抗イヌ歯周病組成物
【課題】イヌの歯周病を予防及び／又は治療するための有効でかつ安全性の高い手段を提供する。
【解決手段】Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに由来するプロテアーゼで免疫した鳥類が産生した卵及び／又はその処理物を含むイヌの歯周病を予防及び／又は治療するための組成物、並びに該卵又はその処理物の有効量をイヌに投与することを含むイヌの歯周病を予防及び／又は治療する方法。
【解決手段】Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに由来するプロテアーゼで免疫した鳥類が産生した卵及び／又はその処理物を含むイヌの歯周病を予防及び／又は治療するための組成物、並びに該卵又はその処理物の有効量をイヌに投与することを含むイヌの歯周病を予防及び／又は治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イヌの歯周病を予防及び／又は治療するための組成物、並びにイヌの歯周病を予防及び／又は治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病は、歯周縁下プラークの細菌によって惹起される感染症で、現代人においては最も罹患率の高い感染症の一つである。歯周病が、最近、特に注目されている理由の一つは、歯牙喪失の最大の原因となり口腔機能の低下や各種神経機能の破綻を招くだけでなく、口臭や早産及び低体重児出産の原因ともなり、さらには心循環系疾患、糖尿病、心内膜炎、骨粗しょう症などの、全身性疾患のハイリスクファクターになるということである。従って、歯周病の克服は歯科領域ばかりではなく、他の臨床分野においても緊急な対応が迫られている重要課題となっている。しかしながら、これまでの多くの研究にもかかわらず歯周病の病因の解明や予防・治療に向けた対策の確立は十分ではなかった。
【０００３】
そこで、発明者らは、本病の分子標的を主要な歯周病原性細菌であるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ジンジバリス菌）が産生する２種類のプロテアーゼに注目して研究を進めてきた。一つはアルギニン残基を特異的に認識してそのＣ末端側で切断するＡｒｇ−ジンジパイン（Ｒｇｐ）、もう一つは、リジン残基を特異的に認識してＣ末端側で切断するＬｙｓ−ジンジパイン（Ｋｇｐ）である。これら二つのプロテアーゼ活性を合わせると、本菌が産生するプロテアーゼ活性全体の８５％以上を占める。それらには膜結合型と分泌型の両方が存在している。
【０００４】
これらのジンジパインは口腔環境にあるタンパク質を分解してジンジバリス菌の発育増殖に不可欠なアミノ酸を栄養源として供給する一方、ジンジバリス菌の接着や赤血球凝集及びヘム鉄獲得など重要な役割を果たしている。また、宿主に対しては、色々な生体タンパク質を強力に分解して多彩な病原性機能を発揮している。
【０００５】
発明者らはこれらの技術情報をもとに、ジンジバリス菌に由来するジンジパインＲｇｐ及びＫｇｐを抗原として鶏に免疫して得られた鶏卵から精製した鶏卵抗体が成人の歯周病に対して有効で、かつ安全性が高いことを明らかにした（特許文献１）。
【０００６】
最近、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属の菌種が歯周病に罹患したイヌ及びネコのプラークからしばしば分離され、その分離頻度は加齢に伴って増加することが報告されている（非特許文献１）。これらペットの歯周病症状はほとんど同じであり、８歳から１０歳で歯牙喪失が起こることは珍しくない。治療は、スケーリング・プランニングした後、ミノサイクリン又はクリンダマイシンなどの抗生物質を投与することが一般的であるが、耐性菌の出現が危惧される（非特許文献２及び３）。
【０００７】
Ｊ．Ｈａｒｄｈａｍらは、ペットの歯周病ワクチンの研究について報告している（非特許文献４）。彼らはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ Ｂ４３株を用いて不活化ワクチンを作成して、Ｂａｌｂ／ｃＣｙＪマウスに２回皮下注射して免疫した後、ホモ株又はヘテロ株（Ｐ．ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓ，Ｂ１０６）で、２回経口チャレンジし、本ワクチンの有効性をマウスの下顎歯槽骨吸収の程度をスコア化することにより評価した。その結果、ホモ株であるＰ．ｇｕｌａｅ Ｂ４３株又はヘテロ株であるＰ．ｓａｌｉｖｏｓａ Ｂ１０４でチャレンジした時だけ有効性が検証できた。これに対し、ホモ株であるＰ．ｇｕｌａｅ Ｂ６９又はヘテロ株であるＰ．ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓ Ｂ１０６チャレンジしたところ、有効性は検証できなかった。Ｐ．ｇｕｌａｅ Ｂ４３株を用いて製造したモノバレント不活化ワクチンは交差防御効果を示さなかったことから、Ｐ．ｇｕｌａｅ、Ｐ．ｓａｌｉｖｏｓａ及びＰ．ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓからなる３種混合ワクチンの必要性が示唆された。
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−３６６６１
【非特許文献１】Ｈ．Ｉｓｏｇａｉら、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ Ｂ ４６，４６７−４７３（１９９９）
【非特許文献２】Ｍ．Ｈｉｒａｓａｗａら、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ，６１，１３４９−１３５２（２０００）
【非特許文献３】中出哲也ら、動物抗菌会報、２６，４５−５１（２００４）
【非特許文献４】Ｊ．Ｈａｒｄｈａｍら、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１０６，１１９−１２８（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、イヌの歯周病を予防及び／又は治療するための有効でかつ安全性の高い手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のプロテアーゼを抗原として鳥類に免疫して得られる鶏卵抗体が、成人の歯周病に対して有効であるが、ネコの歯周病に対しては効果がないこと、すなわち、上記鶏卵抗体は特定の哺乳動物の歯周病に有効であることを見出した。本発明者らはまた、イヌ及びネコの歯周病症状はほとんど同じであるにもかかわらず、上記鶏卵抗体がイヌの歯周病に対しては有効であることを見出した。さらには、上記鶏卵抗体が、イヌ由来のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐ．ｇｕｌａｅ、Ｐ．ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓ及びＰ．ｓａｌｉｖｏｓａに対して交差防御効果を有し、イヌの歯周病を効果的に予防及び／又は治療できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに由来するプロテアーゼで免疫した鳥類が産生した卵及び／又はその処理物を含む、イヌの歯周病を予防及び／又は治療するための組成物。
（２）プロテアーゼとして、Ａｒｇ−ジンジパイン、Ｌｙｓ−ジンジパイン又はこれらの組み合わせを用いる、（１）記載の組成物。
（３）Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに由来するプロテアーゼで免疫した鳥類が産生した卵又はその処理物の有効量をイヌに投与することを含む、イヌの歯周病を予防及び／又は治療する方法。
（４）プロテアーゼとして、Ａｒｇ−ジンジパイン、Ｌｙｓ−ジンジパイン又はこれらの組み合わせを用いる、（３）記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、イヌの歯周病を誘導する原因因子を制御し、イヌの歯周病の治療と予防を、効果的かつ安全に実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに由来するプロテアーゼで免疫する鳥類としては、特に限定されないが、通常、鶏、鶉、アヒル等の家禽が挙げられる。抗体の量産性という観点から、鶏、特に、産卵種を用いるのが好ましい。
【００１４】
