抗体のスクリーニング方法
【課題】抗原に対する高い親和性を有するモノクローナル抗体を高い精度でスクリーニングできる方法を提供すること。
【解決手段】任意のサブクラスの抗体に結合できる捕捉抗体を固定化した第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップと、抗原を固定化した第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップのそれぞれに、抗体含有試料を接触させ、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップ及び第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおける表面プラズモン共鳴の変化を測定してそれぞれのシグナル値を取得し、それぞれのシグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）を比較することによって、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料を選択することを含む、抗体のスクリーニング方法。
【解決手段】任意のサブクラスの抗体に結合できる捕捉抗体を固定化した第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップと、抗原を固定化した第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップのそれぞれに、抗体含有試料を接触させ、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップ及び第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおける表面プラズモン共鳴の変化を測定してそれぞれのシグナル値を取得し、それぞれのシグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）を比較することによって、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料を選択することを含む、抗体のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原に対する高い親和性を有する特異抗体のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体作製における細胞融合後の特異抗体のスクリーニング方法としては、従来は、ELISA法を用いてスクリーニングを行っている。しかし、モノクローナル抗体産生細胞の培養上清中における特異抗体の濃度は、細胞によって異なるため、特異抗体を効率よくスクリーニングすることは困難である。モノクローナル抗体の作製においては、抗体産生細胞である脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを作成するが、作成したハイブリドーマの中から、抗原に対して特異性及び親和性の高い抗体を産生するハイブリドーマをいかにして選択するかが重要である。しかし、ハイブリドーマの培養上清中における抗体産生量はハイブリドーマ毎に異なるため、培養上清中の抗体濃度はハイブリドーマ毎に異なり、ばらついている。そのため、従来のELISA評価では、多数の偽陽性サンプルを選択してしまう可能性が高かった。また、細胞が産生する抗体の抗原に対する親和性も分からないため、抗原に対して特異性及び親和性が高い抗体を合理的にスクリーングすることは困難であった。
【０００３】
一方、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできる技術の一つとして、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析が知られている、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析においては、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析することができる。生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜としては、例えば、金属と結合する官能基、鎖長の原子数が１０以上のリンカー、及び生理活性物質と結合できる官能基を有する化合物を用いて、生理活性物質を固定化した測定チップが報告されている（特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第２８１５１２０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
即ち、本発明は、抗原に対する高い親和性を有するモノクローナル抗体を高い精度でスクリーニングできる方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、任意のサブクラスの抗体（IgG、IgM、IgEなど）と結合することができる捕捉抗体を、表面プラズモン共鳴分析用のセンサーチップ上に固定化し、ハイブリドーマ培養上清中の全イムノグロブリン量を定量し、また、別のセンサーチップに特異抗原を固定化し、ハイブリドーマ培養上清中の特異抗体量を定量し、それぞれのシグナル値（ΔRU）の比率を比較することによって、抗原に対する親和性が高い特異抗体を産生するハイブリドーマを選択することに成功し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明によれば、任意のサブクラスの抗体に結合できる捕捉抗体を固定化した第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップと、抗原を固定化した第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップのそれぞれに、抗体含有試料を接触させ、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップ及び第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおける表面プラズモン共鳴の変化を測定してそれぞれのシグナル値を取得し、それぞれのシグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）を比較することによって、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料を選択することを含む、抗体のスクリーニング方法が提供される。
【０００８】
好ましくは、抗体含有試料は、モノクローナル抗体含有試料である。
好ましくは、抗体含有試料は、抗体産生細胞の培養上清である。
好ましくは、抗体含有試料は、抗体産生ハイブリドーマの培養上清である。
好ましくは、抗体含有試料は、限界希釈後の単一クローンに由来する抗体産生ハイブリドーマの培養上清である。
【０００９】
好ましくは、シグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）が所定の基準値以上である試料を、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、捕捉抗体のイムノグロブリン結合能とSPRセンシングを用いて、ハイブリドーマなどの抗体産生細胞の全抗体産生量と特異抗体産生量を定量することにより、抗原に対する親和性が高い特異抗体を高い精度でスクリーニングすることが可能である。本発明によれば、ELISAによるスクリーニング法で偽陽性と判断したサンプルを見分けることができる。また、本発明によれば、培養上清中の抗体濃度が分からない場合であっても、抗原に対する親和性が高い特異抗体を効率よくスクリーニングすることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、細胞融合後の作業スキームを示す。
【図２】図２は、細胞融合後のELISAスクリーニング結果を示す。
【図３】図３は、ELISAで強陽性である1F2ウエルのSPR測定を行った結果であるSPRセンサーグラム（1F2）を示す。
【図４】図４は、ELISAで強陽性である9F1ウエルのSPR測定を行った結果であるSPRセンサーグラム（9F1）を示す。
