散在性ガンの治療法
本発明は、転移を排液する１又はそれより多い転移排液リンパ節(メチネル節)から取得し得る、拡大した腫瘍反応性CD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球を投与することにより散在性ガンに罹患している患者を治療する免疫療法を開示する。この方法は、患者における１又はそれより多いメチネルリンパ節の同定、該１又はそれより多い節と、任意に転移の全て又は一部との切除、該リンパ節からの転移反応性Ｔリンパ球の単離、該転移反応性Ｔリンパ球のインビトロ拡大、こうして取得されたＴリンパ球の該患者への投与を含んでなり、ここで、該Ｔリンパ球はCD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、転移を排液する(draining)１又はそれより多いメチネルリンパ節から得られる、拡大された(expanded)腫瘍反応性CD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球を投与することによる、散在性ガンに罹患している患者を治療するための免疫療法上の方法に関する。ここで、前記Ｔリンパ球はCD4+CD25+Hiリンパ球ではない。すなわち、本発明は調節性Ｔリンパ球を対象としない。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
リンパ系は、間質液を起源とする無色の水状液であるリンパを運搬する脈管のネットワークである。この脈管は、リンパ液の逆流を防止しつつ、身体組織中の間質腔から離れるように過剰の液を輸送し、血流に戻す。リンパ系脈管(lymphatic vessel)の主要な３つのタイプは、毛細リンパ管(lymph capillary)、リンパ管(lymphatic)及びリンパ本管(lymph duct)である。毛細リンパ管は結合して、リンパ管又はリンパ静脈(lymph vein)と呼ばれるより大きな脈管を形成する。これらは血液を導く静脈に似ているが、より薄い壁及び比較的大きな管腔を有し、より多くの弁を有している。皮膚では、リンパ管は皮下組織に位置し、静脈と同じ経路を辿る。内蔵では、リンパ管は一般的には動脈と同行し、その周りに叢を形成する(ネットワーク)。或る場所で、リンパ管はリンパ節に入る。これらは、リンパ系組織からなる小さな特化した器官である。リンパは、静脈循環に入る前に、少なくとも１つのリンパ節で濾過される(Moore)。リンパ節は、例えば細菌及びウイルスを集めて破壊するリンパ球で満たされた内部ハニカム状の結合組織を有するフィルターとして作用する。節では、リンパは血液循環と接しており、液が遠心性のリンパ系脈管を経て節を出て行く前に液の約半分が血液中に排出される(Renkin)。上皮腫瘍からの悪性細胞の実質的に全ての拡散が、リンパ節中のリンパ-静脈結合を介して全身血液循環に入る前に、最初に、(白血球も使用する能動的機序により)薄い有窓リンパ脈管(lymph vessel)を通じて起こるというのは、益々受け入れられている考えである。リンパ節のクラスターは、腋窩、鼠径部、頸部、胸部及び腹部に見出される。
【０００３】
原発腫瘍又は原発腫瘍領域は、１又はそれより多い所謂センチネルリンパ節に排液する(drain)。ここで、センチネル節は、腫瘍からのリンパ排液(lymphatic drainage)を受ける最初のリンパ節として定義され、また「センチネル節概念」としても知られている。これは、転移の最初の部位でもあり、幾つかの充実性腫瘍タイプでは、センチネル節に腫瘍細胞がない場合にはリンパ節転移の危険はほとんど無視できることが示されている。センチネル節は、手術の間に、腫瘍の周りへのトレーサー物質又は色素物質の注射により同定することができる。これら物質は、毛細リンパ管内を輸送され、センチネル節でマクロファージによるファゴサイトーシスを通じて蓄積するので、腫瘍排液リンパ節を同定する。本発明者らは、原発腫瘍を排液するセンチネルリンパ節が、リンパ節で腫瘍抗原に対して感作されインビボ拡大(expansion)を受けているＴリンパ球を相当量含有し得るので、インビトロ拡大用の天然の腫瘍反応性Ｔリンパ球の豊富な供給源である可能性を最近示した(Maritsら，原稿；Karlssonら，Eur J Urol, 採用)。
【０００４】
しかし、今日まで、特定の個々のリンパ節が関与する逐次リンパ排液(sequential lymph drainage)が転移にも当てはまること、すなわち、転移について、転移領域を排液する１又はそれより多いリンパ節が検出可能であることは知られていなかった。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の開示
原発腫瘍の転移は、原発腫瘍の拡散に起因するガンとして定義される。転移は、ガン細胞が獲得する２つの別個の能力−増大した自動運動性及び侵襲性に依存する。転移する細胞は、基本的に、元の腫瘍中の細胞と同じ種類である。ガンが例えば結腸で発生し、例えば肝臓に転移する場合、肝臓中のガン細胞は結腸ガン細胞である。しかし、その細胞は、増大した自動運動性及び別の器官を侵襲する能力を獲得している。
【０００６】
理論的には、原発腫瘍は、腫瘍が発現する器官又は組織に存在する細胞を起源とする。そのような器官又は組織中の細胞は、既に、既存のリンパ排液系に接続しているので、リンパは、既存のリンパ脈管を通じて原発腫瘍から排液される。今日まで、原発腫瘍の「センチネル節概念」が転移にも当てはまること、すなわち転移からの排液を受ける最初の１又はそれより多いリンパ節が転移について同定可能であることは誰も示していなかった。転移がリンパ管形成を誘導することは示されていないし、更に転移がリンパ系への接続を開くことは自明ではなかった。
【０００７】
本発明者らは、例えばリンパ節又は例えば肝臓のような器官若しくは例えば腸間膜脂肪組織のような組織における転移が、リンパ系への接続及びリンパ節への排液を開くこと、及び１又はそれより多い所謂「メチネル」リンパ節、すなわち転移からのリンパ排液を受ける最初のリンパ節が同定可能であることを見出した。
【０００８】
理論的には、転移からの腫瘍細胞の拡散は、腫瘍がトリガーする血管形成活性により形成される血管を介して起こり得る。リンパ系は胚発生以来むしろよく保存され、血管系とは独立して発達すると考えられている。したがって、本発明者らは、種々の充実性原発腫瘍についてリンパ排液をマッピングするために開発された技法と同様な技法を用いて、充実性上皮腫瘍からの転移を研究できることを見出せるとは予測できなかった。皮下組織、リンパ系組織、腹部内及び内部器官に位置する異なるタイプの転移からのリンパ排液を研究する間に、本発明者らは転移排液リンパ節(メチネル節)を同定した。メチネル節は個別に位置し、メチネル節(すなわち、転移からのリンパ排液を受ける最初の節)が、転移から解剖学的最短距離の節でないこともしばしばある
【０００９】
本発明者らによるこのようなメチネルリンパ節の更なる分析により、メチネルリンパ節が、対応する転移中の腫瘍細胞に対して特異活性を有するＴリンパ球を含有することが示された。本発明者らは更に、メチネルリンパ節から得られたＴリンパ球が拡大可能であり、散在性ガン疾患の治療に使用可能であることを示した。
【００１０】
したがって、本発明は、散在性ガンに罹患している患者の治療法に関し、該方法は、
ｉ)患者において、１又はそれより多いメチネルリンパ節を同定し、
ii)該１又はそれより多い節と、任意に転移の全て又は一部とを切除し、
iii)該リンパ節から転移反応性Ｔリンパ球を単離し、
iv)該転移反応性Ｔリンパ球をインビトロ拡大し、
ｖ)そうして得られたＴリンパ球を患者に投与する
ことを含んでなり、前記Ｔリンパ球はCD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球であり、CD4+CD25+Hiリンパ球ではない。すなわち、本発明は調節性Ｔリンパ球を対象としない。
【００１１】
本発明の方法の工程を更に詳述する前に、以下の用語を定義する：
用語「腫瘍反応性Ｔリンパ球」は、腫瘍抗原に特異的でありこれを認識するＴ細胞レセプター(TCR)を有するＴリンパ球を意味すると意図される。ここで、用語 腫瘍反応性Ｔリンパ球はまた、転移抗原に特異的でありこれを認識するTCRを有するＴリンパ球も含むと意図される。すなわち、用語 腫瘍反応性Ｔリンパ球 及び 転移反応性Ｔリンパ球は、互換可能に使用される。
【００１２】
用語「Ｔヘルパー細胞」は、活性化されると適応性の免疫応答を促進するＴリンパ球を意味すると意図される。
用語「Th1細胞」は、IFN-γのようなサイトカインを使用して活性化されると、細胞媒介性免疫応答を促進するＴヘルパー細胞を意味すると意図される。
用語「Th2細胞」は、IL-4のようなサイトカインを使用して活性化されると、体液性免疫応答を促進するＴヘルパー細胞を意味すると意図される。
【００１３】
用語「CD4+ヘルパーＴリンパ球」は、CD4を発現するが転写因子FoxP3を発現しないＴリンパ球を意味すると意図される。
用語「CD8+Ｔリンパ球」は、CD8を発現するＴリンパ球を意味すると意図される。
用語「調節性Ｔリンパ球」は、転写因子FoxP3を発現し、適応性免疫応答を抑制するＴリンパ球を意味すると意図される。
【００１４】
用語 Ｔリンパ球の「特異的活性化」は、抗原特異的でMHC拘束性のＴ細胞レセプター媒介性活性化を意味すると意図される。これに対し、用語 Ｔリンパ球の「非特異的活性化」は、Ｔ細胞レセプターの特異性にかかわらず、全てのＴ細胞の全般的な活性化を意味すると意図される。
【００１５】
用語「腫瘍由来抗原」は、腫瘍細胞、腫瘍のホモジネート(これは変性されていてもよい)、又は例えば精製、天然、合成及び/若しくは組換えのタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドの形態の、腫瘍タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドを含むと意図される。用語 腫瘍は、本明細書中で、原発腫瘍の転移をも包含すると意図されていることに留意すべきである。腫瘍由来抗原は、インタクトな分子、そのフラグメント又はインタクトな分子及び/若しくはフラグメントの多量体若しくは凝集体であり得る。適切なポリペプチド及びペプチドの例は、約５〜約30アミノ酸、例えば約10〜25アミノ酸、約10〜20アミノ酸又は約12〜18アミノ酸を含んでなるポリペプチド及びペプチドである。ペプチドが使用される場合、培養中で約0.1〜約5.0μM、例えば約0.1〜約4.0μM、約0.2〜約3.0μM、約0.3〜約2.0μM又は約0.3〜約1.0μMの最終モル濃度が使用され得る。腫瘍由来抗原は自己由来であっても異種であってもよい。すなわち、腫瘍由来抗原は、治療すべき患者から生じていてもよいし、ガンに罹患している別の対象から取得してもよい。本明細書の実施例では、本発明者らは、自己由来の変性腫瘍抽出物を使用するが、上記のように、腫瘍由来抗原の他の供給源もまた、本発明による方法において使用可能であり得る。
【００１６】
用語「第１フェーズの１日目」又は例えば「第２フェーズの５日目」は、以下のように理解すべきである：リンパ球を採集した日を０日目と呼ぶ。第１のフェーズの１日目は、IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する少なくとも１つの物質と、おそらくは培養培地及び/又は腫瘍由来抗原との添加により拡大が開始された日として定義される。拡大フェーズｉ)は、０日目に開始されてもよいし、リンパ球の採集の２日後までに開始されてもよい。第２のフェーズが腫瘍由来抗原の添加により開始される日は、本明細書を通して、「第２フェーズの１日目」と記述される。
【００１７】
用語「センチネルリンパ節」は、腫瘍からのリンパ排液を受ける最初のリンパ節を意味すると意図される。原発腫瘍又は原発腫瘍領域は、１又はそれより多い所謂センチネルリンパ節に排液する。センチネル節はまた、転移の最初の部位でもあり、幾つかの充実性腫瘍タイプでは、センチネル節に腫瘍細胞がない場合にはリンパ節転移の危険はほとんど無視できることが示されている。用語「メチネル(metinel)リンパ節」とは、転移又は転移領域からのリンパ排液を受ける最初のリンパ節をいう。
【００１８】
本方法の第１工程は、転移を排液する１又はそれより多いメチネルリンパ節の同定である。上記のように、メチネルリンパ節の位置決めは、必ずしも容易な課題ではない。なぜならば、転移からの排液を受ける最初のものが、解剖学的最短距離のリンパ節でないこともしばしばあるからである。しかし、本発明者らは、メチネル節が、転移からリンパ系を更に下行したリンパ節又は無関係のリンパ節(ここでは、腫瘍反応性Ｔリンパ球の含量は実質的に０である)より高い量の腫瘍反応性Ｔリンパ球を含有することを見出したので、１又はそれより多いメチネル節を同定する工程ｉ)は、本発明による方法に関して非常に重要である。
【００１９】
メチネルリンパ節を同定する１つの方法は、患者に１又はそれより多いリンパ節探知体(すなわち、リンパ節を位置決めするに適切な任意の物質)を注射することによる。このような探知体は、好ましくは、医薬的に受容可能であり及び/又は生体適合性である。探知体は、親和性ベースであるか又は非親和性ベースであるかのいずれかであり得る。親和性ベースのリンパ節探知体の例は、抗体(全体又はフラグメント)、ナノボディ(nanobody)、核酸(例えば、RNA、DNA)及びPNAである(これらは全て、次いで、種々の検出様式を用いて標識することができる)。親和性ベースのリンパ節探知体の検出は、トレーサー及び色素(例えば、下記のもの)で標識することにより行うことができる。次いで、可視化は、ｉ)造影物質(contrast generating substance)(例えば、ヨウ素含有物質)又は放射性物質(例えば、テクネチウム-99m)での標識後のＸ線、コンピュータ断層撮影法、シンチグラフィー、陽電子放射技法のような放射線学的方法、ii)磁性又は常磁性物質(例えば、ガドリニウム、磁性デンドリマー(magnetodendromers)又は酸化鉄含有粒子)での標識後の磁気共鳴画像化；iii)裸眼又は光子検出デバイス(例えば、CCD又はCMOSセンサ)による検出用の色素、蛍光色素又は発光色素での標識によりIR-可視-UVスペクトルの光によってなされる。
【００２０】
非親和性ベースのリンパ節探知体の例には、トレーサー及び色素が包含される。これら物質は、毛細リンパ管内を輸送され、センチネル節又はメチネル節でマクロファージによるファゴサイトーシスを通じて蓄積するので、腫瘍又は転移を排液するリンパ節を同定する。
【００２１】
トレーサーの例は、光子感受性フィルム又はセンサ(例えばPET検出器)を用いる放射性崩壊ベースの検出用の放射性物質、例えばテクネチウム-99である。更に、磁性、常磁性又は超常磁性物質については、例えば、磁気共鳴ベースの検出用のガドリニウム含有造影剤、酸化鉄粒子、磁性酸化物粒子、磁性デンドリマーを、放射線学ベースの検出(例えば、コンピュータ断層撮影法又は通常のＸ線)用の造影剤、例えばヨウ素を使用し得る。
【００２２】
色素の例には、例えば、発光光、近赤外光、蛍光、UV光及び可視光による可視化には、アゾ色素、ビスアゾ色素、トリアゾ色素、ジアリールメタン色素、トリアリールメタン色素、アントラキノン(anthrachino)色素、多環式芳香族カルボニル色素、インディゴ色素が包含される。更に、色素については、発光ベースの検出用の発光物質及び蛍光ベースの検出用の蛍光物質、例えばピコグリーン(pico green)、サイバーグリーン(sybr green)、レッド０オイル(red O oil)、テキサスレッドもまた包含される。検出は、選択した波長に依存して、裸眼又は光子検出デバイス(例えば、CCD又はCMOSセンサ)のいずれかにより行うことができる。
【００２３】
１つの実施形態では、色素は、通常光(normal light)で裸眼による可視化を可能にする発光極大を有する。別の実施形態では、色素は、UV光で裸眼による可視化を可能にする発光極大を有する。
適切な色素又はトレーサーの他の例は、WO 04/045650(参照により本明細書に組み込まれる)に見られる。
【００２４】
メチネル節を同定する別の方法ではあるが遥かに時間のかかるものは、推定の転移排液領域において選択したリンパ節を取り出して調べることである。次いで、実際の患者の転移からの腫瘍抽出物を使用して、増殖アッセイにより腫瘍反応性Ｔリンパ球を含有するリンパ節を同定し得る。
【００２５】
リンパ節探知体は、患者に、転移の中、上、周り、近く及び/又は下に注射する。次いで、探知体はリンパ系脈管を通って拡散し、メチネルリンパ節に至り、１又はそれより多い節が、探知体物質の注射後の或る期間内(例えば、５分〜30分以内、例えば５分〜15分以内)に染まり始める。そこで、探知体物質が造影される。上記のように、探知体の造影は、もちろん、使用する探知体物質に依存する。
【００２６】
通常光で裸眼による可視化を可能にする発光極大を有する色素(例えばパテントブルー(Patent Blue))を使用する場合、１又はそれより多いメチネル節は、単純に、着色色素が最初に蓄積する節として同定される。すなわち、パテントブルーを使用する場合、外科医は、青色が最初に蓄積するリンパ節を探す。
【００２７】
探知体は、単回注射又は多回注射(例えば、２回又はそれより多い注射、３回又はそれより多い注射、４回又はそれより多い注射、５回又はそれより多い注射、或いは６回又はそれより多い注射)により注射され得る。
【００２８】
リンパ節探知体の注射を実施する方法は、転移の位置に依存する。リンパ節探知体は、非外科的手順より、すなわち外科的工程を含まない手順により注射され得る。ここで、外科的工程は、外科手術手順を含むもの、すなわち器具を用いる切開を含む工程と定義される。本発明に関しては、注射、すなわち注射針による皮膚の穿孔は、外科的工程と考えない。したがって、リンパ節探知体が非外科的手順により注射され得るとの言及は、リンパ節探知体が、皮膚に又は皮膚を通して直接、転移の中、上、周り、近辺及び/又は下に注射され得ることを意味すると意図される。
【００２９】
リンパ節探知体が皮膚内に又は皮膚を通して注射され得る状況の例は、例えば、転移が患者の皮膚に位置する症例である。このような状況では、リンパ節探知体は、優先的には、転移の上の皮膚中に、又は皮膚を通して転移の中、周り、近辺及び/又は下に注射すべきである。転移が患者の皮下組織に位置する場合、リンパ節探知体は、優先的には、転移の上の皮膚中に、又は皮膚を通して転移の中、周り、近辺及び/又は下に注射すべきである。
【００３０】
上記のように、メチネルリンパ節は、必ずしも、転移から解剖学的最短距離又は最も論理的な解剖学的距離に位置しないことがある。この例としては、本明細書中の実施例に記載されるような、本発明者らによる鼠径部リンパ節転移から遠位で内側のメチネル節の驚くべき同定がある。リンパ系の解剖学に基づいて、鼠径部におけるリンパ節転移に対するメチネルリンパ節が疑われる位置は、皮膚若しくは皮下脂肪中の近位又は骨盤中の腸骨血管に沿って深部のいずれかである。
【００３１】
したがって、メチネルリンパ節は転移から遠位に位置し得るので、幾つかの症例では、手術の必要がないリンパ節探知体の注射が非常に有益であり得る。なぜならば、そのようなメチネルリンパ節の位置を予測することは非常に困難であり得るからである。理論では、鼠径部中の転移は腋窩にメチネルリンパ節を有し得る。すなわち、メチネル節除去手術を行う身体内の場所を予測することは非常に困難なことがある。本発明の具体的実施形態では、リンパ節探知体は、放射性物質、例えばテクネチウム-99mである。これは非外科的手順により注射され得、その後リンパシンチグラフィーを実行することにより造影される。
【００３２】
センチネル節は原発腫瘍を排液する。これは、通常、先天的に、そのリンパ排液がその特定の個体に関して胎発生以来組織された器官に由来する。排液パターンは個体間で異なり得る。本発明者らは、種々の場所(肝臓、腸間膜脂肪、リンパ節、皮下組織、筋肉など)に位置する転移もまた、最初の排液リンパ節を有するリンパ排液を有することを見出した。本発明者らはこれら節を「メチネル節」と呼ぶ。これらは、リンパ管生成因子(例えばVEGF-C)を産生する転移自体の能力によりリンパ管に接続している可能性が高い。本発明者らは、(転移に対するクローン拡大を経験した)これらメチネル節において腫瘍反応性リンパ球を同定し、それらを免疫学的特徴を保持したまま拡大させ、細胞性免疫療法に使用できることを示した。
【００３３】
リンパ節探知体はまた、外科的手順、すなわち切開を含む手順を含んで注射し得る。外科的手順を含み得る状況の例としては、注射針が皮膚を通して到達できない場所に転移が位置する場合又は皮膚及び組織を通しての探知体の造影が不可能である場合である。
【００３４】
このような場合、外科医は、転移の領域で切開を実施し、その後、１又はそれより多いメチネルリンパ節を同定するために、リンパ節探知体を転移の中、上、周り、近辺及び/又は下に直接注射し得る。リンパ節探知体の注射が外科的手順を含み得る状況の例は、例えば、転移が患者の腹部内の領域中、柔組織器官中又はより深部に位置するリンパ節中に位置する場合である。
【００３５】
時に、メチネルリンパ節の同定には、非外科的工程と外科的工程との組合せによるリンパ節探知体の注射が含まれ得る。この例としては、放射活性リンパ節探知体、例えばテクネチウム-99mを、注射針を用いて、すなわち手術用の針を用いずに注射し得る。探知体の蓄積、すなわちメチネル節の同定は、γ検出器を用いて行い得る。このことにより、外科医は、メチネル節が位置する場所に対する示唆が得られる。その後、メチネルリンパ節及び転移の少なくとも一部を除去する手術を患者が受けているときに、着色色素(例えばパテントブルー色素)を注射し得る。更に、最初の注射後約18〜24時間より長く経過する場合には、手術の間にメチネル節を同定するために、放射活性トレーサーを(該放射活性トレーサーの半減期(通常約６時間)に依存して)１又はそれより多く余分に注射することが有益であり得る。
【００３６】
１つの方法又は他の方法により１又はそれより多いメチネルリンパ節を位置決めした後に、外科医は、メチネルリンパ節が腫瘍細胞を含有しているかどうかを調べるため、及び転移反応性Ｔリンパ球の培養物を取得するために、メチネルリンパ節を取り出す。
【００３７】
１又はそれより多いメチネルリンパ節からのリンパ球の採集は、リンパ球の単一細胞懸濁物を取得するために、メチネルリンパ節材料をホモジネートすることにより行われ得る。次いで、単一細胞懸濁物は、転移反応性Ｔリンパ球を取得するために、インビトロ拡大に付す。
【００３８】
インビトロ拡大
本発明に従う方法のインビトロ拡大工程iii)は、
ｉ) 腫瘍反応性CD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球を、腫瘍由来抗原とIL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する少なくとも１つの物質とで刺激して、腫瘍反応性Ｔリンパ球の生存を促進する第１のフェーズ；及び
