抗アレルギー物質、抗アレルギー剤及び食品
【課題】 アレルギーの発症に関わるＩｇＥ抗体の生産を抑制することにより、効果的にアレルギー症状を抑制する抗アレルギー物質等を提供することを課題とする。
【解決手段】 イチゴ由来のグリセロアルデヒド３リン酸を含む抗アレルギー物質や医薬品（抗アレルギー剤）・食品（機能性食品）は、ステロイドのような副作用を示さず、日常的に食事などにより摂取可能で、アレルギー症状を緩和可能である。
【解決手段】 イチゴ由来のグリセロアルデヒド３リン酸を含む抗アレルギー物質や医薬品（抗アレルギー剤）・食品（機能性食品）は、ステロイドのような副作用を示さず、日常的に食事などにより摂取可能で、アレルギー症状を緩和可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗アレルギー物質、抗アレルギー剤及び食品に関し、特に、ＩｇＥ抗体産生を抑制する生理活性物質として機能する抗アレルギー物質等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、都市型疾患である花粉症やハウスダストによるアレルギー患者数は急速に増大している。特に花粉症は全国民の１５〜２０％が患者であるとされている。さらに将来的に、この数字は増えるとも言われており、深刻化している状況である。一方で、花粉症の症状は、鼻水や咳、目の痒みなど生活上に多大な影響を与える疾患であるにも関わらず、致命的ではないため、多くは本人の忍耐に依存し、また、病院でも様々な治療法が試されているものの、決め手となる治療法はなく、症状が激しい場合にステロイド系の抗炎症剤による緩和治療を行っている現状である。
【０００３】
この強い炎症抑制作用をもつステロイド系の抗炎症剤は、ステロイドが生体内のホルモンの一部であるため体内では炎症抑制作用だけでなくホルモンとしての生理作用を有しているため、強い副作用も指摘されている。そのため、医師の厳密な管理の下で使用することが重要であり、また、患者はそうした副作用の影響を懸念する意見も多い。一方で、機能性食品は医薬のように疾病治癒を目指すものではないが、日常の食生活に取り入れることで、手軽に疾病予防や疾病の症状緩和をもたらすため、患者の生活の質を改善することが可能になる手段として大きな期待が寄せられている。
【０００４】
ところで、花粉症やアトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患は医学的にはＩ型アレルギー又は即時型アレルギーと呼ばれており、多くの研究者が発症メカニズムを研究している。今までに解明された知見によれば、以下のことが分かっている。まず、呼吸によって吸入されたアレルゲンである花粉は、体内の免疫反応としてＩｇＥ型の抗体と結合する。さらに、花粉とＩｇＥ抗体の結合物がマスト細胞（肥満細胞）と結合する。このことにより、このマスト細胞からヒスタミンやロイコトリエンという化学物質が放出され、これらの物質が鼻や目、気道の炎症を発生させる。つまり、花粉の体内侵入に対して、ＩｇＥ型の抗体がアレルギーの引き金物質となっている。したがって、ＩｇＥ型抗体の生体内における減少がアレルギー症状の抑制方法のひとつとなる。
【０００５】
一方、本願発明者達は、体内でＩｇＥ抗体生産に関わる免疫細胞を生体外に取り出して細胞培養することにより、対外でＩｇＥ抗体の生産を再現可能な実験系を構築してきた。なお、本願発明者達は、ヒトのアレルギーの体内動態をモデル化したヒト末梢血リンパ球細胞による培養系を独自に構築し、食品成分中から抗アレルギー効果を示す成分の特定を行ってきた。この技術は、従来、マウス等の実験動物を大量に用いて検査する手法と異なり、１０日前後の培養日数で数百種の検体を同時に検査できるため、極めて効率が高い。さらに、ヒト細胞を用いることから、探索した因子中の効果のある成分が見いだされた場合、生体でも効果を発揮する可能性が高く、探索に必要な時間的な短縮も可能である。また、探索した因子と細胞の相互作用を検討することで、因子の作用メカニズムを細胞レベルで解明できるため、食品機能の科学的な評価が可能であるなどの多くの優れた利点を有する（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３３（２０００）ｐｐ．３３−４０ 発行所Ｅｌｓｅｖｉｅｒ社
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記したようにステロイド系の抗炎症剤を持続的に投与した場合には副作用の点で問題がある一方で、日常的な食生活等でこうした症状を緩和するための既存の食品ではその有効性が十分ではないという問題があった。
【０００８】
一方で、本願発明者達は、上記した実験系を構築しており、この実験系を用いてＩｇＥ生産を抑制する効果がある物質のスクリーニングを行っていける状況にあった。
【０００９】
ゆえに、本発明は、ＩｇＥ産生抑制によりアレルギー疾患の治療やアレルギー症状の緩和が可能で、かつ、ステロイドのような副作用を生じず、長期間の服用が可能な高い安全性を有する物質を同定し、その物質を含有する抗アレルギー物質を提供し、さらに同定された物質を組成として含む抗アレルギー剤（医薬品）及び抗アレルギー効果を有する機能性食品と言われる食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者達は、前述の課題を解決するために、ＩｇＥ抗体の産生実験系を用いて様々なイチゴの抽出物を培養系内に添加してＩｇＥ生産を抑制する効果がある物質をスクリーニングするという研究を行った。その結果、イチゴの粗抽出物液中にＩｇＥ抗体産生抑制効果があることを見いだした。さらに、この粗抽出物液に対してＩｇＥ抗体産生抑制効果を指標に精製した結果、精製分画物により、もっとも強い活性を示す成分が代謝酵素の一つであるグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素（GAPDH）であることを突き止めた。さらに、研究を進めるため、このグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素が様々な生物の保有する酵素であることから、他の生物由来の成分としてウサギ由来グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素も同様に試験したところ、イチゴ由来のグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素と同様にＩｇＥ抗体産生抑制効果を示したことから、グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素にＩｇＥ抗体産生抑制作用があることを突き止めた。