本発明に用いるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは、哺乳動物から採取されるものであればよく、ヒトから採取されるものでも、イヌから採取されるものでもよく、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から購入できる。具体的には、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ＡＴＣＣ３３２７７）を用いることができる。
【００１５】
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに由来するプロテアーゼとしては、例えば、Ａｒｇ−ジンジパイン（Ｒｇｐ）及びＬｙｓ−ジンジパイン（Ｋｇｐ）が挙げられる。ＲｇｐとＫｇｐは、それぞれ単独で用いて鳥類を免疫してもよいし、組み合わせて用いて鳥類を免疫してもよい。これらのプロテアーゼは、例えば、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの培養菌体を超音波処理し、硫酸アンモニウムなどによって塩析することによって精製することができる。望ましくは塩析沈降物をＭｏｎｏ−Ｑアフィニティーカラム等で精製して用いる。
【００１６】
鳥類に免疫する方法としては抗原単独又は２種以上を組み合わせて免疫することができ、その際アジュバントと共に皮下、筋肉内、鼻又は目へ免疫する方法、飼料又は水と共に経口的に免疫する方法等、通常の方法が採用できる。鳥類を前記の抗原で免疫する際には、必要に応じてフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、オイルアジュバント又はアルミニウムアジュバント等のアジュバントを用いることもできる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、３〜１０回の免疫を行う。通常、初回免疫から数週間で投与抗原に対して特異的に反応する抗体が卵、特に卵黄中に得られる。接種する抗原量はタンパク質量で、０．０１〜１０ｍｇが好適に用いられる。
【００１７】
卵中の抗体価は、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、菌体凝集反応、毒素又はウイルス中和試験などで測定することができ、免疫後に２週程度の間隔で鶏卵を採取して抗体価を測定することにより抗体価の推移を追跡できる。通常、約４ヶ月間にわたって高い抗体価を得ることができる。なお、免疫後、抗体価の減少が見られた場合、適当な間隔で適宜追加免疫することにより抗体価を高く維持することができる。
【００１８】
本発明において、卵処理物は、鳥類の免疫に使用した免疫原に対する抗体を含むものであれば特に制限されず、例えば、免疫した卵の全卵、卵黄及び卵白、これらの卵液及び溶液、ならびに卵液をプロパノールやクロロホルムを用いて抽出した抽出物等が含まれる。含まれる抗体の量の観点から、卵黄成分を含むことが好ましい。スプレードライ法や凍結乾燥法などにより粉末化したものも含まれる。また、卵黄に水を加えて脂質成分を除去したり、卵黄からヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸や、プロパノール、エタノール、ヘキサン等の有機溶剤などを用いる方法により卵黄脂質成分を除去した後粉末化したものも含まれる。このような粉末をペースト状又は液状にしたものも含まれる。更に、本発明において卵の処理物には、硫酸アンモニウム塩析、硫酸ナトリウム塩析、低温エタノール沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法により卵から精製された抗体自体をも包含される。処理物の保存性を高めるためには、殺菌した全卵液卵又は卵黄液卵をスプレードライ又は凍結乾燥して粉末化するのが好ましい。以下、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに由来するプロテアーゼで免疫した鳥類が産生した卵及びその処理物を、本発明の卵及び卵処理物と称する。
【００１９】
本発明の卵及び卵処理物は、抗体価が１．２ｘ１０５倍以上、好ましくは２．５〜５．０ｘ１０５倍であることを特徴とする。前記の抗体価は、ＥＬＩＳＡによって測定することができる。
【００２０】
前記のようにして得られる卵及び卵処理物は、イヌの歯周病の予防及び／又は治療に有効である。したがって、本発明の卵及び／又はその処理物を、特定保健用食品等の食品又は医薬組成物に配合することにより、イヌの歯周病を治療又は予防するための組成物を製造することができる。本発明において歯周病とは、歯の周囲の組織、例えば、歯肉や骨における感染症をさし、歯肉炎、歯周炎及び歯槽膿漏を包含する。
【００２１】
本発明の組成物の形態は特に制限されず、例えば、飼料、サプリメント及び医薬組成物の形態とすることができる。組成物の剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、液剤、懸濁剤、吸入剤などの経口剤、坐剤などの経腸製剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤などの外用剤、点滴剤、注射剤などが挙げられる。これらのうちでは、経口剤及び外用剤が好ましい。このような剤型の組成物は、本発明の卵及び／又は卵処理物に、慣用の添加剤を剤型に応じて配合し、常法に従って製造することができる。
【００２２】
添加剤には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、着色剤、矯味剤などがあり、必要に応じて使用する。口腔内で長時間作用できるように徐放化するためには、既知の遅延剤等でコーティングすることもできる。賦形剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、軽質無水ケイ酸、ゼラチン、結晶セルロース、ソルビトール、タルク、デキストリン、デンプン、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム等が使用できる。結合剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、エタノール、エチルセルロース、カゼインナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、精製水、ゼラチン、デンプン、トラガント、乳糖、ヒドロキシセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油、ショ糖脂肪酸エステル、ロウ類等が挙げられる。抗酸化剤としては、トコフェロール、没食子酸エステル、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、アスコルビン酸等が挙げられる。
【００２３】
本発明の組成物には、さらに、各種油脂、生薬、アミノ酸、多価アルコール、天然高分子、ビタミン、ミネラル、食物繊維、界面活性剤、安定剤、ｐＨ調製剤、酸化防止剤、甘味料、呈味成分、酸味料及び香料などを配合してもよい。その他の有効成分、例えば、抗生剤、抗ＴＮＦ−α抗体などを配合してもよい。
【００２４】
本発明の組成物において、有効成分である卵及び／又は卵処理物は、抗体の質量を基準として、乾燥質量に基づいて、飼料では通常０．０１〜１質量％、サプリメントでは通常０．１〜１．０質量％、医薬組成物では通常０．５〜１０重量％配合することが好ましいが、目的によって前記の範囲よりも少なく又は多く配合することもできる。
【００２５】
本発明の卵及び／又はその処理物の有効量をイヌに投与することにより、イヌの歯周病を予防及び／又は治療することができる。本発明の卵及び／又はその処理物は、そのまま、あるいは上記のような組成物の形態で投与することができる。有効量とは、例えば、医師によって探索される、動物の生理学的または医学的応答を引き出すのに十分な量を意味し、より具体的には、そのような量の投与を受けなかった対応する被験体と比較したときに、疾患、障害、もしくは副作用の、治療、治癒、予防の向上、もしくは改善をもたらすような量、または疾患もしくは障害の進行速度の低減をもたらすような量を意味する。
【００２６】
本発明の卵及び／又はその処理物の投与量は、特に制限されないが、１日当たり、体重１ｋｇあたり、抗体の質量を基準として、乾燥質量に基づいて、通常２５〜４５ｍｇ、好ましくは９０〜１８０ｍｇである。
【００２７】
本発明の卵及び／又はその処理物を投与する対象となるイヌは、特に制限されないが、好ましくは歯周病に罹患したイヌ、歯周病に罹患する可能性のあるイヌ、例えば、３歳以上のイヌである。
【００２８】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００２９】
