弱毒化サルモネラ生ワクチン
本発明は、獣医学的動物種に感染する細菌、特にサルモネラ・エンテリカの弱毒化ｇｕａＢ欠失変異体、その使用および生成に関する。本発明は、獣医学的動物種において、特に家禽において細菌感染、特にサルモネラ症を防御するための、このような変異体株に基づく弱毒化生ワクチンにさらに関する。本発明により得られる弱毒化サルモネラ・エンテリカ株の１つは寄託番号ＬＭＧ Ｐ−２１６４１を有する腸炎菌株ＳＭ６９である。別の例は、寄託番号ＬＭＧ Ｐ−２１６４６を有するネズミチフス菌ＳＭ８６である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、弱毒化細菌変異体、とりわけ弱毒化サルモネラ・エンテリカ変異体、およびこれを含む弱毒化生ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
サルモネラは、腸内細菌科に属するグラム陰性、通性嫌気性、運動性、非ラクトース発酵性桿菌である。サルモネラは、通常、汚染された食品の摂取によりヒトに伝染し、そしてサルモネラ症を引き起こす。
【０００３】
サルモネラは、ウシ、ニワトリ、シチメンチョウ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ロバ、アザラシ、トカゲおよびヘビを含む多くの動物種から単離されている。
【０００４】
重要なサルモネラ病原体の９５％がサルモネラ・エンテリカに属し、サルモネラ・エンテリカ血清型ティフィムリウム（ネズミチフス菌）およびサルモネラ・エンテリカ血清型エンテリティディス（腸炎菌）が最も一般的な血清型である。
【０００５】
サルモネラ感染は、全世界的に深刻な医学的および獣医学的問題であり、そして食品産業における不安材料である。汚染された食品は容易には同定することができない。
【０００６】
致死的なヒト感染の可能性および畜産業の相当な経済的損失を回避するために、サルモネラ症の制御は重要である。
【０００７】
天然のサルモネラの偏在的な存在により、感染した動物の検出および根絶のみによる疾患の制御は困難になっている。
【０００８】
競合的排除およびワクチン接種の原理に基づくいくつかの制御計画は、例えば家禽の感染を制御するために試験されている。
【０００９】
牧場動物のワクチン接種はしばしば、サルモネラにより引き起こされる人畜共通感染症を防御するための最も有効な方法として考えられる。
【００１０】
全細胞死菌ワクチンおよびサブユニットワクチンは、動物およびヒトにおけるサルモネラ感染の防御において用いられるが、変動する結果を生じる。一般に不活化ワクチンはサルモネラ症に対してあまり良好な保護を提供しない。
【００１１】
弱毒化サルモネラ生ワクチンは：（ｉ）抗体応答に加えて細胞媒介の免疫を誘起するその能力；（ｉｉ）針汚染の危険性のない経口送達；（ｉｉｉ）単回用量の投与の後の有効性；（ｉｖ）複数の粘膜部位での免疫応答の誘起；（ｖ）低い生産コスト；および（ｖｉ）組換え抗原の免疫系への送達のための担体としてのその使用の可能性；のおかげで不活化調製物よりも潜在的に優れている。
【００１２】
弱毒化変異体株での結果は必ずしも良好ではないので、実際に市販されている弱毒化サルモネラ生ワクチンは少ない。
【００１３】
例えば家禽はａｒｏ−またはｃＡＭＰ変異体株でワクチン接種されているが、多くのニワトリがワクチン接種後、短時間で死亡した。サルモネラによる感染はしばしば非常に早期に起こるので、非常に若いニワトリのワクチン接種が不可欠である。しかしながら、これらはこの年齢では、場合によるとその免疫系の未熟さのためにサルモネラに対する感受性が非常に高い。ワクチン接種されたニワトリの保護が弱いのに加えて、ワクチン株の長期の排出がしばしば観察された。
【００１４】
ｃｙａおよびｃｒｐ遺伝子における欠失を担持するＭｅｇａｎ（登録商標）Ｖａｃｌ株（米国特許第５３８９３６８号；米国特許第５８５５８７９号；米国特許第５８５５８８０）でのトリのワクチン接種は、抗原投与の７日後に毒性サルモネラ抗原投与株を単離できるトリの数の低下を招く。しかしながら、これによって完全な保護が提供されるわけではない（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｇａｎｈｅａｌｔｈ．ｃｏｍ／ｍｅｇａｎｖａｃ．ｈｔｍｌ）。
【００１５】
従って、改善された弱毒化サルモネラ生ワクチン株および一般的な獣医学的動物種に感染する細菌の改善された弱毒化生ワクチン株が依然必要とされている。
【００１６】
ｇｕａＢ変異体のサルモネラおよびその他の細菌の毒性に及ぼす影響に関する文献における情報はわずかである。
【００１７】
ＭｃＦａｒｌａｎｄおよびＳｔｏｃｋｅｒ（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ３：１２９−１４１（１９８７））はＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるネズミチフス菌およびサルモネラ・ダブリンのｇｕａＡおよびｇｕａＢ Ｔｎ１０挿入変異体の低減された毒性（ネズミチフス菌について２．５×１０７ｃｆｕ、サルモネラ・ダブリンについて１０４ｃｆｕ）に関して報告しているが、これらの著者は、栄養要求性株の増幅の結果である高い致死性を報告している。
【００１８】
Ｗａｎｇら（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６９：４７３４−４７４１（２００１））はヒトの腸チフスに対するワクチンでの前臨床試験に関して報告した。Ｗａｎｇらのワクチンはチフス菌のΔｇｕａＢＡ変異体株を含む。しかしながら、この弱毒化株はマウスにおける有意な残留毒性を示した。
【００１９】
国際特許出願第ＷＯ９９／５８１４６号および米国特許第６１９０６６９号は、外来抗原を送達するための生ベクターとして使用される、ΔｇｕａＢＡ変異を宿すチフス菌ワクチン株を開示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的は、弱毒化サルモネラ・エンテリカ株を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、サルモネラ症に対する弱毒化生ワクチンおよびそれに基づいた防御の方法を提供することである。
【００２２】
本発明のさらに別の目的は、生ベクターとして、および外来抗原を発現するＤＮＡ媒介ワクチンとして有用である弱毒化生株を提供することである。従って、かかる株は、多価ワクチンを含むワクチンの開発に非常に適切である。
【００２３】
本発明のさらに別の目的は、弱毒化生ワクチンにおける使用のためのサルモネラ・エンテリカ欠失変異体を得る方法を提供することである。
【００２４】
さらに、本発明のさらなる目的は、獣医学的動物種、特に家禽に感染する細菌の弱毒化株を調製するための同一材料および方法を提供することである。
【００２５】
一般的な目標は食品の安全性および動物の健康を改善することである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明の第１の態様は、グアニンヌクレオチドを新規形成できない弱毒化サルモネラ・エンテリカ変異体株に関し、ここでこの変異体株はｇｕａＢ遺伝子に欠失変異を含有する。
【００２７】
サルモネラ・エンテリカに関して本明細書にて実証されるような原理を、中間体としてグアニンヌクレオチドを使用できる任意の生物に適用できる。したがって、本発明の態様は、ｇｕａＢ遺伝子に欠失変異を含有する獣医学的動物種に感染する細菌の弱毒化変異体株に関する。本発明の文脈において「獣医学的動物種に感染する細菌」なる用語は、特に獣医学的動物種に対して病原性である細菌を指し、それはｇｕａＢ遺伝子における欠失変異により弱毒化され得る。獣医学的動物種に感染する細菌はグラム陰性細菌であってよい。好ましいのはサルモネラ、パスツレラ菌、大腸菌等のような家禽のグラム陰性細菌である。最も好ましいのはサルモネラ・エンテリカおよび（病原性）大腸菌である。「に対して病原性」とは、弱毒化されていない場合、獣医学的動物種に感染性疾患を引き起こすことができる細菌を意味する。
【００２８】
本発明の変異体株は機能的ＧｕａＢ遺伝子生成物を発現できない。換言すれば、ｇｕａＢ遺伝子機能が損なわれており、それにより栄養要求性弱毒化株が得られる。
【００２９】
ｇｕａＢ遺伝子に欠失変異を担持する本発明の変異体株は、最小Ａ培地に０．３ｍＭグアニン、キサンチン、グアノシンまたはキサントシンを補充しなければ、この培地で成長できない。
【００３０】
本発明は、特に弱毒化腸炎菌およびネズミチフス菌株を提供することを目的とする。
【００３１】
好ましくは、ｇｕａＢ遺伝子における欠失変異を親株腸炎菌ファージ４型株７６Ｓａ８８または親株ネズミチフス菌１４９１Ｓ９６に導入する。
【００３２】
本発明により得られる弱毒化サルモネラ・エンテリカ株の１つは、寄託番号ＬＭＧ Ｐ−２１６４１を有する腸炎菌株ＳＭ６９である。別の例は、寄託番号ＬＭＧ Ｐ−２１６４６を有するネズミチフス菌ＳＭ８６である。
【００３３】
本発明の弱毒化変異体株は多価またはマルチバレントワクチンを含む弱毒化生ワクチンにおける使用に非常に適している。本発明の弱毒化変異体株は、外来抗原をコードし、発現でき、生ベクターとして、および／またはＤＮＡ媒介ワクチンとして用いられるようなものでよい。
【００３４】
本発明の第２の態様は：
ｇｕａＢ遺伝子における欠失変異のためにグアニンヌクレオチドの新規形成ができない、医薬的に有効な量または免疫量の本発明による変異体株；および
医薬的に許容される担体または希釈剤；
を含む細菌感染（例えばサルモネラにより引き起こされるサルモネラ症）に対して獣医学的動物種を免疫するための医薬用組成物またはワクチンに関する。好ましい組成物は本発明によるサルモネラ・エンテリカ変異体株を含むものである。
【００３５】
本発明の弱毒化株は、外来抗原をコードするＤＮＡを真核細胞に移入できる。この外来抗原は、本発明の弱毒化変異体株により含まれるプラスミドによりコードされ、そこから発現され得る。
【００３６】
一般的に約１０２ｃｆｕ〜約１０１０ｃｆｕ、好ましくは約１０５ｃｆｕ〜約１０１０ｃｆｕが投与される（医薬的に有効な量または免疫量の例）。免疫用量は投与の経路に従って異なる。当業者は、非経口的に投与されるワクチンのための有効用量が、飲料水等を介して投与される類似のワクチンよりも少ない可能性があることを見出すことができる。
【００３７】
本発明の弱毒化株、およびそれを含む医薬組成物またはワクチンは、動物または獣医学的動物種を細菌感染（例えばサルモネラ症）および場合によってはその他の疾患（マルチバレントワクチンの場合）に対して免疫するのに非常に適している。
【００３８】
したがって、本発明のさらなる態様は、動物、好ましくは獣医学的動物種、さらに好ましくはニワトリのような家禽を、細菌による感染（例えばサルモネラにより引き起こされるサルモネラ症）に対して免疫する方法に関し、この方法は：
免疫量の本発明の弱毒化変異体株および／またはそれを含むワクチンを、それを必要とする動物または獣医学的動物種に投与し、それにより次いで動物または獣医学的動物種において保護免疫応答を惹起する工程；