【００１１】
したがって、本発明の第一の観点は、抗アレルギー物質として、ＩｇＥ抗体の産生を抑制するための成分としてグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素が含まれることを特徴とするものである。
【００１２】
ここで、当該成分は、日常生活における簡易摂取を可能にするということが期待されることから、食品として提供されることが望ましい。特に本成分の発見の根拠となったイチゴは、嗜好性の高い食品であるが、市場でも人気の高い食品の一つであり、生食、加工食品（飲料や飴、氷菓など）にも利用されているので、食品としての適用に特に有利である。
【００１３】
したがって、本発明の第二の観点は、グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素を含む組成が食品の形態であることを特徴とする。
【００１４】
一方、本発明の第三の観点は、グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素が抗アレルギー剤の有効成分として含有されることにより、アレルギー予防、治療に用いられることを可能にする。
【００１５】
なお、抗アレルギー効果を有するグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素がイチゴに限らず全ての生物に含まれている。この酵素は、生物の代謝に関わる酵素として知られているが、本願で判明したように抗アレルギー効果という点では捉えられてはいなかったものの、他の幅広い生物に含まれているものであってもＩｇＥ抗体の産生を抑制するための成分として抗アレルギー効果を有すると考えられる。そのため、食品の場合においてもグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素がイチゴ由来のものに限られる必要は必ずしもなく食品の成分として適切なものに由来するものであればよい。また、抗アレルギー剤が経口投与の医薬品であれば食品と同様な観点からの選択になる傾向はあり得るが、抗アレルギー物質として含まれた化粧品の場合も含め、それぞれの商品として用いられる用途に合わせて幅広い生物の中から適切なものに由来するものが選択されればよい。
【発明の効果】
【００１６】
本願の発明によれば、グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素をＩｇＥ産生抑制という抗アレルギー効果を有する成分の一つとして同定できたので、アレルギー疾患の治療やアレルギー症状の緩和が可能で、かつ、ステロイドのような副作用を生じず、長期間の服用が可能な高い安全性を有する抗アレルギー物質が得られたとともに、抗アレルギー剤（医薬品）及び機能性食品も得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】イチゴ品種「あまおう」「とよのか」のＩｇＥ抗体生産抑制作用の効果を確認した結果を示すグラフである。
【図２】イチゴ精製物とウサギ由来グリセロアルデヒド３リン酸とのＩｇＥ抗体生産抑制作用の比較を示したグラフである。
【図３】アトピー性皮膚炎モデルマウスを用いたイチゴ組成物の抗アレルギー効果を示したグラフである。
【図４】アトピー性皮膚炎モデルマウスと鼻炎モデルマウスを用いたイチゴ組成物の抗アレルギー効果の検証写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
まず、本発明に関わるグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素は種々の生物が有する酵素タンパク質であり、そのアミノ酸組成はイチゴ由来のグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素のアミノ酸組成と必ずしも完全な一致を要求しない。
【００１９】
イチゴは、一般に広く生食され、さらに加工食品等でも利用されている。したがって、摂食しても人体に悪影響はなく、安全性の高い食品であることが認められている。このことより、本発明で使用するグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素を主体とするイチゴ抽出物も安心して摂取可能である。
【００２０】
本発明で使用するグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素は、「あまおう」や「とよのか」などのイチゴ果肉を水系溶剤で抽出して得ることができる。抽出物が食品や化粧剤に利用可能であることを考慮し、安全性の面で、水系溶剤を用いるのが好ましい。
【００２１】
また、成分の摂取濃度は、アレルギー患者の年齢や性別、病状などに応じ個別に決定されるべきものであるが、組成物に対して５重量％〜１００重量％であることが好ましい。
【００２２】
本発明の組成物は、例えば、医薬や食品に用いることができる。医薬品の場合には、経口投与が好ましい。したがって、一般的に医薬の製剤添加物として用いられるソルビトール、ゼラチン、乳糖、ブドウ糖、デンプン、クエン酸などと混合して製剤することが可能である。また、本発明の組成物は、固体、液体、ゲル状等の形状の食品に配合することも可能である。その配合は、公知の任意の製造方法で行うことができるため、例えば、アイスクリームやチョコレート、キャンディ、清涼飲料水などに配合することができる。
【００２３】
以下に本発明の実施例を例示するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
［試料］
本実施例で用いたイチゴ試料の品種は、市販の「あまおう」「とよのか」である。
