微生物及びその菌体を含有する脱臭剤
【課題】好熱性で且つ悪臭成分である低級脂肪酸類に対して脱臭能を有する微生物を提供する。
【解決手段】低級脂肪酸に対して脱臭能を有し、且つバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)に属する好熱性微生物。
【解決手段】低級脂肪酸に対して脱臭能を有し、且つバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)に属する好熱性微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば脱臭能を有する微生物及び当該微生物を含有する脱臭剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、家畜糞等の有機残渣を堆肥化させる場合において、悪臭成分が多量に揮散することが問題となっている。悪臭成分としては、例えば低級脂肪酸類が挙げられ、低濃度であっても悪臭成分として問題とされる。
【０００３】
脱臭法に関する従来技術として、特定の微生物や複合微生物を用いて脱臭する微生物脱臭技術が報告されている。例えば硫黄化合物に関しては、チオバチルス・チオパレス(Thiobacillus thioparus)及びシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)の混合培養物によるジメチルスルフィドの分解(非特許文献１)並びにシュードモナスによる硫化水素の分解(特許文献１)が報告されている。また、アシネトバクター・カルコアセテカス(Acinetobacter calcoaceticus)を用いたインドール及びスカトールの分解方法(特許文献２)が報告されている。これら硫黄化合物、インドール及びスカトールの微生物脱臭に関する技術は、畜糞等の悪臭成分の一部を低減する技術として有効であるものの、低級脂肪酸類を多量に含有する畜糞等における悪臭の低減には不十分である。
【０００４】
一方、低級脂肪酸類の微生物脱臭技術として、脱臭能を有するバチルス・バディウス(Bacillus badius)MA001株(FERM BP-4493)が知られている(特許文献３)。しかしながら、当該バチルス・バディウスMA001株の最適活動温度域は通常温度(15℃〜45℃程度)に近く、高温条件となる堆肥化の過程等での使用では、その効果が著しく制限されることとなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平4-262778号公報
【特許文献２】特開平2-53482号公報
【特許文献３】特許第2810308号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Takahiro Kanagawa及び D.P. Kelly, 「FEMS Microbiology Letters」, 1986年, 第34巻, pp. 13-19
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
堆肥化過程での悪臭成分である低級脂肪酸類の微生物脱臭を達成するためには、堆肥化過程の高温条件下で活発に活動する微生物が必要である。
【０００８】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、好熱性で且つ悪臭成分である低級脂肪酸類に対して脱臭能を有する微生物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、好熱性で且つ低級脂肪酸類に対して脱臭能を有する微生物を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、受託番号NITE P-998で特定される微生物等の低級脂肪酸に対して脱臭能を有し、且つバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)に属する好熱性微生物である。ここで、脱臭対象の低級脂肪酸としては、プロピオン酸、酪酸(n-ブタン酸)、吉草酸(n-ペンタン酸)及びイソ吉草酸(3-メチルブタン酸)から成る群より選択される1種又は2種以上が挙げられる。
【００１１】
また、本発明は、上記微生物を有効成分として含有する脱臭剤である。脱臭剤に含有される微生物は、微生物担体に保持することができる。
【００１２】