を含む。
【００３９】
サルモネラ症に対して免疫される獣医学的動物種の例：ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ウズラ、ホロホロチョウ、ブタ、ヒツジ、子牛、畜牛等のような家禽、小型または大型家畜。
【００４０】
一般的に適切な用量が、好ましくは経口、経鼻または非経口経路によりこれらの動物に投与される。
【００４１】
本発明の最後の態様は、医薬品として使用するための（例えばワクチンにおいて使用するための）本発明の変異体株に関する。本発明のなお別の態様は、サルモネラ症のような病原体（感染細菌）により引き起こされる疾患の防御（および／または処置）のための、ワクチンのような医薬品の調製のための本発明の弱毒化変異体株の使用に関する。処置される動物または獣医学的動物種の例および推奨される用量は上述で提示されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
驚くべきことに、ｇｕａＢ遺伝子における欠失変異は、毒性が有意に低下し、家畜動物における免疫応答を誘起することができる弱毒化サルモネラ・エンテリカ株を導くことができることが見出された。かかる欠失は、中間体としてグアニンヌクレオチドを使用できる任意の生物を弱毒化する。
【００４３】
「遺伝子」なる用語は、本明細書にて使用される際には、コード配列ならびにプロモーターおよび終止シグナルのようなその調節配列を指す。
【００４４】
本発明による欠失変異体株は、プリン代謝経路酵素ＩＭＰデヒドロゲナーゼ（ｇｕａＢによりコードされる）が不活化されているものである。
【００４５】
ｇｕａＢ遺伝子機能が損なわれ、影響を受ける（複数の）遺伝子のヌル機能（機能的な遺伝子生成物が形成されない）を導く欠失により、かかる不活化を得ることができる。当業者にはかかる変異体株を得る方法が既知であり、簡単な試験によりｇｕａＢ遺伝子機能が損なわれているかどうかを見分けることができる。機能的ｇｕａＢ遺伝子生成物を発現できない変異体株は、最小Ａ培地に（例えば０．３ｍＭの）グアニン、キサンチン、グアノシンまたはキサントシンを補充しなければ、この培地で成長できない。
【００４６】
本発明は中でも、弱毒化腸炎菌およびネズミチフス菌株が最も一般的なサルモネラ・エンテリカ血清型であるので、これらを提供することを目的とする。
【００４７】
本発明は弱毒化株を提供する。本発明は、とりわけサルモネラ症に対する弱毒化生ワクチンとして、外来抗原を発現する生ベクターとして、および／またはＤＮＡ媒介ワクチンとして使用するための、中でも弱毒化サルモネラ・エンテリカ株を提供する。本明細書にて使用される際には「外来抗原」とはサルモネラに対して外来性である抗原を意味する。
【００４８】
生ベクターワクチンは、「担体ワクチン」および「生抗原送達系」とも称され、ワクチン学の刺激的かつ多目的な分野を含む（Ｌｅｖｉｎｅら、Ｍｉｃｒｏｅｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９：２３−３２（１９９０））。この研究法では、ウイルス性または細菌性生ワクチンは、それが別の微生物の保護性外来抗原を発現し、そしてこれらの抗原を免疫系に送達し、それにより保護免疫応答を刺激するように改変されている。公表されている細菌性生ベクターには、とりわけ弱毒化サルモネラが含まれる。
【００４９】
本発明の目的は、生ワクチン、場合によって多価またはマルチバレント生ワクチンにおいて使用するための弱毒化サルモネラ・エンテリカ株のような弱毒化株を提供することである。
【００５０】
したがって本発明の目的の１つは：
グアニンヌクレオチドの新規形成ができない、医薬的に有効な量または免疫量の本発明の変異体株（例えばサルモネラ・エンテリカ変異体株）、ここでこの変異体株はｇｕａＢ遺伝子において欠失変異を含有する；および
医薬的に許容される担体または希釈剤；
を含む、例えばサルモネラ症に対するワクチンを提供することである。
【００５１】
本発明の別の目的は：
グアニンヌクレオチドの新規形成ができない、医薬的に有効な量または免疫量の本発明の変異体株（例えばサルモネラ・エンテリカ変異体株）、ここでこの変異体株はｇｕａＢ遺伝子において欠失変異を含有し、変異体株外来抗原をコードし、発現する；および
医薬的に許容される担体または希釈剤；
を含む、生ベクターワクチンを提供することである。
【００５２】
生ベクター（サルモネラ・エンテリカ）で用いられる特定の外来抗原は本発明にとって重要ではない。
【００５３】
本発明のさらに別の目的は：
グアニンヌクレオチドの新規形成ができない、医薬的に有効な量または免疫量の本発明の変異体株（例えばサルモネラ・エンテリカ変異体株）、ここでこの変異体株はｇｕａＢ遺伝子において欠失変異を含有し、変異体株外来抗原をコードし、真核細胞において発現するプラスミドを含有する；および
医薬的に許容される担体または希釈剤；
を含むＤＮＡ媒介ワクチンを提供することである。
【００５４】
ＤＮＡ媒介ワクチンの構築および使用に関する詳細は米国特許第５８７７１５９号（参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。また、ＤＮＡ媒介ワクチンに用いられる特定の外来抗原は本発明にとって重要ではない。
【００５５】
例えばサルモネラ・エンテリカにおいて（生ベクターワクチンで真核細胞性プロモーターを用いて）または例えばサルモネラ・エンテリカにより浸潤された細胞において（ＤＮＡ媒介ワクチンで真核細胞性プロモーターを用いて）外来抗原を発現するかどうかの決定は、動物実験もしくは臨床試験においてその特定の抗原に関するどのワクチン構築物により最良の免疫応答が得られるか、および／または抗原のグリコシル化がその保護免疫原性に必須であるかどうか、および／または抗原の正確な三次元立体構造が発現の１つの形態で他の形態よりも良好に達成されるかどうかに基づき得る（米国特許第５７８３１９６号）。
【００５６】
本発明のワクチンでは、投与される本発明の変異体株の医薬的に有効な量または免疫量は対象の年齢、体重および性別に依存して異なる。本明細書にて使用される際には「免疫量」とは、実際に医薬用組成物／ワクチンを投与される動物において免疫応答を誘起することができる量を意味する。惹起される免疫応答は体液性、粘膜、局所および／または細胞性免疫応答であることができる。
【００５７】
特定の医薬的に許容される担体または希釈剤は本発明にとっては重要ではなく、そして当分野で慣用技術である。希釈剤の例には：スクロースを含有するクエン酸緩衝剤（ｐＨ７．０）、重炭酸塩緩衝剤（ｐＨ７．０）単独またはアスコルビン酸、ラクトースおよび場合によってはアスパルテームを含有する重炭酸塩緩衝剤（ｐＨ７．０）のような胃で胃酸に対して緩衝するための緩衝剤が挙げられる。担体の例には：例えば脱脂粉乳に見出されるようなタンパク質；糖；例えばスクロース；またはポリビニルピロリドンが挙げられる。
【００５８】
本発明による欠失変異体は、標準的な相同組換えにより創成され、それによりｇｕａＢ遺伝子の一部、例えばｇｕａＢコード配列の一部は、第１工程では、抵抗性遺伝子およびＦＲＴ部位をフランキングすることにより置き換えられる。
【００５９】
好ましくは、第２工程では、前記抵抗性遺伝子は２つのＦＲＴ部位の間の組換えにより除去される。ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（２０００）に従って、１つのＦＲＴ部位ならびにプライミング部位Ｐ１およびＰ２は組換えの分子メカニズムにより残存し、抗生物質抵抗性遺伝子を除去する（例えば図４参照）。
【００６０】
本発明の特定の実施例は、例えば、変異したｇｕａＢ遺伝子または配列番号１２を含むコード配列を含む、腸炎菌のｇｕａＢ欠失変異体に関する。
【００６１】
図面の簡単な記述
図１は、グアノシン一リン酸の生合成経路の概略図である（ＺａｌｋｉｎおよびＮｙｇａａｒｄ，１９９６「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９９６）Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ編 ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，第１巻、３４章：５６１−５７９から改作した）。ＡＩＣＡＲ：５’−ホスホリボシル−４−カルボキサミド−５−アミノイミダゾール；ＡＴＰ：アデノシン三リン酸；Ｇ：グアニン；ＧＭＰ：グアノシン一リン酸；ＧＲ：グアノシン；Ｈｘ：ヒポキサンチン；ＨｘＲ：ヒポキサンチンリボシド（イノシン）；ＩＭＰ：イノシン一リン酸；Ｘ：キサンチン、ＸＭＰ：キサントシン一リン酸；ｇｕａＡ：ＧＭＰシンテターゼ、ｇｕａＢ：ＩＭＰデヒドロゲナーゼ；ｇｕａＣ：ＧＭＰリダクターゼ。
【００６２】
図２は、腸炎菌ゲノムのコンティグ１２９４を表す（配列番号：１０）。ｇｕａＢ遺伝子のＡＴＧ開始コドンおよびＴＧＡ終止コドンは太字である。
【００６３】
図３は、ｐＵＣ１８にクローン化された腸炎菌のΔｇｕａＢフラグメントの配列を表す（配列番号：１１）。使用されたプライマーを水平矢印により示す。プライマーＧｕａＢ６−ＧｕａＢ７で作成されたフラグメントをｐＵＣ１８にクローン化した。ｇｕａＢ遺伝子のＡＴＧ開始およびＴＧＡ終止コドンならびにＣＣＣＧＧＧ ＳｍａＩ制限部位を太字で示す。
【００６４】
図４は、プライマーＧｕａＢ１０を用いて配列決定後に得られたｇｕａＢ欠失を含む、腸炎菌ＰＣＲフラグメントのヌクレオチド配列を表す（配列番号：１２）。変異体ＳＭ２０の全ゲノムＤＮＡを用いてプライマーＧｕａＢ６−ＧｕａＢ７でＰＣＲフラグメントを増幅した。残存するＦＲＴ部位を太字イタリックで、そしてＰ１およびＰ２プライマーを矢印により示す（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ、ＰＮＡＳ ９７：６６４０−６６４５（２０００））。ｇｕａＢ遺伝子のＡＴＧ開始およびＴＧＡ終止コドンを太字で示す。
【００６５】
図５は、ネズミチフス菌ＬＴ２のｇｕａＢ遺伝子、完全ゲノムのセクション２２０の１１７を示す（配列番号：１３）。ｇｕａＢ遺伝子のＡＴＧ開始およびＴＧＡ終止コドンを太字で示す。
【００６６】
図６−７は、ＳＭ６９およびＳＭ８６の各々に関する寄託受領を表す。
【００６７】
以下の実施例および実施形態において添付の図面を参照して本発明をさらに詳細に記載する。特定の実施形態および実施例は特許請求されるように本発明の範囲がいかなるようにも限定されないと意図される。
【実施例】
【００６８】
実施例１：栄養要求性変異はｇｕａＢ遺伝子に影響を及ぼす
挿入変異誘発により野生型腸炎菌の栄養要求性挿入変異体が得られた。０．３ｍＭグアニン、キサンチン、グアノシンまたはキサントシンを補充した場合のみ、変異体株は最小Ａ培地で成長できた。
【００６９】
これらのデータにより、株の栄養要求性変異は、酵素ＩＭＰデヒドロゲナーゼをコードするｇｕａＢ遺伝子に影響を及ぼすことが強く示唆される（ＥＣ１．１．１．２０５）。図１で示されるように、この酵素はイノシン−５’−一リン酸（ＩＭＰ）をキサントシン一リン酸（ＸＭＰ）に変換する。