【図５】図５は、２つのフローセルの値の比（ΔRU at Fc3/ ΔRU at Fc4 *100 ）を特異抗体結合能の指標として用い、ELISA評価を行った３８ウエルを評価した結果を示す。
【図６】図６は、限界希釈後の培養上清サンプルのスクリーニングの結果を示す。左は9F1のスクリーニング結果を示し、右は22G8のスクリーニング結果を示す。
【図７】図７は、各抗体の速度論解析を行った結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明においては、任意のサブクラスの抗体に結合できる捕捉抗体を固定化した第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップと、抗原を固定化した第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップのそれぞれに、抗体含有試料を接触させ、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップ及び第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおける表面プラズモン共鳴の変化を測定してそれぞれのシグナル値を取得する。次いで、上記で取得したそれぞれのシグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）を比較することによって、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料を選択することによって、抗体のスクリーニングを行う。
【００１３】
シグナル値の比率の比較においては、例えば、シグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）が所定の基準値以上である試料を、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択することができる。上記した「所定の基準値」は、測定条件（例えば、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップに固定化した捕捉抗体の量、第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップに固定化した抗原の量）、並びに取得を意図する抗体の抗原に対する親和性の程度に応じて、所望の値に設定することができる。上記した「所定の基準値」は、例えば、本発明で用いる「任意のサブクラスの抗体に結合できる捕捉抗体を固定化した第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップと、抗原を固定化した第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップ」のそれぞれに、当該抗原に対する既存の抗体（以下、基準抗体とも称する）を接触させ、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップ及び第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおける表面プラズモン共鳴の変化を測定してそれぞれのシグナル値を取得することによって得られるそれぞれのシグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）と同じ値に設定してもよい。あるいは、「所定の基準値」は、上記した基準抗体を用いて測定した場合のシグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）に所定の比率（例えば、０．１から１．０の間の任意の比率、例えば、０．４又は０．８など）を掛けた値に設定してもよい。なお、上記した基準抗体としては、当該抗原に対する抗体であれば任意の抗体を用いることができるが、抗原に対して所望の親和性を有する抗体を用いることが特に好ましい。
【００１４】
本発明の一例としては、シグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）が、基準抗体におけるシグナル値の比率の４０％以上である抗体含有試料を、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択してもよいし、あるいはシグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）が、基準抗体におけるシグナル値の比率の８０％以上である抗体含有試料を、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択してもよい。
【００１５】
なお、シグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）は、測定条件（例えば、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップに固定化した捕捉抗体の量、第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップに固定化した抗原の量など）により変動するため、一般的には、シグナル値の比率の絶対値を、試料の選別の指標とすることは適切ではないと考えられる。しかし、本発明の一例として本明細書の実施例に記載するような条件下又はそれに準ずる条件下においては、シグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）が、例えば０．２以上である抗体含有試料を、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択することができ、あるいは上記のシグナル値の比率が、例えば０．４以上である抗体含有試料を、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択することができる。
【００１６】
更に別の観点によれば、複数の抗体含有試料を、本発明の方法により同一条件下においてスクニーニングし、シグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）が、例えば、上位５０％以内のもの、好ましくは上位４０％以内のもの、より好ましくは上位３０％以内のもの、より好ましくは上位２０％以内のもの、より好ましくは上位１０％以内のもの、より好ましくは上位５％以内のものを、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択してもよい。更に別の観点によれば、複数の抗体含有試料を、本発明の方法により同一条件下においてスクニーニングし、シグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）の偏差値が、例えば５０以上、好ましくは５５以上、より好ましくは６０以上、より好ましくは６５以上、より好ましくは７０以上である抗体含有試料を、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択してもよい。
【００１７】
本発明のスクリーニングの対象となる抗体含有試料における抗体の種類は特に限定されず、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。抗体含有試料としては、抗体産生細胞の培養上清を使用することができ、さらに好ましくは抗体産生ハイブリドーマの培養上清を用いることができる。また、ハイブリドーマとしては、複数のクローンに由来するハイブリドーマでもよいし、限界希釈後の単一クローンに由来する抗体産生ハイブリドーマを用いてもよい。
【００１８】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの取得は、通常の方法で行うことができる。すなわち、抗原をアジュバンドとともに数回腹腔等に注射して、脾臓細胞を取り出しポリエチレングリコール等を用いてマウスミエローマ細胞と融合させればよい。例えば、以下の通り行うことができる。
【００１９】
先ず、所望の抗原を、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は特に限定されないが、例えば、アジュバントを用いないときは0.1〜100mgであり、アジュバントを用いるときは1〜2000μgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは2〜5週間間隔で、１〜10回、好ましくは2〜5回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１〜60日後、好ましくは１〜14日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