実施例１：抗Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓジンジパイン鶏卵抗体の交差反応性
（１）プロテアーゼ（ジンジパイン）の調製
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ＡＴＣＣ３３２７７）は、１０％無菌ウマ脱繊血加ブルセラＨＫ寒天培地（極東製薬）を用いて嫌気性培養を行った。発育したコロニーを釣菌して、イーストエキストラクト、ヘミン、Ｌ−システイン及びメナジオンを添加したトリプチケース・ソイ・ブロース液体培地（ＢＤ）に移植した。同培地に炭酸ガスを吹き込みながら３７℃で４８時間振とう培養（５０ｒｐｍ）を行った。
【００３０】
培養菌体は１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心して集菌し、その後、ＰＢＳで３回洗浄し、ペレットはトリス緩衝液（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−１Ｍ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）に浮遊させた。ジンジパインを抽出するため超音波処理を行い（１５０ワットで１分、これを６回繰り返した）、精製は硫酸アンモニウムで塩析することにより粗精製し、さらに、Ｍｏｎｏ−Ｑアフィニティーカラム（ファルマシア）で精製した。溶出緩衝液としては、上記の緩衝液に１Ｍ ＮａＣｌを加えたものを使用した。回収した主要ピークは、全プロテアーゼ活性の８０％以上を占めるものであった。本調製方法によって、イヌ由来Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐ．ｇｕｌａｅ、Ｐ．ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓ及びＰ．ｓａｌｉｖｏｓａ菌体からも効率よくジンジパインを回収できた。
【００３１】
（２）抗Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓジンジパイン鶏卵抗体の調製
免疫鶏は約５ヶ月齢の白色レグホン種（ハイラインＷ３６、株式会社ゲン・コーポレーション）を用いた。免疫原は精製したジンジパインにオイルアジュバントを加えて乳化させたものを用いた。初回免疫は鶏の左右の胸筋部位に各０．５ｍｌ（タンパク質量は１ｍｇ）を注射することによって行った。初回免疫後８週目に同じ方法でブスター免疫注射を実施し、その２週間後から免疫卵を回収した。免疫卵は卵白と卵黄を分離し、卵黄脂質成分を除去するため、卵黄重量と等量のＰＢＳ（ｐＨ７．５）を加えて攪拌した後、さらに等量のクロロホルムを添加してよく攪拌し、遠心して水溶性画分を得た。抗体の精製は硫酸アンモニウムを用いる塩析によって行った。脱塩した後、凍結乾燥によって約１０ｋｇの精製抗体粉末を得た（以下、抗ジンジパイン鶏卵抗体と称する）。以下の実施例はこのサンプルを用いて実施した。なお、対照として、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のジンジパインに対して特異性を示さないことが確認された抗ピロリ菌ウレアーゼ精製抗体（以下、陰性鶏卵抗体と称する）を使用した。
【００３２】
（３）ＥＬＩＳＡ
（２）で調製した抗ジンジパイン鶏卵抗体のイヌ由来各種ジンジパインに対する特異性をＥＬＩＳＡによって検証した。
【００３３】
各種ジンジパインは０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解した抗原（５μｇ／ｍｌ）を９６穴マイクロプレートの各ウエルに１００μｌ加えた後、固相化するため４℃で１８時間静置した。各ウエルの抗原液を除去し、非特異反応をブロックするため３％ウシ血清アルブミン添加ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を各ウエルに１５０μｌ加えて３７℃で６０分静置した。各ウエルのブロッキング液を除去した後、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０−ＰＢＳを用いて３回洗浄した。次に、抗ジンジパイン鶏卵抗体及び陰性鶏卵抗体を上記洗浄液に溶解し、各ウエルに１００μｌずつ加えプレートを３７℃で６０分反応させた。各ウエルを３回洗浄した後、２次抗体としてホースラデッシュ・パーオキシダーゼ標識抗鶏ＩｇＹ抗体を上記洗浄液で１：８，０００に希釈して、各々のウエルに加えた後、２５℃で３０分間反応させた。その後、発色剤としてｏ−フェニレンジアミン及びジヒドロクロリドを加え、２０分後に反応を止めるため、３Ｎ硫酸を加えた。４９０ｎｍでの吸光度を計測してデータを得た。
【００３４】
その結果、抗ジンジパイン鶏卵抗体は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐ．ｇｕｌａｅ、Ｐ．ｓａｌｉｖｏｓａ及びＰ．ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓから精製したジンジパインに対して各々、１００％、９４％、９０％及び８６％の交差反応性を示した。一方、陰性鶏卵抗体は交差反応性を示さなかった。
【００３５】
（４）酵素阻害試験
（２）で調製した抗ジンジパイン鶏卵抗体による各種イヌ由来ジンジパインのプロテアーゼ活性阻害効果を検証した。
【００３６】
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐ．ｇｕｌａｅ、Ｐ．ｓａｌｉｖｏｓａ及びＰ．ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓから精製したジンジパインからそれぞれ精製したジンジパインと１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した抗ジンジパイン鶏卵抗体又は陰性鶏卵抗体（各々７５０、３７５、１８８、９９及び４７μｇ／ｍｌ）を混合し、４℃で６０分間感作した。酵素反応物５０μｌを５ｍＭ ジチオスレイトール、５ｍＭ Ｌ−システイン及び１ｍＭ Ｎ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（ＢａｐＮＡ）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液からなる反応混合物１５０μｌに加えた。この混合物を３７℃で２５分感作した後、２０％酢酸を加えて酵素反応を停止させた。Ｐ−ニトロアニリンの放出を４０５ｎｍの吸光度によって測定した。ジンジパインのプロテアーゼ活性１ユニットは反応混合物１分あたりのｐ−ニトロアニリン１μｍｏｌを放出する酵素量とし、Ｕ／ｍｌで測定した。
【００３７】
抗ジンジパイン鶏卵抗体は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐ．ｇｕｌａｅ、Ｐ．ｓａｌｉｖｏｓａ及びＰ．ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓから精製したジンジパインに対して、各々、１００％、９０％、８４％及び８０％の酵素阻害効果を認めた。これに対し、陰性鶏卵抗体は酵素阻害効果は示さなかった。
【００３８】
（５）細胞障害性抑制試験
ヒト咽頭上皮細胞（ＦａＤｕ）を１０％ＦＢＳ及び抗生物質加イーグル・ミニマムエッセンシャル培地（ＥＭＥＭ）で１８時間培養して、単層細胞になった段階で、抗ジンジパイン鶏卵抗体又は陰性鶏卵抗体と各種ジンジパイン抗原とを加え、３７℃で６０分間感作した。各ウエルの細胞を剥がしてＥＭＥＭに浮遊させてからトリパンブルーで染色した。鏡検して付着細胞数を算定した。
【００３９】
本発明の抗ジンジパイン鶏卵抗体は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐ．ｇｕｌａｅ、Ｐ．ｓａｌｉｖｏｓａ及びＰ．ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓから精製したジンジパインによる細胞障害を、各々、８８％、７８％、７５％及び７０％抑制した。これに対し、陰性鶏卵抗体は細胞障害抑制効果を示さなかった。
【００４０】
以上の試験結果から、本発明の抗ジンジパイン鶏卵抗体は、イヌ由来Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐ．ｇｕｌａｅ、Ｐ．ｓａｌｉｖｏｓａ及びＰ．ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓのジンジパインに対して、顕著な交差反応性を示すことが確認された。
【００４１】