【００７０】
挿入変異体は復帰することがあり、それにより株の病原性を復活させることがある。これは弱毒化生ワクチンにおけるその適用性を限定する。その態様では欠失変異体が好ましい。したがって腸炎菌およびネズミチフス菌のｇｕａＢ欠失変異体が創成され、そして試験された。双方の血清型のｇｕａＢ遺伝子を図２および５に示す。
【００７１】
実施例２：ｇｕａＢ欠失変異体
ｇｕａＢ欠失変異体の構築
ｇｕａＢ欠失変異体は、大腸菌Ｋ１２のゲノムにおいて欠失変異体を作成するための方法（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ、ＰＮＡＳ ９７：６６４０−６６４５（２０００）、参照により本明細書に組み込まれる）に従って作成された。
【００７２】
この方法はバクテリオファージλレッドリコンビナーゼ系により媒介される、ＰＣＲにより作成された直鎖状ＤＮＡフラグメントの相同組換えに頼る。
【００７３】
これによって、ｇｕａＢ配列が抗生物質抵抗性遺伝子により置換される。この抵抗性遺伝子はＦＲＴ部位（ＦＬＰ認識標的部位）によりフランキングされ、そしてＦＬＰリコンビナーゼにより媒介される部位特異的組換えによりゲノムから切除できる。
【００７４】
重複ＰＣＲ（Ｈｏら、Ｇｅｎｅ ７７：５１−５９（１９８９））を、直鎖状フラグメントを構築するために適用した。原理はｇｕａＢ遺伝子の２つのプライマーセット、１つの上流対（ＧｕａＢ３−ＧｕａＢ４；ＧｕａＢ３：５’ ＧＧＣＴＧＣＧＡＴＴ ＧＧＣＧＡＧＧＴＡＧ ＴＡ ３’，配列番号２；ＧｕａＢ４：５’ ＧＧＴＧＡＴＣＣＣＧ ＧＧＣＧＴＣＡＡＡＣ ＧＴＣＡＧＧＧＣＴＴ ＣＴＴＴＡ ３’，配列番号３）および１つの下流対（ＧｕａＢ５−ＧｕａＢ２；ＧｕａＢ５：５’ ＴＴＧＡＣＧＣＣＣＧ ＧＧＡＴＣＡＣＣＡＡ ＡＧＡＧＴＣＣＣＣＧ ＡＡＣＴＡ ３’，配列番号４；ＧｕａＢ２：５’ ＣＧＴＴＣＡＧＧＣＧ ＣＡＡＣＡＧＧＣＣＧ ＴＴＧＴ ３’，配列番号１）の使用に頼る。
【００７５】
双方のセットは、部分的に相補的であり、そしてそれにＳｍａＩ制限部位を付加したプライマー（ＧｕａＢ４、ＧｕａＢ５）を含有する。
【００７６】
得られた相補的配列のアニーリングおよび鎖伸長の後、外向きプライマー（ＧｕａＢ６−ＧｕａＢ７；ＧｕａＢ６：５’ ＧＣＡＡＣＡＡＣＴＣ ＣＴＧＣＴＧＧＴＴＡ ３’，配列番号５；ＧｕａＢ７：５’ ＡＧＡＣＣＧＡＧＧＡ ＴＣＡＣＴＴＴＡＴＣ ３’，配列番号６）でのＰＣＲにより、ＧｕａＢコード配列の８６１塩基対内部セグメントを置き換える６塩基対ＳｍａＩ部位を有するフラグメントを作成した。このΔｇｕａＢフラグメントをベクターｐＵＣ１８にクローン化した（図３参照）。
【００７７】
プライマーＰ１（５’ ＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧ ＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ ３’，配列番号８）およびＰ２（５’ ＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡ ＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧ ３’，配列番号９）（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（２０００））ならびにプラスミドｐＫＤ３ ＤＮＡ（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（２０００））を鋳型として使用して、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子（ｃａｔ）をそのフランキングＦＲＴ配列と共に増幅した。
【００７８】
このＰＣＲフラグメントを、クローン化されたΔｇｕａＢフラグメントのＳｍａＩ部位にライゲートした。ネステッドプライマー（ＧｕａＢ６−ＧｕａＢ７）を使用して望ましいフラグメントを作成した。
【００７９】
バクテリオファージラムダレッドリコンビナーゼ系をコードする温度感受性複製プラスミドｐＫＤ４６を宿す、腸炎菌ファージ４型株７６Ｓａ８８（Ｔｈｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ａｎｄ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｇｒｏｅｓｅｌｅｎｂｅｒｇ ９９，Ｂ−１１８０ Ｕｋｋｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍから入手したシチメンチョウからの臨床分離株）に、得られたＰＣＲフラグメントをエレクトロポレーションした。
【００８０】
最小Ａ培地および０．３ｍＭグアニンを補充した最小Ａ培地でクロラムフェニコール抵抗性形質転換体を試験した。以下のプライマーの組み合わせ：ＧｕａＢ６−ＧｕａＢ７、ＧｕａＢ６−Ｐ２、ＧｕａＢ７−Ｐ１およびＰ１−Ｐ２を使用するＰＣＲによりΔｇｕａＢ：：ｃａｔＦＲＴ変異体を確認した。
【００８１】
腸炎菌ΔｇｕａＢ：：ｃａｔＦＲＴ変異体（ＳＭ１２）を、エレクトロポレーションによって温度感受性複製プラスミドｐＣＰ２０で形質転換した。プラスミドｐＣＰ２０はＦＬＰリコンビナーゼをコードし、それはｃａｔ遺伝子を除去するためにＦＲＴ部位を認識する。得られた株をＳＭ２０と称した。
【００８２】
変異体ＳＭ２０の全ゲノムＤＮＡおよびプライマーの組み合わせＧｕａＢ６−ＧｕａＢ７を使用して、欠失が位置するＰＣＲフラグメントが得られた（図４参照）。
【００８３】
プライマーＧｕａＢ１０（５’ ＡＧＧＡＡＧＴＴＴＧ ＡＧＡＧＧＡＴＡＡ ３’，配列番号７）を使用して、このフラグメントの配列決定によりΔｇｕａＢ変異を確認した。
【００８４】
前記した全てのプライマーの配列を表１に示す。
【００８５】
レッドリコンビナーゼ系の発現により引き起こされる、可能な追加的な変異体の存在を回避するために、同質遺伝子株を構築した。
【００８６】
変異体ＳＭ１２のΔｇｕａＢ：：ｃａｔＦＲＴ変異をＳＭ１２のバクテリオファージＰ２２ ＨＴ ｉｎｔ−（Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｂｏｔｓｔｅｉｎ Ｄ．およびＲｏｔｈ，Ｊ．Ｒ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａ ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）によって野生型腸炎菌７６Ｓａ８８に形質導入した。プラスミドｐＣＰ２０を使用してｃａｔ遺伝子を除去した。得られた株はＳＭ６９と称された（寄託番号ＬＭＧ Ｐ−２１６４１）。
【００８７】
同一の手順および同一のプライマーを使用してネズミチフス菌株１４９１Ｓ９６のΔｇｕａＢ変異体を構築した。得られたネズミチフス菌ΔｇｕａＢ：：ｃａｔＦＲＴ株およびネズミチフス菌ΔｇｕａＢ株を、それぞれＳＭ９およびＳＭ１９と称した。ＳＭ８６（寄託番号ＬＭＧ Ｐ−２１６４６を有する）は、株ＳＭ９からのバクテリオファージＰ２２ ＨＴ ｉｎｔ−ライゼートによる形質導入の後、およびプラスミドｐＣＰ２０を使用するｃａｔ遺伝子の切除の後に、それらから得られた同質遺伝子株である。
【００８８】
ΔｇｕａＢ変異体ＳＭ１９、ＳＭ２０、ＳＭ８６およびＳＭ６９はバクテリオファージＰ２２に感受性がある。これによりインタクトなリポ多糖類（ＬＰＳ）の存在が判明する。
【００８９】
マウスにおけるｇｕａＢ欠失変異体ＳＭ２０を用いる毒性および保護試験
独立した２つの実験で６−８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの経口感染によりマウスにおける変異体ＳＭ２０の毒性を試験した。これらを前記したように実施した。野生型株腸炎菌７６Ｓａ８８を陽性対照として平行して試験した。腸炎菌７６Ｓａ８８ ΔａｒｏＡ変異体ＳＭ５０をワクチン対照として実験に含めた。この変異体は完全ａｒｏＡコード配列の正確な欠失を担持し、そしてＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（２０００）の方法により構築された。
【００９０】
完全なデータを表２および３に示す。これらの結果により、マウスにおいてΔｇｕａＢ変異体ＳＭ２０が強く弱毒化されるが、この高用量で投与された場合に依然いくらかの残留病原性を示すことが実証される。高用量の対応する病原性野生型腸炎菌株７６Ｓａ８８による感染に対して、この変異体での経口免疫が保護免疫を誘起する。その保護は腸炎菌ΔａｒｏＡ変異体ＳＭ５０により付与される保護と少なくとも同等である。
【００９１】
マウスにおける同質遺伝子ｇｕａＢ欠失変異体ＳＭ６９およびＳＭ８６での毒性および保護試験
マウスにおける変異体ＳＭ６９およびＳＭ８６の毒性を６−８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの経口感染により試験した。これらを前記したように実施した。野生型株腸炎菌７６Ｓａ８８およびネズミチフス菌１４９１Ｓ９６を陽性対照として平行して試験した。
【００９２】
完全なデータを表４−７に示す。これらの結果により、マウスにおいてΔｇｕａＢ変異体ＳＭ６９およびＳＭ８６が強く弱毒化されるが、この高用量で投与された場合に、なお依然いくらかの残留病原性を示すことが実証される。高用量の対応する病原性野生株による感染に対して、変異体での経口免疫が保護免疫を誘起する。
【００９３】
気管内および経口経管経路による１日齢のニワトリにおける腸炎菌ΔｇｕａＢ欠失変異体ＳＭ６９の安全性評価
この研究の目的は、１日齢のニワトリにおける腸炎菌ΔｇｕａＢ変異体株ＳＭ６９マスターシードの安全性を評価することであった。安全性の決定のための一次的なパラメータとして死亡率を用いた。
【００９４】
１日齢のニワトリの脚にバンドを付け、そして４つの処置群の各々に無作為に配した（第１群：ＳＭ６９−ＩＴ、第２群：ＳＭ６９−ＯＧ、第３群：ＰＢＳ−ＩＴおよび第４群：ＰＢＳ−ＯＧ）。マスターシード接種の後、第１および第２群からのトリを１つの隔離飼育器に、そして第３および第４群のトリを別の隔離飼育器に配した。
【００９５】
第１および第２群のニワトリに各々気管内（ＩＴ）経路または経口経管（ＯＧ）経路により、ＳＭ６９マスターシードを、トリあたりの実際の力価１．２８×１０８ｃｆｕ／０．２ｍｌで接種した。第３および第４群のニワトリに各々気管内経路または経口経管経路により、トリあたり０．２ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を投与した。
【００９６】
ＳＭ６９またはＰＢＳの接種の後、ニワトリ死亡率を接種後３８日まで毎日観察した。表８に全４群に関する死亡率の結果をまとめる。第１群では接種中に接種外傷のために１羽のトリが死亡した。接種後（ＤＰＩ）２日に２羽のトリが死亡した。３日目から１３日目までに３羽のトリが死亡した（各々３、５および１３ＤＰＩ）。従って、第１群では全部で６羽のトリが死亡した。第２群では全部で２羽のトリが死亡した。１羽は接種中に接種外傷のために死亡し、そして１羽は接種後５日に死亡した。ＰＢＳ処置群では気管内経路でも経口経管経路でも死亡したトリはなかった。