ii) 腫瘍反応性CD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球の成長を活性化し促進する第２のフェーズ
を含んでなり、第２のフェーズii)は、Ｔリンパ球上でCD25細胞表面マーカー(IL-2Rマーカー)がダウンレギュレートされたときに開始される。
【００３９】
フェーズｉ)
第１のフェーズｉ)の目的は、実質的に高い比率の腫瘍反応性CD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球を含んでなる培養物を取得することである。第１のフェーズは、腫瘍反応性Ｔリンパ球を生存させ分裂させる「養育フェーズ」と考えられる。Ｔリンパ球の供給源(インビトロ拡大法用の出発材料)に依存して、Ｔリンパ球は、比較的過酷な条件、例えばガン細胞によって分泌される因子による抑制及び阻害を漸次導入され得る。
【００４０】
拡大法における使用のための出発材料は、転移を排液するリンパ節から得られるリンパ球の混合物であり得る。
【００４１】
培養物中で拡大させるべきＴリンパ球は、治療すべき対象から取得することができる。すなわち、投与用に得られる特異的腫瘍反応性Ｔリンパ球は自己由来であり得る。しかし、Ｔリンパ球はまた、治療すべき対象以外の供給源から、例えばガンに罹患している別の対象から取得することも可能である。この場合、レシピエント及び拡大された腫瘍反応性Ｔリンパ球は、好ましくは、免疫学的に適合性である(或いは、そうでなければ、レシピエントが、拡大された腫瘍反応性Ｔリンパ球に免疫寛容にされる)。
【００４２】
出発材料は、ほとんどの場合、種々のリンパ球、例えばＴリンパ球、Ｂリンパ球、抗原提示細胞、腫瘍反応性Ｔリンパ球及び非活性化/非反応性Ｔリンパ球の混合物を含んでなる。腫瘍反応性Ｔリンパ球の生存を特異的に促進するために、腫瘍由来抗原とIL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する１又はそれより多い物質とが添加される。
【００４３】
上記のように、第１のフェーズｉ)は、IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する少なくとも１つの物質を添加することにより開始される。その物質の機能は、IL-2レセプターを介してＴリンパ球を刺激し、Ｔリンパ球の細胞分裂を促進することであり、そのことにより細胞死を防止する。
【００４４】
Ｔリンパ球の抗原特異的MHC拘束性活性化は、腫瘍細胞の認識に特異的な有用なＴリンパ球集団のクローン拡大を促進する。対照的に、Ｔリンパ球の非特異的活性化は、腫瘍細胞の認識との関係なく無関係のペプチドを認識するＴリンパ球クローンの拡大を導き、よって非特異的に拡大されたＴリンパ球の大部分は当該腫瘍を認識しない。
【００４５】
本発明は、腫瘍反応性CD4+ヘルパー及びCD8+Ｔリンパ球の特異的活性化及び成長を促進することを目的とする。或る腫瘍抗原に対する特異的活性化により、Ｔリンパ球は、該Ｔリンパ球が活性化されている腫瘍タイプと同じ腫瘍タイプのガン患者に投与されたときに治療効果を有することが可能になる。
【００４６】
本発明の１つの実施形態では、IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質は、アゴニストである。このような物質の例としては、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、アフィボディ、及びそれらのフラグメント、融合タンパク質、合成及び/又は有機分子、例えば、小分子、及び天然リガンドが挙げられる。好ましい実施形態では、この物質は、IL-2レセプターの天然リガンド、すなわちIL-2である。
【００４７】
IL-2は、使用される場合、リンパ球のアポトーシスを減少させるため及びCD4陽性腫瘍反応性Ｔリンパ球の集団を増大させるために、優先的には、低用量で添加される。本発明の具体的実施形態では、IL-2の低用量は、約100 IU/ml培養培地〜約700 IU/ml培養培地、例えば、約100 IU/ml培養培地〜約600 IU/ml培養培地、約100 IU/ml培養培地〜約500 IU/ml培養培地、約100 IU/ml培養培地〜約400 IU/ml培養培地、約100 IU/ml培養培地〜約300 IU/ml培養培地及び約100 IU/ml培養培地〜約200 IU/ml培養培地である。具体的実施形態では、添加するIL-2の量は240 IU/mlである。
【００４８】
IL-2レセプターに対してアゴニスト活性を有する、IL-2以外の物質を使用する場合、それらの具体的用量は、上記用量のIL-2により得られる効果に相当する効果を導くような用量であるべきである。
【００４９】
細胞分裂を促進する最適条件を維持するために、更なる量のIL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する少なくとも１つの物質が、フェーズｉ)を通して定期的に、例えばフェーズｉ)の２日毎、３日毎又は４日毎に添加されてもよい。用語 ２日毎、３日毎又は４日毎は、IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する少なくとも１つの物質が、IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する少なくとも１つの物質の最初の添加後(すなわちフェーズｉ)の開始後)２日目、３日目又は４日目に開始され、フェーズｉ)を通して２日毎、３日毎又は４日毎に添加されることを意味すると意図される。
【００５０】
１つの実施形態では、フェーズｉ)を通して定期的に添加されるべき物質は、IL-2のアゴニストである。好ましい実施形態では、この物質はIL-2である。
定期的、例えば２日毎、３日毎又は４日毎に添加されるべき、IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質(例えば、IL-2)の更なる用量は、上記範囲内である。
【００５１】
第１のフェーズｉ)の拡大における更なる重要な工程は、腫瘍抗原を認識するＴリンパ球レセプターを発現するＴリンパ球、すなわち腫瘍反応性Ｔリンパ球の細胞分裂を促進するための腫瘍由来抗原の添加である。
【００５２】
腫瘍抗原を添加する最適な時点は、リンパ球の供給源に依存する。リンパ球がリンパ節起源である場合、リンパ球は、腫瘍抗原提示に際して増殖で応答するＴリンパ球の能力を促進するために、腫瘍細胞の近傍で腫瘍細胞による免疫抑制に供されてもよく、IL-12レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質(例えば、IL-2)との何日間かのインキュベーションを必要とし得る。したがって、そのような場合、腫瘍由来抗原は、優先的には、第１のフェーズｉ)の２日目から５日目まで(５日目を含む)、例えば２日目、３日目、４日目又は５日目に添加される。
【００５３】
腫瘍由来抗原(例えば、腫瘍ホモジネート)は、出発材料中に存在する抗原提示細胞による、例えばＢリンパ球、樹状細胞及びマクロファージによる、エンドサイトーシス及びプロセッシングを受ける可能性が高い。ほとんどの場合、腫瘍由来抗原は、クラスII MCH分子により提示され、CD4+腫瘍反応性Ｔリンパ球の細胞分裂を導く。しかし、交差提示により、エンドサイトーシスにより取り込まれた抗原は、プロセッシングを受け、クラスＩポケットで提示され、CD8+Ｔリンパ球の活性化を生じる。上記のように、この拡大法の目的の１つは、或る観点では、患者自身の免疫系の天然経路を模倣することであり、或る意味では、抗原がMCHIにより提示されるか又はMCHIIにより提示されるかに依存して、患者免疫系の成分に、CD4+リンパ球を生成するか又はCD8+リンパ球を生成するかを決定させることである。ほとんどの場合、抗原はクラスII MCH分子により提示されてCD4+Ｔリンパ球の生成を導くが、CD8+Ｔリンパ球が生成する場合もある。
【００５４】
フェーズii)
第２のフェーズii)の目的は、フェーズｉ)により得られた腫瘍反応性CD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球を活性化及び拡大すること、並びに腫瘍反応性CD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球を所望の経路に方向付けることによりこれらＴリンパ球の特異的亜集団を取得することである。
【００５５】
本発明者らは、フェーズii)を開始する最適な時点を決定する１つの方法は、Ｔリンパ球が再刺激に感受性であるときを特異的に決定するために、Ｔリンパ球上のCD25細胞表面マーカーの発現をモニターすることによることを見出した。本発明者らは、第２のフェーズii)が、好ましくは、Ｔリンパ球上のCD25の発現がダウンレギュレートされたときに開始されるべきであることを見出した。CD25は活性化マーカーであり、リンパ球が活性化シグナルを受けたことを示す。Ｔリンパ球上のCD25の発現が高い(リンパ球が既にシグナルを受けたことを意味する)ときに第２のフェーズを開始すると、細胞死が起こる。
【００５６】
CD25のダウンレギュレーションは、Ｔリンパ球集団の相当部分がCD25マーカーを本質的に全く発現しないか又は非常に少ししか発現しないこととして定義される。好ましい実施形態では、CD25のダウンレギュレーションは、Ｔリンパ球集団の５％未満がCD25を発現すること、すなわち培養物中の95％又はそれより多いＴリンパ球はCD25を全く発現しないこととして定義される。CD25を発現する５％又はそれ未満のＴリンパ球は、CD25を永続的に高度に発現する調節性CD4+Ｔリンパ球である可能性が最も高い。加えて、Ｔリンパ球集団は、好ましくは、調節性Ｔリンパ球の特異マーカーであるFoxP3マーカーを本質的に全く発現すべきでないか又は非常に少数にしか発現すべきでない。好ましい実施形態では、FoxP3のダウンレギュレーションは、Ｔリンパ球集団の５％未満がFoxP3を発現すること、すなわち培養物中の95％又はそれより多いＴリンパ球はFoxP3を全く発現しないこととして定義される。
【００５７】
CD25の他にも、その発現が第２フェーズを開始する最適な時点を決定するためのモニターに関連する他のマーカーが存在する。そのようなマーカーの例は、初期活性化マーカーCD69、及びＴリンパ球の活性化マーカーであるMCHIIである。CD69及びMCHIIの発現は、Ｔリンパ球の「活性化プログラム」が既に始まっていることを示す(このことは、細胞が追加の刺激に応答できないことを意味する)ので、これら両マーカーは、好ましくは、第２のフェーズが開始される前にダウンレギュレートされるべきである。用語 ダウンレギュレーションは、Ｔリンパ球集団の５〜10％未満がCD69及び/又はMCHIIを発現することとして定義され得る。
【００５８】
本発明の別の実施形態では、本拡大法のフェーズii)の拡大中に、抗CD4抗体を使用して、Ｔヘルパー細胞を培養物中の腫瘍細胞である可能性がある細胞から分離する。
【００５９】
本発明の更なる又はなお別の実施形態では、抗CD3抗体及び抗CD28抗体を有するDynabeads(登録商標)のような製品を使用して、本拡大法のフェーズii)の拡大を促進する。Dynabeads(登録商標) CD3/CD28の使用は、活性化シグナルを有するリンパ球を提供し、培養物中の腫瘍細胞である可能性のある細胞からの分離に使用することもできる。Dynabeads(登録商標) CD3/CD28は、フェーズｉ)の間に抗原特異的に拡大されたＴリンパ球に結合する。こうして、これら細胞は磁気的に富化することが可能となる。最初の抗原特異的活性化が開始され、Ｔリンパ球のクローン拡大が導かれているので、Dynabeads(登録商標) CD3/CD28再刺激は、クローン拡大を更に促進する。なぜならば、フェーズｉ)は非特異的Ｔリンパ球クローンの活性化を支持しないからである。
【００６０】
たとえ、フェーズii)の正確な開始点はリンパ球が特異マーカーの好ましい発現を獲得したときに依存して変化しても、第２のフェーズii)は、ほとんどの場合、第１のフェーズｉ)の17日目から23日目まで(23日目を含む)(例えば17日目、18日目、19日目、20日目、21日目、22日目又は23日目)に開始される。換言すれば、リンパ球が好ましい量及び組合せのマーカーを発現する時点は、ほとんどの場合、第１のフェーズｉ)の17日目から23日目までのようである。
【００６１】
Ｔリンパ球の拡大、すなわちフェーズｉ)及びii)は、ほとんどの場合、適切な培養培地で起こる。好ましくは、患者への疾患の伝染の危険を回避するために、無血清培地又は自己由来血清が使用される。適切な標準培地の例としては、AIMV培地、RPMI 1640、DMEM及びMEMが挙げられる。しかし、アミノ酸、ステロイド、ビタミン、成長因子、サイトカイン及びミネラルの適切なブレンドを含んでなる他の培地も使用し得る。
【００６２】
培養物中の適切な細胞密度を維持するために、２つの拡大フェーズ中、細胞は、幾つかの培養容器に分割されてもよい。拡大フェーズにおけるＴリンパ球の密度は、好ましくは、約３〜約６百万細胞/ml培養培地であるべきである。
【００６３】
拡大の間、培地の条件付けと呼ばれる工程である、新鮮な培地との培養培地の交換もまた必要とされ得る。培養物を分割する時点及び培地を条件付けする時点は、細胞の形態及び細胞培養物密度(これは約６百万細胞/mlを超えるべきでない)に基づいて決定され得るか、又は培地は、適切な指示薬(例えばフェノール指示薬)を含み得る。指示薬が培地に含まれる場合、培養物を分割する時点又は培地を条件付けする時点は、培地の色に基づいて決定してもよい。フェノールレッド指示薬を使用する場合、細胞は、培地が黄色になった(培養物のpHが酸性になっていることを示す)ときに分割又は条件付けすべきである。本発明に使用される培地を条件付けるために適切なスケジュールは、培地の1/4〜1/2(例えば1/3)を３〜９日毎(例えば週１回)交換するというものであり得る。
【００６４】
本明細書に記載の具体的条件を除き、他のパラメータについては、リンパ球培養物の成長用の標準条件(例えば、温度37℃及び５％CO2)が使用される。
上記のように、第２のフェーズii)は、腫瘍反応性Ｔリンパ球のクローン拡大を促進するために、腫瘍反応性CD25陰性Ｔリンパ球の活性化について上記のようにＴリンパ球に腫瘍由来抗原を添加することにより開始される。
【００６５】
本発明の具体的実施形態では、抗原提示細胞(APC)は、腫瘍由来抗原と共にＴリンパ球に添加される。抗原提示細胞(APC)としては、白血球、例えば単球、マクロファージ及びリンパ球(例えばＢ細胞)が挙げられる。これら多様な細胞タイプは、特異的Ｔリンパ球レセプターにより認識される形態で抗原を提示する能力を共通して有する。白血球調製物は、治療すべき患者から得られる、例えば血液、リンパ液、骨髄、リンパ器官組織又は組織培養液から単離される。好ましい実施形態では、APC細胞は、抗原提示Ｂ細胞及び/又は単球を含有する照射末梢血白血球である。添加するAPCの量は、約0.5百万APC/mlリンパ球培養物〜約５百万APC/mlリンパ球培養物の範囲、例えば、約１百万APC/mlリンパ球培養物〜約４百万APC/mlリンパ球培養物の範囲、約１百万APC/mlリンパ球培養物〜約３百万APC/mlリンパ球培養物の範囲又は約１百万APC/mlリンパ球培養物〜約２百万APC/mlリンパ球培養物の範囲にある。
【００６６】
腫瘍反応性Ｔリンパ球のクローン拡大を促進するためのＴリンパ球への腫瘍由来抗原の添加の他に、第２のフェーズii)は、その機能が所望の亜集団に対して腫瘍反応性Ｔリンパ球の拡大を導くことである特定成分の添加を含んでなる。
【００６７】
上記のように、本発明は、腫瘍反応性CD4+ヘルパーＴリンパ球の生成法を提供する。CD4+ヘルパーＴリンパ球は、抗原が主要組織適合性複合体クラスII分子と組み合わさったとき、腫瘍抗原を認識し結合する。活性化CD4+ヘルパーＴリンパ球は、免疫系の他の細胞(例えば他のリンパ球)を刺激するサイトカイン、タンパク質及び/又はペプチドを分泌する。分泌される最も一般的なサイトカインは、インターロイキン-２(IL-2)である。これは、強力なＴリンパ球成長因子である。活性化され増殖中のCD4+ヘルパーＴリンパ球は、産生する特異的サイトカインに基づいて定義される２つの主要なサブタイプの細胞であるTh1細胞及びTh2細胞に分化することができる。Th1細胞は、インターフェロン-γ及びインターロイキン12(IL-12)を産生する一方、Th2細胞は、インターロイキン-４、インターロイキン-５及びインターロイキン-13を産生する。Th1Ｔリンパ球は、細胞傷害性Ｔリンパ球(Tc)、NK細胞、マクロファージ及び単球(これらは全て、ガン細胞を攻撃することができ、一般的には腫瘍に対して防御することができる)の活性化を促進すると考えられている。
【００６８】
タイプTh1及びTh2のＴヘルパー(CD4+)リンパ球は、メモリー細胞及びエフェクター細胞に分化することができる。メモリーＴヘルパー(CD4+)リンパ球は、それらが最初に遭遇した抗原に特異的であり、二次免疫応答の間に召集されて、当該腫瘍抗原に対するより迅速で規模の大きな応答を引き起こすことができる。ヒトにおいて、リンパ球が少なくとも20年(おそらく生涯)生存するという証拠が存在する。エフェクターCD4+Ｔリンパ球は、サイトカイン及びINF-γを産生する活性な細胞である。
【００６９】
ガンの有効な治療のために、Th1タイプの腫瘍反応性Ｔリンパ球の投与は、このタイプが細胞傷害性Ｔリンパ球(Tc)、NK細胞、マクロファージ及び単球(これらは全てガン細胞を攻撃し、一般的には腫瘍に対して防御することができる)の活性化を促進すると考えられているので、特に有益である。すなわち、具体的実施形態において、本発明は、腫瘍反応性CD4+ヘルパーＴリンパ球を生成する方法に関し、更なる実施形態では、本方法により生成されるTh2タイプのＴリンパ球の割合は、30％又はそれ未満、例えば25％又はそれ未満、20％又はそれ未満、15％又はそれ未満、10％又はそれ未満、５％又はそれ未満、或いは０％である。すなわち、腫瘍反応性CD4+Ｔリンパ球の少なくとも70％、例えば少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％又は100％が、Th1タイプである。
【００７０】
したがって、第２のフェーズは、Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質の添加を含んでなり得る。IL-12Rのアップレギュレーションは、Ｔ細胞が迅速にIL-12サイトカイン活性化を受容し最適化する態勢を増大させ、その結果、最大のSTAT-4シグナル伝達を生じ、そうしてリンパ球をTh1細胞及びIFN-γ産生に傾斜させる(skew)。
【００７１】
Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質は、インターフェロンレセプターに対するアゴニスト活性を有する物質であり得る。本発明の１つの実施形態では、インターフェロンレセプターに対するアゴニスト活性を有する物質は、アゴニストである。このような物質の例としては、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、アフィボディ、及びそれらのフラグメント、融合タンパク質、合成及び/又は有機分子(例えば小分子)、及び天然リガンドが挙げられる。具体的実施形態では、この物質は、インターフェロンレセプターの天然リガンド、すなわちインターフェロン(例えば、インターフェロン-α)である。
【００７２】
Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質(例えば、インターフェロンレセプターに対するアゴニスト活性を有する物質)を添加する最適な時点は、培養培地中のIL-12レベルを測定することにより決定してもよい。この物質は、好ましくは、IL-12レベルが、フェーズii)の１日目のIL-12レベルと比較して、少なくとも１倍増加したとき、例えば少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍又は少なくとも５倍増加したときに添加すべきである。ほとんどの場合、このようなIL-12レベルの増加は、第２のフェーズii)の開始後２日目から４日目まで(４日目を含む)(例えば２日目、３日目又は４日目)に見られる。
【００７３】
Th2タイプの腫瘍反応性Ｔリンパ球の生成を実質的に回避するために、第２のフェーズは、Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る１又はそれより多い物質の添加を更に含んでなってもよい。そのような物質の例は、インターロイキンIL-4、IL-5、IL-10及び/又はTGF-β(後者はインターロイキンではない)(これら４つは全て、Th2サイトカインプロフィールの確立及びTh1サイトカイン産生のダウンレギュレーションに必要とされる)を中和し得る物質である。
【００７４】
このような物質の例としては、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、可溶性レセプター、抗体、アフィボディ、及びそれらのフラグメント、融合タンパク質、合成及び/又は有機分子(例えば小分子)、及び天然リガンドが挙げられる。具体的実施形態では、この物質は、インターロイキンに結合し、そのことによりインターロイキンを中和する抗体(例えば抗IL-4抗体、抗IL-5抗体及び/又は抗IL-10抗体)並びに可溶性レセプター(例えばTGF-βレセプターＩ及びII)及びTGF-βに関する結合性タンパク質(例えばLAP及び/又はLTBP)から選択される。
【００７５】
Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る１又はそれより多い物質(例えば、IL-4、IL-5、IL-10及び/又はTGF-βを中和し得る１又はそれより多い物質)は、第２のフェーズii)の１日目に添加してもよい。しかし、抗体は高価であるので、抗体の添加は、Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質の添加後の後工程において、例えば、Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質の添加の１日後、２日後又は３日後に実施することも可能である。
【００７６】
この中和物質は、インターロイキンを中和するに十分な量で、例えば、中和すべきインターロイキン量の10〜100倍(モル)過剰で添加すべきである。抗体を使用する場合、通常、約２〜約４ng/ml培養培地の最終濃度が必要である。他のタイプの中和物質に関しては、抗体について言及した濃度と同じ効果を与える最終濃度を使用すべきである。
【００７７】
