベル／量を検出するのに適することを特徴とする器具。
【請求項６】
前記器具が、尿サンプル中のｈＰＬのレベル／量を検出するのに適することを特徴とする請求項５に記載の器具。
【請求項７】
前記器具が、サンプルの分析結果を提示するためのディスプレイを具えることを特徴とする請求項５又は６に記載の器具。
【請求項８】
前記ディスプレイが、デジタルであることを特徴とする請求項７に記載の器具。
【請求項９】
妊娠段階を確立するために、女性から採取される体液サンプル中のｈＰＬの濃度を検査するための器具及び／又は試薬を具えることを特徴とするキット。
【請求項１０】
血液、血漿、血清及び／又は尿サンプルから選択されるサンプル中のｈＰＬの量を分析する器具と、サンプル中のｈＣＧの量を分析する器具とを具えることを特徴とする請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
妊娠段階を決定するための抗ｈＰＬ抗体の使用。
【請求項１２】
前記抗ｈＰＬ抗体が、モノクローナルであることを特徴とする請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記抗ｈＰＬ抗体が、抗−ｈＣＧ、抗−リラキシン及び／又は抗−非抱合型エストラジオールから選択される抗体と組み合わせて用いられることを特徴とする請求項１１又は１２に記載の使用。
【請求項１】
妊娠段階を決定する方法であって、血液、血漿、血清、及び／又は尿サンプルから選択される女性から採取される体液サンプル中のホルモンｈＰＬ又はそのフラグメントの量を定量化するステップと、これに対応する妊娠の段階を確立するステップと、を具えることを特徴とする方法。
【請求項２】
さらに、第二のホルモンの量を定量化するステップを具えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第二のホルモンが、ｈＣＧ、非抱合型エストラジオール、リラキシン、又はこれらの組み合わせから選択されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記定量化が、各ホルモンに特異的な一又はそれ以上の抗体を用いて、一又は複数のホルモンの存在を検出することを用いることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
妊娠段階を確立するために女性から採取される、血液、血漿、血清、及び／又は尿サンプルから選択される体液サンプル中のｈＰＬ又はそのフラグメントのレベル／量を検出するのに適することを特徴とする器具。
【請求項６】
前記器具が、尿サンプル中のｈＰＬのレベル／量を検出するのに適することを特徴とする請求項５に記載の器具。
【請求項７】
前記器具が、サンプルの分析結果を提示するためのディスプレイを具えることを特徴とする請求項５又は６に記載の器具。
【請求項８】
前記ディスプレイが、デジタルであることを特徴とする請求項７に記載の器具。
【請求項９】
妊娠段階を確立するために、女性から採取される体液サンプル中のｈＰＬの濃度を検査するための器具及び／又は試薬を具えることを特徴とするキット。
【請求項１０】
血液、血漿、血清及び／又は尿サンプルから選択されるサンプル中のｈＰＬの量を分析する器具と、サンプル中のｈＣＧの量を分析する器具とを具えることを特徴とする請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
妊娠段階を決定するための抗ｈＰＬ抗体の使用。
【請求項１２】
前記抗ｈＰＬ抗体が、モノクローナルであることを特徴とする請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記抗ｈＰＬ抗体が、抗−ｈＣＧ、抗−リラキシン及び／又は抗−非抱合型エストラジオールから選択される抗体と組み合わせて用いられることを特徴とする請求項１１又は１２に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１２−５０８８９２（Ｐ２０１２−５０８８９２Ａ）
【公表日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４３８２０（Ｐ２０１１−５４３８２０）
【出願日】平成２１年１１月１６日（２００９．１１．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０５１５４８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５５３５５
【国際公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【出願人】（５１１１１８７８０）ガイ’ズ アンド エスティー．トーマス’ズ エヌエイチエス ファウンデイション トラスト (1)
【氏名又は名称原語表記】ＧＵＹ’Ｓ ＡＮＤ ＳＴ．ＴＨＯＭＡＳ’Ｓ ＮＨＳ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ ＴＲＵＳＴ
【出願人】（５１１１１８７９１）
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＮＯＮ−ＪＯＨＡＮＳＳＯＮ，Ａｎａｔｏｌｅ Ｓｅｂａｓｔｉａｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１６日（２００９．１１．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０５１５４８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５５３５５
【国際公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【出願人】（５１１１１８７８０）ガイ’ズ アンド エスティー．トーマス’ズ エヌエイチエス ファウンデイション トラスト (1)
【氏名又は名称原語表記】ＧＵＹ’Ｓ ＡＮＤ ＳＴ．ＴＨＯＭＡＳ’Ｓ ＮＨＳ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ ＴＲＵＳＴ
【出願人】（５１１１１８７９１）
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＮＯＮ−ＪＯＨＡＮＳＳＯＮ，Ａｎａｔｏｌｅ Ｓｅｂａｓｔｉａｎ
【Ｆターム（参考）】
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