さらに、本発明は、上記微生物又は脱臭剤を有機残渣に添加する工程を含む堆肥の製造方法である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、堆肥化の過程等において、悪臭成分である低級脂肪酸類の発生を低減し、脱臭することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１−１】TAB7株の16S rRNA遺伝子の相同性分析結果を示す図である。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図２】TAB7株保持微生物資材による畜糞中の低級脂肪酸類の分解を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る微生物は、低級脂肪酸に対して脱臭能を有し、且つバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)に属する好熱性微生物である。ここで、「低級脂肪酸に対する脱臭能」は、低級脂肪酸を分解し、低減することで、低級脂肪酸による悪臭を脱臭する能力を意味する。また、「好熱性微生物」は、50℃以上(例えば50℃〜60℃、好ましくは55℃〜60℃)の高温条件下で生育できる微生物を意味する。本発明に係る微生物は、好熱性であり、堆肥化の過程における50℃以上といった高温条件下でも活発に活動し、且つ堆肥化(堆肥の製造)において悪臭成分として問題となる低級脂肪酸を分解することで、堆肥化の過程において又は得られる堆肥から悪臭を脱臭することができる。
【００１６】
本発明に係る微生物により分解される低級脂肪酸としては、特に限定されるものではないが、例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸(n-ブタン酸)、イソ酪酸(2-メチルプロピオン酸)、吉草酸(n-ペンタン酸)、ヒドロアンゲリカ酸(2-メチルブタン酸)、イソ吉草酸(3-メチルブタン酸)、ピバル酸(2,2-ジメチルプロピオン酸)、カプロン酸(n-ヘキサン酸)、エナント酸(n-ヘプタン酸)、カプリル酸(n-オクタン酸)、ベラルゴン酸(n-ノナン酸)、カプリン酸(n-デカン酸)が挙げられ、特にプロピオン酸、酪酸(n-ブタン酸)、吉草酸(n-ペンタン酸)、イソ吉草酸(3-メチルブタン酸)の1種又は2種以上が挙げられる。
【００１７】
本発明に係る微生物の分離源としては、例えば堆肥化過程の畜糞が用いられる。堆肥化過程の畜糞において、当該畜糞中で活発に活動し、高温条件下で生育可能であり、低級脂肪酸を効率的に分解し、脱臭できるバチルス・リケニホルミスに属する微生物を本発明に係る微生物として分離できる。分離した微生物の脱臭能の評価方法としては、例えば低級脂肪酸含有培地に分離した微生物を添加し、培養し、培養後、培養物中の低級脂肪酸量をガスクロマトグラフ質量分析等により測定する方法が挙げられる。微生物を添加した培養物中の低級脂肪酸量が有意に低減していた場合に、当該微生物が低級脂肪酸に対して脱臭能を有すると判断することができる。当該方法によれば、バチルス・リケニホルミスに属するTAB7株を単離することができた。
【００１８】
TAB7株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NPMD)(千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)に平成22年(2010年)10月29日付で寄託されており、その受託番号は、NITE P-998である。TAB7株は、下記の実施例に示す菌学的性質及び16S rRNA遺伝子の相同性分析等により、バチルス・リケニホルミスに属する新菌株であると同定した。なお、TAB7株において自然的又は人工的手段によって変異させて得られ、かつ低級脂肪酸に対して脱臭能を有する好熱性変異株は、本発明に係る微生物に含まれる。
【００１９】
TAB7株は、例えばグルコース1％、yeast extract 1％、Na2HPO4 0.1％及び(NH4)2SO4 0.1％を含有する培地において、pH6.0〜9.0(例えばpH7.0)及び温度25℃〜55℃(好ましくは45℃〜52℃)の条件下で培養し、生育させることができる。なお、TAB7株の培養に使用する培地は、一般的な発酵技術に使用される多数の栄養培地のいずれであってもよく、例えば肉汁、ペプトン等の有機栄養源と微量の無機栄養源を含有する培地をTAB7株の培養に使用できる。
【００２０】
一方、本発明に係る脱臭剤は、以上に説明する本発明に係る微生物を有効成分として含有する脱臭剤である。例えば、本発明に係る脱臭剤を、堆肥化過程の畜糞や堆肥に添加することで、堆肥化過程における悪臭又は堆肥の悪臭を脱臭することができる。当該脱臭剤中の本発明に係る微生物として、微生物担体に保持させたものを使用することもできる。微生物担体としては、特に限定されるものではないが、例えばパーライト、ベントナイト、ゼオライト、バーミキュライト、珪藻土、ピートモス、活性炭等が挙げられる。例えば、パーライト1kgに本発明に微生物の培養液100ml(吸光度OD660nmの値が2.0程度)を添加し、5分間程度撹拌することで、パーライトに本発明に係る微生物を吸着させることができる。さらに、本発明に係る脱臭剤には、本発明に係る微生物の他に、デンプン、油、フスマ、おがくず、セルロース、糖質、キチン、ゼラチン、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸マグネシウム、活性炭、珪藻土、ゼオライト、ガラス、ナイロン、ウレタン、ポリエステル等の添加物を含有させることもできる。
【００２１】