【００９７】
この研究により、腸炎菌ΔｇｕａＢ変異体株ＳＭ６９は１日齢のトリあたり１．２８×１０８ｃｆｕで気管内経路または経口経管経路により投与された場合に安全ではないことが示される。
【００９８】
気管内経路および経口経管経路による２週齢のニワトリにおける腸炎菌ΔｇｕａＢ欠失変異体ＳＭ６９の安全性評価
次いで腸炎菌ΔｇｕａＢ変異体株ＳＭ６９の安全性を２週齢の特定病原体未感染（ＳＰＦ）のニワトリにおいて気管内経路または経口経管経路により評価した。安全性の決定のために死亡率を一次基準として、および体重を二次基準として用いた。
【００９９】
２週齢のトリの脚にバンドを付け、そして４つの処置群の各々に無作為に配した：ＳＭ６９−ＩＴ、ＳＭ６９−ＯＧ、Ｐｏｕｌｖａｃ ＳＴ−ＩＴおよびＰＢＳ−ＩＴ。第１群の１０羽のトリに気管内経路によりＳＭ６９を接種し；第２群の１０羽のトリに経口経管によりＳＭ６９を接種し；第３群の１０羽のトリに気管内経路によりネズミチフス菌ＡｒｏＡ−ワクチン（Ｐｏｕｌｖａｃ（登録商標）ＳＴ）を接種し；そして第４群の５羽のトリに気管内経路によりＰＢＳを接種した。
【０１００】
第１および第２群のニワトリに各々気管内経路または経口経管経路により、ＳＭ６９マスターシードをトリあたりの実際の力価２．３０４×１０８ｃｆｕ／０．２ｍｌで接種した。第３群のニワトリに気管内経路により、Ｐｏｕｌｖａｃ（登録商標）ＳＴをトリあたり２．１９×１０８ｃｆｕ／０．２ｍｌで投与した。第４群のニワトリに気管内経路によりトリあたり０．２ｍｌのＰＢＳを投与した。
【０１０１】
接種後、処置第１および第２群からのトリを１つの隔離飼育器に、そして第３および第４群のトリを別の隔離飼育器に配した。
【０１０２】
接種に続いて、接種後２１日まで死亡率を毎日観察した。全てのトリの体重もまた研究期間（２１日間）の最後に記録した。Ｐｏｕｌｖａｃ（登録商標）ＳＴおよびＰＢＳを気管内手順の対照として使用した。
【０１０３】
２１日の観察期間中にＳＭ６９気管内処置群（第１群）の１羽のトリが卵黄嚢感染から死亡した。死亡率はＳＭ６９に関連せず、それはＳＭ６９株が気管内経路および経口経管経路により、試験された力価、トリあたり２．３０４×１０８ｃｆｕで安全であることを示している。予想されたように、トリあたり２．１９×１０８ｃｆｕの力価でＰｏｕｌｖａｃ（登録商標）ＳＴ処置されたトリ、またはＰＢＳ処置されたトリのいずれでも死亡は観察されず、それはこの研究が正当であったことを示している（表９）。
【０１０４】
従属変数として体重、および独立変数として含められた処置を用いる分散（ＡＮＯＶＡ）モデルの分析で体重を群間で比較した。多重比較のためにチューキー検定を使用して群比較を行った。有意性のレベルをｐ＜０．０５に設定した、対照ニワトリ（ＰＢＳ対照群）は健常のままであり、そして研究の間中臨床病徴または死亡はなかったので、研究は正当であると考えられた。
【０１０５】
気管内接種または経口経管接種によるＳＭ６９、Ｐｏｕｌｖａｃ（登録商標）ＳＴまたはＰＢＳを投与されたニワトリにおける最終体重に有意差はなかった（表５）。１日齢の各群のトリのベースラインは確立されなかったが、トリは無作為に４つの処置群の各々に配されたので、４群間の初期体重に有意差があったとは考えられなかった。
【０１０６】
死亡率はＳＭ６９の接種に帰因しなかったので、腸炎菌ΔｇｕａＢ変異体株ＳＭ６９は、気管内接種経路または経口経管接種経路のいずれかにより、２週齢のトリあたり２．３０４×１０８ｃｆｕ／０．２ｍｌ用量の試験された力価で投与された場合、安全であると結論づけることができる。ＳＭ６９接種は、本実施例で評価された第二の安全性パラメータであるトリの最終体重には影響しなかった。
【０１０７】
以下の微生物に関してＢＣＣＭ／ＬＭＧカルチャーコレクション、（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ ｖｏｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ、Ｋ．Ｌ．Ｌｅｄｅｇａｎｃｋｓｔｒａａｔ３５、Ｂ−９０００、ゲント（ベルギー））でブダペスト条約に従って寄託を行っている：寄託番号ＬＭＧ Ｐ−２１６４１の下で腸炎菌ＳＭ６９（寄託日：２００２年８月９日）および寄託番号ＬＭＧ Ｐ−２１６４６の下でネズミチフス菌ＳＭ８６（寄託日：２００２年８月２８日）。寄託はＰｒｏｆ．Ｊ．−Ｐ．Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓ（旧住所：Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｂｒｕｓｓｅｌ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ Ｇｅｎｅｔｉｓｃｈｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｅ，Ｐａａｒｄｅｎｓｔｒａａｔ ６５，Ｂ−１６４０ Ｓｉｎｔ−Ｇｅｎｅｓｉｕｓ−Ｒｈｏｄｅ、現住所：Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｂｒｕｓｓｅｌ，Ｏｎｄｅｒｚｏｅｋｓｇｒｏｅｐ Ｇｅｎｅｔｉｓｃｈｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｅ，Ｐｌｅｉｎｌａａｎ ２，Ｂ−１０５０ ブリュッセル、ベルギー）の名の下で行われた。
【０１０８】
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】グアノシン一リン酸の生合成経路の概略図である。
【図２】腸炎菌ゲノムのコンティグ１２９４を表す（配列番号：１０）。
【図３】ｐＵＣ１８にクローン化された腸炎菌のΔｇｕａＢフラグメントの配列を表す（配列番号：１１）。
【図４】プライマーＧｕａＢ１０を用いて配列決定後に得られたｇｕａＢ欠失を含む、腸炎菌ＰＣＲフラグメントのヌクレオチド配列を表す（配列番号：１２）。
【図５】ネズミチフス菌ＬＴ２のｇｕａＢ遺伝子、完全ゲノムのセクション２２０の１１７を示す（配列番号：１３）。
【図６−１】ＳＭ６９に関する寄託受領を表す。
【図６−２】ＳＭ６９に関する寄託受領を表す。
【図６−３】ＳＭ６９に関する寄託受領を表す。
【図６−４】ＳＭ６９に関する寄託受領を表す。
【図７−１】ＳＭ８６に関する寄託受領を表す。
【図７−２】ＳＭ８６に関する寄託受領を表す。
【図７−３】ＳＭ８６に関する寄託受領を表す。
【図７−４】ＳＭ８６に関する寄託受領を表す。
【配列表フリーテキスト】
【０１１０】
配列番号１は、ＧｕａＢ２プライマーの配列である。
配列番号２は、ＧｕａＢ３プライマーの配列である。
配列番号３は、ＧｕａＢ４プライマーの配列である。
配列番号４は、ＧｕａＢ５プライマーの配列である。
配列番号５は、ＧｕａＢ６プライマーの配列である。
配列番号６は、ＧｕａＢ７プライマーの配列である。
配列番号７は、ＧｕａＢ１０プライマーの配列である。
配列番号８は、Ｐ１プライマーの配列である。
配列番号９は、Ｐ２プライマーの配列である。
配列番号１０は、腸炎菌ゲノムのコンティグ１２９４の配列である。
配列番号１１は、ｐＵＣ１８にクローン化された腸炎菌のΔｇｕａＢフラグメントの配列である。
配列番号１２は、プライマーＧｕａＢ１０を用いて得られたｇｕａＢ欠失を含む、腸炎菌ＰＣＲフラグメントのヌクレオチド配列である。
配列番号１３は、ネズミチフス菌ＬＴ２のｇｕａＢ遺伝子、完全ゲノムのセクション２２０の１１７の配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、弱毒化細菌変異体、とりわけ弱毒化サルモネラ・エンテリカ変異体、およびこれを含む弱毒化生ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
サルモネラは、腸内細菌科に属するグラム陰性、通性嫌気性、運動性、非ラクトース発酵性桿菌である。サルモネラは、通常、汚染された食品の摂取によりヒトに伝染し、そしてサルモネラ症を引き起こす。
【０００３】
サルモネラは、ウシ、ニワトリ、シチメンチョウ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ロバ、アザラシ、トカゲおよびヘビを含む多くの動物種から単離されている。
【０００４】
重要なサルモネラ病原体の９５％がサルモネラ・エンテリカに属し、サルモネラ・エンテリカ血清型ティフィムリウム（ネズミチフス菌）およびサルモネラ・エンテリカ血清型エンテリティディス（腸炎菌）が最も一般的な血清型である。
【０００５】
サルモネラ感染は、全世界的に深刻な医学的および獣医学的問題であり、そして食品産業における不安材料である。汚染された食品は容易には同定することができない。
【０００６】
致死的なヒト感染の可能性および畜産業の相当な経済的損失を回避するために、サルモネラ症の制御は重要である。
【０００７】
天然のサルモネラの偏在的な存在により、感染した動物の検出および根絶のみによる疾患の制御は困難になっている。
【０００８】
競合的排除およびワクチン接種の原理に基づくいくつかの制御計画は、例えば家禽の感染を制御するために試験されている。
【０００９】
牧場動物のワクチン接種はしばしば、サルモネラにより引き起こされる人畜共通感染症を防御するための最も有効な方法として考えられる。
【００１０】
全細胞死菌ワクチンおよびサブユニットワクチンは、動物およびヒトにおけるサルモネラ感染の防御において用いられるが、変動する結果を生じる。一般に不活化ワクチンはサルモネラ症に対してあまり良好な保護を提供しない。
【００１１】
弱毒化サルモネラ生ワクチンは：（ｉ）抗体応答に加えて細胞媒介の免疫を誘起するその能力；（ｉｉ）針汚染の危険性のない経口送達；（ｉｉｉ）単回用量の投与の後の有効性；（ｉｖ）複数の粘膜部位での免疫応答の誘起；（ｖ）低い生産コスト；および（ｖｉ）組換え抗原の免疫系への送達のための担体としてのその使用の可能性；のおかげで不活化調製物よりも潜在的に優れている。
【００１２】
弱毒化変異体株での結果は必ずしも良好ではないので、実際に市販されている弱毒化サルモネラ生ワクチンは少ない。
【００１３】
例えば家禽はａｒｏ−またはｃＡＭＰ変異体株でワクチン接種されているが、多くのニワトリがワクチン接種後、短時間で死亡した。サルモネラによる感染はしばしば非常に早期に起こるので、非常に若いニワトリのワクチン接種が不可欠である。しかしながら、これらはこの年齢では、場合によるとその免疫系の未熟さのためにサルモネラに対する感受性が非常に高い。ワクチン接種されたニワトリの保護が弱いのに加えて、ワクチン株の長期の排出がしばしば観察された。
【００１４】
ｃｙａおよびｃｒｐ遺伝子における欠失を担持するＭｅｇａｎ（登録商標）Ｖａｃｌ株（米国特許第５３８９３６８号；米国特許第５８５５８７９号；米国特許第５８５５８８０）でのトリのワクチン接種は、抗原投与の７日後に毒性サルモネラ抗原投与株を単離できるトリの数の低下を招く。しかしながら、これによって完全な保護が提供されるわけではない（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｇａｎｈｅａｌｔｈ．ｃｏｍ／ｍｅｇａｎｖａｃ．ｈｔｍｌ）。