【００２０】
ハイブリドーマを得るため、上記の抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えば P3X63-Ag.8.U1(P3U1)、NS-Iなどのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
【００２１】
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI-1640培地などの動物細胞培養用培地中で、１×106〜１×107個/mlの抗体産生細胞と２×105〜２×106個/mlのミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比５：１が好ましい）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量1000〜6000ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激(例えばエレクトロポレーション)を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００２２】
上記の細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有RPMI-1640培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に３×105個/well程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、14日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００２３】
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。本発明においては、任意のサブクラスの抗体に結合できる捕捉抗体を固定化した第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップと、抗原を固定化した第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップのそれぞれに、上記のハイブリドーマの培養上清を接触させ、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップ及び第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおける表面プラズモン共鳴の変化を測定してそれぞれのシグナル値を取得することができる。
【００２４】
ハイブリドーマのクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立することができる。
【００２５】
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを10％ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件(例えば37℃、５％ CO2濃度)で7〜14日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
【００２６】
腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×107個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採集する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー（プロテインＡ−アガロース等）などの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００２７】
本発明においては、任意のサブクラスの抗体に結合できる捕捉抗体を固定化した第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップと、抗原を固定化した第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップのそれぞれに、上記のハイブリドーマの培養上清を接触させ、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップ及び第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおける表面プラズモン共鳴の変化を測定してそれぞれのシグナル値を取得する。
【００２８】
任意のサブクラスの抗体に結合できる捕捉抗体としては、例えば、スクリーニング対象の抗体が、マウス抗体である場合には、任意のサブクラスのマウス抗体に結合できるα-マウスイムノグロブリンなどを用いることができる。
【００２９】
次に、本発明で用いる表面プラズモン共鳴分析について説明する。表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００３０】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００３１】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００３２】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００３３】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００３４】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００３５】
上述した表面プラズモン測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には、金属膜の上に被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定することができる。
【００３６】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。
【００３７】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【００３８】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
（参考例）
細胞融合後の作業スキームを図１に示す。細胞融合後に、抗体産生細胞のスクリーニングを行い、更にその後の限界希釈後にハイブリドーマ樹立細胞を選択する必要がある。
【００４０】
（抗体産生細胞（脾臓細胞）の取得、細胞融合）
免疫マウスより摘出した脾臓細胞をミエローマと混合して細胞融合を実施した。融合方法は、PEG法を採用した。使用細胞は、最終免疫3日後の脾臓細胞。ミエローマは、P3-X63-Ag8-U1。細胞比は、脾臓細胞 ： ミエローマ = 5-10 ： 1とした。脾臓細胞として0.5〜1.0 × 105 cells/wellで96-well plateに播種。培地は、RPMI-1640 + 10 % FBS + HAT（場合によっては更にHCF or IL-6を添加）を使用した。
【００４１】
（ＥＬＩＳＡ）
マウスに抗原（ポリハプテン）を免疫感作した後に、抗体産生を確認するために、マウス抗血清サンプル(約1mL)を採取しELISAで評価を行った。
ELISA条件は、以下のような操作を行った。
１）固相化：T4-BSAを1 μg/mL濃度で50 μL/wellで分注する（4℃，over night）
２）ブロッキング：1 % BSA/PBSを、200 μL/wellで分注する（4℃，over nightまたは室温1〜2時間）
３）1次抗体：各マウス抗血清を段階希釈にて希釈（×100，×1000，×3000，×10000）し、50 μL/wellで分注する（室温，1時間）
４）洗浄：0.05 % Tween-PBSにて3回洗浄
５）2次抗体：抗マウスIgG POD標識抗体を0.1 % BSA/PBSで希釈し、50 μL/wellで分注する（室温，1時間）