Th2タイプＴリンパ球の発達の抑制を維持するために、更なる量のTh2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る１又はそれより多い物質(例えば、IL-4、IL-5、IL-10及び/又はTGF-βを中和し得る１又はそれより多い物質)が、フェーズii)を通して定期的に、例えばフェーズii)の２日毎、３日毎又は４日毎に添加されてもよい。用語 ２日毎、３日毎又は４日毎は、Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る少なくとも１つの物質が、該Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る少なくとも１つの物質の最初の添加の２日後、３日後又は４日後に開始され、フェーズｉ)を通して２日毎、３日毎又は４日毎に添加されることを意味するように意図されると理解されるべきである。
【００７８】
更に、フェーズｉ)と同様に、更なる量のIL-12レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質(例えば、アゴニスト)が、細胞分裂を促進する最適条件を維持するために、フェーズii)を通して定期的に、例えばフェーズii)の２日〜４日毎(すなわち、２日目、３日目又は４日目)に添加されてもよい。定期的に添加すべき物質の用量は、IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質(例えば、IL-2)の添加についてフェーズｉ)で言及した最適範囲内にある。
【００７９】
Th1タイプ腫瘍反応性Ｔリンパ球の生成に有利にするために、第２のフェーズii)は、Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する１又はそれより多い物質を添加することを含んでなってもよい。このような物質の例は、IL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質である。より具体的には、この物質は、IL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21レセプターのアゴニストであり得る。このようなアゴニストの例としては、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、アフィボディ、及びそれらのフラグメント、融合タンパク質、合成及び/又は有機分子(例えば、小分子)並びに天然リガンドが挙げられる。具体的実施形態では、この物質は、IL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21レセプターの天然リガンド(例えば、それぞれIL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21)である。
【００８０】
IL-12の効果は、IL-12Rを刺激し、そのことによりTh1リンパ球の活性化を促進することによってIFN-γ誘導性STAT経路を活性化することである。IL-21の機能は、Ｔリンパ球の増殖、活性化及びTh1タイプへの発達を増強することである。
IL-7及びIL-15は共に、Ｔリンパ球の恒常的拡大を促進し、活性化されTh1プログラムされたＴリンパ球の列挙(enumeration)を増強することにより働く。
【００８１】
Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する１又はそれより多い物質を添加するに最適な時点は、Ｔリンパ球が改変に対して感受性であるときである。Ｔリンパ球が改変に対して感受性でないときにこの物質が添加されると、そのような添加は効果を有さない。すなわち、Th1タイプＴリンパ球の発達に有利とならない。Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する物質(例えば、IL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質)を添加する最適な時点を決定するため、Ｔリンパ球によるINF-γの産生をモニターし得る。好ましい実施形態では、Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する１又はそれより多い物質(例えば、IL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質)は、IFN-γレベルが第２のフェーズii)の開始時のIFN-γレベルと比較して増加しているときに添加すべきである。
【００８２】
具体的実施形態では、IFN-γレベルの増加は、第２のフェーズii)の開始時のIFN-γレベルと比較して、IFN-γレベルの少なくとも１倍増加、例えば少なくとも２倍増加、少なくとも３倍増加、少なくとも４倍増加として決定され得る。しばしば、このような増加は、培養培地中のIFN-γ含量が少なくとも100ピコグラム/ml培養培地、例えば少なくとも150ピコグラム/ml培養培地、少なくとも200ピコグラム/ml培養培地又は少なくとも250ピコグラム/ml培養培地であるべきであることに相関させることができる。
【００８３】
Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する物質(例えば、IL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質)を添加する最適時点を決定する際、更に、CD4+Ｔリンパ球上での活性化マーカーCD25及びCD69(これらマーカーは優先的にアップレギュレートされるべきである)の発現を観察してもよい。アップレギュレーションにより、フェーズii)の１日目のＴリンパ球上でのCD25及びCD69の発現と比較して、少なくとも約40％〜約60％又はそれより多くのCD4+Ｔリンパ球が、CD25及びCD69を発現すべきであることが理解される。CD25及びCD69の発現は、Ｔリンパ球が活性化シグナルを受けたことを示している。
【００８４】
通常、Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する物質を添加する最適な時点は、Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質及びTh2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る物質を添加する工程の後になる。より具体的には、Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する物質を添加する最適時点は、第２のフェーズii)の開始後５日目〜８日目の間、例えば５日目、６日目、７日目又は８日目になる。
【００８５】
IL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21が添加される場合、培養培地におけるこれら物質の各々の濃度は、約150 IU/ml培養培地〜約300 IU/ml培養培地の範囲内、例えば250 IU/ml培養培地であるべきである。記載の具体的物質以外のものを使用する場合、それらは、言及した具体的範囲内でのIL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21の添加により得られる効果と同じ効果を導く最終濃度で、培養物に添加されるべきである。
【００８６】
上記のように、本方法は、優先的には、Th1タイプのCD4+腫瘍反応性Ｔリンパ球を達成するためのＴリンパ球の拡大に使用される。本発明の１つの更なる観点は、本明細書に記載した腫瘍反応性Ｔリンパ球の拡大法を使用することにより、比較的高量のメモリータイプのＴリンパ球を取得することである。ガンの治療において、治療されるべき患者が高量のエフェクター腫瘍反応性CD4+Ｔリンパ球を受容することは、当然のことながら重要である。なぜなら、これらは、上記のように、細胞傷害性Ｔリンパ球(Tc)、NK細胞、マクロファージ及び単球(これらは全てガン細胞を攻撃し、一般的には腫瘍に対して防御することができる)の活性化を促進するからである。
【００８７】
しかし、同時に相当量のメモリー腫瘍反応性CD4+Ｔリンパ球を投与することにより、患者は、腫瘍又は原発腫瘍の転移の再発に対する生涯にわたる保護までも達成する。
【００８８】
したがって、本発明は、メモリーＴリンパ球の作製方法に関する。通常、腫瘍反応性Ｔリンパ球の培養物が本発明に従って拡大される場合、約35％〜約90％、例えば約40％〜約90％、約50％〜約80％又は約60％〜約70％のメモリータイプの腫瘍反応性Ｔリンパ球が得られる。本発明者らは、フェーズｉ)のリンパ球が、腫瘍抗原の添加前に再生されるという事実は、比較的緩慢な拡大フェーズと併せて、メモリーリンパ球 対 エフェクターリンパ球の高い比の形成を導くと推測する。
【００８９】
上記のように、Ｔリンパ球上での細胞表面活性化マーカーCD25及びCD69の発現は、本方法の重要な工程を開始する時、例えば、第２のフェーズii)を開始する時を決定するために使用し得る。したがって、フェーズｉ)及びフェーズii)を通して、例えば２日毎、３日毎又は４日毎に、CD25及びCD69の発現を継続的にモニターすることは有益であり得る。
【００９０】
本方法の目的の１つは、多数の(患者への投与に使用し得る)特異的CD4+腫瘍反応性Ｔリンパ球を取得することであるので、腫瘍反応性Ｔリンパ球は、或る時点で採取され得、拡大工程の終結に至る。腫瘍反応性Ｔリンパ球を採取する最適時点は、Ｔリンパ球上でのCD25の発現がダウンレギュレートされた時である。ここで、ダウンレギュレーションは、CD4+Ｔリンパ球集団の５％又はそれ未満がCD25を発現することとして定義される。採取する最適時点はまた、産生されるIFN-γの量の測定に基づいて決定してもよい。IFN-γ産生は、最初のIFN-γ産生(通常、少なくとも100pg/ml培養培地のIFN-γレベルに相当する)と比較して、少なくとも２倍増加すべきであり、例えば少なくとも３倍、少なくとも４倍又は少なくとも５倍増加すべきである。
【００９１】
通常、この事象は、第２のフェーズii)の開始後10日目から14日目まで(14日目を含む)に生じる。すなわち、通常、細胞は、第２のフェーズii)の開始後10日目から14日目まで(14日目を含む)に採取される。
【００９２】
したがって、本発明に従う腫瘍反応性Ｔリンパ球の拡大のための全体プロセスは、一般に、約25日から約45日まで(45日を含む)、例えば約26日から約44日まで(44日を含む)、約27日から43日まで(43日を含む)、約27日から42日まで(42日を含む)、約27日から41日まで(41日を含む)、及び約27日から約40日まで(40日を含む)かかる。
【００９３】
CD25マーカーがダウンレギュレートされた時に腫瘍反応性Ｔリンパ球を採取することに代えて、腫瘍反応性Ｔリンパ球を１又はそれより多い回数の追加のフェーズii)に供してもよい。これは、発現法により取得される腫瘍反応性Ｔリンパ球の量がガンに罹患している患者に投与すべき有効量と考えられない場合、又は患者が化学療法治療レジメンにある場合(この場合、化学療法治療が終了するまでＴリンパ球の投与を延期することが有益と考えられ得る)に行うことが有益であり得る。腫瘍反応性Ｔリンパ球を１又はそれより多い回数の追加のフェーズii)に供すべきかどうかを決定するために、産生されるIFN-γのレベル及び/又は取得される腫瘍反応性Ｔリンパ球の総数及び/又はCD25の発現を観察し得る。IFN-γレベルが30pg/ml培養培地又はそれ未満、例えば20pg/ml培養培地又はそれ未満である場合、及び/又はＴ細胞の総数が不満足である場合、追加の回のフェーズii)は、Ｔ細胞の多数がCD25陰性であり(すなわち、Ｔリンパ球集団の５％未満がCD25を発現する)、そのことにより再刺激に感受性であるときに開始され得る。
【００９４】
採取の後、腫瘍反応性Ｔリンパ球は、任意の従来手段により、例えば密度勾配、例えばフィコール培地の使用により精製されてもよい。腫瘍反応性Ｔリンパ球の採取及び精製の後、一部の腫瘍反応性Ｔリンパ球を、適切な凍結培地中で凍結することにより保存してもよい。
【００９５】
治療方法
改良拡大法により取得された腫瘍反応性Ｔリンパ球は、散在性ガンを患っている患者を治療するために使用される。
【００９６】
投与すべき腫瘍反応性Ｔリンパ球の有効量の定義は、リンパ球の具体的タイプ、メモリーＴリンパ球 対 エフェクターＴリンパ球の比及び疾患の重篤度に依存する。しかし、平均で、最低限少なくとも10百万、例えば少なくとも20百万、少なくとも30百万、少なくとも40百万、少なくとも50百万、少なくとも60百万、少なくとも70百万又は少なくとも80百万の腫瘍反応性Ｔリンパ球が投与され得る。単回用量で投与すべき腫瘍反応性Ｔリンパ球の量に関して、上限は何ら特定されない。
【００９７】
好ましい実施形態では、投与用の腫瘍反応性Ｔリンパ球は、エフェクターＴリンパ球とメモリーＴリンパ球との組合せを含んでなる。より具体的には、メモリータイプの腫瘍反応性Ｔリンパ球の量は、約35％〜約90％、例えば約40％〜約90％、約50％〜約80％又は約60％〜約70％であり得、エフェクターＴリンパ球の割合は、約10％〜約65％、例えば約20％〜約50％又は約30％〜約40％であり得る。
【００９８】
腫瘍反応性Ｔリンパ球は、患者への非経口投与、例えば、静脈内、動脈内、鞘内又は腹腔内投与に適切な医薬組成物として製剤化され得る。
【００９９】
腫瘍反応性Ｔリンパ球が非経口投与される場合、それらは、等張性媒体中で、すなわち血液と同じ張度を有し、細胞の凝集を防ぐ１又はそれより多い物質を含んでなる媒体中で製剤化されてもよい。適切な媒体の具体例は、３％までのヒト血清アルブミン(例えば２％までのヒト血清アルブミン又は１％までのヒト血清アルブミン)を含んでなる0.9％NaCl溶液である。静脈内投与のためには、投与すべき組成物中の腫瘍反応性Ｔリンパ球の濃度は、通常、約0.5百万リンパ球/ml媒体から約４百万リンパ球/ml媒体までの範囲、例えば、約0.5百万リンパ球/ml媒体から約３百万リンパ球/ml媒体までの範囲、約0.5百万リンパ球/ml媒体から約２百万リンパ球/ml媒体までの範囲又は約１百万リンパ球/ml媒体から約２百万リンパ球/ml媒体までの範囲にある。
【０１００】
腫瘍反応性Ｔリンパ球を含んでなる組成物は、単回用量又は多回用量として投与されてもよい。これは、１〜２時間にわたって注入されてもよい。
治療方法は、疾患の重篤度に依存して、１回行なわれてもよいし繰り返し行われてもよい。更に、治療は、疾患の再発に際して繰り返されてもよい。
【０１０１】
本発明に従う治療は、散在性ガンのための任意の他の関連治療で補充してもよい。そのような補充治療は、リンパ球の投与前、投与と同時又は投与後に行い得、その治療について通常使用される頻度で行われ得る。補充治療の適切な例は、化学療法などである。
【０１０２】
キット
本発明は更に、本発明に従う方法で使用するためのキットに関し、このキットは、Ｔリンパ球の培養用培地を含んでなる。この培地は、任意の適切な無血清培地、例えばAIMV、RPMI 1640、DMEM又はMEMであり得る。
【０１０３】
キットは更に、腫瘍反応性Ｔリンパ球の刺激、活性化及び方向付けのための１又はそれより多い物質を含んでなり得る。このような物質の例は、腫瘍由来抗原、IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質、Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質、Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る物質及び/又はTh1タイプＴリンパ球の発達を促進する物質であり得る。
【０１０４】
より具体的には、そのような物質は、IL-2、インターフェロン-α、抗IL-4抗体、抗IL-5抗体、抗IL-10抗体、IL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21であり得る。
キットはまた、静脈内投与に適切な医薬組成物を含んでなり得る。医薬組成物は、投与前に腫瘍反応性Ｔリンパ球の集団と混合されてもよい。
【０１０５】
キットはまた、１又はそれより多いシリンジとリンパ節探知体とを含んでなり得る。１つの実施形態では、シリンジにはリンパ節探知体が予め充填されている。
キットはまた、使用のための指示書(例えばコンピュータソフトウェアの形態の指示書)を含んでなり得る。
【０１０６】
図面の説明
図１は、鼠径部リンパ節転移に対して遠位で内側のメチネル節を示すリンパシンチグラフィーである。
図２は、頸部リンパ節転移に対して遠位で内側のメチネル節を示すリンパシンチグラフィーである。
【０１０７】
図３は、腫瘍を排液するリンパ節の同定を説明する。図3Aは、青色素が腫瘍の周りに注射される方法及び当該色素がどのように毛細リンパ管内を輸送されてリンパ排液(白矢印で示す)を示すのかを示す。図3Bは、腫瘍排液リンパ節がどのようにして該色素注射の数分後に青色になるかを示す。白色矢印が腫瘍排液リンパ節を示す。
【０１０８】
図４は、初めに、センチネル節リンパ球が腫瘍抗原と低用量のIL-2とで活性化され、その結果として活性化及び活性化マーカーCD25の発現を生じることを示す(上パネル)。フェーズＩ活性化フェーズの終わりは、CD25を発現するCD4+Ｔ細胞の数の減少により定義される(下パネル)。５％未満のCD4+Ｔ細胞がCD25を発現したときに、フェーズIIが抗原での再刺激により開始される。
【０１０９】
図５は、フェーズＩ及びフェーズIIの活性化により、CD4+Ｔヘルパー細胞の拡大及び富化が生じることを説明する。
図６は、フェーズＩにおいて、細胞の多数がナイーブCD62L+細胞又は活性化CD69+CD62L+細胞であることを説明する。フェーズII後、細胞の多数はCD62L-であり、メモリー及びエフェクターCD4+Ｔヘルパー細胞から構成される。CD62L-Ｔ細胞は、好ましいリンパ節ホーミング分子を発現しておらず、よってそれらは、非リンパ系器官の炎症領域を探し求める。
【０１１０】
図７は、フェーズＩで刺激された、腫瘍(腫瘍浸潤性リンパ球)、センチネル節(SN)及び無関係のリンパ節(LN)に由来する初代細胞は、IFN-γ産生をほとんど生じないことを示す。
図８は、フェーズii)後の拡大後、抗原依存性IFN-γ産生の用量依存的な増加が存在することを説明する。
図９は、TCR Vβ発現の選択的富化により研究されたように、拡大及び活性化プロトコールが抗原特異的Ｔ細胞クローンの拡大を促進することを説明する。
【実施例】
【０１１１】
以下の実施例は、本発明を説明することを意図し、如何なる様式でも本発明を制限するものではない。
実施例
実施例１
転移のメチネルリンパ節の同定
８人の患者(女性４人及び男性４人)が本研究に参加した(表１を参照)；平均年齢は61.4歳であった。このうち１人は２回の手術を受け、両方の処置でメチネル節が位置決めされた。メチネル節は、３つの原理的に異なる方法で位置決めされた。リンパ節探知体を、腹部の再発部、実質性肝臓転移、又は鼠径部リンパ節転移の周囲近傍に注射した。
【０１１２】
【表１】
【０１１３】
１人目の患者は、以前に盲腸ガンのために右側結腸半切除の手術を受けた48歳男性であった。１年後、彼は、腸間膜脂肪で吻合領域に沿って５cm大の腹腔内再発を発症した。吻合領域及び再発部の切除を一括して行った。転移の周りにパテントブルー色素を注射し、内側結腸動脈に沿って３つのメチネル節(腸間膜の根元の上リンパ節を含む)を同定した。
【０１１４】
２人目の患者は、直腸ガンのために腹会陰式直腸切断術の手術を受けた54歳男性であった。手術前の検査では遠位転移はなかったにもかかわらず、本発明者らは、肝臓左葉に肝臓転移を見出した。腹部CTスキャンを手術後に行った。転移は、外径３cmであり、肝臓の第２区域と第３区域との間に位置していた。２ヵ月後、彼は、部分的な左側肝臓切除の手術を受けた。パテントブルー色素を肝臓実質部で転移の周囲近傍に注射した。約５分後、肝十二指腸間膜に２つのメチネル節を見出した。手術中の超音波検査では、肝臓内に更なる転移は証明できなかった。メチネル節には腫瘍細胞は存在しなかった；しかし、メチネル節中のリンパ球は、転移に対して特異的な活性を示した。
【０１１５】
腫瘍反応性リンパ球での最初の治療及び良好な全身状態にもかかわらず、彼は肝臓右葉に新たな肝臓転移を発症し、２回目の肝臓切除を行った。この手術で、２cm大の転移の周囲へパテントブルー色素を注射することにより、肝臓の門に位置する２つのメチネル節を同定した。
【０１１６】
３人目の患者は、２年前にＳ状結腸ガンのためにＳ状結腸切除の手術を受けた77歳女性であった。フォローアップで、CEAの亢進が見出され、PETスキャン及びCTスキャンによる更なる検査により、肝臓右葉でVI区域とVII区域との間に４cmの転移が示された。部分的右側肝切除を行い、パテントブルー色素の注射後、３つのメチネル節を肝臓の門に見出した。
【０１１７】
患者番号４は、Ｓ状結腸の腫瘍のためにＳ状結腸切除の手術を受けた73歳男性であった。１年以上後に、彼は、２cm大の孤立性肝臓転移を発症し、Ｖ区域及びVI区域の部分的切除の手術を受けた。転移の周囲近傍の４つの異なる位置での計1.0mlのパテントブルー色素の注射後、肝臓門に１つのメチネル節を同定した。この節の分析により、転移性疾患の徴候はないが、腫瘍反応性リンパ球を含有していることが判った。
【０１１８】
患者番号５は、以前に上行結腸のガンのために右側結腸半切除の手術を受けた66歳男性であった。結腸ガン手術後のルーチンのフォローアップでのCTスキャンにより、肝臓右葉でVII区域に2.5cmの孤立性転移が示された。手術時に、1.0mlのパテントブルー色素を肝臓組織中の転移の周囲に注射した。肝十二指腸間膜に２つ及び肝臓門に２つのメチネル節が位置していた。VI区域〜VIII区域の切除を、メチネル節の摘出と共に行った。
【０１１９】
第６の症例は、６年前に卵巣ガンのために子宮摘出及び両側卵管卵巣摘出の手術を受けた51歳女性であった。その後、ガンは腹部及び腹膜に広がり、待期療法のみが続けられた。彼女は、大きな部分的壊死性の肝臓転移を有していた。手術時に、肝臓転移の隣接部へのパテントブルー色素の注射後、腹部中央に３つのメチネル節を同定した。メチネル節は全て腫瘍細胞及び腫瘍反応性リンパ球を含有していた。
【０１２０】
患者番号７は、卵巣ガンのために、両側卵巣摘出の手術を受けた63歳女性であった。手術時、彼女は、網への散在性ガン疾患を有しており、この後、数回の腫瘍削減手術(転移に起因する右結腸の切除を含む)を受けた。更に１年後、彼女は、左鼠径部に発症し、細針生検により、卵巣ガンからの転移と判明した。トレーサーたるテクネチウム-99を皮下に触知可能な転移の周りの４箇所で注射後(４×0.25ml，50MBeq/ml)、驚くべきことに、リンパシンチグラフィーにより、鼠径部リンパ節転移に対して遠位で内側に共に接近した２つのメチネル節が証明された(図１を参照)。この節は、更に、リンパシンチグラフィーの数時間後の外科的手順の間にトレーサーと同じ場所にパテントブルー色素を注射することにより、青色に着色した転移を排液するメチネル節と同定された。
【０１２１】