【００１５】
従って、改善された弱毒化サルモネラ生ワクチン株および一般的な獣医学的動物種に感染する細菌の改善された弱毒化生ワクチン株が依然必要とされている。
【００１６】
ｇｕａＢ変異体のサルモネラおよびその他の細菌の毒性に及ぼす影響に関する文献における情報はわずかである。
【００１７】
ＭｃＦａｒｌａｎｄおよびＳｔｏｃｋｅｒ（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ３：１２９−１４１（１９８７））はＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるネズミチフス菌およびサルモネラ・ダブリンのｇｕａＡおよびｇｕａＢ Ｔｎ１０挿入変異体の低減された毒性（ネズミチフス菌について２．５×１０７ｃｆｕ、サルモネラ・ダブリンについて１０４ｃｆｕ）に関して報告しているが、これらの著者は、栄養要求性株の増幅の結果である高い致死性を報告している。
【００１８】
Ｗａｎｇら（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６９：４７３４−４７４１（２００１））はヒトの腸チフスに対するワクチンでの前臨床試験に関して報告した。Ｗａｎｇらのワクチンはチフス菌のΔｇｕａＢＡ変異体株を含む。しかしながら、この弱毒化株はマウスにおける有意な残留毒性を示した。
【００１９】
国際特許出願第ＷＯ９９／５８１４６号および米国特許第６１９０６６９号は、外来抗原を送達するための生ベクターとして使用される、ΔｇｕａＢＡ変異を宿すチフス菌ワクチン株を開示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的は、弱毒化サルモネラ・エンテリカ株を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、サルモネラ症に対する弱毒化生ワクチンおよびそれに基づいた防御の方法を提供することである。
【００２２】
本発明のさらに別の目的は、生ベクターとして、および外来抗原を発現するＤＮＡ媒介ワクチンとして有用である弱毒化生株を提供することである。従って、かかる株は、多価ワクチンを含むワクチンの開発に非常に適切である。
【００２３】
本発明のさらに別の目的は、弱毒化生ワクチンにおける使用のためのサルモネラ・エンテリカ欠失変異体を得る方法を提供することである。
【００２４】
さらに、本発明のさらなる目的は、獣医学的動物種、特に家禽に感染する細菌の弱毒化株を調製するための同一材料および方法を提供することである。
【００２５】
一般的な目標は食品の安全性および動物の健康を改善することである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明の第１の態様は、グアニンヌクレオチドを新規形成できない弱毒化サルモネラ・エンテリカ変異体株に関し、ここでこの変異体株はｇｕａＢ遺伝子に欠失変異を含有する。
【００２７】
サルモネラ・エンテリカに関して本明細書にて実証されるような原理を、中間体としてグアニンヌクレオチドを使用できる任意の生物に適用できる。したがって、本発明の態様は、ｇｕａＢ遺伝子に欠失変異を含有する獣医学的動物種に感染する細菌の弱毒化変異体株に関する。本発明の文脈において「獣医学的動物種に感染する細菌」なる用語は、特に獣医学的動物種に対して病原性である細菌を指し、それはｇｕａＢ遺伝子における欠失変異により弱毒化され得る。獣医学的動物種に感染する細菌はグラム陰性細菌であってよい。好ましいのはサルモネラ、パスツレラ菌、大腸菌等のような家禽のグラム陰性細菌である。最も好ましいのはサルモネラ・エンテリカおよび（病原性）大腸菌である。「に対して病原性」とは、弱毒化されていない場合、獣医学的動物種に感染性疾患を引き起こすことができる細菌を意味する。
【００２８】
本発明の変異体株は機能的ＧｕａＢ遺伝子生成物を発現できない。換言すれば、ｇｕａＢ遺伝子機能が損なわれており、それにより栄養要求性弱毒化株が得られる。
【００２９】
ｇｕａＢ遺伝子に欠失変異を担持する本発明の変異体株は、最小Ａ培地に０．３ｍＭグアニン、キサンチン、グアノシンまたはキサントシンを補充しなければ、この培地で成長できない。
【００３０】
本発明は、特に弱毒化腸炎菌およびネズミチフス菌株を提供することを目的とする。
【００３１】
好ましくは、ｇｕａＢ遺伝子における欠失変異を親株腸炎菌ファージ４型株７６Ｓａ８８または親株ネズミチフス菌１４９１Ｓ９６に導入する。
【００３２】
本発明により得られる弱毒化サルモネラ・エンテリカ株の１つは、寄託番号ＬＭＧ Ｐ−２１６４１を有する腸炎菌株ＳＭ６９である。別の例は、寄託番号ＬＭＧ Ｐ−２１６４６を有するネズミチフス菌ＳＭ８６である。
【００３３】
本発明の弱毒化変異体株は多価またはマルチバレントワクチンを含む弱毒化生ワクチンにおける使用に非常に適している。本発明の弱毒化変異体株は、外来抗原をコードし、発現でき、生ベクターとして、および／またはＤＮＡ媒介ワクチンとして用いられるようなものでよい。
【００３４】
本発明の第２の態様は：
ｇｕａＢ遺伝子における欠失変異のためにグアニンヌクレオチドの新規形成ができない、医薬的に有効な量または免疫量の本発明による変異体株；および
医薬的に許容される担体または希釈剤；
を含む細菌感染（例えばサルモネラにより引き起こされるサルモネラ症）に対して獣医学的動物種を免疫するための医薬用組成物またはワクチンに関する。好ましい組成物は本発明によるサルモネラ・エンテリカ変異体株を含むものである。
【００３５】
本発明の弱毒化株は、外来抗原をコードするＤＮＡを真核細胞に移入できる。この外来抗原は、本発明の弱毒化変異体株により含まれるプラスミドによりコードされ、そこから発現され得る。
【００３６】
一般的に約１０２ｃｆｕ〜約１０１０ｃｆｕ、好ましくは約１０５ｃｆｕ〜約１０１０ｃｆｕが投与される（医薬的に有効な量または免疫量の例）。免疫用量は投与の経路に従って異なる。当業者は、非経口的に投与されるワクチンのための有効用量が、飲料水等を介して投与される類似のワクチンよりも少ない可能性があることを見出すことができる。
【００３７】
本発明の弱毒化株、およびそれを含む医薬組成物またはワクチンは、動物または獣医学的動物種を細菌感染（例えばサルモネラ症）および場合によってはその他の疾患（マルチバレントワクチンの場合）に対して免疫するのに非常に適している。
【００３８】
したがって、本発明のさらなる態様は、動物、好ましくは獣医学的動物種、さらに好ましくはニワトリのような家禽を、細菌による感染（例えばサルモネラにより引き起こされるサルモネラ症）に対して免疫する方法に関し、この方法は：
免疫量の本発明の弱毒化変異体株および／またはそれを含むワクチンを、それを必要とする動物または獣医学的動物種に投与し、それにより次いで動物または獣医学的動物種において保護免疫応答を惹起する工程；
を含む。
【００３９】
サルモネラ症に対して免疫される獣医学的動物種の例：ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ウズラ、ホロホロチョウ、ブタ、ヒツジ、子牛、畜牛等のような家禽、小型または大型家畜。
【００４０】
一般的に適切な用量が、好ましくは経口、経鼻または非経口経路によりこれらの動物に投与される。
【００４１】
本発明の最後の態様は、医薬品として使用するための（例えばワクチンにおいて使用するための）本発明の変異体株に関する。本発明のなお別の態様は、サルモネラ症のような病原体（感染細菌）により引き起こされる疾患の防御（および／または処置）のための、ワクチンのような医薬品の調製のための本発明の弱毒化変異体株の使用に関する。処置される動物または獣医学的動物種の例および推奨される用量は上述で提示されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
驚くべきことに、ｇｕａＢ遺伝子における欠失変異は、毒性が有意に低下し、家畜動物における免疫応答を誘起することができる弱毒化サルモネラ・エンテリカ株を導くことができることが見出された。かかる欠失は、中間体としてグアニンヌクレオチドを使用できる任意の生物を弱毒化する。
【００４３】
「遺伝子」なる用語は、本明細書にて使用される際には、コード配列ならびにプロモーターおよび終止シグナルのようなその調節配列を指す。
【００４４】
本発明による欠失変異体株は、プリン代謝経路酵素ＩＭＰデヒドロゲナーゼ（ｇｕａＢによりコードされる）が不活化されているものである。
【００４５】
ｇｕａＢ遺伝子機能が損なわれ、影響を受ける（複数の）遺伝子のヌル機能（機能的な遺伝子生成物が形成されない）を導く欠失により、かかる不活化を得ることができる。当業者にはかかる変異体株を得る方法が既知であり、簡単な試験によりｇｕａＢ遺伝子機能が損なわれているかどうかを見分けることができる。機能的ｇｕａＢ遺伝子生成物を発現できない変異体株は、最小Ａ培地に（例えば０．３ｍＭの）グアニン、キサンチン、グアノシンまたはキサントシンを補充しなければ、この培地で成長できない。
【００４６】
本発明は中でも、弱毒化腸炎菌およびネズミチフス菌株が最も一般的なサルモネラ・エンテリカ血清型であるので、これらを提供することを目的とする。
【００４７】
本発明は弱毒化株を提供する。本発明は、とりわけサルモネラ症に対する弱毒化生ワクチンとして、外来抗原を発現する生ベクターとして、および／またはＤＮＡ媒介ワクチンとして使用するための、中でも弱毒化サルモネラ・エンテリカ株を提供する。本明細書にて使用される際には「外来抗原」とはサルモネラに対して外来性である抗原を意味する。
【００４８】
生ベクターワクチンは、「担体ワクチン」および「生抗原送達系」とも称され、ワクチン学の刺激的かつ多目的な分野を含む（Ｌｅｖｉｎｅら、Ｍｉｃｒｏｅｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９：２３−３２（１９９０））。この研究法では、ウイルス性または細菌性生ワクチンは、それが別の微生物の保護性外来抗原を発現し、そしてこれらの抗原を免疫系に送達し、それにより保護免疫応答を刺激するように改変されている。公表されている細菌性生ベクターには、とりわけ弱毒化サルモネラが含まれる。
【００４９】
本発明の目的は、生ワクチン、場合によって多価またはマルチバレント生ワクチンにおいて使用するための弱毒化サルモネラ・エンテリカ株のような弱毒化株を提供することである。
【００５０】
したがって本発明の目的の１つは：
グアニンヌクレオチドの新規形成ができない、医薬的に有効な量または免疫量の本発明の変異体株（例えばサルモネラ・エンテリカ変異体株）、ここでこの変異体株はｇｕａＢ遺伝子において欠失変異を含有する；および
医薬的に許容される担体または希釈剤；
を含む、例えばサルモネラ症に対するワクチンを提供することである。
【００５１】
本発明の別の目的は：