さらに、本発明に係る堆肥の製造方法(以下、「本方法」と称する)は、上述の本発明に係る微生物又は脱臭剤を利用し、当該微生物又は脱臭剤を添加した有機残渣を堆肥化に供し、堆肥を製造する方法である。本方法によれば、堆肥化の際に低級脂肪酸による悪臭を脱臭でき、悪臭が少ないか又は全くしない堆肥を提供することができる。堆肥化に使用する有機残渣としては、例えばヒトや家畜(例えば、ブタ、ウシ及びニワトリ)の畜糞を含む動物の糞又は糞尿混合物が挙げられる。
【００２２】
本方法では、適宜含水調整した(例えば、含水率60％程度)有機残渣に、例えば有機残渣1kg当たり105〜1013個の本発明に係る微生物又は当該微生物を含有する本発明に係る脱臭剤を添加する。当該添加は、堆肥化の前であればいずれの時点であってもよい。次いで、本発明に係る微生物又は本発明に係る脱臭剤を添加した有機残渣を堆肥化に供する。堆肥化は、例えば本発明に係る微生物又は脱臭剤と有機残渣との混合物を発酵に供することで行われる。発酵条件としては、例えば温度40℃〜75℃(好ましくは、50℃〜60℃)で2〜5週間(好ましくは3〜5週間)が挙げられる。このようにして、堆肥化の過程における低級脂肪酸による悪臭を低減でき、また低級脂肪酸による悪臭が少ないか又は全くしない堆肥を製造することができる。
【００２３】
本方法における堆肥化中の堆肥の低級脂肪酸による悪臭又は本方法により製造された堆肥の低級脂肪酸による悪臭の評価方法としては、例えば堆肥化中の堆肥又は製造した堆肥中の低級脂肪酸量をガスクロマトグラフ質量分析等により測定する方法が挙げられる。本発明に係る微生物又は脱臭剤を添加しない有機残渣を使用した堆肥化中の堆肥又は製造した堆肥と比較して、低級脂肪酸量が有意に低減していた場合に、本方法における堆肥化中の堆肥又は本方法により製造した堆肥は不快臭が少なく、良好であると判断することができる。
【００２４】
あるいは、官能評価により堆肥の低級脂肪酸による悪臭を評価することができる。すなわち、本方法における堆肥化中の堆肥の臭い又は本方法により製造された堆肥の臭いを複数人が確認し、本発明に係る微生物又は脱臭剤を添加しない有機残渣を使用した堆肥化中の堆肥又は製造した堆肥と比較して、有意に悪臭が少ないか又は全くしないと判断した場合に、本方法における堆肥化中の堆肥又は本方法により製造した堆肥は不快臭が少なく、良好であると判断することができる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２６】
〔実施例１〕低級脂肪酸類を効率的に分解及び脱臭する微生物の単離及び当該微生物の分類学的性質
1-1．微生物の単離
堆肥化において活発に作用し、堆肥化過程の悪臭成分を効率的に分解及び脱臭させうる微生物を探索するために、日本全国の畜産農家より堆肥化過程の畜糞を入手し、悪臭低減微生物の単離を試みた。
【００２７】
その結果、畜糞中で活発に活動可能で、高温条件下において生育可能であり、且つ低級脂肪酸類を効率的に分解及び脱臭する微生物を取得した。得られた菌株をTAB7株と呼ぶ。
【００２８】
1-2．TAB7株の生理学的性質
TAB7株の菌学的性質を、「バージェーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー, 第3巻(BERGEY'S MANUAL of Systematic Bacteriology volume Three)」及び「Manual for the Identification of Medical Bacteria. 3rd edition」に記載の方法を用いて調査し、並びにAPI50CHB(bioMerieux, Lyon, France)を用いた試験により、以下の所見が得られた。
【００２９】
【表１】
【００３０】
表１に示す菌学的性質から判るように、TAB7株は運動性を有するグラム陽性細菌であり、芽胞を形成し、芽胞による菌体の膨張は示さず、カタラーゼ反応は陽性で、且つオキシダーゼ反応は陰性を示した。これらの性質は、バチルス(Bacillus)属の一般性状に一致した。
【００３１】
さらに、TAB7株は、グリセロール、リボース及びフラクトース等を発酵し、L-キシロース、ガラクトース等を発酵せず、β-ガラクトシダーゼ及びアルギニンジヒドロラーゼ活性を示し、アセトインを産生せず、ゼラチナーゼ活性を示さず、硝酸塩を還元しなかった。また、TAB7株は、10％NaClで生育し、カゼイン及びデンプンを加水分解した。これらの性状は、後述する16S rRNA遺伝子による同定試験で、示唆されたバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)の性状に一致する点が多く認められた。しかしながら、相違点も認められ、特に、アセトインを産生せず、ゼラチンを加水分解しない点で異なり、TAB7株は、公知のバチルス・リケニホルミスの菌株との相違が認められた。
【００３２】
1-3．16S rRNA遺伝子配列によるTAB7株の分類特定
TAB7株の遺伝子配列による分類・同定を実施するために、微生物学実験法(講談社)に記載の方法に従い、TAB7株のゲノムDNAからの16S rRNA遺伝子の取得及び当該遺伝子の塩基配列の特定を実施した。同定したTAB7株の16S rRNA遺伝子の一部の塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列であった。