６）洗浄：0.05 % Tween-PBSにて5回洗浄
７）発色：発色基質（OPD）を100 μL/wellで分注する（室温，5〜15分）
８）反応停止：2N H2SO4を100 μL/wellで分注する
【００４２】
細胞融合後のELISAスクリーニング結果を図２に示す。38サンプルの陽性サンプルが確認された。この中からクローニングする細胞を選択する必要があるが、どれを選択するかの決定は困難である。
【００４３】
実施例１
（ＳＰＲ装置、センサーチップ、フローセルの説明）
SPRはBiacore社のBiacore3000を使用し、センサーチップは、CM5を使用した。SPR センサーは抗原・抗体複合物等の結合物質を迅速に検出する装置である。 抗原あるいは抗体を金属薄膜に蒸着したセンサーチップ表面に固定化し、このセンサーチップ上に固定化された抗原あるいは抗体に作用する物質を含む試料を一定量流し、抗原抗体反応を起こさせ、この時生じる微妙な金属表面の変化を表面プラズモン共鳴という光学現象を用いて検出し， センサグラムと呼ぶグラフにより表示する。光学的な変化を直接検出する手法であるため標識を行う必要が無く， 短時間で測定できるとともに少量の試料で検出することが可能という特徴を有している。表面プラズモン共鳴とは， ある特定の角度から入射した光は金属表面プラズモンと共鳴し吸収されるが、このとき金属膜の表面で抗原抗体反応等が発生すると， 反射光が高感度に変化するという原理を利用している。
【００４４】
（ＳＰＲ測定条件の説明）
測定装置は Biacore 3000（ビアコア社製） を使用し， センサーチップとして CM5チップ （カルボキシルメチル基を導入） を用いた。抗体は， 抗 サイロキシン（以下 T4） モノクローナル抗体マウス（以下 MAb）IgG1（Medix社製）を使用した。測定試料 （抗原） はT4-BSA（Fitzgerald社製または、別途自社合成品） を使用した。 測定時にこれらの抗体液を移動相 HBS-P（10ｍM HEPES pH7.4， 0.15M NaCl 0.005％ Surfactant P20） で希釈して使用した。
【００４５】
まず， Medix社製抗体の T4-BSAに対する反応性を確認した。Biacore 3000の操作手順としては， まず， センサーチップ （CM5チップ） を装置にセットし， 移動相を用いて装置の安定化を行った．抗体、抗原の固定化溶液 （10mM 酢酸ナトリウム pH5.5） でタンパク質量50μｇ/ml になるように希釈した後，アミノカップリング薬 （200 mM M-Ethyl-3-carbodiimide hydrochloride, 50 mM N-hydroxysuccinimide） でチップの活性化， 抗体、抗原の固定及び１M ethanolamine-HCｌによるブロッキングを行い， 固定化をした。 チップ接触時間は、 活性化， 固定化の順に各７分ずつ行った。
【００４６】
測定条件は Biacore3000の既定条件に従った。 同一抗体による繰り返し測定を行うため， センサーチップ上で結合した抗原を解離溶液 （10mM グリシン-塩酸緩衝液） で解離した。流速は、10μl/min で行った。SPR センサーによる測定結果を図３、４のセンサグラムに示した。測定結果は， センサーチップ上の質量変化をビアコア独自の単位であるリゾナンスユニット （RU） で表した。（1000RU＝1mm2当たり１ng の変化）
【００４７】
（速度論解析の説明）
抗原（T4-BSA）固定化
抗原の固定化は、上記で記載した通りの手法で、固定化量（RU）が、1500を使用した。
抗体液の調製
抗体として、Medix社製の抗体１、及び本実施例で作成した抗体２種（ＦＦ１及び２）を用いた。それぞれ、0.2, 0.4, 1, 2, 5 nMの溶液を作成し、測定に用いた。
【００４８】
（４）ＳＰＲでの評価
上記のFc1及びFc3を用い、以下の条件で抗体溶液を添加して評価を行った。測定結果を図３に、及びBivalent（２価結合の相互作用）での速度論解析結果を表２に示す。
流速、結合、解離、洗浄条件
Flow: 10μL / mL
結合：10 min
解離：20 min
洗浄1 Gly pH1.5：3 min
洗浄2 Gly 10 mM NaOH：3 min
洗浄3 Gly pH1.5：3 min
洗浄4 Gly 10 mM NaOH：3 min
再生：HBSP buffer 8 min
【００４９】
一例として、ELISAで強陽性である1F2ウエルのSPR測定を行った結果を図３に示す。
キャプチャー抗体は、α-Mouse Immunoglobulins（Biacore社製）を使用し、フローセル4に固定化した。抗原としては、T4-BSAを使用し、フローセル3（Fc3）に固定化した。フローセル4（Fc4）において、抗体産生量（ΔRU=388）は確認されたが、Fc3においては、特異抗体産生量は確認されなかった（ΔRU=0）。この細胞ウエルでは、イムノグロブリンは産生されているが、親和性の高い特異抗体は産生されてないことが示唆された。
【００５０】
一方、ELISAで強陽性である9F1ウエルのSPR測定を行った結果を図４に示す。フローセル4（Fc4）において、抗体産生量（ΔRU=402）が確認され、Fc3においても特異抗体の産生量も確認された（ΔRU=104）。この細胞ウエルでは、イムノグロブリンが産生され、親和性の高い特異抗体も産生されていることが示唆された。
【００５１】
この時の２つのフローセルの値の比（ΔRU at Fc3/ ΔRU at Fc4 ×100）を特異抗体結合能の指標として用い、ELISA評価を行った３８ウエルを評価した結果を図５に示す。
参照値：Medix社製市販抗体：5μg/mL（30 nM）, Kd = 10-11M
サブクラス陰性サンプル以外で９サンプルまで絞り込めた。
【００５２】
実施例２
限界希釈後の培養上清サンプルのスクリーニングも、実施例１と同じように行った。その結果を図６に示す。クローン名9F1では、9F1D8, 9F1E1の２株を選択した。また、クローン名22G8では、22G8A2, 22G8E6の２株を選択した。同様に、他のクローンについてもスクリーニングを行った結果を表１に示す。
【００５３】
【表１】
【００５４】
結合能の指標の高い9F1D8と22G8A2の２株について、マウス２０匹腹水法で抗体作製を行った。その結果を表２に示す。
【００５５】
【表２】
【００５６】
実施例３
各抗体の速度論解析を行った結果を図７に示す。Biacore社製T100、センサーチップはCM5を用いて行った。抗原（T4-BSA）の固定化量は、100RU、流速：10μL/min, 結合：10 min, 解離：10 minで行った。
速度論解析の結果を以下の表３に示す。
【００５７】
【表３】
【００５８】
22G8A2から作製したモノクローナル抗体は、市販抗体よりも解離定数が小さい高親和性の抗体であることがわかった。また、結合速度が市販抗体より約１０倍高いことが分かった。親和性の高く、結合速度の速い抗体が得られたことで、より感度の良いアッセイ系への応用が期待できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原に対する高い親和性を有する特異抗体のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体作製における細胞融合後の特異抗体のスクリーニング方法としては、従来は、ELISA法を用いてスクリーニングを行っている。しかし、モノクローナル抗体産生細胞の培養上清中における特異抗体の濃度は、細胞によって異なるため、特異抗体を効率よくスクリーニングすることは困難である。モノクローナル抗体の作製においては、抗体産生細胞である脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを作成するが、作成したハイブリドーマの中から、抗原に対して特異性及び親和性の高い抗体を産生するハイブリドーマをいかにして選択するかが重要である。しかし、ハイブリドーマの培養上清中における抗体産生量はハイブリドーマ毎に異なるため、培養上清中の抗体濃度はハイブリドーマ毎に異なり、ばらついている。そのため、従来のELISA評価では、多数の偽陽性サンプルを選択してしまう可能性が高かった。また、細胞が産生する抗体の抗原に対する親和性も分からないため、抗原に対して特異性及び親和性が高い抗体を合理的にスクリーングすることは困難であった。
【０００３】
