改良された等温鎖置換増幅
等温ＤＮＡ増幅のための方法であって、増幅されるＤＮＡに、ＤＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的であり、キサントシンを含有する第１のプライマーと、ＤＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的であり、キサントシンを含有する第２のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、鎖置換が可能な酵素と、二本鎖ＤＮＡ中のキサントシンを認識し、キサントシンの位置またはその近傍で一方のＤＮＡ鎖においてニックを入れるか、または１塩基を切り取る酵素とを含む増幅混合物を提供する工程；および熱サイクリングを実質的に伴わずにＤＮＡを増幅する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱サイクリングを実質的に伴わずに核酸分子を増幅するための、改良された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸配列集団内から特定の配列を増幅するのに最も広く用いられる方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である（Dieffenbach CおよびDveksler G編、PCR Primer: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、Plainview、NY）。この増幅法では、相補鎖上の、増幅される領域のいずれかの末端の、一般に１５〜３０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドが、変性させた一本鎖ＤＮＡ鋳型上でのＤＮＡ合成のプライミングに用いられる。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いる変性、プライマーハイブリダイゼーション、およびＤＮＡ鎖合成の連続的なサイクルにより、プライマー間の配列が指数関数的に増幅される。ＲＮＡ配列は、ｃＤＮＡコピーを生成させる逆転写酵素を用いてまずこれをコピーすることにより、増幅することができる。増幅されたＤＮＡ断片は、ゲル電気泳動、標識プローブによるハイブリダイゼーション、その後の同定（例えば、酵素結合アッセイによる）を可能とするタグを付したプライマーの使用、標的ＤＮＡとハイブリダイズするとシグナルを発生させる、蛍光タグを付したプライマー（例えば、Ｂｅａｃｏｎシステム、およびＴａｑＭａｎシステム）の使用を包含する、各種の手段により検出することができる。
【０００３】
ＰＣＲの１つの欠点は、増幅混合物を加熱および冷却してＤＮＡを変性させる、サーマルサイクラーを必要とすることである。この増幅は、旧式の施設では実施することができないか、または実験室環境外では容易に操作することができない。
【０００４】
ＰＣＲに加えて、特定の配列を検出および増幅するための各種の他の技法が開発されている。一例は、リガーゼ連鎖反応（Barany F、Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193、1991）である。
【０００５】
増幅反応時の標的の熱変性に依存する従来のＤＮＡ増幅法に加えて、増幅反応時に鋳型の変性を必要とせず、このため等温増幅技術と呼ばれる多数の方法が記述されている。
【０００６】
等温増幅は、１９９２年に初めて記述され（Walker GT、Little MC、Nadeau JG、およびShank D.、Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system、PNAS 89: 392-396、1992）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）と名づけられた。それ以来、ＲＮＡ配列はコピーするが、対応するゲノムＤＮＡはコピーしないＲＮＡポリメラーゼを用いた、転写媒介増幅（ＴＭＡ）および核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）を包含する、他の多数の等温増幅技術が記述されている（Guatelli JC、Whitfield KM、Kwoh DY、Barringer KJ、Richmann DD、およびGingeras TR、Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication、PNAS 87: 1874-1878、1990; Kievits T、van Gemen B、van Strijp D、Schukkink R、Dircks M、Adriaanse H、Malek L、Sooknanan R、Lens P、NASBA isothermal enzymatic in vitro nucleic acid amplification optimized for the diagnosis of HIV-1 infection、J Virol Methods、1991年12月、35（3）:273-86）。
【０００７】
他のＤＮＡベースの等温技法には、ＤＮＡポリメラーゼにより、環状鋳型に対するプライマーを伸長させる、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（Fire AおよびXu SQ、Rolling replication of short circles、PNAS 92: 4641-4645、1995）；標的を検出するのに環状プローブを用いる分枝増幅（Ramification amplification）（ＲＡＭ）（Zhang W、Cohenford M、Lentrichia B、Isenberg HD、Simson E、Li H、Yi J、Zhang DY、Detection of Chlamydia trachomatis by isothermal ramification amplification method: a feasibility study、J Clin Microbiol. 2002年1月、40（1）:128-32）；ならびに、より近年では、熱の代わりにヘリカーゼ酵素を用いてＤＮＡ鎖を巻き戻す、ヘリカーゼ依存等温ＤＮＡ増幅（ＨＤＡ）（Vincent M、Xu Y、Kong H、Helicase-dependent isothermal DNA amplification、EMBO Rep. 2004年8月、5（8）:795-800）が含まれる。
【０００８】
従来の増幅法は、増幅反応の各サイクルにおける標的分子の変性と再生のサイクルを継続することに依存する。ＤＮＡの熱処理は、ＤＮＡ分子に対してある程度のせん断を結果としてもたらし、したがって、発生中の胚盤胞細胞の少数の細胞からＤＮＡを単離する場合、または、特に、ＤＮＡが、組織切片、パラフィンブロック、および古代ＤＮＡ試料中など、既に断片形態にある場合など、ＤＮＡが限定される場合、この加熱冷却サイクルによって、ＤＮＡがさらに損傷を受け、その結果、増幅シグナルがさらに失われる可能性がある。等温法は、一本鎖分子を生成させて、さらなる増幅のための鋳型として用いるために鋳型ＤＮＡの変性を継続することには依存せず、一定温度で、特定の制限エンドヌクレアーゼによりＤＮＡ分子を酵素的にニッキングすることに依存する。
【０００９】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）と呼ばれる技法は、特定の制限酵素の、半修飾(hemi-modified)ＤＮＡの非修飾鎖にニックを入れる能力と、５’−３’エクソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼが下流の鎖を伸長および置換する能力とに依存する。次いで、センス反応の置換鎖を、アンチセンス反応の鋳型として用いて、センス反応とアンチセンス反応とを組み合わせることにより、指数関数的増幅が達成される（Walker GT、1992）。このような技法は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Walker GT、1992）、ＨＩＶ−１、Ｃ型肝炎、およびＨＰＶ−１６（Nuovo G J、2000）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（Spears PA、Linn P、Woodard DL、およびWalker GT、Simultaneous Strand Displacement Amplification and Fluorescence Polarization Detection of Chlamydia trachomatis、Anal. Biochem. 247: 130-137、1997）に用いられ、増幅に成功している。
【００１０】
ＳＤＡの使用はこれまで、半ホスホロチオエートＤＮＡ二重鎖を作製するために、修飾鎖上では酵素切断に耐性であり、その結果、消化ではなく酵素によるニッキングをもたらして置換反応を起こさせる、修飾ホスホロチオエートヌクレオチドに依存してきた。しかし、近年では、いくつかの「ニッカーゼ」酵素が遺伝子工学的に作製されている。これらの酵素は、従来のようにＤＮＡを切断せず、ＤＮＡ鎖の一方にニックを入れる。「ニッカーゼ」酵素には、Ｎ．Ａｌｗ１（Xu Y、Lunnen KD、およびKong H、Engineering a nicking endonuclease N.Alw1 by domain swapping、PNAS 98: 12990-12995、2001）、Ｎ．ＢｓｔＮＢ１（Morgan RD、Calvet C、Demeter M、Agra R、Kong H、Characterization of the specific DNA nicking activity of restriction endonuclease N.BstNBI、Biol Chem.、2000年11月、381（11）:1123-5）、およびＭｌｙ１（Besnier CE、Kong H、Converting MlyI endonuclease into a nicking enzyme by changing its oligomerization state、EMBO Rep.、2001年9月、2（9）:782-6、電子版2001年8月23日）が含まれる。
【００１１】
さらに、ＳＤＡは、熱安定性制限酵素（Ａｖａ１）と、熱安定性ｅｘｏ−ポリメラーゼ（Ｂｓｔポリメラーゼ）との組合せを用いることにより改良された。この組合せは、反応の増幅効率を、１０８倍の増幅から１０１０倍の増幅へと増大させることが示され、この技法を用いて、固有の単一コピー分子を増幅することが可能となる。熱安定性ポリメラーゼ／酵素の組合せを用いる結果としてもたらされる増幅倍数は、ほぼ１０９倍程度である（Milla M. A.、Spears P. A、Pearson R E、およびWalker G T、Use of the Restriction Enzyme Ava1 and Exo-Bst Polymerase in Strand Displacement Amplification Biotechniques、24:392-396、1997）。
【００１２】
現在のところ、すべての等温ＤＮＡ増幅法は、増幅を開始する前に、変性させる最初の二本鎖鋳型ＤＮＡ分子を必要とする。加えて、各プライミング事象から増幅は１回しか開始されない。
【００１３】
イノシン、デオキシイノシン、８デオキシグアニン、ヒドロキシウラシル、５−メチル−ｄＣ、５−ヒドロキシウリジン、Ｃを伴う５−ブロモ−ｄＵイノシン、リボヌクレオチド、およびウラシルなどの非正規ＤＮＡ塩基は、等温増幅において有用であることが判明している（国際公開２００６／１２５２６７号（Human Genetic Signatures株式会社））。
【００１４】
ここで、本発明者らにより、好ましい先行技術の非正規塩基であるイノシンより、等温増幅において、１０〜１０００倍良好な成果をもたらす、新規の非正規塩基が見出された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明者らは、非正規塩基、酵素、およびプライマーを用いる改良された増幅法であって、温度サイクリングの反復を必要としない方法を開発した。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
第１の態様において、本発明は、等温ＤＮＡ増幅のための方法であって、
増幅されるＤＮＡに、
ＤＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的であり、キサントシンを含有する第１のプライマーと、
ＤＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的であり、キサントシンを含有する第２のプライマーと、
ＤＮＡポリメラーゼと、
鎖置換が可能な酵素と、
二本鎖ＤＮＡ中のキサントシンを認識し、キサントシンの位置またはその近傍で一方のＤＮＡ鎖においてニックを入れるか、または１塩基を切り取る酵素と
を含む増幅混合物を提供する工程；および
熱サイクリングを実質的に伴わずにＤＮＡを増幅する工程
を含む方法を提供する。
【００１７】
場合により、ＤＮＡは、増幅混合物を添加する前、添加する間、または添加した後に変性されることができる。
【００１８】
好ましくは、第１のプライマーは、ＤＮＡの第１の鎖の領域に少なくとも部分的に相補的であり、第２のプライマーは、ＤＮＡの第２の鎖のＤＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である。
【化１】
【００１９】
第１および第２のプライマーは、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、またはキメラ性のオリゴヌクレオチド、例えば、ＰＮＡ／オリゴヌクレオチドもしくはＩＮＡ／オリゴヌクレオチドであってよい。好ましくは、前記プライマーはデオキシオリゴヌクレオチドである。
【００２０】
好ましくは、オリゴヌクレオチド類似体は、挿入(intercalating)核酸（ＩＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、ＭＮＡ、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、シクロヘキサニル核酸（ＣＡＮ）、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、核酸ベースのコンジュゲート、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リクソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、２’−ＯＲ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ、これらの混合物およびこれらのハイブリッド、ならびにこれらのリン原子修飾型（例えば、限定的ではないが、ホスホロチオエート、メチルホスホレート、ホスホラミダイト、ホスホロジチエート、ホスホロセレノエート、ホスホトリエステルおよびホスホボラノエート）からなる群から選択される。さらに、ヌクレオチドを連結するために、非リン含有化合物（例えば、限定的ではないが、メチルイミノメチル、ホルムアセテート、チオホルムアセテートおよび連結基含有アミド）を、用い得る。特に、核酸および核酸類似体は、１または複数の挿入剤(intercalator)シュードヌクレオチドを含有し得る。
【００２１】
ＩＮＡとは、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開０３／０５１９０１号、国際公開０３／０５２１３２号、国際公開０３／０５２１３３号および国際公開０３／０５２１３４号（Unest A/S、Human Genentic Signatures株式会社に譲渡）の教示による挿入核酸を意味する。ＩＮＡは、１または複数の挿入剤シュードヌクレオチド（ＩＰＮ）分子を含有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体である。
【００２２】
キサントシンを有するプライマーがＤＮＡに結合すると、酵素によって認識される部位を形成する。
【００２３】
プライマーは、１または複数のキサントシンを有してよい。ある状況では、２または複数のキサントシンが増幅プロセスを改善することができる。キサントシンは、近接して、または少なくとも数個の正規塩基により隔てられて、位置することができる。
【００２４】
ＤＮＡポリメラーゼは、ＴａｑポリメラーゼＳｔｏｆｆｅｌ断片、Ｔａｑポリメラーゼ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ、Ｔｉｔａｎｉｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼターボ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−ポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、９°Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｘｐａｎｄ ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＥＸＴポリメラーゼ（ＤｙＮＡｚｙｍｅＩＩ ＤＮＡポリメラーゼとプルーフリーディング酵素の最適化混合物。ＤｙＮＡｚｙｍｅＩＩ ＤＮＡポリメラーゼは、Thermus brockianus由来のクローンＤｙＮＡｚｙｍｅ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現するE.coli株から単離精製される(New England Biolabs Inc, USA)）、クレノウ断片、ＤＮＡポリメラーゼ１、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）（ポリメラーゼ活性を保持し、３’−５’エクソヌクレアーゼ活性を事実上伴わない、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子操作型(Affymetrix Inc, USA)）、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｂｃａポリメラーゼ、ｐｈｉ−２９ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼベータまたはこれらの改変バージョンなど、任意の適切なポリメラーゼであってよい。
【００２５】
鎖置換酵素は、鎖置換可能なヘリカーゼ、ＡＰエンドヌクレアーゼ、ミスマッチ修復酵素、または鎖置換可能な遺伝子組み換えによる（もしくは他の様式での）修飾酵素など、任意の適切な酵素であってよい。
【００２６】
好ましい形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換能も有する。ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換能を有する任意の適切なポリメラーゼであってよい。例には、限定的ではないが、クレノウ ｅｘｏ−（New England Biolabs (NEB)カタログ番号M0212S）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大型断片（NEBカタログ番号M0275S）、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−（NEBカタログ番号M0257S）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−（NEBカタログ番号M0259S）、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（NEBカタログ番号M0253S）、９０Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ（NEBカタログ番号M0260S）およびＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（NEBカタログ番号M0269S）、ＴｈｅｒｍｏＰｈｉ（商標）（Prokaria ehf）、Ｔｆｉポリメラーゼ（Invitrogen）およびＢＣａポリメラーゼ（Takara）が含まれる。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、クレノウ Ｅｏ−またはＢｓｔポリメラーゼのいずれかである。
【００２７】
好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、エクソヌクレアーゼ欠損である。
【００２８】
酵素は、二本鎖ＤＮＡ中のキサントシンを認識可能であり、キサントシンの位置またはその近傍で一方のＤＮＡ鎖においてニックを入れるか、または１塩基を切り取ることができる、任意の適切な酵素であってよい。
【００２９】
好ましくは、酵素は、エンドヌクレアーゼＶ、ｈＯＧＧ１またはＦｐｇである。特に好ましい態様において、酵素はエンドヌクレアーゼＶである。他の好ましい態様において、酵素はＦｐｇである。
【００３０】
本発明の方法において、二本鎖ＤＮＡ中のキサントシンを認識し、ニックを入れるか、または塩基を切り取ることにより要求に応じて作用する、他の適切な酵素を、作成するか、または獲得することができることが、理解されるであろう。
【００３１】
ＤＮＡ増幅に必要とされる添加剤は、ヌクレオチド、バッファーまたは希釈剤、例えばマグネシウムイオンもしくはマンガンイオン、補因子等、技術分野で既知のものを包含する。
【００３２】
増幅混合物は、ヌクレオチド、バッファーまたは希釈剤、例えばマグネシウムイオンもしくはマンガンイオン、補因子および適切な添加剤、例えば一本鎖結合タンパク質（例えば、Ｔ４ｇｐ３２、ＲｅｃＡ、またはＳＳＢ）も含むことができる。
【００３３】
酵素が所望の活性を有する場合、増幅は、任意の適切な温度で実施することができる。典型的には、温度は、約２０℃〜約７５℃、約２５℃〜６０℃とすることができる。本研究で用いられる酵素の場合、とりわけ、中温性のクレノウ ｅｘｏ−酵素を用いる場合は約４２℃、熱安定性Ｂｓｔポリメラーゼを用いる場合は６０℃が特に適切であることが分かっている。より高温または低温の他の温度もまた用いることができ、周囲温度または室温も含まれることが理解されるであろう。本発明は、核酸を増幅するのに熱サイクリングを必要としないことが重要である。
【００３４】
好ましい実施形態では、増幅混合物が、増幅反応を改善する目的で、塩（ＮａＣｌ）をさらに包含する。熱安定性Ｂｓｔポリメラーゼ／ＴＭＡエンドヌクレアーゼＶによる酵素組合せの場合、約１００ｍＭまでのＮａＣｌが、増幅を改善することが判明した。約５０ｍＭのＮａＣｌが好ましいことが判明した。
【００３５】
好ましい一形態では、一本鎖修飾ＤＮＡを形成する条件下で、シトシン塩基は修飾するが、５’−メチル−シトシン塩基は修飾しない修飾剤により、ＤＮＡを前処理する。重亜硫酸、酢酸、またはクエン酸から修飾剤を選択し、処理の結果として、ＤＮＡが実質的に断片化しないことが好ましい。修飾剤は、水の存在下で、シトシンをウラシルへと修飾する試薬である、重亜硫酸ナトリウムであることがより好ましい。
【００３６】
重亜硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）は、シトシンの５，６位二重結合と容易に反応して、スルホン化シトシン反応の中間体を形成するが、この中間体は、脱アミノ化を受けやすく、水の存在下で亜硫酸ウラシルをもたらす。必要な場合は、穏やかなアルカリ性条件下で亜硫酸基を除去し、その結果として、ウラシルを形成させることができる。したがって、潜在的にすべてのシトシンは、ウラシルへと変換される。しかし、メチル化したシトシンは、メチル化による保護のため、修飾剤により変換させることができない。
【００３７】
核酸を重亜硫酸処理するのに好ましい方法は、参照により本明細書に組み込まれる、Human Genetic Signatures株式会社（オーストラリア）の国際公開２００４／０９６８２５号において見出すことができる。
【００３８】
処理されたＤＮＡの両方の鎖を同じ増幅反応において増幅する必要がある場合は、４つのプライマー（すなわち、修飾されたＤＮＡ鎖の各々につき、２つずつのプライマー）を用いることができる。
【００３９】
第２の態様では、本発明は、少なくとも１つの内部キサントシンを含有し、ＤＮＡの領域に結合すると、キサントシンの位置またはその近傍で、一方のＤＮＡ鎖においてニックを入れるか、または１塩基を切り取ることが可能な酵素により認識される部位を形成する、等温ＤＮＡ増幅のためのプライマーを提供する。
【００４０】
第３の態様では、本発明は、熱サイクリングを実質的に伴わないＤＮＡ増幅のための、本発明の第２の態様によるプライマーの使用を提供する。
【００４１】