【００３３】
また、当該TAB7株の16S rRNA遺伝子の塩基配列を、DNA塩基配列データベース(NCBI(GenBank))と比較して、BLAST検索を実施した。結果を図１−１及び図１−２に示す。図１−１及び図１−２に示すように、TAB7株は、バチルス・リケニホルミスと最も相同性を示した。
以上の結果より、TAB7株は、バチルス・リケニホルミスの新菌株であると同定した。
【００３４】
1-4．畜糞中でのTAB7株の生育性の確認
TAB7株が堆肥化過程において、着実に機能するためには、畜糞成分中で生育することが必要である。そこで、実際の畜糞を用いて、TAB7株の生育性の確認を実施した。
【００３５】
実際の農場から採取した豚糞(含水率60％程度)及び鶏糞(含水率60％程度）100gを計量した。当該畜糞に純水400mlを添加した後、培地用寒天を1.5％となるように添加し、当該混合物をオートクレーブ滅菌(121℃、20分)に供した。
【００３６】
オートクレーブ滅菌後、混合物を室温程度まで冷却し、クリーンルーム内で滅菌シャーレに添加し、固化させた。
【００３７】
このようにして作製した畜糞培地にTAB7株を白金耳で接種し、50℃で12時間培養し、畜糞成分中でTAB7株が問題無く生育することを確認した。
【００３８】
〔実施例２〕TAB7株による畜糞中の低級脂肪酸類の分解
2-1．TAB7株の培養
必要量のTAB7株を、以下の表２に示す成分を含む培養培地で培養し、増殖させた。
【００３９】
【表２】
【００４０】
上記培養培地成分を純水に溶解させ、pH7.0に調整し、オートクレーブを用いて121℃で15分間保持し、滅菌した。
【００４１】
次いで、500mlバッフル付きフラスコに作製した培地を300ml添加し、作製済みのグリセロールストックからTAB7株を少量植菌し、50℃にて撹拌しながら16時間培養し、吸光度(OD660nm)の値が2.0程度のTAB7株培養液を取得した。
【００４２】
2-2．微生物担体へのTAB7株の保持
上記2-1節で得られたTAB7株培養液100mlをパーライト(微生物担体)1kgに添加し、5分間撹拌に供することで、パーライトにTAB7株を吸着させ、微生物資材を取得した。
【００４３】
2-3．TAB7株保持微生物資材による畜糞中の低級脂肪酸類の分解
養豚農家から3ヶ月〜6ヶ月齢の豚新鮮糞(含水率70％程度)を入手し、含水調整のため乾燥糞(水分率20％程度）を用いて含水率60％程度に調整した。
【００４４】
含水調整後の豚糞9kgに、上記2-2節で作製した微生物資材18g(当該微生物資材1g当たりTAB7株生菌数約107個程度）を添加し、試験区（畜糞1g当たりTAB7株2×104個程度）とした。また、豚糞に何も添加しない区を対照区とした。
【００４５】
これらの糞を小型堆肥化装置かぐやひめ(富士平工業製)にて堆肥化させた。堆肥化約4日間経過した豚糞を用いて、悪臭成分である低級脂肪酸濃度を測定した。
【００４６】
低級脂肪酸濃度の測定においては、先ず採取した堆肥サンプルの水分率を測定し、ヘッドスペースにて60℃で30分間保持した後（バイアル22ml）、揮発したガスをガスクロマトグラフ質量分析装置K9（日本電子製）にて分析し、堆肥における低級脂肪酸量を定量した(使用カラム：GLサイエンス製TC-WAX ID 0.32mm, 30m）。定量した低級脂肪酸量を図２に示す。
【００４７】
図２において、各パネルは、以下の通りである;(A)：堆肥における酪酸揮散濃度、(B)：堆肥における吉草酸揮散濃度、(C)：堆肥におけるプロピオン酸揮散濃度、(D)：堆肥におけるイソ吉草酸揮散濃度。
【００４８】
図２に示すように、対照区(微生物資材無添加区)と比較して、試験区(微生物資材添加区)の堆肥において、酪酸、吉草酸、プロピオン酸及びイソ吉草酸がそれぞれ90.1％、77.5％、62.5％、90.1％減少したことが確認された。
【受託番号】
【００４９】
NITE P-998
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば脱臭能を有する微生物及び当該微生物を含有する脱臭剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、家畜糞等の有機残渣を堆肥化させる場合において、悪臭成分が多量に揮散することが問題となっている。悪臭成分としては、例えば低級脂肪酸類が挙げられ、低濃度であっても悪臭成分として問題とされる。
【０００３】
脱臭法に関する従来技術として、特定の微生物や複合微生物を用いて脱臭する微生物脱臭技術が報告されている。例えば硫黄化合物に関しては、チオバチルス・チオパレス(Thiobacillus thioparus)及びシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)の混合培養物によるジメチルスルフィドの分解(非特許文献１)並びにシュードモナスによる硫化水素の分解(特許文献１)が報告されている。また、アシネトバクター・カルコアセテカス(Acinetobacter calcoaceticus)を用いたインドール及びスカトールの分解方法(特許文献２)が報告されている。これら硫黄化合物、インドール及びスカトールの微生物脱臭に関する技術は、畜糞等の悪臭成分の一部を低減する技術として有効であるものの、低級脂肪酸類を多量に含有する畜糞等における悪臭の低減には不十分である。