８人目の患者は、膵臓ガンのためにホウィップル手術を受けた59歳女性であった。２年後、局所的な再発が診断され、彼女は、腫瘍削減手術を受けた。手術中、当該局所再発の隣接部でかつ上部にパテントブルー色素を注射後、４つのメチネル節を見出した。
【０１２２】
サイトケラチン抗体を使用して、悪性細胞を検出した。転移を有しない節中のリンパ球は、増殖アッセイにおいて、腫瘍ホモジネートによる刺激に際してインターフェロン-γを分泌する能力により示されるように、自発的に活性化された。転移性メチネル節からのリンパ球は、最初、この刺激に対して乏しい反応を示した。このことは、これらが転移により免疫抑制されたことを示唆する。しかし、非転移性節及び転移性節からの細胞は共に、実施例２に記載のように、インビトロで多数に拡大させることができた。
【０１２３】
実施例２
腫瘍反応性Ｔリンパ球の拡大
本明細書に記載の方法を用いてメチネル節の同定を行った。
メチネルリンパ節及び非メチネルリンパ節を半分に切断し、節の一部を、ルーチンの手順に従う組織学的検査に送った。転移の一部(侵襲マージン(invasive margin)のサンプルを含む)を取り出して、更なる手順の間の抗原供給源として使用した。
【０１２４】
細胞培養
フェーズＩ、最初の活性化
メチネル節材料を氷上に維持し、毎回直ぐにAIM V(登録商標)培地(Invitrogen)を用いて処理した。ルーズフィットのガラスホモジネーター中での穏やかなホモジネーションによりメチネル節リンパ球の単一細胞懸濁物を取得し、ホモジネーション後、細胞を培地中で２回洗浄した。メチネル節リンパ球を４百万細胞/mlで細胞培養フラスコに入れ、インターロイキン-２(IL-2)(Proleukin(登録商標)、Chiron)を240 IU/ml培地の濃度まで添加した。
【０１２５】
５容量(w/v)の２×PBS中でのUltra Turraxを用いたホモジネーション、続いて97℃で５分間の変性により、自己由来転移抽出物を調製した。細胞培養の開始３〜４日後、自己由来腫瘍抽出物を1/100の濃度で添加した。長期培養には、細胞を細胞インキュベーター中で37℃で５％CO2に維持し、240 IU IL-2/mL培地を３〜４日毎に添加した。
【０１２６】
フェーズII、活性化及び拡大
18〜22日後、細胞培養物をCD25の発現に関してモニターした。CD25発現細胞の数が５％を下回って減少したとき、フェーズII(図４)において、濃度１/100の自己由来転移抽出物の添加により細胞を再刺激した。効率的な抗原提示のためには、自己由来PBMCを、Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences、GE Healthcare)を使用して集め、2500ラドで照射し、細胞培養物に添加した。再刺激の３日後、インターフェロン-α(Introna)を濃度100〜500 IU/mlで、抗IL-4抗体を２μg/mlの濃度で添加した。５〜８日後、IFN-γ産生Th1細胞の誘導を促進するために、IL-12(４ng/ml)を添加して拡大させた。
【０１２７】
患者への輸注(transfusion)の前日に、培養物中の生存細胞を取り出すために、細胞培養物を、Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences、GE Healthcare)を使用する精製に付した。輸注当日、細胞を生理食塩水溶液(Natriumklorid Baxter Viaflo 9 mg/ml、Baxter)中で２回洗浄し、次いで100〜200mlの生理食塩水溶液及び１％ヒト血清アルブミン(Baxter)を含有する輸送バッグに移した。輸注の前に、微生物の存在についての検査を行った。細胞の注入(infusion)は、医学専門家の監督の下で１〜２時間の間行った。
【０１２８】
免疫学的評価
トリチウム標識チミジン取込み増殖アッセイを用いて更なる免疫学的評価を行った。メチネル節リンパ球のアリコートをこの目的に取り置き、ルーズフィットガラスホモジネーターにおける穏やかな押付けにより非メチネル節リンパ球の単一細胞懸濁物を取得し、Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences、GE Healthcare)により末梢血白血球を精製した。
【０１２９】
細胞を再懸濁し、2.5％ウシ胎仔血清(FCS)(Life technologies)を含有するRPMI 1640(Life technologies)中で２回洗浄した。最後に、細胞を、10％ヒトAB血清(Sigma)、１％ペニシリン-ストレプトマイシン(Sigma)及び１％グルタミン(Sigma)を含有するRPMI 1640増殖培地中に再懸濁した。リンパ節細胞及び精製したPBLを96-ウェルプレート中３×105細胞/ウェルで使用し、３連で(in triplicates)１/100、１/10に希釈した転移ホモジネート又はCon A 10μg/ml(Sigma)で刺激した。５日目、６日目及び７日目に、採取の18時間前に、１μCiの3H-チミジン/ウェル(Amersham)を添加することにより増殖を測定した。サンプルをシンチレーションカウンティングに付した。
【０１３０】
細胞培養の開始時、IFN-γ分泌測定のためのリンパ節細胞及びPBLの刺激を、１/10及び１/100に希釈した腫瘍ホモジネート又はCon A 10μg/ml(Sigma)を用い、96-ウェルプレート中３×105細胞/ウェルで３連で行った。プールした３連のサンプル中の培養上清について、分泌IFN-γの量をELISA(Human IFN-γ Duoset、R&D Systems)で測定した(図７)。細胞培養の終わりに、上清のサンプルを取出し、３連でIFN-γ及びIL-4分泌をELISA(human IFN-γ Duoset及びhuman IL-4 Duoset、R&D Systems)で測定した(図8A及び8B)。
【０１３１】
フローサイトメトリー分析
初めにメチネル節、非メチネル節、PBMCからの細胞及び転移からの細胞について、フローサイトメトリーを使用して細胞の特徴づけを行った。培養中のメチネル節で獲得したリンパ球から、フローサイトメトリー分析のために、サンプルを２〜３週間毎に採取した。細胞を、２％FCS及び0.05％NaN3を補充したPBS(FACS緩衝液)中で、免疫細胞亜集団のマーカー及びリンパ球活性化のマーカーに対する抗体と共に30分間インキュベートした(図５、６及び７)。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)に接合した、以下のマーカーに対する抗体：CD69、HLA-DR、CD45RA、CD25；フィコエリトリン(PE)に接合した、以下のマーカーに対する抗体：CD62L、CD19、CD45RO、CD56；ペリニジン-クロロフィル-タンパク質(PerCP)に接合した、以下のマーカーに対する抗体：CD8、CD3；アロフィコシアニン(APC)に接合した、以下のマーカーに対する抗体：CD4、CD14、CD8を使用した。
【０１３２】
Beta mark kit(Beckman Coulter)を使用してVβ-レパートリーを検査し、５×105細胞/試験管を、FITCとPEと二色FITC-PE接合TCR Vβ抗体との混合物を含む10μlの８つの異なるバイアル中で、各試験管にCD8 PerCP及びCD4 APCを添加して染色した(図９)。
【０１３３】
実施例３
拡大した転移反応性Ｔリンパ球を投与することによる転移の治療
以下の３つの症例は、メチネルリンパ節から得られ拡大されたＴリンパ球を散在性ガンの治療に使用し得ることを説明するためのものである。
【０１３４】
47歳男性は、以前に、盲腸における結腸ガンのために右側結腸半切除の手術を受けた。１年後、彼は、吻合領域の外側の腸間膜脂肪に５cm大の腹腔内再発を発症した。手術の間に、転移の周囲の脂肪に近接してパテントブルー色素を注射し、内側結腸動脈に沿って３つのメチネル節(腸間膜の根元の１つの上リンパ節を含む)を同定した。吻合領域及び再発の切除を一括して行った。手術後、メチネル節及び転移の侵襲部分を切り分け、本明細書に記載のように処理した。転移反応性リンパ球を多数に拡大した。手術の約４週間後、これら自己由来CD4+Ｔ細胞を患者に輸注した。通常の胸部及び腹部CTスキャンの施行により転移の徴候は見出せず、CEAレベル(腫瘍マーカー)が正常であったため、彼は完全な健康状態であった。今まで、輸注後フォローアップは36ヶ月である。
【０１３５】
63歳女性は、卵巣ガンのために両側卵巣摘出の手術を受けた。手術時に、彼女は、網への散在性ガン疾患を有しており、数回の腫瘍削減手術(転移に起因する右結腸の切除を含む)を受けた。１年後、彼女は、左鼠径部に発症し、細針生検により、卵巣ガンからの転移と判明した。リンパシンチグラフィーにより、鼠径部リンパ節転移に対して遠位で内側に共に接近した２つのメチネル節が証明された(図１を参照)。この節は、パテントブルー色素との組合せでのテクネチウム-99m及びγ線検出管の使用により、位置決めされた。節及び転移は上記と同じ原理に従って処理された。治療の７ヵ月後、患者は健康でフルタイムで働いている。腫瘍マーカーCA135は、多数から少数に減少している。
【０１３６】
第３の例は54歳男性であり、下部直腸ガンのために腹会陰式直腸切断術の手術を受けていた。手術時、(手術前の陰性肝臓スキャンにもかかわらず)左葉の肝臓転移を同定した。更に６週間後、彼は、左側肝臓切除の手術を受けた。パテントブルー色素を肝臓実質部で転移の周囲に注射した。数分後、肝十二指腸間膜で、２つのメチネル節が青色に変わった。メチネル節で転移は検出されなかったが、それらは全て腫瘍に対する活性を示した。患者は、該メチネル節に由来する拡大された腫瘍反応性リンパ球で治療された。腫瘍反応性リンパ球での最初の治療及び良好な全身状態にもかかわらず、彼は肝臓右葉に新たな肝臓転移を発症した。２回目の肝臓切除を行った。この手術で、２cm大の転移の周囲へのパテントブルー色素の注射により、肝臓の門に位置する２つのメチネル節が同定された。彼は、新たなメチネル節に由来する腫瘍反応性リンパ球の輸注で再度治療された。患者は完全に回復し、フルタイムで働いている。CT画像によれば、彼は、肝臓に幾つかの残存疾患を有し、腫瘍マーカー(CEA)が少し亢進している。最初のリンパ球輸注以来の合計のフォローアップは36ヶ月である。
【０１３７】
参考文献
Marits Pら．Detection of immune responses against urinary bladder cancer in sentinel lymph nodes. Eur Urol 採用
Moore KL．Clinically oriented anatomy. Baltimore: Williams and Wilkins. 1985. p42-p45.
Renkins EM．Some consequences of capillary permaebility to macromolecules: Starling's hypothesis reconsidered. Am J Physiology. 1986;250:H706-H710.
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】鼠径部リンパ節転移に対して遠位で内側のメチネル節を示すリンパシンチグラフィーである。
【図２】頸部リンパ節転移に対して遠位で内側のメチネル節を示すリンパシンチグラフィーである。
【図３Ａ】青色素が腫瘍の周りに注射される方法及び当該色素がどのように毛細リンパ管内を輸送されてリンパ排液(白矢印で示す)を示すのかを示す。
【図３Ｂ】腫瘍排液リンパ節がどのようにして該色素注射の数分後に青色になるかを示す。
【図４】初めに、センチネル節リンパ球が腫瘍抗原と低用量のIL-2とで活性化され、その結果として活性化及び活性化マーカーCD25の発現を生じることを示す(上パネル)。フェーズＩ活性化フェーズの終わりは、CD25を発現するCD4+Ｔ細胞の数の減少により定義される(下パネル)。
【図５】フェーズＩ及びフェーズIIの活性化により、CD4+Ｔヘルパー細胞の拡大及び富化が生じることを説明する。
【図６】フェーズＩにおいて、細胞の多数がナイーブCD62L+細胞又は活性化CD69+CD62L+細胞であることを説明する。
【図７】フェーズＩで刺激された、腫瘍(腫瘍浸潤性リンパ球)、センチネル節(SN)及び無関係のリンパ節(LN)に由来する初代細胞は、IFN-γ産生をほとんど生じないことを示す。
【図８】フェーズii)後の拡大後、抗原依存性IFN-γ産生の用量依存的な増加が存在することを説明する。
【図９】TCR Vβ発現の選択的富化により研究されたように、拡大及び活性化プロトコールが抗原特異的Ｔ細胞クローンの拡大を促進することを説明する。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、転移を排液する(draining)１又はそれより多いメチネルリンパ節から得られる、拡大された(expanded)腫瘍反応性CD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球を投与することによる、散在性ガンに罹患している患者を治療するための免疫療法上の方法に関する。ここで、前記Ｔリンパ球はCD4+CD25+Hiリンパ球ではない。すなわち、本発明は調節性Ｔリンパ球を対象としない。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
リンパ系は、間質液を起源とする無色の水状液であるリンパを運搬する脈管のネットワークである。この脈管は、リンパ液の逆流を防止しつつ、身体組織中の間質腔から離れるように過剰の液を輸送し、血流に戻す。リンパ系脈管(lymphatic vessel)の主要な３つのタイプは、毛細リンパ管(lymph capillary)、リンパ管(lymphatic)及びリンパ本管(lymph duct)である。毛細リンパ管は結合して、リンパ管又はリンパ静脈(lymph vein)と呼ばれるより大きな脈管を形成する。これらは血液を導く静脈に似ているが、より薄い壁及び比較的大きな管腔を有し、より多くの弁を有している。皮膚では、リンパ管は皮下組織に位置し、静脈と同じ経路を辿る。内蔵では、リンパ管は一般的には動脈と同行し、その周りに叢を形成する(ネットワーク)。或る場所で、リンパ管はリンパ節に入る。これらは、リンパ系組織からなる小さな特化した器官である。リンパは、静脈循環に入る前に、少なくとも１つのリンパ節で濾過される(Moore)。リンパ節は、例えば細菌及びウイルスを集めて破壊するリンパ球で満たされた内部ハニカム状の結合組織を有するフィルターとして作用する。節では、リンパは血液循環と接しており、液が遠心性のリンパ系脈管を経て節を出て行く前に液の約半分が血液中に排出される(Renkin)。上皮腫瘍からの悪性細胞の実質的に全ての拡散が、リンパ節中のリンパ-静脈結合を介して全身血液循環に入る前に、最初に、(白血球も使用する能動的機序により)薄い有窓リンパ脈管(lymph vessel)を通じて起こるというのは、益々受け入れられている考えである。リンパ節のクラスターは、腋窩、鼠径部、頸部、胸部及び腹部に見出される。
【０００３】
原発腫瘍又は原発腫瘍領域は、１又はそれより多い所謂センチネルリンパ節に排液する(drain)。ここで、センチネル節は、腫瘍からのリンパ排液(lymphatic drainage)を受ける最初のリンパ節として定義され、また「センチネル節概念」としても知られている。これは、転移の最初の部位でもあり、幾つかの充実性腫瘍タイプでは、センチネル節に腫瘍細胞がない場合にはリンパ節転移の危険はほとんど無視できることが示されている。センチネル節は、手術の間に、腫瘍の周りへのトレーサー物質又は色素物質の注射により同定することができる。これら物質は、毛細リンパ管内を輸送され、センチネル節でマクロファージによるファゴサイトーシスを通じて蓄積するので、腫瘍排液リンパ節を同定する。本発明者らは、原発腫瘍を排液するセンチネルリンパ節が、リンパ節で腫瘍抗原に対して感作されインビボ拡大(expansion)を受けているＴリンパ球を相当量含有し得るので、インビトロ拡大用の天然の腫瘍反応性Ｔリンパ球の豊富な供給源である可能性を最近示した(Maritsら，原稿；Karlssonら，Eur J Urol, 採用)。
【０００４】
しかし、今日まで、特定の個々のリンパ節が関与する逐次リンパ排液(sequential lymph drainage)が転移にも当てはまること、すなわち、転移について、転移領域を排液する１又はそれより多いリンパ節が検出可能であることは知られていなかった。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の開示
原発腫瘍の転移は、原発腫瘍の拡散に起因するガンとして定義される。転移は、ガン細胞が獲得する２つの別個の能力−増大した自動運動性及び侵襲性に依存する。転移する細胞は、基本的に、元の腫瘍中の細胞と同じ種類である。ガンが例えば結腸で発生し、例えば肝臓に転移する場合、肝臓中のガン細胞は結腸ガン細胞である。しかし、その細胞は、増大した自動運動性及び別の器官を侵襲する能力を獲得している。
【０００６】
理論的には、原発腫瘍は、腫瘍が発現する器官又は組織に存在する細胞を起源とする。そのような器官又は組織中の細胞は、既に、既存のリンパ排液系に接続しているので、リンパは、既存のリンパ脈管を通じて原発腫瘍から排液される。今日まで、原発腫瘍の「センチネル節概念」が転移にも当てはまること、すなわち転移からの排液を受ける最初の１又はそれより多いリンパ節が転移について同定可能であることは誰も示していなかった。転移がリンパ管形成を誘導することは示されていないし、更に転移がリンパ系への接続を開くことは自明ではなかった。
【０００７】
本発明者らは、例えばリンパ節又は例えば肝臓のような器官若しくは例えば腸間膜脂肪組織のような組織における転移が、リンパ系への接続及びリンパ節への排液を開くこと、及び１又はそれより多い所謂「メチネル」リンパ節、すなわち転移からのリンパ排液を受ける最初のリンパ節が同定可能であることを見出した。
【０００８】
理論的には、転移からの腫瘍細胞の拡散は、腫瘍がトリガーする血管形成活性により形成される血管を介して起こり得る。リンパ系は胚発生以来むしろよく保存され、血管系とは独立して発達すると考えられている。したがって、本発明者らは、種々の充実性原発腫瘍についてリンパ排液をマッピングするために開発された技法と同様な技法を用いて、充実性上皮腫瘍からの転移を研究できることを見出せるとは予測できなかった。皮下組織、リンパ系組織、腹部内及び内部器官に位置する異なるタイプの転移からのリンパ排液を研究する間に、本発明者らは転移排液リンパ節(メチネル節)を同定した。メチネル節は個別に位置し、メチネル節(すなわち、転移からのリンパ排液を受ける最初の節)が、転移から解剖学的最短距離の節でないこともしばしばある
【０００９】
本発明者らによるこのようなメチネルリンパ節の更なる分析により、メチネルリンパ節が、対応する転移中の腫瘍細胞に対して特異活性を有するＴリンパ球を含有することが示された。本発明者らは更に、メチネルリンパ節から得られたＴリンパ球が拡大可能であり、散在性ガン疾患の治療に使用可能であることを示した。
【００１０】
したがって、本発明は、散在性ガンに罹患している患者の治療法に関し、該方法は、
ｉ)患者において、１又はそれより多いメチネルリンパ節を同定し、
ii)該１又はそれより多い節と、任意に転移の全て又は一部とを切除し、
iii)該リンパ節から転移反応性Ｔリンパ球を単離し、
iv)該転移反応性Ｔリンパ球をインビトロ拡大し、
ｖ)そうして得られたＴリンパ球を患者に投与する
ことを含んでなり、前記Ｔリンパ球はCD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球であり、CD4+CD25+Hiリンパ球ではない。すなわち、本発明は調節性Ｔリンパ球を対象としない。
【００１１】
本発明の方法の工程を更に詳述する前に、以下の用語を定義する：
用語「腫瘍反応性Ｔリンパ球」は、腫瘍抗原に特異的でありこれを認識するＴ細胞レセプター(TCR)を有するＴリンパ球を意味すると意図される。ここで、用語 腫瘍反応性Ｔリンパ球はまた、転移抗原に特異的でありこれを認識するTCRを有するＴリンパ球も含むと意図される。すなわち、用語 腫瘍反応性Ｔリンパ球 及び 転移反応性Ｔリンパ球は、互換可能に使用される。
【００１２】
用語「Ｔヘルパー細胞」は、活性化されると適応性の免疫応答を促進するＴリンパ球を意味すると意図される。
用語「Th1細胞」は、IFN-γのようなサイトカインを使用して活性化されると、細胞媒介性免疫応答を促進するＴヘルパー細胞を意味すると意図される。
用語「Th2細胞」は、IL-4のようなサイトカインを使用して活性化されると、体液性免疫応答を促進するＴヘルパー細胞を意味すると意図される。
【００１３】
用語「CD4+ヘルパーＴリンパ球」は、CD4を発現するが転写因子FoxP3を発現しないＴリンパ球を意味すると意図される。
用語「CD8+Ｔリンパ球」は、CD8を発現するＴリンパ球を意味すると意図される。
用語「調節性Ｔリンパ球」は、転写因子FoxP3を発現し、適応性免疫応答を抑制するＴリンパ球を意味すると意図される。
【００１４】
用語 Ｔリンパ球の「特異的活性化」は、抗原特異的でMHC拘束性のＴ細胞レセプター媒介性活性化を意味すると意図される。これに対し、用語 Ｔリンパ球の「非特異的活性化」は、Ｔ細胞レセプターの特異性にかかわらず、全てのＴ細胞の全般的な活性化を意味すると意図される。
【００１５】
用語「腫瘍由来抗原」は、腫瘍細胞、腫瘍のホモジネート(これは変性されていてもよい)、又は例えば精製、天然、合成及び/若しくは組換えのタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドの形態の、腫瘍タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドを含むと意図される。用語 腫瘍は、本明細書中で、原発腫瘍の転移をも包含すると意図されていることに留意すべきである。腫瘍由来抗原は、インタクトな分子、そのフラグメント又はインタクトな分子及び/若しくはフラグメントの多量体若しくは凝集体であり得る。適切なポリペプチド及びペプチドの例は、約５〜約30アミノ酸、例えば約10〜25アミノ酸、約10〜20アミノ酸又は約12〜18アミノ酸を含んでなるポリペプチド及びペプチドである。ペプチドが使用される場合、培養中で約0.1〜約5.0μM、例えば約0.1〜約4.0μM、約0.2〜約3.0μM、約0.3〜約2.0μM又は約0.3〜約1.0μMの最終モル濃度が使用され得る。腫瘍由来抗原は自己由来であっても異種であってもよい。すなわち、腫瘍由来抗原は、治療すべき患者から生じていてもよいし、ガンに罹患している別の対象から取得してもよい。本明細書の実施例では、本発明者らは、自己由来の変性腫瘍抽出物を使用するが、上記のように、腫瘍由来抗原の他の供給源もまた、本発明による方法において使用可能であり得る。
【００１６】