【００２５】
［リンパ球の分離］
ヒト末梢リンパ球を取得するために健常者の末梢血を密度勾配遠心法により、血液分離した。まず,健常人から末梢血をヘパリン入り真空管に採集し、あらかじめ１５ml遠心管に分注しておいた４mlの血液分離剤（Ficoll; GE Healthcare）の上に液面を乱さないように５mlの末梢血を重層し、４００×g、３０minの条件で遠心した。そして、最上層の血漿の層を取得し、−２４℃で保存した。次に、血漿層とFicoll層の間にあるリンパ球を回収後、基本合成培地ＥＲＤＦ（Kyokuto
Seiyaku）で洗浄し、４００×g、５ｍｉｎの条件で遠心、洗浄を３回繰り返した。取得したリンパ球は、−８５℃で凍結保存し、解凍後はリンパ球をＥＲＤＦ培地で洗浄して使用した。
【００２６】
［生体外アレルギー発症モデル細胞培養系］
５％ウシ胎児血清(FBS; Trace)及び１０％ヒト血漿を含むＥＲＤＦ培地中に、生体外に取り出した２．５×１０６ cells/mlのヒト末梢血リンパ球と免疫賦活剤としてムラミルジペプチド(MDP;
SIGMA)を１０ mg/ml、インターロイキン−２、−４、−６(IL−２、−４、−６; R＆D)を１０ ng/ml、さらにスギ花粉抗原(Cryj1; HAYASHIBARA)を１００ ng/mlの終濃度で加え、生体外アレルギー発症モデル培養系とした。添加した免疫賦活剤の主な働きは、ＭＤＰによる抗原への免疫応答を高めるアジュバンド活性、IL−２によるＴ細胞の増殖・分化の促進、IL−４によるＩｇＥクラススイッチ誘導、IL−６によるＢ細胞の分化誘導である。これらの免疫賦活剤とCryj1を加えたヒト末梢血リンパ球を９６穴プレートに各２００ml分注し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにて１０日間培養してＩｇＥ抗体産生を誘導した。なお、この培養系に含まれるヒト血漿とヒト末梢血リンパ球は同一個体のものを使用した。
【００２７】
［イチゴ抽出物の調製］
ＰＲＯ２５０ホモジナイザー(PRO Scientific)を用いて、イチゴを６，０００rpmで３０秒間破砕した。なお、この操作はイチゴを氷冷して行なった。次に、イチゴ破砕物に等量のＰＢＳを加え、８，３００×gで１時間、４℃で遠心した。遠心後の上澄み液を０．２２mmフィルター滅菌したものをイチゴ抽出物として、生体外アレルギー発症モデル培養系に５％（v/v）添加し、抗アレルギー効果を検討した。
【００２８】
［酵素抗体法によるＩｇＥ抗体産生量の測定］
培養上清中のＩｇＥ抗体産生量を酵素抗体法(ELISA; enzyme-linked immunosorbent assay)を用いて測定した。９６穴イムノプレートにヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体（Biosource）を炭酸緩衝液で２，０００倍に希釈し、１００ml/wellで分注してプレートコートした。３７℃で1時間静置した後、非特異的反応を防ぐために、リン酸緩衝食塩水（PBS）にウシ血清アルブミン（BSA; ICN）を１％に希釈した溶液（１％BSA/PBS）を３００ml/wellで分注し、ブロッキングを行った。その後、３７℃で１時間静置し、定量するＩｇＥ抗体を含む培養上清を１％BSA/PBSで１／８希釈し５０ml/wellで分注した。また、同様に１mg/mlから１／３ずつ１／３８mg/mlまで段階希釈した標準溶液を５０ml/wellずつ分注し、３７℃で１時間静置した。その後、ビオチン標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体（Biosource）を１％BSA/PBSで２，０００倍に希釈し、１００ml/wellで分注した後、３７℃で１時間静置した。その後、西洋わさび由来ペルオキシターゼが標識されたストレプトアビジン（Funakoshi）を１％BSA/PBS溶液で１，０００倍に希釈し、１００ml/wellで分注して３７℃で１時間静置した。発色液として０．００６％H2O2-0.2
Mクエン酸緩衝液（pH4.0）、６mg/ml ABTS
-(NH4)2（Wako）、超純水をそれぞれ１０：１：９の割合で混合した溶液を１００ml/wellで分注し、３０分後に４１４nmの波長により吸光度を測定した。各反応の間ではPBSにポリエチレン(20)ソルビタンモノラウレート（Tween20; Wako）を０．０５％濃度に希釈した溶液で３回洗浄した。図１は、イチゴ品種「あまおう」「とよのか」のＩｇＥ抗体生産抑制作用の効果を確認した結果を示すグラフである。図１に、このようにして抗アレルギー効果を確認した結果を示す。
【実施例２】
【００２９】
［活性画分の同定］
実施例１で調整したイチゴ抽出物を、ＩｇＥ抗体産生抑制効果を指標にして陰イオン交換樹脂（DEAE-650S）を用いて精製したところ、非吸着画分に活性成分が溶出した。さらに、陽イオン交換樹脂（SP550C）を用いてこの活性成分を含む画分を０．５Mの塩化ナトリウム溶液で精製した。さらに、分画分子量３０００Daの限外濾過を行った画分を調べたところＩｇＥ産生抑制効果が確認できたため、タンパク質解析を実施した。その結果、タンパク質のＮ末端側からAKIKIGINGFのアミノ酸配列を有するおよそ３６KDａタンパク質であることが判明し、これをタンパク質データベースで検索した結果、グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素と一致した。
【００３０】
［グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素の活性確認］