実施例２：抗ジンジパイン鶏卵抗体のイヌ歯周病に対する有効性及び安全性
実施例１の（２）で調製した抗ジンジパイン鶏卵抗体について、有効性及び安全性を検証した。抗ジンジパイン鶏卵抗体粉末を飼料（ドライペットフード）に添加して犬に８週間連続投与する試験（飼料添加試験）と１週間間隔で１日１回、計４回、歯周溝ポケットに充満するまで直接塗布投与する試験（直接塗布試験）で、それぞれ歯周病に対する効果及びイヌに対する安全性を検討した。
【００４２】
供試動物：
品種：ビーグル、ミニチュアダックスフンド、柴、キャバリア、パグ
年齢：５歳６ヶ月〜７歳５ヶ月齢及び飼育歴５年以上の年齢不詳のイヌ
供試頭数：１８頭
選定基準：左右口腔内歯肉溝にポケットが確認され、口臭が中度（明らかに匂う）以上であるイヌ
【００４３】
飼育条件：
飼育環境：開放系畜舎のケージ内〔５６５×７９５×６３５（Ｈ）ｍｍ〕で個体別に飼育
飼料の種類：市販イヌ用固形飼料
飼料の給与量及び給与方法：体重から算出された１日当たりの所用量を朝、１回給与
飲水：自家水道を自動給水器で自由摂取
【００４４】
投与方法：
抗ジンジパイン鶏卵抗体粉末を０．１％添加した飼料を８週間投与した。試験群は体重の０．１％の抗ジンジパイン鶏卵抗体添加飼料を１日あたり１回投与する群（以下、投与群）及び抗体無添加飼料を投与した対照群の２群とし、投与前の口腔内観察スコアがほぼ同程度となるように割り付け、８週間連続投与して観察を行った。また、飼料添加試験終了後、対照群の５頭中症状の重い２頭及び他の重度歯周病罹患イヌに対してルートキャナルシリンジを用いて抗ジンジパイン鶏卵抗体２０％含有ぺリオフィールゲル（昭和薬品化工株式会社）の直接塗布投与を行った。投与は１週間間隔で１日１回、歯肉溝ポケットに充満するまで投与し、初回投与後４週間の観察を行った。観察事項は以下のとおりである。
【００４５】
観察事項
１）一般状態の観察：元気、食欲、糞便性状等について毎日観察した。
２）口腔内の観察：口腔内の観察は飼料添加試験では４週毎に３回、直接投与試験では各投与前及び最終投与終了１週後の５回行った。なお、口腔内の状態は下記表１のスコアに従い、左右別々に評価を行った。また、歯周ポケットの深さを測定し記録した。その他、投与部位に著変があればその詳細を記録することとした。
３）口腔内細菌検査：サンプルは特定の歯周溝ポケットからペーパーポイントを用いて採取し、測定時まで−３０℃で保存した。細菌の検出はＰＣＲインベーダー法を用いて行い、細菌の１６ＳｒＲＮＡを測定対象とし、総嫌気性細菌及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属の菌数を測定した。検査は株式会社ビー・エム・エルに委託して実施した。
４）体重測定：飼料添加試験では投与開始直前、投与開始後４，８週に、直接投与試験では第１回投与直前及び４週後に測定した。
５）飼料摂取量：定量給与のため残飼料を確認した。
６）写真撮影：飼料添加試験では投与直前及び投与開始後４週及び８週に、直接投与試験では各投与前及び最終投与終了１週後に歯肉溝（左右）の写真撮影を行った。
【００４６】
【表１】
【００４７】
また、試験日程を以下の表２及び３にまとめ、試験区分を以下の表４にまとめる。
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
【００５０】
【表４】
【００５１】
結果
飼料添加試験では投与群において、口腔内スコアが投与前及び対照群と比較し有意に減少しており、抗ジンジパイン鶏卵抗体の８週連続投与によって口腔内炎症及び歯周ポケットの症状が改善することが確認された（図１及び図２）。８週目の投与群及び対照群の歯周溝ポケットにおける総嫌気性菌数に有意な変動は認められなかったが、歯周病起因菌とされるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属の菌数は、投与群において、対照群と比較した有意な低下がみられた（図３）。また直接塗布試験では投与群が、口腔内スコア及び歯周ポケットの深さの推移で、対照群と比較し有意に減少しており、抗ジンジパイン鶏卵抗体の直接塗布による効果が確認された（図４及び図５）。一方、４週目における抗体投与群のＰｏｒｐｙｒｏｍｏｎａｓ菌数は、対照群のそれと比較したところ、有意に低下していた。一方、両群の歯周溝ポケットにおける総嫌気性菌数に有意な差は認められなかった（図６）。また試験期間中、供試動物の一般状態に異常を認めなかったことから抗ジンジパイン鶏卵抗体の安全性が確認された。
【００５２】
以上のことから、歯周病に罹患したイヌに抗Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓジンジパイン鶏卵抗を飼料添加投与及び／又は直接塗布投与することで歯周病に対する改善効果が得られることが確認された。また、試験期間中の供試動物の一般状態に異常が認められなかったことから、ペット・オーラル・ケアとして用いる場合のイヌに対する安全性が確認された。
【００５３】
比較例：抗ジンジパイン鶏卵抗体のネコ歯周病に対する有効性及び安全性
実施例１の（２）で調製した抗ジンジパイン鶏卵抗体粉末を飼料（ドライペットフード）に添加してネコに８週間連続投与する試験で、ネコ歯周病に対する効果及びネコに対する安全性を検討した。
【００５４】
供試動物：
動物種：ネコ
品種：雑種
年齢：飼育歴５年以上の年齢不詳ネコ
供試頭数：１０頭
選定基準：歯周病罹患ネコで左右口腔内歯肉溝にポケットが観察され、口臭が中度（明らかに匂う）以上であるネコ
【００５５】
飼育条件：
飼育環境：開放系畜舎のケージ内で個体別に飼育した。
飼料：市販のネコ用固形飼料を使用し、給与量は体重から算出した１日当たりの所用量を朝、１回給与した。
飲水：自家水道水を自動給水器で自由摂取させた。
【００５６】
投与方法：
抗ジンジパイン鶏卵抗体粉末を０．１％添加した飼料を８週間給与した。試験群は体重の０．１％の抗ジンジパイン鶏卵抗体添加飼料を１日当たり１回投与する投与群と抗体無添加飼料を投与する対照群を設定し、投与前の口腔内診査で臨床スコアレベルが同程度となるように、５頭ずつ割付けた。
【００５７】
観察事項：
１）一般状態の観察：元気、食欲、糞便性状等を観察した。
２）口腔内診査は各群で投与前、投与後４週及び８週目に実施した。なお、口腔内の臨床スコアはイヌで用いた判定基準に準拠した。
【００５８】
結果：
投与群において、投与前と投与４週目及び８週目のデータを比較すると、有意差は認められなかった。さらに、群間においても有意差は認められなかった。また、試験期間中、供試動物の一般状態に臨床的異常を認めなかった。以上から、歯周病に罹患したイヌ及びネコのプラークからは共にＰｏｒｐｈｙｌｏｍｏｎａｓ属の菌種が分離され、その歯周病症状もほとんど同じであるにもかかわらず、抗Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓジンジパイン鶏卵抗体は、ネコには有効ではなくイヌには有効であることが確認された。すなわち当該抗体は、特定の哺乳動物に対して有効であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】飼料添加試験における、抗ジンジパイン鶏卵抗体投与群及び対照群の口腔内炎症の変動を示す。
【図２】飼料添加試験における、抗ジンジパイン鶏卵抗体投与群及び対照群の歯周ポケットの深さの変動を示す。
【図３】飼料添加試験における、抗ジンジパイン鶏卵抗体投与群及び対照群の歯周溝ポケットにおける総嫌気性菌数及びＰｏｒｐｈｙｌｏｍｏｎａｓ属菌数を示す。
【図４】直接塗布試験における、抗ジンジパイン鶏卵抗体投与群及び対照群の口腔内炎症の変動を示す。
【図５】直接塗布試験における、抗ジンジパイン鶏卵抗体投与群及び対照群の歯周ポケットの深さの減少を示す。
【図６】直接塗布試験における、抗ジンジパイン鶏卵抗体投与群及び対照群の歯周溝ポケットにおける総嫌気性菌数及びＰｏｒｐｈｙｌｏｍｏｎａｓ属菌数を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イヌの歯周病を予防及び／又は治療するための組成物、並びにイヌの歯周病を予防及び／又は治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病は、歯周縁下プラークの細菌によって惹起される感染症で、現代人においては最も罹患率の高い感染症の一つである。歯周病が、最近、特に注目されている理由の一つは、歯牙喪失の最大の原因となり口腔機能の低下や各種神経機能の破綻を招くだけでなく、口臭や早産及び低体重児出産の原因ともなり、さらには心循環系疾患、糖尿病、心内膜炎、骨粗しょう症などの、全身性疾患のハイリスクファクターになるということである。従って、歯周病の克服は歯科領域ばかりではなく、他の臨床分野においても緊急な対応が迫られている重要課題となっている。しかしながら、これまでの多くの研究にもかかわらず歯周病の病因の解明や予防・治療に向けた対策の確立は十分ではなかった。