用語「第１フェーズの１日目」又は例えば「第２フェーズの５日目」は、以下のように理解すべきである：リンパ球を採集した日を０日目と呼ぶ。第１のフェーズの１日目は、IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する少なくとも１つの物質と、おそらくは培養培地及び/又は腫瘍由来抗原との添加により拡大が開始された日として定義される。拡大フェーズｉ)は、０日目に開始されてもよいし、リンパ球の採集の２日後までに開始されてもよい。第２のフェーズが腫瘍由来抗原の添加により開始される日は、本明細書を通して、「第２フェーズの１日目」と記述される。
【００１７】
用語「センチネルリンパ節」は、腫瘍からのリンパ排液を受ける最初のリンパ節を意味すると意図される。原発腫瘍又は原発腫瘍領域は、１又はそれより多い所謂センチネルリンパ節に排液する。センチネル節はまた、転移の最初の部位でもあり、幾つかの充実性腫瘍タイプでは、センチネル節に腫瘍細胞がない場合にはリンパ節転移の危険はほとんど無視できることが示されている。用語「メチネル(metinel)リンパ節」とは、転移又は転移領域からのリンパ排液を受ける最初のリンパ節をいう。
【００１８】
本方法の第１工程は、転移を排液する１又はそれより多いメチネルリンパ節の同定である。上記のように、メチネルリンパ節の位置決めは、必ずしも容易な課題ではない。なぜならば、転移からの排液を受ける最初のものが、解剖学的最短距離のリンパ節でないこともしばしばあるからである。しかし、本発明者らは、メチネル節が、転移からリンパ系を更に下行したリンパ節又は無関係のリンパ節(ここでは、腫瘍反応性Ｔリンパ球の含量は実質的に０である)より高い量の腫瘍反応性Ｔリンパ球を含有することを見出したので、１又はそれより多いメチネル節を同定する工程ｉ)は、本発明による方法に関して非常に重要である。
【００１９】
メチネルリンパ節を同定する１つの方法は、患者に１又はそれより多いリンパ節探知体(すなわち、リンパ節を位置決めするに適切な任意の物質)を注射することによる。このような探知体は、好ましくは、医薬的に受容可能であり及び/又は生体適合性である。探知体は、親和性ベースであるか又は非親和性ベースであるかのいずれかであり得る。親和性ベースのリンパ節探知体の例は、抗体(全体又はフラグメント)、ナノボディ(nanobody)、核酸(例えば、RNA、DNA)及びPNAである(これらは全て、次いで、種々の検出様式を用いて標識することができる)。親和性ベースのリンパ節探知体の検出は、トレーサー及び色素(例えば、下記のもの)で標識することにより行うことができる。次いで、可視化は、ｉ)造影物質(contrast generating substance)(例えば、ヨウ素含有物質)又は放射性物質(例えば、テクネチウム-99m)での標識後のＸ線、コンピュータ断層撮影法、シンチグラフィー、陽電子放射技法のような放射線学的方法、ii)磁性又は常磁性物質(例えば、ガドリニウム、磁性デンドリマー(magnetodendromers)又は酸化鉄含有粒子)での標識後の磁気共鳴画像化；iii)裸眼又は光子検出デバイス(例えば、CCD又はCMOSセンサ)による検出用の色素、蛍光色素又は発光色素での標識によりIR-可視-UVスペクトルの光によってなされる。
【００２０】
非親和性ベースのリンパ節探知体の例には、トレーサー及び色素が包含される。これら物質は、毛細リンパ管内を輸送され、センチネル節又はメチネル節でマクロファージによるファゴサイトーシスを通じて蓄積するので、腫瘍又は転移を排液するリンパ節を同定する。
【００２１】
トレーサーの例は、光子感受性フィルム又はセンサ(例えばPET検出器)を用いる放射性崩壊ベースの検出用の放射性物質、例えばテクネチウム-99である。更に、磁性、常磁性又は超常磁性物質については、例えば、磁気共鳴ベースの検出用のガドリニウム含有造影剤、酸化鉄粒子、磁性酸化物粒子、磁性デンドリマーを、放射線学ベースの検出(例えば、コンピュータ断層撮影法又は通常のＸ線)用の造影剤、例えばヨウ素を使用し得る。
【００２２】
色素の例には、例えば、発光光、近赤外光、蛍光、UV光及び可視光による可視化には、アゾ色素、ビスアゾ色素、トリアゾ色素、ジアリールメタン色素、トリアリールメタン色素、アントラキノン(anthrachino)色素、多環式芳香族カルボニル色素、インディゴ色素が包含される。更に、色素については、発光ベースの検出用の発光物質及び蛍光ベースの検出用の蛍光物質、例えばピコグリーン(pico green)、サイバーグリーン(sybr green)、レッド０オイル(red O oil)、テキサスレッドもまた包含される。検出は、選択した波長に依存して、裸眼又は光子検出デバイス(例えば、CCD又はCMOSセンサ)のいずれかにより行うことができる。
【００２３】
１つの実施形態では、色素は、通常光(normal light)で裸眼による可視化を可能にする発光極大を有する。別の実施形態では、色素は、UV光で裸眼による可視化を可能にする発光極大を有する。
適切な色素又はトレーサーの他の例は、WO 04/045650(参照により本明細書に組み込まれる)に見られる。
【００２４】
メチネル節を同定する別の方法ではあるが遥かに時間のかかるものは、推定の転移排液領域において選択したリンパ節を取り出して調べることである。次いで、実際の患者の転移からの腫瘍抽出物を使用して、増殖アッセイにより腫瘍反応性Ｔリンパ球を含有するリンパ節を同定し得る。
【００２５】
リンパ節探知体は、患者に、転移の中、上、周り、近く及び/又は下に注射する。次いで、探知体はリンパ系脈管を通って拡散し、メチネルリンパ節に至り、１又はそれより多い節が、探知体物質の注射後の或る期間内(例えば、５分〜30分以内、例えば５分〜15分以内)に染まり始める。そこで、探知体物質が造影される。上記のように、探知体の造影は、もちろん、使用する探知体物質に依存する。
【００２６】
通常光で裸眼による可視化を可能にする発光極大を有する色素(例えばパテントブルー(Patent Blue))を使用する場合、１又はそれより多いメチネル節は、単純に、着色色素が最初に蓄積する節として同定される。すなわち、パテントブルーを使用する場合、外科医は、青色が最初に蓄積するリンパ節を探す。
【００２７】
探知体は、単回注射又は多回注射(例えば、２回又はそれより多い注射、３回又はそれより多い注射、４回又はそれより多い注射、５回又はそれより多い注射、或いは６回又はそれより多い注射)により注射され得る。
【００２８】
リンパ節探知体の注射を実施する方法は、転移の位置に依存する。リンパ節探知体は、非外科的手順より、すなわち外科的工程を含まない手順により注射され得る。ここで、外科的工程は、外科手術手順を含むもの、すなわち器具を用いる切開を含む工程と定義される。本発明に関しては、注射、すなわち注射針による皮膚の穿孔は、外科的工程と考えない。したがって、リンパ節探知体が非外科的手順により注射され得るとの言及は、リンパ節探知体が、皮膚に又は皮膚を通して直接、転移の中、上、周り、近辺及び/又は下に注射され得ることを意味すると意図される。
【００２９】
リンパ節探知体が皮膚内に又は皮膚を通して注射され得る状況の例は、例えば、転移が患者の皮膚に位置する症例である。このような状況では、リンパ節探知体は、優先的には、転移の上の皮膚中に、又は皮膚を通して転移の中、周り、近辺及び/又は下に注射すべきである。転移が患者の皮下組織に位置する場合、リンパ節探知体は、優先的には、転移の上の皮膚中に、又は皮膚を通して転移の中、周り、近辺及び/又は下に注射すべきである。
【００３０】
上記のように、メチネルリンパ節は、必ずしも、転移から解剖学的最短距離又は最も論理的な解剖学的距離に位置しないことがある。この例としては、本明細書中の実施例に記載されるような、本発明者らによる鼠径部リンパ節転移から遠位で内側のメチネル節の驚くべき同定がある。リンパ系の解剖学に基づいて、鼠径部におけるリンパ節転移に対するメチネルリンパ節が疑われる位置は、皮膚若しくは皮下脂肪中の近位又は骨盤中の腸骨血管に沿って深部のいずれかである。
【００３１】
したがって、メチネルリンパ節は転移から遠位に位置し得るので、幾つかの症例では、手術の必要がないリンパ節探知体の注射が非常に有益であり得る。なぜならば、そのようなメチネルリンパ節の位置を予測することは非常に困難であり得るからである。理論では、鼠径部中の転移は腋窩にメチネルリンパ節を有し得る。すなわち、メチネル節除去手術を行う身体内の場所を予測することは非常に困難なことがある。本発明の具体的実施形態では、リンパ節探知体は、放射性物質、例えばテクネチウム-99mである。これは非外科的手順により注射され得、その後リンパシンチグラフィーを実行することにより造影される。
【００３２】
センチネル節は原発腫瘍を排液する。これは、通常、先天的に、そのリンパ排液がその特定の個体に関して胎発生以来組織された器官に由来する。排液パターンは個体間で異なり得る。本発明者らは、種々の場所(肝臓、腸間膜脂肪、リンパ節、皮下組織、筋肉など)に位置する転移もまた、最初の排液リンパ節を有するリンパ排液を有することを見出した。本発明者らはこれら節を「メチネル節」と呼ぶ。これらは、リンパ管生成因子(例えばVEGF-C)を産生する転移自体の能力によりリンパ管に接続している可能性が高い。本発明者らは、(転移に対するクローン拡大を経験した)これらメチネル節において腫瘍反応性リンパ球を同定し、それらを免疫学的特徴を保持したまま拡大させ、細胞性免疫療法に使用できることを示した。
【００３３】
リンパ節探知体はまた、外科的手順、すなわち切開を含む手順を含んで注射し得る。外科的手順を含み得る状況の例としては、注射針が皮膚を通して到達できない場所に転移が位置する場合又は皮膚及び組織を通しての探知体の造影が不可能である場合である。
【００３４】
このような場合、外科医は、転移の領域で切開を実施し、その後、１又はそれより多いメチネルリンパ節を同定するために、リンパ節探知体を転移の中、上、周り、近辺及び/又は下に直接注射し得る。リンパ節探知体の注射が外科的手順を含み得る状況の例は、例えば、転移が患者の腹部内の領域中、柔組織器官中又はより深部に位置するリンパ節中に位置する場合である。
【００３５】
時に、メチネルリンパ節の同定には、非外科的工程と外科的工程との組合せによるリンパ節探知体の注射が含まれ得る。この例としては、放射活性リンパ節探知体、例えばテクネチウム-99mを、注射針を用いて、すなわち手術用の針を用いずに注射し得る。探知体の蓄積、すなわちメチネル節の同定は、γ検出器を用いて行い得る。このことにより、外科医は、メチネル節が位置する場所に対する示唆が得られる。その後、メチネルリンパ節及び転移の少なくとも一部を除去する手術を患者が受けているときに、着色色素(例えばパテントブルー色素)を注射し得る。更に、最初の注射後約18〜24時間より長く経過する場合には、手術の間にメチネル節を同定するために、放射活性トレーサーを(該放射活性トレーサーの半減期(通常約６時間)に依存して)１又はそれより多く余分に注射することが有益であり得る。
【００３６】
１つの方法又は他の方法により１又はそれより多いメチネルリンパ節を位置決めした後に、外科医は、メチネルリンパ節が腫瘍細胞を含有しているかどうかを調べるため、及び転移反応性Ｔリンパ球の培養物を取得するために、メチネルリンパ節を取り出す。
【００３７】
１又はそれより多いメチネルリンパ節からのリンパ球の採集は、リンパ球の単一細胞懸濁物を取得するために、メチネルリンパ節材料をホモジネートすることにより行われ得る。次いで、単一細胞懸濁物は、転移反応性Ｔリンパ球を取得するために、インビトロ拡大に付す。
【００３８】
インビトロ拡大
本発明に従う方法のインビトロ拡大工程iii)は、
ｉ) 腫瘍反応性CD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球を、腫瘍由来抗原とIL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する少なくとも１つの物質とで刺激して、腫瘍反応性Ｔリンパ球の生存を促進する第１のフェーズ；及び
ii) 腫瘍反応性CD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球の成長を活性化し促進する第２のフェーズ
を含んでなり、第２のフェーズii)は、Ｔリンパ球上でCD25細胞表面マーカー(IL-2Rマーカー)がダウンレギュレートされたときに開始される。
【００３９】
フェーズｉ)
第１のフェーズｉ)の目的は、実質的に高い比率の腫瘍反応性CD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球を含んでなる培養物を取得することである。第１のフェーズは、腫瘍反応性Ｔリンパ球を生存させ分裂させる「養育フェーズ」と考えられる。Ｔリンパ球の供給源(インビトロ拡大法用の出発材料)に依存して、Ｔリンパ球は、比較的過酷な条件、例えばガン細胞によって分泌される因子による抑制及び阻害を漸次導入され得る。
【００４０】
拡大法における使用のための出発材料は、転移を排液するリンパ節から得られるリンパ球の混合物であり得る。
【００４１】
培養物中で拡大させるべきＴリンパ球は、治療すべき対象から取得することができる。すなわち、投与用に得られる特異的腫瘍反応性Ｔリンパ球は自己由来であり得る。しかし、Ｔリンパ球はまた、治療すべき対象以外の供給源から、例えばガンに罹患している別の対象から取得することも可能である。この場合、レシピエント及び拡大された腫瘍反応性Ｔリンパ球は、好ましくは、免疫学的に適合性である(或いは、そうでなければ、レシピエントが、拡大された腫瘍反応性Ｔリンパ球に免疫寛容にされる)。
【００４２】
出発材料は、ほとんどの場合、種々のリンパ球、例えばＴリンパ球、Ｂリンパ球、抗原提示細胞、腫瘍反応性Ｔリンパ球及び非活性化/非反応性Ｔリンパ球の混合物を含んでなる。腫瘍反応性Ｔリンパ球の生存を特異的に促進するために、腫瘍由来抗原とIL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する１又はそれより多い物質とが添加される。
【００４３】
上記のように、第１のフェーズｉ)は、IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する少なくとも１つの物質を添加することにより開始される。その物質の機能は、IL-2レセプターを介してＴリンパ球を刺激し、Ｔリンパ球の細胞分裂を促進することであり、そのことにより細胞死を防止する。
【００４４】
Ｔリンパ球の抗原特異的MHC拘束性活性化は、腫瘍細胞の認識に特異的な有用なＴリンパ球集団のクローン拡大を促進する。対照的に、Ｔリンパ球の非特異的活性化は、腫瘍細胞の認識との関係なく無関係のペプチドを認識するＴリンパ球クローンの拡大を導き、よって非特異的に拡大されたＴリンパ球の大部分は当該腫瘍を認識しない。
【００４５】
本発明は、腫瘍反応性CD4+ヘルパー及びCD8+Ｔリンパ球の特異的活性化及び成長を促進することを目的とする。或る腫瘍抗原に対する特異的活性化により、Ｔリンパ球は、該Ｔリンパ球が活性化されている腫瘍タイプと同じ腫瘍タイプのガン患者に投与されたときに治療効果を有することが可能になる。
【００４６】
本発明の１つの実施形態では、IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質は、アゴニストである。このような物質の例としては、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、アフィボディ、及びそれらのフラグメント、融合タンパク質、合成及び/又は有機分子、例えば、小分子、及び天然リガンドが挙げられる。好ましい実施形態では、この物質は、IL-2レセプターの天然リガンド、すなわちIL-2である。
【００４７】
IL-2は、使用される場合、リンパ球のアポトーシスを減少させるため及びCD4陽性腫瘍反応性Ｔリンパ球の集団を増大させるために、優先的には、低用量で添加される。本発明の具体的実施形態では、IL-2の低用量は、約100 IU/ml培養培地〜約700 IU/ml培養培地、例えば、約100 IU/ml培養培地〜約600 IU/ml培養培地、約100 IU/ml培養培地〜約500 IU/ml培養培地、約100 IU/ml培養培地〜約400 IU/ml培養培地、約100 IU/ml培養培地〜約300 IU/ml培養培地及び約100 IU/ml培養培地〜約200 IU/ml培養培地である。具体的実施形態では、添加するIL-2の量は240 IU/mlである。
【００４８】
IL-2レセプターに対してアゴニスト活性を有する、IL-2以外の物質を使用する場合、それらの具体的用量は、上記用量のIL-2により得られる効果に相当する効果を導くような用量であるべきである。
【００４９】
細胞分裂を促進する最適条件を維持するために、更なる量のIL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する少なくとも１つの物質が、フェーズｉ)を通して定期的に、例えばフェーズｉ)の２日毎、３日毎又は４日毎に添加されてもよい。用語 ２日毎、３日毎又は４日毎は、IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する少なくとも１つの物質が、IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する少なくとも１つの物質の最初の添加後(すなわちフェーズｉ)の開始後)２日目、３日目又は４日目に開始され、フェーズｉ)を通して２日毎、３日毎又は４日毎に添加されることを意味すると意図される。
【００５０】
１つの実施形態では、フェーズｉ)を通して定期的に添加されるべき物質は、IL-2のアゴニストである。好ましい実施形態では、この物質はIL-2である。
定期的、例えば２日毎、３日毎又は４日毎に添加されるべき、IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質(例えば、IL-2)の更なる用量は、上記範囲内である。
【００５１】
第１のフェーズｉ)の拡大における更なる重要な工程は、腫瘍抗原を認識するＴリンパ球レセプターを発現するＴリンパ球、すなわち腫瘍反応性Ｔリンパ球の細胞分裂を促進するための腫瘍由来抗原の添加である。
【００５２】
腫瘍抗原を添加する最適な時点は、リンパ球の供給源に依存する。リンパ球がリンパ節起源である場合、リンパ球は、腫瘍抗原提示に際して増殖で応答するＴリンパ球の能力を促進するために、腫瘍細胞の近傍で腫瘍細胞による免疫抑制に供されてもよく、IL-12レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質(例えば、IL-2)との何日間かのインキュベーションを必要とし得る。したがって、そのような場合、腫瘍由来抗原は、優先的には、第１のフェーズｉ)の２日目から５日目まで(５日目を含む)、例えば２日目、３日目、４日目又は５日目に添加される。
【００５３】
腫瘍由来抗原(例えば、腫瘍ホモジネート)は、出発材料中に存在する抗原提示細胞による、例えばＢリンパ球、樹状細胞及びマクロファージによる、エンドサイトーシス及びプロセッシングを受ける可能性が高い。ほとんどの場合、腫瘍由来抗原は、クラスII MCH分子により提示され、CD4+腫瘍反応性Ｔリンパ球の細胞分裂を導く。しかし、交差提示により、エンドサイトーシスにより取り込まれた抗原は、プロセッシングを受け、クラスＩポケットで提示され、CD8+Ｔリンパ球の活性化を生じる。上記のように、この拡大法の目的の１つは、或る観点では、患者自身の免疫系の天然経路を模倣することであり、或る意味では、抗原がMCHIにより提示されるか又はMCHIIにより提示されるかに依存して、患者免疫系の成分に、CD4+リンパ球を生成するか又はCD8+リンパ球を生成するかを決定させることである。ほとんどの場合、抗原はクラスII MCH分子により提示されてCD4+Ｔリンパ球の生成を導くが、CD8+Ｔリンパ球が生成する場合もある。
【００５４】
フェーズii)
第２のフェーズii)の目的は、フェーズｉ)により得られた腫瘍反応性CD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球を活性化及び拡大すること、並びに腫瘍反応性CD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球を所望の経路に方向付けることによりこれらＴリンパ球の特異的亜集団を取得することである。
【００５５】
本発明者らは、フェーズii)を開始する最適な時点を決定する１つの方法は、Ｔリンパ球が再刺激に感受性であるときを特異的に決定するために、Ｔリンパ球上のCD25細胞表面マーカーの発現をモニターすることによることを見出した。本発明者らは、第２のフェーズii)が、好ましくは、Ｔリンパ球上のCD25の発現がダウンレギュレートされたときに開始されるべきであることを見出した。CD25は活性化マーカーであり、リンパ球が活性化シグナルを受けたことを示す。Ｔリンパ球上のCD25の発現が高い(リンパ球が既にシグナルを受けたことを意味する)ときに第２のフェーズを開始すると、細胞死が起こる。
【００５６】
CD25のダウンレギュレーションは、Ｔリンパ球集団の相当部分がCD25マーカーを本質的に全く発現しないか又は非常に少ししか発現しないこととして定義される。好ましい実施形態では、CD25のダウンレギュレーションは、Ｔリンパ球集団の５％未満がCD25を発現すること、すなわち培養物中の95％又はそれより多いＴリンパ球はCD25を全く発現しないこととして定義される。CD25を発現する５％又はそれ未満のＴリンパ球は、CD25を永続的に高度に発現する調節性CD4+Ｔリンパ球である可能性が最も高い。加えて、Ｔリンパ球集団は、好ましくは、調節性Ｔリンパ球の特異マーカーであるFoxP3マーカーを本質的に全く発現すべきでないか又は非常に少数にしか発現すべきでない。好ましい実施形態では、FoxP3のダウンレギュレーションは、Ｔリンパ球集団の５％未満がFoxP3を発現すること、すなわち培養物中の95％又はそれより多いＴリンパ球はFoxP3を全く発現しないこととして定義される。
【００５７】
CD25の他にも、その発現が第２フェーズを開始する最適な時点を決定するためのモニターに関連する他のマーカーが存在する。そのようなマーカーの例は、初期活性化マーカーCD69、及びＴリンパ球の活性化マーカーであるMCHIIである。CD69及びMCHIIの発現は、Ｔリンパ球の「活性化プログラム」が既に始まっていることを示す(このことは、細胞が追加の刺激に応答できないことを意味する)ので、これら両マーカーは、好ましくは、第２のフェーズが開始される前にダウンレギュレートされるべきである。用語 ダウンレギュレーションは、Ｔリンパ球集団の５〜10％未満がCD69及び/又はMCHIIを発現することとして定義され得る。
【００５８】
本発明の別の実施形態では、本拡大法のフェーズii)の拡大中に、抗CD4抗体を使用して、Ｔヘルパー細胞を培養物中の腫瘍細胞である可能性がある細胞から分離する。
【００５９】