【０００４】
一方、低級脂肪酸類の微生物脱臭技術として、脱臭能を有するバチルス・バディウス(Bacillus badius)MA001株(FERM BP-4493)が知られている(特許文献３)。しかしながら、当該バチルス・バディウスMA001株の最適活動温度域は通常温度(15℃〜45℃程度)に近く、高温条件となる堆肥化の過程等での使用では、その効果が著しく制限されることとなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平4-262778号公報
【特許文献２】特開平2-53482号公報
【特許文献３】特許第2810308号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Takahiro Kanagawa及び D.P. Kelly, 「FEMS Microbiology Letters」, 1986年, 第34巻, pp. 13-19
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
堆肥化過程での悪臭成分である低級脂肪酸類の微生物脱臭を達成するためには、堆肥化過程の高温条件下で活発に活動する微生物が必要である。
【０００８】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、好熱性で且つ悪臭成分である低級脂肪酸類に対して脱臭能を有する微生物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、好熱性で且つ低級脂肪酸類に対して脱臭能を有する微生物を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、受託番号NITE P-998で特定される微生物等の低級脂肪酸に対して脱臭能を有し、且つバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)に属する好熱性微生物である。ここで、脱臭対象の低級脂肪酸としては、プロピオン酸、酪酸(n-ブタン酸)、吉草酸(n-ペンタン酸)及びイソ吉草酸(3-メチルブタン酸)から成る群より選択される1種又は2種以上が挙げられる。
【００１１】
また、本発明は、上記微生物を有効成分として含有する脱臭剤である。脱臭剤に含有される微生物は、微生物担体に保持することができる。
【００１２】
さらに、本発明は、上記微生物又は脱臭剤を有機残渣に添加する工程を含む堆肥の製造方法である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、堆肥化の過程等において、悪臭成分である低級脂肪酸類の発生を低減し、脱臭することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１−１】TAB7株の16S rRNA遺伝子の相同性分析結果を示す図である。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図２】TAB7株保持微生物資材による畜糞中の低級脂肪酸類の分解を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る微生物は、低級脂肪酸に対して脱臭能を有し、且つバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)に属する好熱性微生物である。ここで、「低級脂肪酸に対する脱臭能」は、低級脂肪酸を分解し、低減することで、低級脂肪酸による悪臭を脱臭する能力を意味する。また、「好熱性微生物」は、50℃以上(例えば50℃〜60℃、好ましくは55℃〜60℃)の高温条件下で生育できる微生物を意味する。本発明に係る微生物は、好熱性であり、堆肥化の過程における50℃以上といった高温条件下でも活発に活動し、且つ堆肥化(堆肥の製造)において悪臭成分として問題となる低級脂肪酸を分解することで、堆肥化の過程において又は得られる堆肥から悪臭を脱臭することができる。
【００１６】
本発明に係る微生物により分解される低級脂肪酸としては、特に限定されるものではないが、例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸(n-ブタン酸)、イソ酪酸(2-メチルプロピオン酸)、吉草酸(n-ペンタン酸)、ヒドロアンゲリカ酸(2-メチルブタン酸)、イソ吉草酸(3-メチルブタン酸)、ピバル酸(2,2-ジメチルプロピオン酸)、カプロン酸(n-ヘキサン酸)、エナント酸(n-ヘプタン酸)、カプリル酸(n-オクタン酸)、ベラルゴン酸(n-ノナン酸)、カプリン酸(n-デカン酸)が挙げられ、特にプロピオン酸、酪酸(n-ブタン酸)、吉草酸(n-ペンタン酸)、イソ吉草酸(3-メチルブタン酸)の1種又は2種以上が挙げられる。
【００１７】