グアニンヌクレオチドの新規形成ができない、医薬的に有効な量または免疫量の本発明の変異体株（例えばサルモネラ・エンテリカ変異体株）、ここでこの変異体株はｇｕａＢ遺伝子において欠失変異を含有し、変異体株外来抗原をコードし、発現する；および
医薬的に許容される担体または希釈剤；
を含む、生ベクターワクチンを提供することである。
【００５２】
生ベクター（サルモネラ・エンテリカ）で用いられる特定の外来抗原は本発明にとって重要ではない。
【００５３】
本発明のさらに別の目的は：
グアニンヌクレオチドの新規形成ができない、医薬的に有効な量または免疫量の本発明の変異体株（例えばサルモネラ・エンテリカ変異体株）、ここでこの変異体株はｇｕａＢ遺伝子において欠失変異を含有し、変異体株外来抗原をコードし、真核細胞において発現するプラスミドを含有する；および
医薬的に許容される担体または希釈剤；
を含むＤＮＡ媒介ワクチンを提供することである。
【００５４】
ＤＮＡ媒介ワクチンの構築および使用に関する詳細は米国特許第５８７７１５９号（参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。また、ＤＮＡ媒介ワクチンに用いられる特定の外来抗原は本発明にとって重要ではない。
【００５５】
例えばサルモネラ・エンテリカにおいて（生ベクターワクチンで真核細胞性プロモーターを用いて）または例えばサルモネラ・エンテリカにより浸潤された細胞において（ＤＮＡ媒介ワクチンで真核細胞性プロモーターを用いて）外来抗原を発現するかどうかの決定は、動物実験もしくは臨床試験においてその特定の抗原に関するどのワクチン構築物により最良の免疫応答が得られるか、および／または抗原のグリコシル化がその保護免疫原性に必須であるかどうか、および／または抗原の正確な三次元立体構造が発現の１つの形態で他の形態よりも良好に達成されるかどうかに基づき得る（米国特許第５７８３１９６号）。
【００５６】
本発明のワクチンでは、投与される本発明の変異体株の医薬的に有効な量または免疫量は対象の年齢、体重および性別に依存して異なる。本明細書にて使用される際には「免疫量」とは、実際に医薬用組成物／ワクチンを投与される動物において免疫応答を誘起することができる量を意味する。惹起される免疫応答は体液性、粘膜、局所および／または細胞性免疫応答であることができる。
【００５７】
特定の医薬的に許容される担体または希釈剤は本発明にとっては重要ではなく、そして当分野で慣用技術である。希釈剤の例には：スクロースを含有するクエン酸緩衝剤（ｐＨ７．０）、重炭酸塩緩衝剤（ｐＨ７．０）単独またはアスコルビン酸、ラクトースおよび場合によってはアスパルテームを含有する重炭酸塩緩衝剤（ｐＨ７．０）のような胃で胃酸に対して緩衝するための緩衝剤が挙げられる。担体の例には：例えば脱脂粉乳に見出されるようなタンパク質；糖；例えばスクロース；またはポリビニルピロリドンが挙げられる。
【００５８】
本発明による欠失変異体は、標準的な相同組換えにより創成され、それによりｇｕａＢ遺伝子の一部、例えばｇｕａＢコード配列の一部は、第１工程では、抵抗性遺伝子およびＦＲＴ部位をフランキングすることにより置き換えられる。
【００５９】
好ましくは、第２工程では、前記抵抗性遺伝子は２つのＦＲＴ部位の間の組換えにより除去される。ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（２０００）に従って、１つのＦＲＴ部位ならびにプライミング部位Ｐ１およびＰ２は組換えの分子メカニズムにより残存し、抗生物質抵抗性遺伝子を除去する（例えば図４参照）。
【００６０】
本発明の特定の実施例は、例えば、変異したｇｕａＢ遺伝子または配列番号１２を含むコード配列を含む、腸炎菌のｇｕａＢ欠失変異体に関する。
【００６１】
図面の簡単な記述
図１は、グアノシン一リン酸の生合成経路の概略図である（ＺａｌｋｉｎおよびＮｙｇａａｒｄ，１９９６「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９９６）Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ編 ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，第１巻、３４章：５６１−５７９から改作した）。ＡＩＣＡＲ：５’−ホスホリボシル−４−カルボキサミド−５−アミノイミダゾール；ＡＴＰ：アデノシン三リン酸；Ｇ：グアニン；ＧＭＰ：グアノシン一リン酸；ＧＲ：グアノシン；Ｈｘ：ヒポキサンチン；ＨｘＲ：ヒポキサンチンリボシド（イノシン）；ＩＭＰ：イノシン一リン酸；Ｘ：キサンチン、ＸＭＰ：キサントシン一リン酸；ｇｕａＡ：ＧＭＰシンテターゼ、ｇｕａＢ：ＩＭＰデヒドロゲナーゼ；ｇｕａＣ：ＧＭＰリダクターゼ。
【００６２】
図２は、腸炎菌ゲノムのコンティグ１２９４を表す（配列番号：１０）。ｇｕａＢ遺伝子のＡＴＧ開始コドンおよびＴＧＡ終止コドンは太字である。
【００６３】
図３は、ｐＵＣ１８にクローン化された腸炎菌のΔｇｕａＢフラグメントの配列を表す（配列番号：１１）。使用されたプライマーを水平矢印により示す。プライマーＧｕａＢ６−ＧｕａＢ７で作成されたフラグメントをｐＵＣ１８にクローン化した。ｇｕａＢ遺伝子のＡＴＧ開始およびＴＧＡ終止コドンならびにＣＣＣＧＧＧ ＳｍａＩ制限部位を太字で示す。
【００６４】
図４は、プライマーＧｕａＢ１０を用いて配列決定後に得られたｇｕａＢ欠失を含む、腸炎菌ＰＣＲフラグメントのヌクレオチド配列を表す（配列番号：１２）。変異体ＳＭ２０の全ゲノムＤＮＡを用いてプライマーＧｕａＢ６−ＧｕａＢ７でＰＣＲフラグメントを増幅した。残存するＦＲＴ部位を太字イタリックで、そしてＰ１およびＰ２プライマーを矢印により示す（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ、ＰＮＡＳ ９７：６６４０−６６４５（２０００））。ｇｕａＢ遺伝子のＡＴＧ開始およびＴＧＡ終止コドンを太字で示す。
【００６５】
図５は、ネズミチフス菌ＬＴ２のｇｕａＢ遺伝子、完全ゲノムのセクション２２０の１１７を示す（配列番号：１３）。ｇｕａＢ遺伝子のＡＴＧ開始およびＴＧＡ終止コドンを太字で示す。
【００６６】
図６−７は、ＳＭ６９およびＳＭ８６の各々に関する寄託受領を表す。
【００６７】
以下の実施例および実施形態において添付の図面を参照して本発明をさらに詳細に記載する。特定の実施形態および実施例は特許請求されるように本発明の範囲がいかなるようにも限定されないと意図される。
【実施例】
【００６８】
実施例１：栄養要求性変異はｇｕａＢ遺伝子に影響を及ぼす
挿入変異誘発により野生型腸炎菌の栄養要求性挿入変異体が得られた。０．３ｍＭグアニン、キサンチン、グアノシンまたはキサントシンを補充した場合のみ、変異体株は最小Ａ培地で成長できた。
【００６９】
これらのデータにより、株の栄養要求性変異は、酵素ＩＭＰデヒドロゲナーゼをコードするｇｕａＢ遺伝子に影響を及ぼすことが強く示唆される（ＥＣ１．１．１．２０５）。図１で示されるように、この酵素はイノシン−５’−一リン酸（ＩＭＰ）をキサントシン一リン酸（ＸＭＰ）に変換する。
【００７０】
挿入変異体は復帰することがあり、それにより株の病原性を復活させることがある。これは弱毒化生ワクチンにおけるその適用性を限定する。その態様では欠失変異体が好ましい。したがって腸炎菌およびネズミチフス菌のｇｕａＢ欠失変異体が創成され、そして試験された。双方の血清型のｇｕａＢ遺伝子を図２および５に示す。
【００７１】
実施例２：ｇｕａＢ欠失変異体
ｇｕａＢ欠失変異体の構築
ｇｕａＢ欠失変異体は、大腸菌Ｋ１２のゲノムにおいて欠失変異体を作成するための方法（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ、ＰＮＡＳ ９７：６６４０−６６４５（２０００）、参照により本明細書に組み込まれる）に従って作成された。
【００７２】
この方法はバクテリオファージλレッドリコンビナーゼ系により媒介される、ＰＣＲにより作成された直鎖状ＤＮＡフラグメントの相同組換えに頼る。
【００７３】
これによって、ｇｕａＢ配列が抗生物質抵抗性遺伝子により置換される。この抵抗性遺伝子はＦＲＴ部位（ＦＬＰ認識標的部位）によりフランキングされ、そしてＦＬＰリコンビナーゼにより媒介される部位特異的組換えによりゲノムから切除できる。
【００７４】
重複ＰＣＲ（Ｈｏら、Ｇｅｎｅ ７７：５１−５９（１９８９））を、直鎖状フラグメントを構築するために適用した。原理はｇｕａＢ遺伝子の２つのプライマーセット、１つの上流対（ＧｕａＢ３−ＧｕａＢ４；ＧｕａＢ３：５’ ＧＧＣＴＧＣＧＡＴＴ ＧＧＣＧＡＧＧＴＡＧ ＴＡ ３’，配列番号２；ＧｕａＢ４：５’ ＧＧＴＧＡＴＣＣＣＧ ＧＧＣＧＴＣＡＡＡＣ ＧＴＣＡＧＧＧＣＴＴ ＣＴＴＴＡ ３’，配列番号３）および１つの下流対（ＧｕａＢ５−ＧｕａＢ２；ＧｕａＢ５：５’ ＴＴＧＡＣＧＣＣＣＧ ＧＧＡＴＣＡＣＣＡＡ ＡＧＡＧＴＣＣＣＣＧ ＡＡＣＴＡ ３’，配列番号４；ＧｕａＢ２：５’ ＣＧＴＴＣＡＧＧＣＧ ＣＡＡＣＡＧＧＣＣＧ ＴＴＧＴ ３’，配列番号１）の使用に頼る。
【００７５】
双方のセットは、部分的に相補的であり、そしてそれにＳｍａＩ制限部位を付加したプライマー（ＧｕａＢ４、ＧｕａＢ５）を含有する。
【００７６】
得られた相補的配列のアニーリングおよび鎖伸長の後、外向きプライマー（ＧｕａＢ６−ＧｕａＢ７；ＧｕａＢ６：５’ ＧＣＡＡＣＡＡＣＴＣ ＣＴＧＣＴＧＧＴＴＡ ３’，配列番号５；ＧｕａＢ７：５’ ＡＧＡＣＣＧＡＧＧＡ ＴＣＡＣＴＴＴＡＴＣ ３’，配列番号６）でのＰＣＲにより、ＧｕａＢコード配列の８６１塩基対内部セグメントを置き換える６塩基対ＳｍａＩ部位を有するフラグメントを作成した。このΔｇｕａＢフラグメントをベクターｐＵＣ１８にクローン化した（図３参照）。
【００７７】
プライマーＰ１（５’ ＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧ ＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ ３’，配列番号８）およびＰ２（５’ ＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡ ＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧ ３’，配列番号９）（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（２０００））ならびにプラスミドｐＫＤ３ ＤＮＡ（ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（２０００））を鋳型として使用して、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子（ｃａｔ）をそのフランキングＦＲＴ配列と共に増幅した。
【００７８】
このＰＣＲフラグメントを、クローン化されたΔｇｕａＢフラグメントのＳｍａＩ部位にライゲートした。ネステッドプライマー（ＧｕａＢ６−ＧｕａＢ７）を使用して望ましいフラグメントを作成した。
【００７９】