一方、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできる技術の一つとして、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析が知られている、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析においては、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析することができる。生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜としては、例えば、金属と結合する官能基、鎖長の原子数が１０以上のリンカー、及び生理活性物質と結合できる官能基を有する化合物を用いて、生理活性物質を固定化した測定チップが報告されている（特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第２８１５１２０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
即ち、本発明は、抗原に対する高い親和性を有するモノクローナル抗体を高い精度でスクリーニングできる方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、任意のサブクラスの抗体（IgG、IgM、IgEなど）と結合することができる捕捉抗体を、表面プラズモン共鳴分析用のセンサーチップ上に固定化し、ハイブリドーマ培養上清中の全イムノグロブリン量を定量し、また、別のセンサーチップに特異抗原を固定化し、ハイブリドーマ培養上清中の特異抗体量を定量し、それぞれのシグナル値（ΔRU）の比率を比較することによって、抗原に対する親和性が高い特異抗体を産生するハイブリドーマを選択することに成功し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明によれば、任意のサブクラスの抗体に結合できる捕捉抗体を固定化した第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップと、抗原を固定化した第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップのそれぞれに、抗体含有試料を接触させ、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップ及び第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおける表面プラズモン共鳴の変化を測定してそれぞれのシグナル値を取得し、それぞれのシグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）を比較することによって、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料を選択することを含む、抗体のスクリーニング方法が提供される。
【０００８】
好ましくは、抗体含有試料は、モノクローナル抗体含有試料である。
好ましくは、抗体含有試料は、抗体産生細胞の培養上清である。
好ましくは、抗体含有試料は、抗体産生ハイブリドーマの培養上清である。
好ましくは、抗体含有試料は、限界希釈後の単一クローンに由来する抗体産生ハイブリドーマの培養上清である。
【０００９】
好ましくは、シグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）が所定の基準値以上である試料を、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、捕捉抗体のイムノグロブリン結合能とSPRセンシングを用いて、ハイブリドーマなどの抗体産生細胞の全抗体産生量と特異抗体産生量を定量することにより、抗原に対する親和性が高い特異抗体を高い精度でスクリーニングすることが可能である。本発明によれば、ELISAによるスクリーニング法で偽陽性と判断したサンプルを見分けることができる。また、本発明によれば、培養上清中の抗体濃度が分からない場合であっても、抗原に対する親和性が高い特異抗体を効率よくスクリーニングすることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、細胞融合後の作業スキームを示す。
【図２】図２は、細胞融合後のELISAスクリーニング結果を示す。
【図３】図３は、ELISAで強陽性である1F2ウエルのSPR測定を行った結果であるSPRセンサーグラム（1F2）を示す。
【図４】図４は、ELISAで強陽性である9F1ウエルのSPR測定を行った結果であるSPRセンサーグラム（9F1）を示す。
【図５】図５は、２つのフローセルの値の比（ΔRU at Fc3/ ΔRU at Fc4 *100 ）を特異抗体結合能の指標として用い、ELISA評価を行った３８ウエルを評価した結果を示す。
【図６】図６は、限界希釈後の培養上清サンプルのスクリーニングの結果を示す。左は9F1のスクリーニング結果を示し、右は22G8のスクリーニング結果を示す。
【図７】図７は、各抗体の速度論解析を行った結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明においては、任意のサブクラスの抗体に結合できる捕捉抗体を固定化した第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップと、抗原を固定化した第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップのそれぞれに、抗体含有試料を接触させ、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップ及び第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおける表面プラズモン共鳴の変化を測定してそれぞれのシグナル値を取得する。次いで、上記で取得したそれぞれのシグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）を比較することによって、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料を選択することによって、抗体のスクリーニングを行う。
【００１３】
シグナル値の比率の比較においては、例えば、シグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）が所定の基準値以上である試料を、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択することができる。上記した「所定の基準値」は、測定条件（例えば、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップに固定化した捕捉抗体の量、第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップに固定化した抗原の量）、並びに取得を意図する抗体の抗原に対する親和性の程度に応じて、所望の値に設定することができる。上記した「所定の基準値」は、例えば、本発明で用いる「任意のサブクラスの抗体に結合できる捕捉抗体を固定化した第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップと、抗原を固定化した第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップ」のそれぞれに、当該抗原に対する既存の抗体（以下、基準抗体とも称する）を接触させ、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップ及び第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおける表面プラズモン共鳴の変化を測定してそれぞれのシグナル値を取得することによって得られるそれぞれのシグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）と同じ値に設定してもよい。あるいは、「所定の基準値」は、上記した基準抗体を用いて測定した場合のシグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）に所定の比率（例えば、０．１から１．０の間の任意の比率、例えば、０．４又は０．８など）を掛けた値に設定してもよい。なお、上記した基準抗体としては、当該抗原に対する抗体であれば任意の抗体を用いることができるが、抗原に対して所望の親和性を有する抗体を用いることが特に好ましい。