次に、グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素は広く生物が有する代謝酵素であるため、一般試薬として市販されているウサギ由来グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素標品を用いて、イチゴ精製品由来のグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素と活性比較したところ、同様にＩｇＥ産生抑制効果を有することが確認できた。なお、ウサギ由来グリセロアルデヒド３リン酸はイチゴ精製物中のグリセロアルデヒド３リン酸濃度が０．１〜１マイクログラム／ｍｌの範囲にあるため、比較のために、上限値と下限値である０．１マイクログラム／ｍｌと１マイクログラム／ｍｌを添加した場合を検証した。図２はイチゴ精製物とウサギ由来グリセロアルデヒド３リン酸とのＩｇＥ抗体生産抑制作用の比較を示したグラフである。このようにして確認した結果を図２に示す。図２中のコントロールは比較対照であり、とよのか精製物は本願発明のイチゴ精製物である。縦軸はＩｇＥ抗体の生産量を示している。対照が１８０ナノグラム／ミリリットルのＩｇＥ抗体生産量に対して、イチゴ精製物は１４０ナノグラム／ミリリットルと約２０％強の抗体生産抑制効果を示した。ウサギ由来のグリセロアルデヒド３リン酸も添加濃度の範囲内で、ほぼ同様の１４０ナノグラム／ミリリットル程度と約２０％の抗体生産抑制効果を示したことから、グリセロアルデヒド３リン酸にＩｇＥ抗体生産抑制作用が認められた。
【実施例３】
【００３１】
［グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素の生理活性］
イチゴ抽出物中の抗アレルギー成分の生理活性を調べるため、アトピー性皮膚炎症状を発症するモデルマウスであるNC/Ngaマウス（日本チャールス・リバー）とアレルギー性鼻炎症状を誘導したBALB/Cマウス（日本チャールス・リバー）を用いて食餌により症状改善の検討を行った。
【００３２】
アトピー性皮膚炎モデルマウスはPicryl Chloride塗布による皮膚炎誘導を行った。すなわち、Picryl
Chloride ５g をコニカルフラスコに入れ、１００％エタノールを４０ｍｌ加えて、フラスコをゆっくり暖め静かに混合しながら Picryl Chlorideを融解した。次に、溶液が黄色になったら加熱を止め、氷温の蒸留水を１０ml加え、すばやくフラスコを氷中に入れた後、Picryl Chloride の結晶化を行った。上清をガラス濾過器（ポアサイズ：
２０−３０μm）に通し、上に残った結晶を集めた。集めた結晶を２００mlの５０％エタノールに懸濁し、数分間静置した後、１００％エタノールで洗浄したガラス濾過器に通し、上に残った結晶を集めた。集めた結晶を２００mlの５０％エタノールに懸濁し、数分間静置した後、１００％エタノールで洗浄したガラス濾過器に通し、上に残った結晶を集めた。得られた結晶を濾紙の上に置き、結晶が内側に入るよう濾紙を折り曲げた。濾紙をアルミホイルなどで被って遮光し、室温で翌朝まで乾燥させた。この標品をPicryl Chlorideの精製品としてオリーブオイルに０．８〜１．０％になるよう溶解しマウスの体躯部の一部を剃毛して露出皮膚に塗布し、アトピー性皮膚炎症状の発症誘導を行った。
【００３３】
一方、アレルギー性鼻炎マウスは、水酸化アルミニウムを含むリン酸緩衝生理食塩水に精製スギ花粉抗原を５０μg/mlの濃度で溶解し、これを抗原液としてマウス腹空内に注射し、その５日後から毎日一回抗原液を経鼻投与して鼻炎を誘導した。
【００３４】
症状の改善効果を評価するため、アトピー性皮膚炎モデルマウスは、その皮膚炎の面積を０．５cm２で１点、１．０cm２で２点、２．０cm２で３点、３．０cm２で４点として、点数化した。図３はアトピー性皮膚炎モデルマウスを用いたイチゴ組成物の抗アレルギー効果を示したグラフである。この結果を図３に示す。図３のグラフは横軸にイチゴ抽出物の摂食日数を示し、縦軸は前述の皮膚炎の炎症点数を示したものである。なお点数が高いほど、炎症の程度が高いことを示している。対照実験もイチゴ摂取群も全体的に炎症の程度は同様な傾向を示しているが、摂取後２１日を過ぎる頃から、イチゴ摂取群は常に対照実験より炎症点数が低くなっている。したがって、イチゴ摂取による炎症の症状緩和が認められた。
【００３５】
免疫開始後から皮膚炎が発生し、その炎症程度は日を追うごとに悪化したのに対して、イチゴ抽出物を投与したマウス群では、炎症が治まる傾向が見られ、実験終了時には評価点で半分程度まで症状改善が進むことが分った。
【００３６】
図４は、アトピー性皮膚炎モデルマウスと鼻炎モデルマウスを用いたイチゴ組成物の抗アレルギー効果の検証写真である。図４（Ａ）がアトピー性皮膚炎モデルマウス、図４（Ｂ）が鼻炎モデルマウスの写真である。それぞれ左の写真の症状がイチゴ抽出物の摂食により右の写真のように改善した。アトピー性皮膚炎モデルマウスでは、イチゴの摂食により、皮膚炎が軽減されている様子がわかる。また、アレルギー性鼻炎モデルマウスでは、対照群はマウスの鼻周辺は脱毛が観察されるのに対し、イチゴ抽出物摂取群では、鼻炎が発症せず、結果的に鼻周辺の脱毛がないことが分かった。
【００３７】
なお、本願において、抗アレルギー効果を有する食品としては、種々の生物（植物・動物）に由来するグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素を含有してＩｇＥ抗体産生を抑制する食品であればよく、イチゴを品種改良する場合のほか、既存の他の果物や野菜を品種改良する場合への適用、さらには今後期待される様々な特徴を持つべく品種改良した新品種などにも適用できる。このことは、機能性食品分野における抗アレルギー効果を有する食品への大きな貢献となる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗アレルギー物質、抗アレルギー剤及び食品に関し、特に、ＩｇＥ抗体産生を抑制する生理活性物質として機能する抗アレルギー物質等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、都市型疾患である花粉症やハウスダストによるアレルギー患者数は急速に増大している。特に花粉症は全国民の１５〜２０％が患者であるとされている。さらに将来的に、この数字は増えるとも言われており、深刻化している状況である。一方で、花粉症の症状は、鼻水や咳、目の痒みなど生活上に多大な影響を与える疾患であるにも関わらず、致命的ではないため、多くは本人の忍耐に依存し、また、病院でも様々な治療法が試されているものの、決め手となる治療法はなく、症状が激しい場合にステロイド系の抗炎症剤による緩和治療を行っている現状である。