【０００３】
そこで、発明者らは、本病の分子標的を主要な歯周病原性細菌であるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ジンジバリス菌）が産生する２種類のプロテアーゼに注目して研究を進めてきた。一つはアルギニン残基を特異的に認識してそのＣ末端側で切断するＡｒｇ−ジンジパイン（Ｒｇｐ）、もう一つは、リジン残基を特異的に認識してＣ末端側で切断するＬｙｓ−ジンジパイン（Ｋｇｐ）である。これら二つのプロテアーゼ活性を合わせると、本菌が産生するプロテアーゼ活性全体の８５％以上を占める。それらには膜結合型と分泌型の両方が存在している。
【０００４】
これらのジンジパインは口腔環境にあるタンパク質を分解してジンジバリス菌の発育増殖に不可欠なアミノ酸を栄養源として供給する一方、ジンジバリス菌の接着や赤血球凝集及びヘム鉄獲得など重要な役割を果たしている。また、宿主に対しては、色々な生体タンパク質を強力に分解して多彩な病原性機能を発揮している。
【０００５】
発明者らはこれらの技術情報をもとに、ジンジバリス菌に由来するジンジパインＲｇｐ及びＫｇｐを抗原として鶏に免疫して得られた鶏卵から精製した鶏卵抗体が成人の歯周病に対して有効で、かつ安全性が高いことを明らかにした（特許文献１）。
【０００６】
最近、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属の菌種が歯周病に罹患したイヌ及びネコのプラークからしばしば分離され、その分離頻度は加齢に伴って増加することが報告されている（非特許文献１）。これらペットの歯周病症状はほとんど同じであり、８歳から１０歳で歯牙喪失が起こることは珍しくない。治療は、スケーリング・プランニングした後、ミノサイクリン又はクリンダマイシンなどの抗生物質を投与することが一般的であるが、耐性菌の出現が危惧される（非特許文献２及び３）。
【０００７】
Ｊ．Ｈａｒｄｈａｍらは、ペットの歯周病ワクチンの研究について報告している（非特許文献４）。彼らはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ Ｂ４３株を用いて不活化ワクチンを作成して、Ｂａｌｂ／ｃＣｙＪマウスに２回皮下注射して免疫した後、ホモ株又はヘテロ株（Ｐ．ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓ，Ｂ１０６）で、２回経口チャレンジし、本ワクチンの有効性をマウスの下顎歯槽骨吸収の程度をスコア化することにより評価した。その結果、ホモ株であるＰ．ｇｕｌａｅ Ｂ４３株又はヘテロ株であるＰ．ｓａｌｉｖｏｓａ Ｂ１０４でチャレンジした時だけ有効性が検証できた。これに対し、ホモ株であるＰ．ｇｕｌａｅ Ｂ６９又はヘテロ株であるＰ．ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓ Ｂ１０６チャレンジしたところ、有効性は検証できなかった。Ｐ．ｇｕｌａｅ Ｂ４３株を用いて製造したモノバレント不活化ワクチンは交差防御効果を示さなかったことから、Ｐ．ｇｕｌａｅ、Ｐ．ｓａｌｉｖｏｓａ及びＰ．ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓからなる３種混合ワクチンの必要性が示唆された。
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−３６６６１
【非特許文献１】Ｈ．Ｉｓｏｇａｉら、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ Ｂ ４６，４６７−４７３（１９９９）
【非特許文献２】Ｍ．Ｈｉｒａｓａｗａら、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ，６１，１３４９−１３５２（２０００）
【非特許文献３】中出哲也ら、動物抗菌会報、２６，４５−５１（２００４）
【非特許文献４】Ｊ．Ｈａｒｄｈａｍら、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１０６，１１９−１２８（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、イヌの歯周病を予防及び／又は治療するための有効でかつ安全性の高い手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のプロテアーゼを抗原として鳥類に免疫して得られる鶏卵抗体が、成人の歯周病に対して有効であるが、ネコの歯周病に対しては効果がないこと、すなわち、上記鶏卵抗体は特定の哺乳動物の歯周病に有効であることを見出した。本発明者らはまた、イヌ及びネコの歯周病症状はほとんど同じであるにもかかわらず、上記鶏卵抗体がイヌの歯周病に対しては有効であることを見出した。さらには、上記鶏卵抗体が、イヌ由来のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐ．ｇｕｌａｅ、Ｐ．ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓ及びＰ．ｓａｌｉｖｏｓａに対して交差防御効果を有し、イヌの歯周病を効果的に予防及び／又は治療できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに由来するプロテアーゼで免疫した鳥類が産生した卵及び／又はその処理物を含む、イヌの歯周病を予防及び／又は治療するための組成物。
（２）プロテアーゼとして、Ａｒｇ−ジンジパイン、Ｌｙｓ−ジンジパイン又はこれらの組み合わせを用いる、（１）記載の組成物。
（３）Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに由来するプロテアーゼで免疫した鳥類が産生した卵又はその処理物の有効量をイヌに投与することを含む、イヌの歯周病を予防及び／又は治療する方法。
（４）プロテアーゼとして、Ａｒｇ−ジンジパイン、Ｌｙｓ−ジンジパイン又はこれらの組み合わせを用いる、（３）記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、イヌの歯周病を誘導する原因因子を制御し、イヌの歯周病の治療と予防を、効果的かつ安全に実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに由来するプロテアーゼで免疫する鳥類としては、特に限定されないが、通常、鶏、鶉、アヒル等の家禽が挙げられる。抗体の量産性という観点から、鶏、特に、産卵種を用いるのが好ましい。
【００１４】
本発明に用いるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは、哺乳動物から採取されるものであればよく、ヒトから採取されるものでも、イヌから採取されるものでもよく、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から購入できる。具体的には、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ＡＴＣＣ３３２７７）を用いることができる。
【００１５】
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに由来するプロテアーゼとしては、例えば、Ａｒｇ−ジンジパイン（Ｒｇｐ）及びＬｙｓ−ジンジパイン（Ｋｇｐ）が挙げられる。ＲｇｐとＫｇｐは、それぞれ単独で用いて鳥類を免疫してもよいし、組み合わせて用いて鳥類を免疫してもよい。これらのプロテアーゼは、例えば、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの培養菌体を超音波処理し、硫酸アンモニウムなどによって塩析することによって精製することができる。望ましくは塩析沈降物をＭｏｎｏ−Ｑアフィニティーカラム等で精製して用いる。
【００１６】
鳥類に免疫する方法としては抗原単独又は２種以上を組み合わせて免疫することができ、その際アジュバントと共に皮下、筋肉内、鼻又は目へ免疫する方法、飼料又は水と共に経口的に免疫する方法等、通常の方法が採用できる。鳥類を前記の抗原で免疫する際には、必要に応じてフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、オイルアジュバント又はアルミニウムアジュバント等のアジュバントを用いることもできる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、３〜１０回の免疫を行う。通常、初回免疫から数週間で投与抗原に対して特異的に反応する抗体が卵、特に卵黄中に得られる。接種する抗原量はタンパク質量で、０．０１〜１０ｍｇが好適に用いられる。