本発明に係る微生物の分離源としては、例えば堆肥化過程の畜糞が用いられる。堆肥化過程の畜糞において、当該畜糞中で活発に活動し、高温条件下で生育可能であり、低級脂肪酸を効率的に分解し、脱臭できるバチルス・リケニホルミスに属する微生物を本発明に係る微生物として分離できる。分離した微生物の脱臭能の評価方法としては、例えば低級脂肪酸含有培地に分離した微生物を添加し、培養し、培養後、培養物中の低級脂肪酸量をガスクロマトグラフ質量分析等により測定する方法が挙げられる。微生物を添加した培養物中の低級脂肪酸量が有意に低減していた場合に、当該微生物が低級脂肪酸に対して脱臭能を有すると判断することができる。当該方法によれば、バチルス・リケニホルミスに属するTAB7株を単離することができた。
【００１８】
TAB7株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NPMD)(千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)に平成22年(2010年)10月29日付で寄託されており、その受託番号は、NITE P-998である。TAB7株は、下記の実施例に示す菌学的性質及び16S rRNA遺伝子の相同性分析等により、バチルス・リケニホルミスに属する新菌株であると同定した。なお、TAB7株において自然的又は人工的手段によって変異させて得られ、かつ低級脂肪酸に対して脱臭能を有する好熱性変異株は、本発明に係る微生物に含まれる。
【００１９】
TAB7株は、例えばグルコース1％、yeast extract 1％、Na2HPO4 0.1％及び(NH4)2SO4 0.1％を含有する培地において、pH6.0〜9.0(例えばpH7.0)及び温度25℃〜55℃(好ましくは45℃〜52℃)の条件下で培養し、生育させることができる。なお、TAB7株の培養に使用する培地は、一般的な発酵技術に使用される多数の栄養培地のいずれであってもよく、例えば肉汁、ペプトン等の有機栄養源と微量の無機栄養源を含有する培地をTAB7株の培養に使用できる。
【００２０】
一方、本発明に係る脱臭剤は、以上に説明する本発明に係る微生物を有効成分として含有する脱臭剤である。例えば、本発明に係る脱臭剤を、堆肥化過程の畜糞や堆肥に添加することで、堆肥化過程における悪臭又は堆肥の悪臭を脱臭することができる。当該脱臭剤中の本発明に係る微生物として、微生物担体に保持させたものを使用することもできる。微生物担体としては、特に限定されるものではないが、例えばパーライト、ベントナイト、ゼオライト、バーミキュライト、珪藻土、ピートモス、活性炭等が挙げられる。例えば、パーライト1kgに本発明に微生物の培養液100ml(吸光度OD660nmの値が2.0程度)を添加し、5分間程度撹拌することで、パーライトに本発明に係る微生物を吸着させることができる。さらに、本発明に係る脱臭剤には、本発明に係る微生物の他に、デンプン、油、フスマ、おがくず、セルロース、糖質、キチン、ゼラチン、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸マグネシウム、活性炭、珪藻土、ゼオライト、ガラス、ナイロン、ウレタン、ポリエステル等の添加物を含有させることもできる。
【００２１】
さらに、本発明に係る堆肥の製造方法(以下、「本方法」と称する)は、上述の本発明に係る微生物又は脱臭剤を利用し、当該微生物又は脱臭剤を添加した有機残渣を堆肥化に供し、堆肥を製造する方法である。本方法によれば、堆肥化の際に低級脂肪酸による悪臭を脱臭でき、悪臭が少ないか又は全くしない堆肥を提供することができる。堆肥化に使用する有機残渣としては、例えばヒトや家畜(例えば、ブタ、ウシ及びニワトリ)の畜糞を含む動物の糞又は糞尿混合物が挙げられる。
【００２２】
本方法では、適宜含水調整した(例えば、含水率60％程度)有機残渣に、例えば有機残渣1kg当たり105〜1013個の本発明に係る微生物又は当該微生物を含有する本発明に係る脱臭剤を添加する。当該添加は、堆肥化の前であればいずれの時点であってもよい。次いで、本発明に係る微生物又は本発明に係る脱臭剤を添加した有機残渣を堆肥化に供する。堆肥化は、例えば本発明に係る微生物又は脱臭剤と有機残渣との混合物を発酵に供することで行われる。発酵条件としては、例えば温度40℃〜75℃(好ましくは、50℃〜60℃)で2〜5週間(好ましくは3〜5週間)が挙げられる。このようにして、堆肥化の過程における低級脂肪酸による悪臭を低減でき、また低級脂肪酸による悪臭が少ないか又は全くしない堆肥を製造することができる。
【００２３】
本方法における堆肥化中の堆肥の低級脂肪酸による悪臭又は本方法により製造された堆肥の低級脂肪酸による悪臭の評価方法としては、例えば堆肥化中の堆肥又は製造した堆肥中の低級脂肪酸量をガスクロマトグラフ質量分析等により測定する方法が挙げられる。本発明に係る微生物又は脱臭剤を添加しない有機残渣を使用した堆肥化中の堆肥又は製造した堆肥と比較して、低級脂肪酸量が有意に低減していた場合に、本方法における堆肥化中の堆肥又は本方法により製造した堆肥は不快臭が少なく、良好であると判断することができる。
【００２４】