本発明の増幅法は、ＰＣＲまたは他の既知のＤＮＡ増幅工程に対する代替法として用いることができる。使用には、疾患の検出、ＤＮＡまたはＲＮＡの所望の遺伝子または断片の増幅、ＳＮＰの検出、リアルタイムにおける増幅手順、重亜硫酸処理したＤＮＡの増幅、全ゲノム増幅法、クローニング法の補助手順(adjunct)；切片または塗抹標本中の微生物の検出、食物汚染における微生物の検出など、細胞学的標本におけるｉｎ ｓｉｔｕのＤＮＡ増幅；各種の癌におけるＢＣＲ−ＡＢＬ転座など、染色体中の切断点の増幅；ＨＰＶ断片の挿入など、発癌性の可能性があり、疾患の進行を予測しうる、染色体内に挿入された配列の増幅；癌性細胞に対する正常細胞における、また、胚盤胞発生の正常性についてのＩＶＦ検査におけるメチル化の変化についてのｉｎ ｓｉｔｕ検査における、非メチル化配列に対するメチル化配列の検出；ならびに感染作用物質の増幅および検出が含まれるがこれらに限定されない。
【００４２】
本発明の顕著な利点は、二本鎖ＤＮＡにおいて直接実施することができるということである。本発明はまた、等温増幅の前に、ＲＮＡの逆転写を実施することにより、ＲＮＡにも用いることができる。さらに、本発明は、増幅のための加熱または冷却を必要としない。本発明による方法は、実験室設備の装備を必要とすることなく、「現場で」、すなわち、室温または周囲温度で実施することができる。
【００４３】
本明細書の全体において、文脈により別段に必要とされない限り、「含む（comprise）」という語、または「含む（comprises）」または「含む（comprising）」などの変化形は、言及された要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群の包含を含意するが、他の任意の要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群の除外は含意しないことが理解される。
【００４４】
本明細書に包含されている文書、行為、材料、装置、製品などについての任意の議論は、本発明に対する関連を示すことだけを目的とする。この議論は、これらの内容のうちのいずれかまたはすべてが、本発明の開発より前に存在した、先行技術基準の一部をなすか、または、本発明に関連する分野における一般的な共通知識であったことの自認として理解されるべきではない。
【００４５】
本発明がより明確に理解されうるように、以下の図面および実施例を参照して、好ましい実施形態を記述する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明による核酸増幅法の概略を示す図である。
【図２】イノシン含有プライマーに最適化された条件を用いる、イノシン含有オリゴヌクレオチドと、キサントシン含有オリゴヌクレオチドとの直接的な比較を示す図である。Ａ．イノシン含有オリゴヌクレオチドに最適化された条件を用いる標的鋳型の増幅を示す。Ｂ．キサントシンに、より高度に最適化された条件を用いる標的鋳型の増幅を示す。
【図３】Ｂｓｔポリメラーゼ／ＴＭＡエンドヌクレアーゼ系を用いる等温増幅の結果を示す図である。
【図４】ＮａＣｌを添加した、Ｂｓｔポリメラーゼ／ＴＭＡエンドヌクレアーゼ系を用いる等温増幅の結果を示す図である。Ａ．イノシン含有オリゴヌクレオチド対照。Ｂ．キサントシン含有オリゴヌクレオチド＋５０ｍＭ ＮａＣｌ。Ｃ．キサントシン含有オリゴヌクレオチド＋１００ｍＭ ＮａＣｌ。
【図５】キサントシン含有増幅プライマーおよびイノシン含有増幅プライマーのリアルタイム比較の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
材料および方法
プライマー
任意の市販のＤＮＡ合成サービスまたは自家用ＤＮＡ合成機を用いて、プライマーを合成することができる。標準的なホスホルアミダイト合成法を用いて、プライマーの任意の位置にキサントシンを組み込むことができる。
【００４８】
酵素
二本鎖ＤＮＡ内のキサントシンを認識し、キサントシンの位置またはその近傍で一方のＤＮＡ鎖においてニックを入れるか、または１塩基を切り取る酵素は、エンドヌクレアーゼＶ（デオキシイノシン３’エンドヌクレアーゼ）（NEB社カタログ番号M0305S）またはＴ．ｍａｒｉｔｉｍａに由来するエンドヌクレアーゼＶの熱安定形（ＴＭＡエンドヌクレアーゼＶ）（Fermentas社カタログ番号EN0141）であることが好ましい。しかし、エンドヌクレアーゼＶの修飾形もしくは変化形、またはエンドヌクレアーゼＶの機能的特徴を有する酵素もまた適することが理解される。
【００４９】
鎖置換が可能な酵素には、クレノウｅｘｏ−、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大型断片、Ｂｃａポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、９０Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ、およびＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。
【００５０】
ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換能を有する任意の適切なポリメラーゼであってよい。例には、クレノウ（exo-）（New England Biolabs（NEB）社カタログ番号M0212S）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大型断片（NEB社カタログ番号M0275S）、Ｖｅｎｔ（exo-）（NEB社カタログ番号M0257S）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（exo-）（NEB社カタログ番号M0259S）、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（NEB社カタログ番号M0253S）、９０Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ（NEB社カタログ番号M0260S）、およびＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（NEB社カタログ番号M0269S）、ならびにＴｈｅｒｍｏＰｈｉ（商標）（Prokaria ehf社製）、Ｔｆｉポリメラーゼ（Invitrogen社製）、およびＢｃａポリメラーゼ（Takara社製）が含まれるがこれらに限定されない。ＤＮＡポリメラーゼは、クレノウ（exo-）またはＢｓｔポリメラーゼであることが好ましい。
【００５１】
増幅
本発明による増幅は、以下の方法：
第１のプライマーを、ＤＮＡの１つの鎖に結合させ（Ａ）、
ＤＮＡポリメラーゼが、第１のプライマーを伸長させて、Ｘ個のキサントシンを含有する、第１の新規合成鎖を有する二本鎖分子を形成し（Ｂ）、
ニッキング酵素により、伸長したＤＮＡのキサントシンの位置またはその近傍で、ニックを入れるか、または塩基を切り取り（Ｃ）、
鎖置換酵素、または鎖置換可能なＤＮＡポリメラーゼにより、第１の新規合成鎖を置換し（Ｄ）、
第２のプライマーを、置換した第１の新規合成鎖に結合させ（Ｅ）、
ＤＮＡポリメラーゼが、第２のプライマーを伸長させて、キサントシンを含有する、第２の新規合成鎖を有する二本鎖分子を形成し（Ｆ）、
ニッキング酵素により、伸長したＤＮＡのキサントシンの位置またはその近傍に、ニックを入れるか、または塩基を切り取り（Ｇ）、
鎖置換酵素、または鎖置換可能なＤＮＡポリメラーゼにより、第２の新規合成鎖を置換し（Ｈ）、
第１のプライマーを、置換した第２の新規合成鎖に結合させ（Ｉ）、
工程を継続して、ＤＮＡの新規合成鎖を繰り返し形成する（Ｊ）
で行われる（図１を参照されたい）。
【００５２】
ポリメラーゼが５’−３’方向で第１のプライマーをコピーしなければ、ニック部位が失われてさらなる増幅が阻止されることにより、第３の増幅サイクルの後に反応が停止してしまうため、このコピーは必須である。次いで、上記の反応は、ニッキング、伸長、および置換のラウンドを繰り返しながら、サイクリングを継続する。プライマーは通常、ポリメラーゼにより再生されて、連続的な増幅ラウンドを可能とする。
【００５３】
結果
イノシン含有プライマーに最適化された条件を用いる、イノシン含有オリゴヌクレオチドと、キサントシン含有オリゴヌクレオチドとの直接的な比較
【化２】
【化３】
【化４】
【００５４】
Ａ クレノウ／エンドヌクレアーゼＶ反応条件
イノシン含有オリゴヌクレオチドのための最適化条件
【００５５】
Ｘ１０ Ｓｔｏｆｆｅｌバッファー １μｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．５μｌ
１００ｎｇ／μｌ プライマー１ ０．５μｌ
１００ｎｇ／μｌ プライマー２ ０．５μｌ
エンドヌクレアーゼＶ ０．０５μｌ
クレノウ ｅｘｏ− ０．４μｌ
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ０．４μｌ
水 ５．５５ μｌ
【００５６】
各反応に、１μｌの段階希釈した標的ＤＮＡを添加し、４２℃で４時間にわたり試料をインキュベートした。
【００５７】
Ｂ イノシン含有オリゴヌクレオチドでのキサントシン条件についての条件最適化
【００５８】
混合物Ａ
Ｘ１０ Ｓｔｏｆｆｅｌバッファー ０．５μｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．５μｌ
１００ｎｇ／μｌ プライマー２ ０．１２５μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ０．５μｌ
水 ３．４μｌ
【００５９】
混合物Ｂ
Ｘ１０ Ｓｔｏｆｆｅｌバッファー ０．５μｌ
１００ｎｇ／μｌ プライマー２ ０．１２５μｌ
エンドヌクレアーゼＶ ０．０５μｌ
クレノウ ｅｘｏ− ０．４μｌ
Ｔ４ｇｐ３２ ０．５μｌ
水 ３．４２ μｌ
【００６０】
混合物Ａに、１μｌの段階希釈した標的ＤＮＡを添加し、２分間９４℃試料を加熱し、次いで、４２℃へと冷却し、混合物Ｂを添加し、次いで、４２℃で４時間試料をインキュベートした。
【００６１】
図２Ａは、イノシン含有オリゴヌクレオチドに最適化された条件を用いる、標的鋳型の等温増幅を示す。結果から見ることができる通り、キサントシン含有オリゴヌクレオチドを用いると、１ｎｇの標的鋳型を検出することができるが、イノシンオリゴヌクレオチドではこれを検出することができず、これにより、キサントシン修飾は、等温増幅反応において、イノシン修飾と比較して、より有効に作用することが裏付けられる。
【００６２】
図２Ｂは、キサントシン含有オリゴヌクレオチドに、より高度に最適化された条件を示し、この条件では、イノシンプライマーによる１ｎｇと比較して、１０ｐｇという微量の出発鋳型でもシグナルを検出することができる。これは、キサントシン修飾プライマーを用いる場合、増幅が１００倍に増大することを表わす。おそらくは、キサントシンオリゴヌクレオチドは、イノシン修飾と比較して、ニッキングに対する耐性が大きいために、プライマー濃度を低下させなければならなかった。
【００６３】
Ｂｓｔポリメラーゼ／ＴＭＡエンドヌクレアーゼ系を用いる等温増幅
【００６４】
混合物Ａ
Ｘ１０ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー ０．５μｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．２５μｌ
１００ｎｇ／μｌ プライマー２ ０．１２５μｌ
Ｔ４ｇｐ３２ ０．５μｌ
１００ｍＭ ＤＴＴ ０．５μｌ
水 ３．１２μｌ
【００６５】
混合物Ｂ
Ｘ１０ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー ０．５μｌ
１００ｎｇ／μｌ プライマー２ ０．１２５μｌ
ＴＭＡエンドヌクレアーゼＶ ０．１μｌ
Ｂｓｔポリメラーゼ ０．５μｌ
水 ３．８μｌ
【００６６】
混合物Ａに、１μｌの段階希釈した標的ＤＮＡを添加し、２分間９４℃で試料を加熱し、次いで、２分間４５℃で冷却し、次いで、２分間６０℃で加熱し、混合物Ｂを添加し、次いで、６０℃で４５分間試料をインキュベートした。
【００６７】
図３は、キサントシン含有オリゴヌクレオチドに最適化された条件を用い、熱安定性Ｂｓｔポリメラーゼ／ＴＭＡエンドヌクレアーゼＶ増幅コンビネーションを用いる、標的鋳型の等温増幅を示す。結果から見ることができる通り、キサントシン含有オリゴヌクレオチドを用いると、１０ｐｇの標的鋳型を容易に検出することができるが、イノシンオリゴヌクレオチドではこれを検出することができない。さらに、この反応は、クレノウ ｅｘｏ−／エンドヌクレアーゼＶ系を用いると４時間のインキュベーション時間が必要であるのと比べ、４５分間という短い時間で実施することができる。