【００１７】
卵中の抗体価は、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、菌体凝集反応、毒素又はウイルス中和試験などで測定することができ、免疫後に２週程度の間隔で鶏卵を採取して抗体価を測定することにより抗体価の推移を追跡できる。通常、約４ヶ月間にわたって高い抗体価を得ることができる。なお、免疫後、抗体価の減少が見られた場合、適当な間隔で適宜追加免疫することにより抗体価を高く維持することができる。
【００１８】
本発明において、卵処理物は、鳥類の免疫に使用した免疫原に対する抗体を含むものであれば特に制限されず、例えば、免疫した卵の全卵、卵黄及び卵白、これらの卵液及び溶液、ならびに卵液をプロパノールやクロロホルムを用いて抽出した抽出物等が含まれる。含まれる抗体の量の観点から、卵黄成分を含むことが好ましい。スプレードライ法や凍結乾燥法などにより粉末化したものも含まれる。また、卵黄に水を加えて脂質成分を除去したり、卵黄からヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸や、プロパノール、エタノール、ヘキサン等の有機溶剤などを用いる方法により卵黄脂質成分を除去した後粉末化したものも含まれる。このような粉末をペースト状又は液状にしたものも含まれる。更に、本発明において卵の処理物には、硫酸アンモニウム塩析、硫酸ナトリウム塩析、低温エタノール沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法により卵から精製された抗体自体をも包含される。処理物の保存性を高めるためには、殺菌した全卵液卵又は卵黄液卵をスプレードライ又は凍結乾燥して粉末化するのが好ましい。以下、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに由来するプロテアーゼで免疫した鳥類が産生した卵及びその処理物を、本発明の卵及び卵処理物と称する。
【００１９】
本発明の卵及び卵処理物は、抗体価が１．２ｘ１０５倍以上、好ましくは２．５〜５．０ｘ１０５倍であることを特徴とする。前記の抗体価は、ＥＬＩＳＡによって測定することができる。
【００２０】
前記のようにして得られる卵及び卵処理物は、イヌの歯周病の予防及び／又は治療に有効である。したがって、本発明の卵及び／又はその処理物を、特定保健用食品等の食品又は医薬組成物に配合することにより、イヌの歯周病を治療又は予防するための組成物を製造することができる。本発明において歯周病とは、歯の周囲の組織、例えば、歯肉や骨における感染症をさし、歯肉炎、歯周炎及び歯槽膿漏を包含する。
【００２１】
本発明の組成物の形態は特に制限されず、例えば、飼料、サプリメント及び医薬組成物の形態とすることができる。組成物の剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、液剤、懸濁剤、吸入剤などの経口剤、坐剤などの経腸製剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤などの外用剤、点滴剤、注射剤などが挙げられる。これらのうちでは、経口剤及び外用剤が好ましい。このような剤型の組成物は、本発明の卵及び／又は卵処理物に、慣用の添加剤を剤型に応じて配合し、常法に従って製造することができる。
【００２２】
添加剤には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、着色剤、矯味剤などがあり、必要に応じて使用する。口腔内で長時間作用できるように徐放化するためには、既知の遅延剤等でコーティングすることもできる。賦形剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、軽質無水ケイ酸、ゼラチン、結晶セルロース、ソルビトール、タルク、デキストリン、デンプン、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム等が使用できる。結合剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、エタノール、エチルセルロース、カゼインナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、精製水、ゼラチン、デンプン、トラガント、乳糖、ヒドロキシセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油、ショ糖脂肪酸エステル、ロウ類等が挙げられる。抗酸化剤としては、トコフェロール、没食子酸エステル、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、アスコルビン酸等が挙げられる。
【００２３】
本発明の組成物には、さらに、各種油脂、生薬、アミノ酸、多価アルコール、天然高分子、ビタミン、ミネラル、食物繊維、界面活性剤、安定剤、ｐＨ調製剤、酸化防止剤、甘味料、呈味成分、酸味料及び香料などを配合してもよい。その他の有効成分、例えば、抗生剤、抗ＴＮＦ−α抗体などを配合してもよい。
【００２４】
本発明の組成物において、有効成分である卵及び／又は卵処理物は、抗体の質量を基準として、乾燥質量に基づいて、飼料では通常０．０１〜１質量％、サプリメントでは通常０．１〜１．０質量％、医薬組成物では通常０．５〜１０重量％配合することが好ましいが、目的によって前記の範囲よりも少なく又は多く配合することもできる。
【００２５】
本発明の卵及び／又はその処理物の有効量をイヌに投与することにより、イヌの歯周病を予防及び／又は治療することができる。本発明の卵及び／又はその処理物は、そのまま、あるいは上記のような組成物の形態で投与することができる。有効量とは、例えば、医師によって探索される、動物の生理学的または医学的応答を引き出すのに十分な量を意味し、より具体的には、そのような量の投与を受けなかった対応する被験体と比較したときに、疾患、障害、もしくは副作用の、治療、治癒、予防の向上、もしくは改善をもたらすような量、または疾患もしくは障害の進行速度の低減をもたらすような量を意味する。
【００２６】
本発明の卵及び／又はその処理物の投与量は、特に制限されないが、１日当たり、体重１ｋｇあたり、抗体の質量を基準として、乾燥質量に基づいて、通常２５〜４５ｍｇ、好ましくは９０〜１８０ｍｇである。
【００２７】
本発明の卵及び／又はその処理物を投与する対象となるイヌは、特に制限されないが、好ましくは歯周病に罹患したイヌ、歯周病に罹患する可能性のあるイヌ、例えば、３歳以上のイヌである。
【００２８】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００２９】
実施例１：抗Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓジンジパイン鶏卵抗体の交差反応性
（１）プロテアーゼ（ジンジパイン）の調製
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ＡＴＣＣ３３２７７）は、１０％無菌ウマ脱繊血加ブルセラＨＫ寒天培地（極東製薬）を用いて嫌気性培養を行った。発育したコロニーを釣菌して、イーストエキストラクト、ヘミン、Ｌ−システイン及びメナジオンを添加したトリプチケース・ソイ・ブロース液体培地（ＢＤ）に移植した。同培地に炭酸ガスを吹き込みながら３７℃で４８時間振とう培養（５０ｒｐｍ）を行った。
【００３０】
培養菌体は１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心して集菌し、その後、ＰＢＳで３回洗浄し、ペレットはトリス緩衝液（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−１Ｍ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）に浮遊させた。ジンジパインを抽出するため超音波処理を行い（１５０ワットで１分、これを６回繰り返した）、精製は硫酸アンモニウムで塩析することにより粗精製し、さらに、Ｍｏｎｏ−Ｑアフィニティーカラム（ファルマシア）で精製した。溶出緩衝液としては、上記の緩衝液に１Ｍ ＮａＣｌを加えたものを使用した。回収した主要ピークは、全プロテアーゼ活性の８０％以上を占めるものであった。本調製方法によって、イヌ由来Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐ．ｇｕｌａｅ、Ｐ．ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓ及びＰ．ｓａｌｉｖｏｓａ菌体からも効率よくジンジパインを回収できた。