あるいは、官能評価により堆肥の低級脂肪酸による悪臭を評価することができる。すなわち、本方法における堆肥化中の堆肥の臭い又は本方法により製造された堆肥の臭いを複数人が確認し、本発明に係る微生物又は脱臭剤を添加しない有機残渣を使用した堆肥化中の堆肥又は製造した堆肥と比較して、有意に悪臭が少ないか又は全くしないと判断した場合に、本方法における堆肥化中の堆肥又は本方法により製造した堆肥は不快臭が少なく、良好であると判断することができる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２６】
〔実施例１〕低級脂肪酸類を効率的に分解及び脱臭する微生物の単離及び当該微生物の分類学的性質
1-1．微生物の単離
堆肥化において活発に作用し、堆肥化過程の悪臭成分を効率的に分解及び脱臭させうる微生物を探索するために、日本全国の畜産農家より堆肥化過程の畜糞を入手し、悪臭低減微生物の単離を試みた。
【００２７】
その結果、畜糞中で活発に活動可能で、高温条件下において生育可能であり、且つ低級脂肪酸類を効率的に分解及び脱臭する微生物を取得した。得られた菌株をTAB7株と呼ぶ。
【００２８】
1-2．TAB7株の生理学的性質
TAB7株の菌学的性質を、「バージェーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー, 第3巻(BERGEY'S MANUAL of Systematic Bacteriology volume Three)」及び「Manual for the Identification of Medical Bacteria. 3rd edition」に記載の方法を用いて調査し、並びにAPI50CHB(bioMerieux, Lyon, France)を用いた試験により、以下の所見が得られた。
【００２９】
【表１】
【００３０】
表１に示す菌学的性質から判るように、TAB7株は運動性を有するグラム陽性細菌であり、芽胞を形成し、芽胞による菌体の膨張は示さず、カタラーゼ反応は陽性で、且つオキシダーゼ反応は陰性を示した。これらの性質は、バチルス(Bacillus)属の一般性状に一致した。
【００３１】
さらに、TAB7株は、グリセロール、リボース及びフラクトース等を発酵し、L-キシロース、ガラクトース等を発酵せず、β-ガラクトシダーゼ及びアルギニンジヒドロラーゼ活性を示し、アセトインを産生せず、ゼラチナーゼ活性を示さず、硝酸塩を還元しなかった。また、TAB7株は、10％NaClで生育し、カゼイン及びデンプンを加水分解した。これらの性状は、後述する16S rRNA遺伝子による同定試験で、示唆されたバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)の性状に一致する点が多く認められた。しかしながら、相違点も認められ、特に、アセトインを産生せず、ゼラチンを加水分解しない点で異なり、TAB7株は、公知のバチルス・リケニホルミスの菌株との相違が認められた。
【００３２】
1-3．16S rRNA遺伝子配列によるTAB7株の分類特定
TAB7株の遺伝子配列による分類・同定を実施するために、微生物学実験法(講談社)に記載の方法に従い、TAB7株のゲノムDNAからの16S rRNA遺伝子の取得及び当該遺伝子の塩基配列の特定を実施した。同定したTAB7株の16S rRNA遺伝子の一部の塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列であった。
【００３３】
また、当該TAB7株の16S rRNA遺伝子の塩基配列を、DNA塩基配列データベース(NCBI(GenBank))と比較して、BLAST検索を実施した。結果を図１−１及び図１−２に示す。図１−１及び図１−２に示すように、TAB7株は、バチルス・リケニホルミスと最も相同性を示した。
以上の結果より、TAB7株は、バチルス・リケニホルミスの新菌株であると同定した。
【００３４】
1-4．畜糞中でのTAB7株の生育性の確認
TAB7株が堆肥化過程において、着実に機能するためには、畜糞成分中で生育することが必要である。そこで、実際の畜糞を用いて、TAB7株の生育性の確認を実施した。
【００３５】
実際の農場から採取した豚糞(含水率60％程度)及び鶏糞(含水率60％程度）100gを計量した。当該畜糞に純水400mlを添加した後、培地用寒天を1.5％となるように添加し、当該混合物をオートクレーブ滅菌(121℃、20分)に供した。
【００３６】
オートクレーブ滅菌後、混合物を室温程度まで冷却し、クリーンルーム内で滅菌シャーレに添加し、固化させた。
【００３７】
このようにして作製した畜糞培地にTAB7株を白金耳で接種し、50℃で12時間培養し、畜糞成分中でTAB7株が問題無く生育することを確認した。
【００３８】
〔実施例２〕TAB7株による畜糞中の低級脂肪酸類の分解
2-1．TAB7株の培養
必要量のTAB7株を、以下の表２に示す成分を含む培養培地で培養し、増殖させた。
【００３９】
【表２】
【００４０】
上記培養培地成分を純水に溶解させ、pH7.0に調整し、オートクレーブを用いて121℃で15分間保持し、滅菌した。
【００４１】