本発明の更なる又はなお別の実施形態では、抗CD3抗体及び抗CD28抗体を有するDynabeads(登録商標)のような製品を使用して、本拡大法のフェーズii)の拡大を促進する。Dynabeads(登録商標) CD3/CD28の使用は、活性化シグナルを有するリンパ球を提供し、培養物中の腫瘍細胞である可能性のある細胞からの分離に使用することもできる。Dynabeads(登録商標) CD3/CD28は、フェーズｉ)の間に抗原特異的に拡大されたＴリンパ球に結合する。こうして、これら細胞は磁気的に富化することが可能となる。最初の抗原特異的活性化が開始され、Ｔリンパ球のクローン拡大が導かれているので、Dynabeads(登録商標) CD3/CD28再刺激は、クローン拡大を更に促進する。なぜならば、フェーズｉ)は非特異的Ｔリンパ球クローンの活性化を支持しないからである。
【００６０】
たとえ、フェーズii)の正確な開始点はリンパ球が特異マーカーの好ましい発現を獲得したときに依存して変化しても、第２のフェーズii)は、ほとんどの場合、第１のフェーズｉ)の17日目から23日目まで(23日目を含む)(例えば17日目、18日目、19日目、20日目、21日目、22日目又は23日目)に開始される。換言すれば、リンパ球が好ましい量及び組合せのマーカーを発現する時点は、ほとんどの場合、第１のフェーズｉ)の17日目から23日目までのようである。
【００６１】
Ｔリンパ球の拡大、すなわちフェーズｉ)及びii)は、ほとんどの場合、適切な培養培地で起こる。好ましくは、患者への疾患の伝染の危険を回避するために、無血清培地又は自己由来血清が使用される。適切な標準培地の例としては、AIMV培地、RPMI 1640、DMEM及びMEMが挙げられる。しかし、アミノ酸、ステロイド、ビタミン、成長因子、サイトカイン及びミネラルの適切なブレンドを含んでなる他の培地も使用し得る。
【００６２】
培養物中の適切な細胞密度を維持するために、２つの拡大フェーズ中、細胞は、幾つかの培養容器に分割されてもよい。拡大フェーズにおけるＴリンパ球の密度は、好ましくは、約３〜約６百万細胞/ml培養培地であるべきである。
【００６３】
拡大の間、培地の条件付けと呼ばれる工程である、新鮮な培地との培養培地の交換もまた必要とされ得る。培養物を分割する時点及び培地を条件付けする時点は、細胞の形態及び細胞培養物密度(これは約６百万細胞/mlを超えるべきでない)に基づいて決定され得るか、又は培地は、適切な指示薬(例えばフェノール指示薬)を含み得る。指示薬が培地に含まれる場合、培養物を分割する時点又は培地を条件付けする時点は、培地の色に基づいて決定してもよい。フェノールレッド指示薬を使用する場合、細胞は、培地が黄色になった(培養物のpHが酸性になっていることを示す)ときに分割又は条件付けすべきである。本発明に使用される培地を条件付けるために適切なスケジュールは、培地の1/4〜1/2(例えば1/3)を３〜９日毎(例えば週１回)交換するというものであり得る。
【００６４】
本明細書に記載の具体的条件を除き、他のパラメータについては、リンパ球培養物の成長用の標準条件(例えば、温度37℃及び５％CO2)が使用される。
上記のように、第２のフェーズii)は、腫瘍反応性Ｔリンパ球のクローン拡大を促進するために、腫瘍反応性CD25陰性Ｔリンパ球の活性化について上記のようにＴリンパ球に腫瘍由来抗原を添加することにより開始される。
【００６５】
本発明の具体的実施形態では、抗原提示細胞(APC)は、腫瘍由来抗原と共にＴリンパ球に添加される。抗原提示細胞(APC)としては、白血球、例えば単球、マクロファージ及びリンパ球(例えばＢ細胞)が挙げられる。これら多様な細胞タイプは、特異的Ｔリンパ球レセプターにより認識される形態で抗原を提示する能力を共通して有する。白血球調製物は、治療すべき患者から得られる、例えば血液、リンパ液、骨髄、リンパ器官組織又は組織培養液から単離される。好ましい実施形態では、APC細胞は、抗原提示Ｂ細胞及び/又は単球を含有する照射末梢血白血球である。添加するAPCの量は、約0.5百万APC/mlリンパ球培養物〜約５百万APC/mlリンパ球培養物の範囲、例えば、約１百万APC/mlリンパ球培養物〜約４百万APC/mlリンパ球培養物の範囲、約１百万APC/mlリンパ球培養物〜約３百万APC/mlリンパ球培養物の範囲又は約１百万APC/mlリンパ球培養物〜約２百万APC/mlリンパ球培養物の範囲にある。
【００６６】
腫瘍反応性Ｔリンパ球のクローン拡大を促進するためのＴリンパ球への腫瘍由来抗原の添加の他に、第２のフェーズii)は、その機能が所望の亜集団に対して腫瘍反応性Ｔリンパ球の拡大を導くことである特定成分の添加を含んでなる。
【００６７】
上記のように、本発明は、腫瘍反応性CD4+ヘルパーＴリンパ球の生成法を提供する。CD4+ヘルパーＴリンパ球は、抗原が主要組織適合性複合体クラスII分子と組み合わさったとき、腫瘍抗原を認識し結合する。活性化CD4+ヘルパーＴリンパ球は、免疫系の他の細胞(例えば他のリンパ球)を刺激するサイトカイン、タンパク質及び/又はペプチドを分泌する。分泌される最も一般的なサイトカインは、インターロイキン-２(IL-2)である。これは、強力なＴリンパ球成長因子である。活性化され増殖中のCD4+ヘルパーＴリンパ球は、産生する特異的サイトカインに基づいて定義される２つの主要なサブタイプの細胞であるTh1細胞及びTh2細胞に分化することができる。Th1細胞は、インターフェロン-γ及びインターロイキン12(IL-12)を産生する一方、Th2細胞は、インターロイキン-４、インターロイキン-５及びインターロイキン-13を産生する。Th1Ｔリンパ球は、細胞傷害性Ｔリンパ球(Tc)、NK細胞、マクロファージ及び単球(これらは全て、ガン細胞を攻撃することができ、一般的には腫瘍に対して防御することができる)の活性化を促進すると考えられている。
【００６８】
タイプTh1及びTh2のＴヘルパー(CD4+)リンパ球は、メモリー細胞及びエフェクター細胞に分化することができる。メモリーＴヘルパー(CD4+)リンパ球は、それらが最初に遭遇した抗原に特異的であり、二次免疫応答の間に召集されて、当該腫瘍抗原に対するより迅速で規模の大きな応答を引き起こすことができる。ヒトにおいて、リンパ球が少なくとも20年(おそらく生涯)生存するという証拠が存在する。エフェクターCD4+Ｔリンパ球は、サイトカイン及びINF-γを産生する活性な細胞である。
【００６９】
ガンの有効な治療のために、Th1タイプの腫瘍反応性Ｔリンパ球の投与は、このタイプが細胞傷害性Ｔリンパ球(Tc)、NK細胞、マクロファージ及び単球(これらは全てガン細胞を攻撃し、一般的には腫瘍に対して防御することができる)の活性化を促進すると考えられているので、特に有益である。すなわち、具体的実施形態において、本発明は、腫瘍反応性CD4+ヘルパーＴリンパ球を生成する方法に関し、更なる実施形態では、本方法により生成されるTh2タイプのＴリンパ球の割合は、30％又はそれ未満、例えば25％又はそれ未満、20％又はそれ未満、15％又はそれ未満、10％又はそれ未満、５％又はそれ未満、或いは０％である。すなわち、腫瘍反応性CD4+Ｔリンパ球の少なくとも70％、例えば少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％又は100％が、Th1タイプである。
【００７０】
したがって、第２のフェーズは、Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質の添加を含んでなり得る。IL-12Rのアップレギュレーションは、Ｔ細胞が迅速にIL-12サイトカイン活性化を受容し最適化する態勢を増大させ、その結果、最大のSTAT-4シグナル伝達を生じ、そうしてリンパ球をTh1細胞及びIFN-γ産生に傾斜させる(skew)。
【００７１】
Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質は、インターフェロンレセプターに対するアゴニスト活性を有する物質であり得る。本発明の１つの実施形態では、インターフェロンレセプターに対するアゴニスト活性を有する物質は、アゴニストである。このような物質の例としては、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、アフィボディ、及びそれらのフラグメント、融合タンパク質、合成及び/又は有機分子(例えば小分子)、及び天然リガンドが挙げられる。具体的実施形態では、この物質は、インターフェロンレセプターの天然リガンド、すなわちインターフェロン(例えば、インターフェロン-α)である。
【００７２】
Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質(例えば、インターフェロンレセプターに対するアゴニスト活性を有する物質)を添加する最適な時点は、培養培地中のIL-12レベルを測定することにより決定してもよい。この物質は、好ましくは、IL-12レベルが、フェーズii)の１日目のIL-12レベルと比較して、少なくとも１倍増加したとき、例えば少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍又は少なくとも５倍増加したときに添加すべきである。ほとんどの場合、このようなIL-12レベルの増加は、第２のフェーズii)の開始後２日目から４日目まで(４日目を含む)(例えば２日目、３日目又は４日目)に見られる。
【００７３】
Th2タイプの腫瘍反応性Ｔリンパ球の生成を実質的に回避するために、第２のフェーズは、Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る１又はそれより多い物質の添加を更に含んでなってもよい。そのような物質の例は、インターロイキンIL-4、IL-5、IL-10及び/又はTGF-β(後者はインターロイキンではない)(これら４つは全て、Th2サイトカインプロフィールの確立及びTh1サイトカイン産生のダウンレギュレーションに必要とされる)を中和し得る物質である。
【００７４】
このような物質の例としては、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、可溶性レセプター、抗体、アフィボディ、及びそれらのフラグメント、融合タンパク質、合成及び/又は有機分子(例えば小分子)、及び天然リガンドが挙げられる。具体的実施形態では、この物質は、インターロイキンに結合し、そのことによりインターロイキンを中和する抗体(例えば抗IL-4抗体、抗IL-5抗体及び/又は抗IL-10抗体)並びに可溶性レセプター(例えばTGF-βレセプターＩ及びII)及びTGF-βに関する結合性タンパク質(例えばLAP及び/又はLTBP)から選択される。
【００７５】
Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る１又はそれより多い物質(例えば、IL-4、IL-5、IL-10及び/又はTGF-βを中和し得る１又はそれより多い物質)は、第２のフェーズii)の１日目に添加してもよい。しかし、抗体は高価であるので、抗体の添加は、Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質の添加後の後工程において、例えば、Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質の添加の１日後、２日後又は３日後に実施することも可能である。
【００７６】
この中和物質は、インターロイキンを中和するに十分な量で、例えば、中和すべきインターロイキン量の10〜100倍(モル)過剰で添加すべきである。抗体を使用する場合、通常、約２〜約４ng/ml培養培地の最終濃度が必要である。他のタイプの中和物質に関しては、抗体について言及した濃度と同じ効果を与える最終濃度を使用すべきである。
【００７７】
Th2タイプＴリンパ球の発達の抑制を維持するために、更なる量のTh2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る１又はそれより多い物質(例えば、IL-4、IL-5、IL-10及び/又はTGF-βを中和し得る１又はそれより多い物質)が、フェーズii)を通して定期的に、例えばフェーズii)の２日毎、３日毎又は４日毎に添加されてもよい。用語 ２日毎、３日毎又は４日毎は、Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る少なくとも１つの物質が、該Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る少なくとも１つの物質の最初の添加の２日後、３日後又は４日後に開始され、フェーズｉ)を通して２日毎、３日毎又は４日毎に添加されることを意味するように意図されると理解されるべきである。
【００７８】
更に、フェーズｉ)と同様に、更なる量のIL-12レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質(例えば、アゴニスト)が、細胞分裂を促進する最適条件を維持するために、フェーズii)を通して定期的に、例えばフェーズii)の２日〜４日毎(すなわち、２日目、３日目又は４日目)に添加されてもよい。定期的に添加すべき物質の用量は、IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質(例えば、IL-2)の添加についてフェーズｉ)で言及した最適範囲内にある。
【００７９】
Th1タイプ腫瘍反応性Ｔリンパ球の生成に有利にするために、第２のフェーズii)は、Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する１又はそれより多い物質を添加することを含んでなってもよい。このような物質の例は、IL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質である。より具体的には、この物質は、IL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21レセプターのアゴニストであり得る。このようなアゴニストの例としては、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、アフィボディ、及びそれらのフラグメント、融合タンパク質、合成及び/又は有機分子(例えば、小分子)並びに天然リガンドが挙げられる。具体的実施形態では、この物質は、IL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21レセプターの天然リガンド(例えば、それぞれIL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21)である。
【００８０】
IL-12の効果は、IL-12Rを刺激し、そのことによりTh1リンパ球の活性化を促進することによってIFN-γ誘導性STAT経路を活性化することである。IL-21の機能は、Ｔリンパ球の増殖、活性化及びTh1タイプへの発達を増強することである。
IL-7及びIL-15は共に、Ｔリンパ球の恒常的拡大を促進し、活性化されTh1プログラムされたＴリンパ球の列挙(enumeration)を増強することにより働く。
【００８１】
Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する１又はそれより多い物質を添加するに最適な時点は、Ｔリンパ球が改変に対して感受性であるときである。Ｔリンパ球が改変に対して感受性でないときにこの物質が添加されると、そのような添加は効果を有さない。すなわち、Th1タイプＴリンパ球の発達に有利とならない。Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する物質(例えば、IL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質)を添加する最適な時点を決定するため、Ｔリンパ球によるINF-γの産生をモニターし得る。好ましい実施形態では、Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する１又はそれより多い物質(例えば、IL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質)は、IFN-γレベルが第２のフェーズii)の開始時のIFN-γレベルと比較して増加しているときに添加すべきである。
【００８２】
具体的実施形態では、IFN-γレベルの増加は、第２のフェーズii)の開始時のIFN-γレベルと比較して、IFN-γレベルの少なくとも１倍増加、例えば少なくとも２倍増加、少なくとも３倍増加、少なくとも４倍増加として決定され得る。しばしば、このような増加は、培養培地中のIFN-γ含量が少なくとも100ピコグラム/ml培養培地、例えば少なくとも150ピコグラム/ml培養培地、少なくとも200ピコグラム/ml培養培地又は少なくとも250ピコグラム/ml培養培地であるべきであることに相関させることができる。
【００８３】
Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する物質(例えば、IL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質)を添加する最適時点を決定する際、更に、CD4+Ｔリンパ球上での活性化マーカーCD25及びCD69(これらマーカーは優先的にアップレギュレートされるべきである)の発現を観察してもよい。アップレギュレーションにより、フェーズii)の１日目のＴリンパ球上でのCD25及びCD69の発現と比較して、少なくとも約40％〜約60％又はそれより多くのCD4+Ｔリンパ球が、CD25及びCD69を発現すべきであることが理解される。CD25及びCD69の発現は、Ｔリンパ球が活性化シグナルを受けたことを示している。
【００８４】
通常、Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する物質を添加する最適な時点は、Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質及びTh2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る物質を添加する工程の後になる。より具体的には、Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する物質を添加する最適時点は、第２のフェーズii)の開始後５日目〜８日目の間、例えば５日目、６日目、７日目又は８日目になる。
【００８５】
IL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21が添加される場合、培養培地におけるこれら物質の各々の濃度は、約150 IU/ml培養培地〜約300 IU/ml培養培地の範囲内、例えば250 IU/ml培養培地であるべきである。記載の具体的物質以外のものを使用する場合、それらは、言及した具体的範囲内でのIL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21の添加により得られる効果と同じ効果を導く最終濃度で、培養物に添加されるべきである。
【００８６】
上記のように、本方法は、優先的には、Th1タイプのCD4+腫瘍反応性Ｔリンパ球を達成するためのＴリンパ球の拡大に使用される。本発明の１つの更なる観点は、本明細書に記載した腫瘍反応性Ｔリンパ球の拡大法を使用することにより、比較的高量のメモリータイプのＴリンパ球を取得することである。ガンの治療において、治療されるべき患者が高量のエフェクター腫瘍反応性CD4+Ｔリンパ球を受容することは、当然のことながら重要である。なぜなら、これらは、上記のように、細胞傷害性Ｔリンパ球(Tc)、NK細胞、マクロファージ及び単球(これらは全てガン細胞を攻撃し、一般的には腫瘍に対して防御することができる)の活性化を促進するからである。
【００８７】
しかし、同時に相当量のメモリー腫瘍反応性CD4+Ｔリンパ球を投与することにより、患者は、腫瘍又は原発腫瘍の転移の再発に対する生涯にわたる保護までも達成する。
【００８８】
したがって、本発明は、メモリーＴリンパ球の作製方法に関する。通常、腫瘍反応性Ｔリンパ球の培養物が本発明に従って拡大される場合、約35％〜約90％、例えば約40％〜約90％、約50％〜約80％又は約60％〜約70％のメモリータイプの腫瘍反応性Ｔリンパ球が得られる。本発明者らは、フェーズｉ)のリンパ球が、腫瘍抗原の添加前に再生されるという事実は、比較的緩慢な拡大フェーズと併せて、メモリーリンパ球 対 エフェクターリンパ球の高い比の形成を導くと推測する。
【００８９】
上記のように、Ｔリンパ球上での細胞表面活性化マーカーCD25及びCD69の発現は、本方法の重要な工程を開始する時、例えば、第２のフェーズii)を開始する時を決定するために使用し得る。したがって、フェーズｉ)及びフェーズii)を通して、例えば２日毎、３日毎又は４日毎に、CD25及びCD69の発現を継続的にモニターすることは有益であり得る。
【００９０】
本方法の目的の１つは、多数の(患者への投与に使用し得る)特異的CD4+腫瘍反応性Ｔリンパ球を取得することであるので、腫瘍反応性Ｔリンパ球は、或る時点で採取され得、拡大工程の終結に至る。腫瘍反応性Ｔリンパ球を採取する最適時点は、Ｔリンパ球上でのCD25の発現がダウンレギュレートされた時である。ここで、ダウンレギュレーションは、CD4+Ｔリンパ球集団の５％又はそれ未満がCD25を発現することとして定義される。採取する最適時点はまた、産生されるIFN-γの量の測定に基づいて決定してもよい。IFN-γ産生は、最初のIFN-γ産生(通常、少なくとも100pg/ml培養培地のIFN-γレベルに相当する)と比較して、少なくとも２倍増加すべきであり、例えば少なくとも３倍、少なくとも４倍又は少なくとも５倍増加すべきである。
【００９１】
通常、この事象は、第２のフェーズii)の開始後10日目から14日目まで(14日目を含む)に生じる。すなわち、通常、細胞は、第２のフェーズii)の開始後10日目から14日目まで(14日目を含む)に採取される。
【００９２】
したがって、本発明に従う腫瘍反応性Ｔリンパ球の拡大のための全体プロセスは、一般に、約25日から約45日まで(45日を含む)、例えば約26日から約44日まで(44日を含む)、約27日から43日まで(43日を含む)、約27日から42日まで(42日を含む)、約27日から41日まで(41日を含む)、及び約27日から約40日まで(40日を含む)かかる。
【００９３】