【０００３】
この強い炎症抑制作用をもつステロイド系の抗炎症剤は、ステロイドが生体内のホルモンの一部であるため体内では炎症抑制作用だけでなくホルモンとしての生理作用を有しているため、強い副作用も指摘されている。そのため、医師の厳密な管理の下で使用することが重要であり、また、患者はそうした副作用の影響を懸念する意見も多い。一方で、機能性食品は医薬のように疾病治癒を目指すものではないが、日常の食生活に取り入れることで、手軽に疾病予防や疾病の症状緩和をもたらすため、患者の生活の質を改善することが可能になる手段として大きな期待が寄せられている。
【０００４】
ところで、花粉症やアトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患は医学的にはＩ型アレルギー又は即時型アレルギーと呼ばれており、多くの研究者が発症メカニズムを研究している。今までに解明された知見によれば、以下のことが分かっている。まず、呼吸によって吸入されたアレルゲンである花粉は、体内の免疫反応としてＩｇＥ型の抗体と結合する。さらに、花粉とＩｇＥ抗体の結合物がマスト細胞（肥満細胞）と結合する。このことにより、このマスト細胞からヒスタミンやロイコトリエンという化学物質が放出され、これらの物質が鼻や目、気道の炎症を発生させる。つまり、花粉の体内侵入に対して、ＩｇＥ型の抗体がアレルギーの引き金物質となっている。したがって、ＩｇＥ型抗体の生体内における減少がアレルギー症状の抑制方法のひとつとなる。
【０００５】
一方、本願発明者達は、体内でＩｇＥ抗体生産に関わる免疫細胞を生体外に取り出して細胞培養することにより、対外でＩｇＥ抗体の生産を再現可能な実験系を構築してきた。なお、本願発明者達は、ヒトのアレルギーの体内動態をモデル化したヒト末梢血リンパ球細胞による培養系を独自に構築し、食品成分中から抗アレルギー効果を示す成分の特定を行ってきた。この技術は、従来、マウス等の実験動物を大量に用いて検査する手法と異なり、１０日前後の培養日数で数百種の検体を同時に検査できるため、極めて効率が高い。さらに、ヒト細胞を用いることから、探索した因子中の効果のある成分が見いだされた場合、生体でも効果を発揮する可能性が高く、探索に必要な時間的な短縮も可能である。また、探索した因子と細胞の相互作用を検討することで、因子の作用メカニズムを細胞レベルで解明できるため、食品機能の科学的な評価が可能であるなどの多くの優れた利点を有する（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３３（２０００）ｐｐ．３３−４０ 発行所Ｅｌｓｅｖｉｅｒ社
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記したようにステロイド系の抗炎症剤を持続的に投与した場合には副作用の点で問題がある一方で、日常的な食生活等でこうした症状を緩和するための既存の食品ではその有効性が十分ではないという問題があった。
【０００８】
一方で、本願発明者達は、上記した実験系を構築しており、この実験系を用いてＩｇＥ生産を抑制する効果がある物質のスクリーニングを行っていける状況にあった。
【０００９】
ゆえに、本発明は、ＩｇＥ産生抑制によりアレルギー疾患の治療やアレルギー症状の緩和が可能で、かつ、ステロイドのような副作用を生じず、長期間の服用が可能な高い安全性を有する物質を同定し、その物質を含有する抗アレルギー物質を提供し、さらに同定された物質を組成として含む抗アレルギー剤（医薬品）及び抗アレルギー効果を有する機能性食品と言われる食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者達は、前述の課題を解決するために、ＩｇＥ抗体の産生実験系を用いて様々なイチゴの抽出物を培養系内に添加してＩｇＥ生産を抑制する効果がある物質をスクリーニングするという研究を行った。その結果、イチゴの粗抽出物液中にＩｇＥ抗体産生抑制効果があることを見いだした。さらに、この粗抽出物液に対してＩｇＥ抗体産生抑制効果を指標に精製した結果、精製分画物により、もっとも強い活性を示す成分が代謝酵素の一つであるグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素（GAPDH）であることを突き止めた。さらに、研究を進めるため、このグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素が様々な生物の保有する酵素であることから、他の生物由来の成分としてウサギ由来グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素も同様に試験したところ、イチゴ由来のグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素と同様にＩｇＥ抗体産生抑制効果を示したことから、グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素にＩｇＥ抗体産生抑制作用があることを突き止めた。
【００１１】
したがって、本発明の第一の観点は、抗アレルギー物質として、ＩｇＥ抗体の産生を抑制するための成分としてグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素が含まれることを特徴とするものである。
【００１２】
ここで、当該成分は、日常生活における簡易摂取を可能にするということが期待されることから、食品として提供されることが望ましい。特に本成分の発見の根拠となったイチゴは、嗜好性の高い食品であるが、市場でも人気の高い食品の一つであり、生食、加工食品（飲料や飴、氷菓など）にも利用されているので、食品としての適用に特に有利である。
【００１３】
したがって、本発明の第二の観点は、グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素を含む組成が食品の形態であることを特徴とする。
【００１４】
一方、本発明の第三の観点は、グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素が抗アレルギー剤の有効成分として含有されることにより、アレルギー予防、治療に用いられることを可能にする。