次いで、500mlバッフル付きフラスコに作製した培地を300ml添加し、作製済みのグリセロールストックからTAB7株を少量植菌し、50℃にて撹拌しながら16時間培養し、吸光度(OD660nm)の値が2.0程度のTAB7株培養液を取得した。
【００４２】
2-2．微生物担体へのTAB7株の保持
上記2-1節で得られたTAB7株培養液100mlをパーライト(微生物担体)1kgに添加し、5分間撹拌に供することで、パーライトにTAB7株を吸着させ、微生物資材を取得した。
【００４３】
2-3．TAB7株保持微生物資材による畜糞中の低級脂肪酸類の分解
養豚農家から3ヶ月〜6ヶ月齢の豚新鮮糞(含水率70％程度)を入手し、含水調整のため乾燥糞(水分率20％程度）を用いて含水率60％程度に調整した。
【００４４】
含水調整後の豚糞9kgに、上記2-2節で作製した微生物資材18g(当該微生物資材1g当たりTAB7株生菌数約107個程度）を添加し、試験区（畜糞1g当たりTAB7株2×104個程度）とした。また、豚糞に何も添加しない区を対照区とした。
【００４５】
これらの糞を小型堆肥化装置かぐやひめ(富士平工業製)にて堆肥化させた。堆肥化約4日間経過した豚糞を用いて、悪臭成分である低級脂肪酸濃度を測定した。
【００４６】
低級脂肪酸濃度の測定においては、先ず採取した堆肥サンプルの水分率を測定し、ヘッドスペースにて60℃で30分間保持した後（バイアル22ml）、揮発したガスをガスクロマトグラフ質量分析装置K9（日本電子製）にて分析し、堆肥における低級脂肪酸量を定量した(使用カラム：GLサイエンス製TC-WAX ID 0.32mm, 30m）。定量した低級脂肪酸量を図２に示す。
【００４７】
図２において、各パネルは、以下の通りである;(A)：堆肥における酪酸揮散濃度、(B)：堆肥における吉草酸揮散濃度、(C)：堆肥におけるプロピオン酸揮散濃度、(D)：堆肥におけるイソ吉草酸揮散濃度。
【００４８】
図２に示すように、対照区(微生物資材無添加区)と比較して、試験区(微生物資材添加区)の堆肥において、酪酸、吉草酸、プロピオン酸及びイソ吉草酸がそれぞれ90.1％、77.5％、62.5％、90.1％減少したことが確認された。
【受託番号】
【００４９】
NITE P-998
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低級脂肪酸に対して脱臭能を有し、且つバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)に属する好熱性微生物。
【請求項２】
低級脂肪酸が、プロピオン酸、酪酸、吉草酸及びイソ吉草酸から成る群より選択される1種又は2種以上である、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
微生物が、受託番号NITE P-998で特定される微生物である、請求項１又は２記載の微生物。
【請求項４】
請求項１〜３の微生物を有効成分として含有する脱臭剤。
【請求項５】
微生物が微生物担体に保持されている、請求項４記載の脱臭剤。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載の微生物又は請求項４若しくは５記載の脱臭剤を有機残渣に添加する工程を含む、堆肥の製造方法。
【請求項１】
低級脂肪酸に対して脱臭能を有し、且つバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)に属する好熱性微生物。
【請求項２】
低級脂肪酸が、プロピオン酸、酪酸、吉草酸及びイソ吉草酸から成る群より選択される1種又は2種以上である、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
微生物が、受託番号NITE P-998で特定される微生物である、請求項１又は２記載の微生物。
【請求項４】
請求項１〜３の微生物を有効成分として含有する脱臭剤。
【請求項５】
微生物が微生物担体に保持されている、請求項４記載の脱臭剤。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載の微生物又は請求項４若しくは５記載の脱臭剤を有機残渣に添加する工程を含む、堆肥の製造方法。
【図１−１】
【図１−２】
【図２】
【図１−２】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−１０５５５６（Ｐ２０１２−１０５５５６Ａ）
【公開日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２５５１４０（Ｐ２０１０−２５５１４０）
【出願日】平成２２年１１月１５日（２０１０．１１．１５）
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１５日（２０１０．１１．１５）
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【Ｆターム（参考）】
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