【００６８】
ＮａＣｌ添加を伴うＢｓｔポリメラーゼ／ＴＭＡエンドヌクレアーゼ系を用いる等温増幅
【００６９】
混合物Ａ
Ｘ１０ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー ０．５μｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．２５μｌ
１００ｎｇ／μｌ プライマー２ ０．１２５μｌ
１Ｍ ＮａＣｌ ０．５／１μｌ
１００ｍＭ ＤＴＴ ０．５μｌ
水 ３．１２／２．６３μｌ
【００７０】
混合物Ｂ
Ｘ１０ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー ０．５μｌ
１００ｎｇ／μｌ プライマー２ ０．１２５μｌ
ＴＭＡエンドヌクレアーゼＶ ０．１μｌ
Ｂｓｔポリメラーゼ ０．５μｌ
水 ３．８μｌ
【００７１】
混合物Ａに、１μｌの段階希釈した標的ＤＮＡを添加し、２分間９４℃で試料を加熱し、次いで、２分間４５℃で冷却し、次いで、２分間６０℃で加熱し、混合物Ｂを添加し、次いで、６０℃で４５分間試料をインキュベートした。
【００７２】
図４は、塩の添加が、キサントシン含有オリゴヌクレオチドを用いた増幅効率を改善することができることを示す。しかし、結果から、最終反応における塩濃度を５０ｍＭ超に増加すると、シグナルの消失につながり得るようである。この系を用いると、イノシンで修飾したプライマーと比較して、キサントシン含有オリゴヌクレオチドを用いて１０００倍の感度増加が示された。
【００７３】
キサントシン含有増幅プライマーとイノシン含有増幅プライマーのリアルタイム比較
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【００７４】
反応混合物
混合物Ａ
Ｘ１０ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー ０．５μｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．２５μｌ
１００ｎｇ／μｌ プライマーＲ ０．２５μｌ
５Ｍ ベタイン １．０μｌ
水 ２．７５μｌ
【００７５】
混合物Ｂ
Ｘ１０ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー ０．５μｌ
１００ｎｇ／μｌ プライマーＦ ０．２５μｌ
ＴＭＡエンドヌクレアーゼＶ ０．１μｌ
Ｂｓｔポリメラーゼ １．０μｌ
水 ２．６５μｌ
２０μＭ プローブ ０．５μｌ
【００７６】
メチル化標的オリゴを１／１０００〜１／１０，０００，０００に段階希釈し、試験する各試料について、混合物Ａに、１μｌの材料を添加した。チューブを１分間９５℃で加熱し、１分間４５℃で冷却し、次いで、５分間６０℃で加熱し、次いで、混合物Ｂを各試料に添加した。
【００７７】
次いで、試料を、６０℃で５分間、４５℃で１０秒間サイクルした（Ｆａｍチャンネルでプレートを読んだ）。２０サイクル実施した。
【００７８】
【表１】
【００７９】
図５は、イノシン含有オリゴヌクレオチドおよびキサントシン含有オリゴヌクレオチドの両方を用いる、リアルタイムの等温増幅プロットを示す。イノシンと比較した場合、キサントシンが、エンドヌクレアーゼＶ反応にとってはるかに改良された基質であることを、データは明確に示す。キサントシンの増幅シグナルが、被験最低レベル（１００ｆｇ）で見られるのに対し、イノシンシグナルを用いると、１０ｐｇのレベルで検出されるに過ぎない。加えて、キサントシンを用いて生成される蛍光シグナルは、イノシンによる場合より３倍超強い。
【００８０】
広く記述された本発明の精神または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態において示された本発明に対して、多くの変更および／または改変を行いうることを、当業者は理解するであろう。したがって、本明細書における実施形態は、すべての点において、例示的なものとして考えるべきであり、限定的なものとして考えるべきではない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱サイクリングを実質的に伴わずに核酸分子を増幅するための、改良された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸配列集団内から特定の配列を増幅するのに最も広く用いられる方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である（Dieffenbach CおよびDveksler G編、PCR Primer: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、Plainview、NY）。この増幅法では、相補鎖上の、増幅される領域のいずれかの末端の、一般に１５〜３０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドが、変性させた一本鎖ＤＮＡ鋳型上でのＤＮＡ合成のプライミングに用いられる。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いる変性、プライマーハイブリダイゼーション、およびＤＮＡ鎖合成の連続的なサイクルにより、プライマー間の配列が指数関数的に増幅される。ＲＮＡ配列は、ｃＤＮＡコピーを生成させる逆転写酵素を用いてまずこれをコピーすることにより、増幅することができる。増幅されたＤＮＡ断片は、ゲル電気泳動、標識プローブによるハイブリダイゼーション、その後の同定（例えば、酵素結合アッセイによる）を可能とするタグを付したプライマーの使用、標的ＤＮＡとハイブリダイズするとシグナルを発生させる、蛍光タグを付したプライマー（例えば、Ｂｅａｃｏｎシステム、およびＴａｑＭａｎシステム）の使用を包含する、各種の手段により検出することができる。
【０００３】
ＰＣＲの１つの欠点は、増幅混合物を加熱および冷却してＤＮＡを変性させる、サーマルサイクラーを必要とすることである。この増幅は、旧式の施設では実施することができないか、または実験室環境外では容易に操作することができない。
【０００４】
ＰＣＲに加えて、特定の配列を検出および増幅するための各種の他の技法が開発されている。一例は、リガーゼ連鎖反応（Barany F、Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193、1991）である。
【０００５】
増幅反応時の標的の熱変性に依存する従来のＤＮＡ増幅法に加えて、増幅反応時に鋳型の変性を必要とせず、このため等温増幅技術と呼ばれる多数の方法が記述されている。
【０００６】
等温増幅は、１９９２年に初めて記述され（Walker GT、Little MC、Nadeau JG、およびShank D.、Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system、PNAS 89: 392-396、1992）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）と名づけられた。それ以来、ＲＮＡ配列はコピーするが、対応するゲノムＤＮＡはコピーしないＲＮＡポリメラーゼを用いた、転写媒介増幅（ＴＭＡ）および核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）を包含する、他の多数の等温増幅技術が記述されている（Guatelli JC、Whitfield KM、Kwoh DY、Barringer KJ、Richmann DD、およびGingeras TR、Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication、PNAS 87: 1874-1878、1990; Kievits T、van Gemen B、van Strijp D、Schukkink R、Dircks M、Adriaanse H、Malek L、Sooknanan R、Lens P、NASBA isothermal enzymatic in vitro nucleic acid amplification optimized for the diagnosis of HIV-1 infection、J Virol Methods、1991年12月、35（3）:273-86）。
【０００７】
他のＤＮＡベースの等温技法には、ＤＮＡポリメラーゼにより、環状鋳型に対するプライマーを伸長させる、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（Fire AおよびXu SQ、Rolling replication of short circles、PNAS 92: 4641-4645、1995）；標的を検出するのに環状プローブを用いる分枝増幅（Ramification amplification）（ＲＡＭ）（Zhang W、Cohenford M、Lentrichia B、Isenberg HD、Simson E、Li H、Yi J、Zhang DY、Detection of Chlamydia trachomatis by isothermal ramification amplification method: a feasibility study、J Clin Microbiol. 2002年1月、40（1）:128-32）；ならびに、より近年では、熱の代わりにヘリカーゼ酵素を用いてＤＮＡ鎖を巻き戻す、ヘリカーゼ依存等温ＤＮＡ増幅（ＨＤＡ）（Vincent M、Xu Y、Kong H、Helicase-dependent isothermal DNA amplification、EMBO Rep. 2004年8月、5（8）:795-800）が含まれる。
【０００８】
従来の増幅法は、増幅反応の各サイクルにおける標的分子の変性と再生のサイクルを継続することに依存する。ＤＮＡの熱処理は、ＤＮＡ分子に対してある程度のせん断を結果としてもたらし、したがって、発生中の胚盤胞細胞の少数の細胞からＤＮＡを単離する場合、または、特に、ＤＮＡが、組織切片、パラフィンブロック、および古代ＤＮＡ試料中など、既に断片形態にある場合など、ＤＮＡが限定される場合、この加熱冷却サイクルによって、ＤＮＡがさらに損傷を受け、その結果、増幅シグナルがさらに失われる可能性がある。等温法は、一本鎖分子を生成させて、さらなる増幅のための鋳型として用いるために鋳型ＤＮＡの変性を継続することには依存せず、一定温度で、特定の制限エンドヌクレアーゼによりＤＮＡ分子を酵素的にニッキングすることに依存する。
【０００９】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）と呼ばれる技法は、特定の制限酵素の、半修飾(hemi-modified)ＤＮＡの非修飾鎖にニックを入れる能力と、５’−３’エクソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼが下流の鎖を伸長および置換する能力とに依存する。次いで、センス反応の置換鎖を、アンチセンス反応の鋳型として用いて、センス反応とアンチセンス反応とを組み合わせることにより、指数関数的増幅が達成される（Walker GT、1992）。このような技法は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Walker GT、1992）、ＨＩＶ−１、Ｃ型肝炎、およびＨＰＶ−１６（Nuovo G J、2000）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（Spears PA、Linn P、Woodard DL、およびWalker GT、Simultaneous Strand Displacement Amplification and Fluorescence Polarization Detection of Chlamydia trachomatis、Anal. Biochem. 247: 130-137、1997）に用いられ、増幅に成功している。
【００１０】