CD25マーカーがダウンレギュレートされた時に腫瘍反応性Ｔリンパ球を採取することに代えて、腫瘍反応性Ｔリンパ球を１又はそれより多い回数の追加のフェーズii)に供してもよい。これは、発現法により取得される腫瘍反応性Ｔリンパ球の量がガンに罹患している患者に投与すべき有効量と考えられない場合、又は患者が化学療法治療レジメンにある場合(この場合、化学療法治療が終了するまでＴリンパ球の投与を延期することが有益と考えられ得る)に行うことが有益であり得る。腫瘍反応性Ｔリンパ球を１又はそれより多い回数の追加のフェーズii)に供すべきかどうかを決定するために、産生されるIFN-γのレベル及び/又は取得される腫瘍反応性Ｔリンパ球の総数及び/又はCD25の発現を観察し得る。IFN-γレベルが30pg/ml培養培地又はそれ未満、例えば20pg/ml培養培地又はそれ未満である場合、及び/又はＴ細胞の総数が不満足である場合、追加の回のフェーズii)は、Ｔ細胞の多数がCD25陰性であり(すなわち、Ｔリンパ球集団の５％未満がCD25を発現する)、そのことにより再刺激に感受性であるときに開始され得る。
【００９４】
採取の後、腫瘍反応性Ｔリンパ球は、任意の従来手段により、例えば密度勾配、例えばフィコール培地の使用により精製されてもよい。腫瘍反応性Ｔリンパ球の採取及び精製の後、一部の腫瘍反応性Ｔリンパ球を、適切な凍結培地中で凍結することにより保存してもよい。
【００９５】
治療方法
改良拡大法により取得された腫瘍反応性Ｔリンパ球は、散在性ガンを患っている患者を治療するために使用される。
【００９６】
投与すべき腫瘍反応性Ｔリンパ球の有効量の定義は、リンパ球の具体的タイプ、メモリーＴリンパ球 対 エフェクターＴリンパ球の比及び疾患の重篤度に依存する。しかし、平均で、最低限少なくとも10百万、例えば少なくとも20百万、少なくとも30百万、少なくとも40百万、少なくとも50百万、少なくとも60百万、少なくとも70百万又は少なくとも80百万の腫瘍反応性Ｔリンパ球が投与され得る。単回用量で投与すべき腫瘍反応性Ｔリンパ球の量に関して、上限は何ら特定されない。
【００９７】
好ましい実施形態では、投与用の腫瘍反応性Ｔリンパ球は、エフェクターＴリンパ球とメモリーＴリンパ球との組合せを含んでなる。より具体的には、メモリータイプの腫瘍反応性Ｔリンパ球の量は、約35％〜約90％、例えば約40％〜約90％、約50％〜約80％又は約60％〜約70％であり得、エフェクターＴリンパ球の割合は、約10％〜約65％、例えば約20％〜約50％又は約30％〜約40％であり得る。
【００９８】
腫瘍反応性Ｔリンパ球は、患者への非経口投与、例えば、静脈内、動脈内、鞘内又は腹腔内投与に適切な医薬組成物として製剤化され得る。
【００９９】
腫瘍反応性Ｔリンパ球が非経口投与される場合、それらは、等張性媒体中で、すなわち血液と同じ張度を有し、細胞の凝集を防ぐ１又はそれより多い物質を含んでなる媒体中で製剤化されてもよい。適切な媒体の具体例は、３％までのヒト血清アルブミン(例えば２％までのヒト血清アルブミン又は１％までのヒト血清アルブミン)を含んでなる0.9％NaCl溶液である。静脈内投与のためには、投与すべき組成物中の腫瘍反応性Ｔリンパ球の濃度は、通常、約0.5百万リンパ球/ml媒体から約４百万リンパ球/ml媒体までの範囲、例えば、約0.5百万リンパ球/ml媒体から約３百万リンパ球/ml媒体までの範囲、約0.5百万リンパ球/ml媒体から約２百万リンパ球/ml媒体までの範囲又は約１百万リンパ球/ml媒体から約２百万リンパ球/ml媒体までの範囲にある。
【０１００】
腫瘍反応性Ｔリンパ球を含んでなる組成物は、単回用量又は多回用量として投与されてもよい。これは、１〜２時間にわたって注入されてもよい。
治療方法は、疾患の重篤度に依存して、１回行なわれてもよいし繰り返し行われてもよい。更に、治療は、疾患の再発に際して繰り返されてもよい。
【０１０１】
本発明に従う治療は、散在性ガンのための任意の他の関連治療で補充してもよい。そのような補充治療は、リンパ球の投与前、投与と同時又は投与後に行い得、その治療について通常使用される頻度で行われ得る。補充治療の適切な例は、化学療法などである。
【０１０２】
キット
本発明は更に、本発明に従う方法で使用するためのキットに関し、このキットは、Ｔリンパ球の培養用培地を含んでなる。この培地は、任意の適切な無血清培地、例えばAIMV、RPMI 1640、DMEM又はMEMであり得る。
【０１０３】
キットは更に、腫瘍反応性Ｔリンパ球の刺激、活性化及び方向付けのための１又はそれより多い物質を含んでなり得る。このような物質の例は、腫瘍由来抗原、IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質、Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質、Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る物質及び/又はTh1タイプＴリンパ球の発達を促進する物質であり得る。
【０１０４】
より具体的には、そのような物質は、IL-2、インターフェロン-α、抗IL-4抗体、抗IL-5抗体、抗IL-10抗体、IL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21であり得る。
キットはまた、静脈内投与に適切な医薬組成物を含んでなり得る。医薬組成物は、投与前に腫瘍反応性Ｔリンパ球の集団と混合されてもよい。
【０１０５】
キットはまた、１又はそれより多いシリンジとリンパ節探知体とを含んでなり得る。１つの実施形態では、シリンジにはリンパ節探知体が予め充填されている。
キットはまた、使用のための指示書(例えばコンピュータソフトウェアの形態の指示書)を含んでなり得る。
【０１０６】
図面の説明
図１は、鼠径部リンパ節転移に対して遠位で内側のメチネル節を示すリンパシンチグラフィーである。
図２は、頸部リンパ節転移に対して遠位で内側のメチネル節を示すリンパシンチグラフィーである。
【０１０７】
図３は、腫瘍を排液するリンパ節の同定を説明する。図3Aは、青色素が腫瘍の周りに注射される方法及び当該色素がどのように毛細リンパ管内を輸送されてリンパ排液(白矢印で示す)を示すのかを示す。図3Bは、腫瘍排液リンパ節がどのようにして該色素注射の数分後に青色になるかを示す。白色矢印が腫瘍排液リンパ節を示す。
【０１０８】
図４は、初めに、センチネル節リンパ球が腫瘍抗原と低用量のIL-2とで活性化され、その結果として活性化及び活性化マーカーCD25の発現を生じることを示す(上パネル)。フェーズＩ活性化フェーズの終わりは、CD25を発現するCD4+Ｔ細胞の数の減少により定義される(下パネル)。５％未満のCD4+Ｔ細胞がCD25を発現したときに、フェーズIIが抗原での再刺激により開始される。
【０１０９】
図５は、フェーズＩ及びフェーズIIの活性化により、CD4+Ｔヘルパー細胞の拡大及び富化が生じることを説明する。
図６は、フェーズＩにおいて、細胞の多数がナイーブCD62L+細胞又は活性化CD69+CD62L+細胞であることを説明する。フェーズII後、細胞の多数はCD62L-であり、メモリー及びエフェクターCD4+Ｔヘルパー細胞から構成される。CD62L-Ｔ細胞は、好ましいリンパ節ホーミング分子を発現しておらず、よってそれらは、非リンパ系器官の炎症領域を探し求める。
【０１１０】
図７は、フェーズＩで刺激された、腫瘍(腫瘍浸潤性リンパ球)、センチネル節(SN)及び無関係のリンパ節(LN)に由来する初代細胞は、IFN-γ産生をほとんど生じないことを示す。
図８は、フェーズii)後の拡大後、抗原依存性IFN-γ産生の用量依存的な増加が存在することを説明する。
図９は、TCR Vβ発現の選択的富化により研究されたように、拡大及び活性化プロトコールが抗原特異的Ｔ細胞クローンの拡大を促進することを説明する。
【実施例】
【０１１１】
以下の実施例は、本発明を説明することを意図し、如何なる様式でも本発明を制限するものではない。
実施例
実施例１
転移のメチネルリンパ節の同定
８人の患者(女性４人及び男性４人)が本研究に参加した(表１を参照)；平均年齢は61.4歳であった。このうち１人は２回の手術を受け、両方の処置でメチネル節が位置決めされた。メチネル節は、３つの原理的に異なる方法で位置決めされた。リンパ節探知体を、腹部の再発部、実質性肝臓転移、又は鼠径部リンパ節転移の周囲近傍に注射した。
【０１１２】
【表１】
【０１１３】
１人目の患者は、以前に盲腸ガンのために右側結腸半切除の手術を受けた48歳男性であった。１年後、彼は、腸間膜脂肪で吻合領域に沿って５cm大の腹腔内再発を発症した。吻合領域及び再発部の切除を一括して行った。転移の周りにパテントブルー色素を注射し、内側結腸動脈に沿って３つのメチネル節(腸間膜の根元の上リンパ節を含む)を同定した。
【０１１４】
２人目の患者は、直腸ガンのために腹会陰式直腸切断術の手術を受けた54歳男性であった。手術前の検査では遠位転移はなかったにもかかわらず、本発明者らは、肝臓左葉に肝臓転移を見出した。腹部CTスキャンを手術後に行った。転移は、外径３cmであり、肝臓の第２区域と第３区域との間に位置していた。２ヵ月後、彼は、部分的な左側肝臓切除の手術を受けた。パテントブルー色素を肝臓実質部で転移の周囲近傍に注射した。約５分後、肝十二指腸間膜に２つのメチネル節を見出した。手術中の超音波検査では、肝臓内に更なる転移は証明できなかった。メチネル節には腫瘍細胞は存在しなかった；しかし、メチネル節中のリンパ球は、転移に対して特異的な活性を示した。
【０１１５】
腫瘍反応性リンパ球での最初の治療及び良好な全身状態にもかかわらず、彼は肝臓右葉に新たな肝臓転移を発症し、２回目の肝臓切除を行った。この手術で、２cm大の転移の周囲へパテントブルー色素を注射することにより、肝臓の門に位置する２つのメチネル節を同定した。
【０１１６】
３人目の患者は、２年前にＳ状結腸ガンのためにＳ状結腸切除の手術を受けた77歳女性であった。フォローアップで、CEAの亢進が見出され、PETスキャン及びCTスキャンによる更なる検査により、肝臓右葉でVI区域とVII区域との間に４cmの転移が示された。部分的右側肝切除を行い、パテントブルー色素の注射後、３つのメチネル節を肝臓の門に見出した。
【０１１７】
患者番号４は、Ｓ状結腸の腫瘍のためにＳ状結腸切除の手術を受けた73歳男性であった。１年以上後に、彼は、２cm大の孤立性肝臓転移を発症し、Ｖ区域及びVI区域の部分的切除の手術を受けた。転移の周囲近傍の４つの異なる位置での計1.0mlのパテントブルー色素の注射後、肝臓門に１つのメチネル節を同定した。この節の分析により、転移性疾患の徴候はないが、腫瘍反応性リンパ球を含有していることが判った。
【０１１８】
患者番号５は、以前に上行結腸のガンのために右側結腸半切除の手術を受けた66歳男性であった。結腸ガン手術後のルーチンのフォローアップでのCTスキャンにより、肝臓右葉でVII区域に2.5cmの孤立性転移が示された。手術時に、1.0mlのパテントブルー色素を肝臓組織中の転移の周囲に注射した。肝十二指腸間膜に２つ及び肝臓門に２つのメチネル節が位置していた。VI区域〜VIII区域の切除を、メチネル節の摘出と共に行った。
【０１１９】
第６の症例は、６年前に卵巣ガンのために子宮摘出及び両側卵管卵巣摘出の手術を受けた51歳女性であった。その後、ガンは腹部及び腹膜に広がり、待期療法のみが続けられた。彼女は、大きな部分的壊死性の肝臓転移を有していた。手術時に、肝臓転移の隣接部へのパテントブルー色素の注射後、腹部中央に３つのメチネル節を同定した。メチネル節は全て腫瘍細胞及び腫瘍反応性リンパ球を含有していた。
【０１２０】
患者番号７は、卵巣ガンのために、両側卵巣摘出の手術を受けた63歳女性であった。手術時、彼女は、網への散在性ガン疾患を有しており、この後、数回の腫瘍削減手術(転移に起因する右結腸の切除を含む)を受けた。更に１年後、彼女は、左鼠径部に発症し、細針生検により、卵巣ガンからの転移と判明した。トレーサーたるテクネチウム-99を皮下に触知可能な転移の周りの４箇所で注射後(４×0.25ml，50MBeq/ml)、驚くべきことに、リンパシンチグラフィーにより、鼠径部リンパ節転移に対して遠位で内側に共に接近した２つのメチネル節が証明された(図１を参照)。この節は、更に、リンパシンチグラフィーの数時間後の外科的手順の間にトレーサーと同じ場所にパテントブルー色素を注射することにより、青色に着色した転移を排液するメチネル節と同定された。
【０１２１】
８人目の患者は、膵臓ガンのためにホウィップル手術を受けた59歳女性であった。２年後、局所的な再発が診断され、彼女は、腫瘍削減手術を受けた。手術中、当該局所再発の隣接部でかつ上部にパテントブルー色素を注射後、４つのメチネル節を見出した。
【０１２２】
サイトケラチン抗体を使用して、悪性細胞を検出した。転移を有しない節中のリンパ球は、増殖アッセイにおいて、腫瘍ホモジネートによる刺激に際してインターフェロン-γを分泌する能力により示されるように、自発的に活性化された。転移性メチネル節からのリンパ球は、最初、この刺激に対して乏しい反応を示した。このことは、これらが転移により免疫抑制されたことを示唆する。しかし、非転移性節及び転移性節からの細胞は共に、実施例２に記載のように、インビトロで多数に拡大させることができた。
【０１２３】
実施例２
腫瘍反応性Ｔリンパ球の拡大
本明細書に記載の方法を用いてメチネル節の同定を行った。
メチネルリンパ節及び非メチネルリンパ節を半分に切断し、節の一部を、ルーチンの手順に従う組織学的検査に送った。転移の一部(侵襲マージン(invasive margin)のサンプルを含む)を取り出して、更なる手順の間の抗原供給源として使用した。
【０１２４】
細胞培養
フェーズＩ、最初の活性化
メチネル節材料を氷上に維持し、毎回直ぐにAIM V(登録商標)培地(Invitrogen)を用いて処理した。ルーズフィットのガラスホモジネーター中での穏やかなホモジネーションによりメチネル節リンパ球の単一細胞懸濁物を取得し、ホモジネーション後、細胞を培地中で２回洗浄した。メチネル節リンパ球を４百万細胞/mlで細胞培養フラスコに入れ、インターロイキン-２(IL-2)(Proleukin(登録商標)、Chiron)を240 IU/ml培地の濃度まで添加した。
【０１２５】
５容量(w/v)の２×PBS中でのUltra Turraxを用いたホモジネーション、続いて97℃で５分間の変性により、自己由来転移抽出物を調製した。細胞培養の開始３〜４日後、自己由来腫瘍抽出物を1/100の濃度で添加した。長期培養には、細胞を細胞インキュベーター中で37℃で５％CO2に維持し、240 IU IL-2/mL培地を３〜４日毎に添加した。
【０１２６】
フェーズII、活性化及び拡大
18〜22日後、細胞培養物をCD25の発現に関してモニターした。CD25発現細胞の数が５％を下回って減少したとき、フェーズII(図４)において、濃度１/100の自己由来転移抽出物の添加により細胞を再刺激した。効率的な抗原提示のためには、自己由来PBMCを、Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences、GE Healthcare)を使用して集め、2500ラドで照射し、細胞培養物に添加した。再刺激の３日後、インターフェロン-α(Introna)を濃度100〜500 IU/mlで、抗IL-4抗体を２μg/mlの濃度で添加した。５〜８日後、IFN-γ産生Th1細胞の誘導を促進するために、IL-12(４ng/ml)を添加して拡大させた。
【０１２７】
患者への輸注(transfusion)の前日に、培養物中の生存細胞を取り出すために、細胞培養物を、Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences、GE Healthcare)を使用する精製に付した。輸注当日、細胞を生理食塩水溶液(Natriumklorid Baxter Viaflo 9 mg/ml、Baxter)中で２回洗浄し、次いで100〜200mlの生理食塩水溶液及び１％ヒト血清アルブミン(Baxter)を含有する輸送バッグに移した。輸注の前に、微生物の存在についての検査を行った。細胞の注入(infusion)は、医学専門家の監督の下で１〜２時間の間行った。
【０１２８】
免疫学的評価
トリチウム標識チミジン取込み増殖アッセイを用いて更なる免疫学的評価を行った。メチネル節リンパ球のアリコートをこの目的に取り置き、ルーズフィットガラスホモジネーターにおける穏やかな押付けにより非メチネル節リンパ球の単一細胞懸濁物を取得し、Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences、GE Healthcare)により末梢血白血球を精製した。
【０１２９】
細胞を再懸濁し、2.5％ウシ胎仔血清(FCS)(Life technologies)を含有するRPMI 1640(Life technologies)中で２回洗浄した。最後に、細胞を、10％ヒトAB血清(Sigma)、１％ペニシリン-ストレプトマイシン(Sigma)及び１％グルタミン(Sigma)を含有するRPMI 1640増殖培地中に再懸濁した。リンパ節細胞及び精製したPBLを96-ウェルプレート中３×105細胞/ウェルで使用し、３連で(in triplicates)１/100、１/10に希釈した転移ホモジネート又はCon A 10μg/ml(Sigma)で刺激した。５日目、６日目及び７日目に、採取の18時間前に、１μCiの3H-チミジン/ウェル(Amersham)を添加することにより増殖を測定した。サンプルをシンチレーションカウンティングに付した。
【０１３０】
細胞培養の開始時、IFN-γ分泌測定のためのリンパ節細胞及びPBLの刺激を、１/10及び１/100に希釈した腫瘍ホモジネート又はCon A 10μg/ml(Sigma)を用い、96-ウェルプレート中３×105細胞/ウェルで３連で行った。プールした３連のサンプル中の培養上清について、分泌IFN-γの量をELISA(Human IFN-γ Duoset、R&D Systems)で測定した(図７)。細胞培養の終わりに、上清のサンプルを取出し、３連でIFN-γ及びIL-4分泌をELISA(human IFN-γ Duoset及びhuman IL-4 Duoset、R&D Systems)で測定した(図8A及び8B)。
【０１３１】
フローサイトメトリー分析
初めにメチネル節、非メチネル節、PBMCからの細胞及び転移からの細胞について、フローサイトメトリーを使用して細胞の特徴づけを行った。培養中のメチネル節で獲得したリンパ球から、フローサイトメトリー分析のために、サンプルを２〜３週間毎に採取した。細胞を、２％FCS及び0.05％NaN3を補充したPBS(FACS緩衝液)中で、免疫細胞亜集団のマーカー及びリンパ球活性化のマーカーに対する抗体と共に30分間インキュベートした(図５、６及び７)。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)に接合した、以下のマーカーに対する抗体：CD69、HLA-DR、CD45RA、CD25；フィコエリトリン(PE)に接合した、以下のマーカーに対する抗体：CD62L、CD19、CD45RO、CD56；ペリニジン-クロロフィル-タンパク質(PerCP)に接合した、以下のマーカーに対する抗体：CD8、CD3；アロフィコシアニン(APC)に接合した、以下のマーカーに対する抗体：CD4、CD14、CD8を使用した。
【０１３２】
Beta mark kit(Beckman Coulter)を使用してVβ-レパートリーを検査し、５×105細胞/試験管を、FITCとPEと二色FITC-PE接合TCR Vβ抗体との混合物を含む10μlの８つの異なるバイアル中で、各試験管にCD8 PerCP及びCD4 APCを添加して染色した(図９)。
【０１３３】
実施例３
拡大した転移反応性Ｔリンパ球を投与することによる転移の治療
以下の３つの症例は、メチネルリンパ節から得られ拡大されたＴリンパ球を散在性ガンの治療に使用し得ることを説明するためのものである。
【０１３４】
47歳男性は、以前に、盲腸における結腸ガンのために右側結腸半切除の手術を受けた。１年後、彼は、吻合領域の外側の腸間膜脂肪に５cm大の腹腔内再発を発症した。手術の間に、転移の周囲の脂肪に近接してパテントブルー色素を注射し、内側結腸動脈に沿って３つのメチネル節(腸間膜の根元の１つの上リンパ節を含む)を同定した。吻合領域及び再発の切除を一括して行った。手術後、メチネル節及び転移の侵襲部分を切り分け、本明細書に記載のように処理した。転移反応性リンパ球を多数に拡大した。手術の約４週間後、これら自己由来CD4+Ｔ細胞を患者に輸注した。通常の胸部及び腹部CTスキャンの施行により転移の徴候は見出せず、CEAレベル(腫瘍マーカー)が正常であったため、彼は完全な健康状態であった。今まで、輸注後フォローアップは36ヶ月である。
【０１３５】
63歳女性は、卵巣ガンのために両側卵巣摘出の手術を受けた。手術時に、彼女は、網への散在性ガン疾患を有しており、数回の腫瘍削減手術(転移に起因する右結腸の切除を含む)を受けた。１年後、彼女は、左鼠径部に発症し、細針生検により、卵巣ガンからの転移と判明した。リンパシンチグラフィーにより、鼠径部リンパ節転移に対して遠位で内側に共に接近した２つのメチネル節が証明された(図１を参照)。この節は、パテントブルー色素との組合せでのテクネチウム-99m及びγ線検出管の使用により、位置決めされた。節及び転移は上記と同じ原理に従って処理された。治療の７ヵ月後、患者は健康でフルタイムで働いている。腫瘍マーカーCA135は、多数から少数に減少している。
【０１３６】
第３の例は54歳男性であり、下部直腸ガンのために腹会陰式直腸切断術の手術を受けていた。手術時、(手術前の陰性肝臓スキャンにもかかわらず)左葉の肝臓転移を同定した。更に６週間後、彼は、左側肝臓切除の手術を受けた。パテントブルー色素を肝臓実質部で転移の周囲に注射した。数分後、肝十二指腸間膜で、２つのメチネル節が青色に変わった。メチネル節で転移は検出されなかったが、それらは全て腫瘍に対する活性を示した。患者は、該メチネル節に由来する拡大された腫瘍反応性リンパ球で治療された。腫瘍反応性リンパ球での最初の治療及び良好な全身状態にもかかわらず、彼は肝臓右葉に新たな肝臓転移を発症した。２回目の肝臓切除を行った。この手術で、２cm大の転移の周囲へのパテントブルー色素の注射により、肝臓の門に位置する２つのメチネル節が同定された。彼は、新たなメチネル節に由来する腫瘍反応性リンパ球の輸注で再度治療された。患者は完全に回復し、フルタイムで働いている。CT画像によれば、彼は、肝臓に幾つかの残存疾患を有し、腫瘍マーカー(CEA)が少し亢進している。最初のリンパ球輸注以来の合計のフォローアップは36ヶ月である。
【０１３７】
参考文献
Marits Pら．Detection of immune responses against urinary bladder cancer in sentinel lymph nodes. Eur Urol 採用
Moore KL．Clinically oriented anatomy. Baltimore: Williams and Wilkins. 1985. p42-p45.
Renkins EM．Some consequences of capillary permaebility to macromolecules: Starling's hypothesis reconsidered. Am J Physiology. 1986;250:H706-H710.