バクテリオファージラムダレッドリコンビナーゼ系をコードする温度感受性複製プラスミドｐＫＤ４６を宿す、腸炎菌ファージ４型株７６Ｓａ８８（Ｔｈｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ａｎｄ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｇｒｏｅｓｅｌｅｎｂｅｒｇ ９９，Ｂ−１１８０ Ｕｋｋｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍから入手したシチメンチョウからの臨床分離株）に、得られたＰＣＲフラグメントをエレクトロポレーションした。
【００８０】
最小Ａ培地および０．３ｍＭグアニンを補充した最小Ａ培地でクロラムフェニコール抵抗性形質転換体を試験した。以下のプライマーの組み合わせ：ＧｕａＢ６−ＧｕａＢ７、ＧｕａＢ６−Ｐ２、ＧｕａＢ７−Ｐ１およびＰ１−Ｐ２を使用するＰＣＲによりΔｇｕａＢ：：ｃａｔＦＲＴ変異体を確認した。
【００８１】
腸炎菌ΔｇｕａＢ：：ｃａｔＦＲＴ変異体（ＳＭ１２）を、エレクトロポレーションによって温度感受性複製プラスミドｐＣＰ２０で形質転換した。プラスミドｐＣＰ２０はＦＬＰリコンビナーゼをコードし、それはｃａｔ遺伝子を除去するためにＦＲＴ部位を認識する。得られた株をＳＭ２０と称した。
【００８２】
変異体ＳＭ２０の全ゲノムＤＮＡおよびプライマーの組み合わせＧｕａＢ６−ＧｕａＢ７を使用して、欠失が位置するＰＣＲフラグメントが得られた（図４参照）。
【００８３】
プライマーＧｕａＢ１０（５’ ＡＧＧＡＡＧＴＴＴＧ ＡＧＡＧＧＡＴＡＡ ３’，配列番号７）を使用して、このフラグメントの配列決定によりΔｇｕａＢ変異を確認した。
【００８４】
前記した全てのプライマーの配列を表１に示す。
【００８５】
レッドリコンビナーゼ系の発現により引き起こされる、可能な追加的な変異体の存在を回避するために、同質遺伝子株を構築した。
【００８６】
変異体ＳＭ１２のΔｇｕａＢ：：ｃａｔＦＲＴ変異をＳＭ１２のバクテリオファージＰ２２ ＨＴ ｉｎｔ−（Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｂｏｔｓｔｅｉｎ Ｄ．およびＲｏｔｈ，Ｊ．Ｒ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａ ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）によって野生型腸炎菌７６Ｓａ８８に形質導入した。プラスミドｐＣＰ２０を使用してｃａｔ遺伝子を除去した。得られた株はＳＭ６９と称された（寄託番号ＬＭＧ Ｐ−２１６４１）。
【００８７】
同一の手順および同一のプライマーを使用してネズミチフス菌株１４９１Ｓ９６のΔｇｕａＢ変異体を構築した。得られたネズミチフス菌ΔｇｕａＢ：：ｃａｔＦＲＴ株およびネズミチフス菌ΔｇｕａＢ株を、それぞれＳＭ９およびＳＭ１９と称した。ＳＭ８６（寄託番号ＬＭＧ Ｐ−２１６４６を有する）は、株ＳＭ９からのバクテリオファージＰ２２ ＨＴ ｉｎｔ−ライゼートによる形質導入の後、およびプラスミドｐＣＰ２０を使用するｃａｔ遺伝子の切除の後に、それらから得られた同質遺伝子株である。
【００８８】
ΔｇｕａＢ変異体ＳＭ１９、ＳＭ２０、ＳＭ８６およびＳＭ６９はバクテリオファージＰ２２に感受性がある。これによりインタクトなリポ多糖類（ＬＰＳ）の存在が判明する。
【００８９】
マウスにおけるｇｕａＢ欠失変異体ＳＭ２０を用いる毒性および保護試験
独立した２つの実験で６−８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの経口感染によりマウスにおける変異体ＳＭ２０の毒性を試験した。これらを前記したように実施した。野生型株腸炎菌７６Ｓａ８８を陽性対照として平行して試験した。腸炎菌７６Ｓａ８８ ΔａｒｏＡ変異体ＳＭ５０をワクチン対照として実験に含めた。この変異体は完全ａｒｏＡコード配列の正確な欠失を担持し、そしてＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（２０００）の方法により構築された。
【００９０】
完全なデータを表２および３に示す。これらの結果により、マウスにおいてΔｇｕａＢ変異体ＳＭ２０が強く弱毒化されるが、この高用量で投与された場合に依然いくらかの残留病原性を示すことが実証される。高用量の対応する病原性野生型腸炎菌株７６Ｓａ８８による感染に対して、この変異体での経口免疫が保護免疫を誘起する。その保護は腸炎菌ΔａｒｏＡ変異体ＳＭ５０により付与される保護と少なくとも同等である。
【００９１】
マウスにおける同質遺伝子ｇｕａＢ欠失変異体ＳＭ６９およびＳＭ８６での毒性および保護試験
マウスにおける変異体ＳＭ６９およびＳＭ８６の毒性を６−８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの経口感染により試験した。これらを前記したように実施した。野生型株腸炎菌７６Ｓａ８８およびネズミチフス菌１４９１Ｓ９６を陽性対照として平行して試験した。
【００９２】
完全なデータを表４−７に示す。これらの結果により、マウスにおいてΔｇｕａＢ変異体ＳＭ６９およびＳＭ８６が強く弱毒化されるが、この高用量で投与された場合に、なお依然いくらかの残留病原性を示すことが実証される。高用量の対応する病原性野生株による感染に対して、変異体での経口免疫が保護免疫を誘起する。
【００９３】
気管内および経口経管経路による１日齢のニワトリにおける腸炎菌ΔｇｕａＢ欠失変異体ＳＭ６９の安全性評価
この研究の目的は、１日齢のニワトリにおける腸炎菌ΔｇｕａＢ変異体株ＳＭ６９マスターシードの安全性を評価することであった。安全性の決定のための一次的なパラメータとして死亡率を用いた。
【００９４】
１日齢のニワトリの脚にバンドを付け、そして４つの処置群の各々に無作為に配した（第１群：ＳＭ６９−ＩＴ、第２群：ＳＭ６９−ＯＧ、第３群：ＰＢＳ−ＩＴおよび第４群：ＰＢＳ−ＯＧ）。マスターシード接種の後、第１および第２群からのトリを１つの隔離飼育器に、そして第３および第４群のトリを別の隔離飼育器に配した。
【００９５】
第１および第２群のニワトリに各々気管内（ＩＴ）経路または経口経管（ＯＧ）経路により、ＳＭ６９マスターシードを、トリあたりの実際の力価１．２８×１０８ｃｆｕ／０．２ｍｌで接種した。第３および第４群のニワトリに各々気管内経路または経口経管経路により、トリあたり０．２ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を投与した。
【００９６】
ＳＭ６９またはＰＢＳの接種の後、ニワトリ死亡率を接種後３８日まで毎日観察した。表８に全４群に関する死亡率の結果をまとめる。第１群では接種中に接種外傷のために１羽のトリが死亡した。接種後（ＤＰＩ）２日に２羽のトリが死亡した。３日目から１３日目までに３羽のトリが死亡した（各々３、５および１３ＤＰＩ）。従って、第１群では全部で６羽のトリが死亡した。第２群では全部で２羽のトリが死亡した。１羽は接種中に接種外傷のために死亡し、そして１羽は接種後５日に死亡した。ＰＢＳ処置群では気管内経路でも経口経管経路でも死亡したトリはなかった。
【００９７】
この研究により、腸炎菌ΔｇｕａＢ変異体株ＳＭ６９は１日齢のトリあたり１．２８×１０８ｃｆｕで気管内経路または経口経管経路により投与された場合に安全ではないことが示される。
【００９８】
気管内経路および経口経管経路による２週齢のニワトリにおける腸炎菌ΔｇｕａＢ欠失変異体ＳＭ６９の安全性評価
次いで腸炎菌ΔｇｕａＢ変異体株ＳＭ６９の安全性を２週齢の特定病原体未感染（ＳＰＦ）のニワトリにおいて気管内経路または経口経管経路により評価した。安全性の決定のために死亡率を一次基準として、および体重を二次基準として用いた。
【００９９】
２週齢のトリの脚にバンドを付け、そして４つの処置群の各々に無作為に配した：ＳＭ６９−ＩＴ、ＳＭ６９−ＯＧ、Ｐｏｕｌｖａｃ ＳＴ−ＩＴおよびＰＢＳ−ＩＴ。第１群の１０羽のトリに気管内経路によりＳＭ６９を接種し；第２群の１０羽のトリに経口経管によりＳＭ６９を接種し；第３群の１０羽のトリに気管内経路によりネズミチフス菌ＡｒｏＡ−ワクチン（Ｐｏｕｌｖａｃ（登録商標）ＳＴ）を接種し；そして第４群の５羽のトリに気管内経路によりＰＢＳを接種した。
【０１００】
第１および第２群のニワトリに各々気管内経路または経口経管経路により、ＳＭ６９マスターシードをトリあたりの実際の力価２．３０４×１０８ｃｆｕ／０．２ｍｌで接種した。第３群のニワトリに気管内経路により、Ｐｏｕｌｖａｃ（登録商標）ＳＴをトリあたり２．１９×１０８ｃｆｕ／０．２ｍｌで投与した。第４群のニワトリに気管内経路によりトリあたり０．２ｍｌのＰＢＳを投与した。
【０１０１】
接種後、処置第１および第２群からのトリを１つの隔離飼育器に、そして第３および第４群のトリを別の隔離飼育器に配した。
【０１０２】
接種に続いて、接種後２１日まで死亡率を毎日観察した。全てのトリの体重もまた研究期間（２１日間）の最後に記録した。Ｐｏｕｌｖａｃ（登録商標）ＳＴおよびＰＢＳを気管内手順の対照として使用した。
【０１０３】
２１日の観察期間中にＳＭ６９気管内処置群（第１群）の１羽のトリが卵黄嚢感染から死亡した。死亡率はＳＭ６９に関連せず、それはＳＭ６９株が気管内経路および経口経管経路により、試験された力価、トリあたり２．３０４×１０８ｃｆｕで安全であることを示している。予想されたように、トリあたり２．１９×１０８ｃｆｕの力価でＰｏｕｌｖａｃ（登録商標）ＳＴ処置されたトリ、またはＰＢＳ処置されたトリのいずれでも死亡は観察されず、それはこの研究が正当であったことを示している（表９）。
【０１０４】
従属変数として体重、および独立変数として含められた処置を用いる分散（ＡＮＯＶＡ）モデルの分析で体重を群間で比較した。多重比較のためにチューキー検定を使用して群比較を行った。有意性のレベルをｐ＜０．０５に設定した、対照ニワトリ（ＰＢＳ対照群）は健常のままであり、そして研究の間中臨床病徴または死亡はなかったので、研究は正当であると考えられた。
【０１０５】
気管内接種または経口経管接種によるＳＭ６９、Ｐｏｕｌｖａｃ（登録商標）ＳＴまたはＰＢＳを投与されたニワトリにおける最終体重に有意差はなかった（表５）。１日齢の各群のトリのベースラインは確立されなかったが、トリは無作為に４つの処置群の各々に配されたので、４群間の初期体重に有意差があったとは考えられなかった。
【０１０６】
死亡率はＳＭ６９の接種に帰因しなかったので、腸炎菌ΔｇｕａＢ変異体株ＳＭ６９は、気管内接種経路または経口経管接種経路のいずれかにより、２週齢のトリあたり２．３０４×１０８ｃｆｕ／０．２ｍｌ用量の試験された力価で投与された場合、安全であると結論づけることができる。ＳＭ６９接種は、本実施例で評価された第二の安全性パラメータであるトリの最終体重には影響しなかった。
【０１０７】