【００３１】
（２）抗Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓジンジパイン鶏卵抗体の調製
免疫鶏は約５ヶ月齢の白色レグホン種（ハイラインＷ３６、株式会社ゲン・コーポレーション）を用いた。免疫原は精製したジンジパインにオイルアジュバントを加えて乳化させたものを用いた。初回免疫は鶏の左右の胸筋部位に各０．５ｍｌ（タンパク質量は１ｍｇ）を注射することによって行った。初回免疫後８週目に同じ方法でブスター免疫注射を実施し、その２週間後から免疫卵を回収した。免疫卵は卵白と卵黄を分離し、卵黄脂質成分を除去するため、卵黄重量と等量のＰＢＳ（ｐＨ７．５）を加えて攪拌した後、さらに等量のクロロホルムを添加してよく攪拌し、遠心して水溶性画分を得た。抗体の精製は硫酸アンモニウムを用いる塩析によって行った。脱塩した後、凍結乾燥によって約１０ｋｇの精製抗体粉末を得た（以下、抗ジンジパイン鶏卵抗体と称する）。以下の実施例はこのサンプルを用いて実施した。なお、対照として、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のジンジパインに対して特異性を示さないことが確認された抗ピロリ菌ウレアーゼ精製抗体（以下、陰性鶏卵抗体と称する）を使用した。
【００３２】
（３）ＥＬＩＳＡ
（２）で調製した抗ジンジパイン鶏卵抗体のイヌ由来各種ジンジパインに対する特異性をＥＬＩＳＡによって検証した。
【００３３】
各種ジンジパインは０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解した抗原（５μｇ／ｍｌ）を９６穴マイクロプレートの各ウエルに１００μｌ加えた後、固相化するため４℃で１８時間静置した。各ウエルの抗原液を除去し、非特異反応をブロックするため３％ウシ血清アルブミン添加ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を各ウエルに１５０μｌ加えて３７℃で６０分静置した。各ウエルのブロッキング液を除去した後、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０−ＰＢＳを用いて３回洗浄した。次に、抗ジンジパイン鶏卵抗体及び陰性鶏卵抗体を上記洗浄液に溶解し、各ウエルに１００μｌずつ加えプレートを３７℃で６０分反応させた。各ウエルを３回洗浄した後、２次抗体としてホースラデッシュ・パーオキシダーゼ標識抗鶏ＩｇＹ抗体を上記洗浄液で１：８，０００に希釈して、各々のウエルに加えた後、２５℃で３０分間反応させた。その後、発色剤としてｏ−フェニレンジアミン及びジヒドロクロリドを加え、２０分後に反応を止めるため、３Ｎ硫酸を加えた。４９０ｎｍでの吸光度を計測してデータを得た。
【００３４】
その結果、抗ジンジパイン鶏卵抗体は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐ．ｇｕｌａｅ、Ｐ．ｓａｌｉｖｏｓａ及びＰ．ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓから精製したジンジパインに対して各々、１００％、９４％、９０％及び８６％の交差反応性を示した。一方、陰性鶏卵抗体は交差反応性を示さなかった。
【００３５】
（４）酵素阻害試験
（２）で調製した抗ジンジパイン鶏卵抗体による各種イヌ由来ジンジパインのプロテアーゼ活性阻害効果を検証した。
【００３６】
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐ．ｇｕｌａｅ、Ｐ．ｓａｌｉｖｏｓａ及びＰ．ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓから精製したジンジパインからそれぞれ精製したジンジパインと１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した抗ジンジパイン鶏卵抗体又は陰性鶏卵抗体（各々７５０、３７５、１８８、９９及び４７μｇ／ｍｌ）を混合し、４℃で６０分間感作した。酵素反応物５０μｌを５ｍＭ ジチオスレイトール、５ｍＭ Ｌ−システイン及び１ｍＭ Ｎ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（ＢａｐＮＡ）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液からなる反応混合物１５０μｌに加えた。この混合物を３７℃で２５分感作した後、２０％酢酸を加えて酵素反応を停止させた。Ｐ−ニトロアニリンの放出を４０５ｎｍの吸光度によって測定した。ジンジパインのプロテアーゼ活性１ユニットは反応混合物１分あたりのｐ−ニトロアニリン１μｍｏｌを放出する酵素量とし、Ｕ／ｍｌで測定した。
【００３７】
抗ジンジパイン鶏卵抗体は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐ．ｇｕｌａｅ、Ｐ．ｓａｌｉｖｏｓａ及びＰ．ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓから精製したジンジパインに対して、各々、１００％、９０％、８４％及び８０％の酵素阻害効果を認めた。これに対し、陰性鶏卵抗体は酵素阻害効果は示さなかった。
【００３８】
（５）細胞障害性抑制試験
ヒト咽頭上皮細胞（ＦａＤｕ）を１０％ＦＢＳ及び抗生物質加イーグル・ミニマムエッセンシャル培地（ＥＭＥＭ）で１８時間培養して、単層細胞になった段階で、抗ジンジパイン鶏卵抗体又は陰性鶏卵抗体と各種ジンジパイン抗原とを加え、３７℃で６０分間感作した。各ウエルの細胞を剥がしてＥＭＥＭに浮遊させてからトリパンブルーで染色した。鏡検して付着細胞数を算定した。
【００３９】
本発明の抗ジンジパイン鶏卵抗体は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐ．ｇｕｌａｅ、Ｐ．ｓａｌｉｖｏｓａ及びＰ．ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓから精製したジンジパインによる細胞障害を、各々、８８％、７８％、７５％及び７０％抑制した。これに対し、陰性鶏卵抗体は細胞障害抑制効果を示さなかった。
【００４０】
以上の試験結果から、本発明の抗ジンジパイン鶏卵抗体は、イヌ由来Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐ．ｇｕｌａｅ、Ｐ．ｓａｌｉｖｏｓａ及びＰ．ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓのジンジパインに対して、顕著な交差反応性を示すことが確認された。
【００４１】
実施例２：抗ジンジパイン鶏卵抗体のイヌ歯周病に対する有効性及び安全性
実施例１の（２）で調製した抗ジンジパイン鶏卵抗体について、有効性及び安全性を検証した。抗ジンジパイン鶏卵抗体粉末を飼料（ドライペットフード）に添加して犬に８週間連続投与する試験（飼料添加試験）と１週間間隔で１日１回、計４回、歯周溝ポケットに充満するまで直接塗布投与する試験（直接塗布試験）で、それぞれ歯周病に対する効果及びイヌに対する安全性を検討した。
【００４２】
供試動物：
品種：ビーグル、ミニチュアダックスフンド、柴、キャバリア、パグ
年齢：５歳６ヶ月〜７歳５ヶ月齢及び飼育歴５年以上の年齢不詳のイヌ
供試頭数：１８頭
選定基準：左右口腔内歯肉溝にポケットが確認され、口臭が中度（明らかに匂う）以上であるイヌ
【００４３】
飼育条件：
飼育環境：開放系畜舎のケージ内〔５６５×７９５×６３５（Ｈ）ｍｍ〕で個体別に飼育
飼料の種類：市販イヌ用固形飼料
飼料の給与量及び給与方法：体重から算出された１日当たりの所用量を朝、１回給与
飲水：自家水道を自動給水器で自由摂取
【００４４】
投与方法：
抗ジンジパイン鶏卵抗体粉末を０．１％添加した飼料を８週間投与した。試験群は体重の０．１％の抗ジンジパイン鶏卵抗体添加飼料を１日あたり１回投与する群（以下、投与群）及び抗体無添加飼料を投与した対照群の２群とし、投与前の口腔内観察スコアがほぼ同程度となるように割り付け、８週間連続投与して観察を行った。また、飼料添加試験終了後、対照群の５頭中症状の重い２頭及び他の重度歯周病罹患イヌに対してルートキャナルシリンジを用いて抗ジンジパイン鶏卵抗体２０％含有ぺリオフィールゲル（昭和薬品化工株式会社）の直接塗布投与を行った。投与は１週間間隔で１日１回、歯肉溝ポケットに充満するまで投与し、初回投与後４週間の観察を行った。観察事項は以下のとおりである。