ＳＤＡの使用はこれまで、半ホスホロチオエートＤＮＡ二重鎖を作製するために、修飾鎖上では酵素切断に耐性であり、その結果、消化ではなく酵素によるニッキングをもたらして置換反応を起こさせる、修飾ホスホロチオエートヌクレオチドに依存してきた。しかし、近年では、いくつかの「ニッカーゼ」酵素が遺伝子工学的に作製されている。これらの酵素は、従来のようにＤＮＡを切断せず、ＤＮＡ鎖の一方にニックを入れる。「ニッカーゼ」酵素には、Ｎ．Ａｌｗ１（Xu Y、Lunnen KD、およびKong H、Engineering a nicking endonuclease N.Alw1 by domain swapping、PNAS 98: 12990-12995、2001）、Ｎ．ＢｓｔＮＢ１（Morgan RD、Calvet C、Demeter M、Agra R、Kong H、Characterization of the specific DNA nicking activity of restriction endonuclease N.BstNBI、Biol Chem.、2000年11月、381（11）:1123-5）、およびＭｌｙ１（Besnier CE、Kong H、Converting MlyI endonuclease into a nicking enzyme by changing its oligomerization state、EMBO Rep.、2001年9月、2（9）:782-6、電子版2001年8月23日）が含まれる。
【００１１】
さらに、ＳＤＡは、熱安定性制限酵素（Ａｖａ１）と、熱安定性ｅｘｏ−ポリメラーゼ（Ｂｓｔポリメラーゼ）との組合せを用いることにより改良された。この組合せは、反応の増幅効率を、１０８倍の増幅から１０１０倍の増幅へと増大させることが示され、この技法を用いて、固有の単一コピー分子を増幅することが可能となる。熱安定性ポリメラーゼ／酵素の組合せを用いる結果としてもたらされる増幅倍数は、ほぼ１０９倍程度である（Milla M. A.、Spears P. A、Pearson R E、およびWalker G T、Use of the Restriction Enzyme Ava1 and Exo-Bst Polymerase in Strand Displacement Amplification Biotechniques、24:392-396、1997）。
【００１２】
現在のところ、すべての等温ＤＮＡ増幅法は、増幅を開始する前に、変性させる最初の二本鎖鋳型ＤＮＡ分子を必要とする。加えて、各プライミング事象から増幅は１回しか開始されない。
【００１３】
イノシン、デオキシイノシン、８デオキシグアニン、ヒドロキシウラシル、５−メチル−ｄＣ、５−ヒドロキシウリジン、Ｃを伴う５−ブロモ−ｄＵイノシン、リボヌクレオチド、およびウラシルなどの非正規ＤＮＡ塩基は、等温増幅において有用であることが判明している（国際公開２００６／１２５２６７号（Human Genetic Signatures株式会社））。
【００１４】
ここで、本発明者らにより、好ましい先行技術の非正規塩基であるイノシンより、等温増幅において、１０〜１０００倍良好な成果をもたらす、新規の非正規塩基が見出された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明者らは、非正規塩基、酵素、およびプライマーを用いる改良された増幅法であって、温度サイクリングの反復を必要としない方法を開発した。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
第１の態様において、本発明は、等温ＤＮＡ増幅のための方法であって、
増幅されるＤＮＡに、
ＤＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的であり、キサントシンを含有する第１のプライマーと、
ＤＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的であり、キサントシンを含有する第２のプライマーと、
ＤＮＡポリメラーゼと、
鎖置換が可能な酵素と、
二本鎖ＤＮＡ中のキサントシンを認識し、キサントシンの位置またはその近傍で一方のＤＮＡ鎖においてニックを入れるか、または１塩基を切り取る酵素と
を含む増幅混合物を提供する工程；および
熱サイクリングを実質的に伴わずにＤＮＡを増幅する工程
を含む方法を提供する。
【００１７】
場合により、ＤＮＡは、増幅混合物を添加する前、添加する間、または添加した後に変性されることができる。
【００１８】
好ましくは、第１のプライマーは、ＤＮＡの第１の鎖の領域に少なくとも部分的に相補的であり、第２のプライマーは、ＤＮＡの第２の鎖のＤＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である。
【化１】
【００１９】
第１および第２のプライマーは、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、またはキメラ性のオリゴヌクレオチド、例えば、ＰＮＡ／オリゴヌクレオチドもしくはＩＮＡ／オリゴヌクレオチドであってよい。好ましくは、前記プライマーはデオキシオリゴヌクレオチドである。
【００２０】
好ましくは、オリゴヌクレオチド類似体は、挿入(intercalating)核酸（ＩＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、ＭＮＡ、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、シクロヘキサニル核酸（ＣＡＮ）、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、核酸ベースのコンジュゲート、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リクソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、２’−ＯＲ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ、これらの混合物およびこれらのハイブリッド、ならびにこれらのリン原子修飾型（例えば、限定的ではないが、ホスホロチオエート、メチルホスホレート、ホスホラミダイト、ホスホロジチエート、ホスホロセレノエート、ホスホトリエステルおよびホスホボラノエート）からなる群から選択される。さらに、ヌクレオチドを連結するために、非リン含有化合物（例えば、限定的ではないが、メチルイミノメチル、ホルムアセテート、チオホルムアセテートおよび連結基含有アミド）を、用い得る。特に、核酸および核酸類似体は、１または複数の挿入剤(intercalator)シュードヌクレオチドを含有し得る。
【００２１】
ＩＮＡとは、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開０３／０５１９０１号、国際公開０３／０５２１３２号、国際公開０３／０５２１３３号および国際公開０３／０５２１３４号（Unest A/S、Human Genentic Signatures株式会社に譲渡）の教示による挿入核酸を意味する。ＩＮＡは、１または複数の挿入剤シュードヌクレオチド（ＩＰＮ）分子を含有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体である。
【００２２】
キサントシンを有するプライマーがＤＮＡに結合すると、酵素によって認識される部位を形成する。
【００２３】
プライマーは、１または複数のキサントシンを有してよい。ある状況では、２または複数のキサントシンが増幅プロセスを改善することができる。キサントシンは、近接して、または少なくとも数個の正規塩基により隔てられて、位置することができる。
【００２４】
ＤＮＡポリメラーゼは、ＴａｑポリメラーゼＳｔｏｆｆｅｌ断片、Ｔａｑポリメラーゼ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ、Ｔｉｔａｎｉｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼターボ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−ポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、９°Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｘｐａｎｄ ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＥＸＴポリメラーゼ（ＤｙＮＡｚｙｍｅＩＩ ＤＮＡポリメラーゼとプルーフリーディング酵素の最適化混合物。ＤｙＮＡｚｙｍｅＩＩ ＤＮＡポリメラーゼは、Thermus brockianus由来のクローンＤｙＮＡｚｙｍｅ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現するE.coli株から単離精製される(New England Biolabs Inc, USA)）、クレノウ断片、ＤＮＡポリメラーゼ１、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）（ポリメラーゼ活性を保持し、３’−５’エクソヌクレアーゼ活性を事実上伴わない、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子操作型(Affymetrix Inc, USA)）、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｂｃａポリメラーゼ、ｐｈｉ−２９ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼベータまたはこれらの改変バージョンなど、任意の適切なポリメラーゼであってよい。
【００２５】
鎖置換酵素は、鎖置換可能なヘリカーゼ、ＡＰエンドヌクレアーゼ、ミスマッチ修復酵素、または鎖置換可能な遺伝子組み換えによる（もしくは他の様式での）修飾酵素など、任意の適切な酵素であってよい。
【００２６】
好ましい形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換能も有する。ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換能を有する任意の適切なポリメラーゼであってよい。例には、限定的ではないが、クレノウ ｅｘｏ−（New England Biolabs (NEB)カタログ番号M0212S）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大型断片（NEBカタログ番号M0275S）、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−（NEBカタログ番号M0257S）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−（NEBカタログ番号M0259S）、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（NEBカタログ番号M0253S）、９０Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ（NEBカタログ番号M0260S）およびＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（NEBカタログ番号M0269S）、ＴｈｅｒｍｏＰｈｉ（商標）（Prokaria ehf）、Ｔｆｉポリメラーゼ（Invitrogen）およびＢＣａポリメラーゼ（Takara）が含まれる。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、クレノウ Ｅｏ−またはＢｓｔポリメラーゼのいずれかである。
【００２７】
好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、エクソヌクレアーゼ欠損である。
【００２８】
酵素は、二本鎖ＤＮＡ中のキサントシンを認識可能であり、キサントシンの位置またはその近傍で一方のＤＮＡ鎖においてニックを入れるか、または１塩基を切り取ることができる、任意の適切な酵素であってよい。
【００２９】
好ましくは、酵素は、エンドヌクレアーゼＶ、ｈＯＧＧ１またはＦｐｇである。特に好ましい態様において、酵素はエンドヌクレアーゼＶである。他の好ましい態様において、酵素はＦｐｇである。
【００３０】
本発明の方法において、二本鎖ＤＮＡ中のキサントシンを認識し、ニックを入れるか、または塩基を切り取ることにより要求に応じて作用する、他の適切な酵素を、作成するか、または獲得することができることが、理解されるであろう。
【００３１】