【００１４】
本発明の一例としては、シグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）が、基準抗体におけるシグナル値の比率の４０％以上である抗体含有試料を、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択してもよいし、あるいはシグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）が、基準抗体におけるシグナル値の比率の８０％以上である抗体含有試料を、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択してもよい。
【００１５】
なお、シグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）は、測定条件（例えば、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップに固定化した捕捉抗体の量、第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップに固定化した抗原の量など）により変動するため、一般的には、シグナル値の比率の絶対値を、試料の選別の指標とすることは適切ではないと考えられる。しかし、本発明の一例として本明細書の実施例に記載するような条件下又はそれに準ずる条件下においては、シグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）が、例えば０．２以上である抗体含有試料を、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択することができ、あるいは上記のシグナル値の比率が、例えば０．４以上である抗体含有試料を、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択することができる。
【００１６】
更に別の観点によれば、複数の抗体含有試料を、本発明の方法により同一条件下においてスクニーニングし、シグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）が、例えば、上位５０％以内のもの、好ましくは上位４０％以内のもの、より好ましくは上位３０％以内のもの、より好ましくは上位２０％以内のもの、より好ましくは上位１０％以内のもの、より好ましくは上位５％以内のものを、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択してもよい。更に別の観点によれば、複数の抗体含有試料を、本発明の方法により同一条件下においてスクニーニングし、シグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）の偏差値が、例えば５０以上、好ましくは５５以上、より好ましくは６０以上、より好ましくは６５以上、より好ましくは７０以上である抗体含有試料を、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択してもよい。
【００１７】
本発明のスクリーニングの対象となる抗体含有試料における抗体の種類は特に限定されず、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。抗体含有試料としては、抗体産生細胞の培養上清を使用することができ、さらに好ましくは抗体産生ハイブリドーマの培養上清を用いることができる。また、ハイブリドーマとしては、複数のクローンに由来するハイブリドーマでもよいし、限界希釈後の単一クローンに由来する抗体産生ハイブリドーマを用いてもよい。
【００１８】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの取得は、通常の方法で行うことができる。すなわち、抗原をアジュバンドとともに数回腹腔等に注射して、脾臓細胞を取り出しポリエチレングリコール等を用いてマウスミエローマ細胞と融合させればよい。例えば、以下の通り行うことができる。
【００１９】
先ず、所望の抗原を、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は特に限定されないが、例えば、アジュバントを用いないときは0.1〜100mgであり、アジュバントを用いるときは1〜2000μgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは2〜5週間間隔で、１〜10回、好ましくは2〜5回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１〜60日後、好ましくは１〜14日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
【００２０】
ハイブリドーマを得るため、上記の抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えば P3X63-Ag.8.U1(P3U1)、NS-Iなどのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
【００２１】
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI-1640培地などの動物細胞培養用培地中で、１×106〜１×107個/mlの抗体産生細胞と２×105〜２×106個/mlのミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比５：１が好ましい）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量1000〜6000ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激(例えばエレクトロポレーション)を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００２２】
上記の細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有RPMI-1640培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に３×105個/well程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、14日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００２３】
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。本発明においては、任意のサブクラスの抗体に結合できる捕捉抗体を固定化した第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップと、抗原を固定化した第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップのそれぞれに、上記のハイブリドーマの培養上清を接触させ、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップ及び第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおける表面プラズモン共鳴の変化を測定してそれぞれのシグナル値を取得することができる。
【００２４】
ハイブリドーマのクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立することができる。
【００２５】
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを10％ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件(例えば37℃、５％ CO2濃度)で7〜14日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
【００２６】
腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×107個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採集する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー（プロテインＡ−アガロース等）などの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００２７】
本発明においては、任意のサブクラスの抗体に結合できる捕捉抗体を固定化した第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップと、抗原を固定化した第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップのそれぞれに、上記のハイブリドーマの培養上清を接触させ、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップ及び第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおける表面プラズモン共鳴の変化を測定してそれぞれのシグナル値を取得する。
【００２８】
任意のサブクラスの抗体に結合できる捕捉抗体としては、例えば、スクリーニング対象の抗体が、マウス抗体である場合には、任意のサブクラスのマウス抗体に結合できるα-マウスイムノグロブリンなどを用いることができる。
【００２９】
次に、本発明で用いる表面プラズモン共鳴分析について説明する。表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００３０】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００３１】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００３２】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００３３】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００３４】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００３５】
上述した表面プラズモン測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には、金属膜の上に被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定することができる。
【００３６】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。
【００３７】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【００３８】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
（参考例）
細胞融合後の作業スキームを図１に示す。細胞融合後に、抗体産生細胞のスクリーニングを行い、更にその後の限界希釈後にハイブリドーマ樹立細胞を選択する必要がある。
【００４０】
（抗体産生細胞（脾臓細胞）の取得、細胞融合）
免疫マウスより摘出した脾臓細胞をミエローマと混合して細胞融合を実施した。融合方法は、PEG法を採用した。使用細胞は、最終免疫3日後の脾臓細胞。ミエローマは、P3-X63-Ag8-U1。細胞比は、脾臓細胞 ： ミエローマ = 5-10 ： 1とした。脾臓細胞として0.5〜1.0 × 105 cells/wellで96-well plateに播種。培地は、RPMI-1640 + 10 % FBS + HAT（場合によっては更にHCF or IL-6を添加）を使用した。
【００４１】
（ＥＬＩＳＡ）
マウスに抗原（ポリハプテン）を免疫感作した後に、抗体産生を確認するために、マウス抗血清サンプル(約1mL)を採取しELISAで評価を行った。
ELISA条件は、以下のような操作を行った。
１）固相化：T4-BSAを1 μg/mL濃度で50 μL/wellで分注する（4℃，over night）
２）ブロッキング：1 % BSA/PBSを、200 μL/wellで分注する（4℃，over nightまたは室温1〜2時間）
３）1次抗体：各マウス抗血清を段階希釈にて希釈（×100，×1000，×3000，×10000）し、50 μL/wellで分注する（室温，1時間）
４）洗浄：0.05 % Tween-PBSにて3回洗浄
５）2次抗体：抗マウスIgG POD標識抗体を0.1 % BSA/PBSで希釈し、50 μL/wellで分注する（室温，1時間）
６）洗浄：0.05 % Tween-PBSにて5回洗浄
７）発色：発色基質（OPD）を100 μL/wellで分注する（室温，5〜15分）
８）反応停止：2N H2SO4を100 μL/wellで分注する
【００４２】
細胞融合後のELISAスクリーニング結果を図２に示す。38サンプルの陽性サンプルが確認された。この中からクローニングする細胞を選択する必要があるが、どれを選択するかの決定は困難である。
【００４３】
実施例１
（ＳＰＲ装置、センサーチップ、フローセルの説明）
SPRはBiacore社のBiacore3000を使用し、センサーチップは、CM5を使用した。SPR センサーは抗原・抗体複合物等の結合物質を迅速に検出する装置である。 抗原あるいは抗体を金属薄膜に蒸着したセンサーチップ表面に固定化し、このセンサーチップ上に固定化された抗原あるいは抗体に作用する物質を含む試料を一定量流し、抗原抗体反応を起こさせ、この時生じる微妙な金属表面の変化を表面プラズモン共鳴という光学現象を用いて検出し， センサグラムと呼ぶグラフにより表示する。光学的な変化を直接検出する手法であるため標識を行う必要が無く， 短時間で測定できるとともに少量の試料で検出することが可能という特徴を有している。表面プラズモン共鳴とは， ある特定の角度から入射した光は金属表面プラズモンと共鳴し吸収されるが、このとき金属膜の表面で抗原抗体反応等が発生すると， 反射光が高感度に変化するという原理を利用している。
【００４４】
（ＳＰＲ測定条件の説明）
測定装置は Biacore 3000（ビアコア社製） を使用し， センサーチップとして CM5チップ （カルボキシルメチル基を導入） を用いた。抗体は， 抗 サイロキシン（以下 T4） モノクローナル抗体マウス（以下 MAb）IgG1（Medix社製）を使用した。測定試料 （抗原） はT4-BSA（Fitzgerald社製または、別途自社合成品） を使用した。 測定時にこれらの抗体液を移動相 HBS-P（10ｍM HEPES pH7.4， 0.15M NaCl 0.005％ Surfactant P20） で希釈して使用した。
【００４５】
まず， Medix社製抗体の T4-BSAに対する反応性を確認した。Biacore 3000の操作手順としては， まず， センサーチップ （CM5チップ） を装置にセットし， 移動相を用いて装置の安定化を行った．抗体、抗原の固定化溶液 （10mM 酢酸ナトリウム pH5.5） でタンパク質量50μｇ/ml になるように希釈した後，アミノカップリング薬 （200 mM M-Ethyl-3-carbodiimide hydrochloride, 50 mM N-hydroxysuccinimide） でチップの活性化， 抗体、抗原の固定及び１M ethanolamine-HCｌによるブロッキングを行い， 固定化をした。 チップ接触時間は、 活性化， 固定化の順に各７分ずつ行った。
【００４６】
測定条件は Biacore3000の既定条件に従った。 同一抗体による繰り返し測定を行うため， センサーチップ上で結合した抗原を解離溶液 （10mM グリシン-塩酸緩衝液） で解離した。流速は、10μl/min で行った。SPR センサーによる測定結果を図３、４のセンサグラムに示した。測定結果は， センサーチップ上の質量変化をビアコア独自の単位であるリゾナンスユニット （RU） で表した。（1000RU＝1mm2当たり１ng の変化）
【００４７】
（速度論解析の説明）
抗原（T4-BSA）固定化
抗原の固定化は、上記で記載した通りの手法で、固定化量（RU）が、1500を使用した。
抗体液の調製
抗体として、Medix社製の抗体１、及び本実施例で作成した抗体２種（ＦＦ１及び２）を用いた。それぞれ、0.2, 0.4, 1, 2, 5 nMの溶液を作成し、測定に用いた。