【００４５】
観察事項
１）一般状態の観察：元気、食欲、糞便性状等について毎日観察した。
２）口腔内の観察：口腔内の観察は飼料添加試験では４週毎に３回、直接投与試験では各投与前及び最終投与終了１週後の５回行った。なお、口腔内の状態は下記表１のスコアに従い、左右別々に評価を行った。また、歯周ポケットの深さを測定し記録した。その他、投与部位に著変があればその詳細を記録することとした。
３）口腔内細菌検査：サンプルは特定の歯周溝ポケットからペーパーポイントを用いて採取し、測定時まで−３０℃で保存した。細菌の検出はＰＣＲインベーダー法を用いて行い、細菌の１６ＳｒＲＮＡを測定対象とし、総嫌気性細菌及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属の菌数を測定した。検査は株式会社ビー・エム・エルに委託して実施した。
４）体重測定：飼料添加試験では投与開始直前、投与開始後４，８週に、直接投与試験では第１回投与直前及び４週後に測定した。
５）飼料摂取量：定量給与のため残飼料を確認した。
６）写真撮影：飼料添加試験では投与直前及び投与開始後４週及び８週に、直接投与試験では各投与前及び最終投与終了１週後に歯肉溝（左右）の写真撮影を行った。
【００４６】
【表１】
【００４７】
また、試験日程を以下の表２及び３にまとめ、試験区分を以下の表４にまとめる。
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
【００５０】
【表４】
【００５１】
結果
飼料添加試験では投与群において、口腔内スコアが投与前及び対照群と比較し有意に減少しており、抗ジンジパイン鶏卵抗体の８週連続投与によって口腔内炎症及び歯周ポケットの症状が改善することが確認された（図１及び図２）。８週目の投与群及び対照群の歯周溝ポケットにおける総嫌気性菌数に有意な変動は認められなかったが、歯周病起因菌とされるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属の菌数は、投与群において、対照群と比較した有意な低下がみられた（図３）。また直接塗布試験では投与群が、口腔内スコア及び歯周ポケットの深さの推移で、対照群と比較し有意に減少しており、抗ジンジパイン鶏卵抗体の直接塗布による効果が確認された（図４及び図５）。一方、４週目における抗体投与群のＰｏｒｐｙｒｏｍｏｎａｓ菌数は、対照群のそれと比較したところ、有意に低下していた。一方、両群の歯周溝ポケットにおける総嫌気性菌数に有意な差は認められなかった（図６）。また試験期間中、供試動物の一般状態に異常を認めなかったことから抗ジンジパイン鶏卵抗体の安全性が確認された。
【００５２】
以上のことから、歯周病に罹患したイヌに抗Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓジンジパイン鶏卵抗を飼料添加投与及び／又は直接塗布投与することで歯周病に対する改善効果が得られることが確認された。また、試験期間中の供試動物の一般状態に異常が認められなかったことから、ペット・オーラル・ケアとして用いる場合のイヌに対する安全性が確認された。
【００５３】
比較例：抗ジンジパイン鶏卵抗体のネコ歯周病に対する有効性及び安全性
実施例１の（２）で調製した抗ジンジパイン鶏卵抗体粉末を飼料（ドライペットフード）に添加してネコに８週間連続投与する試験で、ネコ歯周病に対する効果及びネコに対する安全性を検討した。
【００５４】
供試動物：
動物種：ネコ
品種：雑種
年齢：飼育歴５年以上の年齢不詳ネコ
供試頭数：１０頭
選定基準：歯周病罹患ネコで左右口腔内歯肉溝にポケットが観察され、口臭が中度（明らかに匂う）以上であるネコ
【００５５】
飼育条件：
飼育環境：開放系畜舎のケージ内で個体別に飼育した。
飼料：市販のネコ用固形飼料を使用し、給与量は体重から算出した１日当たりの所用量を朝、１回給与した。
飲水：自家水道水を自動給水器で自由摂取させた。
【００５６】
投与方法：
抗ジンジパイン鶏卵抗体粉末を０．１％添加した飼料を８週間給与した。試験群は体重の０．１％の抗ジンジパイン鶏卵抗体添加飼料を１日当たり１回投与する投与群と抗体無添加飼料を投与する対照群を設定し、投与前の口腔内診査で臨床スコアレベルが同程度となるように、５頭ずつ割付けた。
【００５７】
観察事項：
１）一般状態の観察：元気、食欲、糞便性状等を観察した。
２）口腔内診査は各群で投与前、投与後４週及び８週目に実施した。なお、口腔内の臨床スコアはイヌで用いた判定基準に準拠した。
【００５８】
結果：
投与群において、投与前と投与４週目及び８週目のデータを比較すると、有意差は認められなかった。さらに、群間においても有意差は認められなかった。また、試験期間中、供試動物の一般状態に臨床的異常を認めなかった。以上から、歯周病に罹患したイヌ及びネコのプラークからは共にＰｏｒｐｈｙｌｏｍｏｎａｓ属の菌種が分離され、その歯周病症状もほとんど同じであるにもかかわらず、抗Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓジンジパイン鶏卵抗体は、ネコには有効ではなくイヌには有効であることが確認された。すなわち当該抗体は、特定の哺乳動物に対して有効であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】飼料添加試験における、抗ジンジパイン鶏卵抗体投与群及び対照群の口腔内炎症の変動を示す。
【図２】飼料添加試験における、抗ジンジパイン鶏卵抗体投与群及び対照群の歯周ポケットの深さの変動を示す。
【図３】飼料添加試験における、抗ジンジパイン鶏卵抗体投与群及び対照群の歯周溝ポケットにおける総嫌気性菌数及びＰｏｒｐｈｙｌｏｍｏｎａｓ属菌数を示す。
【図４】直接塗布試験における、抗ジンジパイン鶏卵抗体投与群及び対照群の口腔内炎症の変動を示す。
【図５】直接塗布試験における、抗ジンジパイン鶏卵抗体投与群及び対照群の歯周ポケットの深さの減少を示す。
【図６】直接塗布試験における、抗ジンジパイン鶏卵抗体投与群及び対照群の歯周溝ポケットにおける総嫌気性菌数及びＰｏｒｐｈｙｌｏｍｏｎａｓ属菌数を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに由来するプロテアーゼで免疫した鳥類が産生した卵及び／又はその処理物を含む、イヌの歯周病を予防及び／又は治療するための組成物。
【請求項２】
プロテアーゼとして、Ａｒｇ−ジンジパイン、Ｌｙｓ−ジンジパイン又はこれらの組み合わせを用いる、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに由来するプロテアーゼで免疫した鳥類が産生した卵又はその処理物の有効量をイヌに投与することを含む、イヌの歯周病を予防及び／又は治療する方法。
【請求項４】
プロテアーゼとして、Ａｒｇ−ジンジパイン、Ｌｙｓ−ジンジパイン又はこれらの組み合わせを用いる、請求項３記載の方法。
【請求項１】
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに由来するプロテアーゼで免疫した鳥類が産生した卵及び／又はその処理物を含む、イヌの歯周病を予防及び／又は治療するための組成物。
【請求項２】
プロテアーゼとして、Ａｒｇ−ジンジパイン、Ｌｙｓ−ジンジパイン又はこれらの組み合わせを用いる、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに由来するプロテアーゼで免疫した鳥類が産生した卵又はその処理物の有効量をイヌに投与することを含む、イヌの歯周病を予防及び／又は治療する方法。
【請求項４】
プロテアーゼとして、Ａｒｇ−ジンジパイン、Ｌｙｓ−ジンジパイン又はこれらの組み合わせを用いる、請求項３記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−１７３５５８（Ｐ２００９−１７３５５８Ａ）
【公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１１７５３（Ｐ２００８−１１７５３）
【出願日】平成２０年１月２２日（２００８．１．２２）
【出願人】（０００１２９９７６）株式会社ゲン・コーポレーション (11)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月２２日（２００８．１．２２）
【出願人】（０００１２９９７６）株式会社ゲン・コーポレーション (11)
【Ｆターム（参考）】
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