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】鼠径部リンパ節転移に対して遠位で内側のメチネル節を示すリンパシンチグラフィーである。
【図２】頸部リンパ節転移に対して遠位で内側のメチネル節を示すリンパシンチグラフィーである。
【図３Ａ】青色素が腫瘍の周りに注射される方法及び当該色素がどのように毛細リンパ管内を輸送されてリンパ排液(白矢印で示す)を示すのかを示す。
【図３Ｂ】腫瘍排液リンパ節がどのようにして該色素注射の数分後に青色になるかを示す。
【図４】初めに、センチネル節リンパ球が腫瘍抗原と低用量のIL-2とで活性化され、その結果として活性化及び活性化マーカーCD25の発現を生じることを示す(上パネル)。フェーズＩ活性化フェーズの終わりは、CD25を発現するCD4+Ｔ細胞の数の減少により定義される(下パネル)。
【図５】フェーズＩ及びフェーズIIの活性化により、CD4+Ｔヘルパー細胞の拡大及び富化が生じることを説明する。
【図６】フェーズＩにおいて、細胞の多数がナイーブCD62L+細胞又は活性化CD69+CD62L+細胞であることを説明する。
【図７】フェーズＩで刺激された、腫瘍(腫瘍浸潤性リンパ球)、センチネル節(SN)及び無関係のリンパ節(LN)に由来する初代細胞は、IFN-γ産生をほとんど生じないことを示す。
【図８】フェーズii)後の拡大後、抗原依存性IFN-γ産生の用量依存的な増加が存在することを説明する。
【図９】TCR Vβ発現の選択的富化により研究されたように、拡大及び活性化プロトコールが抗原特異的Ｔ細胞クローンの拡大を促進することを説明する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ)患者において、１又はそれより多いメチネルリンパ節を同定し、
ii)該１又はそれより多い節と、任意に転移の全て又は一部とを切除し、
iii)該リンパ節から転移反応性Ｔリンパ球を単離し、
iv)該転移反応性Ｔリンパ球をインビトロ拡大し、
ｖ)こうして取得されたＴリンパ球を該患者に投与する
ことを含んでなり、該Ｔリンパ球はCD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球である、散在性ガンに罹患している患者を治療する方法。
【請求項２】
前記ガンが、任意の解剖学的位置にある上皮性起源、間葉性起源又は胎生学的起源の任意の充実性新生物、例えば、上皮性新生物については、例えば胸部、結腸、膵臓、膀胱、小腸、前立腺、子宮頸、外陰部、卵巣のガン腫のような新生物；間葉性新生物については、例えば関節、骨、筋肉及び腱の肉腫のような新生物、並びにリンパ腫のような幾つかの血液学的新生物；胎生学的新生物については、例えば奇形腫のような新生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記メチネルリンパ節が、工程ｉ)において、前記患者に１又はそれより多いリンパ節探知体を注射することにより同定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記１又はそれより多いリンパ節探知体が親和性ベースである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記１又はそれより多いリンパ節探知体が非親和性ベースである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記１又はそれより多いリンパ節探知体が、転移の中、上、周り、近傍及び/又は下に注射される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記１又はそれより多いリンパ節探知体が単回注射により注射される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記１又はそれより多いリンパ節探知体が多回注射により注射される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記１又はそれより多いリンパ節探知体が非外科的手順により注射される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記１又はそれより多いリンパ節探知体が外科的手順の一部として注射される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記インビトロ拡大工程iv)が、
ｉ)腫瘍反応性CD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球を、腫瘍由来抗原とIL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する少なくとも１つの物質とで刺激して、腫瘍反応性CD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球の生存を促進する第１のフェーズ；及び
ii)腫瘍反応性CD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球の成長を活性化し促進する第２のフェーズ
を含んでなり、該第２のフェーズii)は、Ｔリンパ球上でCD25細胞表面マーカー(すなわちIL-2Rマーカー)がダウンレギュレートされたときに開始される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ダウンレギュレーションが、前記Ｔリンパ球集団の５％又はそれ未満がCD25を発現することとして規定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｔリンパ球が培養培地中に存在する、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記培養培地が例えばAIMV培地のような無血清培地である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のフェーズｉ)が、前記IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する少なくとも１つの物質を添加することにより開始される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質がIL-2である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
IL-2が、例えば約100 IU/ml培養培地〜約700 IU/ml培養培地、約100 IU/ml培養培地〜約600 IU/ml培養培地、約100 IU/ml培養培地〜約500 IU/ml培養培地、約100 IU/ml培養培地〜約400 IU/ml培養培地、約100 IU/ml培養培地〜約300 IU/ml培養培地、及び約100 IU/ml培養培地〜約200 IU/ml培養培地のような低用量で添加される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する少なくとも１つの物質の更なる量が、例えばフェーズｉ)の２日毎、３日毎又は４日毎のように、フェーズｉ)を通して定期的に添加される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質がIL-2である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
添加されるIL-2の濃度が、約100 IU/ml培養培地〜約700 IU/ml培養培地、約100 IU/ml培養培地〜約600 IU/ml培養培地、約100 IU/ml培養培地〜約500 IU/ml培養培地、約100 IU/ml培養培地〜約400 IU/ml培養培地、約100 IU/ml培養培地〜約300 IU/ml培養培地、及び約100 IU/ml培養培地〜約200 IU/ml培養培地である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記腫瘍由来抗原が、例えば２日目、３日目、４日目又は５日目のように、前記第１のフェーズｉ)の２日目から５日目まで(５日目を含む)に添加される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記腫瘍由来抗原が、フェーズｉ)の開始と本質的に同時又はその最大３日後までに添加される、請求項１１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記腫瘍由来抗原が腫瘍の変性ホモジネートである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記腫瘍由来抗原がタンパク質、ポリペプチド又はペプチドである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２のフェーズii)が、例えば17日目、18日目、19日目、20日目、21日目、22日目又は23日目のように、前記第１のフェーズｉ)の17日目から23日目まで(23日目を含む)に開始される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２のフェーズが、腫瘍反応性CD25陰性Ｔリンパ球を活性化するために、前記Ｔリンパ球に腫瘍由来抗原を添加することにより開始される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記腫瘍由来抗原が腫瘍の変性ホモジネートである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記腫瘍由来抗原が腫瘍タンパク質、ポリペプチド又はペプチドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
抗原提示細胞を前記腫瘍由来抗原と共に前記Ｔリンパ球へ添加することを更に含んでなる、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗原提示細胞が、抗原提示Ｂ細胞及び/又は単球を含有する照射された末梢血白血球である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２のフェーズii)が、前記Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る少なくとも１つの物質を添加することを含んでなる、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質が、インターフェロンレセプターに対するアゴニスト活性を有する物質である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記インターフェロンレセプターに対するアゴニスト活性を有する物質がインターフェロンである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記インターフェロンレセプターに対するアゴニスト活性を有する物質がインターフェロン-αである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
例えばインターフェロンレセプターに対するアゴニスト活性を有する物質のような前記Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質が、IL-12のレベルが、フェーズii)の１日目のIL-12のレベルと比較して、例えば少なくとも２倍増加、少なくとも３倍増加、少なくとも４倍増加、又は少なくとも５倍増加のように、少なくとも１倍増加したときに添加される、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
例えばインターフェロンレセプターに対するアゴニスト活性を有する物質のような前記Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質が、例えば２日目、３日目又は４日目のように、前記第２のフェーズii)の開始後２日目から４日目まで(４日目を含む)に添加される、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記第２のフェーズii)が、Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る１又はそれより多い物質を添加することを含んでなる、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る１又はそれより多い物質が、IL-4、IL-5、IL-10及び/又はTGF-βを中和し得る１又はそれより多い物質である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記IL-4、IL-5、IL-10及び/又はTGF-βを中和し得る１又はそれより多い物質が、抗IL-4抗体、抗IL-5抗体及び/又は抗IL-10抗体である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
例えばIL-4、IL-5、IL-10及び/又はTGF-βを中和し得る１又はそれより多い物質のような前記Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る１又はそれより多い物質が、前記第２のフェーズii)の１日目に添加される、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
例えばIL-4、IL-5、IL-10及び/又はTGF-βを中和し得る１又はそれより多い物質のような前記Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る１又はそれより多い物質が、前記Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質の添加後の後続の工程で添加される、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
例えばIL-4、IL-5、及び/又はIL-10を中和し得る１又はそれより多い物質のような前記Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る１又はそれより多い物質が、前記Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質の添加の１日後に添加される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
例えばIL-4、IL-5、IL-10及び/又はTGF-βを中和し得る１又はそれより多い物質のような前記Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る１又はそれより多い物質の更なる量が、フェーズii)を通して定期的に添加される、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
例えばIL-4、IL-5、IL-10及び/又はTGF-βを中和し得る１又はそれより多い物質のような前記Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る１又はそれより多い物質の更なる量が、フェーズii)の２日毎、３日毎又は４日毎に添加される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
IL-12レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質の更なる量が、フェーズii)を通して定期的に添加される、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質が、例えば３日毎のように、フェーズii)の２日毎、３日毎又は４日毎に添加される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質がIL-2である、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記第２のフェーズii)が、Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する１又はそれより多い物質を添加することを含んでなる、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する１又はそれより多い物質が、IL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記１又はそれより多い物質が、IL-7、IL-12、IL-15及びIL-21から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
例えばIL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質のようなTh1タイプＴリンパ球の発達を促進する１又はそれより多い物質が、IFN-γのレベルが第２のフェーズii)の開始時のIFN-γのレベルと比較して増加したときに添加される、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記IFN-γの増加レベルが、前記第２のフェーズii)の開始時のIFN-γのレベルと比較して、例えば少なくとも２倍増加、少なくとも３倍増加、少なくとも４倍増加のように、IFN-γレベルの少なくとも１倍増加として決定される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
例えばIL-12、IL-15及び/又はIL-21レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質のような前記Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する１又はそれより多い物質が、CD25及び/又はCD69がダウンレギュレートされたときに添加される、請求項４８〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
添加される、例えばIL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質のような前記Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する１又はそれより多い物質の各々の濃度が、例えば250 IU/ml培養培地のように、約150 IU/ml培養培地〜約300 IU/ml培養培地である、請求項４８〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
例えばIL-12、IL-15及び/又はIL-21レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質のような前記Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する１又はそれより多い物質が、５日目、６日目、７日目又は８日目のように、前記第２のフェーズii)の開始後５日目から８日目まで(８日目を含む)に添加される、請求項４８〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
CD4+ヘルパーＴリンパ球の製造のための、請求項１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
エフェクターＴリンパ球の製造のための、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
メモリーＴリンパ球の製造のための、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
Th1タイプＴリンパ球の製造のための、請求項１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記Ｔリンパ球上での例えばCD25及び/又はCD69のような細胞表面マーカーの発現を、前記第１のフェーズｉ)の間及び前記第２のフェーズii)の間に継続してモニターすることを更に含んでなる、請求項１〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記Ｔリンパ球が、前記第２のフェーズii)においてＴリンパ球上のCD25がダウンレギュレートされたときに採集される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記Ｔリンパ球が、Ｔリンパ球上のCD25がダウンレギュレートされたとき、少なくとも１回の追加のフェーズii)に付される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ダウンレギュレーションが、前記CD4陽性Ｔリンパ球集団の５％又はそれ未満がCD25を発現することとして規定される、請求項６１又は６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記腫瘍反応性Ｔリンパ球が、前記第２のフェーズii)の開始後10日目から14日目まで(14日目を含む)に採集される、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記腫瘍反応性Ｔリンパ球が採集後に精製される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記第２のフェーズii)で得られた前記腫瘍反応性Ｔリンパ球を凍結させる工程を更に含んでなる、請求項１〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記Ｔリンパ球が、原発腫瘍及び/又は転移を排液するリンパ節に由来するか又は血液に由来する、請求項１〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
工程iv)の前記腫瘍反応性Ｔリンパ球が、静脈内、動脈内、鞘内、又は腹腔内に投与される、請求項１〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
投与される前記腫瘍反応性Ｔリンパ球の量が、例えば少なくとも20百万、少なくとも30百万、少なくとも40百万、少なくとも50百万、少なくとも60百万、少なくとも70百万又は少なくとも80百万のような少なくとも10百万である、請求項１〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
投与される前記腫瘍反応性Ｔリンパ球が、エフェクターＴリンパ球とメモリーＴリンパ球との組合せである、請求項１〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
エフェクターＴリンパ球の割合が、例えば約20％〜約50％又は約30％〜約40％のような約10％〜約65％である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記腫瘍反応性Ｔリンパ球が自己由来である、請求項１〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記腫瘍反応性Ｔリンパ球が非自己由来である、請求項１〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
請求項１〜７３のいずれか１項に記載の方法により製造される腫瘍反応性Ｔリンパ球。
【請求項７５】
CD4+Ｔリンパ球である、請求項７４に記載の腫瘍反応性Ｔリンパ球。
【請求項７６】
エフェクターＴリンパ球である、請求項７４又は７５に記載の腫瘍反応性Ｔリンパ球。
【請求項７７】
メモリーＴリンパ球である、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の腫瘍反応性Ｔリンパ球。
【請求項７８】
Th1タイプＴリンパ球である、請求項７４〜７７のいずれか１項に記載の腫瘍反応性Ｔリンパ球。
【請求項７９】
散在性ガンの治療用医薬の製造のための、請求項７４〜７８のいずれか１項に記載の腫瘍反応性Ｔリンパ球の使用。
【請求項８０】
Ｔリンパ球の培養用培地を含んでなる、請求項１〜７３のいずれか１項に記載の方法で使用するキット。
【請求項８１】
腫瘍反応性Ｔリンパ球を刺激し、活性化し及び方向付けるための１又はそれより多い物質を更に含んでなる、請求項８０に記載のキット。
【請求項８２】
前記培地が、例えばAIMV、RPMI 1640、DMEM又はMEMのような無血清培地である、請求項８０又は８１に記載のキット。
【請求項８３】
前記腫瘍反応性Ｔリンパ球を刺激し、活性化し及び方向付けるための１又はそれより多い物質が、腫瘍由来抗原、IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質、前記Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質、Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る物質及びTh1タイプＴリンパ球の発達を促進する物質から選択される、請求項８０〜８２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８４】
前記腫瘍反応性Ｔリンパ球を刺激し、活性化し及び方向付けるための１又はそれより多い物質が、IL-2、インターフェロン-α、抗IL-4抗体、抗IL-5抗体、抗IL-10抗体、IL-7、IL-12、IL-15及びIL-21を含んでなる群より選択される、請求項８０〜８３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８５】
静脈内投与に適切な医薬組成物を含んでなる、請求項８０〜８４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８６】
シリンジ及びリンパ節探知体を含んでなる、メチネルリンパ節の検出用キット。
【請求項８７】
リンパ節探知体を予め充填したシリンジを含んでなる、メチネルリンパ節の検出用キット。
【請求項８８】
使用指示書を更に含んでなる、請求項８０〜８７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８９】
前記指示書がコンピュータソフトウェアの形態である、請求項８８に記載のキット。
【請求項１】
ｉ)患者において、１又はそれより多いメチネルリンパ節を同定し、
ii)該１又はそれより多い節と、任意に転移の全て又は一部とを切除し、
iii)該リンパ節から転移反応性Ｔリンパ球を単離し、
iv)該転移反応性Ｔリンパ球をインビトロ拡大し、
ｖ)こうして取得されたＴリンパ球を該患者に投与する
ことを含んでなり、該Ｔリンパ球はCD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球である、散在性ガンに罹患している患者を治療する方法。
【請求項２】
前記ガンが、任意の解剖学的位置にある上皮性起源、間葉性起源又は胎生学的起源の任意の充実性新生物、例えば、上皮性新生物については、例えば胸部、結腸、膵臓、膀胱、小腸、前立腺、子宮頸、外陰部、卵巣のガン腫のような新生物；間葉性新生物については、例えば関節、骨、筋肉及び腱の肉腫のような新生物、並びにリンパ腫のような幾つかの血液学的新生物；胎生学的新生物については、例えば奇形腫のような新生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記メチネルリンパ節が、工程ｉ)において、前記患者に１又はそれより多いリンパ節探知体を注射することにより同定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記１又はそれより多いリンパ節探知体が親和性ベースである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記１又はそれより多いリンパ節探知体が非親和性ベースである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記１又はそれより多いリンパ節探知体が、転移の中、上、周り、近傍及び/又は下に注射される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記１又はそれより多いリンパ節探知体が単回注射により注射される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記１又はそれより多いリンパ節探知体が多回注射により注射される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記１又はそれより多いリンパ節探知体が非外科的手順により注射される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記１又はそれより多いリンパ節探知体が外科的手順の一部として注射される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記インビトロ拡大工程iv)が、
ｉ)腫瘍反応性CD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球を、腫瘍由来抗原とIL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する少なくとも１つの物質とで刺激して、腫瘍反応性CD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球の生存を促進する第１のフェーズ；及び
ii)腫瘍反応性CD4+ヘルパー及び/又はCD8+Ｔリンパ球の成長を活性化し促進する第２のフェーズ
を含んでなり、該第２のフェーズii)は、Ｔリンパ球上でCD25細胞表面マーカー(すなわちIL-2Rマーカー)がダウンレギュレートされたときに開始される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ダウンレギュレーションが、前記Ｔリンパ球集団の５％又はそれ未満がCD25を発現することとして規定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｔリンパ球が培養培地中に存在する、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記培養培地が例えばAIMV培地のような無血清培地である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のフェーズｉ)が、前記IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する少なくとも１つの物質を添加することにより開始される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質がIL-2である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
IL-2が、例えば約100 IU/ml培養培地〜約700 IU/ml培養培地、約100 IU/ml培養培地〜約600 IU/ml培養培地、約100 IU/ml培養培地〜約500 IU/ml培養培地、約100 IU/ml培養培地〜約400 IU/ml培養培地、約100 IU/ml培養培地〜約300 IU/ml培養培地、及び約100 IU/ml培養培地〜約200 IU/ml培養培地のような低用量で添加される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する少なくとも１つの物質の更なる量が、例えばフェーズｉ)の２日毎、３日毎又は４日毎のように、フェーズｉ)を通して定期的に添加される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質がIL-2である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
添加されるIL-2の濃度が、約100 IU/ml培養培地〜約700 IU/ml培養培地、約100 IU/ml培養培地〜約600 IU/ml培養培地、約100 IU/ml培養培地〜約500 IU/ml培養培地、約100 IU/ml培養培地〜約400 IU/ml培養培地、約100 IU/ml培養培地〜約300 IU/ml培養培地、及び約100 IU/ml培養培地〜約200 IU/ml培養培地である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記腫瘍由来抗原が、例えば２日目、３日目、４日目又は５日目のように、前記第１のフェーズｉ)の２日目から５日目まで(５日目を含む)に添加される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記腫瘍由来抗原が、フェーズｉ)の開始と本質的に同時又はその最大３日後までに添加される、請求項１１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記腫瘍由来抗原が腫瘍の変性ホモジネートである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記腫瘍由来抗原がタンパク質、ポリペプチド又はペプチドである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２のフェーズii)が、例えば17日目、18日目、19日目、20日目、21日目、22日目又は23日目のように、前記第１のフェーズｉ)の17日目から23日目まで(23日目を含む)に開始される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２のフェーズが、腫瘍反応性CD25陰性Ｔリンパ球を活性化するために、前記Ｔリンパ球に腫瘍由来抗原を添加することにより開始される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記腫瘍由来抗原が腫瘍の変性ホモジネートである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記腫瘍由来抗原が腫瘍タンパク質、ポリペプチド又はペプチドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
抗原提示細胞を前記腫瘍由来抗原と共に前記Ｔリンパ球へ添加することを更に含んでなる、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗原提示細胞が、抗原提示Ｂ細胞及び/又は単球を含有する照射された末梢血白血球である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２のフェーズii)が、前記Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る少なくとも１つの物質を添加することを含んでなる、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質が、インターフェロンレセプターに対するアゴニスト活性を有する物質である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記インターフェロンレセプターに対するアゴニスト活性を有する物質がインターフェロンである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記インターフェロンレセプターに対するアゴニスト活性を有する物質がインターフェロン-αである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
例えばインターフェロンレセプターに対するアゴニスト活性を有する物質のような前記Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質が、IL-12のレベルが、フェーズii)の１日目のIL-12のレベルと比較して、例えば少なくとも２倍増加、少なくとも３倍増加、少なくとも４倍増加、又は少なくとも５倍増加のように、少なくとも１倍増加したときに添加される、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
例えばインターフェロンレセプターに対するアゴニスト活性を有する物質のような前記Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質が、例えば２日目、３日目又は４日目のように、前記第２のフェーズii)の開始後２日目から４日目まで(４日目を含む)に添加される、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記第２のフェーズii)が、Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る１又はそれより多い物質を添加することを含んでなる、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る１又はそれより多い物質が、IL-4、IL-5、IL-10及び/又はTGF-βを中和し得る１又はそれより多い物質である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記IL-4、IL-5、IL-10及び/又はTGF-βを中和し得る１又はそれより多い物質が、抗IL-4抗体、抗IL-5抗体及び/又は抗IL-10抗体である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
例えばIL-4、IL-5、IL-10及び/又はTGF-βを中和し得る１又はそれより多い物質のような前記Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る１又はそれより多い物質が、前記第２のフェーズii)の１日目に添加される、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
例えばIL-4、IL-5、IL-10及び/又はTGF-βを中和し得る１又はそれより多い物質のような前記Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る１又はそれより多い物質が、前記Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質の添加後の後続の工程で添加される、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
例えばIL-4、IL-5、及び/又はIL-10を中和し得る１又はそれより多い物質のような前記Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る１又はそれより多い物質が、前記Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質の添加の１日後に添加される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
例えばIL-4、IL-5、IL-10及び/又はTGF-βを中和し得る１又はそれより多い物質のような前記Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る１又はそれより多い物質の更なる量が、フェーズii)を通して定期的に添加される、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
例えばIL-4、IL-5、IL-10及び/又はTGF-βを中和し得る１又はそれより多い物質のような前記Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る１又はそれより多い物質の更なる量が、フェーズii)の２日毎、３日毎又は４日毎に添加される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
IL-12レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質の更なる量が、フェーズii)を通して定期的に添加される、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質が、例えば３日毎のように、フェーズii)の２日毎、３日毎又は４日毎に添加される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質がIL-2である、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記第２のフェーズii)が、Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する１又はそれより多い物質を添加することを含んでなる、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する１又はそれより多い物質が、IL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記１又はそれより多い物質が、IL-7、IL-12、IL-15及びIL-21から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
例えばIL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質のようなTh1タイプＴリンパ球の発達を促進する１又はそれより多い物質が、IFN-γのレベルが第２のフェーズii)の開始時のIFN-γのレベルと比較して増加したときに添加される、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記IFN-γの増加レベルが、前記第２のフェーズii)の開始時のIFN-γのレベルと比較して、例えば少なくとも２倍増加、少なくとも３倍増加、少なくとも４倍増加のように、IFN-γレベルの少なくとも１倍増加として決定される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
例えばIL-12、IL-15及び/又はIL-21レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質のような前記Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する１又はそれより多い物質が、CD25及び/又はCD69がダウンレギュレートされたときに添加される、請求項４８〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
添加される、例えばIL-7、IL-12、IL-15及び/又はIL-21レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質のような前記Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する１又はそれより多い物質の各々の濃度が、例えば250 IU/ml培養培地のように、約150 IU/ml培養培地〜約300 IU/ml培養培地である、請求項４８〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
例えばIL-12、IL-15及び/又はIL-21レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質のような前記Th1タイプＴリンパ球の発達を促進する１又はそれより多い物質が、５日目、６日目、７日目又は８日目のように、前記第２のフェーズii)の開始後５日目から８日目まで(８日目を含む)に添加される、請求項４８〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
CD4+ヘルパーＴリンパ球の製造のための、請求項１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
エフェクターＴリンパ球の製造のための、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
メモリーＴリンパ球の製造のための、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
Th1タイプＴリンパ球の製造のための、請求項１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記Ｔリンパ球上での例えばCD25及び/又はCD69のような細胞表面マーカーの発現を、前記第１のフェーズｉ)の間及び前記第２のフェーズii)の間に継続してモニターすることを更に含んでなる、請求項１〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記Ｔリンパ球が、前記第２のフェーズii)においてＴリンパ球上のCD25がダウンレギュレートされたときに採集される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記Ｔリンパ球が、Ｔリンパ球上のCD25がダウンレギュレートされたとき、少なくとも１回の追加のフェーズii)に付される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ダウンレギュレーションが、前記CD4陽性Ｔリンパ球集団の５％又はそれ未満がCD25を発現することとして規定される、請求項６１又は６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記腫瘍反応性Ｔリンパ球が、前記第２のフェーズii)の開始後10日目から14日目まで(14日目を含む)に採集される、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記腫瘍反応性Ｔリンパ球が採集後に精製される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記第２のフェーズii)で得られた前記腫瘍反応性Ｔリンパ球を凍結させる工程を更に含んでなる、請求項１〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記Ｔリンパ球が、原発腫瘍及び/又は転移を排液するリンパ節に由来するか又は血液に由来する、請求項１〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
工程iv)の前記腫瘍反応性Ｔリンパ球が、静脈内、動脈内、鞘内、又は腹腔内に投与される、請求項１〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
投与される前記腫瘍反応性Ｔリンパ球の量が、例えば少なくとも20百万、少なくとも30百万、少なくとも40百万、少なくとも50百万、少なくとも60百万、少なくとも70百万又は少なくとも80百万のような少なくとも10百万である、請求項１〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
投与される前記腫瘍反応性Ｔリンパ球が、エフェクターＴリンパ球とメモリーＴリンパ球との組合せである、請求項１〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
エフェクターＴリンパ球の割合が、例えば約20％〜約50％又は約30％〜約40％のような約10％〜約65％である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記腫瘍反応性Ｔリンパ球が自己由来である、請求項１〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記腫瘍反応性Ｔリンパ球が非自己由来である、請求項１〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
請求項１〜７３のいずれか１項に記載の方法により製造される腫瘍反応性Ｔリンパ球。
【請求項７５】
CD4+Ｔリンパ球である、請求項７４に記載の腫瘍反応性Ｔリンパ球。
【請求項７６】
エフェクターＴリンパ球である、請求項７４又は７５に記載の腫瘍反応性Ｔリンパ球。
【請求項７７】
メモリーＴリンパ球である、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の腫瘍反応性Ｔリンパ球。
【請求項７８】
Th1タイプＴリンパ球である、請求項７４〜７７のいずれか１項に記載の腫瘍反応性Ｔリンパ球。
【請求項７９】
散在性ガンの治療用医薬の製造のための、請求項７４〜７８のいずれか１項に記載の腫瘍反応性Ｔリンパ球の使用。
【請求項８０】
Ｔリンパ球の培養用培地を含んでなる、請求項１〜７３のいずれか１項に記載の方法で使用するキット。
【請求項８１】
腫瘍反応性Ｔリンパ球を刺激し、活性化し及び方向付けるための１又はそれより多い物質を更に含んでなる、請求項８０に記載のキット。
【請求項８２】
前記培地が、例えばAIMV、RPMI 1640、DMEM又はMEMのような無血清培地である、請求項８０又は８１に記載のキット。
【請求項８３】
前記腫瘍反応性Ｔリンパ球を刺激し、活性化し及び方向付けるための１又はそれより多い物質が、腫瘍由来抗原、IL-2レセプターに対するアゴニスト活性を有する物質、前記Ｔリンパ球上のIL-12Rをアップレギュレートし得る物質、Th2タイプＴリンパ球の発達に拮抗し得る物質及びTh1タイプＴリンパ球の発達を促進する物質から選択される、請求項８０〜８２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８４】
前記腫瘍反応性Ｔリンパ球を刺激し、活性化し及び方向付けるための１又はそれより多い物質が、IL-2、インターフェロン-α、抗IL-4抗体、抗IL-5抗体、抗IL-10抗体、IL-7、IL-12、IL-15及びIL-21を含んでなる群より選択される、請求項８０〜８３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８５】
静脈内投与に適切な医薬組成物を含んでなる、請求項８０〜８４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８６】
シリンジ及びリンパ節探知体を含んでなる、メチネルリンパ節の検出用キット。
【請求項８７】
リンパ節探知体を予め充填したシリンジを含んでなる、メチネルリンパ節の検出用キット。
【請求項８８】
使用指示書を更に含んでなる、請求項８０〜８７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８９】
前記指示書がコンピュータソフトウェアの形態である、請求項８８に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図８】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図８】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【公表番号】特表２００９−５２０７２４（Ｐ２００９−５２０７２４Ａ）
【公表日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４６２４４（Ｐ２００８−５４６２４４）
【出願日】平成１８年１２月２０日（２００６．１２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１２３０５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７１３８９
【国際公開日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【出願人】（５０８１８６９１２）セントクローネ エービー (4)
【氏名又は名称原語表記】ＳＥＮＴＯＣＬＯＮＥ ＡＢ
【住所又は居所原語表記】Ａｌｌｅｎ ５，Ｓ−１７２ ６６ Ｓｕｎｄｂｙｂｅｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２０日（２００６．１２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１２３０５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７１３８９
【国際公開日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【出願人】（５０８１８６９１２）セントクローネ エービー (4)
【氏名又は名称原語表記】ＳＥＮＴＯＣＬＯＮＥ ＡＢ
【住所又は居所原語表記】Ａｌｌｅｎ ５，Ｓ−１７２ ６６ Ｓｕｎｄｂｙｂｅｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ
【Ｆターム（参考）】
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