ＤＮＡ増幅に必要とされる添加剤は、ヌクレオチド、バッファーまたは希釈剤、例えばマグネシウムイオンもしくはマンガンイオン、補因子等、技術分野で既知のものを包含する。
【００３２】
増幅混合物は、ヌクレオチド、バッファーまたは希釈剤、例えばマグネシウムイオンもしくはマンガンイオン、補因子および適切な添加剤、例えば一本鎖結合タンパク質（例えば、Ｔ４ｇｐ３２、ＲｅｃＡ、またはＳＳＢ）も含むことができる。
【００３３】
酵素が所望の活性を有する場合、増幅は、任意の適切な温度で実施することができる。典型的には、温度は、約２０℃〜約７５℃、約２５℃〜６０℃とすることができる。本研究で用いられる酵素の場合、とりわけ、中温性のクレノウ ｅｘｏ−酵素を用いる場合は約４２℃、熱安定性Ｂｓｔポリメラーゼを用いる場合は６０℃が特に適切であることが分かっている。より高温または低温の他の温度もまた用いることができ、周囲温度または室温も含まれることが理解されるであろう。本発明は、核酸を増幅するのに熱サイクリングを必要としないことが重要である。
【００３４】
好ましい実施形態では、増幅混合物が、増幅反応を改善する目的で、塩（ＮａＣｌ）をさらに包含する。熱安定性Ｂｓｔポリメラーゼ／ＴＭＡエンドヌクレアーゼＶによる酵素組合せの場合、約１００ｍＭまでのＮａＣｌが、増幅を改善することが判明した。約５０ｍＭのＮａＣｌが好ましいことが判明した。
【００３５】
好ましい一形態では、一本鎖修飾ＤＮＡを形成する条件下で、シトシン塩基は修飾するが、５’−メチル−シトシン塩基は修飾しない修飾剤により、ＤＮＡを前処理する。重亜硫酸、酢酸、またはクエン酸から修飾剤を選択し、処理の結果として、ＤＮＡが実質的に断片化しないことが好ましい。修飾剤は、水の存在下で、シトシンをウラシルへと修飾する試薬である、重亜硫酸ナトリウムであることがより好ましい。
【００３６】
重亜硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）は、シトシンの５，６位二重結合と容易に反応して、スルホン化シトシン反応の中間体を形成するが、この中間体は、脱アミノ化を受けやすく、水の存在下で亜硫酸ウラシルをもたらす。必要な場合は、穏やかなアルカリ性条件下で亜硫酸基を除去し、その結果として、ウラシルを形成させることができる。したがって、潜在的にすべてのシトシンは、ウラシルへと変換される。しかし、メチル化したシトシンは、メチル化による保護のため、修飾剤により変換させることができない。
【００３７】
核酸を重亜硫酸処理するのに好ましい方法は、参照により本明細書に組み込まれる、Human Genetic Signatures株式会社（オーストラリア）の国際公開２００４／０９６８２５号において見出すことができる。
【００３８】
処理されたＤＮＡの両方の鎖を同じ増幅反応において増幅する必要がある場合は、４つのプライマー（すなわち、修飾されたＤＮＡ鎖の各々につき、２つずつのプライマー）を用いることができる。
【００３９】
第２の態様では、本発明は、少なくとも１つの内部キサントシンを含有し、ＤＮＡの領域に結合すると、キサントシンの位置またはその近傍で、一方のＤＮＡ鎖においてニックを入れるか、または１塩基を切り取ることが可能な酵素により認識される部位を形成する、等温ＤＮＡ増幅のためのプライマーを提供する。
【００４０】
第３の態様では、本発明は、熱サイクリングを実質的に伴わないＤＮＡ増幅のための、本発明の第２の態様によるプライマーの使用を提供する。
【００４１】
本発明の増幅法は、ＰＣＲまたは他の既知のＤＮＡ増幅工程に対する代替法として用いることができる。使用には、疾患の検出、ＤＮＡまたはＲＮＡの所望の遺伝子または断片の増幅、ＳＮＰの検出、リアルタイムにおける増幅手順、重亜硫酸処理したＤＮＡの増幅、全ゲノム増幅法、クローニング法の補助手順(adjunct)；切片または塗抹標本中の微生物の検出、食物汚染における微生物の検出など、細胞学的標本におけるｉｎ ｓｉｔｕのＤＮＡ増幅；各種の癌におけるＢＣＲ−ＡＢＬ転座など、染色体中の切断点の増幅；ＨＰＶ断片の挿入など、発癌性の可能性があり、疾患の進行を予測しうる、染色体内に挿入された配列の増幅；癌性細胞に対する正常細胞における、また、胚盤胞発生の正常性についてのＩＶＦ検査におけるメチル化の変化についてのｉｎ ｓｉｔｕ検査における、非メチル化配列に対するメチル化配列の検出；ならびに感染作用物質の増幅および検出が含まれるがこれらに限定されない。
【００４２】
本発明の顕著な利点は、二本鎖ＤＮＡにおいて直接実施することができるということである。本発明はまた、等温増幅の前に、ＲＮＡの逆転写を実施することにより、ＲＮＡにも用いることができる。さらに、本発明は、増幅のための加熱または冷却を必要としない。本発明による方法は、実験室設備の装備を必要とすることなく、「現場で」、すなわち、室温または周囲温度で実施することができる。
【００４３】
本明細書の全体において、文脈により別段に必要とされない限り、「含む（comprise）」という語、または「含む（comprises）」または「含む（comprising）」などの変化形は、言及された要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群の包含を含意するが、他の任意の要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群の除外は含意しないことが理解される。
【００４４】
本明細書に包含されている文書、行為、材料、装置、製品などについての任意の議論は、本発明に対する関連を示すことだけを目的とする。この議論は、これらの内容のうちのいずれかまたはすべてが、本発明の開発より前に存在した、先行技術基準の一部をなすか、または、本発明に関連する分野における一般的な共通知識であったことの自認として理解されるべきではない。
【００４５】
本発明がより明確に理解されうるように、以下の図面および実施例を参照して、好ましい実施形態を記述する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明による核酸増幅法の概略を示す図である。
【図２】イノシン含有プライマーに最適化された条件を用いる、イノシン含有オリゴヌクレオチドと、キサントシン含有オリゴヌクレオチドとの直接的な比較を示す図である。Ａ．イノシン含有オリゴヌクレオチドに最適化された条件を用いる標的鋳型の増幅を示す。Ｂ．キサントシンに、より高度に最適化された条件を用いる標的鋳型の増幅を示す。
【図３】Ｂｓｔポリメラーゼ／ＴＭＡエンドヌクレアーゼ系を用いる等温増幅の結果を示す図である。
【図４】ＮａＣｌを添加した、Ｂｓｔポリメラーゼ／ＴＭＡエンドヌクレアーゼ系を用いる等温増幅の結果を示す図である。Ａ．イノシン含有オリゴヌクレオチド対照。Ｂ．キサントシン含有オリゴヌクレオチド＋５０ｍＭ ＮａＣｌ。Ｃ．キサントシン含有オリゴヌクレオチド＋１００ｍＭ ＮａＣｌ。
【図５】キサントシン含有増幅プライマーおよびイノシン含有増幅プライマーのリアルタイム比較の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
材料および方法
プライマー
任意の市販のＤＮＡ合成サービスまたは自家用ＤＮＡ合成機を用いて、プライマーを合成することができる。標準的なホスホルアミダイト合成法を用いて、プライマーの任意の位置にキサントシンを組み込むことができる。
【００４８】
酵素
二本鎖ＤＮＡ内のキサントシンを認識し、キサントシンの位置またはその近傍で一方のＤＮＡ鎖においてニックを入れるか、または１塩基を切り取る酵素は、エンドヌクレアーゼＶ（デオキシイノシン３’エンドヌクレアーゼ）（NEB社カタログ番号M0305S）またはＴ．ｍａｒｉｔｉｍａに由来するエンドヌクレアーゼＶの熱安定形（ＴＭＡエンドヌクレアーゼＶ）（Fermentas社カタログ番号EN0141）であることが好ましい。しかし、エンドヌクレアーゼＶの修飾形もしくは変化形、またはエンドヌクレアーゼＶの機能的特徴を有する酵素もまた適することが理解される。
【００４９】
鎖置換が可能な酵素には、クレノウｅｘｏ−、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大型断片、Ｂｃａポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、９０Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ、およびＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。
【００５０】
ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換能を有する任意の適切なポリメラーゼであってよい。例には、クレノウ（exo-）（New England Biolabs（NEB）社カタログ番号M0212S）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大型断片（NEB社カタログ番号M0275S）、Ｖｅｎｔ（exo-）（NEB社カタログ番号M0257S）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（exo-）（NEB社カタログ番号M0259S）、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（NEB社カタログ番号M0253S）、９０Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ（NEB社カタログ番号M0260S）、およびＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（NEB社カタログ番号M0269S）、ならびにＴｈｅｒｍｏＰｈｉ（商標）（Prokaria ehf社製）、Ｔｆｉポリメラーゼ（Invitrogen社製）、およびＢｃａポリメラーゼ（Takara社製）が含まれるがこれらに限定されない。ＤＮＡポリメラーゼは、クレノウ（exo-）またはＢｓｔポリメラーゼであることが好ましい。
【００５１】
増幅
本発明による増幅は、以下の方法：
第１のプライマーを、ＤＮＡの１つの鎖に結合させ（Ａ）、
ＤＮＡポリメラーゼが、第１のプライマーを伸長させて、Ｘ個のキサントシンを含有する、第１の新規合成鎖を有する二本鎖分子を形成し（Ｂ）、
ニッキング酵素により、伸長したＤＮＡのキサントシンの位置またはその近傍で、ニックを入れるか、または塩基を切り取り（Ｃ）、
鎖置換酵素、または鎖置換可能なＤＮＡポリメラーゼにより、第１の新規合成鎖を置換し（Ｄ）、
第２のプライマーを、置換した第１の新規合成鎖に結合させ（Ｅ）、
ＤＮＡポリメラーゼが、第２のプライマーを伸長させて、キサントシンを含有する、第２の新規合成鎖を有する二本鎖分子を形成し（Ｆ）、
ニッキング酵素により、伸長したＤＮＡのキサントシンの位置またはその近傍に、ニックを入れるか、または塩基を切り取り（Ｇ）、
鎖置換酵素、または鎖置換可能なＤＮＡポリメラーゼにより、第２の新規合成鎖を置換し（Ｈ）、
第１のプライマーを、置換した第２の新規合成鎖に結合させ（Ｉ）、
工程を継続して、ＤＮＡの新規合成鎖を繰り返し形成する（Ｊ）
で行われる（図１を参照されたい）。
【００５２】
ポリメラーゼが５’−３’方向で第１のプライマーをコピーしなければ、ニック部位が失われてさらなる増幅が阻止されることにより、第３の増幅サイクルの後に反応が停止してしまうため、このコピーは必須である。次いで、上記の反応は、ニッキング、伸長、および置換のラウンドを繰り返しながら、サイクリングを継続する。プライマーは通常、ポリメラーゼにより再生されて、連続的な増幅ラウンドを可能とする。
【００５３】
結果
イノシン含有プライマーに最適化された条件を用いる、イノシン含有オリゴヌクレオチドと、キサントシン含有オリゴヌクレオチドとの直接的な比較
【化２】
【化３】
【化４】
【００５４】
Ａ クレノウ／エンドヌクレアーゼＶ反応条件
イノシン含有オリゴヌクレオチドのための最適化条件
【００５５】
Ｘ１０ Ｓｔｏｆｆｅｌバッファー １μｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．５μｌ
１００ｎｇ／μｌ プライマー１ ０．５μｌ
１００ｎｇ／μｌ プライマー２ ０．５μｌ
エンドヌクレアーゼＶ ０．０５μｌ
クレノウ ｅｘｏ− ０．４μｌ
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ０．４μｌ
水 ５．５５ μｌ
【００５６】
各反応に、１μｌの段階希釈した標的ＤＮＡを添加し、４２℃で４時間にわたり試料をインキュベートした。