以下の微生物に関してＢＣＣＭ／ＬＭＧカルチャーコレクション、（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ ｖｏｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ、Ｋ．Ｌ．Ｌｅｄｅｇａｎｃｋｓｔｒａａｔ３５、Ｂ−９０００、ゲント（ベルギー））でブダペスト条約に従って寄託を行っている：寄託番号ＬＭＧ Ｐ−２１６４１の下で腸炎菌ＳＭ６９（寄託日：２００２年８月９日）および寄託番号ＬＭＧ Ｐ−２１６４６の下でネズミチフス菌ＳＭ８６（寄託日：２００２年８月２８日）。寄託はＰｒｏｆ．Ｊ．−Ｐ．Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓ（旧住所：Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｂｒｕｓｓｅｌ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ Ｇｅｎｅｔｉｓｃｈｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｅ，Ｐａａｒｄｅｎｓｔｒａａｔ ６５，Ｂ−１６４０ Ｓｉｎｔ−Ｇｅｎｅｓｉｕｓ−Ｒｈｏｄｅ、現住所：Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｂｒｕｓｓｅｌ，Ｏｎｄｅｒｚｏｅｋｓｇｒｏｅｐ Ｇｅｎｅｔｉｓｃｈｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｅ，Ｐｌｅｉｎｌａａｎ ２，Ｂ−１０５０ ブリュッセル、ベルギー）の名の下で行われた。
【０１０８】
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】グアノシン一リン酸の生合成経路の概略図である。
【図２】腸炎菌ゲノムのコンティグ１２９４を表す（配列番号：１０）。
【図３】ｐＵＣ１８にクローン化された腸炎菌のΔｇｕａＢフラグメントの配列を表す（配列番号：１１）。
【図４】プライマーＧｕａＢ１０を用いて配列決定後に得られたｇｕａＢ欠失を含む、腸炎菌ＰＣＲフラグメントのヌクレオチド配列を表す（配列番号：１２）。
【図５】ネズミチフス菌ＬＴ２のｇｕａＢ遺伝子、完全ゲノムのセクション２２０の１１７を示す（配列番号：１３）。
【図６−１】ＳＭ６９に関する寄託受領を表す。
【図６−２】ＳＭ６９に関する寄託受領を表す。
【図６−３】ＳＭ６９に関する寄託受領を表す。
【図６−４】ＳＭ６９に関する寄託受領を表す。
【図７−１】ＳＭ８６に関する寄託受領を表す。
【図７−２】ＳＭ８６に関する寄託受領を表す。
【図７−３】ＳＭ８６に関する寄託受領を表す。
【図７−４】ＳＭ８６に関する寄託受領を表す。
【配列表フリーテキスト】
【０１１０】
配列番号１は、ＧｕａＢ２プライマーの配列である。
配列番号２は、ＧｕａＢ３プライマーの配列である。
配列番号３は、ＧｕａＢ４プライマーの配列である。
配列番号４は、ＧｕａＢ５プライマーの配列である。
配列番号５は、ＧｕａＢ６プライマーの配列である。
配列番号６は、ＧｕａＢ７プライマーの配列である。
配列番号７は、ＧｕａＢ１０プライマーの配列である。
配列番号８は、Ｐ１プライマーの配列である。
配列番号９は、Ｐ２プライマーの配列である。
配列番号１０は、腸炎菌ゲノムのコンティグ１２９４の配列である。
配列番号１１は、ｐＵＣ１８にクローン化された腸炎菌のΔｇｕａＢフラグメントの配列である。
配列番号１２は、プライマーＧｕａＢ１０を用いて得られたｇｕａＢ欠失を含む、腸炎菌ＰＣＲフラグメントのヌクレオチド配列である。
配列番号１３は、ネズミチフス菌ＬＴ２のｇｕａＢ遺伝子、完全ゲノムのセクション２２０の１１７の配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グアニンヌクレオチドを新規形成できない、獣医学的動物種に感染する細菌の弱毒化変異体株であって、前記変異体はｇｕａＢ遺伝子に欠失変異を含有する、弱毒化変異体株。
【請求項２】
獣医学的動物種は家禽である、請求項１に記載の変異体株。
【請求項３】
サルモネラ・エンテリカ株または（病原性）大腸菌株である、請求項１または２に記載の変異体株。
【請求項４】
前記変異体株は、外来抗原をコードし、かつ発現する、請求項１〜３のいずれかに記載の変異体株。
【請求項５】
腸炎菌株またはネズミチフス菌株である、請求項１〜４のいずれかに記載の変異体株。
【請求項６】
前記変異は、親株腸炎菌ファージ４型株７６Ｓａ８８に導入される、請求項１〜５のいずれかに記載の変異体株。
【請求項７】
寄託番号ＬＭＧ Ｐ−２１６４１を有する腸炎菌株ＳＭ６９である、請求項６に記載の変異体株。
【請求項８】
前記変異は、親株ネズミチフス菌１４９１Ｓ９６に導入される、請求項１〜７のいずれかに記載の変異体株。
【請求項９】
寄託番号ＬＭＧ Ｐ−２１６４６を有するネズミチフス菌株ＳＭ８６である、請求項８に記載の変異体株。
【請求項１０】
ｇｕａＢ遺伝子における欠失変異のためにグアニンヌクレオチドを新規形成できない、医薬的に有効な量または免疫量の請求項１〜９のいずれかに記載の変異体株；および医薬的に許容される担体または希釈剤を含む、細菌感染に対して獣医学的動物種を免疫するためのワクチン。
【請求項１１】
前記変異体株は、外来抗原をコードし、かつ発現する、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記変異体株は、真核細胞において外来遺伝子をコードしかつ発現するプラスミドを含む、請求項１０または１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
免疫量の請求項１〜９のいずれかに記載の変異体株および／または請求項１０〜１２のいずれかに記載のワクチンを、それを必要とする獣医学的動物種に投与する工程
を含む、細菌感染に対して獣医学的動物種を免疫する方法。
【請求項１４】
獣医学的動物種は家禽である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
変異体株および／またはワクチンは、経口、経鼻または非経口経路により投与される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
医薬品としての使用のための請求項１〜９のいずれかに記載の弱毒化変異体株。
【請求項１７】
獣医学的動物種、好ましくは家禽における細菌による感染の防御および／または処置のための医薬品またはワクチンの調製のための、請求項１〜９のいずれかに記載の弱毒化変異体株の使用。
【請求項１】
グアニンヌクレオチドを新規形成できない、獣医学的動物種に感染する細菌の弱毒化変異体株であって、前記変異体はｇｕａＢ遺伝子に欠失変異を含有する、弱毒化変異体株。
【請求項２】
獣医学的動物種は家禽である、請求項１に記載の変異体株。
【請求項３】
サルモネラ・エンテリカ株または（病原性）大腸菌株である、請求項１または２に記載の変異体株。
【請求項４】
前記変異体株は、外来抗原をコードし、かつ発現する、請求項１〜３のいずれかに記載の変異体株。
【請求項５】
腸炎菌株またはネズミチフス菌株である、請求項１〜４のいずれかに記載の変異体株。
【請求項６】
前記変異は、親株腸炎菌ファージ４型株７６Ｓａ８８に導入される、請求項１〜５のいずれかに記載の変異体株。
【請求項７】
寄託番号ＬＭＧ Ｐ−２１６４１を有する腸炎菌株ＳＭ６９である、請求項６に記載の変異体株。
【請求項８】
前記変異は、親株ネズミチフス菌１４９１Ｓ９６に導入される、請求項１〜７のいずれかに記載の変異体株。
【請求項９】
寄託番号ＬＭＧ Ｐ−２１６４６を有するネズミチフス菌株ＳＭ８６である、請求項８に記載の変異体株。
【請求項１０】
ｇｕａＢ遺伝子における欠失変異のためにグアニンヌクレオチドを新規形成できない、医薬的に有効な量または免疫量の請求項１〜９のいずれかに記載の変異体株；および医薬的に許容される担体または希釈剤を含む、細菌感染に対して獣医学的動物種を免疫するためのワクチン。
【請求項１１】
前記変異体株は、外来抗原をコードし、かつ発現する、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記変異体株は、真核細胞において外来遺伝子をコードしかつ発現するプラスミドを含む、請求項１０または１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
免疫量の請求項１〜９のいずれかに記載の変異体株および／または請求項１０〜１２のいずれかに記載のワクチンを、それを必要とする獣医学的動物種に投与する工程
を含む、細菌感染に対して獣医学的動物種を免疫する方法。
【請求項１４】
獣医学的動物種は家禽である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
変異体株および／またはワクチンは、経口、経鼻または非経口経路により投与される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
医薬品としての使用のための請求項１〜９のいずれかに記載の弱毒化変異体株。
【請求項１７】
獣医学的動物種、好ましくは家禽における細菌による感染の防御および／または処置のための医薬品またはワクチンの調製のための、請求項１〜９のいずれかに記載の弱毒化変異体株の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【図６−４】
【図７−１】
【図７−２】
【図７−３】
【図７−４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図６−３】
【図６−４】
【図７−１】
【図７−２】
【図７−３】
【図７−４】
【公表番号】特表２００９−５２９８９５（Ｐ２００９−５２９８９５Ａ）
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５００６７１（Ｐ２００９−５００６７１）
【出願日】平成１８年３月２０日（２００６．３．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＢＥ２００６／００００１９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０６９５６
【国際公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【出願人】（５０２３２０６１１）ヴリジェ ユニヴェルシテ ブリュッセル (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２０日（２００６．３．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＢＥ２００６／００００１９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０６９５６
【国際公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【出願人】（５０２３２０６１１）ヴリジェ ユニヴェルシテ ブリュッセル (3)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]