【００１５】
なお、抗アレルギー効果を有するグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素がイチゴに限らず全ての生物に含まれている。この酵素は、生物の代謝に関わる酵素として知られているが、本願で判明したように抗アレルギー効果という点では捉えられてはいなかったものの、他の幅広い生物に含まれているものであってもＩｇＥ抗体の産生を抑制するための成分として抗アレルギー効果を有すると考えられる。そのため、食品の場合においてもグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素がイチゴ由来のものに限られる必要は必ずしもなく食品の成分として適切なものに由来するものであればよい。また、抗アレルギー剤が経口投与の医薬品であれば食品と同様な観点からの選択になる傾向はあり得るが、抗アレルギー物質として含まれた化粧品の場合も含め、それぞれの商品として用いられる用途に合わせて幅広い生物の中から適切なものに由来するものが選択されればよい。
【発明の効果】
【００１６】
本願の発明によれば、グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素をＩｇＥ産生抑制という抗アレルギー効果を有する成分の一つとして同定できたので、アレルギー疾患の治療やアレルギー症状の緩和が可能で、かつ、ステロイドのような副作用を生じず、長期間の服用が可能な高い安全性を有する抗アレルギー物質が得られたとともに、抗アレルギー剤（医薬品）及び機能性食品も得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】イチゴ品種「あまおう」「とよのか」のＩｇＥ抗体生産抑制作用の効果を確認した結果を示すグラフである。
【図２】イチゴ精製物とウサギ由来グリセロアルデヒド３リン酸とのＩｇＥ抗体生産抑制作用の比較を示したグラフである。
【図３】アトピー性皮膚炎モデルマウスを用いたイチゴ組成物の抗アレルギー効果を示したグラフである。
【図４】アトピー性皮膚炎モデルマウスと鼻炎モデルマウスを用いたイチゴ組成物の抗アレルギー効果の検証写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
まず、本発明に関わるグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素は種々の生物が有する酵素タンパク質であり、そのアミノ酸組成はイチゴ由来のグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素のアミノ酸組成と必ずしも完全な一致を要求しない。
【００１９】
イチゴは、一般に広く生食され、さらに加工食品等でも利用されている。したがって、摂食しても人体に悪影響はなく、安全性の高い食品であることが認められている。このことより、本発明で使用するグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素を主体とするイチゴ抽出物も安心して摂取可能である。
【００２０】
本発明で使用するグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素は、「あまおう」や「とよのか」などのイチゴ果肉を水系溶剤で抽出して得ることができる。抽出物が食品や化粧剤に利用可能であることを考慮し、安全性の面で、水系溶剤を用いるのが好ましい。
【００２１】
また、成分の摂取濃度は、アレルギー患者の年齢や性別、病状などに応じ個別に決定されるべきものであるが、組成物に対して５重量％〜１００重量％であることが好ましい。
【００２２】
本発明の組成物は、例えば、医薬や食品に用いることができる。医薬品の場合には、経口投与が好ましい。したがって、一般的に医薬の製剤添加物として用いられるソルビトール、ゼラチン、乳糖、ブドウ糖、デンプン、クエン酸などと混合して製剤することが可能である。また、本発明の組成物は、固体、液体、ゲル状等の形状の食品に配合することも可能である。その配合は、公知の任意の製造方法で行うことができるため、例えば、アイスクリームやチョコレート、キャンディ、清涼飲料水などに配合することができる。
【００２３】
以下に本発明の実施例を例示するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
［試料］
本実施例で用いたイチゴ試料の品種は、市販の「あまおう」「とよのか」である。
【００２５】
［リンパ球の分離］
ヒト末梢リンパ球を取得するために健常者の末梢血を密度勾配遠心法により、血液分離した。まず,健常人から末梢血をヘパリン入り真空管に採集し、あらかじめ１５ml遠心管に分注しておいた４mlの血液分離剤（Ficoll; GE Healthcare）の上に液面を乱さないように５mlの末梢血を重層し、４００×g、３０minの条件で遠心した。そして、最上層の血漿の層を取得し、−２４℃で保存した。次に、血漿層とFicoll層の間にあるリンパ球を回収後、基本合成培地ＥＲＤＦ（Kyokuto
Seiyaku）で洗浄し、４００×g、５ｍｉｎの条件で遠心、洗浄を３回繰り返した。取得したリンパ球は、−８５℃で凍結保存し、解凍後はリンパ球をＥＲＤＦ培地で洗浄して使用した。
【００２６】
［生体外アレルギー発症モデル細胞培養系］
５％ウシ胎児血清(FBS; Trace)及び１０％ヒト血漿を含むＥＲＤＦ培地中に、生体外に取り出した２．５×１０６ cells/mlのヒト末梢血リンパ球と免疫賦活剤としてムラミルジペプチド(MDP;
SIGMA)を１０ mg/ml、インターロイキン−２、−４、−６(IL−２、−４、−６; R＆D)を１０ ng/ml、さらにスギ花粉抗原(Cryj1; HAYASHIBARA)を１００ ng/mlの終濃度で加え、生体外アレルギー発症モデル培養系とした。添加した免疫賦活剤の主な働きは、ＭＤＰによる抗原への免疫応答を高めるアジュバンド活性、IL−２によるＴ細胞の増殖・分化の促進、IL−４によるＩｇＥクラススイッチ誘導、IL−６によるＢ細胞の分化誘導である。これらの免疫賦活剤とCryj1を加えたヒト末梢血リンパ球を９６穴プレートに各２００ml分注し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにて１０日間培養してＩｇＥ抗体産生を誘導した。なお、この培養系に含まれるヒト血漿とヒト末梢血リンパ球は同一個体のものを使用した。