【００５７】
Ｂ イノシン含有オリゴヌクレオチドでのキサントシン条件についての条件最適化
【００５８】
混合物Ａ
Ｘ１０ Ｓｔｏｆｆｅｌバッファー ０．５μｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．５μｌ
１００ｎｇ／μｌ プライマー２ ０．１２５μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ０．５μｌ
水 ３．４μｌ
【００５９】
混合物Ｂ
Ｘ１０ Ｓｔｏｆｆｅｌバッファー ０．５μｌ
１００ｎｇ／μｌ プライマー２ ０．１２５μｌ
エンドヌクレアーゼＶ ０．０５μｌ
クレノウ ｅｘｏ− ０．４μｌ
Ｔ４ｇｐ３２ ０．５μｌ
水 ３．４２ μｌ
【００６０】
混合物Ａに、１μｌの段階希釈した標的ＤＮＡを添加し、２分間９４℃試料を加熱し、次いで、４２℃へと冷却し、混合物Ｂを添加し、次いで、４２℃で４時間試料をインキュベートした。
【００６１】
図２Ａは、イノシン含有オリゴヌクレオチドに最適化された条件を用いる、標的鋳型の等温増幅を示す。結果から見ることができる通り、キサントシン含有オリゴヌクレオチドを用いると、１ｎｇの標的鋳型を検出することができるが、イノシンオリゴヌクレオチドではこれを検出することができず、これにより、キサントシン修飾は、等温増幅反応において、イノシン修飾と比較して、より有効に作用することが裏付けられる。
【００６２】
図２Ｂは、キサントシン含有オリゴヌクレオチドに、より高度に最適化された条件を示し、この条件では、イノシンプライマーによる１ｎｇと比較して、１０ｐｇという微量の出発鋳型でもシグナルを検出することができる。これは、キサントシン修飾プライマーを用いる場合、増幅が１００倍に増大することを表わす。おそらくは、キサントシンオリゴヌクレオチドは、イノシン修飾と比較して、ニッキングに対する耐性が大きいために、プライマー濃度を低下させなければならなかった。
【００６３】
Ｂｓｔポリメラーゼ／ＴＭＡエンドヌクレアーゼ系を用いる等温増幅
【００６４】
混合物Ａ
Ｘ１０ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー ０．５μｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．２５μｌ
１００ｎｇ／μｌ プライマー２ ０．１２５μｌ
Ｔ４ｇｐ３２ ０．５μｌ
１００ｍＭ ＤＴＴ ０．５μｌ
水 ３．１２μｌ
【００６５】
混合物Ｂ
Ｘ１０ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー ０．５μｌ
１００ｎｇ／μｌ プライマー２ ０．１２５μｌ
ＴＭＡエンドヌクレアーゼＶ ０．１μｌ
Ｂｓｔポリメラーゼ ０．５μｌ
水 ３．８μｌ
【００６６】
混合物Ａに、１μｌの段階希釈した標的ＤＮＡを添加し、２分間９４℃で試料を加熱し、次いで、２分間４５℃で冷却し、次いで、２分間６０℃で加熱し、混合物Ｂを添加し、次いで、６０℃で４５分間試料をインキュベートした。
【００６７】
図３は、キサントシン含有オリゴヌクレオチドに最適化された条件を用い、熱安定性Ｂｓｔポリメラーゼ／ＴＭＡエンドヌクレアーゼＶ増幅コンビネーションを用いる、標的鋳型の等温増幅を示す。結果から見ることができる通り、キサントシン含有オリゴヌクレオチドを用いると、１０ｐｇの標的鋳型を容易に検出することができるが、イノシンオリゴヌクレオチドではこれを検出することができない。さらに、この反応は、クレノウ ｅｘｏ−／エンドヌクレアーゼＶ系を用いると４時間のインキュベーション時間が必要であるのと比べ、４５分間という短い時間で実施することができる。
【００６８】
ＮａＣｌ添加を伴うＢｓｔポリメラーゼ／ＴＭＡエンドヌクレアーゼ系を用いる等温増幅
【００６９】
混合物Ａ
Ｘ１０ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー ０．５μｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．２５μｌ
１００ｎｇ／μｌ プライマー２ ０．１２５μｌ
１Ｍ ＮａＣｌ ０．５／１μｌ
１００ｍＭ ＤＴＴ ０．５μｌ
水 ３．１２／２．６３μｌ
【００７０】
混合物Ｂ
Ｘ１０ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー ０．５μｌ
１００ｎｇ／μｌ プライマー２ ０．１２５μｌ
ＴＭＡエンドヌクレアーゼＶ ０．１μｌ
Ｂｓｔポリメラーゼ ０．５μｌ
水 ３．８μｌ
【００７１】
混合物Ａに、１μｌの段階希釈した標的ＤＮＡを添加し、２分間９４℃で試料を加熱し、次いで、２分間４５℃で冷却し、次いで、２分間６０℃で加熱し、混合物Ｂを添加し、次いで、６０℃で４５分間試料をインキュベートした。
【００７２】
図４は、塩の添加が、キサントシン含有オリゴヌクレオチドを用いた増幅効率を改善することができることを示す。しかし、結果から、最終反応における塩濃度を５０ｍＭ超に増加すると、シグナルの消失につながり得るようである。この系を用いると、イノシンで修飾したプライマーと比較して、キサントシン含有オリゴヌクレオチドを用いて１０００倍の感度増加が示された。
【００７３】
キサントシン含有増幅プライマーとイノシン含有増幅プライマーのリアルタイム比較
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【００７４】
反応混合物
混合物Ａ
Ｘ１０ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー ０．５μｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．２５μｌ
１００ｎｇ／μｌ プライマーＲ ０．２５μｌ
５Ｍ ベタイン １．０μｌ
水 ２．７５μｌ
【００７５】
混合物Ｂ
Ｘ１０ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー ０．５μｌ
１００ｎｇ／μｌ プライマーＦ ０．２５μｌ
ＴＭＡエンドヌクレアーゼＶ ０．１μｌ
Ｂｓｔポリメラーゼ １．０μｌ
水 ２．６５μｌ
２０μＭ プローブ ０．５μｌ
【００７６】
メチル化標的オリゴを１／１０００〜１／１０，０００，０００に段階希釈し、試験する各試料について、混合物Ａに、１μｌの材料を添加した。チューブを１分間９５℃で加熱し、１分間４５℃で冷却し、次いで、５分間６０℃で加熱し、次いで、混合物Ｂを各試料に添加した。
【００７７】
次いで、試料を、６０℃で５分間、４５℃で１０秒間サイクルした（Ｆａｍチャンネルでプレートを読んだ）。２０サイクル実施した。
【００７８】
【表１】
【００７９】
図５は、イノシン含有オリゴヌクレオチドおよびキサントシン含有オリゴヌクレオチドの両方を用いる、リアルタイムの等温増幅プロットを示す。イノシンと比較した場合、キサントシンが、エンドヌクレアーゼＶ反応にとってはるかに改良された基質であることを、データは明確に示す。キサントシンの増幅シグナルが、被験最低レベル（１００ｆｇ）で見られるのに対し、イノシンシグナルを用いると、１０ｐｇのレベルで検出されるに過ぎない。加えて、キサントシンを用いて生成される蛍光シグナルは、イノシンによる場合より３倍超強い。
【００８０】
広く記述された本発明の精神または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態において示された本発明に対して、多くの変更および／または改変を行いうることを、当業者は理解するであろう。したがって、本明細書における実施形態は、すべての点において、例示的なものとして考えるべきであり、限定的なものとして考えるべきではない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
等温ＤＮＡ増幅のための方法であって、
増幅されるＤＮＡに、
ＤＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的であり、キサントシンを含有する第１のプライマーと、
ＤＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的であり、キサントシンを含有する第２のプライマーと、
ＤＮＡポリメラーゼと、
鎖置換が可能な酵素と、
二本鎖ＤＮＡ中のキサントシンを認識し、キサントシンの位置またはその近傍で一方のＤＮＡ鎖においてニックを入れるか、または１塩基を切り取る酵素と
を含む増幅混合物を提供する工程；および
熱サイクリングを実質的に伴わずにＤＮＡを増幅する工程
を含む方法。
【請求項２】
ＤＮＡが、増幅混合物を添加する前、添加する間、または添加した後に変性される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１のプライマーが、ＤＮＡの第１の鎖の領域に少なくとも部分的に相補的であり、第２のプライマーが、ＤＮＡの第２の鎖のＤＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第１および第２のプライマーが、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、またはキメラ性のオリゴヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
プライマーが、デオキシオリゴヌクレオチドである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
プライマーが、挿入核酸（ＩＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、ＭＮＡ、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、シクロヘキサニル核酸（ＣＡＮ）、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、核酸ベースのコンジュゲート、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リクソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、２’−ＯＲ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ、これらの混合物およびこれらのハイブリッド、ならびにこれらのリン原子修飾型からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド類似体である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
プライマーが、１または複数の挿入剤シュードヌクレオチドを含有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
プライマーが、近接して位置した、または少なくとも数個の正規塩基により隔てられた、２または複数のキサントシンを有することができる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＤＮＡポリメラーゼが、ＴａｑポリメラーゼＳｔｏｆｆｅｌ断片、Ｔａｑポリメラーゼ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ、Ｔｉｔａｎｉｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼターボ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−ポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、９°Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｘｐａｎｄ ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＥＸＴポリメラーゼ、クレノウ断片、ＤＮＡポリメラーゼ１、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｂｃａポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、ｐｈｉ−２９ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼベータ、およびこれらの改変バージョンからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