【００４８】
（４）ＳＰＲでの評価
上記のFc1及びFc3を用い、以下の条件で抗体溶液を添加して評価を行った。測定結果を図３に、及びBivalent（２価結合の相互作用）での速度論解析結果を表２に示す。
流速、結合、解離、洗浄条件
Flow: 10μL / mL
結合：10 min
解離：20 min
洗浄1 Gly pH1.5：3 min
洗浄2 Gly 10 mM NaOH：3 min
洗浄3 Gly pH1.5：3 min
洗浄4 Gly 10 mM NaOH：3 min
再生：HBSP buffer 8 min
【００４９】
一例として、ELISAで強陽性である1F2ウエルのSPR測定を行った結果を図３に示す。
キャプチャー抗体は、α-Mouse Immunoglobulins（Biacore社製）を使用し、フローセル4に固定化した。抗原としては、T4-BSAを使用し、フローセル3（Fc3）に固定化した。フローセル4（Fc4）において、抗体産生量（ΔRU=388）は確認されたが、Fc3においては、特異抗体産生量は確認されなかった（ΔRU=0）。この細胞ウエルでは、イムノグロブリンは産生されているが、親和性の高い特異抗体は産生されてないことが示唆された。
【００５０】
一方、ELISAで強陽性である9F1ウエルのSPR測定を行った結果を図４に示す。フローセル4（Fc4）において、抗体産生量（ΔRU=402）が確認され、Fc3においても特異抗体の産生量も確認された（ΔRU=104）。この細胞ウエルでは、イムノグロブリンが産生され、親和性の高い特異抗体も産生されていることが示唆された。
【００５１】
この時の２つのフローセルの値の比（ΔRU at Fc3/ ΔRU at Fc4 ×100）を特異抗体結合能の指標として用い、ELISA評価を行った３８ウエルを評価した結果を図５に示す。
参照値：Medix社製市販抗体：5μg/mL（30 nM）, Kd = 10-11M
サブクラス陰性サンプル以外で９サンプルまで絞り込めた。
【００５２】
実施例２
限界希釈後の培養上清サンプルのスクリーニングも、実施例１と同じように行った。その結果を図６に示す。クローン名9F1では、9F1D8, 9F1E1の２株を選択した。また、クローン名22G8では、22G8A2, 22G8E6の２株を選択した。同様に、他のクローンについてもスクリーニングを行った結果を表１に示す。
【００５３】
【表１】
【００５４】
結合能の指標の高い9F1D8と22G8A2の２株について、マウス２０匹腹水法で抗体作製を行った。その結果を表２に示す。
【００５５】
【表２】
【００５６】
実施例３
各抗体の速度論解析を行った結果を図７に示す。Biacore社製T100、センサーチップはCM5を用いて行った。抗原（T4-BSA）の固定化量は、100RU、流速：10μL/min, 結合：10 min, 解離：10 minで行った。
速度論解析の結果を以下の表３に示す。
【００５７】
【表３】
【００５８】
22G8A2から作製したモノクローナル抗体は、市販抗体よりも解離定数が小さい高親和性の抗体であることがわかった。また、結合速度が市販抗体より約１０倍高いことが分かった。親和性の高く、結合速度の速い抗体が得られたことで、より感度の良いアッセイ系への応用が期待できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意のサブクラスの抗体に結合できる捕捉抗体を固定化した第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップと、抗原を固定化した第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップのそれぞれに、抗体含有試料を接触させ、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップ及び第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおける表面プラズモン共鳴の変化を測定してそれぞれのシグナル値を取得し、それぞれのシグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）を比較することによって、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料を選択することを含む、抗体のスクリーニング方法。
【請求項２】
抗体含有試料が、モノクローナル抗体含有試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗体含有試料が、抗体産生細胞の培養上清である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
抗体含有試料が、抗体産生ハイブリドーマの培養上清である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
抗体含有試料が、限界希釈後の単一クローンに由来する抗体産生ハイブリドーマの培養上清である、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
シグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）が所定の基準値以上である試料を、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択する、請求項１から５の何れかに記載の方法。
【請求項１】
任意のサブクラスの抗体に結合できる捕捉抗体を固定化した第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップと、抗原を固定化した第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップのそれぞれに、抗体含有試料を接触させ、第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップ及び第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおける表面プラズモン共鳴の変化を測定してそれぞれのシグナル値を取得し、それぞれのシグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）を比較することによって、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料を選択することを含む、抗体のスクリーニング方法。
【請求項２】
抗体含有試料が、モノクローナル抗体含有試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗体含有試料が、抗体産生細胞の培養上清である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
抗体含有試料が、抗体産生ハイブリドーマの培養上清である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
抗体含有試料が、限界希釈後の単一クローンに由来する抗体産生ハイブリドーマの培養上清である、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
シグナル値の比率（第二の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値／第一の表面プラズモン共鳴分析用センサーチップにおけるシグナル値）が所定の基準値以上である試料を、抗原に対する親和性が高い特異抗体を含有する試料として選択する、請求項１から５の何れかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１１−７６６４（Ｐ２０１１−７６６４Ａ）
【公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１５２１１３（Ｐ２００９−１５２１１３）
【出願日】平成２１年６月２６日（２００９．６．２６）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月２６日（２００９．６．２６）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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