【００２７】
［イチゴ抽出物の調製］
ＰＲＯ２５０ホモジナイザー(PRO Scientific)を用いて、イチゴを６，０００rpmで３０秒間破砕した。なお、この操作はイチゴを氷冷して行なった。次に、イチゴ破砕物に等量のＰＢＳを加え、８，３００×gで１時間、４℃で遠心した。遠心後の上澄み液を０．２２mmフィルター滅菌したものをイチゴ抽出物として、生体外アレルギー発症モデル培養系に５％（v/v）添加し、抗アレルギー効果を検討した。
【００２８】
［酵素抗体法によるＩｇＥ抗体産生量の測定］
培養上清中のＩｇＥ抗体産生量を酵素抗体法(ELISA; enzyme-linked immunosorbent assay)を用いて測定した。９６穴イムノプレートにヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体（Biosource）を炭酸緩衝液で２，０００倍に希釈し、１００ml/wellで分注してプレートコートした。３７℃で1時間静置した後、非特異的反応を防ぐために、リン酸緩衝食塩水（PBS）にウシ血清アルブミン（BSA; ICN）を１％に希釈した溶液（１％BSA/PBS）を３００ml/wellで分注し、ブロッキングを行った。その後、３７℃で１時間静置し、定量するＩｇＥ抗体を含む培養上清を１％BSA/PBSで１／８希釈し５０ml/wellで分注した。また、同様に１mg/mlから１／３ずつ１／３８mg/mlまで段階希釈した標準溶液を５０ml/wellずつ分注し、３７℃で１時間静置した。その後、ビオチン標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体（Biosource）を１％BSA/PBSで２，０００倍に希釈し、１００ml/wellで分注した後、３７℃で１時間静置した。その後、西洋わさび由来ペルオキシターゼが標識されたストレプトアビジン（Funakoshi）を１％BSA/PBS溶液で１，０００倍に希釈し、１００ml/wellで分注して３７℃で１時間静置した。発色液として０．００６％H2O2-0.2
Mクエン酸緩衝液（pH4.0）、６mg/ml ABTS
-(NH4)2（Wako）、超純水をそれぞれ１０：１：９の割合で混合した溶液を１００ml/wellで分注し、３０分後に４１４nmの波長により吸光度を測定した。各反応の間ではPBSにポリエチレン(20)ソルビタンモノラウレート（Tween20; Wako）を０．０５％濃度に希釈した溶液で３回洗浄した。図１は、イチゴ品種「あまおう」「とよのか」のＩｇＥ抗体生産抑制作用の効果を確認した結果を示すグラフである。図１に、このようにして抗アレルギー効果を確認した結果を示す。
【実施例２】
【００２９】
［活性画分の同定］
実施例１で調整したイチゴ抽出物を、ＩｇＥ抗体産生抑制効果を指標にして陰イオン交換樹脂（DEAE-650S）を用いて精製したところ、非吸着画分に活性成分が溶出した。さらに、陽イオン交換樹脂（SP550C）を用いてこの活性成分を含む画分を０．５Mの塩化ナトリウム溶液で精製した。さらに、分画分子量３０００Daの限外濾過を行った画分を調べたところＩｇＥ産生抑制効果が確認できたため、タンパク質解析を実施した。その結果、タンパク質のＮ末端側からAKIKIGINGFのアミノ酸配列を有するおよそ３６KDａタンパク質であることが判明し、これをタンパク質データベースで検索した結果、グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素と一致した。
【００３０】
［グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素の活性確認］
次に、グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素は広く生物が有する代謝酵素であるため、一般試薬として市販されているウサギ由来グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素標品を用いて、イチゴ精製品由来のグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素と活性比較したところ、同様にＩｇＥ産生抑制効果を有することが確認できた。なお、ウサギ由来グリセロアルデヒド３リン酸はイチゴ精製物中のグリセロアルデヒド３リン酸濃度が０．１〜１マイクログラム／ｍｌの範囲にあるため、比較のために、上限値と下限値である０．１マイクログラム／ｍｌと１マイクログラム／ｍｌを添加した場合を検証した。図２はイチゴ精製物とウサギ由来グリセロアルデヒド３リン酸とのＩｇＥ抗体生産抑制作用の比較を示したグラフである。このようにして確認した結果を図２に示す。図２中のコントロールは比較対照であり、とよのか精製物は本願発明のイチゴ精製物である。縦軸はＩｇＥ抗体の生産量を示している。対照が１８０ナノグラム／ミリリットルのＩｇＥ抗体生産量に対して、イチゴ精製物は１４０ナノグラム／ミリリットルと約２０％強の抗体生産抑制効果を示した。ウサギ由来のグリセロアルデヒド３リン酸も添加濃度の範囲内で、ほぼ同様の１４０ナノグラム／ミリリットル程度と約２０％の抗体生産抑制効果を示したことから、グリセロアルデヒド３リン酸にＩｇＥ抗体生産抑制作用が認められた。
【実施例３】
【００３１】
［グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素の生理活性］
イチゴ抽出物中の抗アレルギー成分の生理活性を調べるため、アトピー性皮膚炎症状を発症するモデルマウスであるNC/Ngaマウス（日本チャールス・リバー）とアレルギー性鼻炎症状を誘導したBALB/Cマウス（日本チャールス・リバー）を用いて食餌により症状改善の検討を行った。
【００３２】
アトピー性皮膚炎モデルマウスはPicryl Chloride塗布による皮膚炎誘導を行った。すなわち、Picryl