鎖置換酵素が、鎖置換可能なヘリカーゼ、ＡＰエンドヌクレアーゼ、およびミスマッチ修復酵素、または鎖置換可能な修飾酵素からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換能も有し、クレノウ ｅｘｏ−、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大型断片、Ｂｃａポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、９０Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ、およびＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡポリメラーゼが、クレノウ Ｅｘｏ−またはＢｓｔポリメラーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡポリメラーゼが、エクソヌクレアーゼ欠損である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
二本鎖ＤＮＡ中のキサントシンを認識することが可能な酵素が、エンドヌクレアーゼＶ、ｈＯＧＧ１、またはＦｐｇである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
増幅混合物が、ヌクレオチド、バッファー、希釈剤、マグネシウムイオンまたはマンガンイオン、一本鎖結合タンパク質、および補因子を包含する、ＤＮＡ増幅に必要とされる添加剤をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
一本鎖結合タンパク質が、Ｔ４ｇｐ３２、ＲｅｃＡ、またはＳＳＢである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
増幅が、２０℃〜約７５℃の温度で実施される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
温度が、約４２℃または６０℃である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
増幅が、ＮａＣｌの存在下で実施される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＮａＣｌ濃度が、約１００ｍＭまでである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つの内部キサントシンを含有し、ＤＮＡの領域に結合すると、キサントシンの位置またはその近傍で、一方のＤＮＡ鎖においてニックを入れるか、または１塩基を切り取ることが可能な酵素により認識される部位を形成する、等温ＤＮＡ増幅のためのプライマー。
【請求項２２】
熱サイクリングを実質的に伴わないＤＮＡ増幅のための、請求項２１に記載のプライマーの使用。
【請求項１】
等温ＤＮＡ増幅のための方法であって、
増幅されるＤＮＡに、
ＤＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的であり、キサントシンを含有する第１のプライマーと、
ＤＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的であり、キサントシンを含有する第２のプライマーと、
ＤＮＡポリメラーゼと、
鎖置換が可能な酵素と、
二本鎖ＤＮＡ中のキサントシンを認識し、キサントシンの位置またはその近傍で一方のＤＮＡ鎖においてニックを入れるか、または１塩基を切り取る酵素と
を含む増幅混合物を提供する工程；および
熱サイクリングを実質的に伴わずにＤＮＡを増幅する工程
を含む方法。
【請求項２】
ＤＮＡが、増幅混合物を添加する前、添加する間、または添加した後に変性される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１のプライマーが、ＤＮＡの第１の鎖の領域に少なくとも部分的に相補的であり、第２のプライマーが、ＤＮＡの第２の鎖のＤＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第１および第２のプライマーが、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、またはキメラ性のオリゴヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
プライマーが、デオキシオリゴヌクレオチドである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
プライマーが、挿入核酸（ＩＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、ＭＮＡ、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、シクロヘキサニル核酸（ＣＡＮ）、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、核酸ベースのコンジュゲート、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リクソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、２’−ＯＲ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ、これらの混合物およびこれらのハイブリッド、ならびにこれらのリン原子修飾型からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド類似体である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
プライマーが、１または複数の挿入剤シュードヌクレオチドを含有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
プライマーが、近接して位置した、または少なくとも数個の正規塩基により隔てられた、２または複数のキサントシンを有することができる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＤＮＡポリメラーゼが、ＴａｑポリメラーゼＳｔｏｆｆｅｌ断片、Ｔａｑポリメラーゼ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ、Ｔｉｔａｎｉｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼターボ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−ポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、９°Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｘｐａｎｄ ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＥＸＴポリメラーゼ、クレノウ断片、ＤＮＡポリメラーゼ１、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｂｃａポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、ｐｈｉ−２９ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼベータ、およびこれらの改変バージョンからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
鎖置換酵素が、鎖置換可能なヘリカーゼ、ＡＰエンドヌクレアーゼ、およびミスマッチ修復酵素、または鎖置換可能な修飾酵素からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換能も有し、クレノウ ｅｘｏ−、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大型断片、Ｂｃａポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、９０Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ、およびＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡポリメラーゼが、クレノウ Ｅｘｏ−またはＢｓｔポリメラーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡポリメラーゼが、エクソヌクレアーゼ欠損である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
二本鎖ＤＮＡ中のキサントシンを認識することが可能な酵素が、エンドヌクレアーゼＶ、ｈＯＧＧ１、またはＦｐｇである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
増幅混合物が、ヌクレオチド、バッファー、希釈剤、マグネシウムイオンまたはマンガンイオン、一本鎖結合タンパク質、および補因子を包含する、ＤＮＡ増幅に必要とされる添加剤をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
一本鎖結合タンパク質が、Ｔ４ｇｐ３２、ＲｅｃＡ、またはＳＳＢである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
増幅が、２０℃〜約７５℃の温度で実施される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
温度が、約４２℃または６０℃である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
増幅が、ＮａＣｌの存在下で実施される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＮａＣｌ濃度が、約１００ｍＭまでである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つの内部キサントシンを含有し、ＤＮＡの領域に結合すると、キサントシンの位置またはその近傍で、一方のＤＮＡ鎖においてニックを入れるか、または１塩基を切り取ることが可能な酵素により認識される部位を形成する、等温ＤＮＡ増幅のためのプライマー。
【請求項２２】
熱サイクリングを実質的に伴わないＤＮＡ増幅のための、請求項２１に記載のプライマーの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１２−５１５５２８（Ｐ２０１２−５１５５２８Ａ）
【公表日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４５５９７（Ｐ２０１１−５４５５９７）
【出願日】平成２２年１月１５日（２０１０．１．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／００００５５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８３５６１
【国際公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【出願人】（５０５１８８９０６）ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド (15)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月１５日（２０１０．１．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／００００５５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８３５６１
【国際公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【出願人】（５０５１８８９０６）ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド (15)
【Ｆターム（参考）】
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