Chloride ５g をコニカルフラスコに入れ、１００％エタノールを４０ｍｌ加えて、フラスコをゆっくり暖め静かに混合しながら Picryl Chlorideを融解した。次に、溶液が黄色になったら加熱を止め、氷温の蒸留水を１０ml加え、すばやくフラスコを氷中に入れた後、Picryl Chloride の結晶化を行った。上清をガラス濾過器（ポアサイズ：
２０−３０μm）に通し、上に残った結晶を集めた。集めた結晶を２００mlの５０％エタノールに懸濁し、数分間静置した後、１００％エタノールで洗浄したガラス濾過器に通し、上に残った結晶を集めた。集めた結晶を２００mlの５０％エタノールに懸濁し、数分間静置した後、１００％エタノールで洗浄したガラス濾過器に通し、上に残った結晶を集めた。得られた結晶を濾紙の上に置き、結晶が内側に入るよう濾紙を折り曲げた。濾紙をアルミホイルなどで被って遮光し、室温で翌朝まで乾燥させた。この標品をPicryl Chlorideの精製品としてオリーブオイルに０．８〜１．０％になるよう溶解しマウスの体躯部の一部を剃毛して露出皮膚に塗布し、アトピー性皮膚炎症状の発症誘導を行った。
【００３３】
一方、アレルギー性鼻炎マウスは、水酸化アルミニウムを含むリン酸緩衝生理食塩水に精製スギ花粉抗原を５０μg/mlの濃度で溶解し、これを抗原液としてマウス腹空内に注射し、その５日後から毎日一回抗原液を経鼻投与して鼻炎を誘導した。
【００３４】
症状の改善効果を評価するため、アトピー性皮膚炎モデルマウスは、その皮膚炎の面積を０．５cm２で１点、１．０cm２で２点、２．０cm２で３点、３．０cm２で４点として、点数化した。図３はアトピー性皮膚炎モデルマウスを用いたイチゴ組成物の抗アレルギー効果を示したグラフである。この結果を図３に示す。図３のグラフは横軸にイチゴ抽出物の摂食日数を示し、縦軸は前述の皮膚炎の炎症点数を示したものである。なお点数が高いほど、炎症の程度が高いことを示している。対照実験もイチゴ摂取群も全体的に炎症の程度は同様な傾向を示しているが、摂取後２１日を過ぎる頃から、イチゴ摂取群は常に対照実験より炎症点数が低くなっている。したがって、イチゴ摂取による炎症の症状緩和が認められた。
【００３５】
免疫開始後から皮膚炎が発生し、その炎症程度は日を追うごとに悪化したのに対して、イチゴ抽出物を投与したマウス群では、炎症が治まる傾向が見られ、実験終了時には評価点で半分程度まで症状改善が進むことが分った。
【００３６】
図４は、アトピー性皮膚炎モデルマウスと鼻炎モデルマウスを用いたイチゴ組成物の抗アレルギー効果の検証写真である。図４（Ａ）がアトピー性皮膚炎モデルマウス、図４（Ｂ）が鼻炎モデルマウスの写真である。それぞれ左の写真の症状がイチゴ抽出物の摂食により右の写真のように改善した。アトピー性皮膚炎モデルマウスでは、イチゴの摂食により、皮膚炎が軽減されている様子がわかる。また、アレルギー性鼻炎モデルマウスでは、対照群はマウスの鼻周辺は脱毛が観察されるのに対し、イチゴ抽出物摂取群では、鼻炎が発症せず、結果的に鼻周辺の脱毛がないことが分かった。
【００３７】
なお、本願において、抗アレルギー効果を有する食品としては、種々の生物（植物・動物）に由来するグリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素を含有してＩｇＥ抗体産生を抑制する食品であればよく、イチゴを品種改良する場合のほか、既存の他の果物や野菜を品種改良する場合への適用、さらには今後期待される様々な特徴を持つべく品種改良した新品種などにも適用できる。このことは、機能性食品分野における抗アレルギー効果を有する食品への大きな貢献となる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素を有効成分として含有してＩｇＥ抗体産生を抑制する、抗アレルギー物質。
【請求項２】
グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素を有効成分として含有してＩｇＥ抗体産生を抑制する、抗アレルギー剤。
【請求項３】
グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素を含有してＩｇＥ抗体産生を抑制し、抗アレルギー効果を有する食品。
【請求項４】
前記グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素はイチゴ由来のものである、請求項３記載の食品。
【請求項１】
グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素を有効成分として含有してＩｇＥ抗体産生を抑制する、抗アレルギー物質。
【請求項２】
グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素を有効成分として含有してＩｇＥ抗体産生を抑制する、抗アレルギー剤。
【請求項３】
グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素を含有してＩｇＥ抗体産生を抑制し、抗アレルギー効果を有する食品。
【請求項４】
前記グリセロアルデヒド３リン酸脱水素酵素はイチゴ由来のものである、請求項３記載の食品。
【図３】
【図１】
【図２】
【図４】
【図１】
【図２】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−２２９１６４（Ｐ２０１２−２２９１６４Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−９６５１２（Ｐ２０１１−９６５１２）
【出願日】平成２３年４月２２日（２０１１．４．２２）
【出願人】（５０４２３７０５０）独立行政法人国立高等専門学校機構 (656)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月２２日（２０１１．４．２２）
【出願人】（５０４２３７０５０）独立行政法人国立高等専門学校機構 (656)
【Ｆターム（参考）】
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